sobrexpresion controlada del gen npr1 en … · controle de doenças de plantas fruteiras. 5. ......
TRANSCRIPT
CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA DE YUCATÁN A.C.
Jorge M. Santamaría,, Virginia Herrera-Valencia, Gabriela Fuentes,
Mariana Menéndez, Fabio Idrovo, Miguel Angel Vallejo-Reyna, Santy
Peraza-Echeverría .
CIBIOGEM, 2 Agosto 2012
1.
SOBREXPRESION CONTROLADA DEL GEN NPR1 EN PAPAYA
UTILIZANDO UN PROMOTOR INDUCIBLE POR ETANOL: UNA
ESTRATEGIA BIOTECNOLOGICA PARA EL CONTROL DE LA
ANTRACNOSIS
Porque papaya?
• Un alimento con un alto contenido nutricional (Jiménez, 2002; USDA, 2008). Vitamina C, Vitamina A, polifenoles, licopenos
Fuente: USDA, 2008
100gr de Papaya fresca contienen:
3
PORQUE PAPAYA ?
PAPAYA, PRODUCCION
En el 2010 Se sembraron a nivel mundial 438 mil has que produjeron 11 millones
de tons, con un valor de $3 mil millones de USD
En México, se sembraron 14 mil has produciéndose un total de 616 mil
tons, con un valor de la producción de $174 millones USD
México ocupó el quinto lugar mundial en producción después de India, Brasil, Nigeria
e Indonesiatons USD (millones)
1 India 4,7 millones 1.3 mil
2 Brazil 1,8 millones 531
3 Nigeria 7 millones 199
4 Indonesia 695 mil 197
5 Mexico 616 mil 174
4
• PAPAYA, EXPORTACION
•México, primer exportador a nivel mundial por arriba de Brasil y USA,
exportándose 100 mil tons anualmente,
con un valor de 55 millones de USD
País Cantidad (TM) Valor (10x103 USD)
México 101306 55327
Brasil 32267 34404
EUA 9604 17715
PORQUE ANTRACNOSIS?
•Producida por el hongo Colletotrichum gloeosporioides
Reduce la calidad del fruto en postcosecha
Pérdidas hasta del del 99% en épocas favorables al desarrollo de la
enfermedad.
• Papaya es un fruto climatérico, es decir madura fuera del árbol. Como parte
fundamental de este proceso de maduración poscosecha se libera etileno. Sin
embargo dicho etileno actúa también como señal, para estimular al hongo y
propagar la enfermedad ya que favorece la germinación de esporas, micelio y
apresorios.
Manners , (1993) . Principles of plant pathology. Prusky y Plumbley, (1992). Colletotrichum Dodd et al., (1992). Colletotrichum. (Flaishman yKolatukkudy,1994). Tatagiba et al., (2002). Fitopatologia BrasileiraLiberato y Zambolin (2002). Controle de doenças de plantas fruteiras. 5
Esta enfermedad postcosecha se presenta cuando eletileno dispara el proceso de maduración del fruto.Esto ocurre a los 4 días de ser removido del árbol.
De manera que se empacan frutos aparentementesanos y se exportan, pero en muchas ocasionespueden regresar el contenedor, ya que se recibelleno de antracnosis
6
7Guzmán et al.,(2009). Academia Journals 30:6
LA ENFERMEDAD SE CONTROLA CON
Fungicidas QUIMICOS
Sin embargo los fungicidas químicos causan
problemas ecológicos y su aplicación representa del
30 al 40 % del costo de producción (entre $20 y 40
mil pesos por ha al año) Guzmán et al., (2009).
Mas aún, los fungicidas se aplican además en postcosecha,
durante el empacado del fruto, 12 días antes de ser
consumidos¡
CLARAMENTE, SE REQUIERE UNA
ESTRATEGIA ALTERNATIVA
• Estrategia biotecnológica alterna para el control del patógeno
•SOBRE-EXPRESAR GENES QUE INCREMENTEN LA RESISTENCIA DE LA
PLANTA AL PATOGENO (NPR1, TGA)
•HACERLO EN FORMA CONTROLADA, SISTEMA ALC
•INDUCIR LA EXPRESION EN EL FRUTO COSECHADO POR LO QUE LA PLANTA
NO EXPRESA EL TRANSGEN EN LA PLANTACIÓN
8
¿PORQUE NPR1?NPR1 (No expresivo de genes PR-1)
Es el regulador maestro de la resistencia sistémica adquirida (SAR)
Su sobre-expresión ha resultado en plantas de varias especies, con mayor resistencia a
patógenos
10
Patógeno
Activación de
una muerte
celular
programada
en el sitio de
ataque
Respuesta
Hipersensible
(HR)
Efectores
Ácido
Salicílico
(AS)
A
S
Metil
salicilato
Inducción de la expresión de
genes relacionados a la
patogénesis (PR) en tejidos
distantes a la zona de ataque
Señal que viaja
a través del
floema y activa
la
Zona de
ataque
Resistencia
Sistémica
Adquirida
(SAR)
Clonación de ADNc completosde NPR1 reportados
Especie Referencia
Arabidopsis thaliana Cao et al. 1997
Nicotiana tabacum Liu et al. 2002
Helianthus annuus Ekergren et al. 2003
Lycopersicon esculentum Chern et al. 2005
Oryza sativa Radwan et al. 2005
Malus x domestica Malnoy et al. 2007
Vitis vinifera Henanff et al. 2009
Glycine max Sandhu et al. 2009
La familia génica de NPR1 en Arabidopsis thaliana
Liu et al. 2005
The Plant Journal,
Vol 41, 304–318
Desarrollo
Regulador
positivo
de la SAR
Reguladores
negativos
de la SAR
Hepworth et al, 2005.
