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LUCIANA SANTOS AFONSO DE MELO
SÍNTESE DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS PARA APLICAÇÕES EM
TERAPIA FOTODINÂMICA E ESPECTROSCOPIA
RECIFE
Abril/2011
1
LUCIANA SANTOS AFONSO DE MELO
SÍNTESE DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS PARA APLICAÇÕES EM
TERAPIA FOTODINÂMICA E ESPECTROSCOPIA
Tese apresentada à Coordenação do Programa de
Pós-graduação em Ciência de Materiais, Centro
de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade
Federal de Pernambuco, para a obtenção do grau
de Doutora.
Orientador:
Prof. Dr. Anderson S. L. Gomes.
Co-orientador:
Patrícia M. A. Farias.
Orientador Externo ao Programa:
Renato E de Araújo.
RECIFE
Abril/2011
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Catalogação na fonte
Bibliotecário Vimário C. da Silva, CRB 4-1204
Melo, Luciana Santos Afonso de.
Síntese de nanopartículas metálicas para aplicações em terapia fotodinâmica e
espectroscopia. / Luciana Santos Afonso de Melo. - Recife: a Autora, 2011.
152 f.: fig.
Orientador: Anderson S. L. Gomes.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Pernambuco. CCEN. Ciências de
Materiais, 2011.
Inclui bibliografia.
1. Ciência de materiais. 2. Nanomateriais. 3. Pectina. 4. Terapia fotodinâmica. I. Gomes, Anderson S. L. II. Título.
620.11 (22. ed.) FQ 2011-029
3
4
AGRADECIMENTOS
A meu Orientador, Professor Anderson S. L. Gomes, pela confiança ao ter aceitado
orientar esta tese, pela amizade, pelos conselhos dados e pela ajuda no amadurecimento
profissional.
Ao Professor Renato Araújo, por mais esta colaboração. Pela amizade, paciência,
sugestões e pela ajuda fundamental na discussão dos resultados.
À Professora Patrícia M. A. Farias, pela co-orientação.
À FACEPE e ao CNPQ pelo auxílio financeiro.
Aos professores Sidney Ribeiro e Younes Messaddeq, do Instituto de Química UNESP-
Araraquara, pela confiança e forma generosa com a qual me acolheram em seu grupo de
pesquisas. Pela colaboração, dedicação, interesse e pela amizade que sempre
demonstraram por mim, sendo a participação fundamental para a realização deste
trabalho.
Ao Professor José Albino Aguiar, Coordenador do Programa de pós-graduação em
Ciência de Materiais.
Aos técnicos do CETENE, Departamento de Física da UFPE e do Instituto de Química
da UNESP/ Araraquara, que auxiliaram na caracterização dos materiais empregados
nesta tese.
Aos amigos do Laboratório de Optoeletrônica e Fotônica, do Departamento de Física da
UFPE: Christian Dominguez, Cynthia Feijó, Bernardo Kyotoku, Douglas Vitoreti,
Marco Sacilotti e Rogério Maltez.
Aos amigos do Grupo de Materiais Fotônicos (UNESP-Araraquara): Adalberto Araújo,
Alexandre Gatti, Anne Jaqueline, César Polachini, Danilo Manzani, Denise De Salvi,
Hernane Barud, Igor, Karina Nigoghossian, Kíria Arruda, Lucas, Maurício Kaiut,
5
Robson Rosa da Silva, Sílvia Helena Santagneli, Sybele Saska, Tâmara Joyce,
Wanderson, Yannik Lademi, pela amizade conquistada, pela disposição em ajudar no
meu aprendizado de química, nas discussões e sugestões que engrandeceram esta
pesquisa.
Às Professoras Adriana Fontes e Beate Santos e todos os amigos do Laboratório de
Nanoestruturas e Interfaces Biológicas – UFPE.
Ao Professor Celso P. de Melo e aos alunos do grupo do Laboratório de Polímeros não
Convencionais do Departamento de Física – UFPE, pela ajuda no uso dos equipamentos
empregados na caracterização dos materiais.
A Maria Virgínia da S. Barbosa, técnica responsável pelo laboratório de química do
Departamento de Física, UFPE.
Aos colegas do Programa de Pós-graduação em Ciência de Materiais, em especial,
Claudilene Chaves, Clécio Santos, Gemima Barros, Geórgia Virgínia e Ronaldo Melo e
Sergio Campelo.
Aos funcionários da secretaria de Pós-graduação em Ciência de Materiais.
A meus pais Ildimar e Jair.
6
RESUMO
Nanopartículas de prata são empregadas com freqüência na Biomedicina em
biossensores, técnicas de diagnóstico preventivo, melhoras na aquisição de imagens e
como agentes terapêuticos. Muitas vezes, estas aplicações estão fundamentadas nas
propriedades ópticas, oriundas da ressonância dos plasmons. O objetivo desta tese foi a
preparação e caracterização de nanopartículas de prata a partir de diferentes técnicas
para aplicação em espectroscopia óptica e terapia fotodinâmica. Foram empregados três
métodos diferentes de síntese: o primeiro trata-se da síntese proposta pro Lee e Meisel,
seguida da ablação a laser; o segundo refere-se à síntese de nanopartículas de prata
revestidas por pectina e o último método, refere-se à preparação de nanopartículas de
prata funcionalizadas com grupamentos amina, revestidas com Jeffamina. Também
foram sintetizadas membranas de celulose impregnadas com nanopartículas de prata,
para posterior aplicação no combate de infecções da cavidade oral. As partículas com
revestimento de pectina foram avaliadas em meios fluorescentes (triptofano e pontos
quânticos de CdTe/CdS), promovendo um aumento da fluorescência. Quando as
mesmas nanopartículas foram testadas com a riboflavina, observou-se um aumento na
geração de oxigênio singleto, pois as nanopartículas de prata auxiliam o aumento da
população dos estados excitados tripletos.
PALAVRAS-CHAVE: Ciência de materiais. 2. Nanomateriais. 3. Pectina. 4. Terapia
fotodinâmica.
7
ABSTRACT
Silver nanoparticles are usually employed in biomedical devices as biosensors,
diagnosis techniques, to improve images techniques and as therapeutic agents. Most
applications are based on optical properties of silver nanoparticles, which are coming
from plasmon resonance. The aim of this thesis was to prepare silver nanoparticles by
using different methods and apply to them in optical spectroscopy and photodynamic
therapy. Three different synthesis methods were presented: the first one was purposed
by Lee and Meisel, followed by laser ablation; the second one is a technique which
allows preparing covered pectin silver nanoparticles and the last technique is about
engineering Jeffamine covered silver nanoparticles with amine free radicals. Bacterial
cellulose membranes impregnated with silver nanoparticles also were prepared and were
indicated to be later used to treat oral infections. Pectin covered silver nanoparticles
were evaluated at fluorescent environments (tryptophan and CdTe quantum dots),
increasing the fluorescence. By trying these nanoparticles at riboflavin environment,
there was a singlet oxygen enhancement. It was explained because silver nanoparticles
can enhance triplet population.
KEY WORDS: Materials science; Nanomaterials; Pectin; Photodynamic therapy.
8
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Taça de Lycurgo. Feita de vidro impregnado com nanopartículas de ouro e
prata. Em (A) mostra-se esverdeada ao refletir a luz e, em (B), vermelha ao transmiti-la
(British Museum). .......................................................................................................... 24
Figura 2 – Dimensões representativas de algumas espécies típicas, em suas várias
escalas. Um nanotubo de carbono é dez mil vezes mais fino do que um fio de cabelo,
porém, pode abrigar várias moléculas em seu interior.
Fonte: www.ofitexto.com.br/conteudo/deg_230778.htm. ............................................. 26
Figura 3 – Interações chave entre a Biologia e a Nanotecnologia. (Adaptado de Roco,
2003). ............................................................................................................................. ........................... 27
Figura 4 – Mecanismo de crescimento de nanopartículas de prata estabilizadas por
ânions citrato. Agx são clusters de prata (<1 nm), Agm partículas primárias estabilizadas
pelo citrato (~1 nm), Agn são partículas finais, R• são os radicais redutores. A
concentração de citrato foi 5x10-4
M, em (A), e 5x10-5
ou 1.5x10-3
M, em (B)
(Henglein e Giersig em 1999). ...................................................................................... 43
Figura 5 – Estrutura química da cadeia de pectina (Sriamornsak, 2003). ..................... 48
Figura 6 – Jeffamina monoamina, onde R=H para OE, ou CH3 para OP (Huntsman
Corporation, 2007). ........................................................................................................ 50
Figura 7 – Estruturas representativas das Jeffaminas diaminas. Em (A) Jeffamina série
D; em (B) série ED, onde y será sempre maior do que a soma entre x e z, garantindo que
o polietileno glicol predomine na estrutura central da cadeia; e (C) série EDR
(Huntsman Corporation, 2007). ..................................................................................... 51
Figura 8 – Estrutura representativa das Jeffaminas triaminas (Huntsman Corporation,
2007). ............................................................................................................................. 51
Figura 9 – Representação da celulose. Parte superior, cadeia de celulose pela união de
unidades β-glucose. Parte inferior, esquema do arranjo das fibrilas, microfibrilas e
celulose (Adaptado de Morais, Nascimento e Melo, 2005). ......................................... 54
Figura 10 – Micrografia por MEV da celulose bacteriana. Em (A), morfologia
superficial e, em (B), morfologia da secção transversal. (Adaptado de Maneerung,
Tokura e Rujiravanit, 2008). .......................................................................................... 54
Figura 11 – Representação da produção in situ das nanopartículas de Ag na estrutura
fibrilar da celulose bacteriana (Adaptado de Maria, Santos, Oliveira e col, 2010). ...... 56
Figura 12 – Esquema da síntese de nanopartículas de prata pela técnica de Lee e Meisel.
Exibição das alterações de coloração observadas depois da adição do redutor (Citrato de
sódio): do aspecto inicial, incolor, à coloração amarelo acinzentada e turva observada ao
final da síntese. .............................................................................................................. 58
9
Figura 13 – Esquema da síntese das nanopartículas de prata revestidas com pectina,
apresentando a mudança de coloração (do incolor, passando ao amarelo pálido, até o
amarelo mais forte, porém transparente) observada durante o processo. ...................... 60
Figura 14 – Comparação da coloração entre a suspensão coloidal que utilizou a pectina
durante a síntese, em (A), e a síntese na qual o polímero foi suprimido, em (B). ......... 61
Figura 15 – Esquema ilustrativo da síntese de nanopartículas de prata revestidas com
Jeffamina. ...................................................................................................................... 62
Figura 16 – Variações no aspecto da membrana de CB durante a síntese in situ de
nanopartículas de prata. Em (A), Aspecto natural da membrana hidratada. Em (B),
membrana devido à impregnação com nanopartículas de prata sintetizadas in situ. Em
(C), CB observada na imagem (B) depois de seca. ....................................................... 64
Figura 17 – Variações no aspecto da membrana de CB impregnada por nanopartículas
de prata em suspensão. Em (A), aspecto natural da membrana hidratada. Em (B),
membrana escurecida devido à impregnação com nanopartículas em suspensão. Em (C),
membrana observada na imagem (B) depois de seca. ................................................... 64
Figura 18 – Esquema da ação do laser fragmentando as nanopartículas de prata. Em (A),
cor amarelo acinzentada, depois da síntese química, porém antes da ablação a laser. Em
(B), coloração amarela, mais clara e transparente, depois da ablação a laser. .............. 66
Figura 19 – Gráfico obtido pela técnica de espalhamento dinâmico de luz da amostra
obtida a partir da técnica de Lee e Meisel e submetida a 2 horas de ablação a laser.
Diâmetro médio indicado de aproximadamente 12 nm ................................................. 67
Figura 20 – Espectro de absorção no UV-Vis das nanopartículas de Prata obtidas pela
técnica de Lee e Meisel (curvas normalizadas). Curva em preto, referente às
nanopartículas antes do processo de ablação a laser e, em vermelho, às partículas que
foram submetidas ao processo de ablação, pelo período de 2 horas. ............................ 69
Figura 21 – Micrografia obtida por MET das nanopartículas de prata obtidas pelo
método proposto por Lee e Meisel. Em (A), amostra antes da ablação a laser, forma e
tamanho variados. Em (B), amostra submetida à ablação a laser, partículas esféricas e
com diâmetro médio de 12 nm. ..................................................................................... 71
Figura 22 – Gráfico com as três medidas da técnica de espalhamento dinâmico de luz
para a amostra de nanopartículas de prata revestidas por pectina. ................................ 72
Figura 23 – Gráfico com as três medidas da técnica de espalhamento dinâmico de luz
para a amostra de nanopartículas de prata sem revestimento de pectina. ...................... 73
Figura 24 – Espectro UV-Vis de nanopartículas de prata (curvas normalizadas). Curva
em preto correspondente às nanopartículas de prata sem recobrimento de pectina, em
vermelho às nanopartículas de prata revestidas com pectina. ...................................... 74
Figura 25 – Micrografia obtida a partir de MET dos aglomerados encontrados nas
amostras das nanopartículas de prata com (A) e sem (B) o revestimento de pectina. ... 75
10
Figura 26 – Micrografia obtida a partir de MET das amostras de nanopartículas de prata
com (A) e sem (B) o revestimento de pectina. Em detalhe, um zoom mostrando a
diferença entre as superfícies das duas amostras. .......................................................... 76
Figura 27 – Espectro de absorção no UV-Vis de nanopartículas de prata revestidas com
Jeffamina. ...................................................................................................................... 77
Figura 28 – Micrografia obtida a partir de MET das amostras de nanopartículas de prata
revestidas com Jeffamina. .............................................................................................. 78
Figura 29 – Gráficos contendo as curvas obtidas a partir da espectroscopia de absorção
no UV-Vis para os compósitos formados por membrana de celulose – nanopartículas de
prata. Curva em preto, referente à celulose pura e seca, em vermelho, ao compósito
formado pela CB e nanopartículas de prata, em azul, à banda de plasmons referente às
nanopartículas de prata (diferença entre o compósito e a CB pura). Gráfico (A), amostra
onde houve síntese in situ das nanopartículas de prata, e, (B), para a membrana imersa
na suspensão de nanopartículas. .................................................................................... 79
Figura 30 – Micrografia obtida por MEV da amostra de celulose bacteriana na qual
ocorreu a síntese das nanopartículas. Imagem, com aumento de 25000 X. No detalhe
acima, um aumento de 40000 X da região assinalada. Abaixo, aspecto da amostra
utilizada. ........................................................................................................................ 81
Figura 31 – Micrografia obtida por MEV da amostra de celulose bacteriana que foi
imersa em suspensão de nanopartículas de prata. Imagem, com aumento de 20000 X.
No detalhe acima, um aumento de 50000 X da região assinalada. Abaixo, aspecto da
amostra utilizada. ........................................................................................................... 81
Figura 32 – Esquema de preparo das amostras de celulose bacteriana impregnadas com
prata para avaliação por MET. ...................................................................................... 82
Figura 33 – Micrografias obtidas por MET das amostras de CB impregnada com prata.
(A) CB na qual ocorreu a síntese in situ e, em (B), membrana imersa na suspensão
contendo nanopartículas de prata. ................................................................................. 83
Figura 34 – Nanopartículas de prata em suspensão. Variações de cor relacionadas ao
tamanho das partículas (Fonte: www.danaco.net/silver.html). ..................................... 86
Figura 35 – Esquema da oscilação dos plasmons para uma esfera. Resposta a uma
excitação eletromagnética que tem como conseqüência a geração de uma nuvem dos
elétrons de condução da partícula (Kelly e col, 2003). ................................................. 87
Figura 36 – Seleção da ressonância de plasmons em nanopartículas metálicas, levando
em consideração o tamanho, a forma e a estrutura de composição (Adaptado de Gomes,
2009). ............................................................................................................................. 88
Figura 37 – Esquema ilustrativo da diferença do dipolo induzido mediante a incidência
da radiação eletromagnética em nanopartículas de formato esférico (parte superior) e de
bastões (parte inferior). Em (A), micrografias obtidas por MET, havendo dois tamanhos
diferentes para as partículas esféricas. Em (B), formação do dipolo induzido. Em (C),
11
gráficos dos espectros de absorção gerados por partículas esféricas de tamanhos
variados, parte superior, e por nanobastões, parte inferior. (Adaptado de: El-Sayed,
2001; Liz-Marzán, 2004). .............................................................................................. 89
Figura 38 – Em (A), aspecto macroscópico dos nanobastões de ouro e prata obtidos a
partir de reações fotoquímicas, em suspensões. Em (B), espectros de absorção no UV-
Vis das suspensões mostradas em (A). (C), micrografias obtidas por MET, em maior e
menor aumento, das mesmas amostras (Song e Yang, 2002). ...................................... 90
Figura 39 – Diagrama de Jabłoński clássico, em (A). Em B, o diagrama modificado para
ilustrar a presença de ilhas, partículas ou colóides metálicos. E – excitação, Em – taxa de
excitação intensificada pela presença do metal, e Гm – taxa radiativa na presença de
metal (Adaptado de Geddes e Lakowicz, 2002). ........................................................... 93
Figura 40 – Aumento da intensidade de emissão do fluoróforo à medida que este se
aproxima da superfície metálica. A concentração de agente desativador se mantém em
todo o sistema. F – fluoróforo, Q – agente desativador (Adaptado de Geddes e
Lakowicz, 2002). ........................................................................................................... 96
Figura 41 – Espectros do triptofano. Em (A), espectro de absorção no UV-Vis do
triptofano, em vermelho, e das nanopartículas de prata revestidas pela pectina, em preto.
Em (B), Estudo da emissão da associação entre nanopartículas de prata revestidas por
pectina e triptofano. Em preto, ausência de emissão da suspensão coloidal de
nanopartículas de prata revestidas com pectina. Em vermelho, emissão do triptofano em
água. Em azul, emissão do triptofano em meio contendo as nanopartículas de prata com
pectina. ........................................................................................................................... 99
Figura 42 – Espectro de emissão da solução de triptofano com diferentes fatores de
preenchimento de nanopartículas de prata (ƒ) excitados pelo processo de absorção de
(A) 1, (B) 2, e (C) 3 fótons (Adaptado de Rátiva, Gomes, Wachsmann-Hogiu e col,
2008). ............................................................................................................................100
Figura 43 – Espectro de absorção e de emissão dos pontos quânticos de CdTe/CdS. No
detalhe, suspensão dos pontos quânticos excitada por luz ultra-violeta (λ – 365 nm). 103
Figura 44 – Curvas do espectro de emissão dos sistemas: Pontos quânticos de
CdTe/CdS em água (em preto); pontos quânticos de CdTe/CDs com nanopartículas de
prata revestidas com pectina (em vermelho); pontos quânticos de CdTe/CdS com
nanopartículas de prata sem pectina (em azul) e pontos quânticos de CdTe/CdS com
nanopartículas de prata obtidas pela técnica de Lee e Meisel, seguida da ablação a laser
(em verde). λ de excitação (acima dos gráficos) – 280, 375 e 445 nm.
...................................................................................................................................... 105
Figura 45 – Curvas do espectro de emissão dos sistemas: Pontos quânticos de
CdTe/CdS em água (em preto); pontos quânticos de CdTe/CdS com pectina, sem prata
(em vermelho) e pontos quânticos de CdTe/CdS em meio contendo nanopartículas de
prata revestidas com pectina (em azul). λ excitação de 375 nm. ................................. 106
Figura 46 – Mecanismos da terapia fotodinâmica (Adaptado de DeRosa e Crutchley,
2002). ........................................................................................................................... 110
12
Figura 47 – Estrutura da riboflavina, destacando a cadeia ribitil e o sistema de anéis
isoaloxazina, responsável pela característica de fluorescência da molécula. No detalhe,
seu aspecto de pó de coloração amarelo forte (Souza, Ferreira, Jucá e col, 2005). ..... 114
Figura 48 – Interpretação da intensificação da fosforescência na presença de metais (A)
e da geração do oxigênio singlet0 (B). P – fosforescência, RB – fotossensibilizador, 3O2
– Oxigênio no estado fundamental tripleto e 1O2 – Oxigênio singlete (Adaptado de
Zhang, Aslan, Previte e col, 2008). ............................................................................. 121
Figura 49 – Esquema do Diagrama de Jablonski para a amplificação da produção de
Oxigênio singleto decorrente da associação entre um fotossensibilizador e os plasmons
superficiais. MEF – Fluorescência amplificada pela presença das nanopartículas
metálicas. MEP – Fosforescência amplificada pela presença das nanopartículas
metálicas. 3O2, Oxigênio no estado tripleto e
1O2, Oxigênio singleto; isc – cruzamento
intersistemas (Adaptado de Zhang, Aslan, Previte e col , 2007). ............................... 122
Figura 50 – Em (A), aspecto do GR. Em (B), propriedades espectrais do GR, antes e
depois da interação com 1O2. Absorção, em a e c, e emissão, em b e d. Sendo que a e b,
correspondem às medidas feitas antes da produção do oxigênio singleto. c e d, depois.
As medidas da emissão foram obtidas com comprimento de onda de excitação em 480
nm (Flors, Fryer, Waring e col, 2006). ........................................................................ 123
Figura 51 – Espectro de absorção no UV-Vis, em preto, das nanopartículas de prata
revestidas com pectina; em vermelho, espectro de absorção no UV-visível da
Riboflavina em água e, em azul, da riboflavina em meio contendo nanopartículas de
prata revestidas com pectina. Foi utilizada uma cubeta de quartzo de 1 mm. ............. 125
Figura 52 – Espectros de emissão. Curva em preto, nanopartículas de prata revestidas
por pectina (ausência de emissão), em vermelho, riboflavina em água e, em azul,
riboflavina em meio contendo nanopartículas de prata revestidas com pectina. λ de
excitação: 267 nm (esquerda), 375 nm (direita) e 444 nm (abaixo). (Estas curvas foram
obtidas com o equipamento Varian (Palo Alto, CA, USA) Cary Eclipse Fluorescence
Spectrophotometer). .................................................................................................... 126
Figura 53 – Espectros de emissão. Curva em preto, riboflavina em água; em vermelho,
riboflavina em meio contendo nanopartículas de prata sem revestimento de pectina; e,
em azul, riboflavina em meio contendo nanopartículas de prata revestidas com pectina.
