8/14/2019 Stereo Cilia Displacement Induced Somatic Motility of Cochlear Outer

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P r o c .N a t l .A c a d .S c i .USAVo l .9 0 ,p p .8 3 4 7 - 8 3 5 1 ,S e p t e m b e r1 9 9 3N e u r o b i o l o g y

S t e r e o c i l i ad i s p l a c e m e n ti n d u c e ds o m a t i cm o t i l i t yo f c o c h l e a ro u t e rh a i r c e l l sBURTN . EVANSANDP E T E RDA L L O S

A u d i t o r yP h y s i o l o g yL a b o ra t o r y ( T h eH u g hK n o w l e sC e n t e r )a n dD e p a r t m e n to f N e u r o b i o l o g ya n d P h y s i o l o g y ,N o r t h w e s t e r nU n i v e r s i t y ,E v a n s t o n ,I L 6 0 2 0 8C o m m u n i c a t e db y A . J . Hu d s p e t h ,J u n e2 , 1 9 9 3( r e c e i v e df o rr e v i e wF e b r u a r y4 , 1 9 9 3 )

ABSTRACT O u t e r h a i rc e l l s ,i s o l a t e df r o mm a m m a l i a nc o c h l e a s ,a r ek n o w nt o r e s p o n dt o e l e c t r i c a ls t i m u l a t i o nw i t he l on g a t i o n o rc o n t r a c t i o no f t h ec e l l ' sc y l i n d r i c a ls o m a .I t i sa s s u m e dt h a ts uc h s ha pec h a n g e s ,w h e nd r i v e nb y t h ec e l l ' sr e c e p t o rp o t e n t i a li n v i v o ,a r ea p a r to f t h ef e e d b a c kp r o c e s st h a tu n d e r l i e sc o c h l e a r a m pl i f i c at i o n .T o d a t ei t h a s n o tb e e np o s s i b l e t od e m o n s t r a t es om a t i cs h a p ec h a n g e su p o nn o r m a lm e c h a n i c a ls t i m u l a t i o no f t h ec e l l - i . e . ,t h ed e f l e c t i o no f i t sh a i rb u n d l e .We s h o wh e r e t h a tm e c h a n i c a l l yi n d u c e dh a i r -b u n d l ed e f l e c t i o np r o d u c e ss o m a t i cm o t i l i yo f t h ec e l l .S u c hmo t i l i t yi s d e p e n d e n tu p o na f u n c t i o n i n gf o r w a r dt r n s u c e r

p r o c e s sa n d d i s a p p e a r su p o ni n t e r f e r e n c ew i t h t r n s d u c t i o n .T h e m o t i l er e s p o n s ea l s or e f l e c t st h e h a i r b u n d l e ' sk n o w nd i r e c t i o n a ls e n s i t i v i t y.T h i s d em o n s t r a t i o no f m e c h a n i c a l l yd r i v e nmo t i l i t yi n d i c a te s t h a tt h ec e l lm a yp o s s e s s c a pa bi l i t i est o a f f e c ti t sm e c h a n i c a le n v i r o n m en t u n d e rc o n t r o lo fi t so w nr e c e p t o rp o t e n t i a la n d , t h e r e b y ,p a r t i c i p a t ei na l o c a lc o c h l e a rf e e d b a c kp r o c e s s .

I t i s c o m m o n l ya c c e p t e dt h a tn o r m a lo p e r a t i o no f t h emam-ma l i a nc o c h l e ai sd e p e n d e n to n a m p l i f i c a t i o n ,i nt h ef o r mo fme c h a n i c a lf e e d b a c k ,f r o mo u t e rh a i rc e i l s( OHC s )t o t h eb a s i l a rm e m b r a n e - t e c t o r i a lm e m b r a n ec o m p l e x( f o rr e v i e w s ,s e er e f s .1 - 4 ) .OHCsa r ec o n s i d e r e dt ob e m e c h a n i c a le f f e c -t o r s ,a n d i n n e rh a i rc e l l s ,p o s s e s s i n g9 0 - 9 5 %o f a f f e r e n ti n n e r v a t i o n( 5 ) ,a r et h o u g h to fa st h et r u es e n s o r yr e c e p t o r s .

I n t h i ss c h e m e ,r e c e p t o rp o t e n t i a l sp r o d u c e db y OHCs i nr e s p o n s et o a c o u s t i cs t i m u l a t i o np r o v i d et h ei n p u tt o t h ec e l l ' sm o t o ra c t i v i t y .C o n s e q u e n t l y ,t h eOHCi s t h o u g h tt op e r f o r mt w o t r a n s d u c e rf u n c t i o n s( 6 ) ,a c o n v e n t i o n a lm e c h -a n o e l e c t r i c a lo r f o r w a r dt r a n s d u c t i o na n da s p e c i a l i z e de l e c -t r o m e c h a n i c a lo r r e v e r s e t r a n s d u c t i o n .T h e c a p a b i l i t yo fOHCs t o c h a n g et h e i rl e n g t hu n d e rv o l t a g ec o n t r o l( 7 - 1 1 )i sa s s u m e dt o b e a p o s s i b l em e a n sw h e r e b yOHCs d e l i v e raf o r c et o t h ec o c h l e a rp a r t i t i o n . *T h e a b o v ec o n s t r u c t i s b a s e d o n t w o s e t so f s e p a r a t e

o b s e r v a t i o n s .( i )I t i s k n o w nt h a tOHCs p r o d u c ea r e c e p t o rp o t e n t i a li nr e s p o n s et oa c o u s t i cs t i m u l a t i o ni nv i v o( 1 4 ) .( i i )E l e c t r i c a ls t i m u l a t i o nr e s u l t si n s o m a t i cmo t i l i t yi n v i t r o ,s o - c a l l e de l e c t r o m o t i l i t y( 7 ) .T o d a t e ,h o w e v e r ,a d i r e c tl i n kb e t w e e nt h ea p p r o p r i a t es t i m u l u st oOHC s ,s t e r e o c i l i a( h a i rb u n d l e )d e f l e c t i o n ,a n d s o m a t i cm o t i l i t yh a s n o t b e e nd e m -o n s t r a t e d .To d i s c r i m i n a t ea s om a t i cm o t i l er e s p o n s ee v o k e db y a m e c h a n i c a ls t i m u l u s ,h a i r - b u n d l ed e f l e c t i o n ,f r o ms i m -p l ee l e c t r o m o t i l i t ya n d t o a v o i d t h er e p e t i t i v eu s e o f t h ec o r r e c tb u t l o n gd e s c r i p t i v et e r m ," h a i r - b u n d l ed i s p l a c e -m e n t - e v o k e ds o m a t i cmo t i l i t y , "we d e s i g n a t et h i sc o m p l e t er e s p o n s em e c h a n o m o t i l i t y .We s e e k t h ee x i s t e n c eo f t h i sr e s p o n s ei n t h ep r e s e n te x p e r i m e n t s .We h a v es t u d i e d( 1 5 )OHCe l e c t r o m o t i l i t yw i t h t h ea i do f

a w i d e - b o r er a p i d l yt a p e r i n gg l a s ss u c t i o np i p e t t e ,t h em i c r o -c h a m b e r( 1 5 ,1 6 ) ,w h i c hwas a l s ou s e dh e r e .C e l l sw e r ef u l l yi n s e r t e di n t ot h ec h a m b e r( F i g .1 A )s o t h a to n l yt h e i rc u t i c u l a r

T h ep u b l i c a t i o nc o s t so ft h is a r ti c l ew e r ed e f r a y e di np a r tb y p a g ec h a r g ep a ym e n t .Th i s a r t i c l em u s tt h e r e f o r eb e h e r e b ym a r k e d" a d v e r t i s e m e n t "i na c c o r d a n c ew i t h1 8U . S . C . 1 7 3 4s o l e l yt o i n d i c a t et h i sf a c t .