The Plant Cell, Vol. 17,
1434–1448
Hepworth et al, 2005.
The Plant Cell, Vol. 17,
1434–1448
Zhang et al., 2006
The Plant Journal,
Vol.48, 647–656
Cao et al. 1997
Cell, Vol. 88
57–63
Sobre-expresión de NPR1 = mayor resistencia a patógenos
Especie Patógeno Fenotipo Referencia
Arabidopsis thaliana Psm ES4526Peronospora parasitica
Resistente Cao et al. 1998
Oriza sativa Xanthomonas oryzae pv oryzae Resistentepleitropía
Fitzgeald et al.2004
Lycopersicon esculentum Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, Stemphylium solaniPhytophthora infestansX. campestris pv. Vesicatoria Ralstonia solanacearumCucumber Mosaic Virus (CMV)Tomato Mosaic Virus (ToMV)Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV)
Resistente Lin et al. 2004
Oriza sativa X. oryzae pv oryzae Resistentepleitropía
Chern et al 2005
Triticum sp. F. graminearum Resistente Makandar et al.2006
Malus × domestica Venturia inaequalisErwinia amylovoraGymnosporangium juniperi-virginianae
Resistente Malnoy et al.2007
Actividad de GUS en tubérculos maduros
(100 mL de agua o disolución de etanol 0.7
M). Sweetman et al., (2002), Plant
Physiology
.
PROMOTOR INDUCIBLE POR ETANOL, GEN alc
Basado en Tomsett et al., (2004) TRENDS in Plant Science
Tubérculo
- +
17
Plant Physiology Volume 129(3):943-948, July 1, 2002
Potato tuber
SOBREXPRESION CONTROLADA DEL GEN NPR1 EN PAPAYA UTILIZANDO UN PROMOTOR INDUCIBLE POR ETANOL:
UNA ESTRATEGIA BIOTECNOLOGICA PARA EL CONTROL DE LA ANTRACNOSIS
Ciencia Básica del CONACYT
CB 83829
2009-2012
18
Objetivos• General
– Caracterizar la estructura, filogenia y expresión del juego completo de los genestipo NPR1 de Carica papaya L., var. Maradol. Sobreexpresar uno de los genesNPR1 mas prometedores en callos embriogénicos, regenerar plantas y evaluarsi frutos de platas que sobreexpresen dicho gen aumentan su resistencia aantracnosis
• Particulares– Caracterizar in silico la estructura de genes tipo NPR1 de Carica papaya L.
Caracterizar las relaciones filogenéticas de genes tipo NPR1 de Carica papaya L.
– Evaluar los patrones de expresión basal de genes tipo NPR1 de Carica papaya L.y en respuesta a SA (inductor de SAR).
– Transformar callos embriogénicos con uno de los genes NPR1 masprometedores, regenerar plantas y evaluar si frutos de las plantas quesobrexpresen dicho gen aumentan su resistencia a antracnosis
Porcentajes de identidad de las secuencias homologas tipo NPR1 (4) encontradas en papaya
vs las 6 secuencias reportadas en A. thaliana
22
Características de NPR1
• Presenta dos dominios de interacción proteína-proteína.– un dominio BTB/POZ (Broad-Complex, Tramtrack, Bric-a-brac /
Poxvirus Zinc finger) .
– un dominio ankyrin-repeat formado de 4 dominios ANK (Ankyrin).
• Cisteínas (Cys) que permiten la oligomerizacion de la proteína.
Hepworth et al, 2005.
