sonneratia alba - repository.ub.ac.idrepository.ub.ac.id/7263/5/bab 4.pdf · batang miana. helander...
TRANSCRIPT
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Kadar Air Mangrove Sonneratia alba
Kadar air dari mangrove Sonneratia alba adalah daun (74,72%), batang
(47,12%), akar (68,96%) dan buah (72,71%). Menurut (Ahmadi & Estiasih,2009),
Kadar air menutupi hampir 71% permukaan bahan. Kadar air diperlukan untuk
kelangsungan proses biokimiawi organisme hidup, sehingga sangat esensial
dalam menentukan kandungan kadar air pada bahan. Mikroorganisme menurut
Winarno dan Fardiaz (1973), dapat tumbuh pada kisaran kadar air tertentu.
Sebagian besar bakteri membutuhkan kadar air 75%-100% untuk tumbuh.
Dengan nilai kadar air sebesar itu akan membatasi pertumbuhan
mikroorganisme. Menurut Piggot dan Tucker (1990) , mikroorganisme yang
masih mungkin tumbuh adalah bakteri Leucocostoc, Leuconostoc
mesenteroides, Pseudomonas, Acetobacter, Flavobacterium, dan Zymomonas.
4.2 Isolasi Bakteri Penghasil Enzim L-Asparaginase
Isolasi bakteri L-asparaginase yang diperoleh dari penelitian ini berasal
dari sampel endofit mangrove Sonneratia alba yang diambil dari pantai Bajul Mati
Malang Jawa Timur. Sampel endofit mangrove adalah dari bagian daun, batang,
akar dan buah untuk diambil sebanyak 1 gram.
Hasil penginokulasian berdasarkan metode pengenceran bertingkat,
pengenceran 10-2, 10-3, 10-4 dan 10-5 merupakan isolat yang cukup untuk
mewakili semua koloni bakteri yang tumbuh. Dari sampel tersebut didapatkan
isolat bakteri sebanyak 8 isolat yang tumbuh dari 16 isolat pada media agar LBA
dapat dilihat pada Tabel 3 sebagai berikut :
37
Tabel 1. Kode Isolat
Kode isolat Keterangan
DSA2 isolat daun dari pengenceran 10-2
DSA3 isolat daun dari pengenceran 10-3
DSA4 isolat daun dari pengenceran 10-4
DSA5 isolat daun dari pengenceran 10-5
BSA2 isolat Buah dari pengenceran 10-2
BSA3 isolat Buah dari pengenceran 10-3
BSA4 isolat Buah dari pengenceran 10-4
BSA5 isolat Buah dari pengenceran 10-5
Isolasi bakteri menurut Dewi (2008), adalah pengambilan atau
memindahkan mikroba dari lingkungannya di alam dan menumbuhkannya
sebagai biakan murni dalam medium buatan. Isolasi dilakukan untuk
mendapatkan koloni tunggal. Hasil isolasi dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 2. Hasil Pengamatan Morfologi Bakteri
Kode isolat Morfologi koloni
Bentuk koloni
Permukaan koloni
Tepi koloni
Warna koloni
DSA2 Tidak teratur Timbul datar Bergerigi Krem
DSA3 Bulat Rata Utuh Krem
DSA4 Bulat Rata Utuh Krem
DSA5 Tidak teratur Timbul datar Berombak Krem
BSA2 Tidak teratur Timbul datar Berombak Krem
BSA3 Tidak teratur Timbul datar Utuh Krem
BSA4 Bulat Timbul datar Utuh Putih
BSA5 Bulat Timbul datar Utuh Krem
Tabel 4 menunjukkan bahwa diperoleh 8 isolat bakteri yang berhasil
diisolasi dari endofit mangrove Sonneratia alba dari Pantai Bajul Mati, Malang
Jawa Timur dengan ciri-ciri makroskopis yang berbeda. Hasil morfologi koloni
menunjukkan bahwa isolat DSA2, DSA3, BSA4, dan BSA5 memiliki bentuk bulat,
DSA2, DSA3, BSA4 dan BSA5 memiliki bentuk tidak teratur. DSA2 dan DSA3
memiliki permukaan koloni rata sedangkan DSA2, DSA3, BSA4, BSA5, BSA4,
dan BSA6 memiliki permukaan koloni timbul datar. Tipe koloni DSA3, DSA4,
BSA3, BSA4 dan BSA5 adalah utuh, sedangkan DSA2, DSA5, BSA2 memiliki
tipe koloni berombak a
BSA2, BSA3, dan BSA5
putih. morfologi koloni 8 isolat bakter
Pantai Bajul Mati, Malang
berikut.