p l a t ea n d s t e r e o c i l i ab u n d l ep r o t r u d e di n t ot h es u r r o u n d i n gb a t h i n gm e d i u m .E x p e r i m e n t sc o n s i s t e do f r e c o r d i n gt h ea x i a le x t e n s i o na n d c o n t r a c t i o no f t h ec e l lb y m e a s u r i n gt h em o t i o no f i t s s y n a p t i cp o l e .Two t y p e so f s t i m u l iw e r ed e l i v e r e d :m e c h a n i c a la n d e l e c t r i c a l .T h e f i r s to f t h e s ew a st h ei n d u c t i o no f s i n u s o i d a lh a i r - b u n d l em o t i o nb y a f l u i dj e t .T h e s e c o n dw a s t h ed e l i v e r yo fa s t e p - v o l t a g ec o m m a n do fe i t he r p o l a r i t ya c r o s st h ec e l lw h i l ec o n t i n u i n gme c h a n i c a ls t i m u l a t i o no f t h eh a i rb u n d l ea n dm e a s u r i n gs o m a t i cl e n g t hc h a n g e s .We f i r s te x a m i n e dw h e t h e rs t i m u l a t i o no f t h es t e -r e o c i l i ae l i c i t e ds o m a t i cm o t i l i t ya n dw h e t h e rt h ea m p l i t u do f t h er e s p o n s ew a sd e p e n d e n to n e l e c t r i c a lp o l a r i z a t i o no ft h ec e l l .We f u r t h e ri n v e s t i g a t e dt h ed e p e n d e n c eo f t h i ss om a t i cm o t i l er e s p o n s eu p o n t h e i n t e g r i t yo f t h e c e l l ' st r a n s d u c e ra p p a r a t u s .T o s t u d yt r a n s d u c t i o n - r e l a t e de v e n t s ,a n d p a r t i c u l a r l y

t r a n s d u c t i o n - c o n t r o l l e dm o t i l ee v e n t s ,i t i s a d v a n t a g e o u st oc o n f i n em e c h a n i c a ls t i m u l a t i o nt ot h es t e r e o c i l i a r yb u n d l e .I th a s b e e nr e p o r t e dt h a tt h e r ea r es t r e t c h - a c t i v a t e dc h a n n e l si nt h eOHC b a s o l a t e r a lm e m b r a n e( 1 9 ,2 0 )a n d t h a td i r e c tme c h a n i c a ls t i m u l a t i o no f t h eb a s o l a t e r a lm e m b r a n emayr e s u l ti n s o m a t i cm o t i l i t y( 2 1 ) .I nt h em i c r o c h a m b e rc o n f i g -u r a t i o n ,t h ec e l l ' ss o m ai sf u l l yi n s u l a t e df r o mt h eme c h a n i c a li n p u tt h a ti s d i r e c t e da t t h eh a i rb u n d l e .C o n s e q u e n t l y ,t h em i c r o c h a m b e rp r o v i d e sa p l a t f o r mf o rt h es t u d yo f t r a n s d u c -t i o n - r e l a t e de l e c t r i c a la n d m e c h a n i c a le v e n t sw i t h o u tl i k e l yc o n t a m i n a t i o nb y o t h e rf a c t o r s .

MATERIALSAN DMETHODSOHCsw e r eo b t a i n e df r o mt h ec o c h l e a so f y o u n g( 1 5 0 - 2 5 0g )a n e s t h e t i z e da l b i n og u i n e ap i g s .C e l l sw e r eh a r v e s t e do n l yf r o mt h et h i r da n d f o u r t ht u r n so ft h ec o c h l e a ;t h e i rl e n g t h sr a n g e d b e t w e e n5 5 a n d 7 5 , u m a n d t h e i rd i am e t e rw a su n i f o r m ,8 - 9 p m .A f t e rr e m o v i n gs e g m e n t so f t h eo r g a no fC o r t i ,c e l l sw e r et r a n s f e r r e da f t e re n z y m a t i ci n c u b a t i o n( t y p eI V c o l l a g e n a s e ,S i gm a ;0 . 5m g / m l )t o t h ee x p e r i m e n t a lb a t hc o n t a i n i n ge i t h e rL e i b o v i t z ' sL - 1 5m e d i u m( G I B CO )o r M e -d i u m1 9 9( G I B CO ) ,s u p p l e m e n t e dw i t h1 5mM H e p e sa n dSmM b o v i ne s e r u m a l bu mi n( S i g m a ) ,a n d a d j u s t e dt o 3 0 0m i l l i o s m o l a la n d pH 7 . 3 5 .T h e p e r f u s i o nm e d i u mf o rl o w

C a 2 +e x p e r i m e n t sc o n s i s t e do fa m o d i f i e dc a l c i u m - d e f i c iM e d i u m1 9 9( 8 3 - 0 0 6 3 ;G I B C O ) ,s u p p l e m e n t e dw i t h 2 0 mM1 , 2 - b i s ( 2 - a m i n o p h e n o x y ) e t h a n e - N , N , N ' , Na c i d( B A P TA ,A 4 9 2 6 ;S i g m a ) ,a d j u s t e dt o 3 0 0m i l l i o s m o l a la n dpH 7 . 3 5 .T h eb a t hm e d i u mw a sr e p l a c e de v e r y 6 0s e cb yu s i n ga H o l t e r ( E x t r a c o r p o r e a l ,K i n g o f P r u s s i a ,P A ) ( R L - 1 7 5 )p e r i s t a l t i cp u m p .E x p e r i m e n t sw e r e d o n e o n a L a b o v e r t( L e i t z )i n v e r t e d

m i c r o s c o p e .B y e x t e n d i n gt h et e c h n i q u eo f S a n t o s - S a c c( 1 7 ) ,t h es om a t i ca n d s t e r e o c i l i a r yd i s p l a c e m e n t sw e r em e a -

A b b r e v i a t i o n s :OHC, o u t e rh a i rc e l l ;B A P TA ,b i s ( 2 - a m i n o p h e n oe t h a n e - N , N , N ' , N ' - t e t r a a c e t a t e .* A l t e r a t i o no fc i l i a r ys t i f f n e s su n d e rs t i m u l u sc o n t r o lmay b e a n o t h e re f f e c t i v em e a n sw h e r e b yOHCsm o d i f yc o c h l e a rm i c r o m e c h a n i c s( 1 2 ,13 ) .

8 3 4 7

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8 3 4 8 N e u r o b i o l o g y :E v a n sa n dD a l l o s

A B

LD e p o l a r i 7 e

-y

E ;4

c o u- 0 . 6- 1 . 6

1 ( 0 0- 8 0 h O 0 4 0n , .X I V

f

Vb

s u r e d u s i n ga p a i ro f p h o t o s e n s i t i v ee l e m e n t s ( 5 5 5 - H S ;U n i t e dD e t e c t o rTe c h n o l o g y ,S a n t aMo n i c a ,C A )t h a tw e r em o u n t e dt o t h ev i d e od i s p l a y .M i c r o c h a m b e r st h a th e l dt h ec e l l sw e r e f a b r i c a t e df r o mb o r o s i l i c a t eg l a s s( F r i e d r i c h&D i mm o c k ,V i n e l a n d ,N J ; 2 0 11 - L )h a v i n ga p e r t u r ed i a m e t e r ss i m i l a rt o t h o s e o f O H C s .C e l l sw e r ed r a w ni n to s i l i c o ni z e d( H i l l s ,B r i s t o l ,P A )m i c r o c h a m b e r sb y g e n t l es u c t i o n .I n -s e r t e dc e l l sw e r e i n s p e c t e da t h i g hm a g n i f i c a t i o na n d d i s -c a r d e du p o na n y s i g no fi n d u c e dt r a u m as u c ha s s w e l l i n go fc e l ls o m a ,n u c l e a rt r a n s l a t i o n ,B r o w n i a nm o t i o no fo r g a n -e l l e s ,o r d i s r u p t i o no ft h es t e r e o c i l i a r yb u n d l e .T h em a n i p u -l a t o rh o l d i n gt h em i c r o c h a m b e ra l l o w e df o ra x i a lr o t a t i o na n dp r o p e r a l i g n m e n to f t h e h a i rb u n d l e w i t h r e s p e c tt o a no s c i l l a t i n gf l u i dj e tt h a ts t i m u l a t e db u n d l ed i s p l a c e m e n t .T h ef l u i dj e tw a sd r i v e nf r o ma s m a l ll o u d s p e a k e rd r i v i n ga p i s t o nt h r o u g ha n a i rc o l u m n( 2 2 ) ,y i e l d i n ga n o s c i l l a t i n gf l o wa t ar a t eo f5 Hz . T h e a p e r t u r eo f t h eg l a s sp i p e t t et h a tp r o v i d e dt h ej e tw a s1 0, u mi nd i a m e t e ra n dw a sp l a c e da t a d i s t a n c eo f- 1 0 , u mf r o m t h es t e r e o c i l i a .T h e s t i m u l a t o rw a s i n i t i a l l yo r i e n t e ds o t h a tt h ef o r c eu p o nt h eh a i rb un dl e w a si n t h ed i r e c t i o no f t h eh a i rb u n d l e ' sa x i so f s y m m e t r ya n d ,c o n s e -q u e n t l y ,i t sa x i so f o p t i m a ls t i m u l a t i o n( 2 3 ) .B y r o t a t i n gt h em i c r o c h a m b e r ,a n d t h u st h ec e l l ,a l o n gi t s a x i s ,d i f f e r e n to r i e n t a t i o n so f t h es t i m u l u sr e l a t i v et o t h eh a i rb u n d l ew e r ep o s s i b l e .C a l i b r a t i o no f t h e f l u i dj e t a p p a r a t u sw a s n o tn e c e s s a r yi n a s m u c ha swe m e a s u r e dt h ea c t u a ls t e r e o c i l i a r yb u n d l em o t i o nr e s u l t i n gf r o mt h em e c h a n i c a ls t i m u l a t i o n .A h i g h - i n t e n s i t yx e n o nl i g h ts o u r c e ( K a r lS t o r z ,C u l v e r