The Plant Cell, Vol. 17,
1434–1448
24
Motivo Fosfodegron Tipo IĸB DSxxxS
AtNPR1 1 ----MDTTIDGFADSYEISSTSF-VATDNTDS-SIVYLAAEQVLTGPDVSALQLLSNSFE
AtNPR2 1 MATTTTTTTARFSDSYEFSNTSG-NSFFAAES-SLDYP--TEFLTPPEVSALKLLSNCLE
CpNPR1 1 ----MDYRTG-TSDSNDISNNSS-TCCVATNTDTLSHP--LEPLTTPEISGLQLLSRNLL
AtNPR3 1 -------MATLTEPSSSLSFTSS-HFSYGSIGSNHFSSSS---ASNPEVVSLTKLSSNLE
AtNPR4 1 ------MAATAIEPSSSISFTSS-HLSNPSPVVTTYHS-----AAN-----LEELSSNLE
CpNPR3 1 -------MANSAEPSSSLSFTSSSHLSNCSASHNFSSSSCHETGPNLEVISLSRLSSNLE
CpNPR4 1 -------MENGSEMSSSLSFASS-NLSSSSSSLSHDPCTS---LEN---LSLNKLSCNLE
CpNPR5 1 -------------------------------------------MSS-LEESLRSLSLDYL
AtNPR5 1 -------------------------------------------MSN-LEESLRSLSLDFL
AtNPR6 1 -------------------------------------------MSNTFEESLKSMSLDYL
AtNPR1 55 SVFDSPD-DFYSDAKLVLSD-GREVSFHRCVLSARSSFFKSALAAAKKE-----------
AtNPR2 57 SVFDSPE-TFYSDAKLVLAG-GREVSFHRCILSARIPVFKSALATVKEQ-----------
CpNPR1 53 TIFDSSDFDFFSDARLMLGS-GREIPVHRCILSSRSPFFKAIFSGSAFK-----------
AtNPR3 50 QLLSNSD-CDYSDAEIIVDG--VPVGVHRCILAARSKFFQDLFKKEKKI-----------
AtNPR4 44 QLLTNPD-CDYTDAEIIIEEEANPVSVHRCVLAARSKFFLDLFKKDKDS-----------
CpNPR3 54 RLLIDST-CDYSDADIIVEG--ISVGVHRCILAARSKILN----KVKHS-----------
CpNPR4 47 NLLFHSE-YDYSDAEIVVED--KPVAVHRCILAARSQFFHQLFSKGVVK-----------
CpNPR5 17 NLLINGQ--AFSDVTFSVEG--RLVHAHRCILAARSLFFRKFFCGPDPP---PGLDPT-G
AtNPR5 17 NLLINGQ--AFSDVTFSVEG--RLVHAHRCILAARSLFFRKFFCGTDSPQPVTGIDPT-Q
AtNPR6 18 NLLINGQ--AFSDVTFSVEG--RLVHAHRCILAARSLFFRKFFCESDPSQ—PGAEPANQ
AtNPR1 102 --KDSNNTAAVKLELKEIAKDYEVGFDSVVTVLAYVYSSRVRPPPKGV---SECADENCC
AtNPR2 104 --KSS---TTVKLQLKEIARDYEVGFDSVVAVLAYVYSGRVRSPPKGA---SACVDDDCC
CpNPR1 101 --ERT-----AKFRLKELAGDYDVGFDALVAVLAYLYTGKVWPLPKGV---CVCVDEECS
AtNPR3 96 --SKTE---KPKYQLREMLPYGAVAHEAFLYFLSYIYTGRLKPFPLEV---STCVDPVCS
AtNPR4 92 --SEK----KPKYQMKDLLPYGNVGREAFLHFLSYIYTGRLKPFPIEV---STCVDSVCA
CpNPR3 96 --ANN-------------------------------------------------------
CpNPR4 93 --EGK-----PRYLMSELVPFGVVGYEAFSVFLNYLYTGKLRPSPPEV---STCVDLTCN
CpNPR5 69 SRMSPG-AARG----AGVIPVNSVGYEVFLLLLQFLYSGQVSIVPQKHEPRPNCGERGCW
AtNPR5 72 HGSVPASPTRGSTAPAGIIPVNSVGYEVFLLLLQFLYSGQVSIVPQKHEPRPNCGERGCW
AtNPR6 72 TGSGARAAAVG-----GVIPVNSVGYEVFLLLLQFLYSGQVSIVPHKHEPRSNCGDRGCW
AtNPR1 157 HVACRPAVDFMLEVLYLAFIFKIPELITLYQRHLLDVVDKVVIEDTLVILKLANICGKAC
AtNPR2 156 HVACRSKVDFMVEVLYLSFVFQIQELVTLYERQFLEIVDKVVVEDILVIFKLDTLCGTTY
CpNPR1 151 HVGCRPAVDFLVEVLYVAFTFQISELVALYQRHLLDIIDKVETDNILVILSVANICGKVC
AtNPR3 148 HDCCRPAIDFVVQLMYASSVLQVPELVSSFQRRLCNFVEKTLVENVLPILMVAFNC--KL
AtNPR4 143 HDSCKPAIDFAVELMYASFVFQIPDLVSSFQRKLRNYVEKSLVENVLPILLVAFHC--DL
CpNPR3 99 --------------------------TNSLGRRLLNFTGKAMVEHVLPILVVAFHC--QL
CpNPR4 143 HDACGPAITYALELMYASATFQVKELVLLLQRRLLDFVEKAFVEDVIPILVAAFHC--QL
CpNPR5 124 HTHCTSAVDLALDTLAAARYFGVEQLALLTQKQLASMVEKASIEDVMKVLIASRKQ--DM
AtNPR5 132 HTHCSAAVDLALDTLAASRYFGVEQLALLTQKQLASMVEKASIEDVMKVLIASRKQ--DM
AtNPR6 127 HTHCTAAVDLSLDILAAARYFGVEQLALLTQKHLTSMVEKASIEDVMKVLIASRKQ--DM
AtNPR1 217 MKLLDRCKEIIVKSNVDMVSLEKSLPEELVKEIIDRRKELGLE----VPK----------
AtNPR2 216 KKLLDRCIEIIVKSDIELVSLEKSLPQHIFKQIIDIREALCLE----PPK----------
CpNPR1 211 DRLLGRCMDIIVKSDVDAVTLDKSLPLSIVKQIMDLRAECDTQ----GPEG---------
AtNPR3 206 TQLLDQCIERVARSDLYRFCIEKEVPPEVAEKIKQLRLISPQDEETSPKIS---------
AtNPR4 201 TQLLDQCIERVARSDLDRFCIEKELPLEVLEKIKQLRVKSVN----IPEVE---------
CpNPR3 131 TQLIAQCVDRVARSDLDKVSIEKELPFEVAEDIRLVRDKSPPDENNNREIL---------
CpNPR4 201 NQLLSNCIQRVARSDIDCACLSKELPSEVFSKLKSVRLEIQQDHESSDLEV---------
CpNPR5 182 HQLWTTCSHLVAKSGLPPEVLAKHLPIDVVAKIEELRLKSSLARRSLMPHHHHHHHHHHH
AtNPR5 190 HQLWTTCSHLVAKSGLPPEILAKHLPIDVVTKIEELRLKSSIARRSLMPHN-------HH
AtNPR6 185 HQLWTTCSYLIAKSGLPQEILAKHLPIELVAKIEELRLKSSMPLRSLMPHH---------
1er ANTKYRIN
BTB
BTB
BTB
•El motivo fosfodegron tipo IĸB (Spoel et al., 2009) de seis
aminoácidos se encuentra en Asp10 - Ser15.