λ de excitação: 415 nm (esquerda) e 502 nm (direita). (Estas curvas foram obtidas com
o espectrofluorímetro contador de fótons modelo ISS PC1). ...................................... 127
Figura 54 – Espectros de emissão do sensor para oxigênio singlete. Em (A), antes da
irradiação com o sistema de LEDs indutor de produção de oxigênio singleto. Em (B),
depois de 2 minutos de irradiação das amostras. Comprimento de onda de excitação foi
de 502 nm. ................................................................................................................... 129
Figura 55 – Espectros de emissão utilizados para quantificar a produção de oxigênio
singleto. Em (A): curva em preto, emissão do GR em água, sem nanopartículas de prata
e sem riboflavina; em vermelho, emissão do GR em nanopartículas de prata com pectina
e sem riboflavina. Em (B): curva em preto, emissão do GR e riboflavina em água,
depois da irradiação com LEDs; em vermelho, emissão do GR e riboflavina em
13
nanopartículas de prata, depois da irradiação com LEDs. Em (C): curva em preto,
emissão da riboflavina em água; em vermelho, emissão da riboflavina em
nanopartículas de prata com pectina; λ excitação = 502 nm. ...................................... 131
Figura 56 – Fator de amplificação da produção de oxigênio singleto para vários
fotossensibilizadores. 1, acridina; 2, RB; 3, cloroquina; 4, indometacina; 5, riboflavina;
6, naproxen; 7, cloropromazina; 8, quinidina. (Adaptado de Zhang, Aslan, Previte e col,
2008). ........................................................................................................................... 132
14
LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES
CB – Celulose bacteriana
CETENE – Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste
DNA – Ácido desoxirribonucléico (deoxynbonucleic acid)
FAD – Dinucleotídeo de flavina e adenina
FMN – Moninucleotídeo de flavina
GR – Sensor verde para oxigênio singleto
MEF – Amplificação da fluorescência por superfícies metálicas (metal enhancement
fluorescence)
MET – Microscopia eletrônica de transmissão
MEV – Microscopia eletrônica de varredura
MIC – Mínima concentração inibitória (Minimum Inhibitory Concentration)
PM – Peso molecular
PMMA – Polimetilmetacrilato
ROS – Espécies de Oxigênio reativas (reactive oxygen species)
TFD – Terapia fotodinâmica
UFPE – Universidade Federal de Pernambuco
UNESP – Universidade Estadual Paulista
UV-vis – Ultravioleta-visível
15
LISTA DE SÍMBOLOS
AgNO3 – Nitrato de prata
C – Celsius
Hz – hertz
l – litro
ml – militro
mg – miligrama
µg – micrograma
M – molar
mM – milimolar
µM – micromolar
nM – nanomolar
m – metro
nm – nanômetro
16
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 19
OBJETIVOS ................................................................................................................ 22
CAPÍTULO 1
NANOPARTÍCULAS DE PRATA EM NANOBIOTECNOLOGIA ..................... 22
1.1 NANOPARTÍCULAS DE PRATA ......................................................................... 23
1.2 NANOBIOTECNOLOGIA ..................................................................................... 25
1.3 APLICAÇÕES DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS EM
NANOBIOTECNOLOGIA ........................................................................................... 27
1.3.1 Biossensores ......................................................................................................... 28
1.3.2 Agentes de contraste em técnicas de imagem ...................................................... 29
1.3.3 Terapia contra o câncer ......................................................................................... 31
1.3.4 Atividade antibacteriana ....................................................................................... 32
1.3.5 Atividade antifúngica e antiviral .......................................................................... 35
1.4 PERSPECTIVAS E PRECAUÇÕES RELACIONADAS À
NANOBIOTECNOLOGIA ........................................................................................... 36
CAPÍTULO 2 ............................................................................................................... 39
SÍNTESE DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA
2.1 SÍNTESE DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA ................................................. 40
2.1.1 Síntese de nanopartículas de prata através de redução pelo citrato ...................... 41
2.2 REVESTIMENTO DE NANOPARTÍCULAS ....................................................... 43
2.2.1 Revestimento polimérico ..................................................................................... 46
2.3 COMPÓSITOS À BASE DE CELULOSE BACTERIANA .................................. 53
2.3.1 Celulose ................................................................................................................ 53
2.3.2 Compósitos à base de celulose bacteriana (CB).................................................... 55
17
2.4 METODOLOGIA DE SÍNTESE PARA NANOPARTÍCULAS DE PRATA ....... 57
2.4.1 Síntese de nanopartículas de prata através da Técnica de Lee e Meisel seguida de
ablação a laser ................................................................................................................ 57
2.4.2 Síntese de nanopartículas de prata revestidas por Pectina .................................... 59
2.4.3 Síntese de nanopartículas de prata revestidas por Jeffamina ................................ 61
2.4.4 Síntese de nanocompósitos a base de celulose bacteriana e nanopartículas de prata
........................................................................................................................................ 63
2.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 65
CAPÍTULO 3 ............................................................................................................... 84
APLICAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA EM ESPECTROSCOPIA
ÓPTICA
3.1 PROPRIEDADES ÓPTICAS NAS NANOPARTÍCULAS METÁLICAS ............ 85
3.1.1 Absorção e espalhamento de luz .......................................................................... 85
3.2 INTERAÇÃO ENTRE SUPERFÍCIES METÁLICAS E FLUORÓFOROS ......... 91
3.3 METODOLOGIA PARA ANÁLISE ÓPTICA DE SISTEMAS COLOIDAIS DE
PRATA .......................................................................................................................... 96
3.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 98
CAPÍTULO 4 ............................................................................................................. 107
NANOPARTÍCULAS DE PRATA E TERAPIA FOTODINÂMICA
4.1 TERAPIA FOTODINÂMICA ...............................................................................108
4.1.1 Mecanismos da terapia fotodinâmica ................................................................. 109
4.1.2 Oxigênio singleto ................................................................................................ 111
4.1.3 Fotossensibilizadores .......................................................................................... 112
4.2 TERAPIA FOTODINÂMICA NO TRATAMENTO DE INDECÇÕES
LOCALIZADAS ......................................................................................................... 115
4.2.1 Terapia Fotodinâmica para tratamento de infecções localizadas em Odontologia.
...................................................................................................................................... 117
18
4.3 NANOPARTÍCULAS METÁLICAS EM TERAPIA FOTODINÂMICA .......... 120
4.4 METODOLOGIA .................................................................................................. 122
4.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 124
CONCLUSÕES .......................................................................................................... 133
PERSPECTIVAS ....................................................................................................... 135
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 136
19
INTRODUÇÃO
Os materiais sempre acompanharam a história da humanidade, desde a idade da
pedra, passando pela descoberta dos metais, até o uso dos plásticos. Atualmente,
materiais utilizados desde a antiguidade, como ouro e prata, estão participando de mais
uma transformação científica e tecnológica, pois se descobriu que quando reduzidos a
escalas nanométricas, eles apresentam propriedades diferentes das observadas nos
materiais convencionais. Estas diferenças são atribuídas à alta relação superfície/volume
existente nos materiais com tamanho nanométrico, que faz com que o número de
átomos presentes na sua superfície seja comparável ao número de átomos localizados no
seu interior. Desta forma, as propriedades físicas e químicas conhecidas no material em
sua forma volumétrica, passam a ser influenciadas pela estrutura de defeitos da
superfície. Estas propriedades dos nanomateriais, mesmo sem o devido conhecimento,
intrigam a humanidade desde a antiguidade quando egípcios produziam um vidro de
coloração vermelha intensa, atribuída à presença de nanopartículas de ouro. Também
foram encontradas nanopartículas metálicas em vitrais coloridos utilizados para adornar
capelas medievais.
A descoberta de novas propriedades tem como conseqüência a inovação das
aplicações que incluem desde o desenvolvimento de dispositivos ópticos, eletrônicos e
de sensores, beneficiando também a área da Biomedicina. No caso de nanopartículas de
metais nobres, dentre elas as de prata, as aplicações, em geral, baseiam-se na
ressonância dos plasmons, ou seja, na oscilação coletiva dos elétrons de condução em
resposta à excitação promovida por um campo eletromagnético externo. Inicialmente as
nanopartículas de prata foram empregadas para aumentar o sinal oriundo de moléculas
orgânicas avaliadas pela técnica de Espectroscopia Raman (Lee e Meisel, 1982). Porém,
20
também são aplicadas no combate a infecções microbianas causadas por bactérias,
fungos ou vírus (Clement e Jarrett, 1994). Atualmente, as nanopartículas de prata
também vêm sendo aplicadas como amplificadoras de fluorescência (Geddes e
Lakowicz, 2002; Lakowicz, Chowdhury, Ray e col, 2006), auxiliando técnicas de
diagnóstico (Hirsch, Stafford, Bankson e col, 2003; Aslan, Zhang, Lakowicz e col,
2004; Loo, Lin, Hirsch, e col, 2004; Chen, Liu, Ameer e col, 2005) e também no
tratamento para doenças como o câncer, por intermédio das técnicas de terapia
fototérmica e da terapia fotodinâmica (Hirsch, Stafford, Bankson e col, 2003; Loo, Lin,
Hirsch, e col 2004; Skrabalak, Chen, Sun e col, 2008).
Para melhor compreensão, esta tese foi dividida da seguinte forma: No Capítulo
1, nanopartículas metálicas em nanobiotecnologia; no Capítulo 2, síntese de
nanopartículas de prata; Capítulo 3, Aplicação de nanopartículas de prata em
espectroscopia óptica e, Capítulo 4, Nanopartículas de prata e terapia fotodinâmica.
Esta tese foi realizada em parceria com o Grupo de Materiais Fotônicos, sob a
supervisão dos Professores Sidney J. L. Ribeiro e Younes Messaddeq (Instituto de
Química – UNESP/Araraquara) e com o Laboratório de Biofísica Química, sob a
supervisão das Professoras Adriana Fontes, Beate Santos e Patrícia M. A. Farias (Depto.
de Biofísica e Radiobiologia, UFPE). Esta tese contou com o apoio financeiro da
FACEPE e CNPQ.
21
OBJETIVOS
O objetivo geral deste trabalho é sintetizar nanopartículas de prata a partir de
diferentes técnicas de síntese para aplicação em terapia fotodinâmica e espectroscopia
óptica.
Objetivos específicos:
Os objetivos específicos foram:
1) Sintetizar nanopartículas de prata empregando diferentes técnicas.
2) Caracterizar as nanopartículas sintetizadas.
3) Avaliar a ação de nanopartículas de prata em meios fluorescentes.
4) Avaliar a ação de nanopartículas de prata na produção do Oxigênio singleto.
22
CAPÍTULO 1
NANOPATÍCULAS DE PRATA EM NANOBIOTECNOLOGIA
O primeiro capítulo apresenta um breve histórico sobre as nanopartículas de
prata e relata suas participações na nanobiotecnologia, dentre elas foram citadas a
atuação das nanopartículas de prata em biossensores, no combate de doenças causadas
por vírus, fungos e bactérias, como agentes de contraste em técnicas de imagem e no
tratamento do câncer. Com tantas aplicações possíveis na área da Biomedicina, o
capítulo finaliza admitindo a relevância das descobertas para a Nanobiotecnologia, mas
ressalta a importância da realização de estudos relacionados a possíveis efeitos nocivos
ao corpo humano e ao meio ambiente.
23
1.1 NANOPARTÍCULAS DE PRATA
O prefixo “nano” tem sua origem na língua grega e significa anão. Um
nanômetro (1 nm) corresponde à bilionésima parte do metro (1.0x10-9
m). Ou seja,
átomos são menores do que 1 nm e algumas moléculas, como as proteínas, têm suas
dimensões de aproximadamente 1 nm. O termo Nanotecnologia foi utilizado pela
primeira vez em 1959, pelo físico Richard Feynman, ao perceber a possibilidade de
manipular um material que estivesse na mesma escala de átomos e moléculas. Em
seguida, o termo caiu em desuso, até que, em 1974, Norio Taniguchi, pesquisador da
Universidade de Tókio, empregou-o para definir a capacidade de produzir materiais em
escala nanométrica (Sahoo, Parveen e Panda, 2007).
A nanotecnologia é a ciência que trabalha numa escala que vai de 1 a 100 nm e
tem como objetivo compreender, criar e aplicar materiais, estruturas e dispositivos
fundamentados em novas propriedades, funções e, conseqüentemente, aplicações a
partir de estruturas pequenas (Bauer, Birenbaum e Meyer, 2004).
Nesta tese, serão trabalhadas as nanopartículas de prata, cujas propriedades
ópticas, mesmo sem o devido conhecimento, são utilizadas desde o Império Romano.
Este fato foi observado ao se analisar a taça de Lycurgo (Figura 1) que data do século
IV, d. C., atualmente exposta no Museu Britânico. A presença de nanopartículas de ouro
e prata com o diâmetro médio de aproximadamente 40 nm excitadas pela luz atribui à
taça mudanças de coloração. A taça absorve e espalha luz verde e azul, por isto, quando
vista em luz refletida, apresenta-se esverdeada (Figura 1(A)). Porém, se uma fonte de
luz for colocada dentro da taça, ela adquire uma coloração avermelhada (Figura 1(B))
(Barber e Freestone, 1990). Vitrais presentes em catedrais e castelos medievais como
24
um dos vitrais mais antigos do mundo, encontrado no Castelo de Sułkowskich, na
Polônia também se utilizam das propriedades ópticas das nanopartículas metálicas.
Figura 1 – Taça de Lycurgo. Feita de vidro impregnado com nanopartículas de ouro e prata. Em (A)
mostra-se esverdeada ao refletir a luz e, em (B), vermelha ao transmiti-la (British Museum).
Os primeiros interesses científicos em nanopartículas metálicas se limitaram a
aplicações para aumentar o sinal oriundo de moléculas orgânicas mediante a técnica de
Espectroscopia Raman (Lee e Meisel, 1982). Também foram estudados eficientes
dispositivos antimicrobianos baseados em nanopartículas de prata (Clement e Jarrett,
1994). No final da década de 80 descobriu-se que nanopartículas metálicas exibiam
propriedades importantes não observadas em materiais em sua forma volumétrica. As
propriedades físicas e químicas passaram a ser influenciadas pela relação
superfície/volume e a descoberta da ressonância dos plasmons superficiais permitiu o
desenvolvimento de novos dispositivos ópticos, eletrônicos e de sensores, trazendo
novas aplicações para estes materiais. Atualmente, é reconhecido que as propriedades e,
conseqüentemente, as aplicações das nanopartículas de prata são moduladas pela forma
(A) (B)
25
e tamanho, sendo fundamental o controle destes parâmetros no momento da síntese do
material (Henglein, 1998).
Dentre as nanopartículas metálicas, as de prata foram selecionadas para este
trabalho, por apresentarem boa capacidade de amplificar sinais de fluorescência, além
de seu precursor ser inerte e de baixo custo (Taton, Mirkin e Letsinger, 2000; Cao, Jin e
Mirkin, 2002; Zhang, Malicka, Gryczynski e col, 2005). Por outro lado, como a
reatividade da prata é maior do que a do ouro, a obtenção de uma amostra com
distribuição de tamanho homogênea e estável torna-se mais difícil (Krutyakov,
Kudrinsky, Olenin e col, 2008).
1.2 NANOBIOTECNOLOGIA
Todos os sistemas biológicos, inclusive o corpo humano, são organizados
primariamente em escala nanométrica, e é exatamente neste nível onde funções e
propriedades importantes são regidas para o perfeito controle e funcionamento dos seres
vivos e também do meio ambiente. O grande interesse na associação entre a
nanotecnologia e a biomedicina está focado na possibilidade de se facilitar e fortalecer a
interação entre os nanomateriais e os sistemas biológicos alvo. Ishijima e Yanagida,
(2001) e Brau, Tarsa, Ferrer e col (2006) acreditam que, agindo-se em nível celular,
torna-se mais fácil controlar e recuperar os sistemas vivos. Para facilitar a compreensão
desta possível interação entre os sistemas biológicos e materiais nanoestruturados, a
figura 2 traz uma escala de comparação entre as dimensões de nanotubos de carbono e
estruturas presentes no organismo humano (fios de cabelo e hemácias), vírus e até
átomos e moléculas.
26
Figura 2 – Dimensões representativas de algumas espécies típicas, em suas várias escalas. Um nanotubo
de carbono é dez mil vezes mais fino do que um fio de cabelo, porém, pode abrigar várias moléculas em
seu interior. Fonte: www.ofitexto.com.br/conteudo/deg_230778.htm.
Pode-se definir a Nanobiotecnologia como a área da ciência que aplica
princípios e técnicas em escala nanométrica para compreender e transformar sistemas
biológicos (vivos ou não vivos) e que usa princípios da Biologia aliados aos da Ciência
de Materiais, com o objetivo de criar novos dispositivos e sistemas integrados, em
escala nanométrica. Ou seja, é uma combinação entre dois ramos distintos da ciência,
onde a nanotecnologia contribui com as ferramentas e as plataformas tecnológicas para
a investigação e transformação dos sistemas biológicos, enquanto que a biologia oferece
os modelos de inspiração e componentes biológicos para a nanotecnologia, como
apresentado na figura 3 (Roco, 2003).
27
Figura 3 – Interações chave entre a Biologia e a Nanotecnologia. (Adaptado de Roco, 2003).
1.3 APLICAÇÕES DAS NANOPARTÍCULAS DE PRATA EM
NANOBIOTECNOLOGIA
Nanopartículas de metais nobres, como o ouro e a prata contribuem para avanços
importantes na Biomedicina, pois além de se encontrarem na mesma escala das
estruturas primárias (células, genes) que formam os tecidos biológicos, suas
propriedades permitem aplicações variadas. Em sua maioria, estas aplicações estão
fundamentadas nas propriedades ópticas, oriundas da ressonância dos plasmons (Link,
Wang e El-Sayed, 1999) e consistem em biossensores (Haes e Duyne, 2002; Aslan,
Lakowicz, Malicka e col, 2005), diagnóstico preventivo (McFarland e Duyne, 2003),
melhoras na aquisição de imagens (Sahoo, Parveen e Panda, 2007) e como agentes
terapêuticos (Huang, Jain, El-Sayed e col, 2008). Os novos métodos de diagnóstico e
tratamento estão cada vez mais próximos de serem aplicados clinicamente (Thrall,
Bio Nano
Plataformas científicas e tecnológicas
Biomateriais e processos
Ferramentas
Modelos
Bio Nano
Plataformas científicas e tecnológicas
Biomateriais e processos
Ferramentas
Modelos
28
2004) e contam com um artifício importante que é a possibilidade de alteração
superficial das partículas, a funcionalização. Para se modificar a superfície das
nanopartículas metálicas geralmente são empregados polímeros sintéticos e ligantes
apropriados capazes de reconhecer e se ligar a sítios específicos nas células que fazem
parte do tecido alvo (Moghimi, Hunter e Murray, 2005; Ebbesen e Jensen, 2006; Sahoo,
Parveen e Panda, 2007).
1.3.1 Biossensores
Um biossensor capta a interação entre um ligante e um receptor. O campo
gerado pela ressonância de plasmons decorrente do uso de nanopartículas de prata nesta
técnica tem a capacidade de torná-la mais sensível, aumentando sua eficácia (Haes e
Duyne, 2002). A aplicação de nanopartículas de prata como sensores biológicos baseia-
se no fato de seu comportamento óptico depender das propriedades dielétricas do meio
no qual elas se encontram, ou seja, variações das moléculas presentes neste meio
modificam características como a absorbância o sistema coloidal (Stuart, Haes, Yonzon
e col, 2005).
Pacientes que sofrem de doenças crônicas, como a diabete, poderão, em breve,
contar com a tecnologia dos biossensores associados a nanopartículas de ouro e prata
para a monitoração dos níveis de glicose nos fluidos orgânicos como sangue, urina e
saliva, pela agregação das nanopartículas devido a interações biológicas específicas e
pela dissociação de agregados devido à competição com a glicose (Aslan, Zhang,
Lakowicz e col, 2004). O DNA foi estudado e identificado depois de associado a
nanopartículas de ouro (Liu e Lu, 2003) e prata (Cai, Xu, Zhu e col, 2002; Sönnichsen,
29
Reinhard, Liphardt e col, 2005) e estes resultados são promissores para o diagnóstico e a
compreensão de doenças genéticas e mutações.
McFarland e Duyne (2003) relatam a utilização das nanopartículas de prata
como sensores em técnicas de imunoensaio. Acreditam que a técnica é ideal para
quantificação de espécies químicas e também para monitorar processos dinâmicos no
interior das células, possibilitando a aplicação do sistema in vivo, sem causar
desconfortos ao paciente, por não ser invasiva. A técnica de imunoensaio se baseia na
reação antígeno anticorpo e permite a detecção de antígenos em soluções e, segundo
Gupta, Huda, Kilpatrick e col (2007) a associação de nanopartículas de prata melhora a
sensibilidade da técnica.
1.3.2 Agentes de contraste em técnicas de imagem
A Biomedicina se preocupa com o desenvolvimento de técnicas de imagem não
invasivas visando diagnóstico seguro sem causar desconforto aos pacientes. Para isto
torna-se necessário o aprimoramento das técnicas de imagem, fato relacionado à
resolução espacial aliada à eficiência dos agentes de contraste. As nanopartículas
metálicas representam uma nova geração de marcadores biológicos (Sahoo, Parveen e
Panda, 2007).
Nanopartículas metálicas (Skrabalak, Chen, Sun e col, 2008) devido à
capacidade de espalhamento da luz, foram empregadas como agentes de contraste em
técnicas de imagem (Hu, Fine, Tasciotti e col, 2011). Este comportamento também é
verificado em nanoestruturas compostas com núcleo metálico e camada externa de
sílica, ou vice-versa (Hirsch, Stafford, Bankson e col, 2003; Loo, Lin, Hirsch, e col,
2004; Chen, Liu, Ameer e col, 2005). A principal vantagem encontrada na utilização
30
destes sistemas nanométricos baseados em nanopartículas metálicas é o amplo espectro
que vai de 80 a 200 nm, não alcançado com os agentes de contraste convencionais,
como compostos à base de lantanídeos (Chen, Liu, Ameer e col, 2005). O
aperfeiçoamento no diagnóstico a partir de melhorias das imagens obtidas por exames
representa a descoberta da doença em seu estágio inicial e conseqüente aumento na
possibilidade de cura. Por esta razão pesquisas sobre a utilização de nanopartículas
metálicas para a obtenção de imagens são direcionadas principalmente para o
diagnóstico precoce do câncer (Hirsch, Stafford, Bankson e col, 2003; Sokolov, Follen,
Aaron e col, 2003; Skrabalak, Chen, Sun e col, 2008). Sokolov, Follen, Aaron e col
(2003) aperfeiçoaram ainda mais a técnica ao trabalharem com nanopartículas
bioconjugadas. Ou seja, as nanopartículas metálicas foram ligadas a um marcador
celular capaz de identificar e se ligar, marcando transformações celulares malignas e
pré-malígnas. Loo, Lin, Hirsch, e col (2004) utilizaram nanoshells bioconjugadas como
agentes de contraste (espalhamento) na técnica de Tomografia por Coerência Óptica.
Para auxiliar técnicas de obtenção de imagens em 3 dimensões de células cancerosas,
Durr, Larson, Smith e col (2007) utilizaram bastões de ouro, em escala nanométrica
como agentes de contraste de brilho.
Materiais com núcleo metálico, em prata, e recobrimento de sílica também
foram propostos para aplicações em biomedicina, neste caso, o fenômeno abordado foi a
potencialização do efeito de emissão pela proximidade entre superfícies de metais
nobres e moléculas fluorescentes (Aslan, Lakowicz, Szmacinski e col, 2004). Este
processo será detalhado no Capítulo 3.
31
1.3.3 Terapia contra o câncer
Nanopartículas metálicas bioconjugadas vêm sendo propostas não só para o
diagnóstico do câncer, mas também para seu tratamento. Graças a possíveis variações
da relação entre a espessura da camada externa metálica e o diâmetro do núcleo de
sílica, nanoshells podem ser confeccionadas de maneira a permitir espalhamento e/ou
absorção da luz ao longo de larga extensão do espectro de luz, incluindo o
Infravermelho próximo, região onde a penetração da luz em tecidos biológicos é
máxima. Ao se optar pelo espalhamento ou pela absorção da luz, pode se utilizar o
mesmo material para imagem e tratamento, respectivamente (Hirsch, Stafford, Bankson
e col, 2003; Loo, Lin, Hirsch e col 2004; Berry, 2005; Loo, Lowery, Hallas e col, 2005;
Skrabalak, Chen, Sun e col, 2008). O tratamento proposto é a terapia fototérmica e trata-
se de uma alternativa aos tratamentos cirúrgicos convencionais para os tumores e está
associado à capacidade que estes materiais apresentam de absorverem a luz na região do
espectro correspondente ao infra-vermelho próximo, o que induz ao aquecimento,
danificando e eliminando as células tumorais pela ação do calor (Huang, Jain, El-Sayed
e col, 2008). Ao se trabalhar com partículas bioconjugadas, os danos térmicos são
limitados ao tecido alvo, havendo comprometimento mínimo dos tecidos vizinhos
sadios (Hirsch, Stafford, Bankson e col, 2003; Skrabalak, Chen, Sun e col, 2008). A
terapia fototérmica também foi proposta para o tratamento do câncer de boca, quando
El-Sayed, Huang, e El-Sayed (2006) empregaram nanopartículas de ouro
bioconjugadas.
A terapia fotodinâmica também pode ser auxiliada pelas nanopartículas
metálicas, porém, este tema será abordado no capítulo 4 desta tese.
32
1.3.4 Atividade antibacteriana
A atividade antimicrobiana da prata é reconhecida há muito tempo. Existem
relatos históricos que descrevem que Herótodo, rei da Pérsia, ao se preparar para a
guerra preocupou-se em levar água reservada em garrafões de prata para evitar a
contaminação. Porém o primeiro registro moderno foi feito por Raulin, em 1869, ao
observar que a Aspergillus niger (fungo que causa manchas ou bolor preto em frutas e
vegetais) não crescia em recipientes de prata. Antes do advento dos antibióticos, a prata
foi bastante utilizada pela medicina, de forma sistêmica, devido a suas propriedades
antimicrobianas (Quinn e Milder, 2002). Clement e Jarrett (1994) afirmam que a
toxicidade da prata em células humanas é menor do que a observada nas de
microrganismos nocivos como bactérias, fungos e vírus.
Não só a prata metálica, mas também seus compostos são utilizados como
agentes antimicrobianos. Dentre eles, o mais freqüentemente empregado é a
Sulfadiazina de prata, porém sais como o Acetato e o Nitrato de prata também se
mostram eficazes contra infecções (McDonnell e Russell, 1999). São encontrados em
dispositivos médicos como cateteres venosos, curativos para queimaduras e cateteres
para drenagem urinária já presentes no mercado. Estudos clínicos mostram que esses
materiais apresentam taxas de infecções mais baixas do que os dispositivos sem agente
antimicrobiano (Quinn e Milder, 2002).
A utilização de nanopartículas de prata tornou-se uma alternativa aos
antimicrobianos químicos convencionais que, apesar de serem eficientes no tratamento
terapêutico propriamente dito, vêm causando resistência em várias cepas virulentas.
Acredita-se que ao se diminuir o tamanho da partícula metálica sua atividade
antimicrobiana é potencializada, pois, já que ambas estão em escala nanométrica, o
33
contato entre elas é facilitado (Quinn e Milder, 2002; Catauro, Raucci, De Gaetano e
col, 2004; Kim, Kuk, Kyeong e col, 2007).
Embora já tenha sido muito estudado (Liau, Read, Pugh e col, 1997; McDonnell
e Russell, 1999; Dibrov, Dzioba, Gosink e col, 2002; Richards, Krumholz, Chval e col,
2002; Kim, Kuk, Kyeong e col, 2007; Guzmán, Dille e Godet, 2009), o mecanismo da
ação antimicrobiana das nanopartículas de prata ainda não está totalmente esclarecido.
Acredita-se que ocorrem interações entre os íons Ag+ ou a prata metálica e a parede
celular bacteriana, porém existem várias hipóteses (Guzmán, Dille e Godet, 2009).
