sodyum dodesİl sÜlfat polİakrİlamİd jel …dilekbalik.com/seminer/doktora_ylisans/aaslan.pdf*...
TRANSCRIPT
T.C.
FIRAT ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ BÖLÜMÜ
SODYUM DODESİL SÜLFAT
POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ
İLE PROTEİNLERİN ANALİZİ
Yüksek Lisans Semineri
Hazırlayan: Abdullah ASLAN
Danışman: Yrd.Doç.Dr. Dilek Turgut-BALIK
SODYUM DODESİL SÜLFAT POLİAKRİLAMİD
JEL ELEKTROFOREZİ (SDS-PAGE)
1. Elektroforezin Temel Prensibi
2. SDS Poliakrilamid Jel Elektroforezi
3. SDS Poliakrilamid Jel Elektroforezinin Kullanım Amaçları
* Elektroforez, protein ve nükleik asitler gibi yüklü taneciklerin
belirli bir pH’da elektriksel bir alanda ve iyonize ortamda
molekül büyüklüğü veya yük farklarına göre ayrılması ve
saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılan bir tekniktir.
1. ELEKTROFOREZİN TEMEL PRENSİBİ
* Elektroforez, elektriksel alanda yüklü partiküllerin hareketidir.
* Elektroforez sırasında pozitif yüklü partiküller katoda doğru
hareket eder ve bundan dolayı katyon olarak adlandırılırlar,
negatif yüklü partiküller anoda doğru hareket eder ve böylece
anyon olarak adlandırılırlar.
* Bir partikülün göç oranı;
- Elektriksel alan gücüne
- Partikülün net yüküne
- Elektroforez ortamının yoğunluğuna bağlıdır.
* Elektroforez sırasında kullanılan jel matriksi çeşitli büyüklükteki
makromoleküllerin göçünü engelleyen bir moleküler elek özelliği
gösterir. Jel matriksi nispeten hareketsiz olup ayrılacak olan
moleküllerle etkileşmez.
*Jel ortamında biyolojik makromoleküllerin elektroforezi
yapıldığında sürtünme oluşturulur. Sürtünmeden dolayı büyük
moleküller jel matriksi boyunca küçük moleküllerden daha yavaş
göç edeceği için makromoleküllerin ayrılması sağlanır.
* Jel elektroforezi için kullanılan cihazların basit elektrik
devreleri Ohm kanunu ile tanımlanır:
V= I X R (Elektriksel Potansiyel = Akım şiddeti x Direnç)
* Elektroforez cihazında direnç;
-Tamponun iyonik kuvveti
- Jelin kesit alanı
- Jelin uzunluğu ile sağlanır.
* Elektroforez sırasında üretilen güç moleküllerin hareketinde
kullanılır.
* Belirli bir jel elektroforezi sistemi sadece belirli bir ısı
miktarını dağıtabilir.
* Jelde düzensiz ısı dağılımı göçün aynı olmamasına neden
olur.
2. POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ
* Poliakrilamid jel elektroforezi, proteinlerin analizinde birçok
laboratuvarda yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu
teknikte proteinler, elektriksel bir alanda ve iyonize bir
ortamda molekül büyüklüğü veya yük farklılığına göre
ayrılmaktadırlar.
2.1. Doğal Jel Elektroforezi
* Doğal jel elektroforezi proteinlerin, denatüre edici maddeler
(örneğin, sodyum dodesil sülfat) kullanılmadan biyolojik ve
enzimatik özelliklerini kaybetmeksizin ayrıldığı bir tekniktir.
2.2. SDS-PAGE (Denatüre Jel Elektroforezi)
* SDS-PAGE, denatüre edici maddeler (örneğin; sodyum
dodesil sülfat, ß-merkaptoetanol) kullanılarak
proteinlerin poliakrilamid jelde ayrılmasını sağlayan bir
tekniktir.
* Bu teknikte proteinler denatürasyona uğrayarak üç
boyutlu yapıdan linear yapıya dönüşerek poliakrilamid
jelde ayrılırlar.
2.2.1. SDS-PAGE Sistemi
Elektroforez tankı
Güç kaynağı
Jeldeki örnek yükleme kuyularını oluşturan taraklar
Jellerin hazırlandığı cam plaklar
Jel kaseti ve Standı
2.2.2. SDS-PAGE’de Kullanılan Jel Matriksi
* SDS-PAGE’de destekleyici madde (matriks) olarak
poliakrilamid yaygın olarak kullanılmaktadır.
