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8/12/2019 SINTESISYCARACterizacion plata.pdf

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T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:

DOCTOR EN T CNOLOGIA AVANZADA

PRESENTA:

M. T. A. MIGUEL ANGEL AGUILAR MENDEZ

E

Sntesis y caracterizacin de nanopartculas deplata: Efecto sobre

Colletotrichum gloesporioides

CENTRO DE INVESTIGACION EN CIENCIAAPLICADA Y TECNOLOGIA AVANZADA

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

AREA ALIMENTOS

MEXICO, D. F. JUNIO DE 2009


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AGRADECIMIENTOS

Expreso mis ms sinceros agradecimientos a todos aquellos que, de alguna u otra

manera, contribuyeron en la realizacin del presente trabajo:

Al Dr. Jos Antonio Irn Daz Gngora, por todo el apoyo brindado para con mipersona.

Al director de este trabajo, el Dr. Eduardo San Martn Martnez, por sus consejos yenseanzas, por su confianza y amistad.

A los Doctores: Patricia Rodrguez Fragoso, Jos Luis Fernndez Muoz, GeonelRodrguez Gattorno y Miguel Angel Aguilar Frutis, por sus valiosas aportaciones ysugerencias para el mejoramiento del presente trabajo.

Al Dr. Jos Guzmn, por sus consejos y apoyo en el Microscopio Electrnico deBarrido.

A la Dra. Ruth Pedroza Islas, por ser una gran persona, por sus consejos,enseanzas y amistad.

A la Maestra Mara Esther Snchez Espndola ya que gracias a su colaboracinse pudieron realizar los anlisis de Microscopa Electrnica de Transmisin.

Al personal del laboratorio de Pruebas Fsicas: Miguel Lpez, Juana Jaimes eIsabel Contreras, por su apoyo y amistad.

A la Doctora Cristina Garibay por su ser un ejemplo de fortaleza, sencillez,honestidad y sobretodo amistad.

Muy especialmente a mis compaeros del laboratorio: Lesli, Geo, Mara Eugenia,Elba, Mina, Horacio, Mati y Julia, por su compaa, apoyo y amistad.

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Al personal del PTA, en especial a Lety Cardona, por toda la ayuda y apoyobrindados durante mis estudios de doctorado.

Al personal de CICATA-IPN.

A todos muchas GRACIAS.

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DEDICATORIA

Con especial cario y gratitud a las personas que me dieron la

vida

Mis padres:

Cristina Mndez Hidalgo y Roberto Aguilar Beltrn

A Karina Salmern por su amor apoyo y compaa

A mis hermanos: Ricardo Oscar Velia Daniel y Roberto por ser

parte importante en mi vida

A mis sobrinos

A toda mi familia...

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A la memoria de mi gran amigo

ORLANDO BELTRAN

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CONTENIDO GENERAL

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CONTENIDO................................................................................................

INDICE DE FIGURAS..................................................................................

INDICE DE TABLAS..................................................................................

RESUMEN...................................................................................................

SUMMARY...................................................................................................

1. INTRODUCCION....................................................................................

2. ANTECEDENTES...................................................................................

2.1. NANOPARTICULAS METALICAS...................................................2.1.1. Mtodos para la obtencin de nanopartculas metlicas.......

2.1.1.1. Mtodos qumicos....................................................2.1.1.2. Mtodos fsicos............................................................2.1.1.3. Mtodos biolgicos......................................................

2.1.2. Tcnicas de caracterizacin de nanopartculas metlicas.....2.1.2.1. Espectroscopia UV-visible...........................................

2.1.2.2. Microscopa electrnica de transmisin.......................2.1.2.3. Espectroscopia Raman..........................2.1.2.4. Espectroscopia de infrarrojo de transformada de

Fourier.....................................................................2.1.3. Estabilidad de nanopartculas en sistemas coloidales2.1.4. Factores que afectan el tamao y la forma de

nanopartculas metlicas..

2.2. NANOPARTICULAS DE PLATA......................................................

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2.2.1. Plata: efecto biocida.............2.2.2. Toxicidad de la plata inica, compuestos de plata y

nanopartculas de plata2.3. NANOEMPAQUES ALIMENTICIOS.........................................2.4. PROBLEMTICA POSTCOSECHA EN FRUTOS TROPICALES...

2.4.1. Enfermedades postcosecha: antracnosis..

3. JUSTIFICACION....................................................................................

4. OBJETIVOS........................................................................................... 4.1. GENERAL........................................................................................4.2. ESPECIFICOS.................................................................................

5. MATERIALES Y METODOS.................................................................. 5.1. MATERIALES...................................................................................5.2. METODOS.......................................................................................

5.2.1. Elaboracin y caracterizacin de nanopartculas de plata.5.2.1.1. Sntesis de nanopartculas de plata..

5.2.1.2. Evaluacin de las propiedades pticas(Espectroscopia UV-vis)........................

5.2.1.3. Determinacin del tamao y morfologa......................5.2.1.4. Evaluacin mediante espectroscopia Raman..............5.2.1.5. Evaluacin mediante espectroscopia de infrarrojo.....

5.2.2. Diseo Experimental..................................5.2.3. Anlisis estadstico........................................

5.2.4. Evaluacin de la actividad antifngica de nanopartculas deplata.

5.2.4.1. Aislamiento deColletotrichum gloesporioides .............5.2.4.2. Evaluacin in vitro de la actividad antifngica.............5.2.4.3. Recoleccin de esporas de C. gloesporioides ..

5.2.5. Evaluacin in situ de la actividad antifngica....5.3. EVALUACION DE LA CALIDAD DE FRUTOS DE PAPAYA

5.3.1. Prdida de peso.....................................................................

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5.2.6. Firmeza de la pulpa..................................................5.2.7. Slidos solubles totales..

6. RESULTADOS Y DISCUSION..............................................................6.1. SINTESIS Y CARACTERIZACION DE NANOPARTICULAS DE

PLATA6.1.1. Formacin de nanopartculas de plata...................................6.1.2. Espectroscopia UV-visible......................................................6.1.3. Microscopa Electrnica de transmisin........6.1.4. Espectroscopia Raman.....6.1.5. Espectroscopia de infrarrojo (FTIR)....

6.2. EVALUACIN IN VITRO DE LA ACTIVIDAD ANTIFNGICA DENANOPARTCULAS DE PLATA

6.3. EVALUACIN IN SITU DE LA ACTIVIDAD ANTIFNGICA DENANOPARTCULAS DE PLATA

6.3.1. ndice de severidad e incidencia.6.4. EVALUACIN DE LA CALIDAD DE FRUTOS DE PAPAYA

6.4.1. Prdida de peso.....................................................................

6.4.2. Prdida de firmeza................................................................6.4.3. Slidos solubles totales (Brix)

7. CONCLUSIONES

8. SUGERENCIAS......................................................................................

9. BIBLIOGRAFIA.................................................................................

ANEXOS...................................................................................................

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INDICE DE FIGURAS

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Figura 1. Vibraciones de tensin: a) simtrica y b) asimtrica.

Figura 2. Vibraciones de flexin: a) balanceo en el plano, b) tijereteo enel plano, c) aleteo fuera del plano y d) torsin fuera del plano..

Figura 3. a) Antracnosis producida por Colletotrichum gloesporioides b)esporas de C. gloesporioides ..

Figura 4. Espectro tpico de absorcin UV-vis de un sistema coloidal denanopartculas de plata

Figura 5. Estabilidad de nanopartculas de plata

Figura 6. Superficies de respuesta para la caracterizacin por UV-vis: a)58C, b) 92C.

Figura 7. Imgenes de MET de nanopartculas de plata...

Figura 8. Patrn de difraccin de electrones de nanopartculas de plata...

Figura 9. Superficies de respuesta para la caracterizacin por MET: a)58C, b) 92C.

Figura 10. Espectros Raman: a) AgNO3, b) gelatina y c) nanopartculasde plata...

Figura 11. Espectros FTIR de los precursores empleados (AgNO3 ygelatina) y de las nanopartculas de plata.

Figura 12. Crecimiento de Colletotrichum gloesporioides bajo diferentes

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concentraciones de nanopartculas de plata

Figura 13. Efecto de la adicin de nanopartculas de plata en elcrecimiento miceliar deC. gloesporioides .

Figura 14. Frutos de papaya con sntomas de antracnosis..

Figura 15. Frutos de papaya con dao en el tejido superficial.

Figura 16. Prdida de peso de frutos de papaya en funcin del tiempo.

Figura 17. Firmeza de frutos de papaya al finalizar el tiempo deexperimentacin.

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INDICE DE TABLAS

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Tabla 1. Regiones del espectro infrarrojo.

Tabla 2. Variables independientes y sus niveles de variacin..

Tabla 3. Diseo experimental.

Tabla 4. Porcentajes de inhibicin de C. gloesporioides ...

Tabla 5. Efecto de las nanopartculas de plata en el ndice de incidenciay severidad.

Tabla 6. Contenido de SST en frutos de papaya

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RESUMEN

En la presente investigacin se sintetizaron nanopartculas de plata por reduccin

qumica y teniendo como variables de estudio las relaciones glucosa/Ag ygelatina/Ag, y la temperatura de sntesis. Los materiales obtenidos fueroncaracterizados mediante Espectroscopia UV-vis, Espectroscopia Raman (FT-Raman), Espectroscopia de infrarrojo (FTIR) y Microscopa Electrnica deTransmisin (MET). Adems la informacin obtenida por Espectroscopia UV-vis yMET fue analizada mediante la metodologa de superficie de respuesta (MSR),con la finalidad de observar la influencia de las variables de sntesis en el tamao

de partcula. La actividad antifngica de las nanopartculas de plata fue evaluadain vitro e in situ, empleando el fitopatgenoColletotrichum gloesporioides , el cuales el hongo causante de la antracnosis en frutos como papaya. La incidencia dela enfermedad fue evaluada como ndice de severidad e incidencia. La calidadpostcosecha de los frutos fue tambin determinada a travs de la prdida depeso, firmeza y slidos solubles totales (SST). Con los resultados de UV-vis sepudo confirmar la presencia de nanopartculas de plata al termino de la reaccin,y adems se pudo deducir que la morfologa de las nanopartculas de plata era deforma preferentemente esferoidal, y de tamao relativamente pequeo (