C i t y ,C A )w a s u s e d t o i l l um i n a t e t h es p e c i m e nb y a 0 . 5 - i n c hf i b e ro p t i cc o u p l e r( 1i n c h= 2 . 5 4c m ) .T h eo p t i c s( Z e i s s6 3x ,0 . 9n . a .N e o f l u a r )w e r e m od i f i e df o rc o n t r a s t e n h a n c e m e n t(M o d u l a t i o nO p t i c s ,G r e e n v a l e ,N Y ) .T h e e d g e so f t h es t e -r e o c i l i a r yh a i rb u n d l ea n d t h ec e l l ' ss y n a p t i cp o l ep r o v i d e dm a r k e dl i g h t - d a r kt r a n s i t i o n s .S u c hi m a g e sw e r ep r o j e c t e dt h r o u g ha d d i t i o n a lr e l a yl e n s e sa n d t h e n t o a m u l t i i m a g em o d u l e( N i k o n ) ,a l l o w i n gs i m u l t a n e o u sh i g h - m a g n i f i c a t i o n( x3 5 , 00 0 ) i m ag i ng o ft h ec e l l ' sh a i rb u n d l ea n ds y n a p t i cp o l e .

R e a l - t i m ed i g i t a la n d a n a l o gp r o c e s s i n g( H am am a t s u ,M i d -d l e s e x ,N J ) o f t h e v i d e o s i g n a lf u r t h e re n h a n c e de d g e -d e t e c t i o nc a p a b i l i t y .T h e im a g e sw e r e f i n a l l yd i s p l a y e do nb l a c ka n d w h i t em o n i t o rs c r e e n su p o nw h i c ht h ec a l i b r a t e dd i o d e s e n s o r sw e r ea f f i x e d .By u s i n ga p i e z o e l e c t r i ca c t u a t o r ,c a l i b r a t e dd i s p l a c e m e n t s

o f t h em i c r o c h a m b e ra n dc e l l ,i nt o t o ,i n d i c a t e dt h a ts u b p i x e lm o t i o n( 1 0nm p e a k - t o - p e a k )c o u l db e r e s o l v e d .B ye m p l o y -i n gs i g n a la v e r a g i n g ,t i m e - l o c k e dm o v e m e n t so n t h eo r d e ro f1 nm c o u l db e r o u t i n e l yr e c o r d e d .C a l i b r a t i o nf a c t o r sw e r eo b t a i n e df o re a c he x p e r i m e n t a lr u nu n d e rp r o g r a mc o n t r o lb ye l e c t r o n i c a l l yd i s p l a c i n gt h el i v ev i d e o i m a g ei n f r o n to f t h ed i o d es e n s o r sb y k n o w na m o u n t s( + 1p i x e l= 5 8n m )a f t e rt h es y s t e mi t s e l fw a sc a l i b r a t e db y me a s u r i n gt h ei m a g es i z eo f m i c r o b e a d s( P o l y s c i e n c e )1 . 0, u mi nd i a m e t e r .T h ea b o v et e c h n i q u ew a s f o u n dt o b e e q u i v a l e n tt o o t h e r c a l i b r a t i o n

F I G .1 . ( A )F u l l yi n s e r t e dOHCh e l dw i t h i nt h em i c r o c h a m b e r .D u r i n gd a t aa c q u i s i t i o n ,t h es t e r e o c i l i a r yb u n d l ea n d t h ec e l l ' ss y n a p t i cp o l ea r e f u r t he rm a g n i f i e da n d i m a g e do n t o p h o t o -d i o d e sf o rme a s u r i n gd i s p l a c e m e n t s .( B )S c h e -m a t i cd i a g r a mo f t h ec e l li n t h em i c r o c h a m b e rw i t ha n e q u i v a l e n te l e ct r ic a l c i rc u i ts u p e r i m -p o s e d .H a i r - b u n d l ed e f l e c t i o nmo d u l a t e st h ec e l l ' sa p i c a lm e m b r a n er e s i s t a n c eR a .Vo l t a g ed r o p o n t h eb a s o l a t e r a lm e m b r a n er e s i s t a n c eR b ,d u et ot h er e c e p t o rc u r r e n ti ,d r i v e sp u t a t i v ev o l t a g e - t o - d i s p l a c e m en t c o n v e r t e r m( I n -s e t )C h a r a c t e r i s t i cf u n c t i o no f e l e c t r o m o t i l i t y( 1 7 ,1 8 ) .N o t et h a ta st h eo p e r a t i n gp o i n to n t h ef u n c t i o nm o v e st o w a r da m o r ed e p o l a r i z e dr e -g i o n ,t h es l o p e( g a i n )f i r s ti n c r e a s e sa n d t h e nd e c r e a s e s .

p r o c e d u r e sp r e v i o u s l yi m p l e m e n t e di n c l u d i n gt h e o p t i c a ll e v e rt e c h n i q u e( 2 4 ) .T h e l i n e a r i t yo f t h e c h a r g e - c o u p l e dd e v i c ec a m e r aw a s v e r i f i e db y i n t e r r o g a t i n gp i x e li n t e n s i t yp r o f i l e sg e n e r a t e di nr e s p o n s et o t e s tp a t t e r n sa f t e rd i s a b l i n gt h ec a m e r a ' sa u t o m a t i cg a i nc o n t r o lc i r c u i t r y .F i n a l l y ,i tw a sv e r i f i e dt h a tt h e s m a l ld i s p l a c e m e n t sw e r en o t d i s t o r t e db ya u t o m a t i cg a i nc o n t r o lf e a t u r e sr e s i d e n ti n t h e d i s p l a ym o n -i t o ri t s e l f .T h el i n e a r i t yo f t h ee n t i r em e a s u r e m e n ts y s t e mw a st e s t e db y e l e c t r o n i c a l l yd i s p l a c i n g t h ei m a g ea r o u n di t sc e n t e rp o s i t i o nu n d e rc o m p u t e rc o n t r o l .I tw a sf o u n dt h a tt h el i n e a rr a n g ef o rd c a n d a c d i s p l a c e m e n t se n c o m p a s s e d 5 p i x e l s ,w hi c h w a ss u f f i c i e n t l yw i d et oa s s u r e u n d i s t o r t e dr e p r o d u c -t i o no f a c d i sp l ac e me n ts o ft h es t e r e o c i l i aa n d s y n a p t i cp o l e .T h ea m p l i f i e dd i o d es i g n a l sw e r ed i g i t i z e da t a r a t eo f3 k H z ,a v e r a g e d( u s u a l l y2 0 t r i a l s ) ,a n d l o w - p a s s - f i l t e r e da t 1 0Hz .Vi d e oi m a g e so f t h ec e l la n dh a i r - b u n d l es e g m e n tw e r es t o r e do n a n o p t i c a ll a s e rd i s k .E l e c t r i c a lcommand s i g n a l sw e r e g e n e r a t e di n v o l t a g e -