25
Motivo Fosfodegron Tipo IĸB DSxxxS
AtNPR1 1 ----MDTTIDGFADSYEISSTSF-VATDNTDS-SIVYLAAEQVLTGPDVSALQLLSNSFE
AtNPR2 1 MATTTTTTTARFSDSYEFSNTSG-NSFFAAES-SLDYP--TEFLTPPEVSALKLLSNCLE
CpNPR1 1 ----MDYRTG-TSDSNDISNNSS-TCCVATNTDTLSHP--LEPLTTPEISGLQLLSRNLL
AtNPR3 1 -------MATLTEPSSSLSFTSS-HFSYGSIGSNHFSSSS---ASNPEVVSLTKLSSNLE
AtNPR4 1 ------MAATAIEPSSSISFTSS-HLSNPSPVVTTYHS-----AAN-----LEELSSNLE
CpNPR3 1 -------MANSAEPSSSLSFTSSSHLSNCSASHNFSSSSCHETGPNLEVISLSRLSSNLE
CpNPR4 1 -------MENGSEMSSSLSFASS-NLSSSSSSLSHDPCTS---LEN---LSLNKLSCNLE
CpNPR5 1 -------------------------------------------MSS-LEESLRSLSLDYL
AtNPR5 1 -------------------------------------------MSN-LEESLRSLSLDFL
AtNPR6 1 -------------------------------------------MSNTFEESLKSMSLDYL
AtNPR1 55 SVFDSPD-DFYSDAKLVLSD-GREVSFHRCVLSARSSFFKSALAAAKKE-----------
AtNPR2 57 SVFDSPE-TFYSDAKLVLAG-GREVSFHRCILSARIPVFKSALATVKEQ-----------
CpNPR1 53 TIFDSSDFDFFSDARLMLGS-GREIPVHRCILSSRSPFFKAIFSGSAFK-----------
AtNPR3 50 QLLSNSD-CDYSDAEIIVDG--VPVGVHRCILAARSKFFQDLFKKEKKI-----------
AtNPR4 44 QLLTNPD-CDYTDAEIIIEEEANPVSVHRCVLAARSKFFLDLFKKDKDS-----------
CpNPR3 54 RLLIDST-CDYSDADIIVEG--ISVGVHRCILAARSKILN----KVKHS-----------
CpNPR4 47 NLLFHSE-YDYSDAEIVVED--KPVAVHRCILAARSQFFHQLFSKGVVK-----------
CpNPR5 17 NLLINGQ--AFSDVTFSVEG--RLVHAHRCILAARSLFFRKFFCGPDPP---PGLDPT-G
AtNPR5 17 NLLINGQ--AFSDVTFSVEG--RLVHAHRCILAARSLFFRKFFCGTDSPQPVTGIDPT-Q
AtNPR6 18 NLLINGQ--AFSDVTFSVEG--RLVHAHRCILAARSLFFRKFFCESDPSQ—PGAEPANQ
AtNPR1 102 --KDSNNTAAVKLELKEIAKDYEVGFDSVVTVLAYVYSSRVRPPPKGV---SECADENCC
AtNPR2 104 --KSS---TTVKLQLKEIARDYEVGFDSVVAVLAYVYSGRVRSPPKGA---SACVDDDCC
CpNPR1 101 --ERT-----AKFRLKELAGDYDVGFDALVAVLAYLYTGKVWPLPKGV---CVCVDEECS
AtNPR3 96 --SKTE---KPKYQLREMLPYGAVAHEAFLYFLSYIYTGRLKPFPLEV---STCVDPVCS
AtNPR4 92 --SEK----KPKYQMKDLLPYGNVGREAFLHFLSYIYTGRLKPFPIEV---STCVDSVCA
CpNPR3 96 --ANN-------------------------------------------------------
CpNPR4 93 --EGK-----PRYLMSELVPFGVVGYEAFSVFLNYLYTGKLRPSPPEV---STCVDLTCN
CpNPR5 69 SRMSPG-AARG----AGVIPVNSVGYEVFLLLLQFLYSGQVSIVPQKHEPRPNCGERGCW
AtNPR5 72 HGSVPASPTRGSTAPAGIIPVNSVGYEVFLLLLQFLYSGQVSIVPQKHEPRPNCGERGCW
AtNPR6 72 TGSGARAAAVG-----GVIPVNSVGYEVFLLLLQFLYSGQVSIVPHKHEPRSNCGDRGCW
AtNPR1 157 HVACRPAVDFMLEVLYLAFIFKIPELITLYQRHLLDVVDKVVIEDTLVILKLANICGKAC
AtNPR2 156 HVACRSKVDFMVEVLYLSFVFQIQELVTLYERQFLEIVDKVVVEDILVIFKLDTLCGTTY
CpNPR1 151 HVGCRPAVDFLVEVLYVAFTFQISELVALYQRHLLDIIDKVETDNILVILSVANICGKVC
AtNPR3 148 HDCCRPAIDFVVQLMYASSVLQVPELVSSFQRRLCNFVEKTLVENVLPILMVAFNC--KL
AtNPR4 143 HDSCKPAIDFAVELMYASFVFQIPDLVSSFQRKLRNYVEKSLVENVLPILLVAFHC--DL
