soutenance de thèse de biologie
DESCRIPTION
Soutenance de thèse de Biologie. Cécile Lestrat. Université Joseph Fourier Grenoble. Directeur de Thèse: Cécile Caron Institut Albert Bonniot Ontogenèse et Oncogenèse Moléculaire. Financé par La Région Rhône-Alpes Et l’ARC. Identification et caractérisation de la protéine Atad2. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Soutenance de thèse de Biologie
Cécile Lestrat
Directeur de Thèse: Cécile CaronInstitut Albert BonniotOntogenèse et Oncogenèse Moléculaire
Université Joseph FourierGrenoble
Financé par La Région Rhône-AlpesEt l’ARC
Identification et caractérisation de la protéine Atad2
Un facteur impliqué dans le remodelage de la chromatine acétylée au cours de la
spermiogenèse
16 Octobre 2008
SommaireIntroduction
La chromatine Le Bromodomaine Les protéines à bromodomaines Autres machineries: Les AAA-ATPases Problématique de recherche
Résultats Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse Atad2 hors spermiogenèse: résultats de
l’équipe
Conclusion et Perspectives
SommaireIntroduction
La chromatine Le Bromodomaine Les protéines à bromodomaines Autres machineries: Les AAA-ATPases Problématique de recherche
Résultats
Conclusion et Perspectives
ADN double brin (2 nm)
’’collier’’ de nucléosome (11 nm)
Fibre de chromatine (30 nm)
Section chromosomique sous sa forme étendue (300 nm)
Section condensée de la chromatine (700 nm)
Chromosome mitotique entier (1400 nm)
Les différents degrés de l’organisation de la chromatinienne
Felsenfeld & Groudine, 2003
La structure chromatinienne
H2B
H2A H
2B
H2AH3
H3H4
H4
Nucléosome
Epigénétique et code histone
H2B N- PEPVKSAPVPKKGSKKAINK…..VKYTSSK….
N- SGRGKQGGKARA…..AVLLPKKTESHHK….H2A
N- ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP…..H3
N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGIT….H4
Ub
Me
P
Ac
Structure fermée(Transcription réprimée)
HDAC(Histones
déacétylases)
HAT(Histones
acétytransférases)CH3-CO-SCoA
CoA
Structure ouverte(Transcription activée)
Exemple de l’acétylation
Machinerie de remodelage
SommaireIntroduction
La chromatine Le Bromodomaine Les protéines à bromodomaines Autres machineries: Les AAA-ATPases Problématique de recherche
Résultats
Conclusion et Perspectives
Les bromodomaines: Conservation et structures N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV...
H4
Bromo
:Ac
Zeng & Zhou, 2002
Les bromodomaines: reconnaissance des histones acétylées
N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV...
H4
Bromo
:Ac
Reconnaissance des lysines acétylées
Spécificité de la reconnaissance: chaque bromodomaine ne reconnait pas toutes les lysines acétylées
Affinité expliquée par l’environnement du site de liaison (au niveau des acides aminées non conservés, de la conformation de la protéine)
SommaireIntroduction
La chromatine Le Bromodomaine Les protéines à bromodomaines Autres machineries: Les AAA-ATPases Problématique de recherche
Résultats
Conclusion et Perspectives
Les protéines à bromodomaines
De la Serna, Ohkawa & Imbalzano, 2006.
Famille SWI/SNF
Facteurs de remodelage dépendantes à l’ATP
Les Histones AcetylTransferases (HAT)
HAT, reconnaissance des histones acétylées et extension du signal au nucléosome suivant
SommaireIntroduction
La chromatine Le Bromodomaine Les protéines à bromodomaines Autres machineries: Les AAA-
ATPases Problématique de recherche
Résultats
Conclusion et Perspectives
Les AAA-ATPasesVCP AAAATPases Associated with a wide variety of cellular Activities
Anneaux hexa/heptamériquesImplication dans le désassemblage de complexes multiprotéiques
Walker AWalker BSRH
Boucle Pore
Hanson and Whiteheart, 2005; Lenzen et al.,1998
Homologue d’Atad2
Sous-unités Rpt du protéasome
Homologues de VCP
Conservation des AAA-ATPases
VCP AAA
Les AAA-ATPasesVCP AAA
VCP
sous-unités du protéasome (dégradation des protéines)Hexamères chargés du dépliement des protéines à dégrader
Particule 20S
Particule 19S
Particule 19S
protéasomeRpt
Hexamérisation en anneaux, dépliement des protéines neo-synthétisées mal repliées..