Algumas pesquisas mostram que a carga positiva dos íons de prata e das nanopartículas
de prata positivamente carregadas são capazes de promover uma interação eletrostática
com a membrana celular dos microorganismos, carregada negativamente (Liau, Read,
Pugh e col, 1997; McDonnell e Russell, 1999; Dibrov, Dzioba, Gosink e col, 2002).
Essa teoria passou a ser questionada quando nanopartículas de prata, cuja superfície foi
negativamente carregada, também apresentaram comportamento antimicrobiano (Kim,
Kuk, Kyeong e col, 2007).
Testes realizados em bactérias Gram-negativas mostraram dependência entre a
morte celular e a concentração de nanopartículas de prata (Sondi e Salopek-Sondi
2004). Neste caso, a morte celular seria conseqüência da formação de poços na parede
da célula bacteriana, tornando-a permeável e desregulando o transporte entre membrana
e citoplasma, levando à morte da célula (Sondi e Salopek-Sondi 2004). Kin, Kuk,
Kyeong e col, 2007 suspeitam que o mecanismo de ação bactericida das nanopartículas
de prata esteja associado à formação de radicais livres formados pelas nanopartículas de
prata capazes de induzir danos à membrana. Recentemente, descobriu-se que íons de
prata, oriundos das nanopartículas, podem entrar na célula e levar à produção de
espécies de oxigênio reativas (ROS), ou seja, radical superóxido (O2-), radical hidroxila
34
(_OH), peróxido de hidrogênio (H2O2), e Oxigênio singleto (
1O2). Espécies de oxigênio
reativas podem ser formadas diretamente ou indiretamente no interior das células e o
estresse oxidativo seria conseqüência de um desequilíbrio entre a geração das espécies
de oxigênio reativas e as funções de defesa celular, levando a danos nas proteínas, no
DNA e nos lipídios da célula bacteriana (Pape, Solano-Serena, Contini e col, 2004;
Park, Kin, Kin e col, 2009; Wijnhoven, Peijnenburg, Herberts e col, 2009).
Baseando-se na tendência dos íons de prata interagirem com grupos tióis
presentes em enzimas bacterianas importantes (Hatchett e White, 1995) e na
possibilidade da presença de nanopartículas no interior da célula, é possível que os
danos às bactérias sejam causados através pela interação da prata com organelas
celulares como o DNA. Esse tipo de interação impediria o mecanismo de multiplicação
celular (Quinn e Milder, 2002; Wijnhoven, Peijnenburg, Herberts e col, 2009).
Depois de comprovada a eficácia das nanopartículas de prata como agentes
antibacterianos, várias aplicações já foram propostas (Clement e Jarrett, 1994).
Compósitos para uso odontológico (Catauro, Raucci, De Gaetano e col, 2004),
dispositivos médicos, como cateteres, (Furno, Morley, Wong e col, 2004), curativos
para queimadura (Dias, Batdorf, Fianchini e col, 2006) e recobrimento de superfícies
com função antimicrobiana, tecidos e fibras com efeito antimicrobiano prolongado
(Yeo, Lee e Jeong, 2003; Jeong, Hwang e Yi, 2005; Jeong, Yeo e Yi, 2005). A
biocompatibilidade da prata presente em compósitos também tem fundamentado seu
emprego em implantes ósseos, no tratamento de água e em materiais restauradores
odontológicos (Catauro, Raucci, De Gaetano e col, 2004).
35
1.3.5 Atividade antifúngica e antiviral
Também são bem sedimentados e antigos os estudos dos efeitos da prata contra
fungos. Berger, Spadaro, Bierman e col, (1976) e Kim, Kuk, Kyeong e col, (2007)
testaram o efeito fungicida da prata em várias espécies de Candida e Torulopsis. Os
estudos que relatam a atividade de nanopartículas de prata em vírus como HIV (Sun,
Chen, Chung e col, 2005) e o causador da Hepatite B (Lu, Sun, Chen e col, 2008)
também são relevantes.
Lu, Sun, Chen e col (2008) mostraram que, associando-se nanopartículas de
prata ao DNA do vírus causador da hepatite B, o HBV, poderia se alterar o ciclo viral.
Apesar dos estudos terem sido realizados in vitro, os autores viram nestes resultados
uma possibilidade de cura para a hepatite B, uma doença crônica que tem como
conseqüências o desenvolvimento da cirrose e carcinoma hepáticos.
A AIDS, outra doença viral e que até hoje não apresenta cura, também é alvo de
investigações da nanobiotecnologia. Para combater a doença, Sun, Chen, Chung e col
(2005) investigaram o tipo de associação entre nanopartículas de prata e o vírus HIV,
concluindo que as nanopartículas de prata, ao se ligarem ao vírus inibiam sua ligação às
células hospedeiras. A facilidade de ligação entre as nanopartículas de prata e o HIV
seria conseqüência do surgimento de sítios de enxofre que facilitariam um arranjo
espacial regular das nanopartículas de prata na cápsula viral (Elechiguerra, Burt,
Morones e col, 2005). Há ainda pesquisas com resultados que mostram que as
nanopartículas de prata atuam no estágio inicial da replicação viral, sem causar
resistência do vírus HIV às nanopartículas, situação comum em drogas freqüentemente
utilizadas durante o tratamento da doença (Lara, Ayala-Nuñez, Ixtepan-Turrent e col,
2010).
36
1.4 PERSPECTIVAS E PRECAUÇÕES RELACIONADAS À
NANOBIOTECNOLOGIA
Fazer previsões num campo amplo e complexo como é o da Medicina não é uma
tarefa fácil. Porém há uma tendência de que os estudos na área médica continuem sendo
incentivados neste novo século. O número de investigadores deve continuar
aumentando em todo o mundo, os governantes estão conscientes das vantagens em se
investir em pesquisa, as universidades no primeiro mundo continuarão a encarar a
pesquisa como primordial, e países como o Brasil já estão reconhecendo esta realidade
(Andrade, 2008). Por esta razão, pode-se prever o avanço rápido e crescente na
produção de novos materiais capazes de revolucionar a Medicina em um futuro
próximo.
O emprego de materiais nanoestruturados vem interessando os pesquisadores
que visam suas aplicações biológicas. Porém, a repercussão das interações entre
nanomateriais e seres vivos ainda é desconhecida e tem muito que progredir até que
estes sistemas sejam aplicados, de forma segura, em seres vivos (Ebbesen e Jensen,
2006).
Muitos trabalhos já vêm sendo desenvolvidos com o objetivo de se avaliar a
relação entre a ação terapêutica esperada por nanopartículas de prata e a toxicidade que
elas apresentam ao corpo humano (Kim, Kuk, Kyeong e col 2007). Para Berger,
Spadaro, Bierman e col (1976) as concentrações necessárias para que os íons de prata
sejam eficientes contra os microorganismos patogênicos são baixas e, por isto,
acreditam que não tragam efeitos nocivos às células humanas. Os valores da mínima
concentração inibitória (MIC) de nanopartículas de prata ficaram entre 3.3 nM e 6.6 nM
para E. coli, bactéria que causa enterite hemorrágica (Berger, Spadaro, Bierman e col,
37
1976; b). Já Kim, Kuk, Kyeong e col (2007) ao avaliarem a ação das nanopartículas de
prata diante do S. aureus, verificaram um MIC maior do que 33 nM, resultado atribuído
à maior resistência desta cepa às nanopartículas. Em testes contra leveduras, os
pesquisadores relataram que a MIC das nanopartículas de prata ficou entre 6.6 nM e13.2
nM.
Braydich-Stolle, Hussain, Schlager e col (2005) realizaram estudos, in vitro, de
toxicidade para vários materiais nanoestruturados, inclusive nanopartículas de prata, em
células germinativas (células tronco). Este tipo de células foi escolhido porque mutações
sofridas por elas representam um risco a toda a linhagem que se segue. Na membrana
celular as nanopartículas de prata não promoveram grandes alterações. Porém
provocaram alterações na morfologia celular. Já a atividade mitocondrial foi
comprometida.
O efeito tóxico das nanopartículas de prata foi estudado mais recentemente por
AshaRani, Mun, Hande e col (2009) que confirmaram as alterações na morfologia
celular e na atividade mitocondrial, além de detectarem a presença de nanopartículas
também no núcleo e relatarem a possibilidade de danos ao DNA celular.
Segundo Duran, Marcato, De Conti e col (2010) o tamanho dos nanomateriais
facilita a mobilidade no organismo e também no ambiente. Este fato associado à alta
reatividade vem chamando atenção para possíveis riscos à saúde humana, ao impacto
ambiental e, principalmente, para a necessidade de mais estudos que garantam uma
aplicação segura dos materiais nanoestruturados de uma forma geral.
O emprego da Nanotecnologia na Biomedicina é uma questão ética
freqüentemente descrita na literatura atual (Kim, Yoon, Yu e col, 2006; Costa, 2010).
São tratados eventuais efeitos adversos da aplicação no corpo humano de materiais ou
superfícies nanoestruturadas e também seu impacto na saúde pública e no ambiente, a
38
médio e longo prazo. Existe uma preocupação com o desenvolvimento de
nanopartículas e materiais biodegradáveis e biocompatíveis. No entanto, para fins
terapêuticos destacam-se possíveis riscos de toxicidade e também o grau de
imprevisibilidade e incerteza do conhecimento atual sobre seus efeitos colaterais. Os
referidos efeitos, resultantes da interação destes nanomateriais com os sistemas
biológicos, podem trazer conseqüências ao nosso patrimônio genético (Costa, 2010).
São necessários estudos que tragam informações seguras sobre a distribuição destes
materiais pelo organismo e também de sua toxicidade (Kim, Yoon, Yu e col, 2006).
39
CAPÍTULO 2
SÍNTESE DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA
O capítulo 2 refere-se às técnicas de síntese utilizadas para se obter as
nanopartículas de prata e o nanocompósito de celulose bacteriana impregnada com
nanopartículas.
São apresentadas sínteses de nanopartículas de prata pelo método proposto por
Lee e Meisel, seguido de ablação a laser, e também, de partículas com revestimento
polimérico. As partículas foram revestidas com a Pectina e a Jeffamina. Este
procedimento teve como objetivo a obtenção de nanopartículas com grupamentos
funcionais livres, facilitando a ligação de moléculas ou outras estruturas às suas
superfícies. Além disso, a pectina contribuiu melhorando a biocompatibilidade das
nanopartículas por se tratar de um material natural, pois está presente nos vegetais, e
também é empregado na indústria de alimentos. Os nanocompósitos à base de celulose
foram obtidos de duas formas: uma onde a síntese das nanopartículas se deu na própria
membrana (in situ) e a outra onde as partículas já prontas foram incorporadas a ela. Nas
duas situações, foram empregadas as concentrações de precursores da técnica de Lee e
Meisel.
Depois da preparação, é apresentada a caracterização dos materiais. Nesta etapa,
são utilizadas as técnicas de Espalhamento dinâmico de luz, Espectroscopia de absorção
no UV-Vis, Microscopia eletrônica de transmissão e Microscopia eletrônica de
varredura, sendo esta última técnica empregada apenas para os compósitos de celulose e
prata.
40
2.1 SÍNTESE DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA
Numa síntese coloidal, em geral, participam: o meio, o precursor, o agente
redutor e o estabilizante. O meio compreende a fase líquida onde a reação química
ocorre. O precursor é o composto químico responsável pelo fornecimento do material
que irá formar as partículas. Tratando-se de nanopartículas metálicas, geralmente,
utiliza-se um sal deste metal. Para que o íon seja reduzido e finalmente transformado na
espécie metálica, entra na reação o agente redutor. Os agentes redutores utilizados na
reação podem ser compostos químicos que fornecem elétrons por meio de uma reação
química, porém esta redução também pode ocorrer através do efeito de algum agente
externo, que pode ser luz, temperatura ou mesmo raios gama. O estabilizante é uma
molécula responsável pelo recobrimento das superfícies das nanopartículas e seu
objetivo é evitar que ocorra a agregação, controlando o crescimento e mantendo-as
dispersas no meio (Burda, Chen, Narayanan e col, 2005).
De maneira geral, a formação de nanopartículas pode ser explicada pelo
mecanismo de nucleação e crescimento demonstrado experimentalmente por La Mer e
Gruen em 1952. De acordo com o mecanismo citado, quando a concentração de
monômeros (átomos, íons ou complexos moleculares que irão formar a nanopartícula)
em solução ultrapassa a concentração crítica de nucleação, há a formação de pequenos
aglomerados de átomos denominados de núcleos ou sementes. Uma vez ocorrida a
nucleação, a concentração dos monômeros disponíveis diminui, podendo ficar abaixo da
concentração crítica de nucleação. A partir deste ponto ocorre somente o crescimento
dos núcleos pré-formados, esta fase é denominada etapa de crescimento. Em alguns
casos, após o crescimento, quando a concentração de monômeros torna-se menor que o
valor crítico de crescimento, pode ocorrer o processo de Ostwald rippening que
41
promove a dissolução das partículas menores e crescimento das maiores, ou mesmo o
crescimento por incorporação de outros núcleos (aglomeração e coalescência) (Burda,
Chen, Narayanan e col, 2005). Entretanto, como resultado de sua grande área
superficial, nanopartículas coloidais são termodinamicamente instáveis, havendo uma
tendência de aglomeração (Atkins, 1994). Para que as partículas se mantenham estáveis,
é importante envolvê-las com uma camada estabilizadora.
2.1.1 Síntese de nanopartículas de prata através de redução pelo citrato
A primeira vez que o Citrato foi proposto como redutor na síntese de
nanopartículas metálicas deu-se na década de 50, quando Turkevivh estudou a síntese
de nanopartículas de ouro a partir do ácido cloroáurico. Através da avaliação pela
técnica de microscopia eletrônica de transmissão, verificou-se que foram obtidas
partículas de formato esférico e com diâmetro médio bem controlado, de 20 ± 1.5 nm
(Turkevich, Stevenson e Hillier, 1951). Posteriormente, o mesmo método foi
empregado para a aquisição de partículas de prata. A análise da amostra pela
microscopia eletrônica de transmissão constatou a formação de agregados e o diâmetro
médio das partículas variou bastante, encontrando-se partículas com tamanho entre 60 e
200 nm. A característica marcante deste método é que os íons citrato atuam não só
como redutores, mas também como estabilizantes das nanopartículas obtidas. Este fato
dificulta a escolha da concentração ideal de citrato, pois variações neste parâmetro
alteram simultaneamente a taxa de redução dos íons metálicos, e também os processos
de nucleação e de crescimento das partículas (Lee e Meisel, 1982).
O mecanismo da reação pode ser expresso pela reação a seguir (Šileikaitė,
Prosyčevas, Puišo e cols, 2006):
42
4Ag+ + C6H5O7Na3 + 2H2O → 4Ag0 + C6H5O7H3 + 3Na+ + H+ + O2↑ (1)
A ação dos ânions citrato na estabilização das nanopartículas de prata foi
explicada por Henglein e Giersig em 1999 através do mecanismo esquematizado na
figura 4. Depois da redução dos íons Ag+ pelo redutor (R
•), os átomos de prata se unem
formando clusters através de reações de condensação. Agx, corresponde aos núcleos que
irão, através de reações de condensação, formar partículas maiores. A partir daí, foram
propostos dois tipos de nucleação, um para a concentração ideal de citrato (Figura 4
(A)) e o outro, para os sistemas com excesso ou carência deste íon (Figura 4 (B)).
No sistema em equilíbrio, (Agm), os clusters complexados pelo citrato, param de
aumentar de tamanho ao atingirem o tamanho crítico e passam a se comportar como
partículas coloidais propriamente ditas, ou seja, são cercados por uma camada repelente
de citrato que previne a agregação das partículas formadas. Nesta situação a
concentração de citrato é suficiente para recobrir, estabilizando as partículas obtidas.
Isso justifica uma distribuição mais homogênea de tamanhos, além da presença de
estruturas esferóides bem separadas, cristalinas e com poucas imperfeições (Figura 4
(A)) (Henglein e Giersig, 1999).
Nos casos onde a concentração de citrato é muito baixa, ele se torna insuficiente
para estabilizar as superfícies de todas as partículas sintetizadas. Como conseqüência, os
fenômenos de nucleação e crescimento das partículas não são tão distintos quanto foi
observado anteriormente. Os clusters Agm crescem pela redução dos íons de prata em
suas superfícies e o citrato não inibe o crescimento da partícula, facilitando a união dos
átomos. Por isto, as partículas constam de vários cristalitos, com inúmeras imperfeições
(Figura 4 (B)) (Henglein e Giersig, 1999). Quando o citrato está em excesso, as forças
43
iônicas atingem magnitudes grandes o suficiente para desestabilizar a camada de citrato,
resultando numa coagulação (Krutyakov, Kudrinskiy, Olenin e cols, 2008).
A participação do citrato no processo de redução do Nitrato de prata também foi
detalhada. Baseando-se em resultados espectrais, observou-se que o grau de redução dos
íons de prata depende da concentração de Citrato e do tempo que o sistema permaneceu
em ebulição (Pillai e Kamat, 2004).
Figura 4 – Mecanismo de crescimento de nanopartículas de prata estabilizadas por ânions citrato. Agx são
clusters de prata (<1 nm), Agm partículas primárias estabilizadas pelo citrato (~1 nm), Agn são partículas
finais, R• são os radicais redutores. A concentração de citrato foi 5x10
-4 M, em (A), e 5x10
-5 ou 1.5x10
-3
M, em (B) (Adaptado de Henglein e Giersig em 1999).
2.2 REVESTIMENTO DE NANOPARTÍCULAS
O interesse em nanopartículas coloidais já foi descrito no capítulo anterior,
porém o avanço nos estudos e o crescimento de exigências nas áreas de aplicações
tornaram necessário o desenvolvimento de um novo grupo, mais complexo, de
materiais: as nanopartículas revestidas. Neste grupo estão incluídos materiais que
Agn
condensação
citrato
Cristalitos estabilizados
redução na superfície
condensação
citrato
agregação
Cristalitos
insuficientemente
estabilizados
Partículas de prata
agregadas (~20 nm)
(A)
(B)
Ag+ + R
•
Agx
Agx
Agm
Agm
Ag+ + R
•
Ag+ + R
•
Agn
44
apresentam o núcleo formado por um material e recobrimento de outro. Geralmente a
escolha dos materiais está relacionada à aplicação e vêm sendo empregados com
sucesso na biomedicina (Lu, Yi, Zhao e col, 2004). São conhecidos como
nanocompósitos ou materiais nanohíbridos quando alternam em seu núcleo e
recobrimento uma combinação entre materiais orgânicos e inorgânicos (Hirakawa e
Kamat, 2005; Sanchez, Julián, Belleville e col, 2005).
Para se revestir um nanomaterial, tem que se trabalhar sua superfície, isto faz
com que ela seja uma importante ferramenta para a Ciência de Materiais. À superfície
são associadas propriedades como solubilidade, reatividade, estabilidade, temperatura
de fusão, ponto de ebulição e estrutura desses materiais (Alivisatos, 1996).
Modificações químicas da superfície de nanopartículas são importantes por também
serem responsáveis pela conexão entre a nanopartícula e outros materiais e objetos,
desempenhando um papel fundamental no desenvolvimento de novos dispositivos e na
conjugação com moléculas para aplicações em sistemas de liberação controlada de
fármacos (Moghimi, Hunter e Murray, 2005).
Quando o revestimento da nanopartícula desempenha o papel de estabilizante, o
material que o compõe deve ser adicionado durante a fase de crescimento, com o
objetivo de prevenir a agregação e a precipitação. Vários materiais, entre orgânicos e
inorgânicos, podem ser utilizados como capeadores na superfície das nanopartículas
(Murray, Kagan, Bawendi, 2000).
Técnicas de sínteses mais complexas permitem que sejam adicionadas
ramificações à superfície das nanopartículas para que grupos funcionais sejam
colocados à disposição na superfície modificada e que, verdadeiras camadas de
revestimento sejam depositadas em suas superfícies, alterando carga, funcionalidade e
reatividade, além da melhora relacionada à estabilidade e à dispersão da suspensão
45
coloidal (Mulvaney, Liz-Marzán, Giersig e col, 2000; Schmidt e Malwitz, 2003). Além
das vantagens já apresentadas, as propriedades, ópticas, magnéticas e catalíticas do
material podem variar em função de sua camada externa, o que resulta em
comportamento distinto daquele observado quando se está diante apenas de um dos
materiais formadores da partícula (Mulvaney, Liz-Marzán, Giersig e col, 2000; Ung,
Liz-Marzán e Mulvaney, 2001; Graf, Vossen, Imhof e col, 2003; Schmidt e Malwitz,
2003; Lu, Yi, Zhao e col, 2004).
No caso de nanopartículas metálicas, os materiais selecionados para o
recobrimento empregados podem ser polímeros, surfactantes ou moléculas contendo
grupos terminais -SH, -CN, -P(C6H5)2, -NH2 (Henglein, 1989 e Fendler, 1996). Kong e
Jang (2006) sintetizaram nanopartículas de prata embebidas em nanofibras de poli
(álcool vinílico) – poli(metil metacrilato) (PVA-PMMA) e afirmaram que as hidroxilas
oxigenadas presentes no PVA tinham a propriedade de se coordenar com o íon metálico
oriundo do Nitrato de prata. O PVA auxiliou na formação das fibras, mas também atuou
como estabilizante, protegendo os clusters de prata. Dorjnamjin, Ariunaa e Shim (2008)
sintetizaram partículas de prata, esféricas cujo tamanho variou entre 2 e 8 nm com o
objetivo de se explorar suas propriedades antimicrobianas. Observaram que líquidos
iônicos e surfactantes catiônicos, ambos funcionalizados com grupamentos hidroxila,
atuaram tanto como agentes redutores quanto como protetores na síntese das partículas
obtidas.
As aplicações biológicas são exemplos da importância do recobrimento das
nanopartículas metálicas. Em tratamentos terapêuticos pra a remoção de tecidos
malignos, como a terapia fototérmica (Hirsch, Stafford, Bankson e col, 2003; Loo, Lin,
Hirsch, e col 2004; Skrabalak, Chen, Sun e col, 2008), ou em técnicas de diagnóstico
(Hirsch, Stafford, Bankson e col, 2003; McFarland e Duyne, 2003; Loo, Lin, Hirsch, e
46
col 2004; Gupta, Huda, Kilpatrick e col, 2007; Skrabalak, Chen, Sun e col, 2008), o
revestimento das partículas possibilita o reconhecimento de sítios específicos das
células alvo. Além do direcionamento, o revestimento das nanopartículas tem a função
de protegê-las da atividade enzimática e da degradação hidrolítica à qual estão
submetidas durante sua administração (Landfester, Musyanovych e Mailander, 2010).
Enzimas e ácidos encontrados durante o percurso pelo trato digestivo representam
obstáculos em casos de administração oral. Em sistemas que visam à administração
intravenosa, as partículas que têm superfície hidrofóbica, seriam rapidamente
capturadas por proteínas plasmáticas e eliminadas da corrente sanguínea. Nestes casos,
o recobrimento polimérico tem a capacidade de driblar estas barreiras, garantindo a
realização do papel a elas atribuído (Berry e Curtis, 2003; Otsuka, Nagasak e Kataoka,
2003; Berry, 2005; Burda, Chen, Narayanan e col, 2005).
2.2.1 Revestimento polimérico
As aplicações das partículas revestidas por polímeros vão desde a área de
catálise à de aditivos e pigmentos, incluindo a produção de cosméticos, tintas, entre
outras (Caruso, 2001).
Estudos recentes relatam uma grande variedade de polímeros associados a
nanopartículas, sendo eles utilizados para aumentar a possibilidade de reações com as
partículas, e também prevenir a agregação delas. São eles a goma arábica (Velikov,
Zegers e Blaaderen, 2003), a carragenina (Daniel-da-Silva, Tindade, Goodfellow e col,
2007), polivinilpirrolidona (Henglein, 1998), quitosana (Wang, Zhuang, Deng e col,
2010) e heparina (Kemp, Kumar , Clement e col, 2009).
47
Duas das técnicas de sínteses de nanopartículas de prata utilizadas nesta tese
tiveram como objetivo a obtenção de nanopartículas revestidas por polímeros. Os
polímeros escolhidos foram a Pectina e a Jeffamina que serão melhores descritos a
seguir.
a) Pectina
O termo substâncias pécticas é empregado para se referir a carboidratos
poliméricos de plantas que contêm uma grande proporção de unidades de ácido
galacturônico e cuja massa molecular encontra-se na faixa entre 30.000 e 300.000. Estas
substâncias estão presentes nos tecidos de todas as plantas superiores, sendo depositadas
na parede celular durante as primeiras etapas de crescimento do vegetal, contribuindo
para a adesão entre as células e também para a resistência mecânica da parede celular. A
forma natural é insolúvel em água e denominada de protopectina. Sua função está
relacionada à manutenção da forma e à firmeza de frutos e vegetais, além de estarem
envolvidas em interações com agentes patogênicos. As substâncias pécticas diferem
entre si pela solubilidade em água e pelo grau de metoxilação, ou seja, número de
grupos –CH3 esterificados na molécula. (Jarvis, 1984; Fishman e Jem, 1986; Fatibello-
Filho e Vieira, 2002).
De maneira geral, pode-se dizer que estruturalmente as pectinas são polímeros
do ácido D-galacturônico. A principal característica da molécula das pectinas é a cadeia
linear formada por unidades repetidas do ácido D-galacturônico (Figura 5) (Fishman e
Jem, 1986).
