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D-glucosamina reduce la formación de biofilm de Staphylococcus epidermidis1

PUBLICACIÓN DE LA ASOCIACIÓN ARGENTINA DE MICROBIOLOGÍA

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DIRECTORA

Silvia Carla PredariInstituto de Investigaciones Médicas Alfredo Lanari - UBA

SECRETARIO DE REDACCIÓN

José A. Di ConzaFacultad de Famacia y Bioquímica - UBA - CONICETFacutad de Bioquímica y Ciencias Biológicas - UNL

COMITÉ EDITOR

Alicia I. ArechavalaHospital Francisco J. Muñiz - GCBA

Mauricio G. CarobeneFacultad de Medicina - UBA - CONICET

Inés E.García de SalamoneFacultad de Agronomía - UBA

Héctor R. MorbidoniFacultad de Ciencias Médicas

UNR - CIUNR

Beatriz N. Passerini de RossiFacultad de Farmacia y Bioquímica - UBA

ASESORES CIENTÍFICOS

C. Bantar S.R. Costamagna N. Leardini R. RayaJ.C. Basílico C. Coto G.A. Leotta V. RitaccoM.I. Berría M. D’Aquino H. Lopardo H.R. Rodríguez

H.M. Bianchini R. de Torres W.P. Mac Cormack A.P. de Ruiz HolgadoN. Binsztein A.H. Frade D. Masih A. SchudelR. Campos A. Gentile M. Mollerach L. ScolaroG. Carballal A. Giri R. Negroni F. SesmaA. Cataldi J.E. González F. Nicola R. Soloaga

J.J. Cazzulo S. González Ayala T. Orduna H. TerzoloG. Vaamonde

A. Amoroso (Bélgica) M. Gottschalk (Canadá) A. Restrepo (Colombia)J. Arbiza (Uruguay) R. Guerrero (España) G. San Blas (Venezuela)J.A. Ayala (España) M.J. Mendes Giannini (Brasil) G. Schmunis (EE.UU.)

P. Feng (EE.UU.) M. Philipp (EE.UU.) A. Steinbüchel (Alemania)E. García López (España) F. Queiroz Telles (Brasil) M. Tolmasky (EE.UU)

J. Vila Estape (España)

ASESORES EN EL EXTERIOR

Ana M. JarFacultad de Ciencias Veterinarias - UBA

Claudia I. MenghiHospital de Clínicas - Facultad de Farmacia

y Bioquímica - UBA

REVISTA ARGENTINA DE


VOLUMEN 44 Nº 2 ••••• ABRIL-JUNIO 2012

ÍNDICE


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EDITORIALLa nano, el mano y la microbiología clínicaHéctor R. Morbidoni, Ana M. Jar

MICROBIOLOGÍA BÁSICA*Detección del gen ompA de Chlamydophila pecorum en aves en cautiverio, en la ArgentinaMaría C. Frutos, Fernando Venezuela, Ximena Kiguen, Viviana Ré, Cecilia CuffiniDos aislamientos de Salmonella Infantis multirresistentes se comportan como hipoinvasivospero con elevada proliferación intracelularJosé A. Di Conza, Marta E. Mollerach, Gabriel O. Gutkind, Juan A. Ayala

MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Y ENFERMEDADES INFECCIOSASObtención y evaluación preliminar de un virus canarypox recombinante como candidato avacuna antirrábicaFlavia Zanetti, Liliana Rudak, Matías Micucci, Daniela Conte Grand, Andrea Luque, Susana Russo,Oscar Taboga, Oscar Pérez, Gabriela Calamante

Caracterización genotípica de aislamientos de Escherichia coli obtenidos de cerdos con diarreaposdestete y enfermedad de los edemasFabiana A. Moredo, Javier Cappuccio, Lucas Insarralde, Carlos J. Perfumo, María A. Quiroga, Gerardo A. Leotta

CHROMagar KPC. Comparación con el método propuesto por los Centros para el Control y Prevenciónde Enfermedades (CDC, EE.UU.) para el estudio de portación rectal y evaluación de falsos positivosLaura Errecalde, Sandra Cogut, Mariana Erbin, Liliana Jordá Vargas, Eugenia Cattani, Tamara Posse,Silvia Tutzer, Ricardo Hermes, Sara Kaufman

*Dos casos de infección del tracto urinario causados por cepas de Escherichia coli O157:H7productoras de toxina ShigaMaría del P. Gadea, Natalia Deza, María I. Mota, Carolina Carbonari, Mitila Robatto, Beatriz D’Astek,Victoria Balseiro, Cristina Bazet, Eduardo Rügnitz, Valérie Livrelli, Felipe Schelotto, Marta Rivas, Gustavo VarelaAporte de la técnica de PCR en el diagnóstico de Mansonella ozzardi en zonas endémicas dela ArgentinaMaría F. Degese, Marta G. Cabrera, Silvio J. Krivokapich, Lucía Irazu, Marcelo A. Rodríguez, EduardoA. Guarnera

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOSPortación y caracterización de Staphylococcus aureus en manipuladores de alimentosGraciela B. Jordá, Raúl S. Marucci, Adriana M. Guida, Patricia S. Pires, Eduardo A. Manfredi

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Y AMBIENTAL*Uso del escobajo como sustrato para el crecimiento de hongos de la pudrición blanca, laproducción de enzimas ligninolíticas y la decoloración de tinturasLaura Levin, Luis Diorio, Emmanuel Grassi, Flavia Forchiassin*Biodegradación de fenol en cultivos estáticos por Penicillium chrysogenum ERK 1: habilidadescatalíticas y fitotoxicidad residualErika A. Wolski, Viviana Barrera, Claudia Castellari, Jorge F. González

ARTÍCULO ESPECIAL*Bioprospección de microorganismos marinos. Potencialidades y desafíos para ArgentinaHebe M. Dionisi, Mariana Lozada, Nelda L. Olivera

IMÁGENES MICROBIOLÓGICASEndosimbiosis de Arcobacter butzleri en Acanthamoeba castellaniiHeriberto Fernández, María Paz Villanueva, Gustavo Medina

Querión de CelsoMónica Saiz, Lorena P. Uribe, Andrés Gallardo Martínez

Instrucciones para los autores

Guía para la preparación de los manuscritos

* En Inglés

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INDEX

VOLUMEN 44 Nº 2 ••••• APRIL-JUNE 2012

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EDITORIALThe nanotech, the “mano” and the clinical microbiologyHéctor R. Morbidoni, Ana M. Jar

GENERAL MICROBIOLOGY*Detection of the ompA gene of Chlamydophila pecorum in captive birds in ArgentinaMaría C. Frutos, Fernando Venezuela, Ximena Kiguen, Viviana Ré, Cecilia CuffiniTwo multidrug-resistant Salmonella Infantis isolates behave like hypo-invasive strains but havehigh intracellular proliferationJosé A. Di Conza, Marta E. Mollerach, Gabriel O. Gutkind, Juan A. Ayala

CLINICAL MICROBIOLOGY AND INFECTIOUS DISEASESDevelopment and preliminary assessment of a recombinant canarypox virus as an antirabicvaccine candidateFlavia Zanetti, Liliana Rudak, Matías Micucci, Daniela Conte Grand, Andrea Luque, Susana Russo,Oscar Taboga, Oscar Pérez, Gabriela CalamanteGenotypic characterization of toxigenic Escherichia coli isolated from pigs with postweaningdiarrhea (PWD) and edema disease (ED)Fabiana A. Moredo, Javier Cappuccio, Lucas Insarralde, Carlos J. Perfumo, María A. Quiroga, GerardoA. LeottaCHROMagar KPC. Comparison with the method proposed by the Centers for Disease Controland Prevention (CDC, USA) for rectal screening and evaluation of false positive resultsLaura Errecalde, Sandra Cogut, Mariana Erbin, Liliana Jordá Vargas, Eugenia Cattani, Tamara Posse,Silvia Tutzer, Ricardo Hermes, Sara Kaufman* Two cases of urinary tract infection caused by Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7strainsMaría del P. Gadea, Natalia Deza, María I. Mota, Carolina Carbonari, Mitila Robatto, Beatriz D’Astek,Victoria Balseiro, Cristina Bazet, Eduardo Rügnitz, Valérie Livrelli, Felipe Schelotto, Marta Rivas, Gustavo VarelaContribution of the PCR assay to the diagnosis of Mansonella ozzardi in endemic areas ofArgentinaMaría F. Degese, Marta G. Cabrera, Silvio J. Krivokapich, Lucía Irazu, Marcelo A. Rodríguez, EduardoA. Guarnera

FOOD MICROBIOLOGYCarriage and characterization of Staphylococcus aureus in food handlersGraciela B. Jordá, Raúl S. Marucci, Adriana M. Guida, Patricia S. Pires, Eduardo A. Manfredi

INDUSTRIAL AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY*Grape stalks as substrate for white rot fungi, lignocellulolytic enzyme production and dyedecolorizationLaura Levin, Luis Diorio, Emmanuel Grassi, Flavia Forchiassin*Biodegradation of phenol in static cultures by Penicillium chrysogenum ERK1: catalytic abilitiesand residual phytotoxicityErika A. Wolski, Viviana Barrera, Claudia Castellari, Jorge F. González

SPECIAL ARTICLE*Bioprospection of marine microorganisms: potencial and challenges for ArgentinaHebe M. Dionisi, Mariana Lozada, Nelda L. Olivera

MICROBIOLOGICAL IMAGESEndosymbiosis of Arcobacter butzleri in Acanthamoeba castellaniiHeriberto Fernández, María Paz Villanueva, Gustavo MedinaKerion celsiMónica S. Saiz, Lorena P. Uribe, Andrés Gallardo Martínez

Instructions to authors

Manuscript preparation checklist

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Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 63-64 63ISSN 0325-7541

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 63-64EDITORIAL

No hay duda de que las ciencias biológicas han logrado importantes avances durante el siglo pasado, apartir del desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta reacción, desarrollada conceptualmenteen los años setenta, vio la luz a mediados de los ochenta y está basada en el genial concepto introducido porKary Mullis, un bioquímico estadounidense que obtuvo en 1993 el Premio Nobel de Química a consecuenciade su invento (2). La reacción de amplificación de secuencias de ácidos nucleicos permitió clonar fácilmentecualquier gen, como paso ineludible para su posterior estudio, y es, sin duda, una de las bases sobre las quese han apoyado las tecnologías desarrolladas consecutivamente; entre ellas la secuenciación de ácidosnucleicos, los micro y macroarreglos y la PCR en tiempo real.

Básicamente, la PCR es una reacción de replicación de ácido desoxirribonucleico (ADN) a escala “mega”,que se lleva a cabo in vitro en presencia de una ADN-polimerasa termoestable, una cantidad diminuta de ácidonucleico que sirve como molde para la replicación, los cuatro nucleótidos trifosfatos requeridos como sustratosde la polimerasa, ciertas soluciones tampón y dos oligonucleótidos cebadores –uno para cada hebra de ADN–que, al hibridizar con las secuencias que se van a amplificar, ofrecen un punto de partida para la polimerización(3). Así, miles de millones de copias de una secuencia específica se producen en un par de horas, con solounos 30 ciclos de reacción de PCR.

Esta tecnología no solo catapultó a Mullis al premio Nobel, sino que abrió incontables e inesperadas puertasa la investigación, aun en aspectos no directamente relacionados con la biología. En efecto, el desarrollo de latécnica de PCR produjo una revolución en los procesos de electrónica y física aplicada, y llevó a mejoras dediseño y funcionamiento en los aparatos utilizados para la reacción, llamados termocicladores. A su vez, losavances en el clonado de genes y en la producción de proteínas recombinantes causaron un efecto dominó enáreas como la secuenciación de ácidos nucleicos y el análisis de mezclas complejas de proteínas. Una últimaevolución conceptual ha sido el desarrollo de la PCR en tiempo real, en la cual el uso de marcadores fluorescentesespecíficos adicionados a los oligonucleótidos permite seguir la cantidad de ADN amplificado y, por lo tanto, sucuantificación directa a través de un sistema de censado óptico.

El progreso en los procesos de miniaturización ha llevado a la generación de herramientas micrométricas,diseñadas para ejecutar una variedad de ensayos. Estas herramientas integran todas las etapas del ensayo enun único pequeño instrumento, concepto conocido como “laboratorio en un chip” (1). Esta sucesión de cambioscomandó la evolución de la física aplicada a la biología y generó nuevos modelos de trabajo, entre los cualesse destaca con enorme potencialidad el uso de la escala “nano”, es decir, aquella que utiliza componentescuyo tamaño es de una milmillonésima parte del tamaño “normal” (10-9 m), en el intervalo de 1 a 100 nm. El trabajoacadémico e industrial en este área es intenso y está dirigido al empleo de las nanotecnologías en el diagnósticopor imágenes, el diagnóstico y el seguimiento de patologías y la determinación de biomarcadores, entre otrasmuchas aplicaciones que nos sorprenden todos los días desde las revistas especializadas.

En el caso de la microbiología clínica, las consecuencias de estas nanotecnologías son tan asombrosascomo fue en su momento la irrupción de la PCR y el desarrollo de microtécnicas basadas en microlitros demateriales, de muestras o de reactivos. En efecto, la nanofluídica (manipulación de líquidos y soluciones aescala nano de volumen) se rige por leyes físicas que se alejan de las imperantes en la escala macro. Algunasde estas divergencias explican la reducción de la viscosidad y permiten generar dispositivos de escala muypequeña, en los cuales se puede manejar el régimen de flujo y la velocidad de encuentro de los distintosreactivos y analitos de una muestra biológica. A su vez, esto se traduce en una mayor especificidad y sensibilidadde las técnicas.

Each of us have things and thoughts and descriptions of anamazing universe in our possession that kings in the 17th

century would have gone to war to possess.

KARY MULLIS (Premio Nobel de Química 1993)

La “nano”, el “Mano” y la microbiología clínica

The nanotech, the “Mano” and the clinical microbiology

64 Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 63-64

Los nuevos aprovechamientos de materiales como siliconas, plásticos e incluso papel, usados como soportesde estos dispositivos, junto con la posibilidad de recurrir a manipulaciones genéticas para producir reactivos(proteínas inmunogénicas, anticuerpos recombinantes, etc.), han desembocado en una posibilidad que seva tornando cada vez más en una realidad concreta: el desarrollo de materiales de diagnóstico de enfermedadesinfecciosas al lado del paciente. La evaluación in situ de la presencia de un agente infeccioso se realiza conmuestras de volumen mínimo, equipamientos muy simples, de bajo costo, y dispositivos descartables.Aunado al escaso consumo de reactivos y al abaratamiento de costos al llegar a etapas de producciónmasiva, este tipo de elementos o equipos, que pueden ser utilizados en lo que se denomina tecnologíadiagnóstica Point-of-Care (POC), parecen ser una panacea para los países de bajos recursos o con zonasgeográficas de difícil acceso, donde el paciente está lejos de los centros de mediana complejidad. Algunosejemplos de estas nuevas tecnologías los constituyen los microchips para inmunoensayos, para citometríade flujo y, sorprendentemente, para el diagnóstico de resistencia a antibióticos en muestras biológicas, los queutilizan células bacterianas individuales.

En nuestro país, investigadores de la Universidad Nacional de San Martín, conjuntamente con grupos delInstituto Nacional de Tecnología Industrial (INTI), han desarrollado sistemas portátiles para el diagnóstico deenfermedades animales y humanas. Hasta el momento se han producido prototipos que permiten detectaranticuerpos específicos contra la brucelosis y la fiebre aftosa en el ganado, y contra la enfermedad de Chagasy el síndrome urémico hemolítico en humanos (para mayor detalle, visitar la página web http://www.inti.gob.ar/sabercomo/sc107/inti3.php).

Tiempo atrás, una icónica historieta argentina, “El Eternauta”, mostraba a un personaje extraterrestre conmanos que tenían más de los cinco dedos humanos naturales. Este personaje, el “Mano”, era capaz de operara enorme velocidad equipos con paneles plagados de botones y controles, gracias a sus dedos extras. Cuarentaaños más tarde, no nos sorprendemos de ver a nuestros jóvenes manejando sus teclados de tecnologíacelular a gran velocidad en cualquier situación de la vida cotidiana. Parece acertado asumir que en un futurocercano, la microbiología clínica estará tan impactada y modificada por las nanotecnologías como en sumomento lo estuvo por la PCR, el Western blot o las hibridizaciones de ácidos nucleicos. Por lo tanto, seríaprudente comenzar a introducir en el dictado de los cursos de microbiología los conceptos teóricos de lasnuevas nanotecnologías, a fin de despertar el interés de los profesionales jóvenes y de los alumnos de lascarreras con incumbencia en salud. De esa manera, se ayudaría a que los profesionales que en un futuroasistan al cambio de tecnologías puedan hacerlo desde una posición que no solo les permita comprenderlascomo usuarios, sino también perfeccionarlas, participando de los desarrollos tecnológicos correspondientes.

HÉCTOR R. MORBIDONICátedra de Microbiología, Virología y Parasitología

Facultad de Ciencias Médicas

Universidad Nacional de Rosario, Argentina

E-mail: [email protected]

ANA M. JARCátedra de Inmunología

Facultad de Ciencias Veterinarias

Universidad de Buenos Aires, Argentina

E-mail: [email protected]

1- Figeys D, Pinto D. Lab-on-a-chip: a revolution in biological and medical sciences. Anal Chem 2000; 72: 330A-5A.

2- Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 1987;155: 335-50.

3- Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Primer-directed enzymatic amplificationof DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 1988; 239: 487-91. doi:10.1126/science.2448875.

ompA gene of C. pecorum in captive birds 65ISSN 0325-7541

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 65-68INFORME BREVE

Detection of the ompA gene of Chlamydophila pecorumin captive birds in Argentina

MARÍA C. FRUTOS 1*, FERNANDO VENEZUELA 1, XIMENA KIGUEN 1, VIVIANA RÉ 1, CECILIA CUFFINI 1

1Instituto de Virología “Dr. J. M. Vanella”, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba. EnfermeraGordillo Gómez s/n Ciudad Universitaria (5016) Córdoba, Argentina.

*Correspondence. E-mail: [email protected]

RESUMEN

Detección del gen ompA de Chlamydophila pecorum en aves en cautiverio, en la Argentina. Lasbacterias que pertenecen a la familia Chlamydiaceae causan un extenso espectro de enfermedades en una ampliagama de huéspedes, incluidos los seres humanos, otros mamíferos y aves. Sin embargo, se sabe muy poco acercade las infecciones por clamidias en aves de nuestra región. Esta investigación examinó 28 aves clínicamentenormales mantenidas en cautiverio ilegal, que fueron confiscadas en Córdoba, Argentina. El objetivo fue detectarChlamydophila spp. en hisopados cloacales por análisis del gen ompA. La PCR anidada del gen ompA reveló lapresencia de Chlamydophila pecorum en cinco muestras. El análisis de secuencias demostró la presencia delgen ompA de C. pecorum en estas aves. Por el contrario, Chlamydophila psittaci no se detectó. Estas aves puedenser reservorios asintomáticos o portadores subclínicos de C. pecorum. Este es el primer informe de la detección deC. pecorum en la Argentina.

Palabras clave: Chlamydophila pecorum, aves en cautiverio, gen ompA, análisis de secuencias

ABSTRACT

Bacteria belonging to the family Chlamydiaceae cause a broad spectrum of diseases in a wide range of hosts,including humans, other mammals and birds. However, very little is known about chlamydial infections in birds inour region. In the present study, we examined 28 clinically normal birds in illegal captivity that were confiscated inthe province of Córdoba, Argentina. The objective was to detect Chlamydophila spp. in cloacal swabs by geneticanalysis of the ompA gene. Nested-PCR of the ompA gene identified five samples as Chlamydophila pecorum andthe sequence analysis demonstrated the presence of the ompA gene of C. pecorum in these birds. On the otherhand, Chlamydophila psittaci was not detected. These birds could be either asymptomatic reservoirs or subclinicalcarriers of C. pecorum. This is the first report of the detection of C. pecorum in Argentina.

Key words: Chlamydophila pecorum, birds in captivity, ompA gene, sequence analysis

Chlamydophila psittaci, the causing agent of avianchlamydiosis, occurs worldwide and has beendetected in a wide variety of both wild and domesticbirds. However, other clamydiae also have a zoonoticpotential (3).

Chlamydophila pecorum strains have been isolatedfrom ruminants, swine and koalas in several countries.C. pecorum is associated with conjunctivitis,encephalomyelitis, enteritis, pneumonia, polyarthritis,abortion, and reproductive and urinary tract diseases(1, 3, 8). In an assay carried out in free healthy pigeonsin Japan, three fecal samples were found to be C.

pecorum-positive by PCR (7).The epidemiology of Chlamydia infection in animals

in Argentina is unknown. Thus, the aim of the presentstudy was to detect Chlamydia spp. in illegallycaptive birds in Córdoba city, Argentina.

Cloacal swabs were collected from 28 birds livingin illegal captivity without any clinical signs orevidence of chlamydiosis and were referred to theInstituto de Virología, Facultad de Ciencias Médicas,Universidad Nacional de Córdoba, Argentina.According to provincial law N.º 1751, which prohibitscatching and commercialization, these birds wereconsidered illegal possessions. Therefore, they wereconfiscated by the Secretaría Provincial del MedioAmbiente in September 2010. The cotton swabs wereplaced in 1 ml of sucrose-phosphate-glutamate, and200 µl were subjected to DNA extraction using theAccuprep Genomic DNA Extraction Kit (BIONEER,Alameda, CA, USA) according to the manufacturer’sinstructions.

DNA extract (5 µl) was used to amplify a 576-bpfragment of the variable domains II, III and IV of the


GenBankaccesion

L71 Sus scrofa (Wild Boar) polyarthritis Austria Kaltenboeck et al. (1993) M73039

CapraNZ Capra hircus (Goat) unknown New Zeland O’Keefe et al. (2001) AY055109

B13 Bos Taurus (Cow) posthitis Germany Wittenbrink et al. (1990) EU350136

Bahr14 Bos Taurus (Cow) pneumonia Germany Wittenbrink Unpublished data. EU350137

1710S Sus scrofa (Goat) abortion Austria Kaltenboeck et al. (1993) M73033

iB1 Ovis aries (Lamb) no clinical signs France Rodolakis et al. (1989) EU684924

iC2, iC3, iC4 Capra hircus (Goat) no clinical signs France Rodolakis et al. (1989) EU684931

824 Ovis aries (Lamb) conjunctivitis Scotland McClenaghan et al. (1984) EU684922

E58 Bos Taurus (Cow) encephalomyelitis USA McNutt and Waller (1940) EU837071

3638/3 unplished unknown France Yousef Mohamad (2009) GQ228186

4283/3 upplished unknown France Yousef Mohamad (2009) GQ228187Cyanocompsa brissonii

ARG AMB P2 (Ultramarine Grosbeak)(1) no clinical signs Argentina this paper JN16880Paroaria coronata

ARG AMB P6 (Red-crested Cardinal) (1) no clinical signs Argentina this paper JN16881Piranga flava

ARG AMB P7 (Hepatic Tanager) (1) no clinical signs Argentina this paper JN16882Gubernatrix cristata

ARG AMB P9 (Yellow Cardinal) (1) no clinical signs Argentina this paper JN16883Sicalis luteola

ARG AMB P10 (Grassland Yellow – no clinical signs Argentina this paper JN16884finch)(1)

ompA gene of Chlamydophila, using primers 191CHOMP(GCI YTI TGG GAR TGY GGI TGY GCI AC) andCHOMP 371 (TTA GAA ICK GAA TTG IGC RTT IAYGTG IGC IGC), as described by Kaltenböck et al. (2)and modified by Sachse and Hotzel (5). Five sampleswere positive by PCR.