CpNPR3 99 --------------------------TNSLGRRLLNFTGKAMVEHVLPILVVAFHC--QL
CpNPR4 143 HDACGPAITYALELMYASATFQVKELVLLLQRRLLDFVEKAFVEDVIPILVAAFHC--QL
CpNPR5 124 HTHCTSAVDLALDTLAAARYFGVEQLALLTQKQLASMVEKASIEDVMKVLIASRKQ--DM
AtNPR5 132 HTHCSAAVDLALDTLAASRYFGVEQLALLTQKQLASMVEKASIEDVMKVLIASRKQ--DM
AtNPR6 127 HTHCTAAVDLSLDILAAARYFGVEQLALLTQKHLTSMVEKASIEDVMKVLIASRKQ--DM
AtNPR1 217 MKLLDRCKEIIVKSNVDMVSLEKSLPEELVKEIIDRRKELGLE----VPK----------
AtNPR2 216 KKLLDRCIEIIVKSDIELVSLEKSLPQHIFKQIIDIREALCLE----PPK----------
CpNPR1 211 DRLLGRCMDIIVKSDVDAVTLDKSLPLSIVKQIMDLRAECDTQ----GPEG---------
AtNPR3 206 TQLLDQCIERVARSDLYRFCIEKEVPPEVAEKIKQLRLISPQDEETSPKIS---------
AtNPR4 201 TQLLDQCIERVARSDLDRFCIEKELPLEVLEKIKQLRVKSVN----IPEVE---------
CpNPR3 131 TQLIAQCVDRVARSDLDKVSIEKELPFEVAEDIRLVRDKSPPDENNNREIL---------
CpNPR4 201 NQLLSNCIQRVARSDIDCACLSKELPSEVFSKLKSVRLEIQQDHESSDLEV---------
CpNPR5 182 HQLWTTCSHLVAKSGLPPEVLAKHLPIDVVAKIEELRLKSSLARRSLMPHHHHHHHHHHH
AtNPR5 190 HQLWTTCSHLVAKSGLPPEILAKHLPIDVVTKIEELRLKSSIARRSLMPHN-------HH
AtNPR6 185 HQLWTTCSYLIAKSGLPQEILAKHLPIELVAKIEELRLKSSMPLRSLMPHH---------
1er ANTKYRIN
BTB
BTB
BTB
• El dominio BTB (Hepwort et al., 2005) en Ser65 - Val194,
26
AtNPR1 263 ---------VKKHVSNVHKALDSDDIELVKLLLKEDHTNLDDACALHFAVAYCNVKTATD
AtNPR2 262 ---------LERHVKNIYKALDSDDVELVKMLLLEGHTNLDEAYALHFAIAHCAVKTAYD
CpNPR1 258 ------RSFPDKHVKRIHRALDSDDVELVRMLLKEARTNLDDAHALHYAVAYCDAKTTIE
AtNPR3 257 ------EKLLER-IGKILKALDSDDVELVKLLLTESDITLDQANGLHYSVVYSDPKVVAE
AtNPR4 248 ------DKSIER-TGKVLKALDSDDVELVKLLLTESDITLDQANGLHYAVAYSDPKVVTQ
CpNPR3 182 ------DPFREKRVRRIHKALDSDDVELVKLLLTESNISLDDANALHYAVAYCDPKVVSE
CpNPR4 252 ------DAVDEKSIKKIHMALDSDDVELVNRLLSESNITLDKAYALHYAAAYCDPKVVKE
CpNPR5 242 HDLSAAADLEDQKIRRMRRALDSSDVELVKLMVMGEGLNLDEALALHYAVENCSREVVKA
AtNPR5 243 HDLSVAQDLEDQKIRRMRRALDSSDVELVKLMVMGEGLNLDESLALHYAVESCSREVVKA
AtNPR6 236 HDLTSTLDLEDQKIRRMRRALDSSDVELVKLMVMGEGLNLDESLALIYAVENCSREVVKA
AtNPR1 314 LLKLDLADVNHRN-PRGYTVLHVAAMRKEPQLILSLLEKGASASEATLEGRTALMIAKQA
AtNPR2 313 LLELELADVNLRN-PRGYTVLHVAAMRKEPKLIISLLMKGANILDTTLDGRTALVIVKRL
CpNPR1 312 LLDLGLADVNHRN-SRGYTVLHIAAMRKEPKLIVSLLTKGARPSDLTPDGRKALQISKRL
AtNPR3 310 ILALDMGDVNYRN-SRGYTVLHFAAMRREPSIIISLIDKGANASEFTSDGRSAVNILRRL
AtNPR4 301 VLDLDMADVNFRN-SRGYTVLHIAAMRREPTIIIPLIQKGANASDFTFDGRSAVNICRRL
CpNPR3 236 VLCLGLADVNLRN-SRGYTVLHIAAMRKEPSILVSLLTKGASASELTLDGQSSVNICRGL
CpNPR4 306 LLRLGLADLSLRN-PRGLTVLHVAARRKEPSLLMALLTEGASVSGTTLDGQTAVAICRRL
CpNPR5 302 LLELGAADVNFPAGPAGKTPLHIAAEMVSPDMVAVLLDHHADPNVRTVDGVTPLDILRTL
