spektrofotometrie - ulbld.lf1.cuni.cz

UacuteSTAV LEacuteKAŘSKEacute BIOCHEMIE A LABORATORNIacute DIAGNOSTIKY 1 LF UK

Spektrofotometrie

Praktickeacute cvičeniacute z leacutekařskeacute biochemie

Všeobecneacute leacutekařstviacute

20182019

2

Obsah

Uacutevod do spektrofotometrie Iva Subhanovaacute

Zaacutekladniacute pojmy ve spektrofotometrii 3

Kvalitativniacute a kvantitativniacute analyacuteza 12

Aplikace a limitace spektrofotometrie 16

Barevnost komplexů 18

3

Spektrofotometrie je v současnosti nejviacutece využiacutevanou laboratorniacute technikou v klinickeacute

biochemii je metodou prvniacute volby při analyacuteze laacutetek ktereacute jsou samy barevneacute nebo mohou

reagovat za tvorby barevneacuteho produktu Pokud se laacutetky nachaacutezejiacute ve vyšetřovaneacutem

materiaacutelu v menšiacutem množstviacute než bychom dokaacutezali spektrofotometricky stanovit nebo ve

směsi se strukturně podobnyacutemi laacutetkami ktereacute by vzaacutejemně analyticky interferovaly voliacute se

jineacute např imunochemickeacute či chromatografickeacute techniky Avšak i tyto citlivějšiacute metody jsou

často na spektrofotometrii zaacutevisleacute ndash mohou ji využiacutevat jako naacuteslednyacute detekčniacute systeacutem

Zaacutekladniacute pojmy ve spektrofotometrii

Absorbance (A) - udaacutevaacute množstviacute světla pohlceneacuteho měřenyacutem roztokem

Absorpce světla - pohlceniacute a zeslabeniacute zaacuteřeniacute při průchodu měřenyacutem roztokem

Absorpčniacute spektrum - zaacutevislost absorbance na vlnoveacute deacutelce λ A = f (λ)

Atest - znaacutemaacute hodnota standardu stanovenaacute nezaacutevislou metodikou

Auxochrom - skupina atomů s volnyacutem elektronovyacutem paacuterem kteraacute zvyšuje absorpci chromoforu

Blank (slepyacute vzorek) - roztok obsahujiacuteciacute všechny složky kromě analyzovaneacuteho vzorku (reagenčniacute

blank) nebo jen vzorek bez reagenciiacute (vzorkovyacute blank)

Chromofor - skupina (seskupeniacute atomů) v molekule kteraacute způsobuje absorpci v UV-VIS oblasti

Kalibračniacute křivka - zaacutevislost absorbance na koncentraci A = f (c)

Standard - vzorek analytu o znaacutemeacute koncentraci daneacute atestem

Transmitance (T) - propustnost - poměr intenzity zaacuteřeniacute prošleacuteho vzorkem a zaacuteřeniacute vstupujiacuteciacuteho

Do vzorku

UV-VIS - ultrafialovaacute a viditelnaacute čaacutest elektromagnetickeacuteho spektra

4

Vidiacuteme-li 2 roztoky stejneacute laacutetky o různeacute intenzitě zbarveniacute automaticky předpoklaacutedaacuteme že

tmavšiacute roztok je viacutece koncentrovanyacute Tento předpoklad je vlastně podstatou

spektrofotometrie Pokud viacuteme kolik světla roztoky prochaacuteziacute můžeme zjistit jakou majiacute

koncentraci Množstviacute prochaacutezejiacuteciacuteho světla můžeme analyzovat spektrofotometrem na

principu molekuloveacute absorpčniacute spektrofotometrie

Molekulovaacute absorpčniacute spektrofotometrie

Patřiacute do spektroskopickyacutech metod sledujiacuteciacutech interakci (vyacuteměnu energie) mezi molekulami

a elektromagnetickyacutem zaacuteřeniacutem z jineacuteho zdroje ndash absorpci rozptyl nebo odraz zaacuteřeniacute

Spektrofotometrie je zaměřena na absorpci zaacuteřeniacute ndash tedy podiacutel zaacuteřeniacute ktereacute je při

průchodu roztokem selektivně absorbovaacuteno (pohlceno) a propouštěno Pracuje se

zředěnyacutemi čiryacutemi roztoky čiacutemž eliminuje odraz a rozptyl

(Spektroskopickyacutemi metodami zaměřenyacutemi na odraz a rozptyl zaacuteřeniacute se budeme rovněž zabyacutevat - turbidimetriiacute

v praktiku věnovaneacutem imunochemii a reflexniacute fotometriiacute při analyacuteze moče)

Molekulovaacute absorpčniacute spektrofotometrie v UVVIS oblasti

Molekulovaacute absorpčniacute spektrometrie v ultrafialoveacute a viditelneacute oblasti měřiacute absorpci

elektromagnetickeacute zaacuteřeniacute v rozsahu vlnovyacutech deacutelek od 200 do 800 nm Laacutetky ktereacute se jeviacute

jako bezbarveacute absorbujiacute zaacuteřeniacute o vlnovyacutech deacutelkaacutech do 380 nm Laacutetky ktereacute se jeviacute jako

barevneacute absorbujiacute zaacuteřeniacute v rozsahu vlnovyacutech deacutelek 380 nm až 770 nm Absorpciacute zaacuteřeniacute měniacute

molekuly svoji energii o hodnotu energie dopadajiacuteciacuteho fotonu - dochaacuteziacute k přechodu

valenčniacutech elektronů na vyššiacute energetickou hladinu (viz obr 1)

Obr 1 Energetickeacute hladiny molekuly Absorpciacute energie fotonu vhodneacute vlnoveacute deacutelky dochaacuteziacute

k přechodu valenčniacutech elektronů ze zaacutekladniacuteho (E1) do excitovaneacuteho stavu (E2)

Maacute-li molekula přejiacutet ze stavu s nižšiacute energiiacute do stavu sfotonu (o vlnoveacute deacutelce λ a frekvenci hladinami E2 a E1

E2 = energie excitovaneacute hladiny

h = Planckova konstanta (6626

ṽ = frekvence (Hz)

Vlnovaacute deacutelka absorbovaneacuteho světla je nepřiacutemo uacuteměrnaacute

c = rychlost světla (3∙108 ms)