c l a m pm o d e( m o d e l8 9 0 0 ;D a g e nI n s t r u m e n t s ,M i n n e a p o l i sa n d d e l i v e r e db e t w e e nt h ee l e c t r o l y t e ss u r r o u n d i n ga n d f i l l -i n gt h em i c r o c h a m b e r( F i g .1 B ) .T h e c e l la n d t h ec h a m b e rf o r m a r e s i s t i v e s e a lb e t w e e ne l e c t r o l y t e si n s i d ea n d s u r -r o u n d i n gt h em i c r o c h a m b e rw i t ha n a c c e s sr e s i s t a n c eo f= 1 0MQ l .Ma k i n gt h e f l u i dw i t h i nt h em i c r o c h a m b e rp o s i t i v eh y p e r p o l a r i z e st h ei n c l u d e dm e m b r a n es e g m e n ta n d d e p o -l a r i z e st h ee x c l u d e dm e m b r a n e( 1 8 ) .When t h ec e l li s f u l l yi n s e r t e d( a si nF i g .1 ) ,t h ec o m m a n dv o l t a g ei s d i v i d e do n av o l t a g ed i v i d e rf o rm ed b yt h ec e l l ' sc i l i a t e da p i c a lm e m b r a n e( R a ;o u t s i d e t h ec h a m b e r )a n d i t sb a s o l a t e r a lm e m b r a n e( R b ;i n s i d et h ec h am b e r ) .T h ee l e c t r i c a lr e s i s t a n c e so ft h e s et w om e m b r a n er e g i o n sa r el i k e l yv e r yd i f f e r e n tb o t h i n v i v oa n di nv i t r o( 2 5 ,2 6 ) ,w i t hR a >> R b .I t h a sb e e ne s t i m a t e dt h a tt h ee l e c t r i c a lr e s i s t a n c eo f t h ee x c l u d e dm e m b r a n eo f a f u l l yi n s e r t e dc e l li n t h ea b s e n c eo f me c h a n i c a ls t i m u l a t i o ni s a tl e a s t1 0t i m e sg r e a t e rt h a n t h a to f t h ei n c l u d e dm e m b r a n e( 2 5 ) .C o n s e q u e n t l y ,a tl e a s t9 0 %o ft h ea p p l i e dv o l t a g es h o u l da p p e a r a c r o s s R a ,t h ee x c l u d e d( s t e r e o c i l i a r y )m e m b r a n es e g m e n tf o ra f u l l yi n s e r t e dc e l l .Wh i l et h em i c r o c h a m b e rm e t h o dd o e s n o t p e r m i tu s t o m e a s u r et h ec e l l ' sr e s t i n gp o t e n t i a ld i r e c t l y ,a s t h ea b o v ec o n s i d e r a t i o ni n d i c a t e sf o rt h ee x c l u d e dm e m b r a n es e g m e n tt h e c o m m a n dv o l t a g ew e l la p p r o x i m a t e st h ec h a n g ei n m e m b r a n ep o t e n t i a l .F u r t h e r -m o r e ,t h ea s y m m e t r yo f t h ee l e c t r o m o t i l er e s p o n s ei s i n d i c -a t i v eo f t h ec e l l ' sr e s t i n gp o t e n t i a l .C e l l st h a ta r el i k e l yt oh a v er e l a t i v e l yh i g hr e s t i n g p o t en t i a l sp r o d u c el a r g e rs h o r t -e n i n gt h a n e x t e n s i o n - d i r e c t e dr e s p o n s e s( F i g .1 B ; r e f s .1 8a n d 2 7 ) .C o n v e r s e l y ,d e p o l a r i z e dc e l l sg e n e r a t e e i t h e ras ymm e t r i c a le l e c t r o m o t i l er e s p o n s eo r a r e s p o n s ew i t h e x -t e n s i o nd o m i n a n c e( 18 , 2 7 ) .N o t e , f o re x a m p l e ,t h ee l e c t r o -m o t i l er e s p o n s eo f t h ec e l li nF i g .2 B : c o n t r a c t i o ne x c e e d se x p a n s i o n ;h e n c e ,t h em e m b r a n ep o t e n t i a li su n l i k e l yt oh a v eb e e nl e s sn e g a t i v et h a n a p p r o x i m a t e l y- 4 0mV. T h ec u r r e n tp a s s i n gt h r o u g ht h em i c r o c h a m b e ri s t h es u mo ft h er e c e p t o r

P r o c .N a t l .A c a d .S c i .USA 9 0 ( 1 9 9 3 )

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3/5

P r o c .N a t l .A c a d .S c i .USA 9 0 ( 1 9 9 3 ) 8 3 4 9

0

_s

0

C)

1 1

c o

1 1

I

1 -

B

AA/\'W0JAAWVV\A/W\YWVVV

Il

0 2 4

T i m e ,s e c

F I G .2 . ( A )C o m p u t e dm o d e lr e s p o n s e( s o l i dl i n e )t oa c om b i n a -t i o no f a c ( m e c h a n i c a l )m o d u l a t i o no f a p i c a lr e s i s t a n c ea n d d c( e l e c t r i c a l )p o l a r i z a t i o no f t h ec e l l .B a s o l a t e r a lm e m b r a n ev o l t a g ei sc o m p u t e df r o mEq . 2 u s i n gV = + 1 0 0m V ,a o = 0 . 1 ,a n d ( = 0 . 1 .Mo t i l er e s p o n s ei so b t a i n e df r o mt h ef u n c t i o ni nF i g .1 BI n s e t ,w i t hVba s t h ei n p u t .F o r r e f e r e n c e ,t h et i m ec o u r s e so f t h ec o m m a n dv o l t a g eV ( d a s h e dl i n e )a n d t h eme c h a n i c a ls t i m u l u s( d o t t e dl i n e )a r ea l s os h o w n .Ve r t i c a lp r o j e c t i o nl i n e sa i di nd e t e r m i n i n gt h ep h a s eo ft h er e s p o n s ed u r i n gt h et w op o l a r i t i e so ft h ec o m m a n dv o l t a g e .( B )D em o n s t r a t i o no f m e c h a n o m o t i l er e s p o n s e .T h ea x i a ld i s p l a c e m e n to ft h ec e l l ' ss y n a p t i cp o l e ,i n s i d et h em i c r o c h a m b e r ,i s m e a s u r e d( u p p e rt r a c e ) .C e ll e x t e n s i oni s p l o t t e du p w a r d .D u r i n gt h e s em e a -s u r e m e n t s ,t h es t e r e o c i l i aa r ed i s p l a c e ds i n u s o i d a l l yb y t h ef l u i dj e t( 5 - 1 0n m ,p e a k - t o - p e a k ,c o r r e s p o n d i n gt o0 . 0 3 - 0 . 0 8 a n g u l a ra m p l i -t u d e ) .A v o l t a g ec h a n g e( 1 0 0mV) i s a p p l i e da c r o s s t h ec e l l .T h ef i r s tc h a n g ef r o mb a s e l i n ec o r r e s p o n d st o h y p e r p o l a r i z a t i o no f t h ee x c l u d e dp o r t i o n( a n dc o r r e s p o n d i n gd e p o l a r i z a t i o no f t h ei n c l u d e dp o r t i o n )o f t h ec e l lm e m b r a n e .T h e s e c o n dc h a n g ei s a s h i f tt o t h eo p p o s i t epo l a r i t y.T h ed c v o l t a g ec h a n g e se l i c i tt o n i c e l e c t r om o t i l er e s p o n s e s .N o t e t h a tw i t h z e r o e l e c t r i c a lc o m m a n dt h e r ei s as i n u s o i d a ls o m a t i c m o t i l er e s p o n s er e l a t e dt ot h ed i s p l a c e m e n to f t h es t e r e o c i l i a .Du r i n gn e g a t i v ec o m m a n d ,t h em e c h a n o m o t i l i t yi s e n -h a n c e d ,w h e r e a sd u r i n gp o s i t i v ec o m m a n d ,i t i s d e p r e s s e d .T h em e a s u r e dc u r r e n tt h r o u g ht h em i c r o c h a m b e ra n d t h e s i n u s o i d a lme c h a n i c a la n d d c e l e c t r i c a ls t i m u l ia r e a l s os h o w n( l o w e rt w ot r a c e s ) .T h e c u r r e n tt r a c ei s d o m i n a t e db y c u r r e n tt h r o u g hR s h .Ve r t i c a ll i n e s a r ed r a w nt o a i di n d e t e r m i n i n gt h ep h a s e o f t h em e c h a n o m o t i l er e s p o n s e .T h ea p p a r e n tt i m ed e l a yo f t h er e s p o n s ei nt h i sa n d s u b s e q u e n tf i g u r e si s d u e t o t h e1 0 - H zl o w - p a s sf i l t e r i n go ft h ep h o t o d i o d eo u t p u t .

c u r r e n ta n d a d o m i n a n ts h u n tc u r r e n tt h r o u g hR s h . I n t h e s ee x p e r i m e n t st h er e c e p t o rc u r r e n ti s n o t m e a s u r e d .