AAA: Le protéasome
Dégradation des protéines
Rechsteiner & Hill, 2005
19 S : reconnaissance du substrat, dépliement et insertion dans la chambre catalytique
19 S
20 S: chambre catalytique, site de coupure des séquences peptidiques
Les AAA et l’activité génomique
Helicases mcm2-mcm7 (minichromosome maintenance 2-7)Initiation et élongation de la réplication de l ’ADN
RptCoactivatrice traductionnelles (GAL)Dégradation des facteurs de transcription et modifications post-traductionnelles des histonesEtapes de la transcription
SommaireIntroduction
La chromatine Le Bromodomaine Les protéines à bromodomaines Autres machineries: Les AAA-ATPases Problématique de recherche
Résultats
Conclusion et Perspectives
Remodelage chromatinien et spermatogenèse
Arrêt de la transcription
Compaction
Méiose
H2B
H2A H
2B
H2AH3
H3H4
H4
Nucléosome
protamines
Enlèvement des histones
? ?
Axes de recherche de l’équipe
Organisation finale du génome spermatique
Mécanismes moléculaires du remodelage
Recherche fondamentale
Exploitation des connaissances en physiopathologie humaine (procréation)Exploitation des connaissances en oncologie
- Département de Génétique et procréation/CECOS -
Transfert au niveau médical
Mécanismes moléculaires du remodelage
Identification?
Criblage bio-informatique d’ une banque d’ADNc :
Spermiogenèse•Banque testiculaire
•Candidat liant la chromatine
•Candidat ayant une possible activité enzymatique
BRDTCDYL Atad2
Caron, Pivot-Pajot, van Grunsven, Col, Lestrat, Rousseaux, Khochbin; EMBO Rep 2003
Pivot-Pajot, Caron, Govin, Vion, Rousseaux, Khochbin; MCB 2003
SommaireIntroduction
Résultats Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse Atad2 hors spermiogenèse:
résultats de l’équipe
Conclusion et Perspectives
SommaireIntroduction
Résultats Méthodes d’identification Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse Atad2 hors spermiogenèse:
résultats de l’équipe
Conclusion et Perspectives
Atad2 AAATPase Bromodomaine
Reconnaissance des histones acétylées ?
N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV...
H4
Bromo:Ac
Remodelage?
1 114 255 631 743 1040
Atad2 & conservation
mAtad2-l
A.thaliana2
C. elegans
humainAtad2
ratAtad2
S. Cerevisiae
A.thaliana1
mAtad2-s
SommaireIntroduction
Résultats Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse Atad2 hors spermiogenèse:
résultats de l’équipe
Conclusion et Perspectives
Hypothèse de travailSpermiogenèse
protamines
Dégradation des histones?
Enlèvement des histones?
SommaireRésultats
Méthodes d’identification Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse
Profil d’expressionBromodomaineDomaine AAA-ATPase
Atad2 hors spermiogenèse: résultats de l’équipe
Existence d’Atad2,profil d’expression
court
longRT-PCR
Gla
nde
saliv
aire
Atad2
GAPDH
Sans
ARN
7 11 15 17 Cerv
eau
Oei
lCo
eur
Rein
Foie
Poum
on
Rate
Testi
cule
Ute
rus
Embryon
Les deux formes d’Atad2 existent chez la sourisLa forme courte est strictement testiculaire
Existence d’Atad2,profil d’expression
court
long
Western-blotM
uscl
e
180
130
100
73
Poum
on
Coeu
r
Testi
cule
Cerv
eau
Rein
Rate
Foie
PM (K
da)
Spermiogenèse
180
130
PM (K
da)
Les deux formes d’Atad2 sont présentes au cours des phases tardives de la spermiogenèse
SommaireRésultats
Méthodes d’identification Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse
Profil d’expressionBromodomaineDomaine AAA-ATPase
Atad2 hors spermiogenèse: résultats de l’équipe
Les bromodomainesCBP bromodomain
Motifs de reconnaissance des histones acétylées
AAATPase BromodomaineAtad2
N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV...
H4
Bromo:Ac
Localisation subcellulaire
Atat2 dans la fraction chromatinienneAffinité différente des deux formes pour la chromatine
Cyto
plas
me
Nuc
léop
lasm
e
Chro
mati
ne
long
court
Histones de coeur
180
130
PM (K
da)
200
Sol Son C Sol Son C Sol Son C Sol Son C
350 500 750
long
court
Histones de coeur
[KCl] (mM)
Extraction saline
180
130
PM (K
da)
Liaison à la chromatine
H2A
H2B
H3
H4
?
SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV
SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV
ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAC
ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAC
PEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQC
PEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQC
SGLGKQGGKARAC
SGLGKQGGKARAC
Quelle affinité avec les histones?