λ = vlnovaacute deacutelka (nm)


Ze zaacutevislostiacute (1) a (2) vyplyacutevaacute že inverzniacute - čiacutem kratšiacute vlnovou deacutelku molekula absorbuje tiacutem vyššiacute energii pro přechod

elektronu ziacuteskaacute

Obr 3 VIS spektrum Fotony o kratšiacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (modreacute světlo) majiacute vyššiacute energii než fotony o delšiacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech httpscswikipediaorgwikiElektromagnetickC3A9_spektrummediaFileSpectresvg

Nejvyacuteznamnějšiacute přechody valenčniacutech elektronů

π ndash π (z π vazebnyacutech orbitalů do a trojnyacutemi vazbami

n ndash π (z n nevazebnyacutech do vazby přiacutetomen takeacute atom s volnyacutem elektronovyacutem paacuterem

Obr 4 Přechody valenčniacutech elektronů nebo viditelneacute oblasti zaacuteřeniacute je přiacutetomnost vazebnyacutechorbitalech anebo nepaacuterovyacutech elektronů v nevazebnyacutech httpwwwchemguidecoukanalysisuvvisibletheoryhtml

li molekula přejiacutet ze stavu s nižšiacute energiiacute do stavu s vyššiacute energiiacute musiacute absorbovat frekvenci ṽ) kteraacute odpoviacutedaacute rozdiacutelu energiiacute mezi energetickyacutemi

ΔE = E2 ndash E1 = h ∙ ṽ

= energie excitovaneacute hladiny E1 = energie zaacutekladniacute hladiny (eV)

Planckova konstanta (6626 10-34 J s)

lnovaacute deacutelka absorbovaneacuteho světla je nepřiacutemo uacuteměrnaacute jeho frekvenci λ = c

ms)

vyplyacutevaacute že vztah energie k vlnoveacute deacutelce absorbovaneacuteho světla je vlnovou deacutelku molekula absorbuje tiacutem vyššiacute energii pro přechod

o kratšiacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (modreacute světlo) majiacute vyššiacute energii než fotony o delšiacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (červeneacute světlo) (Upraveno dle httpscswikipediaorgwikiElektromagnetickC3A9_spektrummediaFileSpectresvg

vyacuteznamnějšiacute přechody valenčniacutech elektronů jsou

vazebnyacutech orbitalů do π antivazebnyacutech orbitalů) ndash sloučeniny s

nevazebnyacutech do π antivazebnyacutech orbitalů) v molekule je kromě dvojneacute vazby přiacutetomen takeacute atom s volnyacutem elektronovyacutem paacuterem

Přechody valenčniacutech elektronů Podmiacutenkou aby sledovanaacute laacutetka absorbovala v ultrafialoveacute nebo viditelneacute oblasti zaacuteřeniacute je přiacutetomnost vazebnyacutech π elektronů ve vazebnyacutech molekulovyacutech

nepaacuterovyacutech elektronů v nevazebnyacutech molekulovyacutech orbitalechhttpwwwchemguidecoukanalysisuvvisibletheoryhtml)

5

musiacute absorbovat energii kteraacute odpoviacutedaacute rozdiacutelu energiiacute mezi energetickyacutemi

(1)

λ = c ṽ (2)

vlnoveacute deacutelce absorbovaneacuteho světla je vlnovou deacutelku molekula absorbuje tiacutem vyššiacute energii pro přechod

o kratšiacutech vlnovyacutech deacutelkaacutech (modreacute světlo) majiacute vyššiacute energii než

httpscswikipediaorgwikiElektromagnetickC3A9_spektrummediaFileSpectresvg)

sloučeniny s dvojnyacutemi

v molekule je kromě dvojneacute

Podmiacutenkou aby sledovanaacute laacutetka absorbovala v ultrafialoveacute elektronů ve vazebnyacutech molekulovyacutech

molekulovyacutech orbitalech (Upraveno dle

Skupiny v molekule ktereacute umožňujiacute absorpci n

prvky nebo funkčniacute skupiny obsahuj

Na chromofor se mohou navaacutezat

paacuterem ndash tzv auxochromy

barevnost ndash posunujiacute absorpci k

Čiacutem vyššiacute je konjugace dvojnyacutech vazeb

antivazebneacuteho orbitalu a tiacutem vyššiacute vlnovaacute deacutelka

Obr 5 Konjugaciacute dvojnyacutech vazeb se snižuje energie pořebnaacute ktřemi dvojnyacutemi vazbami bude kdvěma volnyacutemi vazbami Obě sloučeninydvojnou vazbou Tomu odpoviacutedajiacute i absorbovaneacute vlnoveacute deacutelky Ethen maximaacutelně absorbuje při nejkratšiacute vlnoveacute deacutelce 177 nm 258 nm (Upraveno dle httpwwwchemguidecoukanalysisuvvisibletheoryhtml

Z obraacutezku 5 je zřejmeacute že 3 dvojneacute vazby hexatrienuspektru Aby byla laacutetka barevnaacute (absorbovala zaacuteřeniacute ve VIS) musiacute obsahovat rozsaacutehlejšiacute systeacutemy konjugovanyacutech dvojnyacutech vazeb pro ktereacute je typickaacute

Vysoce delokalizovaneacute systeacutemy posunou

(tj z UV do VIS) Čiacutem je vyššiacute rozsah

Např oranžovou barvu beta karotenu vidiacuteme diacuteky konjugovan

vazeb (viz obr 6)

Obr 6 Delokalizovaneacute elektrony beta karotenu (Upraveno dle httpwwwchemguidecoukanalysisuvvisibletheoryhtml

Dalšiacutem přiacutekladem delokalizovanyacutech elektronů mohou byacutet

trifenylmethanu s asymetrickyacutemi substituenty

kvantitativniacute analyacuteze jsme použiacutevali jako indikaacutetor

v kyseleacutem prostřediacute bezbarvyacute

prostřediacute (absorbuje 553 nm)

systeacutemu fenolftaleinu Barevnaacute forma

tereacute umožňujiacute absorpci nazyacutevaacuteme chromofory

obsahujiacuteciacute naacutesobneacute (hlavně dvojneacute) vazby

Na chromofor se mohou navaacutezat substituenty nebo skupiny atomů s volnyacutem elektronovyacutem

ktereacute v konjugaci π-elektronovyacutem chromoforem zvyšujiacute jeho

posunujiacute absorpci k delšiacutem vlnovyacutem deacutelkaacutem

vyššiacute je konjugace dvojnyacutech vazeb vazeb tiacutem nižšiacute energie je pořeba k

vyššiacute vlnovaacute deacutelka se absorbuje (viz obr 5)