Nested-PCR using primers 218PSITT (GTA ATT TCIAGC CCA GCA CAA TTY GTG)/CHOMP 336 (CCR CAAGMT TTT CTR GAY TTC AWY TTG TTR AT) showedthat none of the samples was positive for C. psittaci

(389 bp) and that five (17.85 %) were positive for C.

pecorum (441 bp) with primers 204 PECOR (CCA ATAYGC ACA ATC KAA ACC TCG C)/CHOMP 336(CCRCAA GMT TTT CTR GAY TTC AWY TTG TTR AT). Thelatter were confirmed by sequencing.

For sequence analysis, the nested-PCR productswere purified with the QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA) and subjected to directnucleotide sequencing reaction in both directions usingan ABI automatic sequencer. The ompA sequencesobtained were submitted to GenBank and relatedness

of newly characterized sequences was assessed byanalysis with 2.2.19 Basic Local Alignment SearchTool (BLAST). Phylogenetic analyses were constructedwith Mega software version 4, using the Neighbor-Joining method and their reliability was assessed bybootstrap (2,000 replicates) (6). Nine referencesequences of the ompA region of the C. pecorum

genome (403 bp) were included in this analysis. Thecorresponding accession numbers, country of origin,host and clinical condition of these isolates are shownin Table I. The tree was rooted with the ompA sequenceof the Chlamydophila abortus strain (accessionnumber CR848038.1).

The phylogenetic analysis showed that the fivesequences clustered with C. pecorum.

The ompA sequence of the C. pecorum strains washighly homologous and shared more than 98 %similarity with each other. Blast searches revealedthat all novel ompA gene sequences shared highhomology with the ompA from the iC2, iC3, iC4, 3638/3 and 4283/3 strains.

Table 1. Characteristics of C. pecorum isolates analyzed or used as reference strains

(1) Narosky and Yzurieta, 2007.

C. pecorum Host Clinical condition Country origin Reference

ompA gene of C. pecorum in captive birds 67

All local strains were characterized by a thymineat position 132, resulting in Asn instead of Lys in theVD IV of the ompA gene (Figure 1). The discrepancyfound in this position could be defined as a marker oflocal strains (Figure 1).

In 98 % of the cases, the bootstrap values in theompA phylogenetic tree supported the conclusion thatall local strains belong to the same group (Figure 2).

This chlamydia has generally been associated withthe detection in ruminants (10). However, Tanaka et

al. detected this chlamydia in birds similar to those

studied here. Nevertheless, the homology with thesesequences could not be assessed because they arenot available at GenBank.

C. pecorum infection did not appear to beassociated with any clinical signs of these birds. Thus,these birds could be either asymptomatic reservoirsor subclinical carriers of C. pecorum.

The epidemiological significance of C. pecorum

infection is not clear to us at this stage. Furtherstudies are needed to estimate the zoonotic role ofthis pathogen.

Figure 2. Phylogenetic three analysis of the ompA region of the C. pecorum genome (403 bp) of the Argentinean isolates and C.abortus as rooted. Strains belonging to this study are initiated by ARG and marked with asterisks. The bootstrap (> 50 %) isindicated in the branch nodes.

Figure 1. Comparison of MOMP VD IV sequences. Dots represent residues that are identical to those in iC2, iC3, iC4, 3638/3, and4283/3 MOMP. The first and the last residues in the IV domain are given as its position in the complete alignment.

C. abortus S26/3


Competing interests

The authors declare that they have no competinginterests.

Acknowledgements: this work was partially supported bySECyT-UNC 05/H181, Mincyt-Cba 1427/09, Mincyt-Pid 113/11.This short communication has been prepared in the context ofthe collaboration promoted by the Provincial Secretariat forEnvironmental Protection and Sustainable Development,Córdoba, Argentina.

REFERENCES

1. Jackson M, White N, Giffard P, Timms P. Epizootiology ofChlamydia infections in two free-range koala populations.Vet Microbiol 1999; 65: 255-64.

2. Kaltenböeck B, Schmeer N, Schneider R. Evidence fornumerous omp1 alleles of porcine Chlamydia trachomatis

and novel chlamydial species obtained by PCR. J ClinMicrobiol 1997; 35: 1835-41.

3. Longbottom D, Coulter L. Animal chlamydiosis and zoonoticimplications. J Comp Pathol 2003; 128: 217-44.

4. Narosky T, Yzurieta D. Fam. Emberizidae. In: Vázquez Mazzini,editores. Guía para la identificación de aves de Argentina yde Uruguay, 15a edición. Buenos Aires, Argentina, VázquezMazzini, 2007, p. 265-75.

5. Sachse K, Hotzel H. Detection and differentiation ofChlamydiae by nested-PCR. Methods Mol Biol 2002; 216:123-36.

6. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. MEGA4: Molecularevolutionary genetics analysis (MEGA) software version4.0. Mol Biol Evol 2007; 24: 1596-9.

7. Tanaka C, Miyazawa T, Watarai M, Ishiguro N. Bacteriologicalsurvey of feces from feral pigeons in Japan, J Vet Med Sci2005; 67: 951-3.

8. Yousef Mohamad K, Rodolakis A. Recent advances in theunderstanding of Chlamydophila pecorum infections,sixteen years after it was named as the fourth species ofthe Chlamydiaceae family. Vet Res 2010; 41: 27-37.

Recibido:30/8/2011- Aceptado: 4/5/2012

Salmonella Infantis hipoinvasiva y persistente 69ISSN 0325-7541


Dos aislamientos de Salmonella Infantis multirresistentesse comportan como hipoinvasivos pero con elevada

proliferación intracelular

JOSÉ A. DI CONZA 1,2*, MARTA E. MOLLERACH1, GABRIEL O. GUTKIND1, JUAN A. AYALA3

1Facultad de Farmacia y Bioquímica - Universidad de Buenos Aires, Junín 956 (1113) Ciudad Autónoma de Buenos Aires;2 Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas - Universidad Nacional del Litoral, Paraje el Pozo (3000) Santa Fe, Argentina;3Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa”. Consejo Superior de Investigaciones Científicas, (28049) Madrid, España.

*Correspondencia. E-mail: [email protected]

ABSTRACT

Two multidrug-resistant Salmonella Infantis isolates behave like hypo-invasive strains but have

high intracellular proliferation. In this work, plasmid-encoded virulence factors in two Salmonella Infantisisolates carrying multiresistance plasmids were investigated. In addition, their invasion and proliferative ability innon-phagocytic cells was studied. None of them showed the typical determinants of virulence plasmids (spv

operon). The invasion assays of S. Infantis isolates on eukaryotic cells showed a decreased ability to invade butthey remained and proliferated in the cytoplasm regardless of having used a permissive (HeLa) or non-permissive(NRK) cell line. Finally, there was no microscopic evidence suggesting a bactericidal effect of these eukaryotic celllines on the isolates tested.

Key words: Salmonella Infantis, multiresistance, invasion ability, intracellular proliferation

RESUMEN

En este trabajo se investigó la presencia de determinantes característicos de plásmidos de virulencia en dosaislamientos clínicos de Salmonella Infantis portadores de plásmidos de multirresistencia. Además, se estudió lacapacidad de invasión y proliferación en células eucariotas no fagocíticas. Ninguno de los aislamientos de S.Infantis mostró los determinantes genéticos que caracterizan a los plásmidos de virulencia para este género(operón spv). Los ensayos de invasión sobre líneas celulares eucariotas mostraron que los aislamientos de S.

Infantis presentan una capacidad de invasión disminuida pero persisten y proliferan en el citoplasma,independientemente de utilizar una línea celular permisiva (HeLa) o no permisiva (NRK) para tal fin. Finalmente,no se observaron indicios microscópicos que podrían hacer sospechar un efecto bactericida de estas líneascelulares sobre los aislamientos estudiados.

Palabras clave: Salmonella Infantis, multirresistencia, capacidad de invasión, proliferación intracelular

Las especies de Salmonella son patógenosintracelulares facultativos y generalmente colonizanmamíferos, aves y reptiles. En la mayoría de lasinfecciones producidas en humanos, se desarrolla unagastroenteritis autolimitada que cursa con multiplicaciónbacteriana dentro de la submucosa intestinal y diarrea(9, 10). En algunos casos, la invasión del microorganismopuede causar septicemia; el patógeno puede persistiren sangre y provocar infecciones crónicas (10).

Algunos genes que codifican los factores devirulencia residen dentro de grandes plásmidos devirulencia. Estos plásmidos se han encontrado soloen unas pocas serovariedades de Salmonella enterica:Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium,

Salmonella Dublin y Salmonella Choleraesuis (2).

Hasta el momento, no ha habido comunicación deestos plásmidos en Salmonella Infantis.

Se cree que la presencia de estos plásmidos esnecesaria durante la fase sistémica de la enfermedadcausada por Salmonella spp. no tifoideas. Los plásmidosde virulencia contienen una región altamente conservadade 7,8 kb denominada spv (Salmonella plasmid

virulence). El operón spv está formado por cinco genesdesignados spvRABCD. A su vez, se han caracterizadodos replicones independientes, repB y repC. Ambosson funcionales y pueden coexistir o estar presentesen forma independiente (14, 15).

El efecto de los plásmidos de virulencia en laproliferación de Salmonella en macrófagos escontrovertido (11, 15). Existen evidencias de que los


genes spv capacitan a la cepa para infectar bazo ehígado, por aumento en la replicación bacterianadentro de la célula del hospedador. Cuando S. enterica

infecta otros sitios diferentes del intestino y causauna enfermedad sistémica, se requiere una terapiarápida y adecuada. El cuadro se complica aún mássi la cepa aislada es resistente a múltiples drogas.Desde un principio se ha pensado que estos plásmidosde virulencia están poco relacionados con la resistenciaa los antibióticos, pero en la actualidad existen informessobre la presencia de grandes plásmidos híbridos devirulencia/resistencia (2, 3) en las serovariedadesTyphimurium y Choleraesuis, y se postula que estossurgieron como resultado de eventos de recombinaciónentre diferentes plásmidos (12, 14). Poco se sabesobre la presencia simultánea de determinantes devirulencia en plásmidos de resistencia en otrasserovariedades.

El objetivo de este trabajo fue investigar la presenciade determinantes característicos de plásmidos devirulencia en dos aislamientos clínicos de Salmonella

Infantis multirresistentes, y comparar el comportamientode invasión y proliferación intracelular de dichosaislamientos en distintas líneas de células eucariotas.

Los dos aislamientos clínicos de Salmonella enterica

serovar Infantis fueron recuperados de pacientespediátricos internados en el Hospital de Niños “RicardoGutiérrez” de la ciudad de Santa Fe, en los años 1996 y

1997. Estos aislamientos (denominados S07 y S21)presentan, al menos, un plásmido conjugativo quecodifica múltiples mecanismos de resistencia. El perfilde resistencia a los antibióticos y los determinantesgenéticos asociados se resumen en la Tabla 1 (5, 6).

Para identificar plásmidos de virulencia, se investigópor PCR e hibridación sobre colonias la presencia delgen de virulencia plasmídico spvC (por ser el másconservado entre las distintas serovariedades dentrode la región spv) y de los replicones característicosrepB y repC. Las condiciones de PCR, los cebadoresempleados y el tamaño de los fragmentos esperadosfueron los descritos por Chu et al. (4). Como controlde amplificación e hibridación se utilizó la cepa S.

Typhimurium OU5045, cepa de laboratorio C5, cedidagentilmente por el grupo de trabajo responsable de lapublicación recién citada.

Además de los aislamientos clínicos de Salmonella

S07 y S21, se incluyó también la cepa de S. TyphimuriumSL1344, portadora del plásmido de virulencia; estacepa fue utilizada como referente para los ensayosde invasión y proliferación bacteriana en célulaseucariotas (7, 13).

Los aislamientos de S. Infantis S07 y S21 nopresentaron ninguno de los marcadores genéticosevaluados, lo cual indica que estas cepas no portaríanun plásmido de virulencia característico. Estos resultadosconcuerdan con los publicados por otros autores (2,

Cepas S07 S21

Espécimen clínico Material fecal Sangre

Perfil de AMP, PIP, CEF, GEN, KAN, AMP, PIP, CEF, CXM, CTX,resistencia(1) TOB, NET, NIT, SUL CAZ, FEP, AZM, GEN, KAN,

TOB, NET, NIT, SULBLEE(2) (-) (+)

blaTEM-1(3) (+) (+)

blaOXA-2(4) (+) (+)

blaCTX-M-2(5) (-) (+)

aac(6´)-Ib(6) (+) (+)

sul1(7) (+) (+)

intI1(8) (+) (+)

ISCR1(9) (-) (+)

Tamaño plásmido >55 kb 73 kb

TABLA 1. Patrón de resistencia y determinantes genéticos asociados en los aislamientos clínicos de SalmonellaInfantis S07 y S21

(+) presente, (-) ausente; (1)AMP: ampicilina, PIP: piperacilina, CEF: cefalotina, CXM: cefuroxima, CTX: cefotaxima,CAZ: ceftacidima, FEP: cefepima, AZM: aztreonam, GEN: gentamicina, KAN: kanamicina, TOB: tobramicina, NET:netilmicina, NIT: nitrofurantoína, SUL: sulfonamida; (2)detección fenotípica de ß-lactamasa de espectro extendido(BLEE); (3)gen que codifica la ß-lactamasa de espectro ampliado TEM-1; (4)gen que codifica la ß-lactamasa OXA-2;(5)gen que codifica la BLEE CTX-M-2; (6)gen que codifica una 6´-N-acetiltransferasa que confiere resistencia aaminoglucósidos; (7)gen que confiere resistencia a sulfonamidas; (8)gen que codifica la integrasa IntI1 característica delos integrones de resistencia clase 1; (9)secuencia de inserción ISCR1 que forma parte de integrones clase 1 inusualeso complejos.

Salmonella Infantis hipoinvasiva y persistente 71

15), quienes destacan que estos plásmidos, al parecerespecíficos de serovariedad, se encuentran con mayorfrecuencia en las serovariedades Typhimurium,Choleraesuis y Enteritidis, y hasta el presente, no sedescribió ningún caso en la serovariedad Infantis. Lacepa de referencia S. Typhimurium SL1344 mostró lapresencia del gen spvC y solo uno de los replicones,repB.

Si bien los aislamientos de S. Infantis estudiados nopresentan el gen spvC, no puede descartarse la presenciade otros genes del operón spv o de marcadores devirulencia no conocidos en el plásmido de resistencia.

Posteriormente, se efectuaron estudios in vitro deinvasión y proliferación intracelular con los aislamientosS21 y S07 en cultivos de células eucariotas no fagocíticas(línea epitelial HeLa, ATCC CCL2, y fibroblastos NRK,ATCC CRL1570). Los ensayos de infección bacterianade células eucariotas se realizaron aplicando algunasmodificaciones a la metodología utilizada por Martinez-Moya et al. (13). Brevemente, las monocapas de célulaseucariotas se obtuvieron en una placa de 24 pocillos,a una densidad entre 5 y 8 x 104 células/pocillo. Antesde proceder a la infección, estas células se lavaroncon buffer fosfato salino (PBS) pH = 7,4 y se añadiómedio fresco MEM o DMEM, más 10 % de suero fetalbovino (Gibco) (SFB). Luego se añadió un volumenconocido de bacterias (crecidas en medio LB durante14 a 16 h, a 37 ºC y sin agitación), a razón de 10bacterias/células, aproximadamente, y se incubó a37 ºC en atmósfera de CO2 al 5 % durante 30 minutos.Las células infectadas se lavaron con PBS (3 veces)y se incubaron durante 2 h en MEM o DMEM con 10 %de SFB, el cual contenía 300 mg/ml de amicacina(Sigma Ch. Co., EE.UU.). Este antibiótico mata a lasbacterias extracelulares sin afectar la viabilidad de lasbacterias intracelulares, ya que no penetra la membranacitoplasmática eucariota. A las 2 h posinfección, lascélulas se lavaron con PBS (3 veces) y se añadió MEMo DMEM con 10 % de SFB adicionado con 200 mg/mlde amicacina. Se incubó en las mismas condicioneshasta cumplir las 24 h de infección. Para determinarel número de bacterias viables intracelulares a las 2 ya las 24 h de infección, las células contenidas en 2pocillos diferentes se lavaron 3 veces con PBS, seañadió Triton X-100 1 % (100 ml) y se incubó 5 minutosa 37 ºC. Tras añadir 400 ml de PBS y agitar, se realizarondiluciones seriadas en PBS para su posterior recuentoen placas de LB. Los resultados de estos ensayosfueron comparados con los obtenidos con cepas dereferencia: S. Typhimurium SL1344, portadora deplásmido de virulencia, y la cepa isogénica curada de

plásmido SV4277 (gentileza del Dr. David Cano,Sevilla, España). Además, se incluyó a la cepa SV21obtenida mediante transformación de la cepa SV4277con el plásmido de multirresistencia de S21 (5).

Se realizaron entre 3 y 5 ensayos de infección porcepa bacteriana. La capacidad de invasión (Cinv) secalculó dividiendo el número de bacterias intracelularesviables a las 2 h posinfección por el número de bacteriasextracelulares añadidas para infectar, y el índice deproliferación (Ipro) se calculó dividiendo el número debacterias viables intracelulares a largo tiempo (24 h)por el número de bacterias viables intracelularesobtenido a las 2 h. Los resultados se trataronestadísticamente efectuando el análisis de la varianzade un factor fijo (ANOVA) y realizando el test a

posteriori (test de Dunnett) con el programa “GraphPadInStat tm” v2.02.

Sobre las células HeLa, la cepa virulenta SL1344presentó una Cinv de 0,15 y el número de bacteriasviables intracelulares (Ipro) aumentó 4,8 veces a las24 h de infección. La cepa isogénica SV4277 mostróresultados similares. Sin embargo, los aislamientosclínicos S07 y S21 mostraron una Cinv al menos 5 vecesmenor, y el Ipro fue hasta 10 veces mayor que en lascepas controles (Tabla 2). Resultados similares seobservaron con la cepa SV21. El análisis de la varianzareveló que existen diferencias significativas en lacapacidad de invasión (p < 0,0001) y en el índice deproliferación (p = 0,0361) entre los distintos gruposbacterianos. Al realizar el test a posteriori, se observarondiferencias significativas en cada una de las cepas conplásmidos de multirresistencia frente a ambos controles,tanto en la capacidad de invasión (p < 0,01), comoen la de proliferación intracelular (p < 0,05).

El notorio aumento en el Ipro de las cepas clínicasen células HeLa motivó el estudio de infección sobrela línea celular NRK, considerada como no permisivapara la proliferación intracelular de la cepa SL1344(13). Los resultados del ensayo corroboraron la faltade proliferación de la cepa SL1344 en esta línea celular.La variante SV4277 presenta un Ipro < 1, lo que estaríaindicando no solo la falta de proliferación, sino tambiénla menor persistencia intracelular. Pese a esto, losaislamientos S07 y S21 mostraron una Cinv menor (igualque lo observado en células HeLa) y un Ipro entre20-50 veces mayor que la cepa SL1344 (Tabla 2). Elanálisis de la varianza de un factor fijo para ambosparámetros mostró que existen diferencias altamentesignificativas (p < 0,0001) entre los distintos gruposbacterianos. Al realizar el test a posteriori, se observarondiferencias altamente significativas (p < 0,01) de los


aislamientos clínicos frente a los controles en ambasdeterminaciones.

Carlson et al. (1) clasifican a las cepas comohipoinvasivas si existe una reducción de la invasiónrelativa de al menos un 50 % respecto de lo observadocon las cepas controles. Si respetamos este criterio,se puede considerar a los aislamientos clínicosanalizados como hipoinvasivos, independientementede la línea celular empleada. Esta característica yaha sido descrita en algunos aislamientos clínicosmultirresistentes de S. Typhimurium DT104 (y otrosfagotipos) estudiados sobre la línea celular Hep-2.

Los estudios de virulencia sobre modelos murinosmostraron que las cepas hipoinvasivas presentan unaleve disminución en la capacidad de causar letalidad (1).

Por otro lado, en este trabajo se advirtió un aumentode la proliferación intracelular de los aislamientos deSalmonella Infantis, inclusive en la línea eucariotapreviamente descrita como no permisiva para tal fin.In vitro se ha observado que las células epiteliales,a diferencia de determinadas líneas de fibroblastos,han resultado ser más permisivas para el crecimientointracelular bacteriano. Hay evidencias que sugierenque tanto factores del huésped como del patógenocontribuyen a un ajuste fino de la tasa de crecimientointracelular (8); de qué modo estos factores seinterrelacionan para este ajuste es un tema aún pococonocido.

Para profundizar sobre el comportamiento de losaislamientos internalizados en ambas líneas celulares,se analizó por microscopía de inmunofluorescenciaconfocal la integridad, la morfología y el número debacterias intracelulares a las 24 h posinfección. Lasbacterias se detectaron por fluorescencia mediantetinción del ADN con DAPI (que también tiñe el núcleocelular) y con anticuerpo de conejo anti-LPS específico(Difco Laboratories, EE.UU.), donde la reaccióninmunológica se completa con un segundo anticuerpo

de cabra anti-IgG de conejo, marcado con isotiocianatode fluoresceína (FITC) (Sigma). El ensayo fue realizadocomo se describió previamente (6, 13).

En el interior de las células HeLa, S. TyphimuriumSL1344 prolifera activamente manteniendo su morfologíabacilar normal, mientras que en las células NRK nose aprecia crecimiento bacteriano y la bacteria alterasu morfología de bacilar a cocoide. Estas mismasobservaciones fueron señaladas por otros autorescomo Martínez-Moya et al. (13), al ensayar esta cepafrente a las mismas líneas celulares. Además, dichosautores han advertido, mediante microscopía electrónicade transmisión, claros signos de degradación y lisisbacteriana dentro de las células no permisivas NRK y3T3 (efecto bactericida de las líneas celulares).

Sin embargo, S. Infantis S21 se encuentra prolife-rando activamente tanto en el citoplasma de HeLa comode NRK (Figura 1). A su vez, las bacterias intracelularesmantienen su morfología bacilar en ambas líneas. Laausencia de estructuras filamentosas o redondeadasdentro del citoplasma celular sugiere una falta deactividad bactericida de la célula NRK sobre S21.