48
Figura 5 – Estrutura química da cadeia de pectina (Sriamornsak, 2003).
A estrutura química da pectina é assunto de investigações há décadas devido à
importância da compreensão de seu papel, não só nos vegetais, mas também no
processamento de alimentos e como fibra nutricional. Da mesma forma que a maioria
dos outros sacarídeos de origem vegetal, a pectina mostra-se heterogênea tanto no que
diz respeito à estrutura química quanto ao peso molecular, variando o número e a
percentagem de tipos de unidades monoméricas. Por isto, a composição varia de acordo
com sua fonte de origem, com as condições de isolamento e com os tratamentos
subseqüentes. Este fato faz com que, numa mesma amostra, parâmetros como o peso
molecular ou o conteúdo de subunidades específicas sejam diferentes de uma molécula
para outra. Por isso as substâncias pécticas não apresentam massa molecular definida,
podendo esta variar de 25 a 360 kDa (Fishman e Jem, 1986; Kashyap, Vohra, Chopra e
col, 2001; Sriamornsak, 2003). Esta heterogeneidade pode ser observada entre plantas,
entre tecidos e até mesmo dentro da própria parede celular (Lofgren, Guillotin e
Hermansson, 2006; Willatsa, Knoxb e Mikkelsen, 2006).
49
A propriedade mais importante das pectinas é sua capacidade de geleificação
que varia em diferentes fontes, pois está relacionada ao grau de metoxilação, e é
relacionada à sua aplicação na indústria de alimentos, na produção de geléias, doces,
sucos de frutas, produtos de confeitaria, estabilização de bebidas lácteas e iogurtes. O
gel de pectina é formado por uma rede cristalina tridimensional na qual a água e os
solutos ficam presos. Vários fatores determinam esta propriedade gelificante, tais como:
temperatura, o tipo de pectina, o grau de esterificação e de acetilação, pH, açúcares e
outros solutos, além da presença do cálcio. (Jarvis, 1984; Fishman e Jem, 1986;
Brandão e Andrade, 1999; Sriamornsak, 2003; Lofgren, Guillotin e Hermansson, 2006;
Willatsa, Knoxb e Mikkelsen, 2006).
b) Jeffamina
As Jeffaminas fazem parte de uma família de compostos orgânicos que contêm
aminas primárias terminais ligadas a uma estrutura central de poliéter, por esta razão,
são chamadas de polieteraminas. Jeffamina é o nome registrado por Huntsman
Petrochemical Corporation. O esqueleto do poliéter, geralmente tem como base o Óxido
propileno (OP), Óxido etileno (OE) ou uma mistura entre os dois. Por causa da amina
primária, as polieteraminas sofrem reações típicas das aminas (Wang e Pinnavaia, 2003;
Agut, Brûlet, Taton e col, 2007; Strandberg, Yeh, Zeelen e col, 2009).
A quantidade de grupamentos amina permite que as Jeffaminas sejam
subdivididas monoaminas, diaminas, e triaminas.
As Jeffaminas monoaminas (Figura 6) também podem ser chamadas de
Jeffaminas da série M e são obtidas a partir da reação de um monoálcool iniciador com
OE e/ou OP, resultando na conversão dos grupamentos hidroxila terminais em
50
grupamentos amina. Desta forma, as Jeffaminas da série M podem ser polieteraminas
que têm, predominantemente o polipropileno glicol em sua estrutura base, ou o
polietileno glicol. Sendo as últimas mais hidrofílicas (Huntsman Corporation, 2007).
Figura 6 – Jeffamina monoamina, onde R=H para OE, ou CH3 para OP (Huntsman Corporation, 2007).
Dentre as Jeffaminas diaminas, são encontradas as séries D, ED e EDR. A série
D inclui cadeias de polipropileno glicol com aminas terminais como representa a
estrutura da figura 7 (A). As polieteraminas da série ED têm sua estrutura baseada
predominantemente numa estrutura central de polietileno glicol (Figura 7 (B)), o que
lhes confere a solubilidade em água. Ainda no grupo das diaminas estão as Jeffaminas
da série EDR (Figura 7 (C)). A principal característica destas polieteraminas é sua alta
reatividade, sendo a maior dentre todas as Jeffaminas. O que garante ampla aplicação
além de solubilidade em uma grande variedade de solventes (Huntsman Corporation,
2007).
51
Figura 7 – Estruturas representativas das Jeffaminas diaminas. Em (A) Jeffamina série D; em (B) série
ED, onde y será sempre maior do que a soma entre x e z, garantindo que o polietileno glicol predomine na
estrutura central da cadeia; e (C) série EDR (Huntsman Corporation, 2007).
As polietereaminas que contêm três aminas são chamadas de Jeffaminas
triaminas ou da série T. São obtidas a partir da reação do Óxido propileno com um triol
iniciador, seguida da aminação dos grupos tióis terminais (Figura 8) (Huntsman
Corporation, 2007).
Figura 8 – Estrutura representativa das Jeffaminas triaminas (Huntsman Corporation, 2007).
(A)
(B)
(C)
52
Jeffaminas da série D e T de pesos moleculares diferentes foram utilizadas por
Wang e Pinnavaia, em 2003. O objetivo do trabalho foi criar camadas do polímero que
se encontraram intercaladas com camadas de sílica laminada. Quando foram utilizadas
Jeffaminas de menor peso molecular, as camadas formadas mostraram um paralelismo
em relação às folhas de sílica, além de menor espessura, quando comparadas às
camadas formadas no experimento que empregou as Jeffaminas de alto peso molecular,
cujas cadeias se emaranharam garantindo um aspecto enovelado.
A Jeffamina vem sendo utilizada na produção de novos materiais. Baseando-se
na propriedade de auto-organização dos copolímeros em bloco, propriedade que facilita
a formação de estruturas micelares nanométricas empregadas em sistemas de liberação
controlada de fármacos, Agut, Brûlet, Taton e col (2007), obtiveram micelas de um
copolímero em bloco duplamente hidrofílico. O copolímero obtido apresentou unidades
de óxido etileno e óxido propileno (a Jeffamina). A partir de uma técnica complexa,
Kim, Byun, Shin e col (2009) utilizaram a Jeffamina na síntese de nanopartículas de
prata em suporte resinoso sólido, sem a utilização de um agente redutor químico
(Citrato de sódio ou Borohidreto de sódio) para redução do sal de Prata. A prata foi
reduzida pelo sistema tetrahidrofurano/clorofórmio à temperatura ambiente, dando
origem a partículas com tamanho variando entre 2 e 4 nm. A Jeffamina e outros
polímeros foram empregados no experimento como espaçadores hidrofílicos nas resinas
modificadas. Estas resinas passaram a apresentar grupos hidroxila ou amina em seus
terminais. Ao final da pesquisa, observou-se que os grupamentos terminais amina e
carboxil não participaram do processo de redução da Prata e que a formação das
nanopartículas sofreu influência do tamanho da cadeia de PEG.
53
2.3 COMPÓSITOS À BASE DE CELULOSE BACTERIANA
2.3.1 Celulose
A celulose é o polímero mais abundante presente na natureza. Existem duas
formas: a celulose pura (inclui aquela produzida pelo algodão, por algumas algas e a
celulose bacteriana) e a celulose complexa, que compõe a parede celular das plantas
superiores e representa a maior parte da celulose disponível na natureza. É um
polissacarídeo constituído por unidades de -glicose. Suas moléculas se agregam
formando microfibrilas. Nestas microfibrilas há a regiões organizadas (cristalinas) que
se alternam com regiões amorfas (não cristalinas). A reunião destas microfibrilas forma
as fibrilas e estas se agrupam formando as fibras celulósicas (Figura 9) (Silva,
Haraguchi, Muniz e col, 2009).
Produzida pela Acetobacter Xylinum, a celulose bacteriana é estruturalmente
semelhante à celulose vegetal, diferindo por ser livre da lignina e da hemicelulose. A
celulose bacteriana é depositada em camadas que se unem formando a membrana. Sua
estrutura básica é formada por fibrilas nanométricas de 50 a 100 nm emaranhadas e
tridimensionalmente dispostas (Figura 10) (Barud, Assunção, Martines e col, 2008;
Maneerung, Tokura e Rujiravanit, 2008). Esta organização estrutural própria garante à
celulose bacteriana uma grande quantidade de poros e excelente capacidade de retenção
de água (Czaja, Krystynowicza, Bielecki e col, 2006), alta cristalinidade e boa
resistência à tração, elasticidade e elevada capacidade de absorção de água, além de ser
biodegradável e biocompatível (Jonas e Farah, 1998; Klemm, Schumann, Udhardt e col,
2001).
54
Figura 9 – Representação da celulose. Parte superior, cadeia de celulose pela união de unidades β-glicose.
Parte inferior, esquema do arranjo das fibrilas, microfibrilas e celulose (Adaptado de Morais, Nascimento
e Melo, 2005).
Uma das principais vantagens da celulose bacteriana é sua compatibilidade
biológica, o que lhe garante aplicações como bandagens em transplantes de pele,
tratamentos de úlceras, queimaduras e feridas extensas e inflamações supuradas
(Hutchens, Woodward, Evans e col, 2002).
Figura 10 – Micrografia por MEV da celulose bacteriana. Em (A), morfologia superficial e, em (B),
morfologia da secção transversal (Adaptado de Maneerung, Tokura e Rujiravanit, 2008).
(A) (B)
Estrutura da celulose
Fibrila
Microfibrilas
Fibras de celulose
Cadeias de moléculas
de celulose
n = unidade repetida (glicose)
55
2.3.2 Compósitos à base de celulose bacteriana (CB)
Compósitos são estruturas compostas por materiais quimicamente diferentes,
com o objetivo de associar vantagens dos dois materiais em um só. Nanocompósitos
baseados em polímeros com nanopartículas metálicas recebem atenção especial por
apresentarem as propriedades químicas e físicas melhoradas a partir da união de um
material inorgânico a um polimérico (Barud, Barrios, Regiani e col, 2008; Volkov,
Klechkovskaya, Shtykova e col, 2009).
Vários trabalhos foram realizados associando a ação antimicrobiana das
nanopartículas de prata (Liau, Read, Pugh e col, 1997; McDonnell e Russell, 1999;
Dibrov, Dzioba, Gosink e col, 2002; Sondi e Salopek-Sondi 2004; Kin, Kuk, Kyeong e
col, 2007; Guzmán, Dille e Godet, 2009) à biocompatibilidade da celulose bacteriana
(Maneerung, Tokura e Rujiravanit, 2008; Moreira, Silva, Almeida-Lima e col, 2009;
Volkov, Klechkovskaya, Shtykova e col, 2009).
Volkov, Klechkovskaya, Shtykova e col (2009) sintetizaram um filme em gel de
celulose bacteriana com nanopartículas de prata. As nanopartículas de prata foram
obtidas separadamente, a partir de soluções aquosas e da redução química do nitrato de
prata em polivinilpirrolidona. Também existem exemplos de sínteses in situ, ou seja, o
processo de formação das nanopartículas de prata se dá na própria membrana de
celulose. Maneerung, Tokura e Rujiravanit (2008) utilizaram o nitrato de prata e o
borohidreto de sódio.
He, Kunitake e Nakao, 2003 e Maria, Santos, Oliveira e col (2010) explicam o
mecanismo in situ de formação de nanopartículas de prata entre as fibrilas de celulose
bacteriana (Figura 11). Eles relatam que o contato entre a celulose bacteriana (CB) e o
precursor metálico promove uma interação eletrostática entre os íons Ag+ e os átomos
56
de oxigênio dos grupamentos hidroxila presentes nas fibrilas da CB. Quando a
membrana com as fibrilas impregnadas com os íons Ag+ é mergulhada na solução que
contem o agente redutor, os íons são reduzidos a Ag0, formando as nanopartículas.
Figura 11 – Representação da produção in situ das nanopartículas de Ag na estrutura fibrilar da celulose
bacteriana. (Adaptado de Maria, Santos, Oliveira e col, 2010).
Ag+
Redutor
Grupo contendo oxigênio na CB
Nanopartícula de Ag
57
2.4 METODOLOGIA DE SÍNTESE PARA NANOPARTÍCULAS DE PRATA
2.4.1 Síntese de nanopartículas de prata através da Técnica de Lee e Meisel
seguida de ablação a laser
De acordo com a técnica proposta por Lee e Meisel (1982), esquematizada na
figura 12, 250 ml de uma solução de Nitrato de prata (AgNO3) 10-3
M (Sima-Aldrich)
foi aquecida até entrar em ebulição. Neste momento, foram adicionados 5 ml de uma
solução de Citrato de sódio (Sima-Aldrich) 1%. A partir deste instante, o sistema passou
a ser submetido à agitação vigorosa e teve sua temperatura fixa. Depois da adição do
citrato de sódio, a coloração da solução foi se modificando (Figura 12), passando de
incolor, a amarelo pálido e, por fim, amarelo acinzentado, indicando a redução dos íons
de Prata. O aquecimento e a agitação foram mantidos por 60 minutos, depois dos quais,
o sistema foi resfriado à temperatura ambiente.
Após a síntese química de acordo com a técnica descrita, a amostra contendo
nanopartículas de prata foi submetida à ablação a laser. Esta etapa foi adicionada à
síntese com o objetivo de melhorar a distribuição de forma e de tamanho das partículas
de prata obtidas (Kamat, Flumiani e Hartland, 1998; Kamat, 2002; Miranda, Falcão
Filho, Rodrigues e col, 2004; Brito-Silva, Gomez, Araújo e col, 2010).
Para a realização desta etapa, 5 ml da suspensão coloidal foram introduzidos em
uma cubeta e submetidos a 2 horas de ablação, sob agitação constante. Um feixe de
laser de Nd:YAG (532nm, 6 ns, 5 Hz) foi focado numa face da cubeta de vidro.
58
Figura 12 – Esquema da síntese de nanopartículas de prata pela técnica de Lee e Meisel. Exibição das
alterações de coloração observadas depois da adição do redutor (Citrato de sódio): do aspecto inicial,
incolor, à coloração amarelo acinzentada e turva observada ao final da síntese.
5ml Citrato de
sódio 1%
Aquecimento
250 ml AgNO3
10-3
M Ebulição
Início da
redução 1 hora após adição
do citrato de sódio
59
As partículas obtidas a partir desta síntese foram utilizadas em um estudo
realizado com o objetivo de gerar ganho na emissão de um laser aleatório de um filme
de PMMA (Polimetilmetacrilato) onde foram depositadas nanopartículas de prata e
rodamina 6G, enviado para o periódico JOSA B (Dominguez, C. T.; Maltez, R. L.; dos
Reis, R. M. S.; de Melo, L. S. A.; de Araujo, C. B. e Gomes, A. S. L. Dependence of the
random laser emission on silver nanoparticles density in PMMA films containing
rhodamine 6G. JOSA B. v. 28, n. 5. 2011). Outra aplicação destas nanopartículas de
prata será apresentada no capítulo 3, onde a interferência de suas superfícies no
comportamento óptico dos pontos quânticos é comparada à das outras nanopartículas
preparadas nesta tese.
2.4.2 Síntese de nanopartículas de prata revestidas por Pectina
Esta parte da tese foi decorrente de uma interação com o Grupo de Materiais
Fotônicos do Instituto de Química – UNESP\Araraquara, sob a supervisão dos
Professores Sidney J. L. Ribeiro e Younes Messaddec.
Para se obter nanopartículas revestidas com pectina, 1 ml pectina cítrica (CP
Kelco brand) a 0.5% foi adicionado a 25 ml de água e 3 ml de uma solução 10-3
M do
precursor (AgNO3 da Sima-Aldrich). O sistema foi submetido a aquecimento sob
agitação magnética e, ao atingir a temperatura de 80oC, 1 ml de uma solução de Citrato
de sódio (Sima-Aldrich) 0.1 M foi adicionado. A partir da adição da solução de Citrato
de sódio, manteve-se o aquecimento e também a agitação magnética por 30 minutos.
Durante este período, a solução, inicialmente incolor, tornou-se amarelo claro e, ao final
da síntese, amarelo mais escuro, porém com aspecto transparente. A síntese está
esquematizada na figura 13.
60
Figura 13 – Esquema da síntese das nanopartículas de prata revestidas com pectina. Apresenta a mudança
de coloração (do incolor, passando ao amarelo pálido, até o amarelo mais forte, porém transparente)
observada durante o processo.
Para verificar se os resultados das medidas posteriormente realizadas com este
material para esta tese foram influenciados pela presença da pectina na nanopartícula de
prata, a mesma síntese descrita acima foi repetida, porém sem adição da pectina. Para se
manter o volume final de 30 ml de suspensão coloidal, 1 ml correspondente ao volume
da pectina 0.5% em água foi substituído por água apenas.
Adição de 1ml
Citrato de
sódio 0.1M
Início da
redução 30 minutos após
adição do Citrato
de sódio
1 ml pectina cítrica 0.5%
25 ml H2O
3 ml AgNO3 10-3
M
80o
Aquecimento
Agitação
61
Apesar das duas últimas sínteses descritas terem como resultado suspensões
coloidais de coloração amarela, há visivelmente uma diferença de cor entre as duas. A
suspensão que tem a pectina envolvida na síntese tem uma coloração mais forte do que
aquela que não tem polímeros envolvidos na reação. Este fato pode ser confirmado na
figura 14, (A) e (B).
Figura 14 – Comparação da coloração entre a suspensão coloidal que utilizou a pectina durante a síntese,
em (A), e a síntese na qual o polímero foi suprimido, em (B).
2.4.3 Síntese de nanopartículas de prata revestidas por Jeffamina
A técnica desenvolvida para a síntese das nanopartículas de prata revestidas com
Jeffamina foi conseqüência de uma parceria com o Grupo de Materiais Fotônicos do
Instituto de Química – UNESP\Araraquara, sob a supervisão dos Professores Sidney J.
L. Ribeiro e Younes Messaddec. Para iniciar a síntese, 4 g de Jeffamina (PM 1900), da
marca Fluka (Sigma-Aldrich), foram adicionados à água deionizada, completando um
volume final de 25 ml. Esta solução foi aquecida, sob agitação magnética, até que
atingisse a temperatura de 70o
C. Neste momento foram adicionados 3 ml de uma
solução de Nitrato de prata 3x10-3
M. Depois de passados 10 minutos, foram
adicionados 2 ml de uma solução aquosa de Citrato de sódio 0.1 M. Depois de 10
minutos, a redução foi completa e a síntese concluída (Figura 15). O aspecto final da
62
síntese acima explicada é semelhante ao da síntese que utiliza a pectina como polímero
estabilizante.
Figura 15 – Esquema ilustrativo da síntese de nanopartículas de prata revestidas por Jeffamina.
4g Jeffamina
(PM-1900)
+ H2O Aquecimento
Agitação
10 minutos
10 minutos
V = 25ml
3ml Nitrato de
prata 3x10-3
M 2ml Citrato de
sódio 0.1M
Início da redução Aspecto final
70o
63
2.4.4 Síntese de nanocompósitos à base de celulose bacteriana e nanopartículas de
prata
Nesta tese foi utilizada a celulose bacteriana, produzida pela bactéria
Acetobacter xylinum. Esta celulose vem sendo amplamente utilizada pelo grupo de
Materiais Fotônicos do Instituto de Química UNESP\ Araraquara e esta parte do
trabalho foi conseqüência de mais uma parceria com o grupo coordenado pelos
professores Sidney J. L. Ribeiro e Younes Messaddeq.
A síntese dos nanocompósitos se deu a partir de dois métodos, sendo que ambos
se basearam na concentração do precursor metálico e do agente redutor empregados por
Lee e Meisel. Para a síntese foram selecionadas membranas hidratadas e com espessura
de aproximadamente 5 nm.
a) Nanocompósitos de CB com síntese in situ de nanopartículas de prata
Depois de lavada, a membrana hidratada de CB foi imersa em uma solução de
AgNO3 10-3
M para os íons Ag+ penetrarem nos poros da celulose. Passadas quatro
horas, a membrana foi lavada com etanol, e, em seguida, imersa em uma solução de
Citrato de sódio 1%, na qual permaneceu por 12 horas, para ocorrer o processo de
redução dos íons metálicos. Uma vez completo o processo de redução dos íons de prata,
a membrana adquiriu uma coloração amarela. Para concluir o processo, foi novamente
lavada e seca em estufa (Figura 16).
64
Figura 16 – Variações no aspecto da membrana de CB durante a síntese in situ de nanopartículas de prata.
Em (A), Aspecto natural da membrana hidratada. Em (B), membrana devido à impregnação com
nanopartículas de prata sintetizadas in situ. Em (C), CB observada na imagem (B) depois de seca.
b) Nanocompósitos de CB impregnados com nanopartículas de prata em suspensão
Depois de sintetizadas as nanopartículas de prata pela técnica de Lee e Meisel, a
celulose foi imersa na suspensão por um período de 4 horas (Figura 17). Para completar
o processo, a membrana foi seca, também em estufa.
Figura 17 – Variações no aspecto da membrana de CB impregnada por nanopartículas de prata em
suspensão. Em (A), aspecto natural da membrana hidratada. Em (B), membrana escurecida devido à
impregnação com nanopartículas em suspensão. Em (C), membrana observada na imagem (B) depois de
seca.
(A) (B) (C)
(A) (B) (C)
65
2.6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
As nanopartículas de prata obtidas a partir do método proposto por Lee e Meisel
mostraram larga distribuição de tamanho e forma. Esse fato já era esperado e se deveu à
lentidão no processo de redução dos sais de prata pelo íon citrato (Turkevich, Stevenson
e Hillier, 1951; Lee e Meisel, 1982). A lentidão na redução dos íons de prata causa um
desequilíbrio entre as fases de nucleação e crescimento, momento crucial para a
obtenção de uma suspensão coloidal uniforme. Ou seja, quando o precursor foi
totalmente consumido na reação, alguns núcleos ainda estavam sendo formados,
enquanto outros já estavam na fase de crescimento formando as partículas (La Mer e
Gruen, 1952; Henglein e Giersig, 1999; Burda, Chen, Narayanan e col, 2005).
A ablação a laser foi empregada após a síntese química das nanopartículas com o
objetivo de uniformizar o tamanho das nanopartículas e garantir que elas seguissem um
padrão de formato esférico. De acordo com Kamat, Flumiani e Hartland (1998); Kamat
(2002); Miranda, Falcão-Filho, Rodrigues e col (2004) e Brito-Silva, Gómez, Araújo e
cols (2010) nanopartículas de ouro e prata sofrem fusão ou fragmentação e até
modificações morfológicas como conseqüência da irradiação por laser. A figura 18
apresenta um esquema da ação do laser nas nanopartículas de prata, além de mostrar a
mudança de coloração observada depois do processo de ablação a laser.
66
Figura 18 – Esquema da ação do laser fragmentando as nanopartículas de prata. Em (A), cor amarelo
acinzentada, depois da síntese química, porém antes da ablação a laser. Em (B), coloração amarela, mais
clara e transparente, depois da ablação a laser.
A técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz é a mais comum dentre as técnicas
empregadas para a determinação de tamanho de partículas. Consiste da emissão de um
feixe de luz monocromático que incide sobre uma amostra (solução) contendo partículas
esféricas em movimento aleatório, ou seja, Browniano. Devido ao movimento
Browniano, a intensidade da luz espalhada por um conjunto de partículas sofre
flutuações ao longo do tempo. Supondo que haja uma janela de dimensão reduzida,
através da qual a luz espalhada pelas partículas alcança um detector, a intensidade da
luz que atinge o detector irá flutuar devido ao movimento das partículas. Esta flutuação
da intensidade de luz espalhada ocorre com maior velocidade quando a dispersão
contiver partículas pequenas, pois estas se movimentam mais rapidamente e passa
diante da janela um número maior de vezes de dentro de um intervalo de tempo.
Estado de transição
Nanocluster de Ag
hυ
Fragmentação
(A) (B)
67
Portanto, existe uma relação entre a velocidade de flutuação da luz espalhada e o
coeficiente de difusão das partículas (Papini, 2003).
A técnica de espalhamento dinâmico de luz foi empregada para auxiliar na
caracterização das nanopartículas sintetizadas a partir da técnica preconizada por Lee e
Meisel seguida de ablação a laser. As medidas realizadas por esta técnica utilizaram o
equipamento Zetasizer nano ZS 90. São realizadas três varreduras e obtidos três
gráficos, um para cada medida. O resultado final é uma média de três varreduras. A
figura 19 apresenta o gráfico referente à medida de espalhamento dinâmico de luz para
as nanopartículas de prata obtidas a partir da técnica de Lee e Meisel e submetidas a
duas horas de ablação a laser. A análise do gráfico indica que o tamanho médio das
partículas de prata obtidas foi de aproximadamente 12nm.
Figura 19 – Gráfico obtido pela técnica de espalhamento dinâmico de luz da amostra obtida a partir da
técnica de Lee e Meisel e submetida a 2 horas de ablação a laser. Diâmetro médio indicado de
aproximadamente 12 nm.