RESULTST h e o r y .I nF i g .1 Ba n e l e c t r i c a lc i r c u i tt h a tr e p r e s e n t st h e

O H C - m i c r o c h a m b e rs y s t e m i s s h o w n .F o r s i m p l i c i t y ,a l l

v o l t a g e -a n dt i m e - d e p e n d e n tc o n d u c t a n c e so f t h ec e l l ' sb a s o -l a t e r a lm e m b r a n ea r eom i t t e df r o mt h i se l e m e n t a r ym o d e l( 2 8 ) .F i g .1 B I n s e ts h o w s t h e c e l l ' sr e v e r s e t r a n s d u cf u n c t i o n ,i . e . ,m o t i l i t yv s .m e m b r a n ev o l t a g ec h a n g e( 1 7 ,1 8 ) .H a i r - b u n d l ed e f l e c t i o nm o d u l a t e st h ec e l l ' sa p i c a lr e s i s t a n cb y o p e n i n ga n dc l o s i n go f t r a n s d u c e rc h a n n e l si nt h es t e r e o -c i l i a( 2 9 ) .D e n o t et h er a t i oo f r e s t i n g( n os t i m u l u s )b a s o l a t e ra n d a p i c a lm e m b r a n er e s i s t a n c e sa s a o= R b / R a o ,w h e r e a st h ed y n a m i cs t i m u l u s - c o n t r o l l e dv a l u e i s a ( t )= Rb /R a ( t )=a o f t t ) ,wh e r e f ( t )i ss o m ef u n c t i o no f t i m e .T h ev o l t a g e a c rt h ec e l l ' sb a s o l a t e r a lm e m b r a n et h a td r i v e sm o t i l i t yi sV b ( t )A s s u m et h a t t h e c e l lm e m b r a n e ' se l e c t r o m o t i v ef o r c e( T h d v e n i n - e q u i v a l e n to r o p e n - c i r c u i t v o l t a g e )i s E , a d cc o m m a n dv o l t a g eV i sp l a c e da c r o s st h ec e l l ,t h em i c r o c h a m -b e r ' ss e r i e sr e s i s t a n c ei sR o ,a n d t h ea c c e s s r e s i s t a n c eb e -t w e e ne x t e r n a la n d i n t e r n a lf l u i dm e d i ai sR s h .De f i n e( 3 =R o / R s h( a swe h a v ei n d i c a t e d ,B

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4/5

8 3 5 0 N e u r o b i o l o g y :E v a n sa n dD a l l o s

f o r w a r dg a i na p p e a r st o d o m i n a t et h ec h a n g e si n r e s p o n s e ,r e s u l t i n gi n a m o n o t o n i cr e s p o n s em a g n i t u d ef u n c t i o n .F i n a l l y ,i t c a n b e s h o w nt h a tt h ep h a s i cm e c h a n o m o t i l e

r e s p o n s eg o e st h r o u g ha n u l la n d r e v e r s e sp h a s ew h e nt h ed ccommand v o l t a g ei s a p p r o x i m a t e l ye q u a lt o t h ec e l l ' sm e m -b r a n ep o t e n t i a l ,Vbo .S p e c i f i c a l l y ,t h er e s p o n s er e v e r s e si t sp h a s ew h e ni = 0 , a t a command v o l t a g eV = V r , v :

Vr e v= - ( 1 + 3 ) E= - ( 1 + 0 ) ( 1+a o ) Vo .

[ 5 ]

C o n s e q u e n t l y ,b y u s i n gt h em i c r o c h a m b e rt e c h n i q u e ,t h ec e l l ' sm e m b r a n ep o t e n t i a lc a n b e e s t i m a t e dw i t h o u t t h en e c e s s i t yo f i m p a l e m e n t .I nF i g .2A we d em o n s t r a t ea s i m p l em o d e lc a l c u l a t i o nb a s e do n t h ea b o v ec o n c e p t s .T h em o d e la s s u m e s t h a t E =-70mV, a o= 0 . 1 ,, B =0 . 1 ,V= 1 0 0 m V,t h ei n p u tf ( t )i s a s i m p l es i n u s o i d ,a n d t h ee l e c t r o m o t i l i t yf u n c t i o ni s a s s h o w ni n F i g .1 B . N o t e t h a tt h eb a s e l i n er e s p o n s er e p r e s e n t sm e c h a n o m o t i l i t yw i t h z er oe l e c t r i c a lc o m m a n d .When V = - 1 0 0mV, t h em e c h a n o m o t i l er e s p o n s ei s s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ,w h i l ei t i s d e c r e a s e di n a m p l i t u d ed u r i n gt h ea p p l i c a t i o no fV = + 1 0 0mV. S i n c eV > V r e . ,t h em o d e lp r e d i c t sp h a s er e v e r s a lo ft h em e c h a n o m o t i l er e s p o n s ed u r i n gt h ed e p o l a r i z i n gc o m m a n d .E x p e r i m e n t a lR e s u l t s .I nF i g .2 Bwe d em o n s t r a t et h ea x i a l

d i s p l a c e m e n to f t h ec e l l ' ss y n a p t i cp o l e .I n t h i sc a s et h es t i m u l u sc o n s i s t e do f t h ef l u i dj e t d r i v i n gt h es t e r e o c i l i a r yb u n d l ea n d a n e l e c t r i c a lc o m m a n ds i g n a la p p l i e da c r o s st h ec e l l .T h e d a t ad em o n s t r a t et h a th a i r - b u n d l ed e f l e c t i o np r o -d u c e ss o m a t i cmo t i l i t y ,a n d c o n s e q u e n t l y ,m e c h a n o m o t i l i t yd o e se x i s t .P h a s i cm e c h a n o m o t i l ed i s p l a c e m e n to ft h ec e l l ' ss y n a p t i cp o l ew a s d i s c e r n i b l eo n t h ev i d e om o n i t o ra t t h es t i m u l u sf r e q u e n c yo f 5 Hz . T h e b a s e l i n em e c h a n o m o t i l er e s p o n s ei n t h i se x a m p l ew a s ; 5 . 5 nm f r o m p ea kt o p e a k .When t h eb a s o l a t e r a lm e m b r a n eo ft h ec e l lw a sd e p o l a r i z e d ,t h em e c h a n o m o t i l er e s p o n s ei n c r e a s e dt o " 2 5n m ,a n dw h e nt h eb a s o l a t e r a lm e m b r a n ew a s h y p e r p o l a r i z e d ,t h em e c h a -n o m o t i l er e s p o n s ed e c r e a s e dt o - - 2 . 5n m .A f t e rt h ec e s s a t i o no ft h ee l e c t r i c a ls t i m u l u s ,t h em e c h a n om o t i l i t yr e t u r n e dt ot h e b a s e l i n ev a l u e ,= z 5 . 5n m .T h e r e s p o n s ea l s oc o n t a i n e dal a r g ea s ymm e t r i c a ld c e l e c t r o m o t i l ec o m p o n e n td u e t o t h ed i r e c te f f e c to ft h ee l e c t r i c a ls t i m u l a t i o nu p o nt h eb a s o l a t e r a lm e m b r a n ea n d t h ep u t a t i v em o t o rm o l e c u l e st h e r e i n .Wen o t et h es i m i l a r i t yo ft h em e a s u r e dr e s p o n s et ot h a tp r e d i c t e db y t h em o d e l( F i g .2 A ) .I n c l u d e da m o n gs i m i l a rf e a t u r e si st h ep h a s er e v e r s a lo f t h em e c h a n o m o t i l er e s p o n s ed u r i n gd e p o -l a r i z a t i o no ft h ec i l i a r ym e m b r a n ea n d a n i n c r e a s ei n t h ea cg a i nd u r i n g- 1 0 0mV a n d i t sd e c r e a s ed u r i n g+ 1 0 0m V .B yk e e p i n gt h ef l u i dj e ts t i m u l u si n v a r i a n t ,i t i s p o s s i b l et o

r o t a t et h em i c r o c h a m b e r ,a n dt h u st h eOHC, a r o u n dt h ec e l l ' sl o n ga x i s .T h i sp e r m i t st h ed e l i v e r yo fm e c h a n i c a ls t i m u l a t i o nt ot h e h ai rb u n d l ea t d i f fe r e nt o r i e n t a t i o n sv i s - a - v i si t smo r p h o -l o g i c a lp o l a r i z a t i o n .Wea s c e r t a i n e dt h a th a i r - b u n d l em o v e m e n tt o w a r dt h et a l lh a i r sa l w a y sp r o d u c e dm e c h a n o m o t i l er e s p o n s ei nt h es h o r t e n i n gd i r e c t i o n .A sF i g .3 As h o w s ,w h e nt h ec e l li s