AtNPR5 303 LLELGAADVNYPAGPAGKTPLHIAAEMVSPDMVAVLLDHHADPNVRTVGGITPLDILRTL
AtNPR6 296 LLELGAADVNYPAGPTGKTALHIAAEMVSPDMVAVLLDHHADPNVQTVDGITPLDILRTL
4º ANTKYRIN 3er ANTKYRIN 2º ANTKYRIN
2º ANTKYRIN
1er ANTKYRIN
AtNPR1 373 TMAVECNNIPEQCKHSLKG--RLCVEILEQEDKREQI-PRDVPPSFAVAADELKMTLLDL
AtNPR2 372 TKADDYKTSTEDGTPSLKG--GLCIEVLEHEQKLEYLSPIEASLSLPVTPEELRMRLLYY
CpNPR1 371 TKAADYYNTTEEGKAAPKD--RLCVEILEQAERRDPL-LGEASLSLAKAGDDFRMKLLYL
AtNPR3 369 TNPKDYHTKTAKGRESSKA--RLCIDILEREIRKNPMVL-DTPMCSISMPEDLQMRLLYL
AtNPR4 360 TRPKDYHTKTSR-KEPSKY--RLCIDILEREIRRNPLVSGDTPTCSHSMPEDLQMRLLYL
CpNPR3 295 TRPKDYHAKMEQGQETNKD--RICIDILEREMRRNPMAG-DVSMNSHTVADDLHMKLLYL
CpNPR4 365 TRLKDYNKNIEQGQVSHKD--RICIGILEREMG-NSVSG-NVPISSPMNTDDLQRTLDYL
CpNPR5 362 TSDFLFKGAVPGLTHIEPNKLRLCLELVQSAALVISREE---AGSVNAPTSTAIYPPMSE
AtNPR5 363 TSDFLFKGAVPGLTHIEPNKLRLCLELVQSAAMVISREEGNNSNNQNNDNNTGIYPHMNE
AtNPR6 356 TSDFLFKGAIPGLTHIEPNKLRLCLELVQSAALVISREE---GNNNSNDNNTMIYPRMKD
4º ANTKYRIN
los 4 dominios Ankyrin de la región N-terminal (Cao et al., 1997)
27
AtNPR1 489 EHQSRLKALSKTVELGKRFFPRCSAVLDQIM---NCEDLTQLACGEDDTAEKRLQKKQRY
AtNPR2 489 KHLSRLRALCKTVELGKRYFKRCS--LDHFM---DTEDLNHLASVEEDTPEKRLQKKQRY
CpNPR1 ------------------------------------------------------------
AtNPR3 484 RLLTRMVALMKTVETGRRFFPYGSEVLDKYMAEYIDDDILDDFHFEKGSTHERRLKRMRY
AtNPR4 477 RMLTRMKALMKTVETGRRYFPSCYEVLDKYMDQYMDEEIPDMSYPEKGTVKERRQKRMRY
CpNPR3 408 RLLSRVESLMKTVNMGRRFFPHCSEVLDR----FMEDDLPDLFYLEKGTPDEQRRKRTRF
CpNPR4 540 RLQLQLQKLHKTVETGRRYFPHCSDVLDN---FLEDAEMPDSLFLEKGTPEEQKLKKRRF
CpNPR5 470 TMYHHSHDF---------------------------------------------------
AtNPR5 481 TMYHHHHQHHF-------------------------------------------------
AtNPR6 458 TMYHHHHHHF--------------------------------------------------
AtNPR1 546 MEIQETLKKAFSEDNLELGNSSLTDSTSSTSKSTGGKRSNRKLSHRRR------------
AtNPR2 544 MELQETLMKTFSEDKEECGKS-------STPKPTSAVRSNRKLSHRRLKVDKRDFLKRPY
CpNPR1 ------------------------------------------------------------
AtNPR3 544 RELKDDVQKAYSKDKESKIARSCLSASSSPSSSSIRDDLHNTT-----------------
AtNPR4 537 NELKNDVKKAYSKDK---VARSCLSSSSP--ASSLREALENPT-----------------
CpNPR3 464 MELKDDVQKAFIKDK---ARSSCSGLSSSSSSSSLKDAVT--------------------
CpNPR4 597 MELKEDVQKAFNKDME--NKRS--------------------------------------
CpNPR5 ------------------------------------------------------------
AtNPR5 ------------------------------------------------------------
AtNPR6 ------------------------------------------------------------
NLS
la señal de localización nuclear (NLS por sus siglas en inglés)
(Kinkema et al., 2000) que va de Lys537- Lys554.