Un paso esencial en el proceso de patogenicidadde Salmonella spp. está sujeto a la capacidad delmicroorganismo para inducir su absorción por las célulasepiteliales en el intestino. Evaluando los valores de Cinvobtenidos, los aislamientos de S. Infantis parecenmenos agresivos que las cepas controles. Sin embargo,sabiendo que se requiere de la proliferación intracelularpara poder manifestar la máxima capacidad devirulencia, los resultados observados en los valores deIpro marcan la tendencia opuesta.

En principio, estas características podrían estar ligadasa factores desconocidos presentes en el plásmido demultirresistencia de S21, ya que los resultados deinvasión y proliferación se repitieron al realizar los ensayosde infección con la cepa transformante SV21.

En la actualidad, se considera la secuenciación

Células HeLa Células NRK

Capacidad de Índice de Capacidad de Índice deinvasión (%)(1) proliferación(1) invasión (%)(1) proliferación(1)

SL1344 0,145 ± 0,023 4,80 ± 0,68 0,299 ± 0,063 1,26 ± 0,39

SV4277 0,177 ± 0,031 3,25 ± 0,78 0,240 ± 0,075 0,60 ± 0,17

S07 0,027 ± 0,012 43,63 ± 26,58 0,079 ± 0,016 48,59 ± 2,73

S21 0,026 ± 0,006 40,38 ± 32,54 0,081 ± 0,005 21,76 ± 2,98

SV21 0,031 ± 0,013 36,31 ± 20,37 0,061 ± 0,019 32,84 ± 5,99

TABLA 2. Capacidad de invasión e índice de proliferación obtenidos en las líneas HeLa y NRK

(1)Los resultados se expresan como la media aritmética dentro de un intervalo dado por la desviación estándar(X ± SD).

Cepas

Salmonella Infantis hipoinvasiva y persistente 73

total de este plásmido para evaluar la presencia desecuencias comunes o nuevos factores bacterianosque podrían influir en los eventos de invasión,proliferación o persistencia intracelular al infectarcélulas eucariotas no fagocíticas.

Agradecimientos: este trabajo fue financiado con subsidiosANPCyT y UBA otorgados a GG; con proyecto BFU2009-9200del MICINN, Gobierno de España, otorgado a JAA, y confondos de la UNL otorgados a JDC. GG, MM y JDC sonmiembros de la carrera de investigador científico de CONICET.

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Figura 1. Microscopía de inmunofluorescencia. Las flechasmarcan la morfología bacilar de S. Infantis S21 en células nopermisivas NRK (aumento 600X) procesadas 24 h posinfección.Imagen obtenida con: (I) contraste de fase y tinción con DAPI(marcaje de ADN tanto de las células eucariotas como de lasbacterias); (II) tinción con DAPI; (III) inmunofluorescenciaempleando un anticuerpo primario anti-LPS de Salmonella y unanticuerpo secundario anti-IgG de conejo marcado con FITC.


12. Herrero A, Mendoza MC, Threlfall EJ, Rodicio MR. Detectionof Salmonella enterica serovar Typhimurium with pUO-StVR2-like virulence-resistance hybrid plasmids in theUnited Kingdom. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2009; 28:1087-93.

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Recibido:8/11/2011- Aceptado:12/2/2012

Canarypox recombinante como vacuna antirrábica 75ISSN 0325-7541

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 75-84ARTÍCULO ORIGINAL

Obtención y evaluación preliminar de un virus canarypoxrecombinante como candidato a vacuna antirrábica

1Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET); 2Instituto de Biotecnología, Instituto Nacional deTecnología Agropecuaria (CICVyA-INTA). Casilla de Correo 25 (1712) Castelar, Buenos Aires; 3Servicio de Vacuna Antirrábica,

Instituto Nacional de Producción de Biológicos (ANLIS), “Dr. Carlos G. Malbrán”. Av. Vélez Sarsfield 563 (1282), CiudadAutónoma de Buenos Aires; 4Departamento de Rabia y Pequeños Animales de la Dirección General de Laboratorios yControl Técnico (DILAB), Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA). Av. Fleming 1653 (1640)

Martínez, Buenos Aires, Argentina.*Correspondencia. E-mail: [email protected]

RESUMEN

En la Argentina, la rabia está circunscripta a algunas provincias del norte. La disponibilidad de nuevas vacunasque eliminen la manipulación del virus rábico y que permitan el control de la enfermedad es de importanciaestratégica nacional y regional. Las vacunas basadas en poxvirus recombinantes se han utilizado con éxito comovacunas antirrábicas a nivel mundial. Si bien estos sistemas no están disponibles comercialmente, la plataformade obtención de virus canarypox (CNPV) recombinantes ya ha sido implementada en nuestro laboratorio. Elobjetivo de este trabajo fue obtener y evaluar un candidato a vacuna antirrábica basado en CNPV recombinantesque expresan la glicoproteína G (RG) del virus rábico (RV). Se construyó un virus recombinante que expresa lasecuencia codificante de RG (CNPV-RG). La inoculación de ratones con este virus indujo altos títulos de anticuerposseroneutralizantes de RV (3,58 y 9,76 UI/ml después de una o dos inmunizaciones, respectivamente) y protegióal 78 % de los animales desafiados intracerebralmente con RV. Además, se determinó que el CNPV-RG poseeuna potencia relativa de 3,5 UI/ml. Los resultados obtenidos constituyen la primera etapa en la evaluación delCNPV-RG como candidato a vacuna antirrábica. Se requerirán nuevos ensayos para confirmar su utilidad enespecies de interés veterinario.

Palabras clave: virus canarypox recombinante, vacuna antirrábica, glicoproteína G

ABSTRACT

Development and preliminary assessment of a recombinant canarypox virus as an antirabic vaccine

candidate. In Argentina, rabies is limited to some northern provinces. Availability of new vaccines abolishing thehandling of the rabies virus and allowing disease control has regional and national strategic importance. Vaccinesbased on recombinant poxviruses have been successfully used as antirabic vaccines worldwide. Although thesesystems are not commercially available, the platform to obtain recombinant canarypox viruses (CNPV) has beenpreviously set up in our laboratory. The aim of this work was the development and evaluation of an antirabicvaccine candidate based on recombinant CNPV expressing the rabies virus (RV) glycoprotein G (RG). Arecombinant virus (CNPV-RG) expressing the RG coding sequence was designed. Inoculation of mice with thisvirus induced high RV seroneutralizing antibodies (3.58 and 9.76 IU/ml after 1 or 2 immunizations, respectively)and protected 78% of intracerebrally RV-challenged animals. In addition, it was determined that CNPV-RG has arelative potency of 3.5 IU/ml. The obtained results constituted the first stage of CNPV-RG evaluation as antirabicvaccine candidate. Further assays will be necessary to confirm its utility in species of veterinary interest.

Key words: recombinant canarypox virus, rabies vaccine, glycoprotein G

FLAVIA ZANETTI1,2*, LILIANA RUDAK3, MATÍAS MICUCCI3, DANIELA CONTE GRAND1,2, ANDREA LUQUE4, SUSANARUSSO4, OSCAR TABOGA1,2, OSCAR PÉREZ3, GABRIELA CALAMANTE2

INTRODUCCIÓN

La rabia es una enfermedad infecto-contagiosa deevolución aguda, habitualmente mortal. Es causadapor el virus rábico (RV), el cual se transmite entrealgunas especies de animales de sangre caliente y elhombre. De este modo, la rabia constituye una de lasprincipales zoonosis con distribución mundial,responsable de aproximadamente 60 000 muerteshumanas por año (32, 41).

En la década del sesenta, la República Argentinapresentaba una delicada situación sanitaria con almenos 12 provincias con focos activos de transmisiónde rabia canina. Frente al aumento del número de casos,en 1976 se fortaleció el Programa de Control de Rabiatomando medidas de intervención basadas en lavacunación masiva de los perros (principal reservorioy vector de rabia urbana), la eliminación de los reservoriossin dueño y sin control, la vigilancia epidemiológica yla educación sanitaria de la población (21). La citada


campaña de vacunación permitió, hacia mediadosde los años 90, controlar la transmisión de la rabia,al limitar su presencia a algunas provincias del norteargentino. Aunque desde entonces se registra unnúmero reducido de casos de rabia canina, la enfermedadaún permanece presente en esa región del país debidoa la existencia de especies silvestres (principalmentezorros y murciélagos hematófagos e insectívoros) quefuncionan como reservorios del virus y que esporádicamenteinfectan al hombre, a animales domésticos y a otrosde interés económico (bovinos, equinos, porcinos,ovinos y caprinos).

La vacunación es el método preventivo máseconómico y efectivo para la profilaxis y el control delas enfermedades infecciosas. Con la vacunación seestimulan específicamente los mecanismos de defensadel organismo antes de la interacción con el patógeno,de manera que el hospedador inicie una rápida respuestafrente a la infección. En la Argentina, las vacunasantirrábicas de primera y segunda generación para usoveterinario emplean como agente inmunizante al virusinactivado luego de su amplificación en tejido nerviosode animales o en cultivos celulares, respectivamente(21). Si bien estas vacunas son efectivas, presentanciertas desventajas relacionadas con su obtención yadministración. Esto se debe a que la producciónrequiere la utilización y el sacrificio de un gran númerode animales, o la manipulación de grandes cantidadesdel patógeno en plantas productoras, con estrictascondiciones de bioseguridad. Esto implica que elpersonal debe estar específicamente entrenado yposeer inmunidad, con un título de anticuerposprotectores validado. Entre las desventajas inherentesa su aplicación podemos mencionar la aparición dereacciones adversas locales asociadas a losadyuvantes presentes en la formulación y la posibilidadde transmisión de patógenos no detectados (virus,bacterias, priones).

La necesidad de disponer a nivel mundial devacunas antirrábicas seguras, efectivas y de bajocosto ha llevado al desarrollo y evaluación de nuevosinmunógenos desde hace aproximadamente tresdécadas. En este sentido, existen numerosos informesen la bibliografía que describen la utilización de vectoresvirales (replicativos o no) para el clonado y la expresiónde la glicoproteína G del virus rábico, principal antígenoresponsable de inducir inmunidad celular y humoralprotectora en el hospedador (6, 17, 20, 36, 39, 42). Deeste modo, se obtuvieron virus recombinantes basadosen adenovirus canino (2, 15, 16, 19) y humano (24,38), en herpesvirus canino (43), en virus rábico no

replicativo (4), en virus de la pseudorrabia (44) y en lossiguientes poxvirus: vaccinia (8, 18, 37); virus vacciniamodificado, cepa Ankara (Modified vaccinia virus: MVA)(35); racoonpox (viruela de mapache) (9), fowlpox(viruela de ave de corral) (30) y canarypox (viruela decanario) (29). La inmunización de ratones y otras espe-cies con estos vectores confirió protección frente aldesafío letal con virus rábico.

Una ventaja destacable de los avipoxvirus, comoel virus fowlpox (FWPV) o el canarypox (CNPV), essu capacidad de infectar productivamente solo a sushospedadores naturales. Estos virus pueden iniciar unainfección abortiva por inoculación en especies noaviares o por infección de líneas celulares derivadasde mamíferos. Sin embargo, los antígenos foráneosinsertados en estos vectores pueden ser sintetizados,procesados y presentados en la superficie de célulasno permisivas y desencadenar repuestas inmunes detipo celular y humoral (26, 30). De este modo, lainmunización se consigue en ausencia de replicaciónviral, con lo que se elimina la posibilidad de unadiseminación del vector desde los animales vacunadoshacia animales susceptibles o hacia el medio ambiente.Además, el adecuado perfil de seguridad de lasvacunas basadas en CNPV recombinantes estádemostrado en estudios del National Institute of Health

(NIH) para su utilización como vacuna contra el sida ycomo terapia antitumoral en humanos (http://c l in ica l t r ia ls.gov ;h t tp : / /www. iav i .o rg /Pages/home.aspx). En particular, recientemente se publicaronlos resultados de un ensayo clínico (RV144, fase III)realizado en Tailandia, que evalúa una vacuna contraHIV basada en CNPV recombinantes. Por primera vez,se mostró cierta eficacia (31,2 %) en la prevención dela infección por HIV (34).

En este trabajo describimos el desarrollo local deun candidato a vacuna antirrábica basado en un viruscanarypox recombinante que expresa la glicoproteínaG del virus rábico. La capacidad inmunogénica yprotectora del virus recombinante se evaluó en elmodelo murino. La potencia del candidato vacunal secomparó con la potencia de una vacuna antirrábicade uso veterinario en la Argentina.

MATERIALES Y MÉTODOS

Virus y célulasLas líneas celulares Vero (American Type Culture Collection,

ATCC CCL-81) y BHK-21 (ATCC CCL-10) se propagaron enmedio mínimo esencial de Eagle (MEM-E, Life TechnologiesInc., NY, EE.UU.) suplementado con 10 % de suero fetal bovino(Internegocios, Argentina).

Canarypox recombinante como vacuna antirrábica 77

Los cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo(FEP) se prepararon a partir de embriones de 11 días, libresde patógenos específicos (SPF), adquiridos en el InstitutoRosenbusch de la Argentina. Estos se crecieron en medio 199(Life Technologies Inc.) suplementado con 10 % de suero fetalbovino.

La cepa vacunal Abbatista 95 del CNPV, gentilmente cedidapor el Dr. Samus, se utilizó para la obtención de virus canarypoxrecombinantes. La cepa Abbatista 95 se comercializa en laArgentina como vacuna viva atenuada –liofilizada– contra ladifteroviruela del canario (Diftervac®, Laboratorios LaDiPreVet,La Plata) y, en nuestro laboratorio, fue adaptada al crecimientoen FEP.

La cepa Challenge Virus Standard del virus rábico, amplificadaen cerebro de ratón, fue provista por la Organización Panamericanade la Salud (OPS). En el INPB ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”,este virus se propagó en cerebro de rata lactante (CVS) yluego se adaptó al crecimiento en cultivos de células Vero (CVS-Vero). Esta cepa es uno de los componentes de las vacunasantirrábicas de primera generación que se utilizan hasta la fechaen la Argentina.

La vacuna antirrábica de referencia nacional elaborada porSENASA, cepa Virus Pasteur propagada en monocapas decélulas BHK-21 clon 13 e inactivada por tratamiento conbromoetilenimina (BEI, Merck, Alemania) 0,1 mM (PV-BHK 3),se estandarizó con la vacuna de referencia internacional 5º

patrón de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y se usócomo control en los ensayos de potencia.

Construcción del vector de transferencia VT-C-GUS-RG

El ARN viral de la cepa CVS-Vero se extrajo con el reactivocomercial de Trizol®LS (Invitrogen, CA, EE.UU.) a partir delsobrenadante del cultivo de células Vero infectadas. Unaalícuota del ARN extraño se utilizó como templado para laobtención del ADN copia en una reacción de transcripciónreversa junto con hexámeros al azar como oligonucleótidosiniciadores. Posteriormente, la región genómica codificante de laglicoproteína G (RG) se amplificó por PCR en dos fragmentos de922 y 673 pares de bases, utilizando los pares de oligonucleótidosiniciadores RG1 (1-17)-RG4 (903-922) y RG3 (903-922)-RG2(1559-1575), respectivamente. Estos cebadores fueron diseñadossobre la base de las secuencias de otras cepas CVS del virusrábico, depositadas en el GenBank (CVS: AJ506997, CVS-B2c:AF042824, CNV-N2c: AF325714). Las secuencias y característicasde los oligonucleótidos utilizados en este trabajo se indican enla Tabla 1.

Los productos de amplificación de PCR se clonaron en elvector comercial pGem®-T Easy (Promega, Madison, EE.UU.)y se liberaron nuevamente por digestión con las enzimas EcoRIy NsiI o NsiI y SmaI (New England BioLabs, Inc., MA, EE.UU.).Los fragmentos obtenidos se subclonaron en el vector pE/L–disponible en nuestro laboratorio (5)– digerido con las enzimasEcoRI y SmaI. Esto se realizó mediante una reacción de ligacióntriple, de manera de obtener la secuencia completa del gen RGbajo regulación del promotor sintético temprano-tardío E/L depoxvirus (Figura 1A). El cassette de expresión E/L-RG-t se liberópor digestión con la enzima NotI y se subclonó en el mismositio del vector VT-C-GUS (5) digerido parcialmente, con lo quese obtuvo el vector de transferencia denominado VT-C-GUS-RG (Figura 1B). Este vector porta, además, un cassette parala expresión del gen marcador uidA, cuyo producto es laenzima β-glucuronidasa bacteriana (GUS), bajo regulación delpromotor H6 de poxvirus. Ambas construcciones se encuentranflanqueadas por secuencias correspondientes al gen noesencial CNPV 048, para permitir la recombinación homólogain vivo (5). La identidad del gen codificante de RG se corroborópor secuenciación, utilizando el equipo ABI PRIS® 3130Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Japón).

Obtención y selección de virus canarypoxrecombinantes

Un cultivo de FEP (80-90 % de confluencia) se infectó conCNPV en una relación de una partícula viral por cada 10 células.A las 2 h posinfección, el cultivo infectado se transfectó conuna mezcla de 10 μg del ADN purificado de VT-C-GUS-RG y31 μl de lipofectina (Invitrogen), y se incubó a 37 ºC en atmósferade 5 % de CO2 hasta la visualización de efecto citopático. Elvirus recombinante producido, denominado CNPV-RG, seseleccionó por su capacidad de generar placas de lisis azulescuando el sustrato de la enzima marcadora GUS, X-Gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónido, Inalco, Italia) se agregóen el cultivo agarizado (5, 11). Posteriormente, el virus fuepurificado por seis pasajes sucesivos bajo agar hasta obtenerun stock homogéneo (100 % de placas de lisis azules).

Caracterización molecular del virus CNPV-RG por PCR

Con los virus CNPV y CNPV-RG se infectaron monocapasde FEP en una relación de una partícula viral por cada 10células. Cuando el efecto citopático fue de aproximadamente100 %, las monocapas se lavaron y se resuspendieron enPBS (NaCl 0,14 M; KCl 0,003 M; Na2HPO4 0,008 M; KH2PO4

0,0015 M; pH 7,2). A partir de una alícuota de estassuspensiones celulares se realizó la extracción de ADN total

Oligonucleótidos Secuencia nucleotídica Sitios de Fuenterestricción

RG1 (sentido) CAGAATTCATGGTTCCTCAGGTTCT EcoRI Este trabajo

RG2 (antisentido) ATTCCCGGGTCACAGTCTGRTCTCA SmaI Este trabajo

RG3 (sentido) GTCTGGATGCATTAGAGT NsiI Este trabajo

RG4 (antisentido) ACTCTAATGCATCCAGAC NsiI Este trabajo

BPC1 (antisentido) TCCGCTTGTACAGATGGT (5)

CPC1 (sentido) GATTGAAGATACAGGATTCT Este trabajo

outGUS (antisentido) CAGCCTCGGGAATTGCTAC (5)

Tabla 1. Secuencia de los oligonucleótidos utilizados

La secuencia de los oligonucleótidos se indica en orientación 5´ - 3´. En letra subrayada se señalan los sitios derestricción incorporados a la secuencia. En negrita se señalan los codones de iniciación (ATG) y el tripletecomplementario al de terminación (TCA)


por el método descrito por Dellaporta et al. (7). Para comprobarla pureza del stock viral recombinante, el material genéticoobtenido se utilizó como templado en una reacción de PCRdiseñada para obtener dos productos de amplificación de distintotamaño, según se esquematiza en la Figura 2A. La reacción serealizó en presencia de los oligonucleótidos BPC1, outGUS yCPC1 (Tabla 1), este último al doble de concentración, y el tiempode elongación se ajustó de manera tal que la amplificaciónsobre el genoma recombinante estuviera favorecida para laobtención del producto más corto (combinación de cebadoresCPC1-outGUS) y no fuera suficiente para la amplificación delproducto de mayor tamaño (combinación de cebadores CPC1-BPC1).

Análisis de la expresión de la proteína RG porWestern blot

Se infectaron monocapas confluyentes de BHK-21 con losvirus CNPV o CNPV-RG utilizando una relación de 4 partículas

virales por cada 10 células. A las 24 h posinfección, las célulasse cosecharon, se lavaron con PBS y se resuspendieron enbuffer de extracción (Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 150 mM, NP-40 1 %). Los extractos proteicos se incubaron en hielo durante45 min y se centrifugaron a 10 000 g durante 2 min. Las muestrasproteicas se resuspendieron en buffer Laemmli (Tris-HCl 62,5mM pH 6,8; dodecilsulfato de sodio, SDS 2 %; azul de bromofenol0,25 %; glicerol 5 %, β-mercapto-etanol 3 %) y se sembraronsobre un gel de poliacrilamida (PAGE 12 % -SDS). Luego de laelectroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana denitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories, CA, EE.UU.). La expresiónde la proteína RG se determinó mediante la técnica de Western

blot utilizando un suero policlonal equino anti-virus rábico (dilución1/100) obtenido en SENASA, y un suero anti-IgG equinaconjugado a peroxidasa de rábano (dilución 1/1000, Kirkegaard& Perry Laboratories, Inc., EE.UU.). La presencia de la proteínaRG recombinante se reveló mediante precipitación de sustrato4-cloro-1-naftol (Tris-HCl 42 mM pH 7,5; 4-Cl-1-naftol 0,05 %;H2O2 0,02 %).

Figura 1. Esquema de la construcción de VT-C-GUS-RGSe esquematizan las estrategias de clonado para la obtención del plásmido intermediario pE/L/RG (A) y el vector de transferenciaVT-C-GUS-RG (B). 922pb/673pb: amplicones de la secuencia codificante de la glicoproteína G (RG) del virus rábico obtenidoscon los pares de cebadores RG1-RG4 y RG3-RG2, respectivamente. E/L: promotor sintético temprano-tardío E/L de poxvirus,H6: promotor del gen H6 del virus vaccinia, GUS: gen uidA, t: secuencias terminadoras de la transcripción de poxvirus. Lassecuencias de interés se encuentran flanqueadas por secuencias del gen CNPV048 para permitir la recombinación homólogacon el genoma del virus canarypox. Sobre la base de la secuencia genómica del CNPV (33), se definió que 048i corresponde aun fragmento de aprox. 600 pb, con inicio en la posición 59.528, y que 048d corresponde a un fragmento de aprox. 1700 pb, coninicio en la posición 57.247

Nsi I

Sma I

T4 ADN

Ligasa

Nsi I

Eco RI

922pb

673pb

pE/L

Not I Sma I Not I EcoR I

E/L t

pE/L/RG

Not I Sma I Not I Eco RI

RG E/L t

Nsi I

Not I Not I

RG E/L t

T4 ADN

Ligasa

Not I

VT-C-GUS/NotI (digestión parcial)

Not I

H6 uidA 048d t 048i

Not I Not I

RG E/L t

Not I

H6 uidA 048d t 048i

VT-C-GUS-RG

A

B


Ensayos de potencia del virus CNPV-RGDurante el trabajo con animales se cumplió la disposición

N.° 6344/96 de ANMAT, que reglamenta los bioterios delaboratorios elaboradores de especialidades medicinales y/ode análisis para terceros. Los ensayos de potencia relativa delvirus CNPV-RG se realizaron en el modelo murino. Para ello,grupos de 10-11 ratones de la cepa BALB/c de 5-6 semanasse vacunaron por vía intraperitoneal aplicando un esquemadosis-refuerzo. En el primer ensayo se determinó la capacidadde la vacuna de inducir inmunidad protectora. Los ratones seinmunizaron a los 0 y 21 días utilizando una dosis fija de 2x107

unidades formadoras de placas (UFP) de los virus CNPV oCNPV-RG, purificados sobre colchón de sacarosa (5). En elsegundo experimento se evaluó la potencia relativa de la vacunaCNPV-RG. Se realizó una modificación del protocolo del NationalInstitute of Health (NIH) para una vacuna en estudio (40). Losanimales se vacunaron los días 0 y 21 con 0,5 ml de lasdiluciones 1:5, 1:25 y 1:125 de un cultivo de FEP infectado conel virus CNPV-RG (título inicial de 4,2 x 106 UFP/ml).