r o t a t e d9 0 ,m e c h a n o m o t i l i t yd i s a p p e a r s ,w h e r e a sr o t a t i o nb y1 8 0 0p r o d u c e sr e s p o n s e s i n o p p o s i t e p h a s e .T h i sr e s p o n s ec h a r a c t e ri s i n v a r i a n tf r o mc e l lt o c e l l .T h u s ,a s s h o w ni nF i g .3 B ,a n yt w oc e l l st h a t a r eo r i e n t e dw i t ht h e i rh a i r b u n d l e sf a c i n gt h ef l u i dj e t w i t hs h o r tv s . t a l ls t e r e o c i l i a r yr o w s p r o d u c em e c h a n o m o t i l er e s p o n s e si no p p o s i t ep h a s e .M e c h a n i c a l l yi n d u c e ds om a t i cmo t i l i t yd i r e c t l yd e p e n d s

u p o nb a s o l a t e r a lm e m b r a n ev o l t a g ec h a n g e sp r o d u c e db y t h ef o r w a r dt r a n s d u c e rc u r r e n t .I t i s k n o w nt h a tv e r y l o wC a 2 +l e v e l si nt h em e d i u ms u r r o u n d i n gt h eh a i rb u n d l ei r r e v e r s i b l ye l i m i n a t et r a n s d u c t i o n( 3 3 - 3 6 ) .Upon r e p l a c i n gt h ee x t e r n a lb a t h w i t h C a 2 + - f r e ec u l t u r em e d i u mc o n t a i n i n g2 0 mMBAPTA, c e l l sr e s p o n d e dt oe l e c t r i c a ls t i m u l a t i o nw i t h u n d i -m i n i s h e de l e c t r om o t i l i t y ,w h e r e a st h em e c h a n o m o t i l er e -s p o n s e sw e r ee n t i r e l ya b o l i s h e dw i t h i n1 m i n .M e c h a n o m o -t i l i t yi s c l e a r l yd e p e n d e n tu p o nf u n c t i o n i n gm e c h a n o e l e c t r i c

Ce

00

-4 )

6I

CZ

. 00

0 1 8 0

9 0 0

7 0 0 1 3 0 0P o s t s t i m u l u so n s e t ,m s e c

1 9 0 0

B

CC

0

' 0

c e

1 0

z

0 2T i m e , s e c

4 6

F I G .3 . ( A )T h r e es u c c e s s i v er e s p o n s et r a c e so b t a i n e da t t h r e eo r i e n t a t i o n so ft h es a m eh a i rb u n d l ew i t hr e s p e c tt o t h es t i m u l a t i n gf l u i dj e t .S o l i dl i n e ,o r i e n t a t i o ns u c ht h a ts h o r t e s ts t e r e o c i l i a r yr o wf a c e st o j e t( 0 ' )( t h i si st h es a m eo r i e n t a t i o na si nF i g .2 B ) ;d a s h e dl i n e ,b u n d l ei s r o t a t e d9 0 ' ;d o t t e dl i n e ,b u n d l ei sr o t a t e da n a d d i t i o n a l9 0 ' .T o c l e a r l ys h o wt h er e s p o n s ep h a s e s ,o n l ya p o r t i o no ft h er e s p o n s et i m ec o u r s ei sp r e s e n t e d .( B )M e c h a n o m o t i l er e s p o n s e so ft w oc e l l s ,o n e a t 0 ' a n d t h eo t h e ra t 1 8 0 's t e r e o c i l i ab u n d l eo r i e n t a t i o n .N o t e

t h a tt h ea c r e s p o n s ep h a s e sa r eo p p o s i t et h r o u g h o u tt h er e c o r d s ,w h e r e a st h ed c e l e c t r o m o t i l er e s p o n s e sa r et h es am e . C o m b i n e dm e c h a n i c a l( a c )a n d e l e c t r i c a l( d c , 1 0 0m V )s t i m u l a t i o n .

t r a n s d u c t i o n .A n o t h e rm e a n so f d em o n s t r a t i n gt h i si s t ot a k ea d v a n t a g eo f t h ek n o w nc a p a c i t yo f a m i n o g l y c o s i d e st ob l o c kt r a n s d u c e rc h a n n e l si n h a i rc e l l s( 3 7 - 3 9 ) .We o b s e r v e dac o m p l e t ee l i m i n a t i o no f me c h a n om o t i l i t yu p o nr e p l a c i n gt h ee x t e r n a lb a t h i n gm e d i u mw i t h m e d i u mc o n t a i n i n g2 0 0 pMd i h y d r o s t r e p t o m y c i ns u l f a t e .T h ee f f e c tw a sp a r t i a l l yr e v e r s -i b l eu p o nw a s h i n go u t t h ed r u g .F i n a l l y ,me c h a n om o t i l i t yw a sn o ts e e n i na l lc e l l st e s t e d .I nf a c t ,t h em a j o r i t yo f c e l l s( 7 8o f1 1 0c e l l s ) ,d e s p i t ee x c e l l e n tl i g h tm i c r o s c o p i ca p p e a r a n c eo ft h eh a i rb u n d l e a n d f u l la b i l i t yt o p r o d u c ee l e c t r o m o t i l er e s p o n s e s ,f a i l e dt o g e n e r a t em e c h a n i c a l l yi n d u c e ds om a t i cmo t i l i t y .A p p a r e n t l y ,t h et r a n s d u c e rc h a n n e l so r t h e i ri n p u tl i n k a g e st o c i l i a( 4 0 )o f t e nf a i l e dt o s u r v i v e t h ec e l li s o l a t i o np r o c e d u r eo r s u b s e q u e n tm e c h a n i c a lm a n i p u l a t i o n s .

DISCUSSIONT h e s ee x p e r i m e n t sd em o n s t r a t ea d i r e c tl i n kb e t w e e n" n a t -u r a l "me c h a n i c a ls t i m u l a t i o no f t h et r a n s d u c e ro r g a n e l l eo fo u t e rh a i rc e l l s ,t h e i rh a i r ( o rc i l i a r y )b u n d l e ,a n d s om a t i cs h a p ec h a n g e so f t h e s ec e l l s .D e f l e c t i o no f t h eb u n d l et o w a r dt h et a l l e s tr o wo f c i l i ai s k n o w nt ob e e x c i t a t o r y ,p r o d u c i n gd e p o l a r i z a t i o no f t h ec e l l( 2 9 ,4 1 ,4 2 ) .D e f l e c t i o ni n t h eo p p o s i t ed i r e c t i o ng e n e r a t e sh y p e r p o l a r i z a t i o n ,w h e r e a so r -t h o g o n a ld i s p l a c em e n ti s l a r g e l yi n e f f e c t i v e( 2 9 , 4 1 ) .D e f l e c -t i o no f t h eb u n d l et o w a r dt h et a l l e s tc i l i a r yr o wy i e l d ss om a t i cs h o r t e n i n g ;d e f l e c t i o ni n t h eo p p o s i t ed i r e c t i o np r o d u c e sl e n g t h e n i n g .T h e s ep o l a r i t i e sa r ea se x p e c t e d ,f o ri t i sk n o w n

E.E.. Er o c . N a t l .A c a d .S c i .USA 9 0 ( 1 9 9 3 )

8/14/2019 Stereo Cilia Displacement Induced Somatic Motility of Cochlear Outer

5/5

P r o c .N a t l .A c a d .S c i .USA 9 0 ( 1 9 9 3 ) 8 3 5 1

t h a te l e c t r i c a ld e p o l a r i z a t i o no f t h e s ec e l l sg e n e r a t e sc o n -t r a c t i o nw h e r e a sh y p e r p o l a r i z a t i o ng e n e r a t e se x p a n s i o n( 9 ,1 0 ) .Ap p a r e n t l yt h ee x p e c t e ds e q u e n c eo f e v e n t s t a k e s p l a c ei nw h i c hs i n u s o i d a l h a i r - b u n d l ed e f l e c t i o np r od u c e s a na l t e r -n a t i n gr e c e p t o rc u r r e n tv i a t h eo p e n i n ga n d c l o s i n go ft r a n s -d u c e rc h a n n e l s( 4 0 ) .C u r r e n t - i n d u c e dv o l t a g ed r o p so n t h ec e l l ' sb a s o l a t e r a lm e m b r a n ea c t i v a t et h e i rp u t a t i v em o l e c u l a rm o t o r s( 4 3 , 4 4 ) ,t h e r e b yp r o d u c i n gc e l lmo t i l i t y .F o rs i m p l i c -i t y ,t h i sc o m p l e t es e q u e n c eo f e v en t si s now t e r m e d" m e c h -a n o m o t i l i t y . "We h a v eb e g u nt o s y s t e m a t i c a l l ye x a m i n et h eg a i no fm e c h a n o m o t i l i t y - i . e . ,t h er a t i oo f s om a t i cd i s p l a c e -m e n ta n d b u n d l ed i s p l a c e m e n t( o r a ng l e ) .P r e l i m i n a r yi n d i -c a t i o ni s t h a tt h eg a i ni s c l o s et o u n i t y ,a t l e a s tf o rc e l l sw i t ha l e n g t ho f5 5 - 7 5, u m ,h a v i n gb u n d l eh e i g h t so f 3 - 5 , u m ,a n da t l e a s ta t t h ev e r y l o wf r e q u e n c i e st e s t e d .T h e m a r k e dc h a n g ei n t h em e c h a n o m o t i l er e s p o n s ew i t h