• la localización nuclear de la proteína NPR1 se señalan con una flecha ()
• y los relacionados con la interacción con TGA´s con un asterisco (),
•aquellos que intervienen en la transactivación con signo de mas ()
•aquellos que intervienen en la fosforilación con un punto negro ().
TGA
Estructura tridimensional de NPR1 en papaya y arabidopsis
BTB/POZ ANKYRIN REPEATS
AtNPR1
CpNPR1
Fig. 2 Predicted three-dimensional structure of BTB/POZ and ankyrin domains from papaya and Arabidopsis. The 3D models were
generated using the SWISS-model workspace (Bordoli et al. 2009).
Análisis filogenético
29
AAM62410 N.t.
ABG38308 C.a
AAT57637 L.e.
AAT57640 B.v.
XP 002281475 V.v.
CpNPR1C.p.
XP_002308281 P.t.
ABI93182 M.a.
ABL63913 M.a.
CAJ19095 H.v.
AP002537 O.s.
AtNPR1 A.t.
AtNPR2 A.t.
CpNPR4 C.p
XP_002300863 P.t
AtNPR3 A.t
AtNPR4 A.t.
AAT57642 H.a.
CpNPR3 C.p.
ABK62792 P.p.
ACJ45013 G.m.
ACJ45015 G.m.
XP_001757508 P.p.
XP_001759240 P.p.
ABE11621 O.s.
AtNPR6 A.t.
XP_002308905 P.t.
XP_002323261 P.t.
AtNPR5 A.t.
CpNPR5 C.p.
Fig. 5 Neighbor-joining phylogenetic tree of papayaNPR1 homologues (black circles). Numbers on thebranches indicate the percentage of 1000 bootstrapreplications supporting the particular nodes and onlythose with >50% support are shown.
AAM62410 N.t.
ABG38308 C.a
AAT57637 L.e.
AAT57640 B.v.
XP 002281475 V.v.
CpNPR1C.p.
XP_002308281 P.t.
ABI93182 M.a.
ABL63913 M.a.
CAJ19095 H.v.
AP002537 O.s.
AtNPR1 A.t.
AtNPR2 A.t.
CpNPR4 C.p
XP_002300863 P.t
AtNPR3 A.t
AtNPR4 A.t.
AAT57642 H.a.
CpNPR3 C.p.
ABK62792 P.p.
ACJ45013 G.m.
ACJ45015 G.m.
XP_001757508 P.p.
XP_001759240 P.p.
ABE11621 O.s.
AtNPR6 A.t.
XP_002308905 P.t.
XP_002323261 P.t.
AtNPR5 A.t.
CpNPR5 C.p.
Fig. 5 Neighbor-joining phylogenetic tree of papayaNPR1 homologues (black circles). Numbers on thebranches indicate the percentage of 1000 bootstrapreplications supporting the particular nodes and onlythose with >50% support are shown.
.
Cao et al. 1997
Cell, Vol. 88
57–63
Desarrollo
Regulador
positivo de la
SAR
Reguladores
negativos de la
SAR
Hepworth et al, 2005.
The Plant Cell, Vol. 17,
1434–1448
Zhang et al., 2006
The plant Journal, Vol.48
647–656
AtNPR3
AtNPR4
CpNPR3
CpNPR4
AtNPR2
AtNPR1
CpNPR1
AtNPR5
CpNPR5
AtNPR6
Clado1
Clado2
Clado3
MISMA FUNCION
EN PAPAYA?
35
INTEGRACIÓN DEL CASSETTE DE EXPRESIÓN
35S::AlcR::GUS EN Agrobacterium tumefaciens
Fragmentos esperados para los productos de
la doble digestión con HindIII y EcoRI de los
plásmidos pRB35SAlcRGUS y pB35SAlcR.
Gel de los productos de PCR para el cassette de
expresión 35S::AlcR::GUS y el control positivo el
gen uidA (GUSPlus) que presentaron una banda
única de 1200 pb
36
TRANSFORMACIÓN TRANSITORIA EN
hojas DE PAPAYA MARADOL
Expresión transitoria de uidA
(GUSPlus) en hojas (con
peciolo) de plántulas de
papaya Maradol de
aproximadamente 21 días de
edad provenientes de
invernadero
Controles negativos hojas y
tallos de plantas de papaya
Maradol no transformadas,
controles positivos hojas de
N. tabaccum transformadas
de forma estable con el gen
reportero uidA (GUSPlus)
I con infiltración al vacío,
N sin infiltración al vacío.
37
TRANSFORMACIÓN TRANSITORIA DE CALLOS
DE PAPAYA MARADOL
Expresión transitoria de
uidA en callos no
embriogénicos de
papaya Maradol.