En ambos experimentos se incluyeron grupos controles deanimales no vacunados o inmunizados a los 21 y 28 días condiluciones 1:5, 1:25 y 1:125 de la vacuna antirrábica PV-BHK 3.En el día 35, todos los animales se desafiaron por inoculaciónintracerebral con una dosis comprendida entre 12 y 50 DL50/0,03 ml del virus CVS (40). Los ratones se observaron duranteun período de 14 días; se llevó el registro del número de animalesmuertos o con signos clínicos compatibles con rabia respectodel total. Las muertes ocurridas durante los primeros 4 díasposdesafío se registraron como inespecíficas.

Determinación de anticuerpos neutralizantes

del virus rábicoSe utilizó el protocolo de determinación de anticuerpos in

vivo según Fitzgerald (12). Brevemente, los sueros del primerensayo obtenidos a los días 20 o 34 se agruparon en pools, serealizaron diluciones seriadas en base 5 y se incubaron 1 h a

37 ºC con una dosis fija (comprendida entre 12 y 50 DL50) de lacepa CVS de virus rábico. Como control se analizó en paralelouna inmunoglobulina equina estandarizada con la inmunoglobulinaantirrábica de referencia de la OMS. Esta inmunoglobulina equina(IgG) se obtuvo por precipitación con sulfato de amonio a partirde un suero equino hiperinmune, según el protocolo descritopor el Instituto Panamericano de Protección de Alimentos yZoonosis (INPPAZ, Nota Técnica N.° 8 2-IX-75). Las mezclasse inocularon intracerebralmente en ratones adultos (11 a 14 g)naive de la cepa CF-1, los cuales se observaron durante unperíodo de 14 días para llevar un registro del número de animalesmuertos y sobrevivientes.

Análisis de datosEl test estadístico de Reed y Muench (25) se utilizó para

calcular la dilución efectiva 50 (DE50) y la dilución protectora50 (DP50) en los ensayos de potencia y seroneutralización,respectivamente.

La potencia del candidato vacunal CNPV-RG se calculócomo la relación entre los valores de las inversas de las DE50obtenidas para dicho virus respecto de las obtenidas para lavacuna de referencia. Análogamente, pero relacionando lasDP50, se determinaron los títulos de anticuerpos neutralizantesde RV inducidos por la inmunización con el virus recombinante.Todos los resultados se expresaron en unidades internacionalespor ml (UI/ml); a las vacunas y gammaglobulinas de referenciase les asignó el valor de 1.

RESULTADOS

Construcción y caracterización in vitro del virus

canarypox recombinante CNPV-RG

Se desarrollaron virus CNPV recombinantes queportan la secuencia codificante de la glicoproteína G

Figura 2. Análisis por PCR de los virus canarypox recombinantes CNPV-RGA) Representación esquemática de los genomas del virus canarypox recombinante (esquema superior) y no recombinante(esquema inferior). Se indica la ubicación de los oligonucleótidos utilizados en la reacción de amplificación por PCR. Las líneasindican el tamaño esperado de los amplicones. B) Electroforesis en gel de agarosa 1 %, teñido con bromuro de etidio, de losproductos de amplificación por PCR utilizando como templado ADN de cultivos de FEP no infectados (FEP NI), clones virales N.º37 y 38 de CNPV-RG, vector de transferencia VT-C-GUS-RG (VT), y virus no recombinante (CNPV). En la reacción se incluyóun control sin ADN (C-). Como marcador de peso molecular (MPM) se utilizó 1 Kb DNA Plus (Invitrogen)

pE/L-RG pH6-uidA d i

CPC1 outGUS BPC1

CNPV048

CPC1 BPC1

2400 pb

600 pb

A B


del virus rábico interrumpiendo el gen viral no esencialCNPV048. Como se muestra en la Figura 2B, medianteamplificación por PCR se confirmó que los virusrecombinantes CNPV-RG (clones N.º 37 y 38) portanla secuencia del gen heterólogo y se encuentran puros(ausencia de genoma viral no recombinante), ya que solose amplificó un fragmento de 2,4 kpb correspondienteal genoma viral recombinante.

La expresión de la proteína RG se confirmó medianteWestern blot utilizando un suero anti-virus rábico. Lapresencia de una banda reactiva de aproximadamente60 kDa se detectó en las muestras provenientes decélulas infectadas con CNPV-RG, mientras que nose detectó señal en las muestras provenientes decélulas no infectadas o infectadas con CNPV (Figura3). Finalmente, la estabilidad genética del virusrecombinante se confirmó mediante PCR luego de10 pasajes ciegos en FEP (resultado no mostrado).En conjunto, estos resultados demuestran que elvirus recombinante CNPV-RG porta y expresa lasecuencia codificante de la glicoproteína G del virusrábico.

Respuesta inmune y protección en ratones

vacunados con CNPV-RG

La capacidad del virus recombinante CNPV-RG deinducir una respuesta inmune humoral y de conferirprotección frente al desafío con virus rábico se evaluóen un primer ensayo utilizando el modelo murino,según se describe en Materiales y Métodos.

Los títulos de anticuerpos neutralizantes de RVdeterminados en los sueros de los ratones vacunadosse muestran en la Tabla 2. La vacuna antirrábica dereferencia (PV-BHK 3) indujo la síntesis de anticuerposneutralizantes; el título observado fue mayor cuantomayor fue la cantidad de masa antigénicaadministrada. Como era esperado, los sueros de los

ratones no vacunados o inmunizados con el virus norecombinante CNPV no presentaron actividadneutralizante de RV, mientras que en los sueros deratones vacunados con el virus CNPV-RG sedeterminaron títulos seroneutralizantes de 3,58 y 9,76UI/ml luego de una y dos inmunizaciones, respectivamente.

En la Tabla 2 se muestran los valores desupervivencia obtenidos para cada grupo experimentalluego del desafío. Todos los ratones no vacunados ovacunados con el virus CNPV murieron dentro delperíodo de observación. En este ensayo, la vacunaantirrábica PV-BHK 3 protegió al 100 % (dilución 1:5),al 87,5 % (dilución 1:25) y al 50 % (dilución 1:125) delos animales vacunados, mientras que en el grupode ratones inmunizados con CNPV-RG, 7 de 9 animalessobrevivieron, lo que resulta en una protección del78 %.

A un año del desafío, se determinó que los suerosde los ratones sobrevivientes del grupo CNPV-RGpresentaron actividad neutralizante del virus rábico,con un título de 7,39 UI/ml.

Determinación de la potencia relativa del

candidato vacunal CNPV-RG

Con el objetivo de determinar la potencia relativadel virus CNPV-RG, se realizó un segundo experimentode inmunización y desafío de ratones, siguiendo elprotocolo descrito en Materiales y Métodos. Esteensayo permite comparar los niveles de protecciónconferidos por una vacuna en estudio y una vacunaantirrábica de referencia. Luego del desafío se calculóla dilución que protegió al 50 % de los animales (DE50).En este experimento, se obtuvo un valor de 1:49 y de1:174 para PV-BHK 3 y CNPV-RG, respectivamente.La relación entre ambos valores de DE50 permitiócalcular una potencia relativa de 3,5 UI/ml para elcandidato vacunal CNPV-RG (Tabla 3).

DISCUSIÓN

En la actualidad, en el área de la medicina veterinariase requieren vacunas antirrábicas que sean segurasy efectivas. Los vectores virales de expresión noreplicativos constituyen la herramienta de elecciónpara el desarrollo de nuevos inmunógenos quecumplan con este propósito. En particular, el viruscanarypox cepa ALVAC, se utilizó para la expresiónde la glicoproteína G del virus rábico (1, 3). Losensayos de potencia demostraron que la eficaciaprotectora del virus canarypox recombinante (ALVAC-RG) fue 100 veces mayor que la de un vector basado

Figura 3. Expresión de la proteína RG a partir de CNPV-RGLos extractos proteicos se analizaron mediante la técnica deWestern blot. La flecha indica la banda reactiva del tamañoesperado. Los extractos proteicos se obtuvieron a partir decultivos de BHK-21 no infectados (NI) o infectados con el clonviral N.º 37 del virus canarypox recombinante (CNPV-RG) yno recombinante (CNPV). MPM: marcador de peso molecularpreteñido Page Ruler (Fermentas, EE.UU.)

NI CNPV CNPV-RG MPM - 72 kDa

- 55 kDa

-43 kDa


en fowlpox (FPV-RG), pero similar a aquella del virusreplicativo vaccinia, V-RG (29). Estos datos, sumadosal excelente perfil de seguridad de ALVAC-RG paraanimales y humanos (3, 13, 28), permitieron obtenerla licencia para su uso como vacuna antirrábica engatos, en Estados Unidos y Canadá (23).

Basándonos en los buenos resultados obtenidoscon ALVAC-RG, se decidió desarrollar en nuestrolaboratorio un candidato vacunal utilizando la cepaAbbatista 95 del virus canarypox como vector noreplicativo para la expresión de la proteína G del virusrábico. El vector viral utilizado en este trabajo fueobtenido en nuestro laboratorio y está protegido através de la patente argentina N° AR052743B1.

La inmunidad protectora inducida por el virus

CNPV-RG obtenido se evaluó en el modelo murino.La presencia de anticuerpos neutralizantes del virusrábico en los sueros de los ratones vacunados conCNPV-RG purificado indicó la correcta síntesis de

novo de la glicoproteína G y su capacidad para induciruna respuesta inmune humoral, que pudo ser detectadahasta un año después de la última vacunación. Lostítulos de anticuerpos neutralizantes inducidos porCNPV-RG superaron ampliamente el valor de 0,5 UI/ml, asociado con la protección en animales (22), yfueron altos comparados con aquellos inducidos porla vacuna antirrábica nacional de referencia. Sinembargo, la protección fue menor en los ratonesvacunados con CNPV-RG que en los animalesinmunizados con las diluciones 1:5 y 1:25 de la

Los títulos de anticuerpos neutralizantes se definieron como la más alta dilución de suero que incubada con una dosisfija de virus rábico e inoculada intracerebralmente en ratones protege al 50 % de los animales desafiados (DP50). Losvalores obtenidos se normalizaron a unidades internacionales (UI/ml) por división con la DP50 de una inmunoglobulinaantirrábica control estandarizada con la inmunoglobulina de referencia de la OMS. ND: no determinado.(1) Cuatro ratones murieron luego de la primera inmunización; (2) un ratón murió a las 24 h posdesafío (muerte inespecífica);(3) dos ratones murieron a las 24 h posdesafío (muerte inespecífica); (4) el desafío se realizó inoculando intracerebralmente30 DL50 del virus CVS por ratón

Grupos experimentales Día 20 Día 34 DE50

Sin inmunizar ND ND 0/10 (0) -

CNPV 2x107 UFP 0 0 0/6(1) (0) -

CNPV-RG 2x107 UFP 3,58 9,76 7/9(2) (78) -

PV-BHK 3 Dilución 1:5 ND 3,30 9/9(2) (100)

PV-BHK 3 Dilución 1:25 ND 2,18 7/8(3) (87,5) 1:106

PV-BHK 3 Dilución 1:125 ND 0,97 5/10 (50)

Tabla 2. Títulos de anticuerpos neutralizantes (UI/ml) y supervivencia frente al desafío con virus rábico en ratones

N.º sobrevivientes/N.º total

(% sobrevivientes)

Título seroneutralizante Supervivencia(4)

Tabla 3. Potencia relativa del candidato vacunal CNPV-RG

La dilución que protegió al 50 % de los animales (DE50) se calculó por el método de Reedy Muench (25). La potencia del CNPV-RG se calculó como la relación entre los valores delas inversas de las DE50 obtenidas para dicho virus respecto de las obtenidas para lavacuna de referencia. (1) Los animales utilizados en este ensayo se desafiaron con 50DL50 de virus CVS. (2) El título inicial del CNPV-RG fue 4,2 x 106 UFP/ml. (3) Entre uno ycinco ratones murieron a las 24 h posdesafío (muerte inespecífica). (4) La dilución 1:625 delCNPV-RG no protegió a ningún ratón (0 % de supervivencia)

Protección(1)

Grupos experimentales N.º sobrevivientes/N.º total DE50

CNPV-RG Dilución 1:5(2) 7/8(3)

CNPV-RG Dilución 1:25 10/11 1/174(4)

CNPV-RG Dilución 1:125 5/6(3)

PV-BHK 3 Dilución 1:5 7/9(3)

PV-BHK 3 Dilución 1:25 7/9(3) 1/49

PV-BHK 3 Dilución 1:125 3/10


vacuna PV-BHK 3. Esto puede deberse a que nosiempre existe una estricta correlación entre los nivelesde anticuerpos neutralizantes y el grado de protecciónconferido, tal como fue descrito por Hu et al. (16).

Los resultados obtenidos en el ensayo de potenciasugieren que el candidato vacunal, producido comoextracto de células infectadas con CNPV-RG, seríacapaz de brindar una buena protección in vivo frenteal virus rábico debido a que dicho vector presentó unvalor de potencia relativa superior al de la vacuna dereferencia.

Los experimentos presentados aportan datospreliminares y promisorios sobre la evaluación delvirus CNPV-RG como candidato a vacuna antirrábicapara uso veterinario. De todos modos, los valores depotencia relativa como así también el nivel deanticuerpos neutralizantes inducidos por este vectordeberán corroborarse con un número mayor deexperimentos en el modelo murino. Para ello seránecesario aumentar la escala de producción decultivos de FEP infectados con el virus CNPV-RG yestablecer un protocolo de elaboración validado. Estopermitirá contar con la suficiente cantidad de inóculopara continuar con su caracterización. Se prevéanalizar el perfil de seguridad del virus recombinante,la efectividad de la inmunización utilizando diferentesvías de administración, las dosis mínimas inmunizantesy protectoras, la duración de la inmunidad luego de laaplicación de una sola dosis, la utilidad del virus CNPV-RG en presencia de anticuerpos maternos antirrábicos,etc. Otro factor importante que se tendrá en cuentaserá la optimización de la presentación antigénica, loque podría conllevar un mejor reconocimiento porparte del sistema inmune y un aumento de los nivelesde protección en el hospedador. En la bibliografía seha descrito que la potencia de una vacuna antirrábicabasada en vectores virales no replicativos estádeterminada, principalmente, por su capacidad paraexpresar la glicoproteína G (19). En este sentido, sedemostró que la sobreexpresión de esta proteínaincrementa significativamente la velocidad de apariciónde la respuesta inmune humoral al virus rábico en elhospedador, así como su magnitud (4, 10). Además,existen trabajos que indican que la nucleoproteína (N)activa linfocitos T colaboradores y citotóxicos, con loque se facilita la producción de anticuerposneutralizantes y se potencia la respuesta inmune (14,27, 31). Sobre la base de estos resultados, podríanobtenerse CNPV recombinantes que expresen doscopias del gen codificante de RG o que expresensimultáneamente las proteínas RG y N del virus rábico.

La rabia paralítica o paresiante es la rabia del ganadotransmitida por mordedura de murciélagos hematófagos.En la República Argentina, el área endémica abarcalas provincias del norte, donde la mortalidad del ganadoinfectado afecta la economía regional. La vacunaciónde los animales es voluntaria y, en general, solo serealiza cuando se detectan brotes en el campo o en lasinmediaciones, y cesa una vez que el brote fuecontrolado, por lo cual la enfermedad reaparece unavez que transcurrió el período interepidémico. Si bienen el ganado infectado no existe transmisión horizontalde la enfermedad, este representa un riesgo para lasalud pública, ya que constituye un reservorio del viruspor ser la principal fuente de alimentación del vampiro.En este contexto sería interesante evaluar, a futuro, lautilidad del virus recombinante CNPV-RG para laprevención de la rabia paresiante en zonas del paísactualmente endémicas, y en aquellas áreaspotencialmente afectadas debido a las modificacionesen los patrones de migración de los murciélagos, que seregistran a causa del cambio climático. En consecuencia,la disponibilidad de nuevas vacunas que eliminen lamanipulación del agente infeccioso y que permitan elcontrol de la enfermedad en animales de interéseconómico es de importancia estratégica nacional yregional.

Finalmente, podemos mencionar que el conjunto delos resultados preliminares presentados en este trabajomuestran un futuro promisorio del virus CNPV-RG comocandidato a vacuna antirrábica de nueva generaciónpara uso en el área de la medicina veterinaria.

Agradecimientos: los autores agradecen al INTA, por lafinanciación recibida (Proyectos Específicos AEGR 2414 yAERG 232141), al Dr. O. Zabal y su equipo, por la realizaciónde los cultivos primarios de embrión de pollo, y a M. J. Mónaco,S. Díaz, J. De Filippo y G. Fernández, por su asistencia técnica.

BIBLIOGRAFÍA

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Recibido: 22/3/2011- Aceptado: 15/2/2012

ETEC y STEC en cerdos con diarrea posdestete y enfermedad de los edemas 85ISSN 0325-7541


Caracterización genotípica de aislamientos deEscherichia coli obtenidos de cerdos con diarrea posdestete

y enfermedad de los edemas

FABIANA A. MOREDO1*, JAVIER A. CAPPUCCIO2, LUCAS INSARRALDE2, CARLOS J. PERFUMO2,MARÍA A. QUIROGA2, GERARDO A. LEOTTA3

1Cátedra de Microbiología, 2Cátedra de Patología Especial, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP. Calle 60 y 118, (1900)La Plata, Pcia. de Buenos Aires. 3IGEVET CCT - La Plata - CONICET. Argentina.


ABSTRACT

Genotypic characterization of toxigenic Escherichia coli isolated from pigs with postweaning diarrhea

(PWD) and edema disease (ED). The purpose of this work was to characterize 47 Escherichia coli strains isolatedfrom 32 pigs diagnosed with postweaning diarrhea and tree pigs with edema disease by PCR. Forty two (95.5 %)of the strains isolated from diarrheic pigs were characterized as enterotoxigenic E. coli (ETEC) and 2 (4.5 %) as Shigatoxin-producing E. coli (STEC). Fourteen (33.3 %) ETEC strains were positive for est/estII/fedA genes. The mostcomplex genotype was eltA/estI/faeG/aidA. Strains isolated from pigs with ED were classified as porcine STECand were stx

2e/aidA carriers. Eleven (25 %) strains carried the gene encoding adhesin protein AIDA-I. However,

genes coding for F5, F6, F41, intimin and Paa were not detected. The development of vaccines generating antibodiesagainst prevalent E. coli adhesins in Argentina could be useful for the prevention of PWD and ED.

Key words: ETEC, STEC, postweaning diarrhea, edema disease, pigs

RESUMEN

El objetivo del trabajo fue caracterizar mediante PCR 47 aislamientos de Escherichia coli recuperados de 32 cerdoscon diagnóstico clínico de diarrea posdestete (DPD) y de 3 cerdos con enfermedad de los edemas (ED). Sobre 44aislamientos provenientes de cerdos con DPD, 42 (95,5 %) fueron caracterizados como E. coli enterotoxigénicos(ETEC) y 2 (4,5 %) como E. coli productores de toxina Shiga (STEC). Catorce aislamientos de ETEC (33,3 %)fueron positivos para los genes estI/estII/fedA. El genotipo más complejo fue eltA/estII/east1/faeG/aidA. Losaislamientos provenientes de cerdos con ED se clasificaron como STEC porcinos y fueron portadores de stx

2e/aidA.

Once aislamientos (25 %) fueron portadores del gen que codifica la expresión de la adhesina AIDA-I. Sin embargo,en ningún aislamiento se detectaron los genes que codifican la expresión de las adhesinas F5, F6, F41, de intiminay de “Paa”. La prevención de la DPD y de la ED podría realizarse mediante el desarrollo de vacunas que generenanticuerpos contra las adhesinas de las cepas de E. coli prevalentes en la Argentina.

Palabras clave: ETEC, STEC, diarrea posdestete, enfermedad de los edemas, cerdos

La diarrea posdestete (DPD) es una entidad dedistribución mundial en granjas de cerdos en confina-miento (5). Sumado a factores ambientales, socialesy nutricionales (5), en la DPD actúa como agentedesencadenante Escherichia coli enterotoxigénico(ETEC), aunque también pueden estar involucradascepas de E. coli productoras de toxina Shiga (STEC)(10).

Los microorganismos del grupo ETEC secaracterizan por la producción de adhesinas fimbrialesy enterotoxinas. Estas últimas se clasifican entermolábil (LT) y termoestables (STa, STb y EAST1)(5). En la DPD, estos agentes colonizan el intestinodelgado de los lechones en las primeras horas poste-riores al destete, adhiriéndose a las microvellosidades

de los enterocitos a través de alguno de sus factoresfimbriales, particularmente F4 y F18 (3, 5).

El grupo STEC comprende cepas de E. coli

positivas para el factor de adhesión F18, las cualesproducen una variante de toxina Shiga, la Stx2e, quese asocia a la enfermedad de los edemas (ED) (10).La Stx2e producida en el intestino delgado se absorbey se une a su receptor glicolipídico (Gb4) que seencuentra localizado sobre las células endoteliales,esto produce angiopatía degenerativa con aumentode la permeabilidad capilar y la presencia de edemaen el meso, el estómago, el subcutis y el encéfalo; eneste último caso se observan desórdenes neurológicos(11).

Recientemente se describió la presencia de un


nuevo subgrupo de ETEC aislados de cerdos con DPDo ED, negativos a factores de colonización fimbriales,pero que expresan una adhesina no fimbrial relacionadacon la adherencia difusa, la AIDA-I (10). La AIDA-I puedeexpresarse como única adhesina o conjuntamente conF18 (5, 7). Leclerc et al. (7) observaron la aparición denuevos factores de virulencia en cepas ETEC, comoel denominado Paa (porcine attaching and effacing

associated), originalmente asociado a cepas de E. coli

enteropatógenas porcinas (PEPEC).En la Argentina, la información sobre los patotipos

y genotipos asociados a DPD y ED es escasa. Si biense cuenta con datos acerca de la frecuencia de lastoxinas LT, STa, STb y Stx2e (9, 13), no se disponede información acerca de factores de colonización,especialmente los no fimbriales. El objetivo del trabajofue realizar la caracterización genotípica de aislamientosde E. coli recuperados de cerdos con diagnósticoclínico y anatomopatológico de DPD o ED.