Konjugaciacute dvojnyacutech vazeb se snižuje energie pořebnaacute k přechodu elektronu třemi dvojnyacutemi vazbami bude k přechodu elektronů potřebovat meacuteně energie než

volnyacutemi vazbami Obě sloučeniny potřebujiacute menšiacute množstviacute energie než ethen sdvojnou vazbou Tomu odpoviacutedajiacute i absorbovaneacute vlnoveacute deacutelky Ethen maximaacutelně absorbuje při nejkratšiacute vlnoveacute deacutelce 177 nm 13-butadien při 217 a 135-hexatrien při nejdelšiacute vlnoveacute deacutelce

httpwwwchemguidecoukanalysisuvvisibletheoryhtml

3 dvojneacute vazby hexatrienu nedostačujiacute na absorpci ve viditelneacutem Aby byla laacutetka barevnaacute (absorbovala zaacuteřeniacute ve VIS) musiacute obsahovat rozsaacutehlejšiacute

systeacutemy konjugovanyacutech dvojnyacutech vazeb pro ktereacute je typickaacute delokalizace elektronů

delokalizovaneacute systeacutemy posunou maximum absorpce k vyššiacutem vlnovyacutem deacutelkaacutem

Čiacutem je vyššiacute rozsah delokalizace tiacutem delšiacute vlnoveacute deacutelky jsou absorbovaacuteny

Např oranžovou barvu beta karotenu vidiacuteme diacuteky konjugovaneacutemu systeacutemu

Delokalizovaneacute elektrony beta karotenu (zvyacuterazněny červeně) s absorpciacute ve httpwwwchemguidecoukanalysisuvvisibletheoryhtml)

Dalšiacutem přiacutekladem delokalizovanyacutech elektronů mohou byacutet organickaacute barviva na baacutezi

asymetrickyacutemi substituenty V praktickeacutem cvičeniacute věnovan

kvantitativniacute analyacuteze jsme použiacutevali jako indikaacutetor acidobazickeacute titrace fenolftalein

kyseleacutem prostřediacute bezbarvyacute (absorbuje v UV oblasti) a barevnyacute pouze

prostřediacute (absorbuje 553 nm) Změna pH maacute vliv na změnu konjugovaneacuteho chromoformiacuteho

Barevnaacute forma v alkalickeacutem prostřediacute vznikaacute diacuteky

6

Jsou to strukturniacute

volnyacutem elektronovyacutem

chromoforem zvyšujiacute jeho

je pořeba k přechodu do

přechodu elektronu 135-hexatrien se přechodu elektronů potřebovat meacuteně energie než 13-butadien se

potřebujiacute menšiacute množstviacute energie než ethen s jednou dvojnou vazbou Tomu odpoviacutedajiacute i absorbovaneacute vlnoveacute deacutelky Ethen maximaacutelně absorbuje při

při nejdelšiacute vlnoveacute deacutelce httpwwwchemguidecoukanalysisuvvisibletheoryhtml)

nedostačujiacute na absorpci ve viditelneacutem Aby byla laacutetka barevnaacute (absorbovala zaacuteřeniacute ve VIS) musiacute obsahovat rozsaacutehlejšiacute

delokalizace elektronů

vyššiacutem vlnovyacutem deacutelkaacutem

delokalizace tiacutem delšiacute vlnoveacute deacutelky jsou absorbovaacuteny

eacutemu systeacutemu 11 dvojnyacutech

absorpciacute ve VIS (470 nm)

organickaacute barviva na baacutezi

cvičeniacute věnovaneacutem

fenolftalein kteryacute je

arevnyacute pouze v alkalickeacutem

Změna pH maacute vliv na změnu konjugovaneacuteho chromoformiacuteho

diacuteky vyššiacutemu stupni

7

delokalizace elektronů kteryacute posune absorpci k vyššiacutem vlnovyacutem deacutelkaacutem (viz obr 7)

Obr 7 Fenolftalein v kyseleacutem a zaacutesaditeacutem prostřediacute V kyseleacutem prostřediacute braacuteniacute uhliacutekovyacute atom se 4

jednoduchyacutemi vazbami interakci 3 delokalizovanyacutech systeacutemů v zaacutesaditeacutem prostřediacute se po odštěpeniacute 2

protonů otevře laktamovyacute kruh a delokalizovanyacute systeacutem elektronů se rozšiacuteřiacute na celyacute systeacutem

(zvyacuterazněno červeně) což se projeviacute posunem absorpce do viditelneacute oblasti spektra (Upraveno dle

httpwwwchemguidecoukanalysisuvvisibletheoryhtml)

Fenolftalein tedy absorbuje vlnoveacute deacutelky zeleneacute oblasti spektra (553 nm) a zbarviacute se doplňkovou (komplementaacuterniacute) barvou (v jejiacutemž spektru absorbovaneacute vlnoveacute deacutelky chybiacute)

Obr 8 Absorpce fenolftaleinu ve VIS(Upraveno dle


Průhlednaacute laacutetka maacute barvu odpoviacutedajiacuteciacute zaacuteřeniacute ktereacute neabsorbuje ale propouštiacute (ktereacute projde roztokem až k našemu oku) Znamenaacute to že pokud je z biacuteleacuteho světla absorbovaacutena určitaacute

vlnovaacute deacutelka naše oči detekujiacute směs všech ostatniacutech vlnovyacutech deacutelek viditelneacuteho spektra jako komplementaacuterniacute barvu Komplementaacuterniacute barvy světla jsou takoveacute ktereacute po smiacutechaacuteniacute daacutevajiacute biacuteleacute světlo (to ovšem neplatiacute u barev na maliacuteřskeacute paletě ndash pokud bychom smiacutechali zelenou a červenou rozhodně nedostaneme biacutelou) K barevneacutemu roztoku jehož koncentraci budeme spektrofotometricky zjišťovat voliacuteme vlnovou deacutelku vhodnou k analyacuteze jako komplementaacuterniacute k barvě roztoku