Tests de pull down sur la protéine endogène utilisant des peptides mimant les queues N-Terminales des histones
- + - + - + - + - +No
tat
input Acetylation
Peptides pull down d'extraits nucléoplasmiques testiculaires
peptidesH2A H2B H3 H4
Résultats
court
contrôlesK5 K8 K12 K16+ -inputH4
court
Acetylation spécifique
Le bromodomaine d’Atad2 lie l’histone H4 acétylée, majoritairement sur la lysine K5
Liaison à la chromatine
SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV
-
IP HA Atad2
162535
Histones de coeur
PM+ - HA mAtad2
TSA+ + +
HA mAtad2
10
HA mAtad2- - +-
IP HA Atad2
162535
Histones de coeur
PM+ + HA mAtad2
TSA- - +
HA Atad2
10
Implication du bromodomaineTests d’immunoprécipitation de différentes constructions d’Atad2 court
Affinité d’Atad2 avec la chromatine quand celle-ci est acétyléeLe bromodomaine est responsable de cette interaction
SommaireRésultats
Méthodes d’identification Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse
Profil d’expressionBromodomaineDomaine AAA-ATPase
Atad2 hors spermiogenèse: résultats de l’équipe
Hypothèses
Atad2 Hexamère
• Complexe de remodelage• Extraction des nucléosomes acétylés
Atad2 sous unité du protéasome
• S’insère dans l’anneau Rpt• Recrute le protéasome sur la chromatine acétylée• Dégradation des nucléosomes acétylés
Domaine AAA
AAATPase Bromodomaine
ATPases Associated with a wide variety of cellular Activities
Anneaux hexamériquesChaperonnes: désassemblage de complexes multiprotéiques
sous-unités du protéasome (dégradation des protéines)Hexamères chargés du dépliement des protéines à dégrader
RptComplexe 20S
Complexe 19S
Complexe 19S
protéasomeRpt
Interaction avec les Rpt
Interaction avec les Rpt
3ème stratégie-Approche in vivo indirecte: colocalisation des protéines lors de séparation par ultra-centrifugation dans gradient de glycérol
1ère stratégie- Interaction in vitro: GST-Pull down avec une construction GST-AAA d’Atad2 et des Rpt TIV
2ème stratégie-Implication du domaine AAA: Co-immunoprécipitation de constructions HA-Atad2 et Flag-Rpt ou Rpt endogènes
Pull down des Rpt traduites in vitro sur des bille GST / GST-Atad2, domaine ATPase
Input Rpt1 2 3 4 5 6- + - + - + - + - + - +
1 2 3 4 5 6
Pull down
Tests in Vitro
Interactions in vitro
Interaction avec les Rpt
3ème stratégie-Approche in vivo indirecte: colocalisation des protéines lors de séparation par ultra-centrifugation dans gradient de glycérol
1ère stratégie- Interaction in vitro: GST-Pull down avec une construction GST-AAA d’Atad2 et des Rpt TIV
2ème stratégie-Implication du domaine AAA: Co-immunoprécipitation de constructions HA-Atad2 et Flag-Rpt ou Rpt endogènes
Rpt1
Input Rpt1
Rpt1IP
Rpt3
Input Rpt3
Rpt3IP
Atad2 c
Rpt1
-Input 5% +
Rpt6
Rpt
Co-immunoprécipitation
Rpt
Avec des Rpt surexprimées de façon transitoire Avec des Rpt endogènes
Interaction entre les Rpt et Atad2 via son domaine AAA
Interaction avec les Rpt
3ème stratégie-Approche in vivo indirecte: colocalisation des protéines lors de séparation par ultra-centrifugation dans gradient de glycérol
1ère stratégie- Interaction in vitro: GST-Pull down avec une construction GST-AAA d’Atad2 et des Rpt TIV
2ème stratégie-Implication du domaine AAA: Co-immunoprécipitation de constructions HA-Atad2 et Flag-Rpt ou Rpt endogènes
Méthodes de séparation
testicule
1 - Noyaux
2 - Extrait soluble
3 - Centrifugation sur gradient de densité Glycerol
20%
40%
SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV
4 - AcH4 peptide pulldown
Ultracentrifugation
Atad2Fraction
Atad2Pull down
Rpt1
Rpt1
?