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tamao de partcula. En general los frutos de papaya recubiertos con pelcula degelatina-almidn presentaron menor prdida de peso, menor prdida de firmeza ymenor concentracin de SST (Brix), en comparacin con los no recubiertos(control). Sin embargo, la incorporacin de nanopartculas de plata alrecubrimiento, provoc la aparicin de bastas secciones oscuras sobre lasuperficie, afectando considerablemente la apariencia de los frutos de papaya.Con lo anterior se puede inferir que la nanopartcula de plata tambin reaccionacon las clulas vegetales del tejido produciendo una alteracin en el procesofisiolgico de transformacin de la clorofila en otros compuestos y formando unparnquima rgido

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SUMMARY

In the present work silver nanoparticles were synthesized by a chemical reduction

method having as synthesis variables: glucose/Ag, gelatin/Ag and temperature ofsynthesis. The nanoparticles were characterized by means of UV-visSpectroscopy, Raman Spectroscopy (FT-Raman), infrared Spectroscopy (FTIR)and Transmission Electron Microscopy (TEM). The data obtained by UV-visSpectroscopy and MET were also analyzed using the Response SurfaceMethodology (RSM) in order to observe the influence of the synthesis variables inthe size of the nanoparticles. The antifungal activity of silver nanoparticles was

evaluated in vitro and in situ, using the phitopathogen Colletotrichumgloesporioides, which was previously isolated from papaya fruit with anthracnosesymptoms. The incidence of the disease was evaluated as severity index andincidence. The postharvest quality of papaya fruits was also determined throughweight loss, firmness and total soluble solids (TSS). The results of UV-visconfirmed the presence of silver nanoparticles at the end of the reaction time. TheUV-vis spectra also indicated the formation of silver nanoparticles preferablyspherical and of relatively small size (


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presented dark sections onto the surface, affecting significantly the appearance ofthe papaya fruits.

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1. INTRODUCCION

La nanotecnologa involucra el diseo, produccin y aplicacin de estructuras,

dispositivos y sistemas mediante el control de la forma y tamao a nivelnanomtrico (IFST, 2006). En tiempos recientes esta tecnologa haexperimentado gran importancia debido principalmente a sus aplicacionespotenciales en muchas reas de la ciencia. La palabra nano es un trminogriego que se refiere a algo extremadamente pequeo, y en la actualidad estetrmino es usado para indicar una billonsima parte de un metro (10 -9). Para quealgo sea considerado como nanopartcula, los clusters de tomos que lo forman

tienen que tener un tamao de 1-100nm (Rai, et al., 2008).

Los nanomateriales pueden ser producidos de diferentes materiales y de formasdiversas (esferas, tubos, alambres, entre otras). A su vez, pueden ser clasificadosen base al tipo de material en: metlicos, semiconductores y polimricos (Liu,2006). Los metales a nivel nanomtrico poseen propiedades pticas, electrnicas,catalticas, magnticas, etc. que difieren significativamente de aquellas presentesa mayor escala (Luo et al., 2005; Sun y Luo, 2005; Wang et al., 2005). Dichaspropiedades estn fuertemente relacionadas con el tamao, forma, composicin,cristalinidad y estructura de la partcula (Panigrahi, et al., 2006; Ullah, et al., 2006;Pal et al., 2007). Las nanopartculas metlicas pueden ser sintetizadas medianteuna gran variedad de mtodos, sin embargo la reduccin qumica ha sido y esuno de los mtodos ms ampliamente utilizados.

Debido a su gran rea superficial, varios metales a escala nanomtrica presentantambin propiedades biocidas (Rai et al., 2008), las cuales han impulsado elestudio de nanopartculas metlicas con la finalidad de utilizarlas como nuevosagentes antimicrobianos (Sondi y Salopek-Sondi, 2004). Entre los agentesantimicrobianos inorgnicos, la plata ha sido ampliamente utilizada desde tiemposremotos para combatir infecciones y controlar la contaminacin microbiana (Pal etal. 2007). La plata en su estado metlico es inerte, pero sta reacciona con elagua provocando su ionizacin de manera inmediata. En este estado la plata es

altamente reactiva, y su efecto bactericida se debe principalmente a los cambios

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estructurales que provoca en la membrana bacteriana y a su interaccin con losgrupos fosforilados y azufrados de varios compuestos (Rai et al., 2008). Aunqueel mecanismo de accin de la plata en forma nanomtrica no es bien conocido, seplantea que este puede ser similar al de la plata inica.

Uno de los mayores logros de la nanotecnologa ha sido la produccin yaplicacin de de nanopartculas para el rea biolgica (Liu, 2006). En el sectoralimentario, las aplicaciones de esta tecnologa estn enfocadas a reas como elprocesamiento de los alimentos, materiales de empaque y, seguridad y monitoreo(Chau et al., 2007; Sozer y Kokini, 2009). De acuerdo con la Comisin Europea deNanotecnologa (2006), en un futuro no lejano, la nanotecnologa transformar porcompleto la industria alimentaria, cambiando los procesos de produccin,procesamiento, empaque, transporte y consumo de los alimentos. Actualmente yase emplea el trmino nanofood, el cual hace referencia a todo productoalimenticio en donde la nanotecnologa ha intervenido en cualquiera de las etapasde su produccin, procesamiento, transporte y almacenamiento (Chau et al.,2007).

El desarrollo de empaques antimicrobianos es de gran importancia debido alpotencial para proveer calidad y seguridad alimentaria. El objetivo de laincorporacin de antimicrobianos en los materiales de empaque es evitar elcrecimiento de microorganismos en la superficie de los alimentos y por lo tantomantener la calidad de los productos alimenticios por mucho ms tiempo. Loanterior puede reducir en gran medida la adicin de grandes cantidades dequmicos en el propio alimento (Sorrentino et al., 2007). Actualmente existe poca

informacin sobre la incorporacin de nanopartculas metlicas en pelculas orecubrimientos alimentarios y sus efectos en la vida de anaquel.

La mayora de los frutos tropicales importantes son del tipo de los climatricos, loscuales maduran rpidamente durante el transporte y almacenamiento, y su tasade respiracin alcanza un nivel mximo al comienzo de la fase respiratoriaclimatrica (Maftoonazad y Ramaswamy, 2005). De acuerdo con la FAO (2005),

las prdidas postcosecha en frutos tropicales del mundo varan entre 10 y 80%,dependiendo del tipo de cultivo y regin. Una de las principales causas de dichas

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prdidas es la invasin de elementos patgenos. El fitopatgeno Colletotrichumgloesporioides es un organismo econmicamente importante, ya que es elcausante de la enfermedad antracnosis (Zavala-Len et al., 2005). En frutos comopapaya y mango esta enfermedad provoca prdidas postcosecha considerables(Gamagae et al., 2003: Kefialew y Ayalew, 2008).

En la presente investigacin se sintetizaron nanopartculas de plata mediante unmtodo de reduccin qumica. Su caracterizacin se realiz mediante distintastcnicas espectroscpicas y por MET. Se utiliz tambin la MSR para observar lainfluencia de las variables de sntesis en el tamao de las partculas. Finalmentese evalu, in vitro e in situ, la actividad antifngica de las nanopartculas de platasobre el fitopatgeno Colletotrichum gloesporioides .

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2. ANTECEDENTES

2.1. NANOPARTICULAS METALICAS

Debido a que poseen propiedades pticas, catalticas y electromagnticas nicas,las nanopartculas metlicas han sido ampliamente estudiadas (Luo et al., 2005).Esas propiedades son producto en gran medida, de la gran rea superficial queposeen. Metales como el oro, plata, paladio y cobre han sido empleados parafabricar nanopartculas de diversas formas y tamaos (Srkny et al., 2005; Pal etal., 2007; Narayanan y Sakthivel, 2008). El procedimiento y las condiciones de

sntesis de los nanomateriales influyen directamente en su forma y tamao. Acontinuacin se describen algunos mtodos de sntesis y algunas de lasprincipales tcnicas de caracterizacin de nanopartculas metlicas.

2.1.1. Mtodos para la obtencin de nanopartculas metlicas

Una gran variedad de mtodos han sido desarrollados para sintetizarnanopartculas metlicas de distintas morfologas: nanotubos, nanodiscos,nanofibras y otras (Yan et al, 2003). De manera general, estos procedimientos sepueden clasificar en tres grupos: mtodos qumicos, mtodos fsicos y mtodosbiolgicos.

2.1.1.1. Mtodos qumicosLos mtodos qumicos son probablemente los mtodos de sntesis denanopartculas ms utilizados debido a su potencial para ser escalados (Poole yOwens, 2003). La reduccin qumica de sales metlicas en solucin, destacacomo el mtodo qumico ms empleado. De acuerdo con Slistan-Grijalva et al(2008), la reduccin qumica permite controlar adecuadamente el tamao, ladistribucin de tamao y la forma de las nanopartculas.

En sistemas acuosos, el agente reductor es adicionado o generado in situ,

mientras que en sistemas no-acuosos, el solvente puede actuar tambin como

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agente reductor (Bradley y Schmid, 2004). Entre los agentes reductores msutilizados se encuentran el borohidruro de sodio, hidrazina y dimetilformamida, sinembargo, en los ltimos aos se han empleado sustancias no-txicas eigualmente efectivas, tales como el citrato de sodio y la glucosa (Raveendran etal., 2006; Pal et al., 2007). En sistemas no acuosos, alcoholes como elpolietilenglicol, glicerol y etilenglicol han sido utilizados en la fabricacin denanopartculas coloidales (Luo et al., 2005). La ventaja de estos sistemas es queno se requiere la adicin se agentes reductores, an sintetizando a temperaturaambiente (Slistan-Grijalva et al., 2008).

Otros mtodos qumicos que han aparecido recientemente son la reduccinradioltica y fotoqumica. La radilisis involucra la exposicin de muestras acuosasa rayos gamma de alta energa, lo que resulta en la formacin de electronessolvatados, radicales OH y tomos de H. Los radicales OH (altamente oxidantes)pueden ser convertidos en radicales reductores mediante la adicin de 2-propanola la solucin (Srkny et al., 2005). Una de las ventajas de la sntesis denanopartculas coloidales por mtodos radiolticos es la produccin homognea einstantnea de un gran nmero de ncleos metlicos, lo que favorece la

formacin de partculas altamente dispersas (Bradley y Schmid, 2004).

La reduccin fotoqumica o fotlisis es tambin una tcnica relativamente simple,efectiva y limpia para la generacin de partculas metlicas coloidales (Bradley ySchmid, 2004; Ozkaraoglu et al., 2009). En soluciones acuosas, el empleo deradiacin UV induce la fotooxidacin del agua por la excitacin de los ionesmetlicos presentes, resultando en la formacin de tomos metlicos y finalmente

en la generacin de nanopartculas coloidales. Kki et al. (2000) obtuvieronnanopartculas de plata de tamao pequeo (7nm) empleando la reduccinfotoqumica. Por su parte Bakar et al. (2007), observaron una disminucin deltamao promedio de nanopartculas de plata al incrementar el tiempo deexposicin a la radiacin UV.