(DSA3)
(BSA3)
Jumlah bakteri endofit tumbuhan
pada bagian daun daripada batang, akar dan buah. Jumlah bakteri endofit juga
lebih banyak terdapat pada bagian daun daripada b
(Lecava et al., 2004). Berbeda dengan Zinniel
biasanya populasi bakteri lebih banyak diakar dan sedikit di daun dan batang.
Kusumawati (2004) juga mendapatkan jumlah bakteri endofit paling banyak dari
batang miana. Helander
bakteri endofit tergantung dari jenis tanaman, struktur tanah, umur tanah,
sebaran geografis dan waktu pengambilan sampel. Jalur masuk bakteri endofit
biasanya melalui akar, namun bagian tanaman yang terpapar udara langsung
seperti daun (melalui stomata)
38
tipe koloni berombak atau bergerigi. Warna koloni DSA2, DSA3, DSA4, DSA5,
BSA2, BSA3, dan BSA5 memiliki warna isolat krem, sedangkan BSA4
. morfologi koloni 8 isolat bakteri dari endofit mangrove Sonneratia alba
, Malang Jawa Timur dapat dilihat pada Gambar 13 sebagai
(DSA4) (DSA5)
(BSA4) (BSA5)
Gambar 1. Hasil Koloni Bakteri Endofit
Jumlah bakteri endofit tumbuhan Sonneratia alba lebih banyak terdapat
pada bagian daun daripada batang, akar dan buah. Jumlah bakteri endofit juga
lebih banyak terdapat pada bagian daun daripada batang pada tumbuhan jeruk
2004). Berbeda dengan Zinniel et al., (2002), yang menyatakan
biasanya populasi bakteri lebih banyak diakar dan sedikit di daun dan batang.
Kusumawati (2004) juga mendapatkan jumlah bakteri endofit paling banyak dari
batang miana. Helander et al., (2007), menyatakan bahwa adanya variasi jumla
bakteri endofit tergantung dari jenis tanaman, struktur tanah, umur tanah,
sebaran geografis dan waktu pengambilan sampel. Jalur masuk bakteri endofit
biasanya melalui akar, namun bagian tanaman yang terpapar udara langsung
seperti daun (melalui stomata), bunga, batang dan kotiledon dapat juga sebagai
tau bergerigi. Warna koloni DSA2, DSA3, DSA4, DSA5,
arna isolat krem, sedangkan BSA4 adalah
Sonneratia alba dari
dapat dilihat pada Gambar 13 sebagai
(DSA6)
(BSA6)
lebih banyak terdapat
pada bagian daun daripada batang, akar dan buah. Jumlah bakteri endofit juga
atang pada tumbuhan jeruk
(2002), yang menyatakan
biasanya populasi bakteri lebih banyak diakar dan sedikit di daun dan batang.