I con infiltración al
vacío,
N sin infiltración al
vacío.
Controles negativos
callos de papaya
Maradol no
transformados,
Controles positivos
hojas de N. tabaccum
transformadas de
forma estable con el
gen reportero uidA
(GUSPlus)
39
a) callos embriogénicos de papaya
Maradol en suspensión en
medio líquido MS al 50% con 10
mg mL-1 de 2,4-D b) callos
embriogénicos transformados
con el plásmido
pRB35SAlcRGUS en medio MS
al 100% c) vista al
estereomicroscopio de callos
transformados con el plásmido
pRB35SAlcRGUS inducidos con
etanol
d) e) y f) controles positivos, callos
transformados con el plásmido
pCAMBIA 1305.1 f) vista al
estereomicroscopio control
positivo inducido con etanol,
g) y h) controles negativos, callos
transformados con el plásmido
pRB35SAlcR
i) y j) controles negativos, callos sin
transformar
E inducido con etanol,
S no inducidos con etanol.
EXPRESION DE pRB35SAlcRGUS REGULADA POR ETANOL
EN CELULAS EN SUSPENSIÖN DE PAPAYA MARADOL
┼
┼ ┼
┼ E
┼ E
40
EXPRESION DE pRB35SAlcRGUS REGULADA POR
ETANOL EN CALLOS TRANSFORMADOS DE
PAPAYA MARADOL
Callos no embriogénicos de papaya maradol transformados transitoriamente con el plásmido
pRB35SAlcRGUS. Callo no inducido (concentración de etanol 0.0 % v/v) y callos inducidos con
diferentes concentraciones de etanol
Conclusiones1. Se encontraron 4 secuencias tipo NPR1 en el
genoma de C papaya.
2. Tienen alta homología con las 6 secuencias reportadas en A thaliana
3. Filogenéticamente, al menos una secuencia de C papaya se agrupa en los mismos 3 clados en los que se agrupan las de A thaliana
4. Las 4 secuencias presentan expresión basal en diferentes tejidos de plantas comerciales de C papaya variedad maradol
5. NPR1 aumenta su expresión al ser retada con SA41
Trabajo en progreso
• Sobrexpresar NPR1, con el sistema inducible por etanol, en papaya y evaluar si los frutos de plantas que sobrexpresen el gen, al ser tratados con vapores de etanol, aumentan su resistencia a patógenos como Colletotrichum gloesporioides, disminuyendo las pérdidas por antrcnosis
• Nos interesa sobre-expresar el gen NPR1 para que active la respuesta sistémica adquirida (SAR) de manera temporal. Simulando lo que ocurre de manera natural en el momento mas vulnerable a antracnosis del fruto.
• Hay que tomar en cuenta que el gen NPR1 se expresa de manera basal en papaya, la hipótesis es que un aumento en su expresión, conducirá a la activación de SAR aumentando su resistencia a antracnosis
43
44
a) Embrión
cigótico original,
b y c) al 5 día d)
a los 15 días e) a
los 30 días,
b) f) 71 días
posteriores a la
siembra inicial
g) a los 86 días
h) estructuras
verdes y
elongadas a los
142 días
i) explantes con
raíz, hojas y tallo
visibles a los 145
días j) a los 157 días
k) a los 164 días.
Transformar embriones somáticos con
NPR1 y TGA (con el sitema Alc) y regenerar
plantas
DIA CERO DIA NUEVE
Escala: 30 cm
Los frutos de aquellas plantas que sobrexpresen NPR1, se
retarán con esporas del hongo Colletotrichum gloeosporoides
para definir si aumentó su resistencia a antracnosis
Transformados Sin transformar
Comentario FinalDe comprobarse que los frutos de papaya que sobre-expresen NPR1 confieren resistencia a antracnosis, el presente proyecto puede tener un gran impacto.
Loa anterior, debido a que el transgen no se expresará en el campo de cultivo, sino que sólo se expresará en la empacadora, cuando los frutos cosechados sean expuestos a vapores de etanol.
46
Parte de los resultados del presente proyecto fueron publicados recientemente en: Genes and Genomics, 2012
47
También publicamos este año la caracterización la familia de un factor de transcripción ligado a NPR1 (TGA de C. papaya) que puede ser buen candidato para transformar. PPB, Enero (2012).
• .
48
Productos del proyecto
• 1 tesis de doctorado
• 2 tesis de maestría en Ciencias
• 2 Publicaciones Internacionales
• 1 posible patente
49
Jorge M. Santamaría, Virginia Herrera-Valencia, Gabriela Fuentes, Mariana
Menéndez, Fabio Idrovo, Miguel Angel Vallejo-Reyna, Santy Peraza-Echeverría
El equipo…
51
MC. Anabel Solís. Lab. De Fisiología Molecular y
Personal del Lab.Fitopatología Molecular y Biotecnología de
Cultivos Tropicales, por apoyo técnico en el mantenimiento
de callos embriogénicos
AGRADECIMIENTOS
51
Sr. José Arjona, “Rancho Alegre” por donar material de
papaya para los trabajos de expresión
CONACYT por el financiamiento al presente proyecto
CB 83829
Becas por el financiamiento de las becas PNPC a
FI y MMC