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2.1.1.2. Mtodos fsicosEntre los mtodos fsicos se encuentran los mtodos electroqumicos, ablacinlser, termlisis, irradiacin con microondas y la sntesis sonoqumica (Starowiczet al., 2006).

La sntesis de nanopartculas metlicas mediante termlisis involucra ladescomposicin de slidos a altas temperaturas, teniendo como resultadocationes metlicos y aniones moleculares o compuestos orgnicos metlicos.Mediante este proceso es posible obtener partculas menores a 5nm (Poole yOwens, 2003). De acuerdo con Kashiwagi et al. (2006), la termlisis presentaventajas sobre otros mtodos, ya que es una tcnica que se puede adaptar a granescala y a un bajo costo.

Un mtodo fsico novedoso que permite seleccionar y controlar el tamao denanopartculas en sistemas coloidales es la ablacin lser (Tsuji, et al., 2003). Lasntesis mediante este sistema ocurre cuando un lser de alta potencia es dirigidoa un blanco slido (en forma de disco), que se encuentra sumergido en un lquido junto con los precursores. La incidencia del lser provoca que el blanco se

caliente en el punto focal y ste a su vez promueve la reaccin entre losprecursores, generando diminutas partculas. El tamao de las nanopartculas escontrolado por la energa del lser y la velocidad de rotacin del disco. Medianteesta tcnica se pueden producir de 2-3 g/min de nanopartculas de plata (Poole yOwens, 2003; Phuoc, et al., 2008).

El mtodo sonoqumico ha sido propuesto como una va til para la preparacin

de materiales a escala nanomtrica. El efecto qumico de la radiacin ultrasnicarecae sobre el fenmeno de la cavitacin, el cual crea puntos calientes en elmicro ambiente, elevando la temperatura y presin de una manera importante(5000K y 1800atm, respectivamente). Estas condiciones extremas pueden seraprovechadas para la fabricacin de materiales con estructuras y propiedadesdiferentes (Zhu et al., 2008).

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En la sntesis electroqumica una hoja metlica es disuelta andicamente en unsolvente aprtico. De acuerdo con Rodrguez-Snchez et al. (2000), esteprocedimiento permite obtener nanopartculas de alta pureza menores a 10nm,as como controlar su tamao mediante el ajuste de la densidad de corriente.

La tcnica de microondas resulta ser tambin un procedimiento ventajoso yatractivo para la preparacin de nanopartculas, ya que el calentamientohomogneo favorece la nucleacin de las partculas metlicas y por lo tantoreduce en gran medida el tiempo de reaccin. La irradiacin con microondasconlleva a obtener nanoestructuras estables, de tamao pequeo y distribucinuniforme (Chen et al., 2008; Hu et al., 2009; Wu et al., 2009).

2.1.1.3. Mtodos biolgicosLa sntesis biolgica ha surgido como una nueva opcin para la obtencin demateriales a escala nanomtrica, debido principalmente a la creciente necesidadpor utilizar mtodos de sntesis ms amigables con el medio ambiente. Labiosntesis involucra el empleo de microorganismos (bacterias, levaduras y

hongos) o extractos de plantas para lograr la reduccin de varios tipos de ionesmetlicos (Sastry et al., 2003).

Los organismos vivos pueden producir nanopartculas ya sea intra- oextracelularmente, siendo sta ltima la tcnica ms utilizada por losinvestigadores debido a que es ms adaptable y menos costosa (Basavaraja etal., 2008). Vigneshwaran et al. (2007) sintetizaron nanopartculas de plata de

alrededor de 10nm, empleando el hongo Aspergillus flavus . Por su parte He et al.(2007), utilizaron la bacteria Rhodopseudomonas capsulata para producirnanopartculas de oro de diferentes formas y tamaos. Los tiempos de reaccinempleando microorganismos son bastante largos, pudiendo variar desde 24 hasta120 horas (Saifuddin et al., 2009).

En comparacin con los microorganismos, el empleo de extractos de plantas

como agentes reductores puede ser una va ms rpida para la preparacin denanopartculas. De acuerdo con Narayanan y Sakthivel (2008), es posible obtener

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nanopartculas de oro en un tiempo de 12h, empleando extractos de hojas decilantro.

A pesar de ser una tcnica totalmente ecolgica, la sntesis biolgica presentatodava desventajas importantes tales como largos tiempos de reaccin y bajasescalas de produccin (Saifuddin et al., 2009).

2.1.2. Tcnicas de caracterizacin de nanopartculas metlicas

2.1.2.1. Espectroscopa UV-VisLa absorcin de radiacin UV-visible provoca una excitacin de los electrones deorbitales de ms baja energa a orbitales de ms alta energa en una molcula. Lamxima absorcin UV-visible ocurre en una longitud de onda caracterstica de laestructura de la molcula (Moore, 2000).

La espectroscopa UV-vis es una tcnica ampliamente utilizada en el rea de losnanomateriales, ya que permite saber si el proceso de sntesis ha concluido con la

formacin de nanopartculas. Por ejemplo, la aparicin de un pico de absorcinalrededor de los 400nm es un indicativo de la presencia de nanopartculas deplata (Kapoor, 1998).

Los materiales a nivel nanomtrico presentan propiedades pticas que difierengrandemente de sus contrapartes en bulto (Zhao et al., 2006). Los espectros deabsorcin ptica de nanopartculas metlicas son dominados por resonancias de

plasmn superficial (Pal et al., 2007). La posicin y la forma del pico de absorcindependen principalmente de factores como el tamao, la forma y lapolidispersidad de las partculas, el medio circundante y las sustancias adsorbidasen sus superficies (Mitra y Bhaumik, 2007; Slistan-Grijalva et al., 2008).

El pico de absorcin tiende a ubicarse hacia longitudes de onda mayores, amedida que el tamao de la partcula aumenta. Por ejemplo, la emisin de un pico

a 400nm corresponde a nanopartculas de plata de menos de 5nm de dimetro,mientras que si el pico de absorcin se desplaza a 420nm, el tamao de

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predominante de las partculas es de alrededor de 20nm (An et al., 2008). Adems la agregacin de las nanopartculas provoca una disminucin en laintensidad del pico, y la aparicin de hombros en longitudes de onda mayores(Kapoor, 1998). Por otra parte, el nmero de picos de resonancia disminuye conel incremento de la simetra de la partcula (Elechiguerra et al., 2005). De acuerdocon la teora de Mie, solo una banda simple de resonancia de plasmn superficialse presenta en espectros de absorcin de nanopartculas esfricas, mientras queen partculas anisotrpicas se pueden presentar dos o ms bandas, dependiendode la forma de las partculas (Pal et al., 2007).

2.1.2.2. Microscopa Electrnica de Transmisin (MET)Es la tcnica ms importante para caracterizar nanopartculas metlicas, ya quepermite determinar el tamao, forma, estructura interna y, a travs de difraccinde electrones, las especies qumicas de las nanopartculas (Baker et al., 2004).En un MET, un haz de electrones es dirigido hacia la superficie de una muestra.Los electrones penetran la muestra, son dispersados a medida que la atraviesan,son enfocados por la lente objetivo, son amplificados por la lente magnificadora y

finalmente la imagen deseada es producida (Poole y Owens, 2003). Dos tipos deimagen pueden ser obtenidas: campo oscuro y campo claro. Las imgenes encampo claro son producidas por los electrones que se propagan a travs de lamuestra. Por otro lado en el campo oscuro la imagen es producto de loselectrones difractados (Baker et al., 2004). En equipos de alta resolucin sepueden obtener resoluciones de 0.1nm o menos. La imagen es formada de loselectrones que se transmiten a travs del material analizado. Los patrones de

difraccin de electrones permiten determinar las constantes de redes de laspartculas lo que ayuda a la identificacin de la especie. La preparacin de lasmuestras para su observacin en TEM, consiste en realizar una dispersin de lasnanopartculas en un solvente y dejarlas secar sobre una rejilla de cobre conrecubrimiento de carbono.

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2.1.2.3. Espectroscopia RamanLa dispersin Raman involucra la excitacin de una molcula con un fotn de luzel cual es posteriormente dispersado con un cambio en su energa, el cual sedebe a que la longitud de onda de una pequea fraccin de la radiacindispersada por ciertas molculas, difiere de la del haz incidente y adems, que losdesplazamientos de longitud de onda dependen de la estructura qumica de lasmolculas responsables de la dispersin. Este fenmeno esta relacionado con elmismo tipo de cambios vibracionales cunticos que se producen en la absorcininfrarroja (Skoog y Leary, 1994).

Aunque los mecanismos bsicos dependen de los mismos modos vibracionales,corresponden a procesos muy diferentes. La absorcin infrarroja requiere que unmodo de vibracin de la molcula experimente un cambio en el dipolo o ladistribucin de carga asociados y, solamente entonces, la radiacin de la mismafrecuencia puede interaccionar con la molcula y promoverla a un estadovibracional excitado. Por lo contrario la dispersin implica una distorsinmomentnea de los electrones distribuidos alrededor de un enlace de la molcula,seguida por la reemisin de la radiacin cuando el enlace vuelve a su estado

electrnico fundamental

Una ventaja importante de la espectroscopa Raman, con respecto a la deinfrarrojo, es el hecho de que el agua no interfiere y por lo tanto es posible obtenerespectros Raman de disoluciones acuosas (Skoog y Leary, 1994). Otro puntoimportante es que las muestras no necesitan ser pticamente claras, y por lo tantoes posible obtener espectros Raman de muestras opacas (Ma y Phillips, 2002)

La intensidad de un pico Raman depende de la polarizabilidad de la molcula, dela intensidad de la fuente y de la concentracin de grupos activos. Los grupos nopolares como C=C, C-C y S-S aparecen con mayor intensidad en los espectrosRaman (Ma y Phillips, 2002).

Una de las mayores limitaciones de la espectroscopa Raman convencional es la

seal de fondo que proviene de la fluorescencia de la muestra o de las impurezasque contiene. La espectroscopia Raman de transformada de Fourier elimina la

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fluorescencia de fondo y hace posible el uso de la fuente lser de Nd:YAG queemite radiacin slo en el infrarrojo cercano a 1064nm. Esta radiacin no essuficientemente energtica como para producir la excitacin electrnica de lasmolculas y de este modo se impide la fluorescencia.