Em nanopartículas metálicas, a radiação eletromagnética causa a oscilação dos
elétrons de condução, induzindo a formação de momentos dipolo pelo carregamento da
superfície. A partícula tenta compensar através de uma força de restauração resultando
em um comprimento de onda ressonante único, no caso de partículas esféricas, gerando
a banda de plasmon de superfície. O comprimento de onda de oscilação depende de
Inte
nsi
da
de
(%)
Tamanho (d.nm)
68
vários fatores como tamanho, forma, meio em que a partícula se encontra e distância
entre elas (Kerker, 1985; Averitt, Westcott e Halas, 1999; Link e El-Sayed, 1999; El-
Sayed, 2001; Kelly, Coronado, Zhao e col, 2003; Wiley, Sun, Mayers e col, 2005; Xia e
Halas, 2005).
Partículas de ouro e prata apresentam a banda de plasmons, quando em regime
nanométrico (Kim, Song e Yang, 2002; Zhao, Kelly e Schatz, 2003; Chen e Carroll,
2004). Por esta razão, a técnica de espectroscopia de absorção no ultravioleta/visível foi
utilizada na investigação das propriedades eletrônicas das nanopartículas sintetizadas
para esta pesquisa. A absorbância é medida para cada comprimento de onda. O
equipamento empregado para as medidas foi o UV-visible spectrophotometer,
SHMADZU.
Quando utilizada na caracterização das nanopartículas de prata sintetizadas de
acordo com a técnica proposta por Lee e Meisel, a espectroscopia de absorção no UV-
vis mostrou que há diferenças estruturais entre as amostras submetidas e as que não
foram submetidas à ablação a laser. Comparando-se os espectros presentes na figura 20,
distingue-se a amostra na qual não se aplicou a ablação a laser daquela submetida ao
processo. Além da curva da absorbância relacionada à amostra não submetida à ablação
a laser ter se mostrado mais larga, indicando uma maior dispersão de tamanho e forma,
observou-se também um deslocamento da banda de absorção que, antes da ablação
apresentava seu máximo em torno de 430 nm, passando para 394 nm depois da ablação.
Este deslocamento para um comprimento de onda menor, segundo a literatura (Link e
El-Sayed, 1999), indica a diminuição no tamanho médio das partículas.
69
Figura 20 – Espectro de absorção no UV-Vis das nanopartículas de Prata obtidas pela técnica de Lee e
Meisel (curvas normalizadas). Curva em preto, referente às nanopartículas antes do processo de ablação a
laser e, em vermelho, às partículas que foram submetidas ao processo de ablação, pelo período de 2 horas.
Os resultados obtidos pela técnica de espectroscopia de absorção no UV-Vis e
de espalhamento dinâmico de luz foram posteriormente confirmados pela microscopia
eletrônica de transmissão.
A técnica de microscopia eletrônica de transmissão (MET) é adequada para a
obtenção de imagens das nanopartículas, permitindo a avaliação da distribuição de
tamanho, forma e, em microscópios de alta resolução, o estudo da rede cristalina. Os
elétrons interagem com os átomos da amostra através de espalhamentos elásticos ou
inelásticos. Os espalhamentos elásticos são os mais importantes por serem responsáveis
pelo contraste das imagens. Os elétrons são espalhados elasticamente pelos átomos da
amostra, havendo mudança na direção do elétron primário (decorrente do feixe
primário), mas sem perda de energia detectável. O espalhamento inelástico é oriundo de
processos nos quais há perda de energia detectável por parte dos elétrons primários
(Reimer, 1989).
As amostras foram pingadas em grades de ouro cobertas com filme de carbono
(300 mesh), depois disto, aguardou-se um período de 24 horas para secagem. Como as
300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Ab
so
rbâ
ncia
Comprimento de onda (nm)
Antes da ablação
Após ablação (2h; 532nm)
Ab
sorb
ânci
as n
orm
aliz
adas
70
amostras preparadas são bastante finas, os elétrons atravessam a amostra, sendo sua
energia e o ângulo de alcance afetados pelos espalhamentos elásticos e inelásticos na
amostra (Reimer, 1989).
Quanto mais denso o material, mais espessa a amostra e maior o número
atômico do material da amostra, mais intenso o espalhamento. Em sólidos cristalinos, só
os planos cristalinos paralelos ao feixe incidente contribuem para a figura de difração. A
passagem de elétrons em sólidos amorfos provoca espalhamento dos elétrons em quase
todas as direções (Padilha, 2008).
Para aquisição de micrografias a partir da microscopia eletrônica de transmissão,
foi utilizado um microscópio Tecnai 20, fabricado pela FEI.
As imagens obtidas pela técnica de microscopia eletrônica de transmissão
comprovam a importância da ablação a laser na obtenção de uma amostra homogênea
em relação ao tamanho e a forma de suas partículas. A imagem presente na figura 21
(A) refere-se à porção da amostra que não foi submetida à ablação. Apresentou uma
larga distribuição tanto de tamanho quanto de forma de suas nanopartículas,
comprovando o aspecto verificado anteriormente pela avaliação da curva obtida pela
técnica de espectroscopia de absorção no UV-Vis. Na amostra foram localizadas
partículas prismáticas, em forma de bastão e esféricas e o diâmetro variou de 5 a 237
nm (Figura 21 (A)).
Associando os resultados do espalhamento dinâmico de luz e da espectroscopia
de absorção no UV-Vis com os da microscopia eletrônica de transmissão, comprovou-
se a eficácia da ablação a laser. Na imagem 21 (B) as nanopartículas da parte da amostra
submetida ao laser apresentaram formato esférico e uma distribuição de tamanho mais
homogênea do que aquela analisada pela imagem da figura 21 (A).
71
Figura 21 – Micrografia obtida por MET das nanopartículas de prata obtidas pelo método proposto por
Lee e Meisel. Em (A), amostra antes da ablação a laser, forma e tamanho variados. Em (B), amostra
submetida à ablação a laser, partículas esféricas e com diâmetro médio de 12 nm.
Tomando como base os resultados obtidos a partir das técnicas de caracterização
que detectou uma amostra de nanopartículas com diâmetro médio de 12 nm e da
concentração de precursor que participa da reação química, foi estimada uma
concentração de 1.82x1013
nanopartículas por ml da suspensão.
A literatura relata os benefícios trazidos pelas modificações nas superfícies de
nanomateriais (Moghimi, Hunter e Murray, 2005), porém, geralmente apresenta
técnicas de síntese complexas (Mulvaney, Liz-Marzán, Giersig e col, 2000). Esta tese
traz a descrição de duas técnicas simples para a síntese de nanopartículas de prata com
revestimento polimérico. Nos dois casos, tanto da pectina quanto da Jeffamina, o
recobrimento polimérico desempenhou bem seu papel de estabilizador, pois as
nanopartículas de prata sintetizadas mantiveram suas características durante vários
meses.
Nas nanopartículas com revestimento de Pectina, provavelmente a interação
entre o polímero e as nanopartículas foi facilitada pela presença dos grupamentos
(A
)
(B)
100 nm
20 nm
72
hidroxila, oriundos das unidades do ácido D-galacturônico, formador da pectina
(Fishman e Jem, 1986; Sriamornsak, 2003), que interagem com a superfície metálica
(Kong e Jang, 2006; Dorjnamjin, Ariunaa e Shim, 2008).
Para iniciar a caracterização das partículas de prata com e sem pectina, a técnica
escolhida foi o Espalhamento Dinâmico de Luz, pois, na amostra que foi submetida à
ablação a laser, a técnica foi eficiente, permitindo uma rápida avaliação do material
sintetizado. Analisando os gráficos da figura 22, percebem-se três picos principais. O
mais intenso se refere às partículas de 272 nm, o de intensidade intermediária, às de 69
nm e o de menor intensidade, às de 4960 nm. Conclui-se então que as nanopartículas
revestidas com pectina apresentam uma grande dispersão de tamanho.
Figura 22 – Gráfico com as três medidas da técnica de espalhamento dinâmico de luz para a amostra de
nanopartículas de prata revestidas por pectina.
A figura 23 traz os gráficos referentes às varreduras da Técnica de Espalhamento
Dinâmico de Luz para as nanopartículas sem revestimento de pectina e também ilustram
a diversidade de tamanho do material estudado. Porém, segundo a técnica citada, a
maioria das partículas, representada pelo pico de maior intensidade, tem o diâmetro
Inte
nsi
dad
e (%
)
Tamanho (d. nm)
73
aproximado de 43 nm. De acordo com os gráficos, existem também partículas menores
e maiores do que 43 nm.
Figura 23 – Gráfico com as três medidas da técnica de espalhamento dinâmico de luz para a amostra de
nanopartículas de prata sem revestimento de pectina.
Em seguida, foi empregada a técnica de absorção no UV-Vis. Avaliando o
gráfico da figura 24, observam-se as curvas referentes à absorbância das nanopartículas
de prata recobertas com pectina (em vermelho) e a curva das que não foram recobertas
(em preto). Comparando-as, conclui-se que as amostras apresentam-se semelhantes no
que diz respeito à dispersão e ao tamanho de suas partículas. Ainda analisando
informações retiradas do gráfico, observa-se que, em ambos os casos, a banda de
plasmon correspondente às nanopartículas de prata tem seu máximo em torno de 412
nm, havendo um deslocamento de 4 nm do máximo da banda de plasmons, em direção
ao vermelho, na amostra na qual as nanopartículas foram revestidas pela pectina.
Confirma-se a dispersão de tamanho nas duas amostras, representada pela largura das
curvas, porém, há uma discordância entre as duas técnicas empregadas, no que diz
respeito ao diâmetro médio das nanopartículas. Pela técnica de espalhamento dinâmico
de luz os diâmetros médios das nanopartículas obtidas foram muito diferentes para os
Inte
nsi
dad
e (%
)
Tamanho (d. nm)
74
dois métodos de síntese (272 nm para partículas revestidas com pectina e 43 nm para as
partículas sem o polímero). Diante desta situação, as curvas de absorção deveriam
apresentar seus máximos bem distintos, fato não observado nas curvas de absorção da
figura 24.
Figura 24 – Espectro UV-Vis de nanopartículas de prata (curvas normalizadas). Curva em preto
correspondente às nanopartículas de prata sem recobrimento de pectina, em vermelho às nanopartículas
de prata revestidas com pectina.
Para tirar a dúvida entre os resultados das técnicas de espalhamento dinâmico de
luz e de espectroscopia de absorção no UV-Vis, foi então empregada a técnica de
Microscopia Eletrônica de Transmissão. No estudo morfológico e na estatística do
diâmetro médio das nanopartículas foram avaliadas aproximadamente 200
nanopartículas presentes nas micrografias. Confirmou-se a obtenção de nanopartículas
de morfologia semelhante (formato esférico) nos dois métodos de síntese, ou seja, no
método que utiliza a pectina como revestimento e no que conta apenas com o citrato de
sódio no processo de estabilização (Figura 25 (A) e (B)). As micrografias presentes nas
figuras 25 e 26 confirmam também a larga distribuição de tamanho das partículas
obtidas pelos dois métodos. Porém, o estudo estatístico dos tamanhos das nanopartículas
300 350 400 450 500 550 600
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
Ab
so
rbâ
ncia
s n
orm
aliz
ad
as
Comprimento de onda (nm)
Np com pectina
Np sem pectina
75
realizado a partir das micrografias mostrou o diâmetro médio de 13 (+/- 4) nm numa
concentração de aproximadamente 8.3x1012
partículas de prata em cada ml do sistema
coloidal. Este resultado é diferente daquele obtido pela técnica de espalhamento
dinâmico de luz que indicou nanopartículas com diâmetro médio de 272 nm para a
amostra com pectina e de 43 nm para as sem pectina. A diferença entre os diâmetros
médios exibidos pelas duas técnicas pode ser explicada pela presença de aglomerados
de nanopartículas detectados através de micrografias das duas amostras (Figuras 25 (A)
e (B)). Na amostra com pectina, o polímero pode contribuir para aumentar ainda mais
para o diâmetro médio das partículas, confundindo o resultado obtido pela técnica de
espalhamento dinâmico de luz.
Figura 25 – Micrografia obtida a partir de MET dos aglomerados encontrados nas amostras das
nanopartículas de prata com (A) e sem (B) o revestimento de pectina.
Na avaliação da amostra de nanopartículas de prata revestidas com pectina pela
MET foi encontrada uma grande dificuldade na visualização da camada de pectina ao
redor das partículas, pois a energia do feixe de elétrons do microscópio destruiu
rapidamente o polímero durante as sessões de medida (Figura 26 (A)) (Kumar e Adams,
1990).
20 nm
10 nm
(A) (B)
76
Apesar da dificuldade já relatada, sem dúvida, a MET pôde confirmar a presença
e também a disposição do polímero em volta da nanopartícula (Figura 26 (A) e (B)).
Esta característica garantiu que as moléculas dos fluoróforos, posteriormente estudados
nesta tese, fossem mantidas a diferentes distâncias do núcleo metálico das partículas
associadas.
Figura 26 – Micrografia obtida a partir de MET das amostras de nanopartículas de prata com (A) e sem
(B) o revestimento de pectina. Em detalhe, um zoom mostrando a diferença entre as superfícies das duas
amostras.
A espessura média da camada de pectina em volta do núcleo metálico das
nanopartículas de prata foi de 11 +/- 5.1 nm, obtida a partir de uma média da espessura
nas imagens onde o revestimento pôde ser observado.
Como o peso molecular da pectina não é bem definido, a técnica de síntese que
utiliza este polímero não garante o controle da espessura da camada que reveste o
núcleo metálico das nanopartículas metálicas. Por esta razão, foram sintetizadas
nanopartículas de prata revestidas pela Jeffamina. Esta técnica foi desenvolvida durante
os trabalhos laboratoriais realizados para esta tese, não havendo relatos da mesma na
literatura. Como o trabalho visou à aplicação biológica dos materiais obtidos, o objetivo
foi a síntese de nanopartículas de prata com grupamentos amina livres para a posterior
ligação de outras moléculas que direcionassem o material a um tecido alvo ou que
tivessem suas propriedades melhoradas pela proximidade do núcleo metálico. A escolha
(A) (B)
20 nm 20 nm
(A) (B)
(B)
(A)
(A)
Zoom Zoom
77
da Jeffamina se baseou nos trabalhos de Henglein (1998) e Fendler (1996) que indicam
polímeros com aminas em seus terminais para serem utilizados no revestimento de
nanopartículas metálicas. Para garantir que um grupo amina estivesse disponível para
fucionalização, escolheu-se uma Jeffamina diamina. Pela alta reatividade e solubilidade,
o que facilita futuras aplicações, foi selecionada uma Jeffamina diamina (Huntsman
Corporation, 2007).
A formação das nanopartículas de prata foi inicialmente observada através do
espectro de absorção no UV-Vis (Figura 27), cujo gráfico mostra a banda de plasmons
com seu máximo em torno de 423 nm. A curva mostra um formato diferente do
observado nas outras duas sínteses. Provavelmente a alteração se deve à relação entre a
Jeffamina e a Prata, pois para cada mol de Jeffamina, apenas 4.5x10-3
mols de AgNO3
participam da reação. Outra informação importante que se obtém a partir da análise
deste gráfico é a grande distribuição de tamanho das nanopartículas obtidas.
Figura 27 – Espectro de absorção no UV-Vis de nanopartículas de prata revestidas com Jeffamina.
A micrografia exposta na figura 28 foi obtida a partir da técnica de Microscopia
Eletrônica de Transmissão e confirma a diferença de tamanho das nanopartículas de
prata obtidas cujo diâmetro médio foi de 17 +/- 15 nm.
360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
Ab
so
rbâ
ncia
Comprimento de onda (nm)
NpAg com Jeffamina
78
O revestimento de Jeffamina foi proposto com a intenção de se controlar as
dimensões da camada polimérica em torno do núcleo metálico. Este parâmetro é difícil
de ser controlado na síntese que utiliza a pectina, já que esta, apesar da
biocompatibilidade, não apresenta massa molecular definida (Fishman e Jem, 1986;
Kashyap, Vohra, Chopra e col, 2001; Sriamornsak, 2003). Porém a Microscopia
Eletrônica de Transmissão não permitiu a visualização da Jeffamina ao redor dos
núcleos de prata, pelo problema descrito anteriormente. Este fato torna necessária a
realização de novas medidas a partir da mesma técnica de caracterização, visto que este
aspecto é importante para a continuação dos trabalhos desenvolvidos nesta tese.
Figura 28 – Micrografia obtida a partir de MET das amostras de nanopartículas de prata revestidas com
Jeffamina.
Aproveitando as propriedades antimicrobianas das nanopartículas de prata e a
biocompatibilidade da celulose bacteriana, foi preparado um material nanohíbrido que
associa celulose e nanopartículas de prata. O material foi proposto para futura aplicação
no tratamento de infecções da cavidade oral. Para avaliar a interferência dos poros da
celulose em relação ao tamanho das partículas, foram empregadas duas rotas de síntese,
20 nm
79
em ambas o citrato foi empregado como redutor. Na primeira rota, a membrana de
celulose foi utilizada como meio para ocorrer a síntese das nanopartículas. Na segunda,
as nanopartículas foram sintetizadas conforme a técnica de Lee e Meisel (descrita
anteriormente), e, posteriormente, a membrana foi imersa na suspensão com as
nanopartículas.
Depois de secas, as membranas foram submetidas à espectroscopia de absorção
no UV-Vis (Figura 29) para detectar a presença do plasmon referente às nanopartículas
de prata que foram introduzidas na celulose. A figura 29 mostra as curvas referentes aos
espectros de absorção CB pura e seca e também da CB impregnada com as
nanopartículas de prata. Ao se obter a diferença entre a curva referente à celulose
impregnada com as nanopartículas de prata e a celulose pura, obteve-se a curva da
banda de plasmons para as partículas de prata presentes na membrana.
Figura 29 – Gráficos contendo as curvas obtidas a partir da espectroscopia de absorção no UV-Vis para os
compósitos formados por membrana de celulose e nanopartículas de prata. Curva em preto, referente à
celulose pura e seca, em vermelho, ao compósito formado pela CB e nanopartículas de prata, em azul, à
banda de plasmons referente às nanopartículas de prata (diferença entre o compósito e a CB pura).
Gráfico (A), amostra onde houve síntese in situ das nanopartículas de prata, e, (B), para a membrana
imersa na suspensão de nanopartículas.
Em seguida, as membranas de celulose foram submetidas à avaliação pela
técnica de Microscopia Eletrônica de Varredura. A técnica foi escolhida por permitir a
obtenção de informações sobre a ultraestrutura do material. Nesta técnica, ao contrário
da Microscopia eletrônica de transmissão, as informações não são geradas por elétrons
400 450 500 550 600 650 700
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
2,4
2,8
3,2
3,6
4,0
Ab
so
rbâ
ncia
Comprimento de onda (nm)
Cb
Cb+NpAg
Cb+NpAg-Cb
(B)
400 450 500 550 600 650 700
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Ab
so
rbâ
ncia
Comprimento de onda (nm)
Cb
Cb+NpAg
Cb+NpAg-Cb
(A)
Ab
so
rbâ
ncia
80
que atravessam a amostra, e sim pela forma com a qual os elétrons interagem com os
átomos que a compõem. Quando os elétrons do feixe do microscópio entram em contato
com os átomos da amostra, sua velocidade inicial é alterada, em direção e em módulo,
fornecendo informações sobre o material avaliado. Os sinais mais importantes na
formação de imagens são os oriundos dos elétrons secundários e dos retroespalhados.
Os sinais dos elétrons secundários fornecem informações sobre a topografia da amostra
e estão relacionados à resolução da imagem, já os dos elétrons retroespalhados são
oriundos da interação com os núcleos dos átomos do material e geram informações
sobre a composição da amostra avaliada (Reimer, 1998).
Como as amostras utilizadas nesta pesquisa são compostas por polímero, foram
revestidas por uma fina camada de ouro. As medidas foram realizadas no CETENE e foi
empregado o Microscópio eletrônico de varredura ambiental fabricado pela FEI, modelo
Quanta 200 FEG.
A partir da avaliação das micrografias comprovou-se a presença das
nanopartículas de prata nas membranas obtidas pelas duas rotas de síntese, porém a
técnica que utilizou a membrana como meio de síntese teve uma distribuição de
tamanho mais homogênea do que a técnica na qual a celulose foi impregnada por
imersão em nanopartículas em suspensão (Figuras 30 e 31). O controle no tamanho das
partículas obtidas pela primeira rota foi atribuído aos poros de tamanho nanométricos da
celulose bacteriana.
81
Figura 30 – Micrografia obtida por MEV da amostra de celulose bacteriana na qual ocorreu a síntese das
nanopartículas. Imagem, com aumento de 25000 X. No detalhe acima, um aumento de 40000 X da região
assinalada. Abaixo, aspecto da amostra utilizada.
Figura 31 – Micrografia obtida por MEV da amostra de celulose bacteriana que foi imersa em suspensão
de nanopartículas de prata. Imagem, com aumento de 20000 X. No detalhe acima, um aumento de 50000
X da região assinalada. Abaixo, aspecto da amostra utilizada.
Este resultado foi confirmado pelas imagens obtidas pela Microscopia Eletrônica
de Transmissão. Para esta avaliação, as amostras de celulose bacteriana impregnadas
82
com prata foram incluídas em resina Epon, marca Agar e, depois de 24 horas, os blocos
de resina foram removidos para serem recortados em ultramicrótomo (LEICA MZ6).
Foram obtidos cortes de aproximadamente 70 nm de espessura que, me seguida, foram
colocados em uma grade de ouro para MET (300 mesh), sem revestimento (Figura 32).
Figura 32 – Esquema de preparo das amostras de celulose bacteriana impregnadas com prata para
avaliação por MET.
Avaliando as micrografias da figura 33, conclui-se que, de fato, os poros da
membrana de celulose interferiram no diâmetro das nanopartículas de prata sintetizadas.
A partir das imagens obtidas por MET (Figura 33), calculou-se que o diâmetro médio
das nanopartículas de prata que foram formadas pela técnica de crescimento in situ foi
Recortando membrana de celulose Inclusão de celulose em resina
Corte dos blocos de resina com a membrana
em ultramicrótomo
Bloco de resina
com membrana
Lâmina
Membrana de celulos
depositada sobre grade
para MET
Membrana de celulose
depositada sobre grade
para MET
83
de 4 +/- 0.5 nm. Porém, ao se analisar, pela mesma técnica, as partículas presentes na
membrana que foi impregnada por nanopartículas de prata em suspensão, observou-se
que o diâmetro médio foi de 17 +/- 6 nm.
Figura 33 – Micrografias obtidas por MET das amostras de CB impregnada com prata. (A) CB na qual
ocorreu a síntese in situ e, em (B), membrana imersa na suspensão contendo nanopartículas de prata.
(A)
(B)
20 nm
20 nm
84
CAPÍTULO 3
APLICAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE PRATA EM ESPECTROSCOPIA
ÓPTICA
Este capítulo se inicia trazendo conceitos básicos sobre as propriedades ópticas
das nanopartículas metálicas. Em seguida, observa-se, experimentalmente, que ao se
introduzir as partículas obtidas por técnicas de síntese diferentes, descritas no capítulo 2,
em meios fluorescentes contendo triptofano, rodamina e pontos quânticos, elas
apresentaram propriedades ópticas distintas. Conclui-se que a propriedade de emissão
da luz, características dos fluoróforos é intensificada pela presença das nanopartículas
de prata revestidas pela pectina.
85
3.1 PROPRIEDADES ÓPTICAS DAS NANOPARTÍCULAS METÁLICAS
As propriedades ópticas dos metais são conseqüência da possibilidade de
deslocamento de seus elétrons. Ao se diminuir o tamanho do metal, diminui-se o livre
caminho médio dos elétrons (distância que o elétron tem que percorrer entre uma
colisão espalhadora e outra com os centros cristalinos), gerando absorções intensas na
região do espectro que vai do visível ao infravermelho próximo e garantindo às
nanopartículas metálicas uma coloração intensa quando em suspensões coloidais (El-
Sayed, 2001).
3.1.1 Absorção e espalhamento de luz
A primeira característica a ser observada em nanopartículas de metais nobres é a
coloração e intriga os cientistas desde o século XVII. Ao se referir à prata, suspensões
coloidais podem apresentar uma escala de cores que vai do amarelo ao marrom à
medida que o tamanho das partículas aumenta (Figura 34). Essa variação de cores
ocorre como conseqüência de absorção e espalhamento de luz em comprimentos de
onda específicos e que dependem do tamanho, forma e das estruturas vizinhas às
partículas (Kerker, 1985).
86
Figura 34 – Nanopartículas de prata em suspensão. Variações de cor relacionadas ao tamanho das
partículas (Fonte: www.danaco.net/silver.html).