* Poliakrilamid jellerin moleküler elek özellikleri akrilamid
konsantrasyonunun artması ile değişir.
* Poliakrilamid jellerin por büyüklüğü nükleik asitlerin
ayrılmasında kullanılan agaroz jellerinkinden daha küçük olduğu
için küçük moleküllerin ayrılmasını daha iyi sağlamaktadır. Bu
yüzden poliakrilamid jeller, genellikle nükleik asitlerden daha
küçük olan proteinlerin ayrılmasında yaygın olarak
kullanılmaktadır.
2.2.3. SDS-PAGE İçin Kullanılan Tampon Çözeltiler
* Tamponlar akımı ileten iyonları taşır ve pH’ı nisbeten sabit
bir değerde tutar.
* SDS-PAGE’de kullanılan tamponlar şunlardır:
• Ayırma jeli tamponu (1.5M Tris-Cl, pH 8.8)
• Yükleme jeli tamponu (0.5M Tris-Cl, pH 6.8)
• Tank (yürütme) tamponu (0.025M Tris, 0.192M Glisin, %0.1
SDS, pH 8.3)
• Örnek uygulama tamponu (0.125M Tris, %4 SDS, %20
Gliserol, %10 β-merkaptoetanol, Bromophenol blue)
2.2.4. Poliakrilamid Jellerin Hazırlanması
2.2.4.1. Ayırma (separating) Jelinin Hazırlanması (%12)
* Jel oluşturmak için uygun bir pozisyonda tutturulan iki cam
arasına yerleştirilmek üzere ayırma jeli solüsyonu hazırlanır.
* Kaset haline getirilen cam plaklar jel kaseti standına yerleştirilir.
Hazırlanan ayırma jeli solüsyonu pastör pipeti, enjektör veya
uygun bir otomatik pipet ile iki cam arasına aktarılır.
2.2.4.2. Yükleme (stacking) Jelinin Hazırlanması (%4)
* Yükleme jeli solüsyonu hazırlandıktan sonra ayırma jeli
üstünde bulunan boşluğa iki camın en üst seviyesine kadar
yükleme jeli pastör pipeti ile dökülür.
* Protein örneklerini yükleme kuyusu oluşturmak için tarak
yerleştirilir. 30 dakika oda sıcaklığında bekletilerek polimerleşme
sağlanır. Daha sonra tarak dikkatli bir şekilde yavaşça çıkartılır.
2.2.5. Protein Örneklerinin Hazırlanması
* Eşit hacimde protein örneği ve örnek uygulama tamponu
(distile su + Tris-HCI + Gliserol + SDS + β-merkaptoetanol
+ Bromophenol mavisi) küçük bir tüpte karıştırılır.
2.2.6. Poliakrilamid Jelde Protein Örneklerinin
Yürütülmesi
* Jeli taşıyan cam plakalar elektroforez iç modülüne yerleştirildikten
sonra elektroforez tankına bırakılır ve tanka yürütme tamponu
konulur.
* Hazırlanan protein örnekleri ve molekül ağırlığı bilinen standart
protein örnekler yükleme jelindeki tarak dişlerinin oluşturduğu
kuyulara yüklenir.
* Tank kapağı kapatılarak güç kaynağına bağlanır ve akım verilir.
2.2.7. Poliakrilamid Jeldeki Protein Bantlarının
Görüntülenmesi
* Protein bantlarının görünür hale gelmesi için jel boya solüsyonuna
alınır. Burada bir saat- bir gece oda sıcaklığında bekletilir.
* Boya solüsyonundan alınan jel, protein bantlarının dışındaki
boyayı giderici solüsyon ortamına (Destaining: %45 Methanol,
%10 asetik asit, %45 distile su) alınır.
(Turgut- Balik et al., 2004)
* Jel üzerindeki protein bantlarının görüntüsünün en geç 1-2
hafta içinde fotoğrafı alınmalıdır. Ancak jellerin bekletilmesi
gerekiyorsa jel saf su ortamına alınır ve buzdolabında
bekletilir veya jel kurutma sistemlerinde kurutularak
saklanabilir.