Kusumawati (2004) juga mendapatkan jumlah bakteri endofit paling banyak dari
(2007), menyatakan bahwa adanya variasi jumlah
bakteri endofit tergantung dari jenis tanaman, struktur tanah, umur tanah,
sebaran geografis dan waktu pengambilan sampel. Jalur masuk bakteri endofit
biasanya melalui akar, namun bagian tanaman yang terpapar udara langsung
, bunga, batang dan kotiledon dapat juga sebagai
39
jalur masuk bakteri endofit. Studi terakhir diperoleh bakteri endofit pada akar dan
buah. Hal ini membuktikan bahwa bakteri endofit dapat diisolasi dari berbagai
jaringan tanaman seperti akar, daun, batang dan buah (Simarmata et al., 2007).
Kemudian dilakukan pemurnian isolat dengan goresan zig-zag atau
goresan T pada media LBA. Goresan zig-zag bertujuan untuk memurnikan
kembali isolat yang telah lama disimpan, selain itu untuk menghindari terjadinya
kontaminasi oleh mikroba yang tidak diinginkan. Lay (1994), menyatakan bahwa
biakan murni merupakan biakan yang hanya mengandung satu jenis bakteri dari
tiap koloni tersebut diambil dan lakukan pemurnian. Gambar streak zig-zag dapat
dilihat pada Gambar 14 sebagai berikut.
(DSA2) (DSA3) (DSA5)
(DSA5) (BSA2) (BSA3)
(BSA4) (BSA5)
40
Keterangan : Koloni yang diambil
Gambar 2. Streak zig-zag
Isolat bakteri kemudian dipindah pada media agar miring untuk dilakukan
peremajaan. Peremajaan isolat bakteri bertujuan untuk mencegah indukan
terhindar dari kontaminasi, menjaga ketersediaan cadangan bakteri serta
mengoptimalkan pertumbuhan. Pemindahan dan pemeliharaan kultur dilakukan 4
minggu sekali ke dalam media agar miring yang baru dapat dilihat pada Gambar
15.
Gambar 3. Isolat Pada Agar Miring
4.3 Skrining bakteri penghasil L-Asparaginase
Hasil dari penapisan bertujuan untuk memperoleh isolat bakteri penghasil
enzim L-asparaginase. Penapisan enzim L-asparaginase dilakukan dengan
metode plate dan media selektif M-9 yang telah diberi indikator BTB dan L-
asparagin sebagai sumber karbon dan nitrogen tunggal dalam media untuk
menapis mangrove yang mampu menghasilkan enzim L-asparaginase.
Penapisan dilakukan sebanyak 2 kali ulangan untuk mendapatkan enzim L-
asparaginase paling baik.
Enzim L-asparaginase yang dihasilkan oleh isolat akan memecah asam
amino L-asparagin menjadi asam aspartat dan amoniak, pelepasan amoniak
41
tersebut mengubah pH medium yang semula netral (pH 7.0) menjadi basa.
Perubahan pH ditandai dengan perubahan warna medium disekitar koloni
mikroba. Hal tersebut ditunjukkan dengan perubahan warna awal dari media BTB
adalah kuning dengan kondisi pH asam. Deteksi positif enzim L-asparaginase
ditandai dengan adanya perubahan formasi dari amonia, menyebabkan pH dari
kultur berubah menjadi basa dan perubahan warnanya menjadi biru yang
dihasilkan oleh bakteri tersebut. Semakin pekat warna biru yang dihasilkan maka
semakin besar aktivitas enzim L-asparaginase (Mahajan et al., 2013).
Keuntungan dari penggunaaan BTB dibandingkan dengan phenol red
adalah sebagai indikator warna BTB memberikan warna kontras yang tajam (biru
tua dan kuning cerah) diantara yang terhidrolisis dan tidak terhidrolisis
asparagine. Selain itu, penggunaan BTB meningkatkan kejernihan zona
hidrolisis, prosesnya mudah dilakukan serta cepat dan efektif untuk indikator
warna pada medium pertumbuhan mikroorganisme yang menghasilkan
L_asparaginase (Gulati et al., 1997). Hasil penapisan bakteri penghasil enzim L-
asparaginase dapat dilihat pada Gambar 16.