Dentre as propriedades ópticas das nanopartículas de metais nobres, como o
ouro e a prata, a ressonância de plasmons é explicada pela Teoria de Mie, uma solução
da equação de Maxwell. Até hoje estes conceitos são válidos e demonstram que a
ressonância de plasmons em nanopartículas metálicas é influenciada pela alta razão
superfície/volume e manifesta-se por absorções bem definidas em regiões distintas do
espectro visível. A ressonância de plasmons de partícula é provocada pela oscilação
coletiva dos elétrons de condução em resposta à excitação óptica promovida pela
aplicação de um campo eletromagnético externo. A figura 35 traz o esquema da
oscilação de plasmons para uma esfera, mostrando o deslocamento da nuvem dos
elétrons de condução da nanopartícula. O campo elétrico da radiação incidente induz à
87
formação de um dipolo na partícula e uma força de restauração, na própria partícula,
tenta compensar esta formação do dipolo. Ou seja, quando a nuvem de elétrons é
deslocada em relação ao núcleo, uma força restauradora resultante da atração entre os
elétrons e o núcleo resulta numa oscilação da nuvem eletrônica de volta à estrutura
nuclear. O comprimento de onda de oscilação na absorção dos plasmons depende de
fatores tais como o tamanho médio, a forma, o meio no qual estão as nanopartículas, a
densidade de elétrons e a massa eletrônica efetiva. (Averitt, Westcott e Halas, 1999;
Link e El-Sayed, 1999; Jensen, Malinsky, Haynes e col, 2000; Kelly, Coronado, Zhao e
col, 2003; Wiley, Sun, Mayers e col, 2005; Xia e Halas, 2005).
Figura 35 – Esquema da oscilação dos plasmons para uma esfera. Resposta a uma excitação
eletromagnética que tem como conseqüência a geração de uma nuvem dos elétrons de condução da
partícula (Kelly, Coronado, Zhao e col, 2003).
Em nanopartículas de ouro e prata, os elétrons livres geram bandas de absorção
referentes à ressonância dos plasmons na região visível do espectro. Em suspensões de
nanopartículas de ouro e prata, esféricas, e com o tamanho entre 1 e 20 nm, as bandas da
ressonância dos plasmons estão localizadas em torno de 510 e 400 nm, respectivamente
(Xia e Halas, 2005). Por esta razão, a espectroscopia UV-Vis tornou-se uma maneira
rápida e eficaz para detecção da presença, do tamanho médio e da distribuição de
88
tamanhos das nanopartículas metálicas. Para isto, utilizam-se os valores de máximo e de
largura à meia altura da banda dos plasmons (Kim, Song e Yang, 2002; Zhao, Kelly e
Schatz, 2003; Chen e Carroll, 2004).
Conforme o esquema ilustrado pela figura 36, variando-se o formato das
partículas, engloba-se uma região mais ampla do espectro, aumentando as
possibilidades de aplicações dos materiais (Lal, Link e Halas, 2007; Gomes, 2009).
Figura 36 – Seleção da ressonância de plasmons em nanopartículas metálicas, levando em consideração o
tamanho, a forma e a estrutura de composição (Adaptado de Gomes, 2009).
No caso de nanoestruturas metálicas com formato diferente do esférico, como é
o caso dos bastões e das partículas que têm núcleo e recobrimento distintos, a
ressonância de plasmons é influenciada pela geometria: nos nanobastões, pela relação
entre a largura e o comprimento (Figura 37) e nas outras pela relação
núcleo/recobrimento (Link, Wang e El-Sayed, 1999; Westcott, Jackson, Radloff e col,
2002; Liz-Marzán, 2004).
Esferas de Ag
Bastões de Ag
Cubos de Ag
Comprimento de onda (nm)
Prismas de Au
Bastões de Au
Partículas de Au
Plaquetas de Ag
Liga de Ag e Au
Conchas de Au ocas
Conchas de SiO2 Au Conchas de SiO2 Ag
Comprimento de onda (nm)
89
Figura 37 – Esquema ilustrativo da diferença do dipolo induzido mediante a incidência da radiação
eletromagnética em nanopartículas de formato esférico (parte superior) e de bastões (parte inferior). Em
(A), micrografias obtidas por MET, havendo dois tamanhos diferentes para as partículas esféricas. Em
(B), formação do dipolo induzido. Em (C), gráficos dos espectros de absorção gerados por partículas
esféricas de tamanhos variados, parte superior, e por nanobastões, parte inferior. (Adaptado de: El-Sayed,
2001; Liz-Marzán, 2004).
A possibilidade de variar a forma de nanomateriais metálicos gerando
comportamentos ópticos novos e, conseqüentemente, melhorar e ampliar suas
aplicações está se tornando um desafio para os pesquisadores que atuam na área de
síntese de materiais. O principal desafio está associado à complexidade das técnicas
Comprimento de onda (nm)
Ab
sorb
ânci
a
RP transversal
RP longitudinal
(b)
(c)
Ab
sorb
ânci
a Comprimento de onda (nm)
(a) (b)
(c)
(A)
(A)
(C)
(B)
(C)
(B)
90
aplicadas, porém as dificuldades vêm sendo superadas e trabalhos com resultados
relevantes sendo desenvolvidos. É o caso do trabalho publicado por Kim, Song e Yang
(2002) que utiliza reações fotoquímicas, e adiciona concentrações diferentes de Nitrato
de prata a sistemas contendo nanopartículas de ouro, para a obtenção de nanobastões de
ouro e prata (Figura 38).
Figura 38 – Em (A), aspecto macroscópico das suspensões dos nanobastões de ouro e prata obtidos a
partir de reações fotoquímicas, em suspensões. Em (B), espectros de absorção no UV-Vis das suspensões
mostradas em (A). (C), micrografias obtidas por MET, em maior e menor aumento, das mesmas amostras
(Kin, Song e Yang, 2002).
O controle das técnicas de síntese também possibilitou a obtenção de
nanopartículas de prata e ouro com cavidades em seu interior. Nesta síntese, as
nanoestruturas de prata servem tanto de fonte de elétrons quanto de molde, em torno do
qual, os átomos de ouro são gerados por processos de oxidação/redução. A estrutura
resultante assume aspecto complementar à do molde de prata, com o espaço interno oco,
determinado pelo modelo (Wiley, Sun, Meyers e col, 2005).
Ab
sorb
ânci
a
Comprimento de onda (nm)
(a)
(b)
(c) (A)
(B)
(C)
91
3.2 INTERAÇÃO ENTRE SUPERFÍCIES METÁLICAS E FLUORÓFOROS
As interações entre fluoróforos e superfícies de nanopartículas metálicas estão
sendo utilizadas para aumentar a intensidade da fluorescência (Aslan, Wu, Lakowicz,
2007), realizar ensaios baseados na supressão da fluorescência por sistemas coloidais de
metais nobres (Anger, Bharadwaj e Novotny, 2006) e obter radiação direcional a partir
de fluoróforos localizados nas proximidades de superfícies metálicas (Lakowicz,
Malicka, Gryczynski e col, 2003). Estas interações podem ser aplicadas na
Biomedicina, contribuindo para o surgimento de novas técnicas de diagnóstico e
também de tratamento. Estas técnicas contam com o aumento de sensibilidade e
seletividade das nanopartículas (Sokolov, Chumanov e Cotton, 1998; Matveeva,
Gryczynski e Lakowicz, 2005; Geddes, Gryczynski, Malicka e col, 2003).
A teoria sobre a intensificação da fluorescência em presença de superfícies e
nanopartículas metálicas foi desenvolvida nos anos 80 (Gersten e Nitzan, 1984), porém
suas demonstrações e aplicações são mais recentes e atribuem seus efeitos a três
mecanismos. O primeiro é a transferência de energia responsável pela supressão da
fluorescência; o segundo mecanismo compreende a variação espacial do campo da luz
incidente, intensificando a absorção de luz pelos fluoróforos, e, o último mecanismo é
aquele verificado quando uma partícula, por estar próxima a um fluoróforo, tem a
capacidade de aumentar sua taxa de decaimento radiativo, que corresponde à taxa que
mede a capacidade dos fluoróforos emitirem fótons (Geddes e Lakowicz, 2002; Aslan,
Gryczynski, Malicka e col, 2005). Os três mecanismos dependem da distância entre o
fluoróforo e as superfícies metálicas.
A presença de superfícies ou partículas metálicas nas proximidades de moléculas
de fluoróforos altera as condições do meio no qual ocorre o fenômeno da fluorescência
92
alterando os resultados espectrais. Quando um fluoróforo está nas proximidades de uma
partícula ou superfície metálica irradiada, esta gera uma onda de carga superficial. O
grau de interação entre o fluoróforo e a onda de carga superficial da partícula depende
da sobreposição espectral das transições eletrônicas deste fluoróforo e da nanopartícula
ou superfície metálica e também da distância entre a superfície metálica e o fluoróforo
(Aslan, Gryczynski, Malicka e col, 2005).
O diagrama de Jabłoński (Figura 39) pode ajudar na compreensão dos
mecanismos resultantes desta interação. A absorção de um fóton faz com que o
fluoróforo atinja o estado singleto excitado (S1), em seguida, as moléculas emitem um
fóton a uma taxa, Г, ou retornam ao estado fundamental por um processo de decaimento
não radiativo com taxa knr. Existe ainda outra possibilidade de desativação, ou seja, de
remover a população do nível S1, resultando no processo de supressão, cuja taxa é kq. A
presença de superfícies metálicas pode ter como conseqüência um aumento significativo
na absortividade, além de um deslocamento espectral da banda de absorção. O aumento
da absorção, por sua vez, interfere na taxa de transição do nível S1 para S0 através da
emissão de um fóton ou no valor da taxa de fluorescência (Г). A fluorescência
decorrente da molécula (fluoróforo) é, em parte, refletida e refratada pela partícula ou
superfície metálica presente em sua proximidade. Esta associação pode gerar um
segundo efeito do tipo emissão estimulada ou decaimento radiativo. Porém, se a relação
entre a onda de cargas da superfície metálica e o dipolo molecular estiver a uma
distância muito reduzida, o efeito observado será de supressão da emissão, havendo um
aumento na taxa de decaimento não radiativo (knr) (Geddes e Lakowicz, 2002).
93
Figura 39 – Diagrama de Jabłoński clássico, em (A). Em (B), o diagrama modificado para ilustrar a
presença de ilhas, partículas ou colóides metálicos. E – excitação, Em – taxa de excitação intensificada
pela presença do metal, e Гm – taxa radiativa na presença de metal (Adaptado de Geddes e Lakowicz,
2002).
O rendimento quântico de um fluoróforo pode ser expresso através da equação
(2) (Geddes e Lakowicz, 2002).
(2)
Onde, Г é a taxa de fluorescência e knr e kq constantes não radiativas que desativam o
estado excitado.
O tempo de vida da fluorescência, ou tempo de decaimento, é uma média do
tempo proporcional ao conjunto das moléculas fluorescentes que restam no estado S1
(Aslan, Gryczynski, Malicka e col, 2005):
(3)
knr
S0
S1
S2
Г E
Meio livre de
nanopartículas metálicas
S0
S1
S2
Г knr Гm E Em
Com superfícies
metálicas
94
A meia vida e a intensidade da fluorescência dos fluoróforos são diretamente
influenciadas pelo meio, porém Γ não é significantemente alterada. Estas modificações
se devem a mudanças em knr ou kq. Se Q0 for relativamente pequeno, então knr + kq será
muito maior do que Γ. Se o valor de Q0 for alto, então Γ será muito maior do que knr +
kq. Então, é possível promover modificações espectrais nos fluoróforos ao se alterar knr
ou kq. Invariavelmente, Q0 e τ0 são alterados conjuntamente (Geddes e Lakowicz, 2002;
Aslan, Gryczynski, Malicka e col, 2005).
As modificações em Γ geralmente não são levadas em consideração, pois esta
taxa é determinada pela probabilidade de transição e pela capacidade de oscilação na
transição de S1 S0. Quando os fluoróforos são localizados a distâncias adequadas das
partículas ou superfícies metálicas, suas taxas de decaimento radiativo, Γm, podem
sofrer alterações e, ao se aumentar Γm, aumenta-se a intensidade de fluorescência, Qm, e
se reduz o tempo de vida, τm, que se converte à condição verificada no meio, onde
ambos são modificados conjuntamente (Geddes e Lakowicz, 2002; Aslan, Gryczynski,
Malicka e col, 2005).
(4)
(5)
A possibilidade de se modificar e controlar a taxa de decaimento radiativo
(Γ+Γm) pode trazer implicações para estudos de fluorescência e também para suas
95
aplicações. Esta prática recebe o nome de amplificação da fluorescência por superfícies
metálicas (MEF).
O efeito MEF foi confirmado através de simulações teóricas baseadas nas
equações (4) e (5) com fluoróforos de rendimentos quânticos considerados: bom, baixo
e muito baixo. A presença de superfícies metálicas promoveu o maior efeito de
intensificação da emissão nos fluoróforos de rendimento quântico mais baixo que se
tornaram altamente fluorescentes (Kummerlen, Leitner, Brunner e col, 1993). Os
resultados teóricos foram confirmados através de experimentos que associaram
partículas e superfícies metálicas a estruturas biológicas importantes, mas com pouca
capacidade de fluorescência, como DNA e nucleotídeos. A baixa fluorescência
intrínseca destas estruturas biológicas foi acentuada na presença de superfícies
metálicas, possibilitando a medição deste aumento (Lakowicz, Shen, Gryczynski e col,
2001, Lakowicz, Shen, D'Auria e col, 2002). Estas descobertas despertaram a atenção
de importantes grupos de pesquisa para a possibilidade de aumentar a sensibilidade na
detecção do DNA pela intensificação da fluorescência devido à associação de
nanopartículas de prata (Malicka, Gryczynski e Lakowicz, 2003; Chen, Munechika e
Ginger, 2007).
Analisando-se as equações (2) e (3), conclui-se que quando ocorre a supressão,
tanto o tempo de meia vida quanto o rendimento quântico são reduzidos por processos
de diminuição de população no nível S1 (Geddes e Lakowicz, 2002; Aslan, Gryczynski,
Malicka e col, 2005).
Fluoróforos com tempo de vida mais longo sofrem maior supressão da
fluorescência do que aqueles que têm um tempo de vida mais curto. Fluoróforos que
apresentam baixo rendimento quântico em solução contendo agentes desativadores,
quando próximos a superfícies metálicas, tendem a ter a amplificação de fluorescência
96
aumentada devido ao aumento da taxa radiativa, que se mostra mais eficiente, quando
em competição, do que o fenômeno de supressão da fluorescência. O aumento da
concentração de agentes desativadores pode fazer com que apenas os fluoróforos
próximos da superfície metálica sejam observados (Figura 40) (Geddes e Lakowicz,
2002).
Figura 40 – Aumento da intensidade de emissão do fluoróforo à medida que este se aproxima da
superfície metálica. A concentração de agente desativador se mantém em todo o sistema. F – fluoróforo,
Q – agente desativador (Adaptado de Geddes e Lakowicz, 2002).
3.3 METODOLOGIA PARA ANÁLISE ÓPTICA DE SISTEMAS COLOIDAIS
DE PRATA
Esta etapa da tese foi realizada em colaboração com o Grupo de Materiais
Fotônicos do Instituto de Química (UNESP/Araraquara), sob a supervisão dos
Professores Sidney J. L. Ribeiro e Yunes Messaddeq e também com o Laboratório de
F F
Q
Q
Q
Q Q
Q
Q
Q
Q
Q
97
Biofísica Química, sob a supervisão das Professoras Adriana Fontes, Beate Santos e
Patrícia M. A. Farias (Depto. de Biofísica e Radiobiologia, UFPE). Este último foi
responsável pela preparação e caracterização dos pontos quânticos de CdTe/CdS
utilizados.
Foram obtidos espectros de absorção através da técnica de espectroscopia de
absorção na região do ultravioleta-visível. A técnica consiste da absorção da radiação
ultravioleta/visível que compreende a faixa do espectro que vai de 180 a 780 nm, pela
amostra estudada, causando a promoção de elétrons do estado eletrônico fundamental ao
estado excitado. Para se obter a medida, a luz, na faixa de comprimento de onda
descrito, atravessa uma solução diluída da amostra. O espectro de absorção é dado pela
razão entre a intensidade de radiação que passou pela amostra e pela referência (no caso
deste trabalho, água) (Skoog, Holler e Crouch, 2007). Para a realização destas medidas,
foi empregado com o equipamento UV-visible spectrophotometer SHMADZU.
A emissão das soluções com os fluoróforos com e sem nanopartículas de prata
no meio também foi avaliada. Todas as medidas de emissão realizadas neste capítulo da
tese foram executadas com espectrofluorímetro contador de fótons modelo ISS PC1.
Para avaliar o fenômeno de amplificação da fluorescência provocado pela
introdução de nanopartículas de prata a meios contendo fluoróforos, foram empregadas
as nanopartículas de prata obtidas pela metodologia explicada no capítulo 2. Os
fluoróforos selecionados para terem o comportamento estudado, diante das
nanopartículas de prata, foram o Triptofano, rodamina e os pontos quânticos. Sendo a
rodamina utilizada em teste para lasers aleatórios.
98
3.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O triptofano foi escolhido para ser utilizado nesta tese por ser o aminoácido
neutro precursor da síntese do neurotransmissor serotonina (Kapczinski, Busnello, J.
Abreu e col, 1998) e sua fluorescência em proteínas muito utilizada como ferramenta na
microscopia (Koening, Becker, Fischer e col, 1999). Alterações nas propriedades
ópticas do triptofano como intensidade de fluorescência, deslocamentos de
comprimentos de onda máximos de emissão, diminuição nos tempos de vida de
fluorescência, alargamento e mudanças no formato do espectro de excitação, e
transferência de energia, são utilizados para monitorar mudanças nas proteínas,
permitindo o acompanhamento de seus processos dinâmicos (Vivian, James, Callis e
col, 2001). Isto faz com que o aumento na intensidade do espectro de emissão do
triptofano ocasionado pela presença das nanopartículas de prata se torne uma ferramenta
interessante para a Biomedicina.
O gráfico presente na figura 41 (A) apresenta as curvas de absorção no UV-vis
do triptofano (em vermelho), com seu máximo em aproximadamente 280 nm, das
nanopartículas de prata envolvidas com pectina (em preto), com seu máximo em torno
de 412 nm e das nanopartículas de prata revestidas com pectina junto ao triptofano (em
azul). O gráfico da figura 41 (B), que traz as curvas de emissão das mesmas amostras
citadas acima e mostram que quando o triptofano aparece junto às nanopartículas de
prata recobertas com pectina há aumento da emissão, em relação ao triptofano em meio
contendo apenas água. Os espectros de emissão foram adquiridos excitando-se em 280
nm que corresponde ao máximo de absorbância para o triptofano.
99
Figura 41 – Espectros do triptofano. Em (A), espectro de absorção no UV-Vis do triptofano, em
vermellho, e das nanopartículas de prata revestidas pela pectina, em preto. Em (B), Estudo da emissão da
associação entre nanopartículas de prata revestidas por pectina e triptofano. Em preto, ausência de
emissão da suspensão coloidal de nanopartículas de prata revestidas com pectina. Em vermelho, emissão
do triptofano em água. Em azul, emissão do triptofano em meio contendo as nanopartículas de prata com
pectina.
Os dados obtidos nesta pesquisa são contrários aos publicados por Rátiva,
Gomes, Wachsmann-Hogiu e col (2008). Eles observaram que não houve aumento da
fluorescência para excitações com um ou dois fótons (Figura 42 (A) e (B)). Os
pesquisadores apenas relataram o aumento da fluorescência do triptofano nas
proximidades de nanopartículas de prata diante da excitação com 3 fótons em 800 nm
(Figura 42 (C)), explicando o fato através da presença de um nível de plasmon
intermediário (da prata).
300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Inte
nsid
ad
e (
u. a
.)
Comprimento de onda (nm)
AgPec
TrpH2O
TrpAgPec
250 300 350 400 450 500 550 600
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Ab
so
rbâ
ncia
Comprimento de onda (nm)
AgPec
TrpH2O
280 nm
412 nm (A) (B)
Comprimento de onda (mn) Comprimento de onda (nm) Comprimento de onda (nm)
100
Figura 42 – Espectro de emissão da solução de triptofano com diferentes fatores de preenchimento de
nanopartículas de prata (ƒ) excitados pelo processo de absorção de (A) 1, (B) 2, e (C) 3 fótons (Adaptado
de Rátiva, Gomes, Wachsmann-Hogiu e col, 2008).
A diferença entre os resultados obtidos por Rátiva, Gomes, Wachsmann-Hogiu e
col (2008) e os resultantes desta pesquisa está na concentração e revestimento
polimérico das nanopartículas de prata utilizadas. Os pesquisadores citados sintetizaram
as nanopartículas de prata utilizadas, seguindo a técnica proposta por Lee e Meisel,
seguida da ablação a laser (citada no capítulo 2 desta tese), enquanto que neste
experimento foram empregadas as nanopartículas com revestimento de pectina, cuja
síntese também foi detalhada no capítulo anterior.
Como a técnica de síntese proposta por Lee e Meisel, seguida de ablação a laser,
gera uma amostra com maior concentração de partículas (1.82x1013
nanopartículas /ml),
Inte
nsi
dad
e (u
. a.
)
Comprimento de onda (nm)
(A) (B)
Comprimento de onda (nm)
Inte
nsi
dad
e (u
. a.
)
(C)
101
as moléculas de triptofano ao serem adicionadas à suspensão tendem a se localizar
muito próximas às nanopartículas metálicas aí presentes, gerando o efeito anteriormente
explicado de supressão da fluorescência (Geddes e Lakowicz, 2002; Aslan, Gryczynski,
Malicka e col, 2005). Já na amostra utilizada neste experimento, a concentração de
nanopartículas de prata (8.3x1012
nanopartículas /ml) e também a camada de pectina
que as reveste garante a manutenção de uma distância entre a molécula fluorescente, no
caso o triptofano, e o núcleo metálico da partícula. Estas condições favorecem o
fenômeno de amplificação da fluorescência.
Também foram realizados experimentos com a rodamina 6G. Nanopartículas de
prata e rodamina 6G foram introduzidas em um filme de PMMA, com o objetivo de
amplificar o sinal de lasers aleatórios. A técnica de síntese empregada para a preparação
das nanopartículas utilizadas foi a preconizada por Lee e Meisel, seguida da ablação a
laser, detalhada no capítulo 2 desta tese. O polímero (PMMA) foi o hospedeiro da
rodamina, corante que atuou como meio amplificador para o laser aleatório, e das
nanopartículas de prata que tiveram o papel de amplificar a capacidade de emissão do
corante. O trabalho testou a interferência da concentração das nanopartículas de prata na
emissão do laser aleatório. O experimento está descrito no artigo “Dependence of
random laser emission on silver nanoparticle density in PMMA films containing
rhodamine 6G” que foi publiucado no periódico JOSA B, volume 28, páginas 1118 a
1123, em maio de 2011 (Dominguez, Maltez, dos Reis e col, 2011).
Os resultados obtidos com o triptofano e a rodamina em meios contendo as
nanopartículas de prata com e sem o revestimento de pectina estimularam a realização
de testes com os três tipos de partículas de prata obtidos a partir das técnicas de síntese
descritas no capítulo 2. Neste experimento foram utilizados pontos quânticos de
CdTe/CdS.
102
Pontos quânticos são nanocristais de semicondutores e são utilizados como
marcadores fluorescentes em técnicas inovadoras de imagem, colaborando para o
avanço da Biomedicina. Em relação aos corantes orgânicos, os pontos quânticos
apresentam maior resistência à fotodegradação e alta intensidade de fluorescência. O
aumento da intensidade da emissão dos pontos quânticos representa melhoras no
desempenho dos marcadores, resultando na utilização de técnicas de diagnóstico por
imagem com maior sensibilidade (Ray, Badugu e Lakowicz, 2006).
A ligação dos pontos quânticos a outros nanomaterias ou a moléculas altera
quimicamente suas superfícies, podendo diminuir a intensidade de emissão. A
associação destes nanocristais a nanopartículas de prata pode ser apresentada como uma
solução para este problema (Fu, Zhang e Lakowicz, 2009).
Na literatura, experimentos associando nanopartículas metálicas a pontos
quânticos foram realizados e seus resultados mostraram sucesso, ao apresentarem o
aumento da intensidade de emissão. A maioria destes trabalhos, porém, utilizou filmes
contendo as duas espécies (Song, Atay, Shi e col, 2005; Ray, Badugu e Lakowicz, 2006;
Ito, Matsuda e Kanemitsu, 2007). Em 2009, Fu, Zhang e Lakowicz publicaram
resultados de aumento na intensidade da fluorescência de pontos quânticos ligados a
nanopartículas de prata revestidas com biotina (Vitamina B7), em meio líquido.
A caracterização óptica dos pontos quânticos de CdTe/CdS utilizados está
representada na figura 43 pelos espectros de absorção e emissão. A espectroscopia de
absorção no UV-vis permite que se estime o diâmetro médio dos pontos quânticos.
Tomando-se como base o primeiro máximo de absorção (em torno de 470 nm) e dados
da literatura (Rogach, Franzi, Feldmann e col, 2007), afirma-se que as partículas
possuem o diâmetro médio de 2.3 nm. Associando o diâmetro médio dos pontos
103
quânticos à metodologia de síntese, estima-se a que concentração de partículas (Yu, Qu,
Guo e col, 2003) seja de 1021
partículas por ml da suspensão.
Ao se comparar o espectro de absorção das partículas de CdTe/CdS aos das
nanopartículas sintetizadas no capítulo 2, percebe-se uma sobreposição espectral das
transições eletrônicas dos pontos quânticos (Figura 43) e das nanopartículas metálicas.
Figura 43 – Espectro de absorção e de emissão dos pontos quânticos de CdTe/CdS. No detalhe, suspensão
dos pontos quânticos excitada por luz ultra-violeta (λ – 365 nm).