2.1.2.4. Espectroscopa de Infrarrojo de transformada de Fourier(FTIR)

La regin del infrarrojo del espectro abarca la radiacin con nmeros de ondacomprendidos entre 12800 y 10 cm-1, que corresponden a longitudes de onda de0.78 a 1000m. Tanto desde el punto de vista de las aplicaciones como de lainstrumentacin, es conveniente dividir el espectro infrarrojo en tres regionesdenominadas infrarrojo cercano, medio y lejano (Skoog y Leary, 1994). La tabla 1muestra los lmites aproximados de cada una de ellas.

Tabla 1. Regiones del espectro infrarrojo Regin Intervalo de longitud

de onda (m)Intervalo de nmero

de onda (cm -1)

Cercano 0.78 a 2.5 12800 a 4000Medio 2.5 a 50 4000 a 200Lejano 50 a 1000 200 a 10La mas utilizada 2.5 a 15 4000 a 670

La FTIR utiliza la interaccin de la radiacin infrarroja con la materia para obtener

informacin sobre la estructura molecular. Tanto la espectroscopa de infrarrojocomo espectroscopa Raman estn basadas en las transiciones vibracionalesdiscretas que tienen lugar en el estado electrnico de las molculas. Lasposiciones relativas de los tomos en una molcula no son exactamente fijas, sinoque fluctan continuamente como consecuencia de una multitud de tipos devibraciones y rotaciones diferentes alrededor de los enlaces en la molcula.Pueden distinguirse dos categoras bsicas de vibraciones: de tensin (figura 1) yde flexin (figura 2).

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a) b)

Figura 1. Vibraciones de tensin: a) simtrica y b) asimtrica

El principal uso de la FTIR en la caracterizacin de nanopartculas metlicas espara detectar especies qumicas enlazadas a la superficie y para monitorearreacciones tambin en la superficie (Baker et al., 2004). Esta tcnica esesencialmente sensible a la presencia de grupos polares tales como O-H, C=O,C-O y N-H (Ma y Phillips, 2002). Mediante FTIR, Slistan-Grijalva et al. (2008)determinaron que la interaccin entre nanopartculas de plata y polivinilpirrolidona

(PVP) se lleva a cabo a travs del oxgeno del grupo carbonilo del PVP. Por suparte Bakar et al. (2007), emplearon la tcnica de FTIR para estudiar reaccionesde oxidacin sobre la superficie de nanopartculas de plata.

Figura 2. Vibraciones de flexin: a) balanceo en el plano, b) tijereteoen el plano, c) aleteo fuera del plano y d) torsin fuera del plano

+ + -+

-

a) b) c) d)

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2.1.3. Estabilidad de nanopartculas en sistemas coloidales

En solucin coloidal, las partculas metlicas tienden a aglomerarse debido a lasfuerzas de van der Waals y a la ausencia de fuerzas repulsivas (Bradley andSchmid, 2004). En nanopartculas de plata, la oxidacin de sus superficiesprovoca tambin inestabilidad, lo que conlleva a la agregacin (Panigrahi et al.,2006). Una de las estrategias es proteger las partculas coloidales con un agentepasivante, el cual puede asociarse con la superficie de las partculas paramantenerlas suspendidas, y por lo tanto prevenir su agregacin (Sun y Luo,2005). Adems de funcionar como estabilizantes, los agentes protectores tambininfluyen en la solubilidad, reactividad, el tamao y la forma de las nanopartculas(Sarkar et al., 2005; Balan et al., 2007).

Entre los agentes protectores usados para estabilizar sistemas coloidales seencuentran los polielectrolitos (Sun y Luo, 2005). Estos compuestos sonmolculas que presentan varias cargas elctricas descompensadas, es decir,presentan simultneamente ambos signos de carga: positivo y negativo. Estascargas se encuentran fijas en distintas posiciones moleculares, por lo que nopueden anularse mutuamente. Normalmente se trata de grandes molculasorgnicas, de tipo polimrico como las protenas. Partculas coloidales puedenser estabilizadas electrostticamente y estricamente (Petica et al., 2008).

Entre las sustancias utilizadas para pasivar la superficie de nanopartculas seencuentran la polivinilpirrolidona (PVP), el quitosano, almidn, celulosa y gelatina(Bakar et al., 2007; An et al., 2008; Slistan-Grijalva et al., 2008). De acuerdo con

Wang et al. (2005), la utilizacin de PVP mejora en gran medida la dispersabilidadde nanopartculas de plata. Sin embargo Petica et al. (2008), reportan queconcentraciones de ms de 6g/L de PVP promueven la aglomeracin de laspartculas debido a un incremento en la viscosidad del sistema.

La gelatina puede ser otra opcin efectiva y viable para estabilizar sistemascoloidales de nanopartculas. De acuerdo con Kapoor (1998), es posible obtener

nanopartculas de plata de forma esferoidal y de tamao relativamente pequeo

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(6-20nm), empleando gelatina como agente protector. Por su parte Wang et al.(2006), reportaron que la gelatina puede actuar como un excelente estabilizanteen la fabricacin de nanopartculas de titanio. Raevskaya et al. (2008),sintetizaron nanopartculas de selenio de 10-100nm embebidas en una matrizproteica (gelatina), observando adems, una mejora en las propiedades defotoluminiscencia de las nanopartculas, con la incorporacin de dicha protena.

Otro factor importante que influye en la estabilidad de materialesnanoestructurados, es el tipo de solvente empleado durante la sntesis. Deacuerdo con Ullah et al. (2006), la estabilidad de nanopartculas de platasintetizadas en glicerol, es mucho mayor que en etilenglicol o en agua, debido asu mayor viscosidad.

2.1.4. Factores que afectan el tamao y la forma de nanopartculasmetlicas

El tamao, la distribucin de tamao y la forma de nanopartculas metlicas

dependen de algunos parmetros importantes, tales como el mtodo de sntesis,agente protector, tipo de solvente, concentracin del precursor, pH y latemperatura de sntesis (Cho y So, 2006; Slistan-Grijalva et al., 2008).

Se ha reportado que a medida que aumenta su concentracin, el dimetropromedio de nanopartculas de plata, y la distribucin de tamaos se incrementade igual manera (Akamatsu et al., 2000; Bakar et al., 2007; Chen et al., 2008).

De acuerdo con Srkny et al. (2005), el tamao de nanopartculas de Pd fuemenor al emplear 2-propanol como solvente, en comparacin con etanol ymetanol

Shervani et al. (2007) reportaron que agentes reductores fuertes como el NaOHgeneran partculas con un mayor tamao en comparacin con agentes reductores

suaves o moderados. Estos autores obtuvieron nanopartculas de plata con

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dimetros promedio de 43 y 15nm, empleando NaOH y D-glucosarespectivamente.

De acuerdo con Sun y Luo 2005, al aumentar la relacin molar pasivante/plata sepuede conseguir una disminucin del tamao de partcula. Sin embargo Wang etal. (2005) no observaron cambios significativos en el tamao de nanopartculas deplata al incrementar la concentracin del pasivante. Por su parte, Petica et al.(2008) sealan que al aumentar la concentracin del polmero ms all del valorptimo, conlleva a un incremento de la viscosidad de la solucin, obstaculizandola difusin y disminuyendo las repulsiones electrostticas, por lo tantopromoviendo la aglomeracin de las partculas.

La velocidad a la que se mezclan los reactivos tambin puede ser un factor quedetermina el tamao de las partculas. Wang et al. (2005) observaron que almezclar los reactivos a razn de 1 gota/seg se generaron nanopartculas de platabien dispersas y de un tamao de 20-80nm. Por lo contrario empleandovelocidades de mezclado mayores o menores a 1 gota/seg, ellos obtuvieronpartculas de un mayor tamao.

El pH de la reaccin es un factor importante en el ensamblaje de nanopartculasde plata (Panigrahi et al., 2006).

De acuerdo con Luo et al. (2005), la temperatura de sntesis juega un papelpreponderante en la dimensin y morfologa de las partculas. Estos autoresreportaron que el dimetro promedio de nanopartculas de plata se increment de

10 a 20nm cuando la temperatura de sntesis aument de 80 a 100C. De igualmanera, la forma de las nanopartculas cambi de esfrica a nanoprismapoligonal al incrementar la temperatura de sntesis a 120C

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2.2. NANOPARTICULAS DE PLATA

De entre los metales nobles, la plata ha sobresalido por sus propiedades nicas. Adems de presentar propiedades pticas, magnticas, elctricas y catalticasinteresantes, las nanopartculas de plata poseen tambin propiedades biocidas oantimicrobianas (Sondi y Salopek-Sondi, 2004). stas ltimas han encontradoaplicaciones diversas en reas como la farmacologa, medicina, industriaalimentaria, purificacin de agua, etc. (Petica et al., 2008).

2.2.1. Plata: efecto biocida

Entre los agentes antimicrobianos inorgnicos, la plata ha sido ampliamenteusada desde tiempos remotos para combatir infecciones y controlar lacontaminacin microbiana (Pal et al. 2007). El efecto bactericida de los iones deplata en los microorganismos es bien conocido; sin embargo el mecanismo no esan muy claro. Algunas propuestas han sido desarrolladas para explicar losefectos inhibitorios de iones plata y plata metlica en microorganismos (Cho et al.,

2005). Se plantea que los iones plata interaccionan fuertemente con los grupostiol de enzimas vitales, provocando su inactivacin (Feng et al., 2000). Es posibletambin que el ADN de bacterias tratadas con nanopartculas pierda su capacidadde replica, esto por la afinidad de la plata a interaccionar con grupos fosforilados yazufrados (Pal et al., 2007). En otros estudios se ha reportado que los iones plataprovocan cambios estructurales irreversibles en la membrana celular de lasbacterias, afectando drsticamente sus funciones propias como permeabilidad y

respiracin (Cho et al., 2005; Morones et al. 2005).

Aunque se ha planteado que las nanopartculas de plata pueden actuar de unamanera similar a la plata inica, hay indicios de que el efecto biocida queproducen cada uno de ellos es distinto. De acuerdo con Morones et al. (2005), losiones plata producen una regin de bajo peso molecular en el centro de labacteria. Este efecto se debe a que el microorganismo agrupa y protege su ADN

como mecanismo de defensa contra compuestos txicos. Por otro lado, al utilizarnanopartculas de plata, no se observa dicha regin en las clulas bacterianas. De

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Es indudable que el inters por seguir adquiriendo conocimiento acerca de laspropiedades biocidas de los nanomateriales metlicos, se justifica por la aparicinde nuevas y ms agresivas enfermedades, as como por la resistencia a losantibiticos que presentan muchos microorganismos patgenos.