Otestovat si sveacute vniacutemaacuteniacute komplementaacuterniacutech barev můžete na

httpsscilearnsydneyeduaufychemistrycalculatorscolour_wheelshtml

8

Lambert-Beerův zaacutekon

Pokud budeme spektrofotometricky měřit koncentraci roztoku budeme analyzovat kolik

světla roztokem prochaacuteziacute Prochaacuteziacute-li světelnyacute paprsek roztokem kteryacute čaacutest světla absorbuje

je intenzita paprsku vstupujiacuteciacuteho vyššiacute než intenzita paprsku prošleacuteho

Obr 9 Transmitance (Dle Heesung Shim) httpschemlibretextsorgCorePhysical_and_Theoretical_ChemistryKineticsReaction_RatesExperimental_Determination_of_KinetcsSpectrophotometry)

Zajiacutemaacute naacutes poměr obou veličin (poměr vstupniacuteho světla I0 k propuštěneacutemu I1)

Tento poměr udaacutevaacute transmitance T (propustnost) T = I1 I0

Maacuteme-li tedy 2 roztoky laacutetky o různeacute koncentraci potom platiacute že

I0 gt I1 gt I2

Čiacutem vyššiacute bude koncentrace roztoku tiacutem většiacute šanci maacute prochaacutezejiacuteciacute foton že bude absorbovaacuten Pravděpodobnost jeho absorpce bude růst s koncentraciacute

Maacuteme-li 2 roztoky teacuteže laacutetky stejneacute barvy a stejneacute intenzity zbarveniacute a jeden umiacutestiacuteme do delšiacute kyvety než druhyacute budou se lišit pouze v draacuteze kterou musiacute foton roztokem projiacutet Pokud sviacutetiacuteme světlem stejneacute intenzity na obě kyvety delšiacute kyvetou světlo prochaacuteziacute deacutele než v užšiacute potom platiacute že

I0 gt I2 gt I3

Čiacutem deacutele bude foton prochaacutezet tiacutem většiacute maacute šanci že bude absorbovaacuten V širšiacute kyvetě bude jeho draacuteha i absorpce vyššiacute Pravděpodobnost jeho absorpce bude růst s deacutelkou draacutehy

Absorpce fotonu tedy roste s rostouciacute koncentraciacute i deacutelkou draacutehy

9

Transmitance barevneacuteho roztoku pro určitou vlnovou deacutelku zaacutevisiacute na

vlastnostech absorbujiacuteciacute laacutetky

koncentraci absorbujiacuteciacute laacutetky

deacutelce draacutehy (kyvety)

Tyto předpoklady vyjadřuje Lambert-Beerův zaacutekon T = 10 -ε ∙ c ∙ l (3)

ε = molaacuterniacute absorpčniacute koeficient (dm3molcm) = charakterizujiacuteciacute miacuteru absorpce laacutetky při

určiteacute vlnoveacute deacutelce v roztoku o koncentraci 1 moll v 1 cm kyvetě

c = koncentrace rozpuštěneacute laacutetky (moll)

l = tloušťka absorbujiacuteciacute vrstvy (cm)

Lambert-Beerův zaacutekon platiacute jen pro monochromatickeacute zaacuteřeniacute a zředěneacute roztoky o koncentraci lt10-2 moll ve kteryacutech rozpuštěneacute čaacutestice nepodleacutehajiacute žaacutednyacutem interakciacutem a v roztoku je jen jedna absorbujiacuteciacute složka

Ze zaacutevislosti (3) vyplyacutevaacute že transmitance T je exponenciaacutelně zaacutevislaacute na koncentraci laacutetky Pro vyjaacutedřeniacute zaacutevislosti absorpce zaacuteřeniacute na koncentraci absorpčniacute složky je vhodneacute vztah logaritmovat čiacutemž se z exponenciaacutelniacute zaacutevislosti stane lineaacuterniacute

Byla zavedena bezrozměrnaacute veličina absorbance (A) kteraacute kvantitativně vyjadřuje absorpci světla chromoforem (je-li nulovaacute absorpce je nulovaacute i absorbance s rostouciacute absorpciacute roste i absorbance)

A = ndash log(T) = ε c l (4)

Absorbance a transmitance jsou tedy v inverzniacutem vztahu ndash čiacutem viacutece roztok světlo absorbuje tiacutem meacuteně ho propouštiacute Transmitance nabyacuteva hodnot od 0 (nepropustnyacute vzorek) do 1 (zcela propustnyacute vzorek) Absorbance nabyacutevaacute hodnot od 0 (vzorek neabsorbuje) do infin (absorbuje veškereacute zaacuteřeniacute daneacute vlnoveacute deacutelky) Pro praktickeacute měřeniacute majiacute z hlediska jeho přesnosti vyacuteznam jen hodnoty absorbance nepřekračujiacuteciacute hodnotu 1

Platiacute-li vztah (4) že A = ε c l (a koeficient (ε) i deacutelka draacutehy (l) jsou konstantniacute) potom platiacute že absorbance roztoku je lineaacuterně zaacutevislaacute na jeho koncentraci A = f (c)

Pomociacute Lambert-Beerova zaacutekona tedy můžeme kvantitativně stanovit koncentraci laacutetky

v roztoku měřeniacutem jeho absorbance s využitiacutem spektrofotometru

10

Měřeniacute na spektrofotometru

Měřeniacute provaacutediacuteme vždy v teacuteže kyvetě aby byly dodrženy stejneacute podmiacutenky Nejprve

změřiacuteme blank tedy nastaviacuteme nulovou absorbanci roztoku blanku čiacutemž ziacuteskaacuteme bdquobaselineldquo

pro měřeniacute všech standardů i vzorků Tato bdquobaselineldquo musiacute zůstat stejnaacute po celou dobu

měřeniacute nejsme-li si jistiacute změřiacuteme v průběhu analyacutez blank jako vzorek ndash měl by ukazovat

nulovou absorbanci Blank obsahuje jen reagenčniacute směs bez analyzovaneacuteho vzorku Je to tzv

reagenčniacute blank použiacutevaacute se ke kompenzaci vlivu reagenciiacute (Roztok blanku může byacutet

barevnyacute maacuteme-li barevneacute činidlo)