Durante los meses de febrero y marzo de 2010 yfebrero de 2011, se obtuvieron 47 aislamientos de E.

coli toxigénicos a partir de 32 cerdos de la categoríaposdestete (21 a 42 días de vida) con signología clínicacaracterística de DPD, y de 3 cerdos con diagnósticoclínico de ED. Los cerdos pertenecían a siete granjasde producción porcina en confinamiento, localizadasen las provincias de Buenos Aires, Santa Fe y Córdoba.Por cada granja se analizaron entre 3 y 9 cerdos (Tabla2). El aislamiento y la caracterización fenotípica serealizaron utilizando la metodología previamente descrita(9). Se seleccionaron entre 5 y 10 colonias característicasde E. coli con diferente perfil fenotípico, por cadaanimal. En las muestras de los 35 cerdos se identificóal menos un genotipo de E. coli toxigénico. Para lacaracterización genotípica de ETEC y STEC, se utilizóPCR en tiempo final (1, 2, 6, 10). Del total de aislamientosanalizados, 44 se obtuvieron a partir de animalescon DPD y 3 de ejemplares con ED. Se utilizó comoADN templado una colonia de cada aislamiento enestudio, lisada durante 15 minutos a 100 ºC en 150 μlde buffer Tris-EDTA/Tritón. En la Tabla 1 se describen losgenes analizados, las secuencias de oligonucleótidosutilizados y el tamaño de los fragmentos amplificados.Se utilizaron como cepas de referencia E. coli 7805(eltA/estI/estII/faeG/east1), E. coli 81-603 A (fasA),E. coli 1073 B44 (fanC/F41), E. coli 88-1199 (fedA),E. coli LS77-1 I (stx

2e) y E. coli EDL933 (eae/paa).

De los 44 aislamientos provenientes de cerdos conDPD, 42 (95,5 %) se clasificaron como ETEC y 2(4,5 %) como STEC porcinos, estos últimos presentaroncomo único gen marcador de virulencia stx

2e. Catorce

aislamientos ETEC (33,3 %) fueron positivos para losgenes que codifican STa/STb/F18. Esta combinaciónse observó en tres de las siete granjas estudiadas (BuenosAires, Córdoba, Santa Fe). Siete aislamientos ETEC(16,6 %) fueron positivos para la combinación de genesque codifican STa/STb.

El genotipo más complejo fueeltA/estII/east1/faeG/aidA (N = 1), seguido poreltA/estII/east1/faeG (N = 1),estI/estII/fedA/aidA (N = 5),eltA/estI/estII/east1 (N = 1),eltA/estII/east1 (N = 1),east1/aidA (N = 7).

El gen que codifica la enterotoxina enteroagregativatermoestable 1 (EAST1) se detectó en 16 cepasETEC (36,4 %), pero solo en 7 fue este el únicomarcador de virulencia. Las 3 cepas aisladas a partirde cerdos con ED se clasificaron como STEC porcinosy presentaron la combinación de genes stx

2e/aidA.

Entre los genes que codifican la expresión deadhesinas, el más frecuente fue el que codifica laexpresión de la adhesina fimbrial F18 (40,4 %),seguido por el gen que codifica F4 (4,2 %). Todos losaislamientos estudiados fueron negativos al investigarlos genes que codifican las fimbrias F5, F6, F41 y lasadhesinas afimbriales intimina y Paa. En la Tabla 2 sepresentan los diferentes genotipos encontrados encada granja.

Estos resultados coincidieron con lo encontradoen EE.UU. asociados a animales con DPD (14). Aligual que en el presente trabajo, Matiuzzi et al. (8)hallaron un mayor porcentaje de cepas aisladas deanimales con DPD portadoras del gen que codificalas toxinas STb (68,1 %), seguido por el gen quecodifica STa (61,4 %). En un estudio previo realizadoen la Argentina, se detectó estI solo en el 21,3 % delos aislamientos (13). En el presente trabajo sedetectó el gen eltA (toxina LT) en el 9 % de losaislamientos analizados, un porcentaje menor que eldescrito en otros estudios (8, 13).

En este trabajo fue posible identificar el gen quecodifica la expresión de la adhesina AIDA-I en 11 delos 44 aislamientos provenientes de animales conDPD (25 %) y en 3 aislamientos recuperados deanimales con ED. En este último caso, se lo detectócomo único factor de colonización. Niewerth et al.

(11) demostraron la importancia de esta adhesina nofimbrial en asociación con F18 y Stx2e en lapatogénesis de la DPD y de la ED. Respecto de laproducción de la EAST1, se observó la presenciadel gen que la codifica en diferentes combinaciones

ETEC y STEC en cerdos con diarrea posdestete y enfermedad de los edemas 87

Tamaño del fragmentoamplificado (pb)

faeG F4-Fw GGTGATTTCAATGGTTCG 764 2F4-Rv ATTGCTACGTTCAGCGGAGCG

fanC F5-Fw TGGGACTACCAATGCTTCTG 450 2F5-Rv TATCCACCATTAGACGGAGC

fasA F6-Fw TCTGCTCTTAAAGCTACTGG 333 2F6-Rw AACTCCACCGTTTGTATCAG

fedA F18-Fw GTGAAAAGACTAGTTTATTTC 510 2F18-Rv CTTGTAAGTAACCGCGTAAGC

F41 F41-Fw GAGGGACTTTCATCTTTTAG 431 2F41-Rv AGTCCATTCCATTTATAGGC

paa Paa-Fw ATGAGGAAACATAATGGCAGG 350 2Paa-Rv TCTGGTCAGGTCGTCAATAC

aidA AIDA-I-F ACAGTATCATATGGAGCCA 585 10AIDA-I-R TGTGCGCCAGAACTATTA

eae EAE-Fw CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC 864 6EAE-Rv CCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG

eltA LTA-1 GGCGACAGATTATACCGTGC 696 2LTA-2 CCGAATTCTGTTATATATGTC

estI STa1 TCTTTCCCCTCTTTTAGTCAG 166 2STa2 ACAGGCAGGATTACAACAAAG

estII STb1 ATCGCATTTCTTCTTGCATC 172 2STb2 GGGCGCCAAAGCATGCTCC

east1 East11a CCATCAACACAGTATATCCGA 111 2East11b GGTCGCGAGTGACGGCTTTGT

stx2e Stx2eA CCTTAACTAAAAGGAATATA 230 1Stx2eB CTGGTGGTGTATGATTAATA

DPD: diarrea posdestete; ED: enfermedad de los edemas

Tabla 1. Genes analizados y secuencias de los oligonucleótidos cebadores utilizados para la caracterización de los aislamientosETEC y STEC recuperados de cerdos con DPD y ED

Gen Nombre Secuencia (5´-3´) Referencia

Cuadro Animalesclínico analizados

1 Buenos Aires DPD 9 stx2e

2

estI/estII/fedA/aidA 3estI/estII/fedA 8

2 Santa Fe DPD 6 estI/estII/fedA/aidA 2estI/estII/fedA 1

estI/estII 7

3 Santa Fe DPD 3 eltA/estII/east1/faeG/aidA 1eltA/estII/east1/faeG 1

4 Santa Fe DPD 3 eltA/estI/estII/east1 1eltA/estII/east1 1

5 Córdoba DPD 8 east1/aidA 5east1 7

6 Córdoba DPD 3 estI/estII/fedA 5

7 Buenos Aires ED 3 stx2e

/aidA 3

DPD: diarrea posdestete; ED: enfermedad de los edemas

Tabla 2. Genotipos de los aislamientos ETEC y STEC recuperados de cerdos con DPD o ED.

Granja Localización Genotipo Aislamientos


(Tabla 2). Si bien está en discusión su valor cuando sepresenta solo, en este estudio se lo observó asociadoa los genes que codifican la toxina STb o el factor deadherencia AIDA-I en 9 cepas, por lo que podríaconsiderarse como importante marcador de virulenciade E. coli asociado a DPD. Es interesante mencionarque en estudios previos se demostró asociación deF4/LT/STa y STb/EAST1 con casos de DPD (11, 12).

Los datos obtenidos aportan nueva informaciónsobre los patotipos y genotipos de E. coli asociadosa DPD y ED en nuestro país, y constituye el primerrelevamiento de factores de colonización fimbrialesy no fimbriales. El reconocimiento de los factoresde virulencia y adherencia de las cepas de E. coli

toxigénicas asociadas a DPD y ED en granjas decría intensiva de cerdos permitirá implementar medidasde prevención tendientes a controlar el estado sanitariode las piaras. En ese contexto sería de gran valor eldesarrollo de vacunas que generen anticuerpos contralas adhesinas de las cepas de E. coli productoras deDPD y de ED prevalentes en la Argentina.

Agradecimientos: Los autores agradecen al Dr. GustavoZielinski y a la Dra. Nora Lía Padola por la remisión de cepasde referencia. Trabajo parcialmente financiado con subsidioPICT 2005 N.º de resolución BID 1728 OC/AR PICT 2005-33987 Resolución Directorio ANPCyT 217/2006 otorgado porla Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica,Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación Productiva dela Nación y subsidio perteneciente al Proyecto de Incentivos aDocentes-Investigadores V184, otorgado por la UniversidadNacional de La Plata.

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LAURA ERRECALDE*, SANDRA COGUT, MARIANA ERBÍN, LILIANA JORDÁ VARGAS, EUGENIA CATTANI,TAMARA POSSE, SILVIA TUTZER, RICARDO HERMES, SARA KAUFMAN

ABSTRACT

CHROMagar KPC. Comparison with the method proposed by the Centers for Disease Control and

Prevention (CDC, USA) for rectal screening and evaluation of false positive results. Eighty one rectalswabs (RS) were cultured on CHROMagar KPC and the CDC method. Of the 81 samples, 9 were positive forKPC-producing Klebsiella pneumoniae on CHROMagar KPC, and 6 for the CDC method. CHROMagar KPC hadtwo false positive (FP) results: 1 K. pneumoniae and 1 Acinetobacter sp. FP results on the CDC method were: 25Acinetobacter spp., 2 Escherichia coli and 4 K. pneumoniae. CHROMagar KPC yielded a better recovery of KPC-producing bacteria and less FP results than CDC method. In order to evaluate FP results on CHROMagar KPC,1247 RS were cultured and yielded 1021 negatives, 171 KPC-producing K. pneumoniae and 55 FP (4.4 %).Because of the FP results growing on CHROMagar KPC, KPC must be phenotypically confirmed in the bacteriaisolated.

Key words: CHROMagar KPC, KPC, screening KPC

RESUMEN

Se cultivaron 81 hisopados rectales en el medio CHROMagar KPC y por el método del CDC. Fueron positivospara Klebsiella pneumoniae KPC en CHROMagar KPC, 9/81 y 6/81 con el método del CDC. El medio CHROMagarKPC tuvo dos falsos positivos: 1 K. pneumoniae y 1 Acinetobacter sp. Los falsos positivos del método CDC fueron:25 Acinetobacter spp., 2 Escherichia coli y 4 K. pneumoniae. El empleo del medio CHROMagar KPC resultó ser unmétodo con mayor recuperación de aislamientos productores de KPC y menos falsos positivos que el método delCDC. Para evaluar los falsos positivos en el medio CHROMagar KPC se cultivaron 1247 hisopados rectales. Seobtuvieron 1021 negativos, 171 K. pneumoniae KPC y 55 (4,4 %) falsos positivos. Debido al desarrollo de falsospositivos en el medio CHROMagar KPC, se debe confirmar por caracterización fenotípica la presencia de KPC enlas bacterias aisladas.

Palabras clave: CHROMagar KPC, KPC, vigilancia KPC

Hospital Juan A. Fernández. Cerviño 3356 (1425) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.*Correspondencia. E-mail: [email protected]

La resistencia a carbapenems en la familiaEnterobacteriaceae puede deberse a dos mecanismosprincipales:

1) Modificaciones en la permeabilidad de lamembrana externa, asociadas con β-lactamasas deespectro extendido (BLEE) o hiperproducción de AmpC.

2) Producción de β-lactamasas con actividadhidrolítica específica sobre los carbapenems, llamadascarbapenemasas (8).

El primer mecanismo no parece tener potencialepidémico, probablemente debido a que el microorganismoposee una capacidad reducida por haber perdido su porinamayor, mientras que las cepas que poseen carbapene-masas suelen ser altamente epidémicas (14).

La enzima KPC (de Klebsiella pneumoniae carbape-nemasa) es una serincarbapenemasa que pertenece

a la clase A de Ambler y al grupo 2f de Karen Bush, y esuna de las más frecuentemente aisladas, no solo en K.

pneumoniae sino también en otros géneros y especies.Tiene la capacidad de hidrolizar a todos los antibióticosβ-lactámicos incluyendo sus combinaciones coninhibidores. Está localizada en elementos genéticosmóviles/movilizables (transposones/plásmidos), lo quele otorga un gran potencial de diseminación. Lasresistencias asociadas que acarrean estos plásmidosproducen cepas con resistencia a la mayoría de lasfamilias de antibióticos, lo que deja muy pocasalternativas de tratamiento. Una gran proporción de losbrotes descritos en el mundo se deben a K. pneumoniae

ST258 (8).En nuestro país, el primer aislamiento de KPC se

produce a fines del año 2006 en K. pneumoniae y


Citrobacter freundii (10). Sin embargo, a partir deagosto de 2009 se produjo un incremento de seisveces en el número de aislamientos de bla

KPC-2, 94 % de

los cuales fueron ST258 (5). Para limitar la diseminaciónde estas cepas epidémicas dentro del ámbito hospitalario,el Centers for Disease Control and Prevention (CDC)propone la detección temprana de portadoresgastrointestinales por un método de vigilancia activay la implementación de medidas de control deinfecciones. Estas medidas incluyen el aislamientode contacto de los pacientes infectados o colonizados,la intensificación del lavado de manos y el establecimientode protocolos de limpieza, entre otras (1).

En nuestro hospital, el primer aislamiento de K.

pneumoniae portadora de KPC se obtuvo en abril de2010 de un paciente con infección urinaria (4). Elaislamiento fue caracterizado en el Centro Nacionalde Referencia como ST258 y portador del gen blaKPC-2.Además, este aislamiento presentó identidad clonalcon otros aislamientos de K. pneumoniae portadores deKPC aislados en 16 hospitales del área metropolitanade Buenos Aires (12). Durante el mes de junio de 2010se producen dos nuevos aislamientos confirmadosblaKPC-2 y, ante la sospecha de transmisión de labacteria entre pacientes dentro del hospital, se inicióla vigilancia activa de portadores intestinales en lasunidades de cuidados intensivos y clínica médica.Para esta búsqueda fue necesario elegir un métodode screening rápido, sensible y específico.

El medio CHROMagar KPC (CHROM) constituyeun método de screening para detectar la producciónde KPC altamente sensible y específico (7, 9, 13).

Consiste en un agar cromogénico con el agregado deun suplemento que inhibe el desarrollo de bacterias grampositivas y negativas sensibles a los carbapenems.Las bacterias crecen de distintos colores de acuerdocon sus propiedades enzimáticas específicas. Permiteinformar resultados negativos en 24 h y positivos en48 h. También existen otros métodos para detectarmicroorganismos que producen KPC, entre ellos elpropuesto por el CDC (2, 6). Este último es un métodoen dos etapas, la primera utiliza un enriquecimientoen caldo y la segunda un medio selectivo y diferencialcomo el agar EMB de Levine. Permite informarresultados negativos en 48 h y positivos en 72 h.

Los objetivos de nuestro trabajo fueron:1) Comparar el desempeño del medio CHROM con

el método propuesto por el CDC para el estudio decolonización rectal.

2) Evaluar el desarrollo de falsos positivos (FP)en el medio CHROM.

En una primera instancia (10/6 al 17/6/2010), loshisopados rectales se procesaron según las dosmetodologías, para lo cual se tomaron dos hisopadosrectales por paciente (n = 81).

Un hisopado rectal se cultivó en CHROM preparadosegún las instrucciones del fabricante. Se incubó 24 ha 35 °C en atmósfera aeróbica y se estudiaron todaslas colonias positivas que podían indicar presencia decarbapenemasas: colonias azul metálico (Klebsiella,Citrobacter y Enterobacter) y colonias rosadas(Escherichia coli) (Figura 1). Estas se tipificaronmediante métodos convencionales y se realizó la pruebade sinergia entre carbapenems (imipenem, meropenem

Figura 1. Aspecto de las colonias que desarrollaron en CHROMagar KPC. A) K. pneumoniae KPC, B) E. coli KPC

CHROMagar KPC 91

y ertapenem 10 µg) y el ácido 3-aminofenilborónico(APB 300 µg, Britania) para la búsqueda deserincarbapenemasas de clase A, y con EDTA/SMA(740/2000 µg, Britania) para la búsqueda de metaloβ-lactamasas. La distancia entre los discos se calculóde la siguiente manera: radio del carbapenem + radiodel APB + 5 mm. El disco de EDTA se ensayó a 1,5cm de centro a centro de los discos del carbapenem.

Se consideraron productores de KPC aquellosaislamientos que presentaron sinergia entre el APBy los carbapenems. Los halos de inhibición para loscarbapenems se interpretaron según las normas delCLSI (3). En las bacterias productoras de AmpC seutilizaron tabletas diagnósticas (Rosco DiagnosticaA/S, Taastrup, Dinamarca) con meropenem (10 µg),meropenem + APB y meropenem + cloxacilina paradescartar la presencia de carbapenemasas. El APBtiene la doble capacidad de inhibir a las carbapenemasasde clase A y también a las β-lactamasas AmpC,mientras que la cloxacilina inhibe solamente a lasAmpC. Para interpretar los resultados se utilizaronlos puntos de corte sugeridos por el fabricante.

El segundo hisopado rectal se cultivó según elmétodo propuesto por el CDC. Se suspendió el hisopoen 5 ml de caldo tripteína de soja con el agregado deun disco de ertapenem o meropenem de 10 µg y seincubó el caldo a 35 °C en atmósfera aeróbica durante24 h. Luego se repicaron 100 µl del caldo a agar EMBde Levine, se incubó a 35 °C en atmósfera aeróbicadurante 24 h. Se estudiaron las colonias mucosasfermentadoras de lactosa mediante tipificación pormétodos convencionales y búsqueda de carbapenemasasde igual manera que en el paso anterior.

Se consideró resultado positivo el desarrollo debacterias productoras de carbapenemasa por el métodofenotípico. Se consideró resultado negativo la ausenciade desarrollo bacteriano. Se consideró resultado FPtoda vez que se obtuvieron colonias de color azul metálicoo de color rosado en el medio CHROM, o coloniasfermentadoras de lactosa con el método del CDC, enlas que no se detectó carbapenemasa por el métodofenotípico. Se comparó la recuperación de enterobacteriasproductoras de carbapenemasa y de FP por ambosmétodos.

Abarcando un período de mayor extensión (10/6/2010 al 31/5/2011), se realizó la evaluación de FPen el medio CHROM sobre un total de 1247 hisopadosrectales (uno por paciente). Las bacterias quedesarrollaron se estudiaron de la misma manera queen la etapa anterior.

De los 81 hisopados rectales sembrados según

ambos métodos, 9 fueron positivos para K. pneumoniae

(fenotipo probable KPC) en CHROM, mientras quesolo 6 fueron positivos por el método del CDC. LosFP en CHROM correspondieron a los siguientescasos: 1 K. pneumoniae resistente a carbapenems(probable BLEE e impermeabilidad) y 1 Acinetobacter

sp. Por el método del CDC se obtuvieron los siguientesFP: 4 K. pneumoniae, 3 sensibles y 1 resistente acarbapenems (probable BLEE e impermeabilidad), 25Acinetobacter spp. y 2 E. coli sensibles a carbapenems.Todos los aislamientos sensibles a carbapenemspresentaron halos de inhibición > 23 mm para imipenem,meropenem y ertapenem. Se puede observar eldesempeño comparativo de ambos métodos en laTabla 1.

De 1247 hisopados rectales evaluados en el medioCHROM, 1021 (81,9 %) fueron negativos, 171 (13,7 %)fueron positivos para K. pneumoniae APB (+)(probable KPC) (2 muestras positivas en cultivo mixtocon E. coli APB +) y 55 (4,4 %) resultaron FP. Los FPse distribuyeron como sigue: 38 K. pneumoniae

resistentes a carbapenems (probable BLEE eimpermeabilidad), 15 Acinetobacter spp., 1 E. coli

resistente a carbapenems (probable hiperexpresiónde AmpC e impermeabilidad) y 1 Enterobacter sp.resistente a carbapenems (probable AmpC desreprimidae impermeabilidad). Todos los FP presentaron resistenciaal ertapenem, mientras que respecto del imipenem ymeropenem fueron sensibles, intermedios o resistentes.

Para realizar la vigilancia de portación intestinal secompararon dos metodologías: la propuesta por el CDCy el agar cromogénico CHROMagar KPC. El métodopropuesto por el CDC tiene la ventaja de ser accesiblepara cualquier laboratorio de microbiología y tener bajocosto. La concentración del carbapenem en el caldosería de 2 µg/ml, si se considera que todo el antibióticoeluye del disco. Como desventajas, la técnica requieredos días de incubación.

En la Tabla 1 podemos observar que el medioCHROM detectó 3 K. pneumoniae KPC que no fuerondetectadas por el método del CDC. Ambas metodologíastuvieron desarrollo de FP, pero a diferencia de lo queocurrió con el sistema CHROM, donde solo desarrollaronbacterias resistentes a carbapenems, por el métododel CDC se aislaron 2 E. coli y 3 K. pneumoniae

sensibles a carbapenems. Además, por el método delCDC se obtuvo desarrollo de Acinetobacter spp. en25 muestras. Si bien Acinetobacter no forma coloniasfermentadoras de lactosa, su desarrollo dificultó laobservación de otras colonias, de modo que estemétodo resulta muy engorroso y exige reaislar, con


la consiguiente demora del resultado en un día más(96 h). Entendemos que el intenso desarrollo debacterias con el método del CDC se debe a que elcaldo TS actúa como multiplicador, tanto de cepassensibles como resistentes. En la publicación dondeoriginalmente se presenta este método, se señalaque el antibiótico no eluye al 100 %, dado que aíslacepas con CIM de hasta 0,25 µg/ml (6).

La recuperación de FP en el medio CHROM fuede 55/1247 hisopados rectales (4,4 %); 38/55 fueronK. pneumoniae resistentes a carbapenems (probableBLEE e impermeabilidad). Es importante distinguirestas cepas de las productoras de KPC, ya que estasúltimas requieren aislamiento del paciente, mientrasque en el caso de cepas con BLEE e impermeabilidadesto no es necesario. También obtuvimos un aislamientode E. coli y uno de Enterobacter cloacae conprobable AmpC desreprimida (o hiperexpresión deAmpC en E. coli) e impermeabilidad. Con ambosmicroorganismos resultó útil en la detección el uso delas tabletas diagnósticas que contienen meropenem +cloxacilina como inhibidor exclusivo de AmpC. Enambos casos, al igual que en presencia de cepas deK. pneumoniae no productoras de carbapenemasa,no es necesario aislar al paciente.