A concentração de pontos quânticos de CdTe/CdS adicionada à água, às
nanopartículas de prata envolvidas por pectina, às nanopartículas de prata sem o
revestimento de pectina, e às nanopartículas de prata submetidas a ablação a laser foi de
6.0x1018
partículas/ml.
O comportamento dos pontos quânticos em cada um destes meios e a influência
dos meios na capacidade de emissão foi estudado e pode ser avaliado analisando-se as
curvas da figura 44.
Ao se levar em consideração as curvas em preto, referente à emissão dos pontos
quânticos em água e as acurvas referentes aos pontos quânticos em nanopartículas com
e sem revestimento de pectina (vermelha e azul respectivamente), observa-se a
amplificação da emissão na presença das nanopartículas de prata.
104
Analisando-se apenas as curvas em azul e em vermelho, comprova-se que a
camada de pectina em torno dos núcleos metálicos favoreceu o aumento da emissão,
visto que esta é a única diferença entre as duas amostras de nanopartículas de prata
utilizadas. Porém, ao se introduzir os pontos quânticos em um meio onde há
nanopartículas de prata obtidas pela síntese que segue o método proposto por Lee e
Meisel, seguida da ablação a laser, observou-se a supressão da emissão. A supressão da
fluorescência também foi observada por Rátiva, Gomes, Wachsmann-Hogiu e col, em
2008, ao introduzirem nanopartículas de prata, obtidas pela mesma síntese (proposta por
Lee e Meisel, seguida por ablação a laser), no meio contendo triptofano.
As mudanças de emissão provocadas pela introdução de nanopartículas de prata
sem revestimento de pectina em meio contendo pontos quânticos de CdTe/CdS podem
ser acompanhadas analisando-se as curvas azul (nanopartículas sem pectina) e verde
(nanopartículas de prata obtidas a partir da técnica preconizada por Lee e Meisel,
seguida de ablação a laser) do gráfico da figura 44. A diferença do comportamento
óptico gerado pela introdução dois sistemas coloidais no meio contendo os pontos
quânticos foi atribuída à concentração das nanopartículas. Como já explicado
anteriormente, a concentração de nanopartículas de prata altera o meio, podendo resultar
na supressão da emissão (Geddes e Lakowicz, 2002; Aslan, Gryczynski, Malicka e col,
2005).
105
Figura 44 – Curvas do espectro de emissão dos sistemas: Pontos quânticos de CdTe/CdS em água (em
preto); pontos quânticos de CdTe/CdS com nanopartículas de prata revestidas com pectina (em
vermelho); pontos quânticos de CdTe/CdS com nanopartículas de prata sem pectina (em azul) e pontos
quânticos de CdTe/CdS com nanopartículas de prata obtidas pela técnica de Lee e Meisel, seguida da
ablação a laser (em verde). λ de excitação (acima dos gráficos) – 280, 375 e 445 nm.
Para tirar qualquer dúvida sobre a ação da pectina na amplificação da emissão
das medidas exibidas na figura 44, foram feitos testes medindo-se a emissão de uma
amostra contendo pontos quânticos à pectina, mantendo-se a mesma concentração
utilizada na síntese das partículas de prata revestidas (Figura 45). A análise do gráfico
da figura 45 comprova que não houve interferência do polímero no aumento da emissão,
sendo esta atribuída às nanopartículas de prata.
480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Inte
nsid
ad
e (
u. a
.)
Comprimento de onda (nm)
CdTe/CdS H2O
CdTe/CdS AgPec
CdTe/CdS Ag
CdTe/CdS AgFoto
480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Inte
nsid
ad
e (
u. a
.)
Comprimento de onda (nm)
CdTe/CdS H2O
CdTe/CdS AgPec
CdTe/CdS Ag
CdTe/CdS AgFoto
λ excitação – 375 nm λ excitação – 445 nm
480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Inte
nsid
ad
e (
u. a
.)
Comprimento de onda (nm)
CdTe/CdS H2O
CdTe/CdS AgPec
CdTe/CdS Ag
CdTe/CdS AgFoto
λ excitação – 280 nm
Comprimento de onda (nm) Comprimento de onda (nm)
Inte
nsi
dad
e (u
.a.)
106
Figura 45 – Curvas do espectro de emissão dos sistemas: Pontos quânticos de CdTe/CdS em água (em
preto); pontos quânticos de CdTe/CdS com pectina, sem prata (em vermelho) e pontos quânticos de
CdTe/CdS em meio contendo nanopartículas de prata revestidas com pectina (em azul). λ excitação de
375 nm.
480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Inte
nsid
ad
e (
u. a
.)
Comprimento de onda (nm)
CdTe/CdS H2O
CdTe/CdS Pec
CdTe/CdS AgPec
Inte
nsi
dad
e (u
.a.)
107
CAPÍTULO 4
APLICAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA EM TERAPIA
FOTODINÂMICA
O capítulo 4 traz uma breve explicação sobre a técnica de terapia fotodinâmica,
bem como conceitos importantes para sua compreensão. São detalhadas as aplicações da
técnica no tratamento de infecções localizadas, inclusive na Odontologia. Em seguida,
são realizados experimentos que estudam a interferência das nanopartículas de prata na
liberação de oxigênio singleto, elemento fundamental para a terapia fotodinâmica. O
fotossensibilizador escolhido é a riboflavina e as nanopartículas de prata que
proporcionaram o melhor resultado são as revestidas com a pectina. Para concluir o
experimento, o oxigênio singleto gerado pelo sistema nanopartículas de prata revestidas
por pectina – riboflavina é quantificado com o auxílio do sensor verde para oxigênio
singlete (GR). A quantidade de oxigênio singleto produzido foi dobrada quando as
nanopartículas de prata com pectina foram introduzidas no meio contendo riboflavina.
Foi quantificada, pela primeira vez, a produção de oxigênio singleto em meio aquoso e
utilizando-se um sistema biocompatível.
108
4.1 TERAPIA FOTODINÂMICA
A terapia fotodinâmica (TFD) é um método de tratamento que utiliza a luz para
ativar um agente fotossensível (fotossensibilizador) em presença de Oxigênio. A
exposição do fotossensibilizador à luz, num comprimento de onda específico, resulta na
produção de espécies reativas do Oxigênio (Oxigênio singleto e radicais livres),
causando danos e morte celular (Simplício, Maionchi e Hioka, 2002). Os
fotossensibilizadores podem ser injetados por via endovenosa, administrados oralmente
ou localmente aplicados em tratamentos tópicos (Konopka e Goslinski, 2007). A
Terapia Fotodinâmica é proposta principalmente para o tratamento de câncer
(Simplício, Maionchi e Hioka, 2002; Brown, Brown e Walke, 2004), porém, sua
atividade antimicrobiana também foi comprovada (Wainwright, 1998; O’Riordan,
Akilov e Hasan, 2005; Jori, Fabris, Soncin e col, 2006). Neste último caso, representa
uma alternativa no tratamento de doenças infecciosas causadas por bactérias, vírus ou
fungos, que freqüentemente adquirem resistência aos fármacos tradicionalmente
empregados (Wainwright e Crossley, 2004).
Ao ser comparada às técnicas convencionais, a TFD oferece vantagens como
conforto ao paciente, por não ser invasiva, ter ação localizada, permitir a administração
de doses seguras da droga, efeitos colaterais reduzidos e baixo custo (Dougherty, 1996).
A simplicidade da técnica e suas vantagens fazem com que a Terapia Fotodinâmica seja
aprovada e utilizada como tratamento em países como Estados Unidos, União Européia,
Canadá, Rússia e Japão (Biel, 2002).
Apesar de ser uma opção de tratamento recente, há relatos do uso combinado da
ingestão oral de plantas ou extratos com posterior exposição à luz do sol para tratamento
de doenças de pele, como vitiligo e psoríase, com sucesso no Egito há 4000 anos
109
(Simplício, Maionchi e Hioka, 2002). A terapia fotodinâmica no formato atualmente
reconhecido teve início em 1900 quando Oscar Raab, estudante de Medicina, observou
que a exposição de um corante, a acridina, à luz poderia ser letal a paramécios,
protozoários causadores da malária (Calin e Parasca, 2006). Sua primeira aplicação
clínica foi relatada em 1903, por Von Tappeiner e Jesionek. Eles aplicaram eosina,
topicamente, para o tratamento de carcinoma basocelular, antes de irradiarem as lesões.
Porém, apenas nos anos 70 a TFD foi reconhecida como tratamento para o câncer e, a
partir deste instante, surgiram várias drogas e aplicações possíveis para a técnica
(Triesscheijn, Baas, Schellens e col, 2006).
4.1.1 Mecanismos da terapia fotodinâmica
Para que ocorra a fotodestruição dos tecidos ou células alvo é necessário que
haja a excitação eletrônica do fotossensibilizador pela energia da luz empregada na
irradiação. Este processo leva o fotossensibilizador ao estado singleto. Na maioria dos
casos, um processo conhecido como cruzamento intersistemas leva o fotossensibilizador
ao estado tripleto, que tem maior duração do que o estado singleto (Calin e Parasca,
2006). Existem então duas possibilidades para o fotossensibilizador quando atinge o
estado tripleto: a geração de radicais livres extremamente reativos, ROS (mecanismo
tipo I) ou de oxigênio singleto (mecanismo tipo II) (Figura 46) (Triesscheijn, Baas,
Schellens e col, 2006).
No mecanismo do Tipo I, há transferência de elétron entre o fotossensibilizador
no estado tripleto excitado e o substrato ou moléculas do solvente, gerando radicais ou
íons que reagem com o oxigênio produzindo uma mistura de intermediários de oxigênio
altamente reativos (ROS). É o caso do radical superóxido (O2), peróxido de hidrogênio
110
(H2O2) e do radical Hidroxila (OH), capaz de oxidar uma grande variedade de
biomoléculas. Substâncias de fácil oxidação (fenóis e aminas) ou redução (quinonas) em
meios apolares e anaeróbios favorecem o tipo I de Mecanismo. Fotossensibilizadores
que absorvem na região ultravioleta do espectro também favorecem o mesmo tipo de
mecanismo, pois os estados tripletos apresentam energias relativamente altas, o que
facilita a formação de radicais citotóxicos (DeRosa e Crutchley, 2002; Triesscheijn,
Baas, Schellens e col, 2006).
No mecanismo do tipo II, os estados tripletos excitados do fotossensibilizador
podem interagir com o estado fundamental do oxigênio (3O2) para produzir o oxigênio
singleto (1O2), altamente citotóxico (DeRosa e Crutchley, 2002; Triesscheijn, Baas,
Schellens e col, 2006).
Figura 46 – Mecanismos da terapia fotodinâmica (Adaptado de DeRosa e Crutchley, 2002).
111
Como as reações de transferência de energia são mais rápidas do que as reações
de transferência de elétrons, o mecanismo tipo II é favorecido nas reações de foto-
oxidação (Ribeiro, Jorge, da Silva e col, 2007).
4.1.2 Oxigênio singleto
Os estados excitados de mais baixa energia do O2 são os estados excitados
singleto, 1Σg
+ e
1Δg, cujas energias eletrônicas são 158 e 95 kJ/mol maiores do que a do
estado fundamental tripleto (3Σ), respectivamente. A configuração eletrônica do
1Σg
+ é
semelhante à do estado fundamental, diferindo apenas pelo fato de seus dois últimos
elétrons apresentarem os spins organizados de maneira antiparalela, enquanto que no
estado fundamental, eles aparecem dispostos paralelamente. O outro estado singleto
excitado, 1Δg, é comumente chamado de oxigênio singleto (
1O2) e tem um tempo de
vida mais longo do que 1Σg
+ (DeRosa e Crutchley, 2002; Triesscheijn, Baas, Schellens e
col, 2006).
O oxigênio singleto tem participação fundamental na Terapia Fotodinâmica.
Esta participação se deve à sua rápida reação com estruturas celulares, causando por fim
a morte celular. Em água, o tempo de vida da espécie oxigênio singleto, 1O2, é de
aproximadamente 3 μs, enquanto que em solventes orgânicos esse tempo é de 4 a 50
vezes maior. Em contraste com esses resultados, o tempo de vida do 1O2 é
consideravelmente menor em sistemas biológicos, de 100 ns em regiões lipídicas das
membranas a 250 ns no citoplasma (DeRosa e Crutchley, 2002).
A alta reatividade do oxigênio singleto faz com que ele possa interagir com
quase todos os constituintes celulares. No caso de proteínas, seus principais alvos são os
aminoácidos como a cisteína, histidina, metionina, tirosina e o triptofano, sendo o
112
último o de maior reatividade. Nos ácidos nucléicos, a reação principal se dá com a
guanina e, nos lipídios todas as ligações insaturadas podem ser foto-oxidadas. Lipídios e
proteínas são os principais componentes químicos das membranas biológicas, o que as
torna alvos da terapia fotodinâmica, ou seja, as reações químicas decorrentes da TFD
alteram a permeabilidade celular, provocando danos e posterior morte às celulas
(Davies, 2004; Ribeiro, Jorge, da Silva e col, 2007).
4.1.3 Fotossensibilizadores
Fotossensibilizadores são moléculas com capacidade de absorver luz numa
determinada região do espectro e transferir esta energia para outras moléculas.
Atualmente diversos compostos com características para aplicação em TFD estão sob
investigação, dentre os quais podem ser citados: porfirinas, clorinas, bacterioclorinas,
ftalocianinas, naftalocianinas, purpurinas (Boylet e Dolphin, 1996), aminoacridina
(Wainwright, 1998), indocianina verde (Chan, Lam, Lai e col, 2003), azul de metileno
(Tang, Xu, Kopelman e col, 2005), riboflavina (Martins, Combs, Noguera e col, 2008).
Porém, nem todas as substâncias têm aprovação para uso clínico. Em 2002, Simplício,
Maionchi e Hioka, citaram Photofrin
, Levulan
Kerastick e Visudyne
como os três
únicos medicamentos aprovados para uso em Terapia Fotodinâmica pela FDA, havendo
mais dois sob análise, o Foscan
e o MACE.
Tang, Xu, Kopelma e col (2005) enumeraram características importantes para
que um fotossensibilizador seja considerado ideal em seu emprego na terapia
fotodinâmica. São elas:
- Apresentar um alto coeficiente de absorção na região do espectro compatível com a
luz de excitação;
113
- Estado tripleto com energia apropriada para permitir transferência de energia eficiente
para reduzir o oxigênio;
- Alto rendimento e meia vida longa no estado tripleto, visto que a eficiência do
fotossensibilizador depende das propriedades fotofísicas do mais baixo estado excitado
tripleto;
- Ser fotoestável, antes da sua aplicação terapêutica;
- Não possuir toxicidade no seu estado fundamental (não excitado).
Porém, a maioria dos fotossensibilizadores disponíveis não apresenta estas
características. Eles não mostram uma boa seletividade em relação ao tecido alvo,
afetando tecidos sadios; a liberação de oxigênio singleto é insuficiente, tornando
necessária a administração de doses elevadas da droga para se alcançar os efeitos
terapêuticos desejados; normalmente apresentam absorção na faixa de comprimento de
onda de 630 nm, ou seja, a penetração nos tecidos biológicos é relativamente baixa; e
observa-se um acúmulo destas substâncias na pele, impedindo a exposição à luz do
paciente submetido ao tratamento por aproximadamente 4 a 6 semanas após o
tratamento, podendo haver risco de danos à derme (Tang, Xu, Kopelma e col, 2005).
a) Riboflavina
A riboflavina é um composto orgânico que faz parte do complexo vitamínico B.
Também chamada de vitamina B2, é uma vitamina hidrossolúvel que pode ser
encontrada em alimentos de origem animal e vegetal, tais como leite, queijo, peixes,
carnes, ovos, cereais, algumas frutas e hortaliças de folhas verdes escuras e pode ser
excretada via urina quando ingerida em excesso. A presença do grupo flavina
(composto de aneis heterocíclicos) em sua molécula confere propriedades
114
espectroscópicas características assim como uma coloração amarela forte, e
fluorescência, figura 47 (Powers, 2003).
Figura 47 – Estrutura da riboflavina, destacando a cadeia ribitil e o sistema de anéis isoaloxazina,
responsável pela característica de fluorescência da molécula. No detalhe, seu aspecto de pó de coloração
amarelo forte (Souza, Ferreira, Jucá e col, 2005).
A riboflavina é de fundamental importância em organismos aeróbios, sendo
precursora de coenzimas importantes que participam de cadeias transportadoras de
elétrons como a FAD e a FMN. Também é responsável pela origem de várias das
flavinas que se encontram ligadas a diversas enzimas que atuam na catálise de grande
número de reações, como é o caso das relacionadas a reparos do DNA (Edwards,
Bueno, Saldaño e col, 1999).
Estudos sobre as propriedades ópticas da riboflavina (Folkes e Wardman, 2003;
Meisel e Kocher, 2005; Baier, Maisch, Maier e col, 2006) mostram que sua molécula
tem a capacidade de absorver a luz alcançando o estado tripleto excitado. A riboflavina
no estado tripleto pode interagir com o Oxigênio molecular gerando o oxigênio singleto
ou agir diretamente sobre um substrato levando à fotoxidação deste e à conseqüente
115
geração de radicais intermediários, além de espécies reativas de oxigênio, tais como o
superóxido, radical hidroxil e peróxido de hidrogênio (Souza, Ferreira, Jucá e col,
2005). Este comportamento, fez com que a riboflavina passasse a ser utilizada como
fotossensibilizador na técnica de Terapia Fotodinâmica (Folkes e Wardman, 2003;
Meisel e Kocher, 2005; Baier, Maisch, Maier e col, 2006). Meisel e Kocher (2005)
classificam a riboflavina como um potente fotossensibilizador e relatam sua indicação
como agente de descontaminação do sangue, plasma e concentrados celulares
armazenados para transfusões. Baier, Maisch, Maier e col (2006) classificaram a
riboflavina como um fotossensibilizador endógeno, por ser produto do próprio corpo
humano. Declararam que seu rendimento na produção de oxigênio singleto é de 0.54 +\-
0.07.
4.2 TERAPIA FOTODINÂMICA NO TRATAMENTO DE INFECÇÕES
LOCALIZADAS
As infecções localizadas geralmente são provocadas por bactérias e fungos e são
tratadas com drogas antimicrobianas. O contato freqüente com os antimicrobianos faz
com que cepas destes microorganismos se tornem cada vez mais resistentes aos
tratamentos convencionais (Coats, Hu, Bax e col, 2002; Smith, 2005). Este fato vem
despertando a necessidade do desenvolvimento e aplicação de terapias alternativas,
como o uso de compostos à base de prata, relatado no capítulo 1 (Quinn e Milder, 2002;
Catauro, Raucci, De Gaetano e col, 2004; Maisch, Szeimies, Jori e col, 2004; Kim, Kuk,
Kyeong e col, 2007), e também da terapia fotodinâmica, principalmente para combater
cepas mais virulentas (Wainwright, 1998; Minnock, Vernon, Schofiels e col, 2000;
O’Riordan, Akilov e Hasan, 2005; Jori, Fabris, Soncin e col, 2006). Na literatura, a
116
terapia fotodinâmica já foi proposta como tratamento de várias infecções localizadas,
dentre elas estão infecções causadas por bactérias (Salmon-Divon, Nitzan e Malik,
2004), fungos (Donnelly, McCarron, Tunney e col, 2007), vírus (Wainwright, 2003) e
protozoários, como é o caso da leishmaniose (Sah, Ito, Kolli e col, 2002).
Soukos, Wilson, Burns e col (1996) se preocuparam com a sanidade dos tecidos
durante a utilização da Terapia Fotodinâmica no combate a doenças causadas por
microorganismos. Concluíram que a técnica era segura, havendo seletividade pelas
células microbianas, seletividade esta atribuída a diferenças farmacocinéticas
observadas entre as células de mamíferos e as bacterianas. Lavi, Weitman, Holmes e col
(2002) também reconheceram a especificidade da técnica em relação a bactérias,
responsabilizando por ela a curta vida do Oxigênio singleto e, consequentemente, a
limitação em sua área de atuação (100 nm). Calzavara-Pinton, Venturini e Sala (2005)
relatam características semelhantes para a interação entre a Terapia Fotodinâmica e
células de fungos.
Em bactérias, os danos causados pela Terapia Fotodinâmica podem
comprometer o ácido nucléico (Salmon-Divon, Nitzan e Malik, 2004), a membrana
citoplasmática (Schafer, Schmitz, Facius e col, 2000) ou ainda as duas estruturas ao
mesmo tempo (Bertoloni, Lauro, Cortella e col, 2000). Até mesmo nas bactérias Gram
negativas, mais resistentes por possuírem uma membrana dupla (a membrana
citoplasmática e outra membrana externa), vêm se mostrando sensíveis à Terapia
Fotodinâmica (Hamblin e Hasan, 2004). Neste caso, Minnock, Vernon, Schofield e col
(2000) e Hamblin, O’Donnell, Murthy e col (2002) atribuem o sucesso ao emprego de
fotossensibilizadores catiônicos.
117
4.2.1 Terapia Fotodinâmica para tratamento de infecções localizadas em
Odontologia
Também em Odontologia, a Terapia Fotodinâmica foi proposta inicialmente
para o tratamento de lesões malignas de cabeça e pescoço, oferecendo várias vantagens
em relação aos tratamentos cirúrgicos, quimio e radioterápicos convencionais (Biel,
2002; Konopka e Goslinski, 2007). Porém, cada vez mais, a técnica vem sendo indicada
para tratar as diversas doenças infecciosas que acometem a cavidade oral (Bhat,
MacRobert, Meghji e col, 1998; Wood, Nattress, Kirkham e col, 1999; Wainwright e
Crossley, 2004; Wood, Metcalf, Devine e col, 2006; Donnelly, McCarron, Tunney e
col, 2007).
A cavidade oral normalmente é colonizada por uma grande variedade de
microorganismos, incluindo fungos (Candida albicans) e bactérias aeróbicas e
anaeróbias, de espécies Gram positivas e Gram negativas. Quando ocorre um
desequilíbrio, e algumas destas espécies prevalecem sobre outras, desenvolvem-se
patologias como a cárie, a doença periodontal ou candidíase (Newman, Takei e
Carranza, 2002). Uma das causas de desequilíbrio da flora oral é o uso de antibióticos
de largo espectro, por isto Kömerik e MacRobert (2006) recomendam a Terapia
Fotodinâmica como uma técnica que permite a ação antimicrobiana localizada, sem
comprometer a flora das outras regiões.
A periodontite é uma doença inflamatória que acomete os tecidos de suporte do
dente (gengiva, osso e ligamento periodontal) e é causada pelas bactérias que compõem
o biofilme da placa dental e se situam nas superfícies dos dentes, geralmente
subgengivalmente. Em conseqüência da doença aparecem as bolsas periodontais, pois
há uma perda de inserção das fibras que formam o ligamento periodontal, e também
118
destruição óssea, ou seja, em estágios avançados a doença periodontal pode levar a
perda dos elementos dentários envolvidos. Apesar de poder ter conseqüências
irreparáveis, a doença periodontal é bastante comum e de difícil tratamento, pois pode
ser influenciada por diversos fatores, dentre eles a hereditariedade e hábitos de higiene.
Além disso, é uma patologia causada por diferentes tipos de bactérias que podem
responder de maneira diferente aos tratamentos propostos (Newman, Takei e Carranza,
2002).
O tratamento comumente aplicado para a periodontite é a remoção dos cálculos,
através da raspagem e alisamento das superfícies dentárias, e o uso de soluções
antimicrobianas para bochechos. Antibióticos de uso sistêmico também podem ser
utilizados, porém, a grande variedade de espécies que podem estar envolvidas na
patologia e a localização difusa podem causar resistência de algumas espécies ao
tratamento antimicrobiano. Por estas dificuldades, a terapia fotodinâmica vem ganhando
espaço como tratamento alternativo para esta doença (Bhat, MacRobert, Meghji e col,
1998; Wood, Nattress, Kirkham e col, 1999; Wainwright e Crossley, 2004; Meisel e
Kocher, 2005; Wood, Metcalf, Devine e col, 2006).
Três fotossensibilizadores diferentes (eritrosina, azul de metileno e porfirina)
foram testados por Wood, Metcalf, Devine e col (2006) que empregaram a TFD em
colônias de Streptoccocus mutans, bactéria encontrada em abundância no biofilme da
cavidade oral. Observaram que todas as três substâncias foram eficientes, apesar da
eritrosina apresentar a maior eficácia no combate às bactérias
A candidíase é uma patologia que freqüentemente compromete a orofaringe,
principalmente em crianças, idosos, usuários de próteses removíveis e pacientes
imunodeprimidos, a exemplo de HIV positivos. Caracteriza-se pela presença de placas
avermelhadas ou esbranquiçadas e é responsável por sensações de desconforto ao
119
portador (Shafer, Hine, Levy e col, 1983). Na verdade, Candida albicans, o fungo
causador, faz parte da microbiota normal da orofaringe e vive em equilíbrio com outros
microrganismos e a doença manifesta-se quando algum fator facilita o crescimento dos
fungos. O tratamento normalmente consiste no uso de agentes antifúngicos ou
fungistáticos (Shafer, Hine, Levy e col, 1983; Donnelly, McCarron, Tunney e col,
2007).