U některyacutech měřeniacute absorbujiacute-li silně složky matrice analytu (seacuterum moč) se použiacutevaacute

rovněž tzv vzorkovyacute blank kteryacute kompenzuje vliv matrice vzorku Vzorkovyacute blank je jen

vzorek doplněnyacute vodou nebo fyziologickyacutem roztokem do celkoveacuteho objemu reakčniacute směsi

neobsahuje reagencie Naměřenaacute absorbance vzorkoveacuteho blanku se odečiacutetaacute od absorbance

přiacuteslušneacuteho vzorku

Spektrofotometr umožňuje měřit absorbance až do 25 vzorky s vyššiacute absorbanciacute se musiacute

ředit a vyacutesledek naacutesobit faktorem ředěniacute V laboratorniacute praxi se při kvantitativniacute analyacuteze

standardně řediacute vzorky s absorbanciacute nad 10 neboť měřeniacute absorbanciacute nad tuto hodnotu je

zatiacuteženo velkou chybou - viz Přesnost fotometrickyacutech metodprůměrnaacute chyba fotometrickeacuteho

stanoveniacute httpwwwwikiskriptaeuwSpektrofotometrie

Stanoveniacute koncentrace pomociacute spektrofotometrie

Nejprve musiacuteme naleacutezt optimaacutelniacute vlnovou deacutelku při ktereacute budeme měřeniacute provaacutedět

Teoreticky bychom mohli měřit při libovolneacute vlnoveacute deacutelce kteraacute je absorbovaacutena v oblasti

maximaacutelniacute absorpce je však měřeniacute nejcitlivějšiacute - molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε je nejvyššiacute a

změny koncentrace jsou zde nejviacutece patrneacute (viz obr11)

Obr 11 Absorpčniacute spektrum manganistanu draselneacuteho (KMnO4) při dvou různyacutech koncentraciacutech Obě spektra majiacute podobnyacute tvar se shodnou vlnovou deacutelkou maximaacutelniacute absorpce (charakterizuje danou laacutetku) Zjištěniacute koncentrace je při vlnoveacute deacutelce absorpčniacuteho maxima nejcitlivějšiacute - jsou nejviacutece patrneacute změny koncentrace (Upraveno dle employeesoneontaedukotzjcLABSpec_intropdf)

Proměřiacuteme si tedy absorpčniacute spektrum v

Absorpčniacute spektrum je zaacutevislost

jednoznačnou na koncentraci nezaacutevislou charakteristikou barevneacute laacutetky Pomociacute absorpčniacuteho

spektra zjišťujeme optimaacutelniacute vlnovou deacutelku pro měřeniacute koncentrace laacutetky Vlnovou deacutelku při

ktereacute absorpce dosahuje maxima označujeme jako

Měřeniacute při absorpčniacutem maximu laacutetky

nejnižšiacute koncentrace absorbujiacuteciacute laacutetky

absorbujiacute při stejneacute vlnoveacute

jednotlivyacutech složek ve směsi

bliacutezko nelze koncentraci laacutetky stanovit bez jejiacute separace (např chromatografiiacute)

Obr 12 Absorpčniacute spektrum (

httpscommonswikimediaorgwikiFileSpectrale_gevoeligheid_kegeltjespng

Pokud provedeme měřeniacute absorbance při můžeme několika způsoby

1 Teoreticky je možneacute

znaacuteme-li z literatury molaacuterniacute absorpčniacute

koeficient se může lišit od

Rovněž musiacuteme při tomto způsobu použiacutet přesně danou

roměřiacuteme si tedy absorpčniacute spektrum v celeacutem rozsahu vlnovyacutech deacutelek (např 300

Absorpčniacute spektrum

Absorpčniacute spektrum je zaacutevislost absorbance na vlnoveacute deacutelce A = f (λ) Tato z



osahuje maxima označujeme jako λmax (lambda max)

absorpčniacutem maximu laacutetky je maximaacutelně citliveacute umožňuje stanovit fotometricky

koncentrace absorbujiacuteciacute laacutetky Jsou-li v roztoku přitomny dalšiacute složky ktereacute

eacute deacutelce je zjištěnaacute hodnota absorbance součtem hodnot

složek ve směsi Pokud jsou absorpčniacute maxima jednotlivyacutech složek přiacuteliš


Absorpčniacute spektrum (Upraveno dle


Kvantitativniacute analyacuteza

absorbance při optimaacutelniacute vlnoveacute deacutelce kvantifikovat koncentraci

Teoreticky je možneacute vypočiacutetat koncentraci přiacutemo z Lambert

z literatury molaacuterniacute absorpčniacute koeficient neniacute to však nejpřesnějšiacute metoda

koeficient se může lišit od skutečnosti v důsledku různeacute absorptivity rozpouštědel

Rovněž musiacuteme při tomto způsobu použiacutet přesně danou deacutelku kyvety

11

celeacutem rozsahu vlnovyacutech deacutelek (např 300-800 nm)

(λ) Tato zaacutevislost je



je maximaacutelně citliveacute umožňuje stanovit fotometricky

li v roztoku přitomny dalšiacute složky ktereacute

deacutelce je zjištěnaacute hodnota absorbance součtem hodnot

Pokud jsou absorpčniacute maxima jednotlivyacutech složek přiacuteliš


httpscommonswikimediaorgwikiFileSpectrale_gevoeligheid_kegeltjespng)

vlnoveacute deacutelce kvantifikovat koncentraci

vypočiacutetat koncentraci přiacutemo z Lambert-Beerova zaacutekona

neniacute to však nejpřesnějšiacute metoda ndash

důsledku různeacute absorptivity rozpouštědel

kyvety

12

2 Prakticky se provaacutediacute stanoveniacute koncentrace ze směrnice kalibračniacute křivky

Kalibračniacute křivka naacutem rovněž potvrdiacute platnost Lambert-Beerova zaacutekona pro naše

měřeniacute ndash tedy linearitu v celeacutem rozsahu měřeniacute Nepotřebujeme znaacutet hodnotu

molaacuterniacuteho absorpčniacuteho koeficientu a nezaacuteležiacute na šiacuteřce kyvety (všechny vzorky měřiacuteme

ve stejneacute) K sestrojeniacute kalibračniacute křivky potřebujeme řadu standardů o znaacutemeacute