e l e c t r i c a lp o l a r i z a t i o no ft h ec e l li se x p l a i n e db yn o t i n gt h a tt w os y n e r g i s t i ce f f e c t sa c c e n t u a t et h ec h a n g e .When a n e l e c t r i c a ls i g n a li s a p p l i e di n t h em i c r o c h a m b e rt h a th y p e r p o l a r i z e st h ee x c l u d e da p i c a lm e m b r a n ea n d s i m u l t a n e o u s l yd e p o l a r i z e st h ei n c l u d e db a s o l a t e r a lm e m b r a n e ,t h ee f f ec t s a r er e i n f o r c i n gi nf a v o r i n ga l a r g em e c h a n o m o t i l er e s p o n s ea swe h a v ed i s c u s s e da b o v e .T h ep r o n o u n c e de f f e c t sd emo n s t r a t e di nt h em e c h a n o -m o t i l er e s p o n s ed u e t o e l e c t r i c a lp o l a r i z a t i o no ft h ec e l l( F i g .2 B )a r ea c o n s e q u e n c eo ft h eu n i q u ea b i l i t yo f t h em i c r o c h a m b e rt e c h n i q u et o i m p a r to p po s i t e - po l a r i t y v o l t a g ec o m m a n d so n t ot h et w om e m b r a n es e gm e n t s( a p i c a la n db a s o l a t e r a l )o ft h ec e l l .I na d d i t i o n ,t h em i c r o c h a m b e rp r o v i d e sa s t a b l em e c h a n i c a lp l a t f o r m ,p a r t i a l l ys i m u l a t i n g t h ec e l l ' si n v i v oc o n d i t i o n .On er e s u l to ft h i ss t a b i l i t y ,n o tr e a d i l ya c h i e v a b l eb yo t h e rme a n s ,i st o p e r m i tm e c h a n i c a ls t i m u l a t i o no f t h e s t e r e o c i l i aw i t h o u tt r a n s m i s s i o no f m e c h a n i c a lf o r c e st o t h ec e l lb o d y ,a n d t h u sw i t h o u ta l i k e l i h o o do f o p e n i n gs t r e t c h - a c t i v a t e dc h a n n e l st h e r e i n( 1 9 ,2 0 ) .T h em e t h o dmay a l s ob e s u i t e df o rt h em e a -s u r e m e n to f r e c e p t o rc u r r e n t s( 1 6 )w i t h o u tc o n t a m i n a t i o nb yc u r r e n t sd u et os t r e t c h - a c t i v a t e dc h a n n e l s ,a c o n c e i v a b l ep r o b -l e mw i t hp r e v i o u sa t t e m p t s( 3 9 ) .O u rv a r i o u sc o n t r o le x p e r i m e n t se f f e c t i v e l yd em o n s t r a t e

t h a tt h em o t i l er e s p o n s ei s t h er e s u l to ft r a n s d u c e rc h a n n e la c t i v a t i o na n d n o t d e r i v e df r o m s o m em e c h a n o e l e c t r i c a la r t i f a c ts u c ha sm o d u l a t i o no ft h ea c c e s sr e s i s t a n c eo r d i r e c td e f o r m a t i o no f t h ec e l l . tS p e c i f i c a l l y ,r o t a t i o no ft h ec e l la n di t s c o n s e q u e n c eo f c h a n g i n gm e c h a n o m o t i l er e s p o n s ei na c c o r d a n c ew i t ht h e b u n d l e ' sd i r e c t i o n a ls e n s i t i v i t ya r e n o tr e c o n c i l a b l ew i t ha me c h a n i c a la r t i f a c t .T h ep r o f o u n de f f e c t ss e e n u p o nm e c h a n o m o t i l i t ya s a c o n s e q u e n c eo ft h ea p p l i -c a t i o no f a g e n t sk n o w nt o i m p a i rt r a n s d u c t i o n ,s u c h a ss t r e p t o m y c i na n dC a 2 + - f r e em e d i u m ,a r e a l s oi r r e c o n c i l a b l ew i th a na r t i f a c t u a lb a s i sf o rt h i sr e s p o n s e .T h i si s e s p e c i a l l ys o s i n c ea l lo f t h e s ea g e n t sa f f e c t e do n l yt h ep h a s i cm e c h a -n om o t i l er e s p o n s e sb u t n o t t h et o n i ce l e c t r o m o t i l er e s p o n s e sd u e t o t h ev o l t a g e - s t e pc o m m a n d s .We c o n c l u d et h a tam e c h a n o m o t i l er e s p o n s eo c c u r si ni s o l a t e dOHCsa n d ,t h u s ,t h ep r o p o s i t i o nt h a ts u c ha r e s p o n s eo p e r a t e si nv i v oa s a p a r to f t h ep u t a t i v ec o c h l e a ram p l i f i e ra p p e a r st e n a b l e .

t B y a s s u m i n gt h a t a s i g n i f i c a n tm o d u l a t i o no f t h e access r e s i s t a n c e( R . h )o c cu r s , s u c h t h a t, B= o g ( t ) ,we c o u l dexpress Eq . 2 i n t h ef o r m :

VbE Vaof ( t )

1 + a o f ( t ) [ 1+ a o f ( t ) ] [ 1+ Pog ( t ) ] [2aJ

The i m p o r t a n to b s e r v a t i o ni s t h a t a t i m e - d e p e n d e n tresponse c om -p o n e n td u e t o t h i sa r t i f a c tc o u l do c c u r o n l yd u r i n gt h e a p p l i c a t i o no ft h e d c b i a s v o l t a g eV . O b s e r v a t i o no f a l l d a t a c l e a r l yi n di c at e s t h epresence o f a m e c h a n o m o t i l eresponse i n t h e a b s e n c e o fV . E s t i m a -t i o no f s h un tc u r r e n tm a g n i t u d e sr e q u i r e dt o a r t i f a c t u a l l yp r o d u c et h ea c responses seen i s a l s o i n c o m p a t i b l ew i t h o u r m e a s u r e m e n t s .

We t h a n ko u r c o l l e a g u e B r i a n C l a r kf o rs o f t w a r ea n d h a r d w a r ed e v e l o p m e n t ;R a l p hWi l l e n( T e c h n i c a lP r o d u c t s ,I n c . ) ,R o nO v e r -a k er ( R es e a r c hI n s t r u m e n t s ,I n c . ) ,a n dR o nL e p i n s k i( N o r t h w e s tU n i v e r s i t y )f o rd e v e l o p m e n to fme c h a n i c a li n s t r u m e n t a t i o n ;a n dR o b e r tH u g h e s( N u h s b a u m ,I n c . )f o r t e c h n i c a la s s i s t a n c e .D r s .M. A . C h e a t h a m ,S .M . E c h t e l e r ,J . H . S i e g e l ,a n d I . S z i k l a ia r et h a n k e df o rh e l p f u ls u g g e s t i o n s .T h i sw o r kw a s s u p p o r t e db y N a -t i o na l I n s t i tu t e so fH ea l t h G r a n tD C 0 0 7 0 8a n dt h eAm e r i c a nH e a r i n gR e s e a r c hF o u n d a t i o n .

1 .

2 .3 .

4 .5 .6 .7 .

8 .

9 .1 0 .1 1 .1 2 .

1 3 .

1 4 .

1 5 .

1 6 .

1 7 .1 8 .

1 9 .2 0 .

2 1 .

2 2 .

2 3 .

2 4 .

2 5 .2 6 .

2 7 .2 8 .

2 9 .

3 0 .

3 1 .3 2 .

3 3 .3 4 .

3 5 .

3 6 .

3 7 .3 8 .

3 9 .4 0 .4 1 .4 2 .4 3 .

4 4 .