UltracentrifugationRésultats
Colocalisation de la population d’Atad2 en complexe et des Rpt
Hypothèses
Atad2 Hexamère
• Complexe de remodelage• Extraction des nucléosomes acétylés
Atad2 sous-unité du protéasome
• S’insère dans l’anneau Rpt• Recrute le protéasome sur la chromatine acétylée• Dégradation des nucléosomes acétylés
Domaine AAA
Multimérisation
1ère stratégie- Interaction in vitro: GST-Pull down avec une construction GST-AAA d’Atad2 et des constructions Atad2
2ème stratégie-Implication du domaine AAA: Co-immunoprécipitation de constructions HA-Atad2 et Flag-Atad2
3ème Stratégie- Degrés de multimérisation
Multimérisation
Test in vitro: Pull down d’Atad2 traduit in vitro sur des bille GST / GST-Atad2 AAA
Input Atad2Pull down
WT AAA - + - +WT AAA
Dimérisation possible grâce au domaine AAA
Multimérisation
1ère stratégie- Interaction in vitro: GST-Pull down avec une construction GST-AAA d’Atad2 et des constructions ATad2
2ème stratégie-Implication du domaine AAA: Co-immunoprécipitation de constructions HA-Atad2 et Flag-Atad2
3ème Stratégie- Degrés de multimérisation
Implication du domaine AAA
Double transfection: domaine ATPase responsable de la multimérisation?
Flag Ata2:
Ha-Atad2 wt: - + - +1-822 1-822292-822 292-822
- + - +
WB anti-flag
WB anti-Ha
Input IP anti-Ha
Dimérisation possible grâce au domaine AAAHypothèse de la multimérisation plus probable que l’interaction avec les Rpt
Multimérisation
1ère stratégie- Interaction in vitro: GST-Pull down avec une construction GST-AAA d’Atad2 et des constructions ATad2
2ème stratégie-Implication du domaine AAA: Co-immunoprécipitation de constructions HA-Atad2 et Flag-Atad2
3ème Stratégie- Degrés de multimérisation
Proteine recombinante sur gel électrophorèse natif
669440
232
140
KDa
Fla
g-V
CP
Ata
d2
?
Multimérisation
Proteine recombinante en HPLC
Multimérisation possible en hexamère
Effet du domaine AAA sur les propriétés du bromodomaine
AAATPase Bromodomaine
?
N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV...
H4
Bromo:Ac
N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV...
H4
Bromo:Ac
Effet du domaine AAA sur les propriétés du bromodomaine
1ère stratégie- liaison à la chromatine avec un domaine AAA muté?
2ème stratégie-Approche indirecte: Quelle population d’Atad2 a une affinité avec la chromatine acétylée?
Régulation de l’affinité à la chromatine
Pull down H4 acétylée avec des constructions d’Atad2 dont certains domaines sont mutés
- -FL mtBd mtAAA FL mtBd mtATP
HA - Atad2
input pull-down H4 tetra-Ac
L’altération du domaine AAA affaiblit la capacité d’Atad2 à lier H4 acétylée
Effet du domaine AAA sur les propriétés du bromodomaine
1ère stratégie- liaison à la chromatine avec un domaine AAA muté?
2ème stratégie-Approche indirecte: Quelle population d’Atad2 a une affinité avec la chromatine acétylée?
Fractions
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
AcH4 pull down
? ??
20 % 40 %
UltracentrifugationRésultats
La population en complexe/hexamérique peut interagir avec la chromatine acétylée
Rôle au cours de la spermiogenèse
Spermiogenèse
protamines
Enlèvement des histones
protamines
19S Dégradation des histones
Enlèvement des histones ?
AcK5
Multimérisation-affinité
SommaireRésultats
Méthodes d’identification Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse Atad2 hors spermiogenèse:
résultats de l’équipe
SommaireRésultats
Atad2 hors spermiogenèse:
Cellules somatiques
Expression d’Atad2
Influence sur l’activité transcriptionnelleInfluence sur la dynamique de H2A
Cellules cancéreusesPrésence dans des cellules tumorales et
cancersInfluence sur l’apoptose
Atad2 & conservation
mAtad2-l
A.thaliana2
C. elegans
humainAtad2
ratAtad2
S. Cerevisiae
A.thaliana1
mAtad2-s
Profil d’expression
court
longRT-PCR
Gla
nde
saliv
aire
Atad2
GAPDH
Sans
ARN
7 11 15 17 Cerv
eau
Oei
lCo
eur
Rein
Foie
Poum
on
Rate
Testi
cule
Ute
rus
Embryon
La forme longue est retrouvée dans plusieurs tissus
Présence de la forme longue dans des lignées de cellules en culture
Testiculemurin COS Daudi Jurkat Molt HL60 A549 H12
180
130
PM (K
da)
long
Profil d’expression
SommaireRésultats
Atad2 hors spermiogenèse:
Cellules somatiques
Expression d’Atad2
Influence sur l’activité transcriptionnelle
Influence sur la dynamique de H2A
Cellules cancéreusesPrésence dans des cellules tumorales et
cancersInfluence sur l’apoptose
AAATPase Bromodomaine
Motifs de reconnaissance des histones acétylées
N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV...