No fueron calculadas la sensibilidad y la especificidaddel método, por carecer de un método de referencia,pero el porcentaje de K. pneumoniae con BLEE eimpermeabilidad es mayor que el comunicado por otrosautores (13), lo que sugiere que este sería un métodomenos específico. Probablemente esto se deba a queen nuestro país estas cepas existen en alta proporción(aproximadamente 14 % de 6700 cepas nosocomialesexaminadas por la red Whonet en 2007) (11).

Cabe destacar que entre los hisopados rectalespositivos, en dos muestras se obtuvo E. coli

productora de KPC (confirmada por el Centro Nacionalde Referencia) en cultivo mixto con K. pneumoniae

KPC. Hasta el momento no se aislaron en materialesclínicos distintos a los hisopados de este estudio(Errecalde L, comunicación personal).

Las conclusiones de nuestro trabajo son:a) Comparando el medio CHROMagar KPC con el

método del CDC, el primero resultó ser un métodomás rápido, con mayor recuperación de aislamientosproductores de KPC y menor detección de FP que elsegundo.

b) Debido a las características epidemiológicas dela Argentina, se observa el desarrollo en elCHROMagar KPC de cepas resistentes a carbapenemspor mecanismos no enzimáticos, que no requierenponer al paciente en aislamiento de contacto. Por estemotivo es importante caracterizar fenotípicamente atodas las bacterias que desarrollan en este medio.

Agradecimientos: al Servicio de Antimicrobianos del INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” por la caracterización molecularde las cepas. A la Dra. Liliana Guelfand por la lectura crítica deeste manuscrito. Al personal médico y de enfermería del hospitalJuan A. Fernández, por la colaboración en la toma de muestras.A la enfermera en control de infecciones Lic. Carmen Ramallo.

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N.° de hisopadosn = 81

6 Positivo Positivo

3 Positivo Negativo

43 Negativo Negativo

3 Negativo K. pneumoniae sensible acarbapenems

23 Negativo Acinetobacter spp.

1 Negativo Acinetobacter sp. + E. colisensible a carbapenems

1 K. pneumoniae resistente a K. pneumoniae resistente acarbapenems carbapenems

1 Acinetobacter sp. Acinetobacter sp. + E. colisensible a carbapenems

Tabla 1. Desempeño comparativo del CHROMagar KPC y del método propuesto por el CDC

CHROMagar KPC Método del CDC

CHROMagar KPC 93

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Recibido:25/10/2011- Aceptado:2/1/2012

94 Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 94-96ISSN 0325-7541


Two cases of urinary tract infection caused by Shigatoxin-producing Escherichia coli O157:H7 strains

MARÍA DEL P. GADEA1, NATALIA DEZA2, MARÍA I. MOTA1,3, CAROLINA CARBONARI2, MITILA ROBATTO3,BEATRIZ D’ASTEK2, VICTORIA BALSEIRO1, CRISTINA BAZET3, EDUARDO RÜGNITZ 4, VALÉRIE LIVRELLI5,

FELIPE SCHELOTTO1, MARTA RIVAS2, GUSTAVO VARELA1*

1 Departamento de Bacteriología y Virología, Facultad de Medicina, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay;2 Servicio Fisiopatogenia, INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, Buenos Aires, Argentina; 3 Laboratorio de Patología Clínica.

Facultad de Medicina, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay; 4 Departamento de Medicina Interna,Facultad de Medicina, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay; 5 Clermont Université, Université d’Auvergne,

JE 2526, Clermont-Ferrand, France.*Correspondence. E-mail: [email protected]

RESUMEN

Dos casos de infección del tracto urinario causados por cepas de Escherichia coli O157:H7productoras de toxina Shiga. En los seres humanos, las cepas STEC pueden producir infección en sitiosextraintestinales, como el tracto urinario, y causar complicaciones graves. Comunicamos dos casos de infecciónurinaria por STEC en dos mujeres ancianas con comorbilidades. Aunque ambas cepas correspondieron alserotipo O157:H7 y portaban los genes asociados con enfermedad grave, ninguna de las pacientes desarrollósíndrome urémico hemolítico (SUH). Estos hallazgos constituyen una evidencia adicional de la presencia deestos agentes en nuestro país y en la región, y destacan la necesidad de mantener un sistema activo devigilancia, con especial énfasis en el estudio de otros sitios de infección en pacientes que presentan SUH noasociado a diarrea.

Palabras clave: E. coli O157:H7, STEC, infección del tracto urinario

ABSTRACT

STEC strains can infect extra-intestinal sites such as the human urinary tract and sometimes cause severecomplications. We report two cases of urinary tract infection caused by STEC in two elderly women with comorbidities.Although both strains belonged to the O157:H7 serotype and carried genes associated with severe illness, noneof the patients developed hemolytic uremic syndrome (HUS). These findings provide additional evidence for thepresence of these agents in our country and in the region, and highlight the need to maintain an active surveillancesystem of HUS cases, placing special emphasis on the study of other sites of infection in patients with non-diarrheal HUS.

Key words: E. coli O157:H7, STEC, urinary tract infection

Shiga toxin (Stx)-producing Escherichia coli

(STEC) can cause diarrhea, hemorrhagic colitis andhemolytic uremic syndrome (HUS). Post-enteric HUS,a life-threatening complication, is characterized bythrombocytopenia, microangiopathic hemolyticanemia and acute renal failure. Moreover, STECstrains can infect the human urinary tract and alsocause non-diarrheal HUS (1, 6).

The ability of STEC strains to cause severe diseasein humans is related to the capacity to secrete Stx1,Stx2, and/or variant toxins (1), encoded by lysogenicbacteriophages. Another virulence factor of STEC strainsis a 94-kDa outer membrane protein, called intimin. It is

M.P.G., N.D. and M.I.M. contributed equally to this work.

encoded by an eae gene located within a 34-kbchromosomal pathogenicity island termed locus ofenterocyte effacement (LEE). This locus is associatedwith intimate adherence to epithelial cells, initiation ofhost signal transduction pathways and formation ofattaching-and-effacing intestinal lesions (1). Some STECstrains also produce an enterohemorraghic hemolysin(EHEC-Hly), encoded by a large plasmid-borne (90-kb)ehxA gene, which has been associated with severeclinical disease in humans (1).

In the present report we describe two cases ofurinary tract infection (UTI) caused by STEC O157:H7in adults who did not develop HUS.

E. coli O157:H7 in urinary tract infections 95

First case. An 84-year-old woman with a medicalhistory of hypertension, vaginal prolapse and a stage3 chronic kidney disease was admitted to hospitalon July 5, 2010 with fever and anorexia. She hadwatery diarrhea during 48 hours prior to admission,without fever, nausea or vomiting. Diuresis wasmaintained.

Laboratory tests yielded the following results: serumpotassium 8.5 mEq/l (normal range 3.5-5.5 mEq/l),azotemia 1.65 g/l (normal range 0.2-0.6 g/l), creatinine1.78 mg/dl (normal range 0.2-0.6) mg/dl, and hemoglobin9.6 mg/dl (normal range 12-16 mg/dl). The blood cellcount, peripheral blood smear and liver function testswere normal.

The urine analysis showed some polymorphonuclearleukocytes. The clean-catch midstream urine specimenyielded a pure culture with a count of 105 CFU/ml. Thepatient received 3 g of ceftriaxone i/v per day, withgood clinical outcome. The isolate (IH1) was identifiedas E. coli O157 (99 % probability) using the Vitek 2Compact System (bioMérieux, Inc., Marcy l’Etoile,France) and was then sent to the Bacteriology andVirology Department-Institute of Hygiene, Universidadde la República, and to the National ReferenceLaboratory of Argentina, to complete its characterization.

Second case. A 72-year-old woman with a medicalhistory of urinary incontinence and repeated urinaryinfections, living in an elderly long term care facilitylocated in the same town as that of the first patient,was admitted to hospital with symptoms of acutecystitis on October 25, 2010.

In 2002, she had undergone total hysterectomyand bilateral anexectomy due to an ovarian mucinouscystadenoma.

The urine analysis showed leukocytes, erythrocytesand 0.3 g/l proteinuria. The clean-catch midstream urinespecimen yielded a pure culture with a count higherthan 105 CFU/ml and the isolate (IH2) was identifiedas E. coli O157 (99 % probability) using the Vitek 2Compact System. The patient received 15 mg/kg ofcefuroxime axetil orally every 24 hours, with goodclinical outcome. The strain was also submitted to theabovementioned laboratories to complete itscharacterization.

Confirmation of isolates as E. coli was performedthrough biochemical tests and the serotyping wasconducted using antisera provided by the InstitutoNacional de Producción de Biológicos - ANLIS “Dr.Carlos G. Malbrán”.

Antimicrobial susceptibility to amikacin, ampicillin,ceftriaxone, cefuroxime, ciprofloxacin, cloramphenicol,

colistin, gentamicin, nalidixic acid, nitrofurantoin,streptomycin, tetracycline, and trimethoprim-sulfamethoxazole was established according to ClinicalLaboratory Standards Institute (CLSI) guidelines (2).

The stx1, stx2, and rfbO157 genes were detected bymultiplex PCR as described by Leotta et al. (4), whilethe ehxA, eae, and fliCH7 genes were investigatedaccording to previously described procedures (5).

In order to determine Stx production, bacterialsupernatant and periplasmic cell extracts were usedon Vero cells for cytotoxicity assays (5).

The orientation of the invertible DNA elementcontaining the fimA promoter was determined usinga PCR-RFLP assay (7).

Phage typing was performed by the methoddescribed by Khakhria et al. (3).

Strain IH1 was characterized as E. coli O157:H7harboring the stx1, eae-γ1, ehxA, flicH7 and fimA (phaseoff) genes of phage type (PT) 39. Meanwhile, the strainIH2 was characterized as E. coli O157:H7 harboringthe stx

1/stx

2, eae-γ1, flic

H7 and fimA (phase off) genes

of PT40. The expression of toxicity in Vero cell assays,and of flagellar antigens by slide agglutination weredemonstrated in both isolates.

Both strains were susceptible to all antibioticstested.

Unusual cases of HUS involving patients presentingwith UTI have been previously reported. The O-groupsof the STEC strains involved were OX3, O5, O103,O138, O145, and O157 (6).

However, this is the first report in Uruguay and inthe region of extra intestinal STEC infections. Itprovides evidence of two episodes of UTI occurringin two elderly women with previous gynecologic andurinary disease, which are known predisposingfactors favoring access and settlement of bacteria inthe urinary tract. The first patient also had a previouswatery diarrhea episode; however, no studies wereconducted for detection of enteropathogens.

Although both strains belonged to the O157:H7serotype and carried genes associated with severeillness, neither patient developed HUS.

Neither the origin and the reservoir of the recoveredO157:H7 STEC strains, nor the epidemiologic linkbetween both UTI cases could be established.Furthermore, both strains showed different stx-genotypes and PTs.

We can assume that the STEC O157:H7 strainsreached the urinary tract by the ascending route fromthe gastrointestinal tract. Both patients had knownpredisposing factors that favored it.


Between 2002 and 2008, we studied 36 children withclinical diagnoses of post-enteric HUS; in three caseswe recovered STEC strains of serotypes O157:H7,O111:NM, and O26:H11, and in a fourth case a STECO26:H11/O145:HNT co-infection was detected (8).However, there have been no previous local or regionalreports of non-diarrheal HUS caused by STEC or UTIepisodes due to this pathogen.

The detection of STEC O157:H7 in urine infectionsprovides additional evidence about the presence ofthis serotype in the region, reinforcing the importanceof conducting active surveillance of gastrointestinaland urinary infections caused by STEC.

Written consent: both patients have given theirinformed consent for the case reports to be published.

Acknowledgements: this work was partially supported bya grant from the Comisión Sectorial de Investigación Científica(CSIC)-UdelaR, Montevideo, Uruguay and by the ECOS-SudProgram (U08B02).

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Recibido: 29/11/2011 - Aceptado: 7/5/2012

Diagnóstico de Mansonella ozzardi por la técnica de PCR 97ISSN 0325-7541


Aporte de la técnica de PCR en el diagnóstico de Mansonellaozzardi en zonas endémicas de la Argentina

MARÍA F. DEGESE*, MARTA G. CABRERA, SILVIO J. KRIVOKAPICH, LUCIA E. IRAZU,MARCELO A. RODRÍGUEZ, EDUARDO A. GUARNERA

Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud “Dr. Carlos G. Malbrán”, Instituto Nacional de EnfermedadesInfecciosas, Departamento de Parasitología. Av. Vélez Sarsfield 563 (1281) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.


ABSTRACT

Contribution of the PCR assay to the diagnosis of Mansonella ozzardi in endemic areas of Argentina.Mansonella ozzardi is a tissue-dwelling parasitic nematode, the causative agent of mansonelliasis in almost allLatin American countries. It has been described along the Argentine Yungas region. The microscopic diagnosiscan yield false-negative test results at low microfilaremia levels. The aim of this study was to optimize themolecular diagnostic technique and compare it with the Knott’s method and standard blood smear procedures(thin blood films and thick smears) in 92 blood samples of individuals from an endemic area. The PCR techniquefollowed by the sequencing of the amplified product yielded 100 % sensitivity compared to the Knott’s test, whichis considered a reference method. Seven more cases of this parasitosis could only be identified with the moleculartechnique.

Key words: Mansonella ozzardi, diagnosis, PCR, Argentina

RESUMEN

Mansonella ozzardi es un nematode parásito tisular, agente etiológico de mansonellosis en casi la totalidad de lospaíses latinoamericanos. En Argentina la mansonellosis ha sido descrita a lo largo de la región de las yungas. Sudiagnóstico microscópico puede dar resultados falsos negativos en microfilaremias bajas. El objetivo del presenteestudio fue optimizar su diagnóstico molecular y comparar los resultados con los obtenidos mediante las pruebasmicroscópicas de Knott, de gota gruesa y de extendido hemático fino, en 92 muestras de sangre de pacientes dezona endémica. La técnica de PCR seguida de la secuenciación del producto amplificado presentó una sensibilidaddel 100 % frente al método de Knott, considerado como referencia, e incluso permitió identificar 7 casos más dela parasitosis.

Palabras clave: Mansonella ozzardi, diagnóstico, PCR, Argentina

Mansonella ozzardi es un nematode filárico, agenteetiológico de mansonellosis en casi la totalidad de lospaíses latinoamericanos. Esta afección es transmitidapor insectos dípteros hematófagos de los génerosCulicoides y Simulium. Los parásitos adultos, de sexoseparado, miden de 3 a 7 cm y se localizan en losplexos mesentéricos; desde allí las hembras fecundadasdepositan las microfilarias, de aproximadamente 200micrones de longitud, en la sangre y, en menor número,en el tejido celular subcutáneo (3).

Las microfilarias humanas fueron descritas en laArgentina por primera vez en 1913 por Biglieri y Aráoz,en la provincia de Tucumán (2), tras un relevamientodel índice malárico en la región. Estos investigadoresconsideraron que se trataba de una nueva especie ala que denominaron Microfilaria tucumana. Estudiosposteriores revelaron la existencia de M. ozzardi a lolargo de toda la nuboselva tucumano-oranense o

región de las yungas (10). El vector identificado enesta zona es el Culicoides lahillei (5).

No se conoce una enfermedad definida atribuible aesta parasitosis. Se han descrito casos aislados conadenopatías, linfoedemas, artralgias y mialgias (3) y,en estudios recientes, ha sido asociada a la presenciade lesiones oculares (4).

Tradicionalmente, el diagnóstico se realiza a travésde la observación de las microfilarias al microscopioóptico, en sangre capilar o venosa, por medio dediversos métodos, entre ellos el examen directo de lasangre o gota fresca, el examen de extendidos hemáticosen capa fina y gota gruesa teñidos con Giemsa (EF yGG, respectivamente), el método de Knott (KNOTT) y lafiltración por membrana de la sangre (FM). Los tresúltimos son utilizados como métodos de concentración.

Eventualmente, el diagnóstico de la mansonellosisconstituye un hallazgo incidental cuando se realizan


exámenes hematológicos de rutina o durante la búsquedade otras parasitosis en extendidos sanguíneos, debidoa la falta de entidad clínica.

Aun cuando el método microscópico es práctico,económico y permite identificar la especie, requierede un observador experimentado y puede dar resultadosfalsos negativos en pacientes con microfilaremia baja.En un estudio reciente realizado en Brasil (11), latécnica de PCR demostró mayor sensibilidad que laFM cuando ambos métodos fueron comparados con latécnica de GG.

El objetivo del trabajo fue optimizar el diagnósticode infección por M. ozzardi a través de una técnica dePCR y comparar los resultados con los alcanzadosmediante técnicas de microscopía óptica de usohabitual en la rutina en nuestro laboratorio.

Se seleccionaron al azar 92 pacientes residentesde Sargento Moya (latitud: 27°13’59.88"S, longitud65°32’60.00"O), departamento de Monteros, provinciade Tucumán. Este lugar forma parte de la ecorregiónde las yungas, donde existe alta prevalencia demansonellosis.

Se obtuvo sangre entera con EDTA, sangre en formolal 2 % (1 ml de sangre venosa/10 ml de formol al 2 %,para realizar KNOTT) y extendidos hemáticos de capafina. Solo en 10 de los 92 pacientes estudiados serealizaron, además, extendidos hemáticos de gotagruesa.

Se emplearon las técnicas de EF, GG y KNOTT,esta última, con observación directa del sedimento

(KNOTTD) y poscoloración de Giemsa (KNOTTG) (6).Las muestras de sangre entera se dividieron en

alícuotas, estas se colocaron en criotubos de 300 µl yse conservaron a -20 ºC. Se extrajo el ADN de dichasmuestras con el método de extracción de proteinasa Ky fenol-cloroformo (1). El ADN obtenido se resuspendióen 30 ul de agua bidestilada estéril; la calidad y cantidaddel ADN se evaluaron por electroforesis en gel deagarosa al 1 % y fluorescencia al UV con bromuro deetidio y marcadores de peso molecular. Las muestrasse conservaron a 4 ºC hasta su uso. Para determinarla especificidad analítica del ensayo, se extrajo ADNde larvas de Toxocara cati y Toxocara canis, deStrongyloides stercoralis y de Dirofilaria immitis.

Para la identificación de las microfilarias seutilizaron los cebadores MoITS, situado a 227 pbdel extremo 3’ del ITS2, y NC2, situado en el extremo5’ del ADNr 28 S, para amplificar una región del ADNribosomal de 295 pb, específica de Mansonella

ozzardi (7).La mezcla de reacción de PCR se realizó en un

volumen final de 25 µl, que contenía 2 µl de ADNtemplado; 0,5 U de Taq polimerasa (Invitrogen); 10 mMde Tris-HCl pH 9,6; 50 mM de KCl; 1,5 mM de MgCl2,60 µM de cada dNTP, 5 pmol de NC2 y 10 pmol deMoITS2.

Las condiciones de ciclado (termociclador EppendorfMastercycler Gradient) incluyeron una primeradesnaturalización a 94 ºC durante 120 seg, seguidapor 35 ciclos de 15 seg a 94 ºC (desnaturalización),

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa (2 %) de los productos de la PCR. Las calles 1 a 12 muestran losresultados obtenidos con las muestras N.º 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 15, 18, 19 y 20, respectivamente. Calles 13y 14: controles negativos. Calle 15: marcador de PM (100 pb). Se observa la banda de 295 pb en las calles 1,2, 3, 6, 9, 10 y 11

300 pb

200 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Diagnóstico de Mansonella ozzardi por la técnica de PCR 99

30 seg a 52 ºC (hibridación) y 30 seg a 72 ºC(extensión), con una extensión final de 10 min a 72 ºC(7). Como control negativo se utilizó agua bidestiladaestéril.

Los fragmentos de ADN amplificados por PCR fuerondeterminados por electroforesis en geles de agarosa al2 % y comparados con un marcador de tamañomolecular de 100 pb (Fermentas), tras teñir con bromurode etidio (Figura 1).

Las muestras que dieron la señal esperada fueronpurificadas con columnas de purificación de productosde amplificación de PCR a partir de geles de agarosa(Nucleospin Extract II). La secuencia de nucleótidosde los productos de amplificación fue determinadapor la secuenciación automática del ADN utilizandoel ABI PRISM Big DyeTM Terminator Cycle SequencingReady Reaction Kit (Perkin Elmer Applied Biosystems).La electroforesis en gel se llevó a cabo en el secuenciadorautomático de ADN ABI 377 (Perkin Elmer).

Los datos de secuenciación fueron analizados porel programa Chromas LITE 2.01 y las secuenciasfueron alineadas y comparadas con la base de datosgenética a través del programa Mega 4.0.1., paracomprobar que los fragmentos de ADN amplificadosde las muestras en estudio correspondían a M. ozzardi.

La secuencia nucleotídica obtenida se encuentradisponible en la base de datos GenBank con el númerode acceso JN871884.

La PCR dio la señal esperada en el 57,6 % de lasmuestras (53/92). El método KNOTTG arrojóresultados positivos en el 50 % de las muestras (46/92); el KNOTTD en el 45,6 % (42/92) y el examen deEF en el 27,2 % (25/92). Las muestras positivas porEF también lo fueron por los otros métodos, así comolas muestras positivas por KNOTTD fueron positivastambién por KNOTTG y PCR, y 7 muestras fueronsolo positivas por PCR.

No se obtuvo señal cuando se utilizó comotemplado para la PCR el ADN de larvas de T. cati yT. canis, de S. stercoralis y de D. immitis.

Para la estimación del rendimiento diagnóstico dela PCR, se compararon los resultados de las muestrasanalizadas por PCR y por KNOTTG, este últimoconsiderado como método de referencia en nuestrolaboratorio. Los resultados fueron los siguientes:sensibilidad diagnóstica del 100,0 % (IC95%: 90,4-100,0), especificidad diagnóstica del 84,8 % (IC95%:70,5-93,2); valor predictivo negativo (VPN) del 100 %(IC95%: 88,8-100,0) y valor predictivo positivo (VPP)del 86,8 % (IC95%: 74,0-94,1). Para estimar si existendiferencias en la capacidad de discriminacióndiagnóstica de ambos métodos se aplicó el test deMc Nemar, el que reveló diferencias significativas (p:0,016) (Tabla 1).

La secuenciación de los fragmentos de ADNamplificados permitió identificarlos como pertenecientesa M. ozzardi. Los métodos microscópicos permitieronsu identificación sobre la base de las característicasmorfológicas.

Las técnicas de microscopía que concentran lamuestra seguidas de la coloración de Giemsaaumentan la posibilidad de encontrar microfilarias. Eneste sentido, el método KNOTT dio mejores resultadosque el de GG porque concentra mayor volumen demuestra, en concordancia con lo que informan otrosautores (6).

El rendimiento diagnóstico de la PCR nos permiteconcluir que el método molecular presentó unaexcelente sensibilidad diagnóstica en comparacióncon el método de KNOTTG.

Del análisis estadístico se desprende que lasdiferencias significativas encontradas (Mc Nemar: p< 0,05) se deben a las discrepancias observadas en7 muestras, que fueron negativas por KNOTTG ypositivas por PCR.