D a l l o s ,P . ( 1 9 8 5 )i n C o n t e m p o r a r yS e n s o r yN e u r o b i o l o g y ,e d s .C o r r e i a ,M . J . & P e r a c c h i o ,A . A . ( L i s s ,N ew Yo r k ) ,p p .2 0 7 - 2 3 0K i m ,D . 0 . ( 1 9 8 6 )H e a r i n gRe s . 2 2 ,1 0 5 - 1 1 4 .D a l o s ,P . ( 1 9 8 8 )i nF u n c t i o n so f t h eA u d i t o r yS y s t e m ,e d s .E d e l m a nG . M. ,Ga l l ,E .W .&C o w a n ,W .M . ( W i l e y ,NewYo r k ) ,p p .1 5 3 - 1 8 8D a l o s ,P . ( 1 9 9 2 )J . N e u r o s c i .1 2 ,4 5 7 5 - 4 5 8 5 .S p o e n d l i n ,H . ( 1 9 6 9 )A c t aO t o - L a r y n g o l .6 7 ,2 3 9 - 2 5 4 .We i s s ,T .F . ( 19 82 )H e a r i n gRe s . 7 , 3 5 3 - 3 6 0 .B r o w n e l l ,W .E . ,B a de r , C .R . ,B e r t r a n d ,D. & d e R i b a u p i e r r e ,Y .( 1 9 8 5 )S c i e n c e2 2 7 ,1 9 4 - 1 9 6 .K a c h a r ,B . ,B r o w n e l l ,W. E . ,A l t s c h u l e r ,R . A . & F e x , J . ( 1 9 8 6 )N a t u r e( L o n d o n )3 2 2 ,3 6 5 - 3 6 8 .A s h m o r e ,J . F . ( 1 9 8 7 )J . P h y s i o l .( L o n d o n )3 8 8 ,3 2 3 - 3 4 7 .S a n t o s - S a c c h i ,J .&D i l g e r ,D. P . ( 1 9 8 8 )H e a r i n gRe s . 3 5 ,1 4 3 - 1 5 0Z e n n e r ,H. P . ( 1 9 8 6 )H e a r i n gRe s . 2 2 ,8 3 - 9 0 .M ou n ta i n , D .C . ,H u b b a r d ,A . E . & McMu l l e n ,T .A . ( 1 9 8 3 )i nM e c h a n i c so fH e a r i n g ,e d s .d e B o e r ,E. &Vi e r g e v e r ,M . A . ( D e l f tU n i v .P r e s s ,D e l f t ,T h eN e t h e r l a n d s ) ,p p .1 1 9 - 1 2 6 .E v a n s ,B .N . & D a l l o s ,P . ( 1 9 9 3) A b s t r .A s s o c .R e s .O t o l a r y n g o1 6 ,1 1 6 .D a l l o s ,P . , S a n t o s - S a c c h i ,J . & F l o c k ,A . ( 1 9 8 2 )S c i e n c e2 1 8 ,5 8 2 - 5 8 5 .E v a n s , B .N . ,D a l o s , P . & H a l l w o r t h ,R . ( 1 9 8 9 )i n C o c h l e a rM e c h a n i s m s ,e d s .Wi l s o n ,J . P .& K e m p ,D. T .( P l e n um ,L o n d o n ) ,p p .2 0 5 - 2 0 6 .B a y l o r ,D. A . ,L a m b ,T .D . & Ya u , K . - w . ( 1 9 7 9 )J . P h y s i o l .( L o n d o n )2 8 8 ,5 8 9 - 6 1 1 .S a n t o s - S a c c h i ,J . ( 1 9 9 2 )J . N e u r o s c i .1 2 ,1 9 0 6 - 1 9 1 6 .E v a n s ,B .N . , H a l lw o r t h ,R. & Da b o s ,P . ( 1 9 9 1 )H e a r i n gRe s . 5 2 ,2 8 8 - 3 0 4 .D i n g ,J . P . ,S a l v i ,R. J .& S a c h s ,F .( 1 9 9 1 )H e a r i n gRe s . 5 6 ,1 9 - 2 8 .I w a s a ,K . H . ,L i ,M. , J i a ,M . & K a c h a r ,B . ( 1 9 9 1 )N e u r o s c i .L e t t .1 3 3 ,1 7 1 - 1 7 4 .B r u n d i n ,L . ,F l o c k ,A .& C a n l o n ,B .( 1 9 8 9 )N a t u r e( L o n d o n )3 4 2 ,8 1 4 - 8 1 6 .S a u n d e r s ,J . C .& S z y m k o ,Y . M . ( 1 9 8 9 )i nC o c h l e a rMe c h a n i s m s ,e d s .Wi l s o n ,J . P .& K e m p ,D . T .( P l e n u m ,L o n d o n ) ,p p .1 3 5 - 1 4 2 .H u d s p e t h ,A . J .& J a c o b s ,R . ( 1 9 7 9 )P r o c .N a t l .A c a d .S c i .USA7 6 ,1 5 0 6 - 1 5 0 9 .C l a r k ,B . A . ,H a l l w o r t h ,R . & E v a n s ,B .( 1 9 9 0 )P f l a g e r sA r c h .4 1 5 ,4 9 0 - 4 9 3 .D a l l o s ,P . ( 1 9 8 3 )H e a r i n gR e s . 1 2 ,8 9 - 1 1 9 .R o b e r t s ,W .M. , J a c o b s ,R. A . & H u d s p e t h ,A . J . ( 1 9 9 0 )J . N e u -r o s c i .1 0 ,3 6 6 4 - 3 6 8 4 .S a n t o s - S a c c h i ,J . ( 1 9 8 9 )J . N e u r o s c i .9 ,2 9 5 4 - 2 9 6 2 .A s h m o r e ,J . F . & M e e c h ,R. W . ( 1 9 8 6 )N a t u r e ( L o n d o n )3 2 2 ,3 6 8 - 3 7 1 .H u d s p e t h ,A . J .& C o r e y ,D . P . ( 1 9 7 7 )P r o c .N a t l .A c a d .S c i .USA7 4 ,2 4 0 7 - 2 4 1 1 .H o u s l e y ,G . D . & A s h m o r e ,J . F . ( 1 9 9 2 )J . P h y s i o l .( L o n d o n )4 4 8 ,7 3 - 9 8 .O hm o r i ,H . ( 1 9 8 4 )J . P h y s i o l .( L o n d o n )3 5 0 ,5 6 1 - 5 8 1 .E a t o c k ,R. A . ,S a e k i ,M . & H u t z l e r ,M . J . ( 1 9 9 3 )J . N e u r o s c i .1 3 ,1 7 6 7 - 1 7 8 3 .S a n d ,0 . ( 1 9 7 5 )J . C o m p .P h y s i o l .1 0 2 ,2 7 - 4 2 .C o r e y ,D . P . & H u d s p e t h ,A . J . ( 1 9 7 9 )N a t u r e ( L o n d o n )2 8 1 ,6 7 5 - 6 7 7 .C r a w f o r d ,A . C . ,Ev a n s ,M . G . & F e t t i p l a c e ,R. ( 1 9 9 1 )J . P h y s i o l .( L o n d o n )4 3 4 ,3 6 9 - 3 9 8 .A s s a d ,J . A . ,S h e p h e r d ,G . M . G . &C o r e y ,D. P . ( 1 9 9 1 )N e u r o n7 ,9 8 5 - 9 9 4 .O hm o r i ,H . ( 1 9 8 5 )J . P h y s i o l .( L o n d o n )3 5 9 ,1 8 9 - 2 1 7 .K r o e s e ,A . B . A . ,Da s ,A . & Hu d s p e t h ,A . J . ( 1 9 8 9 )H e a r i n gR e s .3 7 ,2 0 3 - 2 1 7 .A s h m o r e ,J . F . ( 1 9 9 0 )N e u r o s c i .Re s . 1 2 ,( S u p p l . ) ,3 9 - 5 0 .Hu d s p e t h ,A . J . ( 1 9 8 9 )N a t u r e( L o n d o n )3 4 1 ,3 9 7 - 4 0 4 .F l o c k ,A .( 1 9 6 4 )J . C e l lB i o l .2 2 ,4 1 3 - 4 3 2 .R u s s e l l ,I . J . & R i c h a r d s o n ,G . P . ( 1 9 8 7 )H e a r i n gR e s . 3 1 ,9 - 2 4 .A s h m o r e ,J . F . ( 1 9 9 1 )i nS e n s o r yT r a n s d u c t i o n ,e d s .C o r e y ,D . P .& Ro p e r ,S .D . ( R o c k e f e l l e rU n i v .P r e s s ,New Yo r k ) ,p p .3 9 6 - 4 1 2 .Da l l o s ,P . ,E v a n s ,B . N . & H a l l w o r t h ,R . ( 1 9 9 1 )N a t u r e( L o n d o n )3 5 0 ,1 5 5 - 1 5 7 .

Ne u r o b i o l o g y :E v a n sa n dD a l l o s