H4
Bromo:Ac
Dépliement/Extraction des histones?
Influence d’Atad2 sur l’activité transcriptionnelle?
Influence d’Atad2 sur l’activité transcriptionnelle?
Atad2 a une activité de répression de la transcription
par RT-qPCR
Expériences de mesure de l’activité transcriptionnelle par puce
Le Knock Down d’Atad2 active globalement l’activité transcriptionnelle
244 gènes affectés2/3 montre une transcription plus élevée
SommaireRésultats
Atad2 hors spermiogenèse:
Cellules somatiques
Expression d’Atad2
Influence sur l’activité transcriptionnelleInfluence sur la dynamique de H2A
Cellules cancéreusesPrésence dans des cellules tumorales et
cancersInfluence sur l’apoptose
Influence sur la dynamique de H2A sur la chromatine
Le Knock Down d’Atad2 déstabilise globalement la structure chromatinienne
Atad2 figerait/organiserait certains domaines de la chromatine en structures stables
Expériences de FRAP: visualisation de H2A
Atad2 dans les cellules somatiques
Relâchement de la structure chromatinienne, transcription, dynamique
Domaines maintenus en structure figées
SommaireRésultats
Atad2 hors spermiogenèse:
Cellules somatiques
Expression d’Atad2
Influence sur l’activité transcriptionnelleInfluence sur la dynamique de H2A
Cellules cancéreusesPrésence dans des cellules tumorales
et cancersInfluence sur l’apoptose
RT-qPCR (Edwige Col)
S. RousseauM. CallananS. Gazzeri
Projet EpiMed
Atad2 dans les tumeurs du poumon
Criblage de tumeurs du poumon
Atad2 est exprimé de façon anormale dans les cancers du poumon
SommaireRésultats
Atad2 hors spermiogenèse:
Cellules somatiques
Expression d’Atad2
Influence sur la rapidité du turn-over de H2A
Influence sur l’activité transcriptionnelle
Cellules cancéreusesPrésence dans des cellules tumorales et
cancersInfluence sur l’apoptose
Influence d’Atad2 sur l’apoptose
Expériences de FACS: mesures d’un marqueur apoptotique (caspase3)
mesures du marqueur d’apoptose caspase 3 en présence d’actynomycine D sur des cellules traitées ou non avec des ARN si d’Atad2
Atad2 agit comme un anti-apoptotique
Atad2 éliminé précocement lors de l’apoptose des cellules
Le Knock Down d’Atad2 augmente l’apoptose
Atad2 dans les cellules somatiques
Dynamique de la chromatine, apoptose
Domaines maintenus en structure figées,Empêche la désorganisation de domainesEffet anti-apoptotique
SommaireIntroduction
Résultats
Conclusion et Perspectives
Rôles d’Atad2: Conclusion
Atad2-court
Atad2-long
Spermiogenèse
Cellules somatiques / Cancéreuses
Atad2 corrélé à une forte dynamique de la chromatineImplication dans l’enlèvement des histones?
Atad2 corrélé à une baisse de la dynamique chromatinienneEffet: baisse de la transcription
baisse de l’apoptose
Les deux formes d’Atad2
Atad2-court
Atad2-longRôle de régulation de l’activité?Site d’interaction de partenaires particuliersSite de reconnaissance d’un substrat?
Pourquoi continuer à étudier Atad2
Les facteurs épigénétiques tels qu’Atad2 semblent avoir un impact fort sur la spermatogenèse
L’étude d’Atad2 en tant que pseudo-C/TA pourrait déboucher sur de nouveaux marqueurs de diagnostic de cancers
Une meilleure compréhension d’Atad2 et des facteurs épigénétiques pourraient être un jour exploitée dans le développement de nouvelles molécules thérapeutiques
Remerciements
Les membres du jury
Cécile CaronSaadi Khochbin
L’équipe
La Région Rhône-Alpes et l’ARC
Mon entourage
Exemple de développement thérapeutiques
Les inhibiteurs d’HDAC
15 molécules en développement
Les inhibiteurs d’Aurora K
1 molécule en développement(réduction de
phosphorylation D’H3)
Les Histones H1 recombinants
3 molécules en développement
Cancers, psoriasis….
Multimérisation ATP-dépendante
Co-immunoprécipitation de constructions d’Atad2. Certaines ont un domaine AAA altéré
La formation du multimère est dépendante de l’ATP.