koncentraci kteraacute by měla rovnoměrně pokryacutet rozsah našeho měřeniacute Lze použiacutet 1

standard a rovnoměrně ho naředit pro alespoň 5 bodů kalibračniacute křivky hodnota atestu

standardu pak bude jejiacutem horniacutem bodem U všech standardů změřiacuteme absorbanci

spolu s absorbanciacute neznaacutemeacuteho vzorku (při vlnoveacute deacutelce absorpčniacuteho maxima v teacuteže

kyvetě a v přiacutestroji vynulovaneacutem na blank) Kalibračniacute křivku A = f (c) ziacuteskaacuteme po

vyneseniacute koncentrace standardů na osu x (nezaacutevislaacute proměnnaacute) a absorbance

standardů na osu y (zaacutevislaacute proměnnaacute) V přiacutepadě přesneacuteho měřeniacute ziacuteskaacuteme lineaacuterniacute

zaacutevislost Podle LambertndashBeerova zaacutekona je při nuloveacute koncentraci nulovaacute absorbance

ndash křivka by měla vychaacutezet z bodu 0 Kalibračniacute křivku si můžeme sestrojit na papiacuteře

(A) nebo pomociacute Excelu (B)

(A) Kalibračniacute křivka na papiacuteře

Graficky Křivka maacute lineaacuterniacute zaacutevislost - pro každou koncentraci bude absorbance ležet na přiacutemce koncentraci neznaacutemeacuteho vzorku tak ziacuteskaacuteme odečteniacutem z grafu na ose x

Obr 13 Kalibračniacute křivka

Vyacutepočtem - kalibračniacutem faktorem Znaacuteme-li koncentraci i absorbanci standardů

můžeme si pro každyacute bod křivky vypočiacutetat faktor Deacutelku draacutehy i absorpčniacute koeficient

můžeme považovat za konstantniacute neboť vzorek i standard měřiacuteme za stejnyacutech

m

m

13

podmiacutenek Ke každeacutemu standardu si vypočiacutetaacuteme faktor jako podiacutel znaacutemeacute koncentrace a

změřeneacute absorbance standardu f = (= převraacutecenaacute hodnota směrnice přiacutemky)

Z těchto faktorů vypočiacutetaacuteme průměrnyacute faktor kteryacutem vynaacutesobiacuteme změřenou

absorbanci vzorku s neznaacutemou koncentraciacute

(B) Kalibračniacute křivka v Excelu

Graficky (po vytištěniacute křivky) Křivka maacute lineaacuterniacute zaacutevislost pro každou koncentraci bude absorbance ležet na přiacutemce koncentraci neznaacutemeacuteho vzorku tak ziacuteskaacuteme odečteniacutem z grafu na ose x

Vyacutepočtem (Lineaacuterniacute regresiacute z rovnice kalibračniacute křivky)

Postup

rarr Zadaacuteme do tabulky Excelu naměřeneacute absorbance pro přiacuteslušneacute koncentrace

rarr Označeniacutem (myšiacute) vybereme data

rarr Vložiacuteme graf (vybereme bodovyacute)

rarrOznačiacuteme pravou myšiacute libovolnyacute bod přiacutemky a vybereme bdquoPřidat spojnici trenduldquo

14

rarr Zde se objeviacute možnosti z nichž vybereme lineaacuterniacute graf a zatrhneme hodnotu y=0 zobrazeniacute rovnice grafu a hodnoty

spolehlivosti R

rarr Zobraziacute se kalibračniacute přiacutemka spolu s rovnviciacute lineaacuterniacute regrese

Hodnota R2 naacutem ukazuje jak přesně jsme pracovali měla by byacutet ideaacutelně gt 099 (odlehlou hodnotu absorbance vzniklou naacutehodnou chybou lze odstranit)

Kalibračniacute faktor si z rovnice vypočiacutetaacuteme jako převraacutecenou hodnotu směrnice k lineaacuterniacute funkce y = k x) kde y odpoviacutedaacute absorbanci a x odpoviacutedaacute koncentraci tedy 1k (Zde je faktor 100041 = 244) Tiacutemto faktorem pak vynaacutesobiacuteme změřenou absorbanci neznaacutemeacuteho vzorku

Osy i graf pojmenujeme (v Excelu nebo po vytištěniacute)

3 Pokud jsme si ověřili linearitu kalibračniacute křivky (tedy platnost Lambert-Beerova zaacutekona) pro naše měřeniacute můžeme pro vyacutepočet použiacutet metodu jednoho standardu což je nejčastěji využiacutevanaacute metoda v praxi Změřiacuteme absorbanci standardu i neznaacutemeacuteho vzorku (při vlnoveacute deacutelce absorpčniacuteho maxima v teacuteže kyvetě a v přiacutestroji vynulovaneacutem na blank) Platiacute že poměr absorbance standardu a vzorku se rovnaacute poměru jejich koncentraciacute

=

Koncentraci neznaacutemeacuteho vzorku pak vypočiacutetaacuteme

=

15

Aplikace spektrofotometrie

Kvalitativniacute analyacuteza - Identifikace (shoda spektra a polohy absorpčniacuteho maxima analytu se standardem)

Kvantitativniacute analyacuteza ndash Určeniacute obsahu analytu ve vzorku z vyacutešky signaacutelu absorpčniacuteho maxima

Typy spektrofotometrickeacuteho stanoveniacute

Přiacutemeacute Přiacutemeacute měřeniacute přirozeně absorbujiacuteciacutech laacutetek (např spektrofotometrie likvoru ndash analyacuteza absorpčniacutech maxim hemoglobinu a bilirubinu pro určeniacute přiacutetomnosti a staacuteřiacute krvaacuteceniacute)

Nepřiacutemeacute stanoveniacute laacutetek ktereacute samy nejsou barevneacute mohou však reagovat za tvorby barevneacuteho produktu Stanovujeme je pomociacute tzv indikačniacutech reakciacute Tyto reakce převaacutediacute bezbarvyacute analyt na barevnyacute produkt vhodnyacute ke spektrofotometrickeacutemu stanoveniacute Budeme se s nimi setkaacutevat jednotlivě u dalšiacutech klinicko-biochemickyacutech spektrofotometrickyacutech analyacutez a jejich souhrn bdquoVybraneacute indikačniacute reakceldquo naleznete jako dodatek v praktickyacutech cvičeniacutech věnovanyacutech oxidoredukčniacutem metodaacutem