2.2.2. Toxicidad de la plata inica, compuestos de plata ynanopartculas de plata

La plata en su estado metlico es inerte pero sta reacciona con el aguaprovocando su ionizacin de manera inmediata. En forma inica la plata esaltamente reactiva (Rai et al., 2008).

El nitrato de plata (AgNO3) al 0.5% es la solucin a base de plata ms usada paratratar tpicamente heridas por quemaduras, sin embargo en concentraciones porarriba del 1%, esta se vuelve txica para los tejidos. Pruebas in vitro con AgNO3 han demostrado la presencia de daos en fibroblastos, hepatocitos y linfocitos(Atiyeh et al., 2007).

Otra sustancia a base de plata que tambin es utilizada en tratamientos tpicos esla sulfadiazina de plata (AgSD). Una de las ventajas de sta sustancia es que slose aplica en forma de crema dos veces al da, mientras que empleando AgNO 3 son necesarias ms de 12 aplicaciones diarias. Sin embargo algunos estudioshan demostrado que la AgSD tambin es citotxica. Se ha observado quetratamientos prolongados con AgSD pueden provocar argiria y leucopenia. La

argiria es un desorden permanente causado por una deposicin de plata en losmicro-vasos sanguneos de la piel. Por su parte la leucopenia es definida comouna disminucin en los niveles normales de leucocitos en el organismo.

Aunque existe muy poca informacin sobre la toxicidad de las nanopartculas engeneral, su tamao pequeo y propiedades especficas hacen que puedanrepresentar un riesgo serio para organismos mayores. Chau et al. (2007), sealan

que nanomateriales de 50 y 70nm pueden penetrar en las clulas y pulmones

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respectivamente, mientras que aquellas de 30nm pueden incluso llegar a lasangre y cerebro.

En lo que respecta a la plata, se ha reportado que el uso de agentesantimicrobianos a base de nano-plata, puede generar efectos citotxicos enfibroblastos de ratas (Ziegler et al., 2006). Por su parte Hussain et al. (2005)reportaron que despus de la exposicin por 24 h a nanopartculas de plata, lafuncin mitocondrial de clulas de hgado de rata, disminuy significativamenteempleando concentraciones de 5-50g/mL. De igual manera observaron unagotamiento en los niveles de glutatin, una disminucin en el potencial de lamembrana mitocondrial y un incremento en los niveles de especies reactivas deloxgeno. Morfolgicamente las clulas presentaron tamaos anormales,encogimiento y formas irregulares.

Se ha observado que la toxicidad de los nanomateriales depende tambin defactores como el tamao y la forma, concentracin, composicin qumica,propiedades superficiales y hasta en la manera en cmo se agregan (Ziegler etal., 2006; Chau et al., 2007; Choi et al., 2008). Hussain et al. (2005) observaron

que al aplicar nanopartculas de plata con un tamao promedio de 15 y 100nm, enclulas de hgado de rata, el efecto txico fue mayor al utilizar las de mayortamao.

A pesar de las controversias por los posibles daos que se puedan presentar porel uso de la plata en cualquiera de sus formas, este material se sigue utilizandoampliamente en la vida cotidiana del ser humano. Por tal motivo es necesario

continuar con la investigacin con la finalidad de discernir sobre los posiblesefectos negativos al ser humano y al medio ambiente (Hussain et al., 2005).

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2.3. NANO-EMPAQUES ALIMENTICIOS

El uso de cubiertas protectoras y empaques en la industria alimentaria es unasunto de gran importancia debido a su capacidad de incrementar la vida deanaquel de muchos productos alimenticios. Hoy en da, la gran mayora de losmateriales empleados para fabricar empaques son derivados del petrleo y por lotanto son prcticamente no-degradables. Esto representa serios problemas decontaminacin ambiental a nivel global. Con la finalidad de extender la vida deanaquel de los alimentos y al mismo tiempo reducir el uso de materiales plsticossintticos, la investigacin en el rea de materiales biodegradables se ha vistofavorecida. El objetivo es que estos materiales acten de la misma manera quelos empaques convencionales, proveyendo proteccin y manteniendo lascualidades propias del alimento. Desafortunadamente el uso de materialesbiodegradables en el rea alimentaria se ha visto muy limitado ya que suspropiedades son todava pobres si se comparan con aquellas de los plsticossintticos. La intervencin de la nanotecnologa en el rea de los materialesbiodegradables puede ser la solucin para mejorar no slo sus propiedades, sinotambin la relacin costo/eficiencia. El uso de aditivos, ya sea orgnicos o

inorgnicos, a escala nanomtrica conlleva al desarrollo de polmeros nano-compuestos. La razn de incorporar nanopartculas inorgnicas es mejorar laspropiedades fisicoqumicas del material, sin embrago los alcances estn enfuncin del tamao, morfologa y propiedades propias de los nanomateriales(Sorrentino et al., 2007).

El desarrollo de empaques antimicrobianos es de gran importancia debido al

potencial para proveer calidad y seguridad. El objetivo de la incorporacin deantimicrobianos en los materiales de empaque es evitar el crecimiento demicroorganismos en la superficie de los alimentos y por lo tanto mantener lacalidad de los productos alimenticios por mucho ms tiempo. Lo anterior puedereducir en gran medida la adicin de grandes cantidades de qumicos en el propioalimento (Sorrentino et al., 2007).

En la actualidad existe poca informacin reportada sobre la incorporacin denanopartculas metlicas en empaques alimenticios y su efecto en la vida de

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anaquel de los productos. A continuacin se citan algunos trabajos que han sidodesarrollados y reportados:

An et al. (2008) evaluaron el efecto de la aplicacin de recubrimientos connanopartculas de plata, en la vida postcosecha de esprragos. De acuerdo conlos resultados obtenidos, el uso de dicha pelcula redujo la prdida de peso ymantuvo la firmeza; redujo la prdida de cido ascrbico y clorofila; retard loscambios relacionados con el color de la piel y se logr inhibir el crecimiento demicroorganismos en la superpie del alimento. La vida postcosecha de losvegetales aument 10 das ms a temperatura de 2C.

Por su parte Li et al. (2008), emplearon un material de empaque conincorporaciones de nanopartculas de plata, dixido de titanio y kaolin, para lapreservacin de dtiles chinos. Adems de presentar mejores propiedades debarrera y mecnicas, los materiales de empaque con nanomateriales mantuvieronla calidad de los frutos por ms tiempo en comparacin con el material deempaque normal.

2.4. PROBLEMATICA POSTCOSECHA EN FRUTOS TROPICALES

La mayora de los frutos tropicales son del tipo de los climatricos, los cualesmaduran rpidamente durante el transporte y almacenamiento, y su tasa derespiracin alcanza un nivel mximo al comienzo de la fase respiratoriaclimatrica (Maftoonazad y Ramaswamy, 2005).

De acuerdo con la FAO (2005), las prdidas postcosecha en frutos tropicales delmundo varan entre 10 y 80%, dependiendo del tipo de cultivo y regin. Entre lasprincipales causas se encuentran:

Daos mecnicos causados por una mala manipulacin a lo largo de lacadena del suministro.

Prdida de humedad por evaporacin y transpiracin.

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En Mxico, C. gloesporioides representa un serio problema para los productoresde papaya debido a las condiciones ambientales favorables y a la resistencia quedesarrolla a los fungicidas sintticos (Bautista-Baos et al., 2003).

Figura 3. a) Antracnosis producida por Colletotrichumgloesporioides b) esporas de C. gloesporioides

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3. JUSTIFICACION

El inters por seguir adquiriendo conocimiento acerca de las propiedades biocidas

de los nanomateriales metlicos, se justifica por la aparicin de nuevas y msagresivas enfermedades, as como por la resistencia a los antibiticos quepresentan muchos microorganismos patgenos.

Aunado a esto, hoy en da los materiales biodegradables estn cobrando msfuerza debido a la crisis medioambiental en la cual nuestro planeta se encuentrainmerso. La incorporacin de materiales nanoestructurados con actividad biocida,

a materiales biodegradables, podra fortalecer ms las propiedades de stos, ypor lo tanto fomentar an ms su uso. Todo esto con el objetivo de reducir laproduccin y consumo de plsticos sintticos. Adems con la utilizacin demateriales biodegradables antimicrobianos como empaques o recubrimientosalimentarios, se podra reducir en gran medida la incorporacin directa de agentesqumicos al producto.

Por lo mencionado anteriormente, se justifica el planteamiento y desarrollo delpresente trabajo. Teniendo siempre presente todas las precauciones necesariassobre los posibles riesgos en el ser humano.

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4. OBJETIVOS

4.1. GENERAL

Sintetizar nanopartculas de plata y determinar su actividad antifngica.

4.2. ESPECIFICOS

Elaborar nanopartculas de plata mediante reduccin qumica. Evaluar las propiedades pticas de las soluciones coloidales de

nanopartculas.

Realizar una caracterizacin morfolgica y estructural de los

nanomateriales obtenidos. Evaluar la actividad antifngica de las nanopartculas, empleando el

fitopatgeno Colletotrichum gloesporioides (in vitro e in situ).

Determinar la posible incorporacin de nanopartculas de plata apelculas biodegradables para el recubrimiento de frutos de papaya.

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5. MATERIALES Y METODOS

5.1. MATERIALES

Las nanopartculas de plata fueron preparadas utilizando nitrato de plata (Sigma- Aldrich, USA) como precursor, glucosa (Mallinckrodt Baker, S. A. de C. V.,Mxico) como agente reductor y gelatina comercial (Gardhal, S. A., Mxico) comoagente pasivante o protector. En todos los experimentos se emple aguadesionizada (18M cm-1, Easypure, EU). Para el ajuste de pH se utiliz hidrxidode sodio (NaOH) de la marca JTBaker (Mallinckrodt Baker, S. A. de C. V.,

Mxico). Para las pruebas in vitro se empleo como medio de cultivo agar de papay dextrosa (PDA, por sus siglas en ingles) de la marca Bioxon (Becton Dickinsonde Mxico, S. A. de C. V., Mxico). Los frutos de papaya, variedad Maradol,fueron adquiridos en la Central de Abastos de la Ciudad de Mxico con un gradode madurez uniforme.