(1) seguida de secuenciación de los fragmentos amplificados; (2) método de Knott con observación poscoloraciónde Giemsa; (3) valor predictivo positivo; (4) valor predictivo negativo

Tabla 1. Rendimiento de las técnicas de PCR(1) y de KNOTTG(2) en el diagnóstico de la mansonellosis

KNOTTG

Parámetro %+ -

+ 46 7 Sensibilidad 100,0 (90,4-100,0)

- 0 39 Especificidad 84,8 (70,5-93,2)

VPP (3) 86,8 (74,0-94,1)

VPN (4) 100,0 (88,8-100,0)

Intervalo deconfianza 95 %

PCR


Para intentar comprender la causa de estas dife-rencias, se tuvo en cuenta el análisis de secuenciaciónde los fragmentos de ADN amplificados por PCR. Losresultados mostraron que, efectivamente, las 7muestras eran de M. ozzardi, es decir, que estasmuestras no arrojaron resultados falsos positivos dela PCR, sino que dieron resultados falsos negativosde KNOTTG. Además, no se observaron señalespositivas de la PCR con otros nematodes ensayados,lo que indicaría una buena especificidad analítica delmétodo.

Este hallazgo representa un aporte de las técnicasde biología molecular en la optimización del diagnósticode infección por M. ozzardi. Este método pudo identificar7 casos positivos que no habían sido detectados porlos métodos tradicionales ensayados. Otros autoreshan demostrado la mayor sensibilidad de esta técnicacomparada con la de FM (11).

La mayor sensibilidad de la PCR hace posible labúsqueda del parásito en una pequeña fracción demuestra y permite llegar a un diagnóstico específico através del análisis de secuenciación del productoobtenido. Los métodos microscópicos suelen requerirpasos previos de concentración de un volumenconsiderable de muestra.

En pacientes con sospecha de la enfermedad porresidir en sitios endémicos, la PCR permitió diagnosticarla infección en casos donde la microscopía fue negativa,probablemente debido a una microfilaremia baja.

Se sugiere considerar esta prueba en el diagnósticode infección por M. ozzardi, principalmente en estudiosepidemiológicos tendientes a conocer la prevalenciade la infección, para avanzar en el conocimiento deesta parasitosis.

Recibido:25/10/2011- Aceptado: 18/4/2012

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Staphylococcus aureus en manipuladores de alimentos 101ISSN 0325-7541


Portación y caracterización de Staphylococcus aureus enmanipuladores de alimentos

GRACIELA B. JORDÁ*1, RAÚL S. MARUCCI1, ADRIANA M. GUIDA1, PATRICIA S. PIRES1,EDUARDO A. MANFREDI2

1Cátedra de Microbiología General, Carrera de Bioquímica, Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales, UniversidadNacional de Misiones. Mariano Moreno 1375 (3300) Posadas, Misiones; 2 INEI-ANLIS “Dr. Carlos Malbrán”.

Av. Vélez Sarsfield 563 (1281) Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Argentina.*Correspondencia. E-mail: [email protected]

ABSTRACT

Carriage and characterization of Staphylococcus aureus in food handlers. Staphylococcus aureus causesfood poisoning due to its ability to produce enterotoxins. Food handlers carrying enterotoxin-producing S. aureus

can contaminate food, thus leading to food poisoning. Samples were obtained from 88 food handlers in theProvince of Misiones, Argentina. S. aureus was isolated from nasal swaps and PCR amplification was performedfor genes encoding staphylococcal enterotoxins. A total of 37.5 % food handlers were positive for S. aureus.

Expression of enterotoxin genes was found in 13 of the 33 (39.4 %) S. aureus isolates studied, accounting for 14.7% of food handlers. Gene sea was detected in 10 isolates followed by gene sec in 3 isolates. All isolates weresusceptible to teicoplanin, gentamicin and rifampicin. Four isolates were resistant to methicillin whereas 2 isolateswere resistant to clindamycin and erythromycin. These results constitute a critical alert and indicate the need fordeveloping rational measures to reduce the potential risk of food poisoning.

Key words: Staphylococcus aureus, food handlers, food poisoning

RESUMEN

Staphylococcus aureus es una causa de intoxicaciones alimentarias por su capacidad de producir enterotoxinas.Los manipuladores de alimentos que portan S. aureus productores de enterotoxinas pueden provocar intoxicacionesalimentarias. Se estudiaron muestras tomadas de fosas nasales de 88 manipuladores de alimentos en la provinciade Misiones. El 37,5 % de los individuos analizados eran portadores de S. aureus. Mediante técnicas de amplificación(PCR), se detectaron genes que codifican la producción de enterotoxinas en 13 de los 33 aislamientos obtenidos(39,4 %) y en el 14,7 % de los manipuladores. De estos aislamientos, 10 portaban el gen sea y 3 el gen sec. Elestudio de sensibilidad a los antibióticos mostró un 100 % de sensibilidad a teicoplanina, gentamicina y rifampicina;2 aislamientos fueron resistentes a clindamicina y a eritromicina y 4 resultaron resistentes a la meticilina. Estosresultados son un alerta e indicarían la necesidad de desarrollar medidas racionales para reducir el riesgopotencial de intoxicaciones alimentarias.

Palabras clave: Staphylococcus aureus, manipuladores de alimentos, intoxicaciones alimentarias

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA)se encuentran ampliamente extendidas y constituyenun problema prioritario de salud pública, tanto en paísesdesarrollados como en aquellos en vía de desarrollo(4).

El agente etiológico más frecuente de las intoxicacionesde origen alimentario es Staphylococcus aureus. Lapresencia de este microorganismo se asocia con lacontaminación introducida por los manipuladores dealimentos, el incumplimiento de buenas prácticas demanufactura o la utilización de materia primacontaminada (2-5, 8, 12, 13).

S. aureus es un microorganismo ubicuo que puedecolonizar la nasofaringe, la piel y las mucosas dehombres y animales, y puede establecerse en un medio

ambiente propicio. Suele contaminar alimentos y,eventualmente, producir una intoxicación aguda debidoa la presencia de una toxina emética muy resistenteal calor y a las enzimas proteolíticas. Las principalesenterotoxinas involucradas son designadas con letrasde la A a la U; dentro de la variedad C existen tressubtipos (4, 11). Al ingerirse el alimento contaminado,la enterotoxina se encuentra ya formada, por lo que elperíodo de incubación es muy corto (menos de treshoras). Las manifestaciones clínicas características,que en general cursan sin fiebre, comprenden náuseas,vómitos intensos, espasmo abdominal y diarrea. Enalgunos casos se observa moco y sangre en losvómitos o en las heces (4, 11). El cuadro suele presentaruna evolución favorable, con tendencia a la recuperación


en 24-48 h, aunque pueden producirse formas gravescon hipotensión, hipotermia y shock (4).

Debido a que las enterotoxinas estafilocócicas sonlas responsables del cuadro clínico y persisten en losalimentos cocinados, aun cuando el microorganismoya no resulte viable (5, 9, 14), no solo es importanteinvestigar la presencia de la bacteria, sino tambiénestablecer si se trata de aislamientos productores deenterotoxina.

El sistema regulador de la expresión de los factoresde virulencia de S. aureus se asocia fuertemente a lacapacidad de este microorganismo de multiplicarsehasta niveles aproximados a 106 UFC/g. Los factoresambientales, entre otros la temperatura, desempeñanun papel importante en la expresión de los genes delas enterotoxinas estafilocócicas (4).

Dado que la presencia de S. aureus en las fosasnasales, las fauces y la piel del hombre es frecuente,los manipuladores de alimentos que no utilizancorrectamente guantes y barbijos o que no cumplencon otras recomendaciones de buenas prácticaspotencian el riesgo de contaminación de los alimentosen los procesos de elaboración y comercialización (4).

En la actualidad, Misiones es una de las provinciasargentinas de mayor afluencia turística y este hechodemanda optimizar las pautas de calidad en los serviciosde gastronomía. Por lo tanto, es necesario que elpersonal involucrado en la manipulación de los alimentosconozca la importancia de los procedimientos quepermiten reducir los riesgos de transmisión de estemicroorganismo, a fin de preservar la salud de losconsumidores.

Al no existir informes nacionales ni locales, se diseñóel presente trabajo con el objetivo de detectar laportación de S. aureus en manipuladores de alimentosen la provincia de Misiones, evaluar la producción deenterotoxinas y determinar la sensibilidad a losantibióticos en los aislamientos obtenidos.

Se incluyeron en el estudio 88 manipuladores dealimentos afectados a dos restaurantes de la ciudadde Posadas y a uno de la ciudad de Puerto Iguazú(restaurantes I, III y II, respectivamente, en la Tabla 1),y de cuatro sucursales de una panadería de Posadas.Los establecimientos cumplimentaban los requerimientoslegales de habilitación. La autorización para la tomade muestra al personal afectado a las distintas tareasse logró con la firma de un acta-acuerdo con lospropietarios de los establecimientos, que incluyó lainvitación a participar, el consentimiento del personalinvolucrado, la confidencialidad de los resultados y laimplementación de actividades de capacitación sobrela importancia de las buenas prácticas de manufactura,en la modalidad de talleres.

Las edades de los manipuladores fluctuaron entrelos 24 y 59 años; 22 eran mujeres y 66 eran hombres.Las muestras se obtuvieron de la zona nasofaríngeamediante hisopos de dacrón estériles (Eurotubo,Deltalab) y se remitieron inmediatamente al Laboratoriode Microbiología General que funciona en el Módulo deFarmacia y Bioquímica de la Facultad de CienciasExactas, Químicas y Naturales de la UniversidadNacional de Misiones. Las muestras se inocularon enplacas de agar manitol salado (Britania) y se incubarona 37 °C durante 24-48 h (5).

Las colonias compatibles con S. aureus fueronsometidas a la observación microscópica con tinciónde Gram e identificadas mediante las siguientespruebas bioquímicas: catalasa, coagulasa, DNasa,Voges Proskauer, sensibilidad a la novobiocina yfermentación anaeróbica de la glucosa. El estudio dela sensibilidad a los antibióticos se efectuó mediantela técnica de difusión en agar, según la metodologíarecomendada por el Clinical and Laboratory Standards

Institute (CLSI). Se utilizaron discos (Britania) con lossiguientes agentes antibacterianos: oxacilina (1 µg),clindamicina (2 µg), eritromicina (15 µg), cefoxitina (30 µg),

Establecimiento N N % sea seb sec sed see

Restaurante I (Posadas) 23 10 43,5 3 - 2 - -

Restaurante II (Pto. Iguazú) 16 6 37,5 4 - - - -

Restaurante III (Posadas) 16 3 18,8 - - - - -

Panaderías (4 locales) (Posadas) 33 14 42,4 3 - 1 - -

Total 88 33 37,5 10 0 3 0 0

Tabla 1. Distribución de S. aureus y presencia de genes productores de enterotoxinas en aislamientos obtenidos demanipuladores de alimentos de la provincia de Misiones

Genes productores de enterotoxinasPortación deS. aureus

Origen y tamaño muestral

Staphylococcus aureus en manipuladores de alimentos 103

teicoplanina (30 µg), rifampicina (5 µg) y gentamicina(10 µg).

Los aislamientos de S. aureus se conservaron enagar tripteína de soja semisólido hasta su derivaciónal Servicio Fisiopatogenia del Departamento deBacteriología del INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”,cumpliendo con las normas de envío vigentes.

Los genes que codifican las enterotoxinas A, B, C, Dy E, más frecuentemente asociadas a brotes deintoxicación alimentaria, se detectaron mediante técnicasde biología molecular. Se utilizó una PCR múltiple A-B-Cpara la detección de los genes sea, seb, sec1, sec2 ysec3 de S. aureus enterotoxigénico, y otra PCR mútipleD-E para la detección de los genes sed y see, según elprotocolo descrito por Manfredi et al. (11).

Se obtuvieron 33 aislamientos de S. aureus de los88 individuos analizados, lo que implica un 37,5 % deportación de este microorganismo en manipuladoresde alimentos. La distribución con respecto al sexofue la siguiente: 25 hombres y 8 mujeres. De los 33aislamientos, 13 fueron potencialmente enterotoxigénicos:10 presentaron el gen que codifica la enterotoxinaA y 3 el que codifica la enterotoxina C. No sedemostró la presencia de los genes codificantes delas enterotoxinas B, D ni E. La Tabla 1 muestra ladistribución de los aislamientos de S. aureus y de losgenes codificantes de enterotoxinas que surgió delrelevamiento efectuado.

El análisis de sensibilidad a los antibióticosmostró que todos los aislamientos de S. aureus

presentaron halos de inhibición frente a teicoplanina,a gentamicina y a rifampicina, y 2 fueron resistentesa la clindamicina y a la eritromicina. Se encontróresistencia a meticilina en 4 aislamientos.

En los establecimientos estudiados, la prevalenciade portadores nasales de S. aureus resultó, en promedio,del 37,5 %, con un rango que varió entre el 18,8 % y el43,5 %. Estos valores son compatibles con lo que informanalgunas comunicaciones nacionales e internacionales,donde la prevalencia osciló entre el 25 % y el 45 % (1, 3,5, 12).

En este trabajo se detectó un 39,4 % de aislamientosque portaban los genes codificantes de enterotoxinas(14,7 % de los manipuladores estudiados); estafrecuencia resultó inferior a las comunicadas en otrasinvestigaciones de Latinoamérica, donde seobservaron valores superiores al 50 % (5, 10). El genpredominante en este estudio fue sea, lo que coincidecon lo referido en comunicaciones internacionales(3, 5, 8, 10). No se ha observado la producciónsimultánea de dos o más grupos toxigénicos, comoinforman Figueroa et al. (5).

El estudio de sensibilidad a los antibióticos mostróque la mayoría de los aislamientos obtenidos de losmanipuladores de alimentos fueron sensibles a losantibióticos ensayados y de uso frecuente en laterapia, en coincidencia con los datos obtenidos porAcco et al. (1). El porcentaje de resistencia a meticilina(12 %) superó el 5,9 % informado por Cifuentes et al.

(2). Otros autores, en cambio, no hallaron resistenciaa dicho antibiótico (5).

S. aureus es uno de los patógenos responsablesde las intoxicaciones alimentarias, de modo que esimportante estar alerta con respecto a las cepasaisladas en la comunidad y su comportamiento frentea los antibióticos.

Este trabajo contribuye al conocimiento de portaciónde S. aureus en manipuladores de alimentos en laprovincia de Misiones, información no disponible hastael presente para esa provincia y escasamente en elresto del país (6). Sería interesante promover larealización de trabajos similares en otras jurisdiccionesde la Argentina, para conocer la frecuencia deaislamientos de S. aureus potencialmente enterotoxi-génicos en manipuladores de alimentos en el país ensu conjunto.

Nuestra expectativa es que este trabajo contribuyade forma significativa al conocimiento del problema yque se implementen medidas tendientes a reducir elnúmero de las intoxicaciones alimentarias por S. aureus.

AGRADECIMIENTOS: a la Facultad de Ciencias Exactas,Químicas y Naturales (UNaM), por el uso de las instalacionesy los servicios prestados durante la realización de este trabajo.A los establecimientos gastronómicos, por la financiación de losmedios de cultivo utilizados, y, especialmente, a su personal, porpermitir la toma de muestras clínicas y colaborar en este tarea.

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Fungal lignocellulases and decolorization in grape stalks 105ISSN 0325-7541


Grape stalks as substrate for white rot fungi, lignocellulolyticenzyme production and dye decolorization

RESUMEN

Uso del escobajo como sustrato para el crecimiento de hongos de la pudrición blanca, la producciónde enzimas ligninolíticas y la decoloración de tinturas. El objetivo de este trabajo fue evaluar el potencialdel escobajo, un residuo agroindustrial, como sustrato para el crecimiento y la producción de enzimaslignocelulósicas de tres hongos causantes de pudrición blanca en la madera: Trametes trogii, Stereum hirsutumy Coriolus antarcticus. Para ello se utilizaron técnicas de fermentación en estado sólido. También se ensayó ladecoloración de colorantes industriales sobre estos cultivos. La pérdida de peso seco del sustrato fue similardespués del día 60 (33-43 %). C. antarcticus produjo las mayores actividades de lacasa y Mn-peroxidasa (33,0y 1,6 U/g peso seco). La mayor actividad endoglucanasa fue medida en cultivos de S. hirsutum (10,4 U/g), y lamayor actividad endoxilanasa en T. trogii (14,6 U/g). El sistema C. antarcticus/escobajo mostró un importantepotencial para su aplicación en la biorremediación de efluentes textiles, con porcentajes de decoloración de 93,86, 82, 82, 77 y 58 % para índigo carmín, verde de malaquita, azure B, azul R brillante de remazol, cristal violetay xilidina, respectivamente, en 5 h.

Palabras clave: escobajo, fermentación en estado sólido, hongos de la pudrición blanca, enzimas lignocelulósicas,decoloración

ABSTRACT

The aim of this work was to evaluate the potential of grape stalks, an agroindustrial waste, for growth andlignocellulolytic enzyme production via solid-state fermentation, using the following three white rot fungi: Trametestrogii, Stereum hirsutum and Coriolus antarcticus. The decolorization of several dyes by the above mentionedcultures was also investigated. Similar values of dry weight loss of the substrate were measured after 60 days(33-43 %). C. antarcticus produced the highest laccase and Mn-peroxidase activities (33.0 and 1.6 U/g dry solid).The maximum endoglucanase production was measured in S. hirsutum cultures (10.4 U/g), while the endoxylanasepeak corresponded to T. trogii (14.6 U/g). The C. antarcticus/grape stalk system seems potentially competitive inbioremediation of textile processing effluents, attaining percentages of decolorization of 93, 86, 82, 82, 77, and 58 %for indigo carmine, malachite green, azure B, remazol brilliant blue R, crystal violet and xylidine, respectively, in 5 h.

Key words: grape stalks, solid state fermentation, white rot fungi, lignocellulolytic enzymes, dye degradation

LAURA LEVIN*, LUIS DIORIO, EMANUEL GRASSI, FLAVIA FORCHIASSIN

Laboratorio de Micología Experimental, Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental, Facultad de Ciencias Exactasy Naturales, PROPLAME-PHRIDEB, CONICET, Universidad de Buenos Aires. Ciudad Universitaria, Pabellón II, Piso 4, (1428)

Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.*Correspondence. E-mail: [email protected]

Argentina is a leading wine-producing country inthe world. The quality and productivity of its wineriesare very competitive compared with those of moretraditional wine- producing countries such as France,Italy and Spain. Given its production output, Argentinarates as the main Latin American producer and has asignificant growth potential. The Argentine WineProduction Statistics Institute stated that during 2009,crop yields reached approximately 2,137,000 tons ofgrapes and wine production was about 1,076 millionliters (17). This picture also shows the need foradopting a sustainable management of the resourcesemployed and for recycling the important amount of

residues produced. Disposal and landfill of thosewastes present environmental and social drawbacks.New technologies were proposed not only for theirreuse in agriculture, but also for the production ofcommon and novel products for other sectors (31).

Pomace is the main solid residue of wine production,which contains 45 % grape skins, 30 % seeds and25 % grape stalks. It constitutes 12 % of a fresh grape’sweight. In Argentina, it accounts for around 213,000tons/y (17). Grape stalks have a high degree of fibers[lignin (22.94 %), cellulose (29.95 %) and hemicellulose(35.33 %)] and a high percentage of nutritive mineralelements, especially nitrogen and potassium (25). The


use of grape stalks in the form of single cell proteinafter solid state fermentation (SSF) has been proposedas ruminant feed or feeding component (32). Resultsindicate that, after biological lignin removal, thecellulose is better accessible to rumen microorganisms,and due to its good protein value and low lignin content,it has a similar value of digestibility as forages (54-60 %). SSF is another way of producing a variety ofcompounds like ethanol, citric acid, gluconic acid,carotenoids, xanthan, etc. (31).

Enzyme production is a growing field of biotechnology.Most enzyme manufacturers produce enzymes usingsubmerged fermentation (SmF) techniques. In general,enzyme titers in SSF are higher than in SmF, whencomparing the same strain and fermentation broth(39). White rot fungi (WRF) are so far unique in theirability to completely degrade all components oflignocellulosic materials. Cellulose biodegradation isa synergistic process involving endo-β-1,4-glucanase,cellobiohydrolase and β-glucosidase. Hydrolysis ofxylans mainly requires the action of endo-β-1,4-xylanase and β-xylosidase. The capability to degradelignin is due to their extracellular nonspecific andnonstereoselective enzyme system composed bylaccases, lignin peroxidases (LiPs) and Mn-peroxidases(MnPs), which function together with H2O2-producingoxidases and secondary metabolites (5, 10, 26). Thesame unique nonspecific mechanisms that give thesefungi the ability to degrade lignin also allow them todegrade a wide range of pollutants, among them:polycyclic aromatic hydrocarbons, chlorinated phenols,polychlorinated biphenyls, dioxins, pesticides, explosivesand dyes (35, 44). Purified laccases, LiPs and MnPsof different fungi are able to decolorize dyes ofdifferent chemical structure (16, 19, 34, 35). All ofthese enzymes are industrially important; thereforeorganisms able to produce them are interesting in viewof the potential importance in industrial processes suchas bioremediation, biobleaching of pulp paper, degradationand detoxification of recalcitrant substances or in thefood industry. Thus, the efficient production of theseenzymes in a low-cost medium is interesting forbiotechnological applications. Moreover, the value-added conversion of the bioproducts from winemakingcan help in reducing the negative costs and demonstratingsustainability in winemaking (31).

Various agricultural substrates/byproducts and WRFhave been used successfully in SSF for ligninolyticenzyme production (39). Two closely related substrateswere assayed in SSF for lignocellulolytic enzymeproduction: grape seeds, as substrate for laccaseproduction by Trametes hirsuta (28, 30) and grapevine

cutting wastes as substrate for laccase, MnP, celluloseand xylanase production by Cerrena unicolor (13). Grapestalks were assayed as substrate for ligninolyticenzyme production by Phanerochaete chrysosporium

during semi-solid-state cultivation. Grape stalks culturesof this fungus led to a decolorization of around 70 % ofPoly R-478 after 8 days of dye incubation (41). Grapestalks added to submerged cultures of Trametes

versicolor induced laccase production. Supernatantsof T. versicolor cultured in such substrate proved theircapacity to decolorize phenol red (25) and indigocarmine (27). But as far as we know, grape stalks hadnever been assayed before as sole substrate for theproduction of lignocellulolytic enzymes by WRF in SSF.

Several studies have demonstrated the ability ofWRF to decolorize synthetic dyes. However, moststudies on dye decolorization have been carried outusing liquid culture conditions or solid cultures onagar plates, which, however, do not reflect the naturalliving conditions (e.g. in wood and other lignocellulosicsubstrates) of WRF. SSF was chosen here becauseit mimics the natural environment of the WRF. Textiledye decolorization has been demonstrated with cellsuspensions, immobilized cells, crude enzymaticextracts and purified ligninolytic enzymes (1, 12, 16,19, 20). The major drawback to using an enzymepreparation is that once the enzymes becomeinactivated, decolorization activity ceases. However,with a whole cell culture, the enzymes could becontinually replenished. Immobilized cultures tend tohave a higher level of activity and are more resilient toenvironmental perturbations such as pH, or exposureto toxic chemical concentrations than suspensioncultures (33, 38). Immobilization by encapsulation in amatrix such as alginate may be too costly forwastewater treatment, while surface immobilization onan inexpensive material such as woodchips orlignocellulosic wastes is cheaper (43).