Typy kvantitativniacuteho spektrofotometrickeacuteho stanoveniacute

End-point Měřiacuteme absorbanci na konci reakce využiacutevaacute se u stanoveniacute řady laacutetek ndash biacutelkoviny mineraacutelů glukoacutezy bilirubinu a mnoha dalšiacutech

Kinetickeacute Měřiacuteme změnu absorbance za časovou jednotku Využiacutevaacute se zejmeacutena u stanoveniacute enzymů

Limitace spektrofotometrie

Ve spektrofotometrii při vyšetřeniacute biologickeacuteho materiaacutelu jsou nejčastějšiacutemi interferenty

hemoglobin (červeneacute zbarveniacute vzorku) bilirubin (žluteacute zbarveniacute vzorku) a triacylglyceroly

(zaacutekal vzorku) Barva krevniacute plazmy ovlivněnaacute uvedenyacutemi interferenty může analyticky

interferovat se spektrofotometrickyacutem měřeniacutem

Obr 14 Zbarveniacute krevniacute plazmy interferenty (Upraveno dle httplaboratoryinfocomtests-affected-

hemolyzed-lipemic-icteric-samples-mechanismprettyPhoto)

16

Hemolyacuteza vzorku byacutevaacute nejčastějšiacute přiacutečinou preanalytickyacutech chyb (= k chybaacutem došlo před

vlastniacute analyacutezou vzorku) Maacuteme-li červeně zabarvenou matrici vzorku ovlivniacute to metody

stanovujiacuteciacute absorbanci bliacutezko absorpčniacuteho maxima hemoglobinu (400 nm) Silnějšiacute hemolyacutezu

nelze eliminovat ani vzorkovyacutem blankem Zakalenyacute vzorek chyloacutezniacuteho seacutera může interferovat

rozptylem zaacuteřeniacute Naacutesledkem analytickyacutech interferenciacute pak může byacutet falešně pozitivniacute nebo

negativniacute vyacutesledek analyacutezy Všechny komerčniacute soupravy musiacute pro každyacute analyt deklarovat

přiacutepustneacute množstviacute interferentu pro vydaacuteniacute validniacuteho vyacutesledku Každyacute vzorek pacienta se před

analyacutezou z hlediska uvedenyacutech interfrentů posuzuje a vzhled vzorku je vždy uveden u

vyacutesledků biochemickeacuteho stanoveniacute (jako hemolytickyacute ikterickyacute nebo chyloacutezniacute)

17

Barevnost koordinačniacutech sloučenin

Porovnaacuteme-li akvakomplexy [ M(H2O)6 ]n+ některyacutech kovů s aquakomplexy přechodnyacutech

prvků rozdiacutel je v jejich barevnosti Aquakomplexy nepřechodnyacutech kovů jsou bezbarveacute

Auakomplexy přechodnyacutech kovů jsou barevneacute

Obr 15 Akvakomplexy přechodnyacutech a nepřechodnyacutech kovů (Obr viz httpwwwchemguidecoukinorganiccomplexionscolourhtml)

Přechodneacute kovy jsou definovaacuteny jako kovy s čaacutestečně zaplněnyacutemi d-orbitaly Tvořiacute

komplexniacute sloučeniny ktereacute jsou často barevneacute

Obr 16 Vazba ligandů kolem centraacutelniacuteho kovu (obr viz

wwwslidesharenetchristophsontagbonding-in-coordination-complexes-part-1)

Navaacuteže-li se 6 ligandů (zde H2O) kolem centraacutelniacuteho iontu (kov) (obr 16) elektrony ligandu

se navzaacutejem odpuzujiacute s elektrony d-orbitalu kovoveacuteho iontu čiacutemž se zvyacutešiacute jejich energie a

naacutesledně se rozštěpiacute na 2 skupiny s různyacutemi energetickyacutemi hladinami Naacutesledujiacuteciacute

scheacutema ukazuje uspořaacutedaacuteniacute elektronů v d-orbitalech před a po navaacutezaacuteniacute 6 molekul vody

Obr 17 Uspořaacutedaacuteniacute elektronů v d-orbitalech před a po navaacutezaacuteniacute 6 molekul vody (Upraveno

dle httpwwwchemguidecoukinorganiccomplexionscolourhtml)

18

5 d-orbitalů se rozděliacute do 2 skupin 2 s vyššiacute a 3 s nižšiacute energiiacute Elektrony původniacuteho orbitalu

se přeskupiacute ndash budou zaplňovat elektrony do orbitalu s nižšiacute energiiacute Aby zaplnily 2 orbitaly

s vyššiacute energiiacute musiacute překonat tzv siacutelu ligandoveacuteho pole ∆E (rozdiacutel energiiacute mezi

rozštěpenyacutemi d orbitaly)

Siacutela ligandoveacuteho pole je tedy energie kterou musiacute elektron překonat aby zaplnil energeticky vyššiacute orbitaly Čiacutem vyššiacute je siacutela ligandoveacuteho pole tiacutem vyššiacute energii vyžaduje elektron k přechodu do vyššiacuteho orbitalu (a tiacutem kratšiacute vlnovou deacutelku zaacuteřeniacute absorbuje)

Obr 18 Absorce světla při přechodu mezi d-d orbitaly (Upraveno dle

httpwwwchemguidecoukinorganiccomplexionscolourhtml)

Pokud siacutela ligandoveacuteho pole odpoviacutedaacute energii žluteacuteho světla absorpciacute žluteacuteho světla dojde k přechodu elektronu do vyššiacuteho orbitalu Aquakomplex bude miacutet komplementaacuterniacute

modrou barvu

Barvu komplexu ovlivňuje

1 Typ ligandu maacute na barvu komplexu největšiacute vliv Změna zbarveniacute komplexu vlivem různyacutech ligandů je zaacutekladem spektrochemickeacute řady ligandů kde jsou ligandy seřazeny podle klesajiacuteciacute vlnoveacute deacutelky světla absorbovaneacuteho přiacuteslušnyacutemi komplexy viz obr