5.2. METODOS

5.2.1. Elaboracin y caracterizacin de nanopartculas de plata

5.2.1.1. Sntesis de nanopartculas de plataLas nanopartculas de plata fueron elaboradas de acuerdo con la siguientemetodologa: Una solucin acuosa de gelatina-glucosa fue preparada de acuerdoa las concentraciones establecidas en el diseo de experimentos. Posteriormenteel pH de la solucin fue ajustado a 10, el cual fue constante para todos losensayos. Empleando una parrilla de calentamiento (Barnsted-Thermolyne, USA) ybajo agitacin constante, la solucin fue sometida a un tratamiento trmico. Alalcanzar la temperatura adecuada, se procedi a agregar, gota a gota, 10 mL deuna solucin 0.1M de AgNO3. La solucin final fue mantenida por 30 minutos msbajo las mismas condiciones de temperatura y agitacin.

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5.2.1.2. Evaluacin de las propiedades pticas (EspectroscopiaUV-vis)

Los espectros de absorcin ptica de las soluciones coloidales de nanopartculasfueron obtenidos en un rango de longitud de onda de 300-800nm, empleando unespectrofotmetro Cary 50 (Varian, USA). Las soluciones coloidales fuerondiluidas 1:5 con agua desionizada previo al anlisis.

5.2.1.3. Determinacin del tamao y morfologaEl tamao y la morfologa de las nanopartculas de plata fueron examinadosempleando un microscopio electrnico de transmisin (JEOL-JEM1010, Japn).Las muestras fueron preparadas colocando una gota de las soluciones coloidalesde nanopartculas sobre una rejilla de cobre con recubrimiento de carbono de 200mesh. Las imgenes se obtuvieron a distintas magnificaciones utilizando unapotencia de 60kV. El tamao promedio y la distribucin de tamao se obtuvo alanalizar 150 partculas aprox. por cada experimento, empleando el software PhotoImpact ()

5.2.1.4. Evaluacin mediante Espectroscopia RamanMediante es tcnica se evalu la posible interaccin entre las nanopartculas deplata y el agente protector (gelatina). Un espectrofotmetro de Raman (Dilor-JobinYvon-Spex), con un lser de He-Ne con una longitud de onda de 632.8 nm. Lasmuestras coloidales fueron secadas y depositadas en porta objetos. El barrido sehizo desde 250 hasta 5000 cm -1 empleando un filtro con 0.2 de apertura el

barrido.

5.2.1.5. Evaluacin mediante espectroscopia de infrarrojo (FTIR)Los espectros de infrarrojo fueron obtenidos en un equipo Spectrum One (PerkinElmer, EUA). Previo al anlisis, las nanopartculas de plata fueron separadas porcentrifugacin a 13,000 rpm (Centrfuga Sigma 2-16, Sigma Laborzentrifugen

GMBH, Alemania) y secadas. Pequeas cantidades de gelatina, AgNO3nanopartculas, fueron molidas y mezcladas con KBr para formar una

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pastilla compacta y transparente. Los espectros de IR fueron registrados en unrango de frecuencia de 4000-400cm -1.

5.2.2. Diseo experimentalDespus de una serie de estudios preliminares, las variables independientesfueron definidas y sus niveles establecidos para la determinacin de los nivelesmximos y mnimos para cada variable (tabla 2). Para llevar a cabo la sntesis delas nanopartculas de plata se utiliz un diseo experimental central compuestoconformado de un factorial 2K (donde K=3), una serie de corridas axiales y 5puntos centrales, teniendo en total 20 experimentos (tabla 3). Las variables deestudio fueron las relaciones glucosa/plata, gelatina/plata y la temperatura desntesis. Todos los experimentos se realizaron aleatoriamente

Tabla 2. Variables independientes y sus niveles de variacin

Variables codificadas -1.682 -1 0 1 1.682

X1 1.2 1.5 2.0 2.5 2.8X2 0.7 1.0 1.5 2.0 2.3X3 58 65 75 85 92

X1: Glucosa/AgX2: Gelatina/AgX3: Temperatura (C)

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De acuerdo con la metodologa de superficie de respuesta, los datosexperimentales fueron utilizados para determinar los coeficientes i y ij de laecuacin de expansin de la serie de Taylor (polinomial cuadrtica), cuyaexpresin general se establece en la ecuacin (1).

++++

++++++=

3223311321122333

2212

21113322110

XXXXXXX

XXXXXY

Ec. (1)

Siendo Y la funcin respuesta genrica y X1, X2 y X3 las variables independientes.Los coeficientes i y ij fueron estimados por el mtodo de mnimos cuadrados y

es el residuo que mide el error experimental, representado por una distribucinnormal, con media cero y variacin igual a2. La influencia de las variables fueobservada a travs de los grficos de superficie de respuesta.

5.2.4. Evaluacin de la actividad antifngica de nanoparticulas deplata

5.2.4.1. Aislamiento deColletotrichum gloesporioides El hongo fue aislado de frutos de papaya con sntomas de antracnsis.Primeramente se procedi a limpiar el tejido vegetal enfermo con un algodnembebido en alcohol, al 70%. Se realizaron pequeos cortes de la zona enferma,los cuales fueron esterilizados sumergindolos en una solucin de hipoclorito desodio al 1% durante 1 min. y lavados con agua destilada estril. Mediante latcnica por picadura, el hongo fue sembrado en placas de petri con medio PDA.Las placas fueron incubadas a 25C hasta observar el crecimiento miceliar.Finalmente se realizaron resiembras utilizando el mismo medio hasta obtener uncultivo puro. La identificacin del hongo se realiz en la Direccin General deSanidad Vegetal (Senasica) por el Biol. David Bonilla Lpez.

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5.2.4.2. Evaluacin in vitro de la actividad antifngicaPara la evaluacin de la actividad antifngica se utiliz la metodologa propuestapor Guo et al. 2007. Se emplearon nanopartculas de 5, 13 y 24nm de dimetropromedio, a diferentes concentraciones. Las nanopartculas de plata fueronincorporadas al medio de cultivo (PDA) previo al vaciado en placas petri. Un discode 5mm de agar+micelio fue tomado del cultivo puro y colocado en el centro de laplaca con los distintos tratamientos de nanopartculas. Las placas fueronincubadas a 25C y se realizaron mediciones del dimetro de la zona decrecimiento cada 24 horas, hasta que el micelio del hongo alcanz los bordes dela placa control (sin nanopartculas). El ndice antifngico (IA) fue calculadomediante la ecuacin 2.

( )2100x2D1D1IA

=

Donde:D1: dimetro del micelio en los tratamientos con nanopartculasD2: dimetro del micelio en el control

5.2.4.3. Recoleccin de esporas de C. gloesporioides.Para las pruebas in situ de la actividad antifngica, se utiliz una cepa de C.gloesporioides proporcionada por la Dra. Silvia Bautista Baos del Centro deDesarrollo de Productos Biticos del Instituto Politcnico Nacional (CEPROBI-IPN). Previo al anlisis, primeramente fue necesario preparar una solucin de

esporas con una concentracin de 1x10 6 esporas/mL. La obtencin de lasesporas se realiz siguiendo la metodologa propuesta por Bautista-Baos et al.(2003). El micelio y las esporas fueron recolectadas de las cajas petri empleandouna varilla de vidrio y agua destilada. La mezcla resultante fue filtrada a travs deuna doble gasa estril. El filtrado resultante fue ajustado a 25mL con aguadestilada. El nmero de esporas/mL de solucin fue determinado utilizando unacmara de Neubauer (Hauser Scientific, EUA).

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49/90

5.2.5. Evaluacin in situ de la actividad antifngicaEl efecto de las nanopartculas de plata (10nm) en el crecimiento deColletotrichum gloesporioides fue evaluado mediante la siguiente metodologa:Frutos de papaya fueron previamente lavados con una solucin de hipoclorito desodio (1%) y secados a temperatura ambiente. Los frutos fueron divididos en 5grupos de 5 unidades y asperjados con una solucin de esporas de C.gloesporioides (1x106 esporas/mL). Una vez que los frutos secaron, a 4 de losgrupos se les aplic una pelcula de gelatina-almidn (Aguilar-Mndez et al.,2008) con distintas concentraciones de nanopartculas (0, 1, 2 y 4L de solucinde nanopartculas/mL de solucin formadora de pelcula). El tratamiento controlpermaneci sin recubrimiento. Los frutos fueron mantenidos a temperaturaambiente por 7 das. Al final del experimento, los sntomas de antracnosis fueronevaluados como incidencia y severidad de la enfermedad (Bautista-Baos et al.,2003). La incidencia fue determinada como el porcentaje de frutos daados porcada tratamiento. Para determinar el ndice de severidad se asignaron valores del1-5, donde 1=0% de dao sobre la superficie de la fruta, 2=1-25%, 3=26-50%,4=51-75% y 5=76-100%. Adems se evalu tambin la calidad de las frutasmediante prdida de peso, slidos solubles totales (SST) y firmeza.

5.3. EVALUACIN DE LA CALIDAD DE FRUTOS DE PAPAYA

5.3.1. Prdida de peso

Se determin por diferencia de peso en los diferentes periodos de evaluacin. Los

datos se expresaron en porcentaje, respecto al peso inicial. La Ec. (3) se utilizpara calcular la prdida.

100=inicialpeso

finalpesoinicialpesopesodePrdida Ec. (3)

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50/90

5.3.2. Firmeza de la pulpa

La firmeza de la pulpa de papaya se determin siguiendo la metodologa de Aguilar-Mndez et al. (2008), empleando un texturmetro TA-XT2i Texture

Analyser (Stable Micro Systems, UK). La penetracin de los frutos se realiz conuna celda en forma de aguja (Fig. 6), de 2mm de dimetro. La distancia recorridapor la celda a travs de la pulpa fue de 10mm, a una razn de 5mm/s. La fuerzamxima fue tomada como valor resultante.

5.3.3. Slidos solubles totales (SST)

Los SST se evaluaron como Brix empleando un refractmetro Master T (AtagoCo., Japn). Una gota del jugo de la fruta fue colocada sobre el refractmetro y setom la lectura sealada. El anlisis se realiz por triplicado.