2.2.8. Proteinlerin Elektroforetik Göçünü Etkileyen
Faktörler
Protein Molekülünün Büyüklüğü
* Yük bakımından aynı özellikte olan fakat molekül ağırlığı farklı
olan iki proteinin hareket hızı jeldeki mevcut pora bağlı olarak
farklı olacaktır.
* Poliakrilamid jel üzerinde büyük moleküllü proteinler göç
sırasında küçük moleküllü proteinlere göre daha fazla polimerde
tutulur. Buna bağlı olarak büyük molekül yapısına sahip
proteinin hızı küçük olana göre daha az olacaktır.
Akrilamid Konsantrasyonu
* Jeldeki porların büyüklüğü polimerizasyona giren akrilamid
konsantrasyonu ile orantılıdır. Konsantrasyon arttıkça porların
çapı daralırken konsantrasyon azaldıkça porların çapı
genişlemektedir.
Uygulanan Akım ve Süre
* Elektroforez sırasında akım düşük tutulursa süre uzayacaktır.
Sürenin uzun tutulması proteinlerin daha iyi ayrılmasını
sağlayabilir; ancak bazen çok uzun süre jelde kalan proteinler
stabilitesini kaybedebilir.
Kullanılan Tamponun İyonik Kuvveti
* Tamponun iyon konsantrasyonu arttıkça iyonik kuvveti de
artar ve böylece protein moleküllerinin mobilitesi artar.
* İyonik kuvvet azaldıkça proteinlerin mobilitesi azalmaktadır.
* Tamponlar, protein moleküllerinin jeldeki hareketini sağlayan
itici gücü oluşturmaktadır.
3. SDS POLİAKRİLAMİD JEL
ELEKTROFOREZİNİN KULLANIM AMAÇLARI
3.1. Molekül Ağırlığı Tayini
(Turgut-Balik et al., 2004)
3.2. Protein Saflığının Kontrolü
* Saf bir protein doğal jel elektroforezinde tek bir bant verir.
Aynı proteinin SDS-PAGE ile analizi sonucunda da tek bir
bant gözleniyorsa, monomerik yapıda olduğu, birden çok bant
gözleniyorsa multimerik yapıda olduğu anlaşılır.
3.3. Proteinlerin Alt Birimlerinin Belirlenmesi
* ß- merkaptoetanol kullanılarak proteinlerin alt birimleri
incelenebilir.
* Merkaptoetanol, S-S köprüleri ile biri diğerine tutunan protein
alt birimlerini ayırır.
3.4. Aminoasit Dizisinin Tespiti
* Elektroforez sonrası poliakrilamid jeldeki protein bantları
nitroselüloz membrana aktarılır ve dizi analizi yapılması
istenen bant kesilerek ilgili merkezlere gönderilip
proteinin aminoasit dizisi belirlenebilir.
3.5. Western Blotlama
* Elektroforezde birbirinden ayrılan protein bantlarından herhangi
birinin diğerlerinden spesifik antikor kullanılarak ayırt edilmesi
tekniğine Western blot veya İmmünoblot adı verilmektedir.
* Western blot tekniği, elektroforez işlemini takip eden dört
adımda gerçekleştirilir. Bunlar; jeldeki proteinlerin nitroselüloz
membrana aktarımı (blotlama), spesifik olmayan reaksiyonları
engellemek için nitroselüloz membranda protein bağlanmamış
bölgelerin ilgisiz proteinlerle kaplanması (bloklama), özgül
antikorlarla tepkime ve en son adımda ise proteinlerin
görüntülenmesi aşamalarıdır.
4. SONUÇ
* Proteinlerin molekül ağırlığının belirlenmesinde,
* Proteinlerin saflığının kontrolünde,
* Bir proteinin alt birimlerinin belirlenmesinde,
* Bir proteinin izoenzimlerinin belirlenmesinde,
* Bir proteinin aminoasit dizisinin tespit edilmesinde,
* Türler arası benzerlik ve farklılıkların belirlenmesinde,
* Genetik hastalıkların teşhisinde kullanılmaktadır.
T.C.
FIRAT ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ BÖLÜMÜ
SODYUM DODESİL SÜLFAT
POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ
İLE PROTEİNLERİN ANALİZİ
Yüksek Lisans Semineri
Hazırlayan: Abdullah ASLAN
Danışman: Yrd.Doç.Dr. Dilek Turgut-BALIK