Obr 19 Nejběžnějšiacute ligandy seřazeneacute podle siacutely ligandoveacuteho pole Ligandy na počaacutetku řady (halogenidy) rozštěpiacute d-orbitaly jen maacutelo ligandy na konci řady (CO CN-) štěpiacute d-orbitaly vyacuterazně

Zaměniacuteme-li v akvakomplexu Cu(II) ligand vody za amoniak změniacute se barva kompexu směrem k nižšiacutem vlnovyacutem deacutelkaacutem odpoviacutedajiacuteciacutem vyššiacute energii Prvniacute komplex absorbuje červeneacute světlo druhyacute komplex absorbuje ve žluteacute oblasti Žluteacute světlo maacute vyššiacute energii než červeneacute

19

Obr 20 Vliv typu ligandu na barvu komplexu (Upraveno dle httpwwwchemguidecoukinorganiccomplexionscolourhtml)

2 Geometrie komplexu ndash počet ligandů navaacutezanyacutech na centraacutelniacute kov Při vzniku oktaedru dochaacuteziacute k vyššiacute miacuteře štěpeniacute než při vzniku tetraedu ndash barva se bude měnit se změnou koordinačniacuteho čiacutesla

Obr 21 Vliv geometrie komplexu na jeho zbarveniacute (Upraveno dle Robert John Lancashire

httpwwwchemuwimonaedujm)

3 Oxidačniacute čiacuteslo centraacutelniacuteho kovu Zvyacutešeniacute oxidačniacuteho čiacutesla centraacutelniacuteho atomu vede k intenzivnějšiacutemu přitahovaacuteniacute ligandů k centraacutelniacutemu atomu čiacutemž roste odpuzovaacuteniacute elektronů siacutela ligandoveacuteho pole se zvyšuje

Změna oxidačniacuteho čiacutesla (z +2 na +3)

Obr 22 Vliv oxidačniacuteho čiacutesla kovu na barvu ligandu (Upraveno dle httpwwwchemguidecoukinorganiccomplexionscolourhtml)

Zdroje

wwwwikiskriptaeu


httpwwwchemguidecoukinorganiccomplexionscolourhtml

2

Obsah

Uacutevod do spektrofotometrie Iva Subhanovaacute

Zaacutekladniacute pojmy ve spektrofotometrii 3

Kvalitativniacute a kvantitativniacute analyacuteza 12

Aplikace a limitace spektrofotometrie 16

Barevnost komplexů 18

3




















Do vzorku


4











































ms)








5


(1)

λ = c ṽ (2)




















vazeb (viz obr 6)






























6




















7














8









I0 gt I1 gt I2



I0 gt I2 gt I3



9


















10





























































11















kyvety

12






















m

m

13








Postup





14


spolehlivosti R






=


=

15

















16










17
















18









modrou barvu





19








Zdroje

wwwwikiskriptaeu



3




















Do vzorku


4











































ms)








5


(1)

λ = c ṽ (2)




















vazeb (viz obr 6)






























6




















7














8









I0 gt I1 gt I2



I0 gt I2 gt I3



9


















10





























































11















kyvety

12






















m

m

13








Postup





14


spolehlivosti R






=


=

15

















16










17
















18









modrou barvu





19








Zdroje

wwwwikiskriptaeu



4











































ms)








5


(1)

λ = c ṽ (2)




















vazeb (viz obr 6)






























6




















7














8









I0 gt I1 gt I2



I0 gt I2 gt I3



9


















10





























































11















kyvety

12






















m

m

13








Postup





14


spolehlivosti R






=


=

15

















16










17
















18









modrou barvu





19








Zdroje

wwwwikiskriptaeu























ms)








5


(1)

λ = c ṽ (2)




















vazeb (viz obr 6)






























6




















7














8









I0 gt I1 gt I2



I0 gt I2 gt I3



9


















10





























































11















kyvety

12






















m

m

13








Postup





14


spolehlivosti R






=


=

15

















16










17
















18









modrou barvu





19








Zdroje

wwwwikiskriptaeu















vazeb (viz obr 6)






























6




















7














8









I0 gt I1 gt I2



I0 gt I2 gt I3



9


















10





























































11















kyvety

12






















m

m

13








Postup





14


spolehlivosti R






=


=

15

















16










17
















18









modrou barvu





19








Zdroje

wwwwikiskriptaeu



7














8









I0 gt I1 gt I2



I0 gt I2 gt I3



9


















10





























































11















kyvety

12






















m

m

13








Postup





14


spolehlivosti R






=


=

15

















16










17
















18









modrou barvu





19








Zdroje

wwwwikiskriptaeu



8









I0 gt I1 gt I2



I0 gt I2 gt I3



9


















10





























































11















kyvety

12






















m

m

13








Postup





14


spolehlivosti R






=


=

15

















16










17
















18









modrou barvu





19








Zdroje

wwwwikiskriptaeu



9


















10





























































11















kyvety

12






















m

m

13








Postup





14


spolehlivosti R






=


=

15

















16










17
















18









modrou barvu





19








Zdroje

wwwwikiskriptaeu



10





























































11















kyvety

12






















m

m

13








Postup





14


spolehlivosti R






=


=

15

















16










17
















18









modrou barvu





19








Zdroje

wwwwikiskriptaeu







































11















kyvety

12






















m

m

13








Postup





14


spolehlivosti R






=


=

15

















16










17
















18









modrou barvu





19








Zdroje

wwwwikiskriptaeu



12






















m

m

13








Postup





14


spolehlivosti R






=


=

15

















16










17
















18









modrou barvu





19








Zdroje

wwwwikiskriptaeu



13








Postup





14


spolehlivosti R






=


=

15

















16










17
















18









modrou barvu





19








Zdroje

wwwwikiskriptaeu



14


spolehlivosti R






=


=

15

















16










17
















18









modrou barvu





19








Zdroje

wwwwikiskriptaeu



15

















16










17
















18









modrou barvu





19








Zdroje

wwwwikiskriptaeu



16










17
















18









modrou barvu





19








Zdroje

wwwwikiskriptaeu



17
















18









modrou barvu





19








Zdroje

wwwwikiskriptaeu



18









modrou barvu





19








Zdroje

wwwwikiskriptaeu



19








Zdroje

wwwwikiskriptaeu



spektrofotometrie - ulbld.lf1.cuni.cz

Documents