(a) (b)
42
(c) (d)
Keterangan : (a) dan (b) Ulangan 1 dan (c) dan (d) Ulangan 2
Gambar 4. Hasil Skrining Bakteri Penghasil Enzim L-Asparaginase
Dari Gambar 16, setelah dilakukan dua kali percobaan pada isolat daun
kode DSA4 menghasilkan warna biru paling pekat, terang dan menyebar penuh
melebihi batas garis. Sedangkan untuk sampel buah hanya satu isolat yaitu
BSA4 yang menghasilkan warna biru namun tidak seterang pada isolat DSA4.
Sedangkan pada kode isolat lain tidak menghasilkan aktivitas enzim L-
asparaginase tetapi hanya tumbuh koloni saja. Garis hitam pada cawan
digunakan untuk mempermudah melihat pertumbuhan bakteri penghasil L-
asparaginase yang diindikasikan dengan perubahan warna pada koloni. Warna
biru yang paling pekat, terang dan menyebar pada cawan merupakan bakteri
yang dapat menghasilkan enzim L-asparaginase paling baik. Pada saat
pengamatan, diberikan tanda positif (+) sesuai dengan perubahan warna pada
cawan. Apabila hidrolisisnya rendah diberikan tanda (+) satu kali, hidrolisis
sedang positif (++) dua kali dan bila hidrolisis tinggi maka positif (+++) tiga kali.
Sedangkan apabila tidak menghasilkan maka diberi tanda negatif (-).
Hasil penapisan menunjukkan bahwa isolat bakteri yang menghasilkan
enzim L-asparaginase adalah dari endofit mangrove dapat dilihat pada Tabel 5.
43
Tabel 3. Hasil Penapisan Bakteri Endofit Mangrove
No Isolat Aktivitas enzim L-asparaginase
Ulangan1 Ulangan 2
1 DSA3 ++ ++
2 DSA4 - -
3 DSA5 +++ +++
4 DSA6 ++ +
5 BSA3 - -
6 BSA4 - -
7 BSA5 ++ +
8 BSA6 - -
Keterangan = - = Tidak ada aktivitas + = Aktivitas hidrolisis rendah ++ = Aktivitas hidrolisis sedang +++ = Aktivitas hidrolisis tinggi
Dari tabel diatas, dapat disimpulkan bahwa dari 8 isolat bakteri endofit
yang berhasil diisolasi mampu menghasilkan enzim L-asparaginase dengan baik
adalah isolat DSA4 yang mempunyai hasil postif (+++) tiga kali. Dari hasil diatas
dapat diketahui bahwa, pada isolat DSA4 adalah isolat bakteri yang mampu
menghidrolisis dengan baik pada medium L-asparginase, karena setelah
dilakukan dua kali percobaan isolat tersebut yang paling baik menghasilkan
aktivitas enzim L-asparaginase, sehingga dapat digunakan untuk uji identifikasi
dengan Microbact untuk mengetahui jenis spesies bakterinya.
4.4 Hasil Uji Identifikasi Bakteri
Identifikasi yang dilakukan meliputi pengamatan visual, pewarnaan Gram
dan uji Biokimia. Pengamatan visual dilakukan dengan mengamati bentuk dan
warna koloni yang akan diidentifikasi. Pewarnaan Gram digunakan untuk
mengetahui morfologi sel bakteri serta untuk membedakan bakteri Gram positif
dan Gram negatif. Jika dilihat dibawah mikroskop, bakteri Gram positif akan
berwarna ungu dikarenakan dinding sel dapat menahan kompleks pewarna
primer (CGV-Lugol), sedangkan bakteri Gram negatif berwarna merah karena
44
pada pewarna primer (CGV-Lugol) hilang akibat pembilasan dengan alkohol dan
terwarnai oleh pewarna lugol. Identifikasi dengan microbact identification
dilakukan menggunakan microbact 24E karena hasil oksidasinya positif..