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6. RESULTADOS

6.1. SINTESIS Y CARACTERIZACION DE NANOPARTICULAS DE PLATA

6.1.1. Formacin de nanopartculas de plata

Empleando los agentes precursores anteriormente listados y bajo condicionesalcalinas (pH 10), es posible que la formacin de las nanopartculas de plata siganel mecanismo planteado por las ecuaciones 4 y 5

( )

( ) ( ) ( ) (5gelatina2AgCOOHCHOHOHCH2gelatinaCHOCHOHOHCHO Ag

4OHO Ag2OH2Ag

42422

22

+++

+

++

) La ecuacin 4 plantea primeramente que los iones plata en solucin acuosa,reaccionan con los grupos hidroxilo formando xido de plata. Posteriormente elxido de plata es reducido por la glucosa generando finalmente nanopartculas deplata (Wang et al., 2005). La funcin de la gelatina es formar una capa protectora

sobre la superficie de las nanopartculas con la finalidad de prevenir suagregacin y por lo tanto mantener su estabilidad en solucin coloidal.

6.1.2. Espectroscopia de UV-visible

Cuando una molcula determinada absorbe radiacin UV-visible, la energa

absorbida excita electrones de orbitales de ms baja energa a orbitales de msalta energa en la molcula. La mxima absorcin UV-visible ocurre en unalongitud de onda caracterstica de la estructura molecular y se puede determinar apartir de una grfica de intensidad de absorcin (absorbancia) contra longitud deonda de la radiacin absorbida (Moore et al., 2000).

La figura 4. muestra un espectro tpico de absorcin UV-vis obtenido para un

sistema coloidal de nanopartculas de plata. Los espectros UV-vis analizadospresentaron una sola banda simtrica de resonancia de plasmn superficial. La

50


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mxima absorbancia UV-vis se ubic en un rango de longitud de onda de 420-430nm en todos los experimentos. De acuerdo Zhang y Fang (2007) y Pal et al.(2007), la aparicin de espectros de absorcin simtricos con absorbanciamxima a 420nm es debido a la resonancia bipolar de partculas de plataesferoidales relativamente pequeas. El color de las soluciones coloidales fue entodos los casos caf oscuro. El color de los metales nobles en solucin es elresultado de la reflexin y transmitancia de la luz incidente. Estas propiedadesestn en funcin de los cambios de la banda de plasmn superficial (Baker et al.,2004).

300 400 500 600 700 8000.0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

1.8

A b s o r b a n c

i a ( u

. a . )

Longitud de onda (nm)

Figura 4. Espectro tpico de absorcin UV-vis de unsistema coloidal de nanopartculas de plata

Con la figura 5, se pretende mostrar la estabilidad de los sistemas coloidales denanopartculas de plata obtenidas en esta investigacin. Se puede observar que

el espectro de absorcin ptica, despus de 3 meses, permanece prcticamenteigual al espectro obtenido inmediatamente despus de elaboradas lasnanopartculas, lo que sugiere que no hubo un crecimiento importante en eltamao de las partculas. Otro punto que cabe resaltar es que al intentar separarlas nanopartculas del solvente, mediante centrifugacin a alta velocidad(13,000rpm), las cantidades de precipitado fueron mnimas. Con lo sealadoanteriormente, se puede decir que los nanomateriales sintetizados tienen una

buena estabilidad debido posiblemente a su tamao relativamente pequeo

51


53/90

(


54/90

un baja relacin Gel/Ag (0.66) y una alta relacin Glu/Ag (2.8), es decirnanopartculas de mayor tamao. Caso contrario si se emplean altas relacionesGel/Ag (2.34) y bajas relaciones Glu/Ag (1.2), ya que bajo estas condiciones seobtendran nanopartculas ms pequeas. Cabe mencionar que la temperatura desntesis influy de manera significativa en las propiedades pticas. Se puedeobservar que al aumentar la temperatura, las bandas espectrales se ubicaran enlongitudes de onda menores; por ende se podra asumir que las nanopartc

ndran un menor tamao al emplear temperaturas de proceso altas.


55/90

6.1.3. Microscopa Electrnica de Transmisin

las y evaluar algn efecto de las variables dentesis en la forma predominante.

smn superficial, ubicndose en un rango de longitud de ondae 420-430nm.

nm), obtenidas bajoondiciones de glu/Ag: 2.0, gel/Ag: 2.3 y temperatura: 75C.

A travs de esta tcnica de caracterizacin se obtuvieron imgenes de lasnanopartculas de plata, las cuales fueron analizadas con el propsito dedeterminar el tamao promedio para cada experimento. De igual manera se pudoobservar la morfologa de las partcus Los resultados determinaron que mediante el mtodo de reduccin qumica y bajolas condiciones de sntesis establecidas en el diseo experimental, es posibleobtener nanopartculas de plata en un rango de dimetro promedio de 5-25nm. Asimismo se pudo observar una prevalencia de nanopartculas de formaesferoidal bajo todas las condiciones de sntesis. Lo anterior se puedecorrelacionar con los resultados de espectroscopia UV-vis, ya que los espectrosobtenidos para cada una de las corridas, presentaron una sola banda simtrica deresonancia de pld

La figura 7 muestra imgenes de MET, con sus respectivos histogramas, denanopartculas de plata obtenidas bajo las condiciones de las corridas 10, 12 y 6.Las nanopartculas de mayor tamao sintetizadas en esta investigacin, tuvieronun dimetro promedio de 23.8nm (figura 7a) y fueron obtenidas bajo condicionesde sntesis de glu/Ag: 2.5, gel/Ag: 1 y temperatura: 85C. De acuerdo con suhistograma, esta corrida experimental present tambin la mayor distribucin detamao. Por lo contrario, bajo condiciones de glu/Ag: 2.8, gel/Ag: 1.5 y

temperatura: 75C se obtuvieron las nanopartculas de menor tamao (5nm) y conla menor distribucin (figura 7c). La figura 7b muestra una imagen de MET y suhistograma para nanopartculas de un tamao medio (13.8c

54


56/90

100nm

a)

10 15 20 25 30 35 40 45 500

2

4

6

8

10

12

F r e c u e n c

i a

Dimetro de partcula (nm)

D=23.80.47nm

10 15 20 25 300

5

10

15

20

F r e c u e n c

i a


D=13.80.13nm

100nm

b)

100nm

c)

3 6 9 120

5

10

15

20

25

F r e c u e n c i a


D=50.36nm

Figura 7. Imgenes de MET de nanopartculas de plata

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57/90

Mediante el patrn de difraccin de electrones (figura 8), fue posible confirmar lanaturaleza cristalina de las nanopartculas de plata. Las distancias interplanaresde los anillos de difraccin, pueden ser indexadas de acuerdo con la estructuracbica centrada en las caras (fcc) de la plata metlica.

Experimental Ag cbica

Con la finalidad de establecer la influencia de las variables de sntesis en eltamao de las nanopartculas de plata, los valores de tamao promedio fueronanalizados mediante la MSR (figura 9). De acuerdo con la figura 9a,nanopartculas de tamao pequeo (3.5nm) pueden ser obtenidas al aumentar

proporcionalmente las relaciones Gel/Ag (desde 0.66 hasta 2.34) y Glu/Ag (desde1.20 hasta 2.80), esto bajo condiciones de temperatura de sntesis de 58C. Lasuperficie de respuesta tambin muestra que partculas de un tamao mayor(28.5nm) podran ser sintetizadas bajo una concentracin alta de protena(Gel/Ag: 2.34) y concentracin mnima del agente reductor (Glu/Ag: 1.20). Alaumentar la temperatura de sntesis hasta 92C la tendencia de la superficie derespuesta se modifica (figura 9b), lo que nos indica una influencia de la

temperatura en el tamao de las nanopartculas de plata. Es posible observar quenanopartculas de tamao relativamente pequeo (7.2) podran ser obtenidas en

() (hkl)2.33 1112.12 2001.45 2201.27 3111.16 2221.06 4000.94 331

Figura 8. Patrn de difraccin de electrones denanopartculas de plata

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58/90

rangos de Gel/Ag: 1.08-1.5 y Glu/Ag: 1.6-2.0. Por otro lado, partculas de mayortamao se sintetizaran bajo condiciones de Glu/Ag: 2.8 y Gel/Ag: 0.66. Comopuede observarse este hecho es totalmente contrario al trabajar a temperatura de52C. De acuerdo con Sun y Luo (2005), al aumentar la relacin pasivante/platase puede conseguir una disminucin del tamao de partcula. Sin embargo enesta investigacin, este suceso solo se observa si se utilizan temperaturas desntesis de 92C, ya que a bajas temperaturas (58C), el aumento en la relacingel/Ag favorece la formacin de partculas de mayor tamao. Bajo este respecto,Petica et al. (2008) sealan que al aumentar la concentracin del polmeroconlleva a un incremento de la viscosidad de la solucin, obstaculizando ladifusin y disminuyendo las repulsiones electrostticas, por lo tanto promoviendola aglomeracin de las partculas. Tomando en cuenta solo la temperatura desntesis se puede notar que al aumentar la temperatura se favorece el crecimientode las partculas. Resultados similares fueron reportados por Luo et al. (2005).

Se puede observar que las graficas de superficie de respuesta para este anlisispresentan tendencias similares a aquellas superficies obtenidas paraespectroscopia UV-vis, lo que nos indica una concordancia entre los resultados de

ambas tcnicas.

La ecuacin 7 representa el modelo matemtico para este anlisis. El modelomostr un ajuste moderado (R2=0.6) a los datos experimentales.

22

21321 X X X X X Tamao *7.19*3.3*1.63*28.21*14.3553.18 +++=

( )73231212

3 X X X X X X X *0.36*0.29*12.27*0.011 ++

57


59/90

3.5

9.7

16.022.2

28.5

T a m a

o

( n m

)

1.20 1.60

2.00 2.40

2.80

0.66

1.08

1.50

1.92

2.34

Glu/AgGel/Ag

a)

7.215.022.930.738.6

T a m a

o

( n m

)

1.20 1.60

2.00 2.40

2.80

0.661.08

1.501.92

2.34

Glu/AgGel/Ag

b)

Figura 9. Superficies de respuesta para la caracterizacinpor MET: a) 58C, b) 92C.