Preocupados com o freqüente desenvolvimento de resistência por parte dos
pacientes tratados com as técnicas convencionais, Donnelly, McCarron, Tunney e col
(2007) propuseram a aplicação da terapia fotodinâmica com o azul de toluidina, agente
fotossensibilizante de eficácia comprovada, para o tratamento de infecções na
orofaringe causadas por Candida albicans. Os pesquisadores contaram ainda com as
técnicas de liberação controlada de fármacos para a liberação do fotossensibilizador a
partir de um patch polimérico com capacidade de aderir à mucosa, permitindo assim
uma ação localizada sem provocar manchas na boca ou dentes. Os “patches” contendo
50 e 100 mg de TBO foram colocados em condições semelhantes às da cavidade oral
com culturas de C. albicans e submetidos a irradiação com a luz. Ao final do
experimento, comprovou-se a eficácia do sistema quando a duração da utilização foi
curta, já em aplicações que simularam uso prolongado, notou-se uma queda na eficácia.
Garcez, Nuñez, Hamblin e col (2008) analisaram o efeito antimicrobiano da
TFD associado ao tratamento endodôntico e concluíram que esta combinação foi
eficiente na destruição de microorganismos que permanecem no interior dos canais
mesmo depois do tratamento endodôntico convencional, isto sem efeitos tóxicos aos
tecidos vizinhos sadios.
120
4.3 NANOPARTÍCULAS METÁLICAS E TERAPIA FOTODINÂMICA
Para o bom desempenho da Terapia Fotodinâmica é fundamental que durante o
processo fotodinâmico o suprimento de oxigênio seja superior ao consumo. Este fato
representa umas das principais limitações da técnica atualmente (Dougherty, Gomer,
Henderson e col, 1998). Para compensar o déficit de oxigênio na região tratada, pode se
aumentar a população dos estados excitados tripletos dos fotossensibilizadores que têm
a propriedade de produzir o oxigênio singleto. Pois, tanto a produção de 1O2, quanto a
de radicais estão associados ao aumento de população no estado tripleto (T1) (Zhang,
Aslan, Previte e col, 2006; Zhang, Aslan, Malyn e col, 2006). Por isto, quando se deseja
melhorar o desempenho dos fotossensibilizadores, trabalha-se para aumentar seu
rendimento de oxigênio singleto, que fica em torno de 0.2 a 0.7, ou seja, 20 a 70% nos
fotossensibilizadores utilizados (Wainwright, 2009).
Ao observarem que a associação de moléculas fluorescentes a superfícies
metálicas não só causava a amplificação da fluorescência, pelo aumento da população
no estado singleto de menor energia (Lakowicz, Shen, Gryczynski e col, 2001; Geddes
e Lakowicz, 2002; Lakowicz, Shen, D'Auria e col, 2002; Malicka, Gryczynski e
Lakowicz, 2003; Aslan, Gryczynski, Malicka e col, 2005), Zhang, Aslan, Malyn e col
(2006) e Zhang, Aslan, Previte e col (2006) observaram que este fato poderia aumentar
a probabilidade de ocorrer o cruzamento intersistemas e a conseqüente produção de 1O2.
Por isto, associaram os fotossensibilizadores empregados em TFD a superfícies
metálicas. O aumento observado na fosforescência foi explicado pela transferência de
energia dos elétrons da superfície plasmônica de um filme de prata não contínuo para o
fotossensibilizador (fluoróforo) (Figura 48) (Zhang, Aslan, Malyn e col, 2006; Zhang,
Aslan, Previte e col, 2007).
121
Figura 48 – Interpretação da intensificação da fosforescência na presença de metais (A) e da geração do
oxigênio singleto (B). P – fosforescência, RB – fotossensibilizador, 3O2 – Oxigênio no estado
fundamental tripleto e 1O2 – Oxigênio singleto (Adaptado de Zhang, Aslan, Previte e col, 2008).
A partir da avaliação da figura 49, que traz o diagrama de Jablonski modificado,
pode se compreender melhor o mecanismo desencadeado pela presença de moléculas de
fluoróforos nas proximidades de superfícies metálicas. O campo eletromagnético gerado
ao redor das partículas intensifica o processo de absorção no estado fundamental, de S0
para Sn, aumentando a taxa de excitação. A partir de Sn, há um relaxamento (não
radiativo) para o estado singleto de menor energia, S1. Como a presença das
nanopartículas metálicas aumenta a população de Sn, conseqüentemente, há um aumento
na população de S1 aumentando a probabilidade de ocorrência do cruzamento
intersistemas, conseqüentemente, intensificando a fosforescência. Como a produção de
oxigênio singleto está associada ao aumento do rendimento tripleto que também está
associada ao fenômeno de fosforescência, o fato de as superfícies metálicas
intensificarem a fosforescência, faz com que a presença delas em meios contendo
fotossensibilizadores também aumente a produção de oxigênio singleto (Zhang, Aslan,
Previte e col, 2007).
Transferência /
acoplamento de plasmons
Intensificação da absorção
(A) (B)
122
.
Figura 49 – Esquema do Diagrama de Jablonski para a amplificação da produção de Oxigênio singleto
decorrente da associação entre um fotossensibilizador e os plasmons superficiais. MEF – Fluorescência
amplificada pela presença das nanopartículas metálicas. MEP – Fosforescência amplificada pela presença
das nanopartículas metálicas. 3O2, Oxigênio no estado tripleto e
1O2, Oxigênio singleto; isc – cruzamento
intersistemas (Adaptado de Zhang, Aslan, Previte e col, 2007).
4. 4 METODOLOGIA
O sistema de Terapia Fotodinâmica empregado nesta tese avaliou a presença de
nanopartículas de prata com e sem pectina com a riboflavina. A utilização das
nanopartículas de prata teve como objetivo a intensificação da produção de Oxigênio
singleto. Foi empregada a riboflavina da Sigma-Aldrich, numa concentração de 35 µM,
tanto em água, quanto nas suspensões de nanopartículas de prata.
Para se comparar a produção de oxigênio singleto pelos sistemas Riboflavina em
água (RbH2O), Riboflavina em nanopartículas de prata com pectina (RbNpAgPEC) e
Riboflavina em nanopartículas de prata sem pectina (RbNpAg) foi empregado o sensor
Sn
S1
S0
kisc
T1
Sn
S1
S0
kisc
T1
Fluorescência
Clássica Fosforescência
Clássica
Ressonância
de plasmons
NpAg
Ressonância
de plasmons
NpAg
Transferência
aos Plasmons
3O2
1O2
Geração de
Oxigênio Singlete
Abso
rção
acen
tuad
a
MEF
MEP
Transferência
aos Plasmons
o
123
verde para oxigênio singleto (GR), da Molecular Probes (Figura 50 (A)). Trata-se de um
sensor altamente seletivo para o oxigênio singleto, capaz inclusive de quantificar sua
produção. Na presença do oxigênio singleto, o GR emite uma fluorescência com
excitação e emissão em torno de 504 nm e 525 nm, respectivamente, figura 50 (B)
(Molecular probes, 2004; Flors, Fryer, Waring e col, 2006).
Figura 50 – Em (A), aspecto do GR. Em (B), propriedades espectrais do GR, antes e depois da interação
com 1O2. Absorção, em a e c, e emissão, em b e d. Sendo que a e b, correspondem às medidas feitas antes
da produção do oxigênio singleto. c e d, depois. As medidas da emissão foram obtidas com comprimento
de onda de excitação em 480 nm (Flors, Fryer, Waring e col, 2006).
O sensor foi inicialmente preparado em uma solução de estoque em metanol de
aproximadamente 5 mM, segundo orientações do fabricante. Porém, para ser utilizada
juntamente com a Riboflavina, a solução de estoque do sensor de oxigênio singleto foi
diluída em água até se obter uma solução de 157 µM, mantendo a mesma relação entre
as concentrações de fotossensibilizador e do GR utilizadas por Zhang, Aslan, Michael e
col (2008).
Para a irradiação das soluções e conseqüente geração do Oxigênio singleto
foram empregados LEDs operando no comprimento de onda de 415 nm, com uma
potência total de 31 mW. O tempo de irradiação utilizado foi de 2 minutos. O
comprimento de onda de 415 nm foi escolhido para irradiar o fotossensibilizador
Ab
sorb
ânci
a
Inten
sidad
e (rel)
Comprimento de onda (nm)
(A) (B)
124
(Riboflavina) por estar na faixa do espectro correspondente à lâmpada de luz halógena
presente nos equipamentos utilizados em consultórios odontológicos para a cura de
materiais compósitos empregados em restaurações dentárias. Além disso, o
comprimento de onda de 415 nm coincide com a região do espectro referente à banda de
plasmon das partículas de prata sintetizadas para este experimento.
4. 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para avaliar o comportamento óptico da molécula de riboflavina quando
associada às partículas de prata, foi obtido inicialmente o espectro de absorção no UV-
visível, exibido na curva em vermelho da figura 51. Sua análise permitiu a identificação
de três máximos: o primeiro localizado em 266 nm, o segundo em 373 e o terceiro em
445 nm. Ainda na figura 50, porém analisando a curva em preto, observa-se a banda de
palsmons das nanopartículas de prata revestidas por pectina com seu máximo em torno
de 412 nm, ou seja, na mesma região do espectro onde se observaram dois máximos da
molécula da riboflavina. Comparando-se a curva referente à absorbância da riboflavina
em água (em vermelho) à das nanopartículas de prata revestidas com pectina,
comprova-se a sobreposição espectral observada na região do espectro que corresponde
aos máximos da riboflavina, referentes aos comprimentos de onda de 373 e 445 nm, e à
banda de plasmons das nanopartículas de prata revestidas com pectina.
125
Figura 51 – Espectro de absorção no UV-Vis, em preto, das nanopartículas de prata revestidas com
pectina; em vermelho, espectro de absorção no UV-visível da Riboflavina em água e, em azul, da
riboflavina em meio contendo nanopartículas de prata revestidas com pectina. Foi utilizada uma cubeta de
quartzo de 1 mm.
A partir da análise dos gráficos de emissão presentes na figura 52, observou-se o
aumento na intensidade da emissão quando a riboflavina esteve no meio contendo as
nanopartículas de prata recobertas com a camada de pectina. Alguns trabalhos da
literatura (Aslan, Lakowicz, Szmacinski e col, 2004; Aslan, Gryczynski, Malicka e col,
2005; Aslan, Lakowicz e Gededs, 2005; Lakowicz, Chowdhury, Ray e col, 2006;
Zhang, Aslan, Previte e col, 2006; Aslan, Wu, Lakowicz e col, 2007; Zhang, Aslan,
Previte e col, 2007) também relatam o aumento da intensidade da emissão de
fluoróforos, quando na presença de nanopartículas de prata, porém as partículas
utilizadas (nanopartículas de prata depositadas em filmes finos ou revestidas com sílica)
são diferentes das empregadas nesta tese.
Os comprimentos de onda de excitação empregados na realização das medidas
de emissão da figura 52 foram selecionados em função dos máximos de absorbância da
riboflavina (267 nm, 375 nm e 445 nm). Ainda em relação à figura 52, as curvas em
250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Ab
so
rbâ
ncia
Comprimento de onda (nm)
AgPec
RbH2O
RbAgPec266 nm
412 nm
373 nm 445 nm
126
preto referem-se à ausência de emissão das nanopartículas de prata revestidas por
pectina, em vermelho, à emissão da riboflavina em água e, em azul, à emissão da
riboflavina juntamente com as nanopartículas de prata revestidas com pectina.
Figura 52 – Espectros de emissão. Curva em preto, nanopartículas de prata revestidas com pectina
(ausência de emissão), em vermelho, riboflavina em água e, em azul, riboflavina em meio contendo
nanopartículas de prata revestidas com pectina. λ de excitação: 267 nm (esquerda), 375 nm (direita) e 444
nm (abaixo). (Estas curvas foram obtidas com o equipamento Varian (Palo Alto, CA, USA) Cary Eclipse
Fluorescence Spectrophotometer).
Também foi importante o comportamento da emissão da riboflavina em
presença das nanopartículas de prata excitando com os comprimentos de onda aplicados
para excitar o sensor (502 nm) e para ativar o sistema de LEDs empregado na irradiação
do sistema (415 nm) (Figura 53). A avaliação das curvas presentes na figura 53 permitiu
460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
Inte
nsid
ad
e (
u.a
.)
Comprimento de onda (nm)
Agpec
RibH2O
RibAgpec
λ excitação – 267 nm
460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
Inte
nsid
ad
e
Comprimento de onda (nm)
Agpec
RbH2O
RbAgpec
λ excitação – 375 nm
460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
Inte
nsid
ad
e (
u. a
.)
Comprimento de onda (nm)
Agpec
RibH2O
RibAgpec
λ excitação – 444 nm
Comprimento de onda (nm)
Comprimento de onda (nm)
Comprimento de onda (nm)
127
a comprovação da interferência do campo gerado pelo plasmon das nanopartículas
metálicas no aumento da fluorescência do composto luminescente, a riboflavina, além
de confirmar a importância do revestimento de pectina nas partículas para o fenômeno
estudado. A amplificação da emissão para as amostras de riboflavina com
nanopartículas de prata revestidas com pectina foi de 1.7, enquanto que para as amostras
de riboflavina com nanopartículas sem pectina foi de 1.3. Comparando os gráficos da
figura 53, observa-se que ao se excitar as amostras em 502 nm, a interferência das
nanopartículas de prata diminui (Figura 53), pois este comprimento de onda está na
região do espectro onde a absorbância das nanopartículas de prata já não é tão evidente.
Figura 53 – Espectros de emissão. Curva em preto, riboflavina em água; em vermelho, riboflavina em
meio contendo nanopartículas de prata sem revestimento de pectina; e, em azul, riboflavina em meio
contendo nanopartículas de prata revestidas com pectina. λ de excitação: 415 nm (direita) e 502 nm
(esquerda). (Estas curvas foram obtidas com o espectrofluorímetro contador de fótons modelo ISS PC1).
Partindo do princípio proposto por Zhang, Aslan, Malyn e col (2006) e Zhang,
Aslan, Previte e col (2006) que diz que a amplificação da emissão também pode causar
o aumento do rendimento do estado tripleto e conseqüente produção do oxigênio
singleto, a próxima etapa desta tese tratou da medição da produção do oxigênio singleto.
Nesta etapa foi empregado o GR. Como o máximo de absorbância do GR está em torno
460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
1100000
1200000
1300000
Y A
xis
Title
Comprimento de onda (nm)
RbH2O
RbAgPec
λ excitação – 502 nm λ excitação – 415 nm
450 500 550 600 650 700
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
1100000
1200000
1300000
Inte
nsid
ad
e (
u. a
.)
Comprimento de onda (nm)
RbH2O
RbAg
RbAgPec
Comprimento de onda (nm)
Comprimento de onda (nm)
Inte
nsid
ade (
u.a
.)
128
de 502 nm e esta região do espectro coincide com a região onde as absorbâncias da
riboflavina e das nanopartículas de prata já não são tão evidentes, este foi o
comprimento de onda de excitação selecionado para ser utilizado nas medidas da
liberação do oxigênio singleto. Esta foi a forma encontrada para se garantir que as
curvas obtidas seriam decorrentes da fluorescência do sensor que foi amplificada na
presença do oxigênio singleto, sofrendo o mínimo possível de interferência da emissão
da riboflavina e da ação das nanopartículas de prata.
A comprovação da presença de oxigênio singleto foi obtida a partir da
comparação entre os gráficos presentes na figura 54. O gráfico representado na figura
54 (A) traz as curvas referentes às emissões dos sistemas RbH2O, RbNpAgPEC e
RbNpAg antes da irradiação com o sistema de LEDs, indutor da produção de oxigênio
singleto. Depois de 2 minutos de irradiação das amostras com os LEDs no comprimento
de onda de 415 nm, foram obtidas as medidas presentes no gráfico da figura 54 (B) que
exibe curvas de maior intensidade decorrentes do aumento da emissão do sensor,
indicativo da presença de oxigênio singleto. Estes resultados foram atribuídos ao
aumento do rendimento dos estados excitados tripletos da Riboflavina.
Observou-se o aumento na produção de oxigênio singleto para o sistema que
introduz a Riboflavina no meio onde estão presentes as nanopartículas de prata cobertas
com pectina. Quando a riboflavina está em um meio no qual estão presentes as
nanopartículas que têm suas superfícies metálicas expostas ao meio, a emissão do
sensor para oxigênio singleto mostrou-se semelhante à do meio que não contém
nanopartículas de prata. O revestimento polimérico interferiu na distância entre as
moléculas de riboflavina e o núcleo metálico das partículas presentes no sistema
coloidal. Ainda analisando o gráfico da figura 54 (A), observa-se que as nanopartículas
de prata com pectina amplificaram a intensidade da fluorescência do GR.
129
Figura 54 – Espectros de emissão do sensor para oxigênio singleto. Em (A), antes da irradiação com o
sistema de LEDs indutor de produção de oxigênio singleto. Em (B), depois de 2 minutos de irradiação das
amostras. Comprimento de onda de excitação foi de 502 nm.
A quantificação do oxigênio singleto produzido foi obtida a partir de cálculo das
áreas sob as curvas presentes na figura 55, de acordo com Zhang et al, 2008. As áreas
sob as curvas foram calculadas com o auxílio do software Origin, versão 8.0. Foram
realizadas várias medidas para comprovar a reprodutibilidade da pesquisa e o valor
apresentado trata-se de uma média entre estes resultados.
A amplificação da produção de oxigênio singleto em presença das superficies
metálicas (1O2,MEO) é dada por:
dRbdRbGRGR
dNpRbdNpRbGRO
depoisdepoisMEF
depoisdepois
MEO)(),(
),(),,(,2
1. (6)
Onde dNpRbGR depois),,( e dRbGR depois),( são os espectros integrados do sensor
GR na solução de riboflavina, com e sem nanopartículas, depois da excitação com 415
520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
1100000
1200000
Inte
nsid
ad
e
Comprimento de onda (nm)
RbH2O_GR
RbAg_GR
RbAgPec_GR
520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
1100000
1200000
Inte
nsid
ad
e (
u.a
.)
Comprimento de onda (nm)
RbH2O_GR
RbAg_GR
RbAgPec_GR
(A) (B)
Comprimento de onda (nm)
Comprimento de onda (nm)
Inte
nsid
ade (
u.a
.)
130
nm. A contribuição da fluorescência oriunda da solução de riboflavina, com e sem
nanopartículas, dNpRb depois),( e dRb depois)( , depois da exposição à luz azul foram
subtraídas. A fluorescência do GR também pode ser afetada pela interação entre o
sensor GR e as nanopartículas por conta do fenômeno de amplificação da fluorescência
em presença de nanopartículas metálicas (Geddes e Lakowicz, 2002). Esta contribuição,
GRMEF, na determinação da amplificação da produção de 1O2 em presença de
superfícies metálicas é dada por:
dGR
dNpGRGRMEF
)(
),(. (7)
Onde dNpGR depois),( e dGR depois)( são a integração dos espectros do GR em
solução aquosa, com e sem as nanopartículas.
131
Figura 55 – Espectros de emissão utilizados para quantificar a produção de oxigênio singleto. Em (A):
curva em preto, emissão do GR em água, sem nanopartículas de prata e sem riboflavina; em vermelho,
emissão do GR em nanopartículas de prata com pectina e sem riboflavina. Em (B): curva em preto,
emissão do GR e riboflavina em água, depois da irradiação com LEDs; em vermelho, emissão do GR e
riboflavina em nanopartículas de prata, depois da irradiação com LEDs. Em (C): curva em preto, emissão
da riboflavina em água; em vermelho, emissão da riboflavina em nanopartículas de prata com pectina; λ
excitação = 502 nm.
A partir deste experimento, foi possível dobrar a capacidade de a riboflavina
produzir o oxigênio singleto, com a presença das nanopartículas de prata envolvidas
com pectina passou para 1,8 +/- 0.2. Foi a primeira vez que o aumento da produção de
oxigênio singleto foi quantificado em meio aquoso. Em 2008, Zhang, Aslan, Previte e
col publicaram um aumento de produção maior do que o apresentado nesta tese, porém
não quantificaram exatamente o valor obtido, além de que, seus trabalhos foram
520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
1100000
1200000
Ite
nsid
ad
e (
u. a
.)
Comprimento de onda (nm)
GR RBH2O_UV
GR RBAgPec_UV
520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
1100000
1200000
Inte
nsid
ad
e (
u. a
.)
Comprimento de onda (nm)
GR H2O
GR AgPec
520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
1100000
1200000
Inte
nsid
ad
e (
u. a
.)
Comprimento de onda (nm)
RbH2O
RbAgPec
(A) (B)
(C)
Inte
nsid
ade (
u.a
.)
Comprimento de onda (nm) Comprimento de onda (nm)
Comprimento de onda (nm)
Inte
nsid
ade (
u.a
.)
132
realizados em filmes finos depositados em substrato de vidro, condição não viável para
a terapia fotodinâmica (Figura 56).
Figura 56 – Fator de amplificação da produção de oxigênio singleto para vários fotossensibilizadores. 1,
acridina; 2, RB; 3, cloroquina; 4, indometacina; 5, riboflavina; 6, naproxen; 7, cloropromazina; 8,
quinidina. (Adaptado de Zhang, Aslan, Previte e col, 2008).
Além do aumento na produção de oxigênio singleto a partir de um sistema
aquoso, houve a preocupação de se trabalhar com substâncias que não fossem tóxicas ao
organismo humano.
Rendimentos quânticos para oxigênio singlete
Fat
or
de
inte
nsi
fica
ção
da
lib
eraç
ão d
e
ox
igên
io s
ing
lete
pel
a aç
ão d
e il
has
de
Np
Ag
em f
ilm
e
Riboflavina
133
CONCLUSÕES
Com realização da fase laboratorial e estudo bibliográfico deste trabalho
conclui-se que:
1) As diferentes técnicas de síntese empregadas permitiram a preparação de
nanopartículas de prata com e sem recobrimento polimérico. Os polímeros
utilizados foram a Pectina e a Jeffamina.
2) A pectina foi eficiente como recobrimento das partículas sintetizadas, e além de
impedir a aglomeração das partículas, contribui para a compatibilidade biológica
do material, já que faz parte da alimentação humana diária.
3) A utilização da Jeffamina permite a síntese de nanopartículas de prata estáveis e
funcionalizadas com grupamentos amina, facilitando, posteriormente, a ligação
de moléculas e outras estruturas às nanopartículas.
4) Nos compósitos nanohíbridos à base de celulose bacteriana impregnada com
nanopartículas de prata, utilizando-se Citrato de sódio como agente redutor, os
poros da membrana tiveram ação comprovada no controle do tamanho das
nanopartículas de prata.
5) Houve diferença de comportamento óptico entre nanopartículas de prata
sintetizadas por técnicas diferentes quando estas partículas foram introduzidas
em meio contendo fluoróforos (triptofano, rodamina 6G, pontos quânticos de
CdTe/CdS e riboflavina).
6) A presença da pectina no revestimento das nanopartículas de prata possibilitou
melhor amplificação da emissão quando estas partículas foram introduzidas em
meio líquido contendo fluoróforos (triptofano, rodamina 6G, pontos quânticos
de CdTe/CdS e riboflavina).
134
7) As nanopartículas de prata envolvidas pela pectina, quando introduzidas em
meio contendo riboflavina, também se mostraram mais eficientes em relação à
produção de oxigênio singleto quando comparado à riboflavina em água e à
riboflavina em nanopartículas de prata sem revestimento polimérico.
8) Aumentou-se em 1.8 a produção do oxigênio singleto ao se introduzir as
nanopartículas com revestimento de pectina a um meio contendo riboflavina.
9) Pela primeira vez, a amplificação da produção de oxigênio singleto foi
quantifica em um meio líquido e utilizando-se um sistema biologicamente
compatível (pectina e riboflavina), trabalhando-se em uma condição próxima do
ideal para a Terapia Fotodinâmica.
135
PERSPECTIVAS
Os resultados oriundos dos trabalhos desenvolvidos para esta tese chamam
atenção à importância da continuidade da pesquisa e para a aplicação clínica segura dos
materiais desenvolvidos. Estes estudos serão realizados durante o pós-doutorado da
aluna e incluem:
a) Testes da atividade antimicrobiana dos compósitos à base da celulose
bacteriana impregnada por nanopartículas de prata em bactérias pertencentes à flora da
cavidade oral.
b) Avaliação dos sistemas de Terapia fotodinâmica propostos na tese em
microorganismos e células tumorais.
c) Testes de toxicidade e mutagenicidade para o sistema proposto pela tese, para
garantir biocompatibilidade e aplicação segura dos materiais desenvolvidos.
d) Utilização da celulose bacteriana não só como veículo para a PDT em
tratamentos tópicos, auxiliando no combate das doenças tumorais, mas também na
cicatrização de feridas presentes na região tratada.
e) Estudos da interação das nanopartículas com outros fotossensibilizadores.
f) Melhora da distribuição de tamanho das partículas funcionalizadas com a
Jeffamina.
g) Ligação de moléculas fluorescentes à superfície das nanopartículas envolvidas
por polímero.
h) Síntese de nanopartículas com revestimento polimérico de diferentes
espessuras, para garantir a distância ideal entre a molécula fluorescente e o núcleo
metálico.
136
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