Pengamatan morfologi pada isolat bakteri DSA5 penghasil enzim L-
asparaginase pertama-tama dilakukan dengan pengamatan visual. Bakteri
tersebut memiliki spora, berwarna krem dan bentuk koloni bulat. Sel bakteri ini
berbentuk basil, diameter koloni 3,82 mm, tepi koloni tidak rata, elevansi koloni
datar, konsistensi basah dan tergolong Gram positif. Hasil menunjukkan
kesamaan dengan buku Bergey’s (1986) bahwa bakteri Bacillus megaterium
termasuk dalam golongan bakteri Gram positif, memiliki warna krem atau kuning,
bentuk koloni bulat dan diameter koloni >1 µm. Berikut adalah gambar dari koloni
dan hasil pewarnaan Gram (1000Χ) dapat dilihat pada Gambar 17.
Gambar 5. A. Foto Koloni dan B. Foto Sel Bacillus megaterium Pada Perbesaran 1000X
Microbact identification yang digunakan adalah 24E yaitu kombinasi dari
12A, 12B dan 12E atau disebut juga uji biokimia. Ciri-ciri utama suatu bakteri
yang perlu diketahui dalam mengkarakterisasi bakteri adalah melalui beberapa
uji morfologi dan uji biokimia (Sudarsono, 2008). Hasil perbandingan dari hasil
Uji Microbact Identification isolat bakteri dengan pustaka (Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology dapat dilihat pada Tabel 6 sebagai berikut.
B A
45
Tabel 4. Hasil Uji Microbact Identification
No. Uji biokimia isolat Buku Bergey’s bakteri Bacillus
megaterium
Keterangan
1 Spora + + Cocok 2 Katalase - + Tidak cocok 3 Oksidase + + Cocok 4 Nitrat + + Cocok 5 Lysin - - Cocok 6 V-P - - Cocok 7 H2S - - Cocok 8 Indol - - Cocok 9 Motilitas - + Tidak Cocok 10 Ornithin - - Cocok 11 Arginin - - Cocok 12 Urease - Td
13 Sitrat - + Tidak Cocok
14 Koagulase + Td 15 ONPG + Td 16 TDA - Td
17
Uji Gula-gula = - Glukosa - Arabinosa - Xylosa - Manitol - Adonitol - Inositol - Lactosa - Rafinosa - Ramnosa - Salicin - Sukrosa
+ - - - - - + - - - -
+ - + +
Td Td Td Td Td Td Td
Cocok Cocok
Tidak Cocok Tidak Cocok
18
Hidrolysis = - Gelatine - Starch - Casein
- + +
+ + +
Tidak Cocok Cocok Cocok
19 Malonate - Td 20 hemolisa Beta Beta Cocok
21 Uji sensitive Novobiosin
TDK TDK cocok
Keterangan: td : Tidak ada dalam pustaka
Berdasarkan Tabel 6 hasil uji biokimia pada isolat DSA4 mempunyai ciri-
ciri sebagai berikut : memiliki spora, katalase negatif, oksidase positif, nitrat
positif, lysine negatif, VP negatif, H2S negatif, indol negatif, motilitas negatif,
46
ornithin negatif, arginin negatif, urease negatif, urease negatif, sitrat negatif, sitrat
negatif, koagulase positif, ONPG positif, TDA negatif, glukosa positif, arabinose
negatif, xylosa negatif, manitol negatif, adonitol negatif, inositol negatif, loctosa
positif, rafinosa negatif, ramnosa negatif, salicin negatif, sukrosa negatif, gelatin
negatif, starch positif, casein positif, malonate negatif, hemolisa beta dan tidak
sensitif novobiosin. Dari hasil uji microbact mengacu dengan Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology bahwa spesies bakteri Bacillus megaterium memiliki
persamaan sifat biokimia. Hal ini sesuai dengan Fithriyah (2015), bahwa isolat
bakteri Bacillus megaterium memiliki ciri yaitu selnya berbentuk batang (basil),