58


60/90

6.1.4. Espectroscopia Raman

Esta tcnica se emple para evaluar las posibles interacciones existentes entrelas nanopartculas de plata y el polmero gelatina (agente pasivante). La figura10a muestra un espectro Raman del AgNO 3 (precursor) evidenciando tres picosimportantes a nmeros de onda de 685, 1011 y 1300 cm -1. El pico ms intensoubicado a un nmero de onda de 1011cm -1 corresponde al ion nitrato (NO3 ). Losdos picos mas dbiles ubicados a 1041 y 1300 cm -1, corresponden al par in Ag+ NO3 , teniendo un modo de tensin simtrica (Oliver and Janz). En lo querespecta a la gelatina (figura 10b) Raman evidenci picos a 1668, 1450, 1315 y1250 cm-1, los cuales corresponden a la Amida I (vibraciones de tensin delenlace C=O), grupos alifticos (vibraciones de tensin del enlace CH), Amida II(vibraciones de flexin del enlace N-H y de tensin del enlace C-N) y Amida III(vibraciones de flexin del enlace N-H). En el espectro Raman de lasnanopartculas de plata (figura 10c) solo es posible observar dos picosensanchados ubicados 1590 y 1300 cm -1 los cuales pueden atribuirse a lasamidas I, II y III. Es posible inferir que los desplazamientos en los valores delongitud de onda, as como el ensanchamiento de los picos sean atribuidos a

interacciones con nanopartculas de plata. Se puede observar tambin que el picocorrespondiente al ion NO3 en el espectro Raman del AgNO 3 prcticamentedesaparece en el espectro Raman de las nanopartculas. Sin embargo esteespectro da muy poca informacin para discutir y es necesario realizar o emplearotra tcnica como FTIR para corroborar y obtener ms informacin sobre lasposibles interacciones gelatina-nanopartculas.

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61/90

a)35000

2100 1800 1500 1200 900 600 300

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

1300

1011

685

I n t e n s

i d a d

( u .

a . )

Nmero de onda (cm-1)

2100 1800 1500 1200 900 600 3000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

b)

12501315

1450

1668

I n t e n s

i d a

d ( u

. a .

)


2100 1800 1500 1200 900 600 3000

30

60

90

120

150

180

c)

15901300

I n t e n s i d a

d ( u

. a .

)


Figura 10. Espectros Raman de: a) AgNO3 b) gelatina y c)nanopartculas de plata

60


62/90

6.1.5. Espectroscopia de Infrarrojo (FTIR)

La principal utilidad de la FTIR en la caracterizacin de nanopartculas metlicas,es para detectar especies qumicas que interaccionan con la superficie de lapartcula (Baker et al., 2004). Esta tcnica es esencialmente sensible a lapresencia de grupos polares tales como O-H, C=O, C-O y N-H (Ma y Phillips,2002).

Los espectros FTIR de los precursores empleados (AgNO 3 y gelatina) y de lasnanopartculas sintetizadas en esta investigacin fueron obtenidos (Figura 11). Elespectro de la gelatina revel bandas de absorcin caractersticas a 3417cm -1 correspondiente a la Amida A (vibraciones de tensin del enlace N-H), 1648cm-1 perteneciente a la amida I (vibraciones de tensin del enlace C=O), 1535cm -1 correspondiente a la amida II (vibraciones de flexin del enlace N-H y de tensindel enlace C-N) y finalmente a 1240 cm-1, la cual es caracterstica de la amida lll(vibraciones de flexin del enlace N-H). De acuerdo con Pranoto et al. (2007), labanda correspondiente a la amida I es el pico ms til para el anlisis de laestructura secundaria de protenas como la gelatina. El espectro del AgNO 3

muestra una banda de absorcin muy intensa a 1376 cm -1, la cual es propia delpar in Ag+ NO3-. Por otro lado, al analizar el espectro de las nanopartculas deplata, se pueden observar ligeros corrimientos de las distintas bandas deabsorcin anteriormente descritas. Las bandas correspondientes a las amidas A yl, se desplazaron a menores valores de nmero de onda (3400 y 1640 cm -1,respectivamente). Por otra parte, el pico perteneciente a la amida ll se ubic a unmayor valor de nmero de onda (1539 cm-1), siendo evidente tambin una

disminucin en su intensidad. La banda ubicada a 1240 cm -1 (amida lll)prcticamente desapareci del espectro de las nanopartculas. En el espectro del AgNO3, la banda antes localizada a 1376 cm -1 (correspondiente al par in Ag+

NO3-), aparece ahora a un mayor valor de nmero de onda (1385 cm -1) y con unadisminucin en su intensidad. Este pico, ubicado a 1385 cm-1, es caracterstico delin NO3- en forma libre, y el desplazamiento es provocado por un cambio en elentorno electrnico del anin como resultado de la separacin de su contraparte

Ag+

(Cho y So, 2006).

61


63/90

Con estos resultados se puede deducir que las nanopartculas de plata seencuentran interaccionando con los distintos grupos amida de la gelatina. Sepuede asumir que estas interacciones favorecen en gran medida la estabilidadpresentada por las soluciones coloidales. De acuerdo con Basavaraja et al. (2008)los grupos carbonilo de aminocidos y protenas tienen la habilidad de ligarpartculas metlicas y de esta manera prevenir su aglomeracin.

AgNO3

Ag Nps

Gelatina

4000 3000 2000 10000

20

40

60

I n t e n s i

d a d

Nmero de onda (cm -1)

1376

1385

1648

1640

1535

1539

3417

3400

1240

Figura 11. Espectros FTIR de los precursores empleados(AgNO3 y gelatina) y de las nanopartculas de plata

62


64/90

6.2. EVALUACIN IN VITRO DE LA ACTIVIDAD ANTIFNGICA DENANOPARTCULAS DE PLATA

La figura 12, muestra el efecto del tamao y concentracin de nanopartculas deplata en el crecimiento miceliar de Colletotrichum gloesporioides . Es evidente quela adicin de nanopartculas de plata al medio de cultivo, provoc una disminucinimportante en la velocidad de crecimiento miceliar, en comparacin con el control. Adems esta reduccin en el crecimiento del hongo fue menor a medida que seaument la concentracin de nanopartculas de plata en el medio de cultivo. Encuanto al efecto del tamao de partcula (5, 13.8 y 23.8nm) sobre la reduccin delcrecimiento miceliar, no se observaron diferencias (figura 12a-12c). Lo anteriorpudo ser debido a la corta distribucin de tamao de partcula utilizada (5-23.8nm). A diferencia de algunos reportes sobre la inactivacin total de variostipos de bacterias como consecuencia de la aplicacin de nanopartculas de plata(Sondi y Salopek-Sondi, 2004; Cho et al., 2005; Pal et al., 2007), en estainvestigacin, la aplicacin de este tipo de nanomateriales solo encontr un efectofungisttico sobre el crecimiento del hongo Colletotrichum gloesporioides (figura13). Petica et al. (2008) reportaron tambin efectos fungistticos de

nanopartculas de plata en solucin coloidal, sobre varias especies de hongos( Aspergillus , Penicillium y Trichoderma ). La tabla 4, muestra los porcentajes deinhibicin que tuvieron cada uno de los tratamientos aplicados, alcanzando casiun 90% de inhibicin con la concentracin C3 para cada uno de los tamaos departcula evaluado.

63


65/90

a)10

2 3 4 5 6 70

2

4

6

8

Figura 12. Crecimiento de Colletotrichum gloesporioides bajo diferentesconcentraciones de nanopartculas de plata

C r e c i m

n t o m

i c e l

i a r

( c m

)

Tiempo (d)

C1 C2 C3 Control

i e

2 3 4 5 6 70

2

4

6

8

10 b)

2 3 4 5 6 70

2

4

6

8

10

C r e c i m

i e n

t o m

i c e l

i a r

( c m

)

Tiempo (d)

C1 C2 C3 Control

c)

C r e c i m

i e n

t o m

i c e l

i a r

( c m

)

Tiempo (d)

C1 C2 C3 Control

64


66/90

a) b)

c) d)

Figura 13. Efecto de la adicin de nanopartculas de plata en

el crecimiento miceliar deC. gloesporioides

Tabla 4. Porcentajes de inhibicin de C. gloesporioides

Inhibicin (%)Concentracin 5nm 13.8nm 23.8nm

C1 73 69 74C2 82 82 82C3 89 88 89

65


67/90


68/90

Tabla 5. Efecto de las nanopartculas de plata en el ndice deincidencia

Tratamiento ndice de severidad Incidencia (%)Control 2.6 100P 2.0 80T1 1.4 40T2 1.2 20T3 1.8 80

Figura 14. Frutos de papaya con sntomas de antracnosis

severidad

Figura 15. Frutos de papaya con dao en el tejido superficial

67


69/90


70/90

1 2 3 4 5 6 70

2

4

6

8

10

P r d

i d a

d e p e s o

( % )

Tiempo (d)

P T1 T2 T3 Control

Figura 16. Prdida de peso de frutos de papaya enfuncin del tiempo

6.4.2. Prdida de firmeza

La textura es considerada como el principal atributo de calidad de las frutas queinfluye en la aceptabilidad por parte de los consumidores. El ablandamiento oprdida de firmeza es el resultado de modificaciones texturales que tienen lugardurante el periodo postcosecha, para prcticamente todas las especies de frutas(Manrique y Lajolo, 2004). Estos cambios en la textura son atribuidos a ladegradacin de los componentes de la pared celular, por la accin de algunasenzimas como la pectinesterasa y poligalacturonasa (Maftoonazad y

Ramaswamy, 2005).

Al inicio de la experimentacin los frutos de papaya presentaron valores defirmeza promedio de 7.890.33N. Al sptimo da de almacenamiento, se pudoobservar una disminucin en los valores para todos los tratamientos (figura 17),producto de la maduracin de los frutos. Sin embargo, el tratamiento sinrecubrimiento (control) tuvo una mayor prdida de firmeza en comparacin con

aquellos con recubrimiento (P, T1, T2 y T3). Por otro lado entre los tratamientoscon pelcula se puede observar que el tratamiento T 1 fue el que present mayores

69


71/90

valores de firmeza al finalizar la experimentacin. La aplicacin de una cubiertabiopolimrica en la superficie de un fruto tiene como objetivo regular lapermeabilidad a gases (O 2 y CO2), y por ende establecer una atmsferamodificada (Maftoonazad y Ramaswamy, 2005). De acuerdo con Yaman yBayoindirli (2002), estas condiciones de atmsfera modificada, pueden reducir laactividad enzimtica causante de la degradacin de los tejidos celulares.

Li et al. (2009) fabricaron materiales de empaque con incorporaciones denanopartculas de plata, dixido de titanio y kaolin, para la preservacin de dtileschinos. Estos autores reportaron que la incorporacin de los nanomaterialesmejor las propiedades de barrera y mecnicas de los materiales de empaque.Por lo tanto, los frutos almacenados en este tipo de materiales retuvieron mejor lafirmeza en comparacin con los frutos control.

Control P T1 T2 T30.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

F i r m e z a

( N )

Tratamientos

Figura 17. Firmeza de frutos de papaya al finalizar eltiempo de experimentacin

70


72/90

6.4.3. Slidos solubles totales (Brix)

sintesisycaracterizacion plata.pdf

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