mempunyai spora, mampu memfermentasi gula – gula (glukosa, manitol sukrosa,
arabinosa, dan xylosa), aktif pada suhu 20ºC sampai 45ºC, positif membentuk β-
helolisa, tidak resisten terhadap Novobiocin, mengkatalase dan
menghidroksidase hydrogen untuk menghasilkan oksigen
Klasifikasi dari Bacillus megaterium menurut Brook (2001), adalah
sebagai berikut :
Kingdom : Prokaryota Divisio : Protophyta Class : Schizomycetes Ordo : Eubacteriales Family : Bacillaceae Genus : Bacillus Spesies : Bacillus megaterium
Bacillus megaterium adalah bakteri gram positif, berbentuk batang
pembentuk endospora. Bakteri ini termasuk dalam bakteri aerobik, tetapi bakteri
ini juga mampu tumbuh di bawah kondisi anaerobik bila diperlukan (Reddy et al.,
2010). Bakteri tumbuh pada suhu 15ºC - 45ºC, reaksi gula-gula positif pada
glukosa xylosa, manitol, sukrosa, maltose dan arabinosa dan negatif pada
laktosa, media tumbuh positif pada Nutrient Broth (NB) dan negatif pada media
MCA, citrate, indol, MR, VP, motalitas positif, tidak menghidrolisis pati, sensitif
47
terhadap penisilin, reaksi dengan β hemolisa, katalase positif, oksidase positif,
tidak mereduksi nitrat dan methylen blue ( Brenner et al., 2005).
Beberapa golongan Bacillus sp. Seperti megaterium merupakan bakteri
aerob, gram positif, berbentuk batang dengan ukuran diameter 1,2 – 1,5 µm dan
panjang 2,0 – 2,4 µm, bentuk sel-sel silindris sampai oval dan bentuk pear, dan
motil endospora. Selain itu bakteri ini juga ditemukan dari beberapa perairan dan
mangrove Avicennia marina, Rhizophora apiculata, Avicennia alba dan
Sonneratia alba (Yahya et al., 2014).
Bacillus megaterium merupakan bakteri non-patogen dan biasanya
ditemukan pada tanah dan sumber air panas. Spesies ini menjadi menarik
karena mampu memproduksi enzim yang menjanjikan dalam bidang
bioteknologi, produksi rekombinan protein, dan produksi rekombinan fragmen
antibodi. Disisi lain bakteri ini tidak mampu untuk memproduksi protease (Malle
et al., 2012).
Hasil identifikasi pada penelitian ini dengan buku panduan manual
Bergey’s (1986) mengenai karakteristik Bacillus megaterium menunjukkan
beberapa perbedaan hasil meliputi uji motilitas, manitol, xylitol, sitrat, gelatin dan
katalase. Pada penelitian ini uji motilitas, manitol, xylitol, sitrat, gelatin dan
katalase menadapatkan hasil (-) sedangkan pada buku Bergey’s (1986), uji
motilitas, manitol, xylitol, sitrat, gelatin dan katalase menunjukkan hasil positif (+).
Perbedaan hasil tersebut dapat terjadi karena bakteri merupakan makhluk hidup
yang dapat berubah karena dipengaruhi oleh faktor lingkungan sehingga hasil
yang didapatkan tidak selalu sama persis. Selain faktor lingkungan juga
dipengaruhi saat melakukan tahap isolasi dan identifikasi bakteri tersebut.
Berdasarkan pengamatan identifikasi, morfologi, pewarnaan Gram dan uji
biokimia dan dibandingkan dengan buku panduan manual bergey’s (1986) dapat
48
disimpulkan bahwa bakteri penghasil enzim L-asparaginase pada endofit
mangrove berasal dari genus Bacillus, dengan spesies Bacillus megaterium.