Trametes trogii (BAFC 463), Coriolus antarcticus

(BAFC 266), and Stereum hirsutum (BAFC 2234) areArgentinean strains of WRF that had proved to beefficient ligninolytic enzyme producers in previousstudies (21, 23, 24, 30). Their ability to decolorize awide range of textile dyes has been recentlydemonstrated (12, 16, 20, 22, 23, 29). The aim of thiswork was to evaluate the potential of grape stalks assupport for their growth and lignocellulolytic enzymeproduction under solid state conditions. The in vivo andin vitro decolorization of several dyes, by the abovementioned cultures was also investigated in order toassess their degradative abilities.

Fungal lignocellulases and decolorization in grape stalks 107

MATERIALS AND METHODS

Fungal strain and culture conditionsTrametes trogii (BAFC 463; MYA 28-11), S. hirsutum (BAFC

2234) and C. antarcticus (BAFC 266) (Basidiomycota) wereobtained from the Centro de Colecciones de la Facultad deCiencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires(BAFC), and maintained at 4 ºC on ME agar (malt extract 1.2 %,glucose 1 %, agar 2 %) slants. Incubation was carried out at 28ºC under stationary conditions in 100 ml Erlenmeyer flasks forup to 60 days. Grape stalks cut into pieces of 3-5 cm [15 g perErlenmeyer (dry basis)] was used as solid substrate for cultures,moistened with 20 ml of distilled water and 5 ml mycelialsuspension (inoculum) (initial moisture content 65 %). Themedium was autoclaved for 20 min at 121 ºC, and asepticallyinoculated with the mycelial suspension. To prepare the inoculum,Erlenmeyer flasks containing ME medium were inoculated withone agar plug (25 mm2) cut out from the margin of a 5-day-oldcolony grown on ME agar and incubated for 5 days at 28 °Cand the mycelium obtained was blended in three cycles of 15 s.For all experiments, measurements were carried out in triplicateparallel cultures. The values are reported as the mean with astandard deviation of (SD) less than 10 %.

Sample preparationWeight losses were determined on the basis of the initial and

final dry weights, drying the content of each flask to constantweight at 80 °C. Enzyme extraction: crude extracts wereobtained by adding 5 ml of distilled water per g wet solid, to thecontents of each flask, stirring for 20 min, followed bycentrifugation. The supernatants were stored at -20 ºC untilenzyme determination.

Enzyme assaysLaccase activity (E.C:1.10.3.2) was measured with 2,2'-

azino bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) in 0.1M sodium acetate buffer (pH 3.6). Oxidation of ABTS wasdetermined by the increase in A420 (ε420

= 36/mM cm) (8). Mn-peroxidase activity (MnP) (E.C:1.11.1.13) was measured usingphenol red as the substrate in 0.1 M sodium dimethylsuccinatebuffer (pH 4.5) (ε610 = 22/mM cm) (14). Lignin peroxidase activity(LiP) (E.C:1.11.1.14) was assayed by the azure B method (2).Ligninolytic activities were measured at 30 ºC. Endo-β-D-1,4-glucanase (E.C:3.2.1.4), and endo-β-D-1,4-xylanase (E.C:3.2.1.8)activities were determined by measuring the reducing sugarsreleased from carboxymethyl cellulose or oat xylan, respectively,as substrates, in 50 mM sodium acetate buffer, pH 4.8, at 50 ºC.Liberated reducing sugars were quantified by the Somogyi-Nelsonmethod (45), using either glucose or xylose as standards.International enzymatic units (U) were used (µmol/min). Enzymaticactivities in the extracts recovered from the solid-state cultureswere reported in U/ml. In terms of production, the activity wasdefined as U/g dry residue (substrate plus mycelium) (U/g).

In vivo decolorization experimentsThe reaction mixture contained in 1g wet material (substrate

plus fungus, 40 days post-inoculation) in 10 ml of different dyes(concentration 100 μM). Six dyes belonging to five differentclasses were analyzed. Decolorization was determined bymeasuring the decrease of dye absorbance at its maximumvisible wavelength 505, 588, 592, 608, 618, and 650 nm,respectively for: xylidine [acid red 26: azoic dye, CI (colourindex N.º): 16150], remazol brilliant blue R (RBBR, reactive blue19: anthraquinone dye, CI 61200), indigo carmine (acid blue 74:indigoic dye, CI 73015), malachite green (basic green 4:triphenylmethanic dye, CI 42000) and crystal violet (gentianviolet: triphenylmethanic dye, CI 42555), and azure B(heterocyclic dye, CI 52010). The initial pH of the solutions was

5.2 for all dye systems. An abiotic control (substrate withoutfungus) was conducted in parallel. A blank treatment containingno dye was used as a control to evaluate possible color changesdue to water extractives liberated by the fungal colonizedsubstrate. Results are expressed as percentage of dyedecolorization after 5 h.

In vitro decolorization experimentsThe decolorization capacity of the cell-free extracts was

also evaluated. The reaction was carried out in test tubes at30 ºC. The reaction mixture contained 1 ml of crude filtrate, andeither 20 µM of malachite green or 30 µM of the other dyesassayed. Boiled extracts were used as controls.

RESULTS AND DISCUSSION

Growth characteristics: dry weight loss and

reducing sugars

Time course of reducing sugars and dry weight lossof the substrate are shown in Figure 1. Loss in totaldry weight in the substrate was measured after 60 d offermentation (33-43 %). Data for reducing sugars,produced by enzymatic substrate hydrolysis showedthat on day 40 they had been almost completelymetabolized.

Enzyme activities

The time course of lignocellulolytic enzymeproduction by T. trogii, C. antarcticus and S. hirsutum,

in SSF using grape stalks as substrate was studied.Extracts from cultures were assayed to determine theactivities of cellulases, xylanases, and ligninases.Figure 2 illustrates the lignocellulolytic enzyme profiles.Laccase (Figure 2A), MnP (Figure 2B), endoglucanase(Figure 2C) and endoxylanase (Figure 2D) weremeasured. Attempts to detect LiP were unsuccessful.If produced in this medium, LiP levels could be too lowto be detected (2). On the other hand, the extractionprocedure may not have been appropriate to guaranteethe recovery of the enzymes adsorbed on the substrate(46). LiP activity had been previously detected inanother T. trogii strain (11). Regarding ligninases, thehighest laccase activity (33 U/g) was produced by C.

antarcticus after 40 d. On that same date, this fungusalso produced the peak of MnP (1.62 U/g); afterwardsboth activities decreased sharply. Maximumendoglucanase titers were produced by S. hirsutum

after 60 d (10.44 U/g). The highest endoxylanase levels(14.56 U/g) were detected in T. trogii after 20 d ofcultivation, but this activity decreased to virtually zeroon day 60 post-inoculation. Endoglucanase productionby T. trogii followed a similar pattern. Laccase activityof T. trogii as well as endoglucanase and endoxylanase


activities of S. hirsutum, and C. antarcticus endoglucanaseactivity reached their peak value on the last samplingday. All these activities, with the exception of theendoglucanase activity from S. hirsutum, showed alineal increase from day 20 to the last fermentation day.Therefore, higher enzyme activities might have beenachieved if the cultivation time had been prolonged.Ligninolytic systems of WRF are mainly activatedduring the secondary metabolic phase of the fungus

(5). But the three fungi growing in SSF, which wereassayed in this study, produced hydrolases along withoxidases also during trophophase in parallel with growth(taking into account that on day 20, glucose was notdepleted from the medium), showing that theseenzymes may not be secondary metabolites.

Previously, lignocellulosic substrates had shownto efficiently induce high amounts of ligninolyticenzymes in other white rot basidiomycetes, for

Figure 1. Time course of dry weight loss (A) reducing sugars (mg/ml of aqueous extract) (B) when culturing T. trogii, C. antarcticusand S. hirsutum on grape stalks.

(A) (B)

Figure 2. Time course of laccase (A), MnP (B), endoglucanase (C) and endoxylanase (D) production by T. trogii, C. antarcticusand S. hirsutum in solid state cultures, grown on grape stalks. Means of three independent experiments with a SD less than 10 %are shown.

(A) (B)

(C) (D)


example some of the highest records of laccaseproduction were obtained in Coriolopsis rigida (108U/g) (15) and T. hirsuta (68.4 U/g) (40), both fungi grownon barley bran. The deuteromycete Aspergillus awamori

produced 40.4 U/g of endoxylanase and 9.6 U/g ofendoglucanase when grown in SSF on grape pomace(7). Although the activities attained in this work arelower than those recorded in such substrates, this isthe first report proving the feasibility of using grapestalks as substrate for SSF lignocellulolytic enzymeproduction by WRF. Because of its low cost, worldwideabundance and the resulting high levels of enzymeproduction, the SSF using grape stalks as principalsubstrate could be used to scale up the productionof lignocellulases.

Dye decolorization

The cultures of the three fungi demonstrated potentialto decolorize a broad spectrum of chemically differentdyes. All the dyes tested were decolorized to someextent, with varying percentages of decolorization (Table1). Forty-day-old cultures of C. antarcticus showed thehighest ability to decolorize the different dyes assayed(in coincidence with maximal laccase and MnP activitiesdetermined), attaining percentages of decolorization ofabout 93, 86, 82, 82, 77, and 58 % for indigo carmine,malachite green, azure B, RBBR, crystal violet andxylidine, respectively, in 5 h. Decolorization was due totwo simultaneous effects: the physical process ofadsorption on the mycelium, and the enzymaticdegradation caused by the ligninolytic enzymesproduced by the fungi. Decolorization due to adsorptionon the support was negligible, as determined with theabiotic control. Extracting dyes (with alcoholic extractionsolution) from heavily colonized substrates forquantification proved difficult. Nevertheless, the role ofadsorption in dye decolorization appears to be minimal.The dyes were rapidly removed from the medium, as a

result of the physical adsorption process, but they werelater eliminated both from the solution and the matsurfaces, as a consequence of the enzymatic degradation.Similar results were obtained recently, when adsorptionof a textile dye by dead biomass pellets of T. versicolor

was determined and compared with dye removal byenzymatic degradation (4), while adsorption demonstratedto be important in dye decolorization by Pestalotiopsis

guepinii (42).The results obtained in this work are in coincidence

with previous decolorization studies applying thesethree strains. The ability of S. hirsutum to decolorizeand detoxify indigo carmine, xylidine and malachitegreen under SSF conditions using either: wheat bran,soya bran or a mixture of both (1:1), had been previouslyinvestigated (29). Seventeen-day cultures on soya branshowed the highest decolorization values: 68 % forxylidine (20 µM) after 120 min of contact time, 90 % formalachite green (10 µM) after 90 min. Cultures on wheatbran/soya bran showed to be more efficient to degradeindigo carmine (20 µM) (95 % after 30 min).Polyacrylamide gel electrophoresis revealed acorrespondence between decolorization bands andlaccase activity bands; thus, laccase activity could beassociated with the process of dye decolorization.Detoxification assays were carried out, using theextraction liquid from malachite green degradation.Detoxification of malachite green was up to 100 % after2 h of contact time (29). T. trogii (BAFC 463) is anoutstanding producer of laccase. In an optimized SSFwood-based medium supplemented with malt extract,peptone and copper, it produced up to 901 U/g of laccaseand 20 U/g of MnP (21). While in SmF T. trogii extracellularfluids which rendered the highest ligninolytic production(45.32 U/ml laccase, 0.21 U/ml MnP) also showed thegreatest ability to decolorize the dyes xylidine, malachitegreen and anthraquinone blue at rates of 2.14; 1.35 mgand 3 mg dye/l x h, respectively (22). Eighteen day-

Table 1. Degree of decolorization (%/ 5h) of xylidine, crystal violet, remazol brilliant blue R(RBBR), indigo carmine, malachite green and azure B (100 µM) by T. trogii, S. hirsutum and C.antarcticus solid state cultures grown on grape stalks for 40 days

T. trogii S. hirsutum C. antarcticus

Xylidine 9.6 (1) 7.3 47.5

Crystal violet 18.4 (1) 8.4 29.8

RBBR 3.8(1) 6.4 56.5

Indigo carmine 26.4(1) 29.3 74.0

Malachite green 3.6(1) 24.5 64.4

Azure B 14.7(1) 3.5 9.3


old C. antarcticus cultures on ME medium were ableto decolorize 28 -100 % of five different dyes added inan hour, representing decolorization rates of 5.3, 3.9,6.6, 22.5, and 22.5 mg/l x h of malachite green, RBBR,xylidine, indigo carmine and Poly R-478, respectively(23). The different rates reflect different capacities ofthe cultures to remove dyes with diverse chemicalstructures. Indigo carmine is a dye, which was shownto be easily decolorized by different wood rottingfungi. It can be degraded either by purified laccase,LiP or MnP (16, 34, 36, 37) Jarosz-Wilkoazka et al.

(18) also demonstrated that anthraquinonic dyes weredecolorized by fungi easier and faster than azoic dyes.A low efficiency of decolorization of some azoic dyescompared to other dye types was also reported for P.

chrysosporium and T. versicolor (49). Microorganismsdo not readily degrade azoic dyes. Sulpho and azoicgroups do not occur naturally, thus sulphonated azoicdyes are recalcitrant to biodegradation. Biodegrada-bility of azoic dyes depends on the presence of veryspecific changes in their molecular structure. Anthraqui-none, azoic and indigoic dyes were decolorized by thelaccase of T. versicolor; however, the mechanism oflaccase-catalyzed decomposition was differentdepending on dye structures. Anthraquinone wasdirectly oxidized by the laccase, azoic and indigodyes were not the substrates of laccase and smallmolecule metabolites mediated the interactionbetween the dyes and the enzyme. The decolorizationrate of nonsubstrate dyes was limited by theconcentration of mediating compounds rather than bylaccase activity in the solutions (47). When screeningdye decolorizing abilities of WRF, azure B is amongthe most recalcitrant dyes. This dye is used to detectLiP activity because it is not oxidized by laccase orMnP alone, but it was partially decolorized in thepresence of the mediators (2, 9). With the addition ofthe natural mediator p-coumaric acid, about 60 %

decolorization was achieved in 2 h with Trametes

villosa laccase (9). The azure B decolorization abilityof Flavodon flavus was tested in ME broth; about 50 %decolorization was achieved after 24 h (36). In the presentwork, C. antarcticus cultures decolorized 82 % of thisdye after 5 h. Decolorization rates obtained in the presentstudy were comparable to or even exceeded thosepreviously reported for the fastest dye-degrading WRF,among them: T. versicolor and P. chrysosporium. C.

antarcticus capacity to decolorize the azo dye xylidi-ne (6.6 mg/l x h) is similar to that previously describedfor T. versicolor in relation to different azo dyes (3 mg/l xh (6) and 5 mg/l x h (48)), and is comparable to that ofT. versicolor to decolorize RBBR (3-7 mg/l x h (6)).Moreover, its ability to decolor ize azure B isoutstanding.

The crude extracellular extracts were able todecolorize some of these dyes but not as efficientlyas the cultures (Table 2). In a previous work, when T.

versicolor was grown in a submerged culture withglucose as carbon source and the addition of grapestalks, it produced 400 U/l laccase and 36 U/l MnP(27). Sixty-two percent decolorization of phenol red (75µM) after 72 h was observed when applying theligninolytic fluids obtained in the abovementionedcultures (25), while indigo carmine (60 µM) was almostcompletely decolorized after 48 h by the extracellularfluids from T. versicolor grown under the sameconditions (27). In our study, the best decolorization wasobtained for indigo carmine (74 % after 2 h). Similarly,while Pleurotus ostreatus decolorized 12 of 23industrial dyes when grown on solid media, the crudeextracellular extracts were able to decolorize only 5dyes, showing that other enzymatic mechanisms couldbe involved in dye decolorization in vivo experiments(37). Although laccase and MnP were detected in cell-free extracts of the three fungi assayed, probably H2O2

or other necessary factors involved in the catalytic

Table 2. Degree of decolorization (%/ 2h) of malachite green, 20 µM, xylidine, crystal violet,remazol brilliant blue R (RBBR), indigo carmine, and azure B, 30 µM, by T. trogii, S. hirsutum andC. antarcticus cell-free extracts from cultures grown on grape stalks for 40 days

T. trogii S. hirsutum C. antarcticus

Xylidine 27.3 (1) 29.5 58.4

Crystal violet 80.9(1) 76.9 77.0

RBBR 71.81) 73.6 82.1

Indigo carmine 75.81) 78.7 92.8

Malachite green 89.11) 92.7 86.3

Azure B 29.11) 84.0 81.7

(1) Values represent the mean of three replicates, with a SD of less than 10 %.


cycle of the enzymes were lacking. These enzymesand their associated components such as H2O2 arepresent extracellularly, but in biobleaching studies withT. versicolor, Archibald (3) has shown that they mustbe constantly replenished from active biomass.Mycelial presence becomes significant if decolorizationrequires such biomass-associated factors.

In conclusion, grape stalks appear to be a goodchoice when searching for lignocellulosic materials toimmobilize cultures of WRF for decolorization purposes.The three fungi assayed colonized it very readilyproducing laccase and MnP activities, the biomass wasnot easily sloughed off, its integrity was maintained overa long period of time and decolorization rates of a broadspectrum of dyes were high. Moreover, the utilizationof this material also helps to solve pollution problemscaused by its disposal. Considering the magnitude ofthe decolorization obtained, the C. antarcticus/ grapestalk system may be employed in the bioremediationof colored effluents without the help of any mediator.

Acknowledgements: the authors are grateful to ConsejoNacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET,Argentina), Universidad de Buenos Aires for financial supportand Ing. Jorge A. Ivanissevich from Mendoza Province, forsupplying the grape stalks.

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Recibido.12/7/2011- Aceptado: 6/2/2012

Phenol degradation in static cultures by P. chrysogenum 113ISSN 0325-7541


Biodegradation of phenol in static cultures byPenicillium chrysogenum ERK1:

catalytic abilities and residual phytotoxicity

1Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Mar del Plata, J. B. Justo 4302 (7600) Mar del Plata; 2IMYZA,CNIA, INTA-Castelar, Castelar; 3Microbiología de Suelos y Alimentos, Unidad Integrada EEA INTA-Balcarce,

Facultad de Ciencias Agrarias, Ruta Nacional 226 Km 73,5; Balcarce. Argentina.Correspondence. E-mail: [email protected]

RESUMENBiodegradación de fenol en cultivos estáticos por Penicillium chrysogenum ERK 1: habilidades catalíticasy fitotoxicidad residual. Un aislamiento fúngico capaz de degradar fenol como única fuente de carbono y energíafue aislado de suelos agrícolas. La caracterización molecular (basada en el empleo de secuencias de espaciadoresde transcriptos internos, de factores de la elongación de la traducción y del gen de la beta-tubulina) y la caracterizaciónbioquímica permitieron identificar a esta cepa como Penicillium chrysogenum Thom ERK1. Se estudió la degradaciónde fenol a 25 °C en cultivos estáticos con 6, 30, 60, 200, 350 y 400 mg/l de fenol inicial. El tiempo requerido paracompletar la degradación de fenol aumentó al elevarse las concentraciones iniciales de dicho compuesto. Lamáxima tasa de degradación específica (0,89978 mg de fenol/día/mg de peso seco) se obtuvo con 200 mg/l. Elrendimiento en biomasa disminuyó con concentraciones iniciales de fenol mayores de 60 mg/l. Se identificó alcatecol como intermediario metabólico por HPLC y se observó actividad de catecol dioxigenasa en placa, lo quesugiere que el metabolismo de degradación del fenol ocurre vía orto fisión del catecol. Se utilizaron semillas detrigo como indicadores de fitotoxicidad de los productos de degradación. Estos productos no fueron fitotóxicospara trigo, mientras que el fenol mostró una alta fitotoxicidad. La alta tasa de degradación específica obtenida encondiciones estáticas resulta de gran interés para la aplicación de este hongo en procesos de descontaminaciónde suelos.

Palabras clave: Penicillium chrysogenum, hongos del suelo, fenol, biodegradación, fitotoxicidad

ERIKA A. WOLSKI1*,VIVIANA BARRERA2, CLAUDIA CASTELLARI3, JORGE F. GONZÁLEZ1

ABSTRACTA phenol-degrading fungus was isolated from crop soils. Molecular characterization (using internal transcribedspacer, translation elongation factor and beta-tubulin gene sequences) and biochemical characterization allowedto identify the fungal strain as Penicillium chrysogenum Thom ERK1. Phenol degradation was tested at 25 °Cunder resting mycelium conditions at 6, 30, 60, 200, 350 and 400 mg/l of phenol as the only source of carbon andenergy. The time required for complete phenol degradation increased at different initial phenol concentrations.Maximum specific degradation rate (0.89978 mg of phenol/day/mg of dry weight) was obtained at 200 mg/l.Biomass yield decreased at initial phenol concentrations above 60 mg/l. Catechol was identified as an intermediatemetabolite by HPLC analysis and catechol dioxygenase activity was detected in plate assays, suggesting thatphenol metabolism could occur via ortho fission of catechol. Wheat seeds were used as phytotoxicity indicatorsof phenol degradation products. It was found that these products were not phytotoxic for wheat but highlyphytotoxic for phenol. The high specific degradation rates obtained under resting mycelium conditions are consideredrelevant for practical applications of this fungus in soil decontamination processes.

Key words: Penicillium chrysogenum, soil fungus, phenol, biodegradation, phytotoxicity

INTRODUCTION

Soil and water contamination is now considered aserious problem in many industrialized countries.Phenol contamination may arise from a variety ofsources of industrial wastewater, such as those fromcoal refineries, phenol manufacturing pharmaceuticals,industries of resins, paints, dyes, petrochemicals,textiles, pulp and paper mill (9). These phenolic effluents

are being discharged into water bodies and this wateris used for agriculture and other purposes. Reportsof incidents on phenol contamination in the area arescarce. In 2004, some information sources reportedthat the Iguazú River (Argentina) was affected by thedischarges of petrochemical effluents which contain0.14 mg/l of phenol and other compounds like manganeseand aluminium. For these reasons, wastewaters


containing phenol and phenolic compounds need anappropriate treatment before discharging them intothe receiving water bodies (20). Many physico-chemical techniques are available to degrade thesepollutants before discharging them (10). Some of thesetechniques are effective, but most of them areexpensive and may lead to the formation of secondarytoxic materials or lower mineralization, or need severeoperating conditions (10). For these reasons, biologicaldegradation is a viable and economic alternative,which leads to the complete mineralization of thexenobiotic.

On the other hand, bioremediation is a well knowntreatment for soil contamination, which employs theuse of microorganisms that are either naturallyoccurring or introduced into the soil in order to degradepollutants (13). Several fungal strains have beenreported to degrade phenol as the only source of carbonand energy (5, 12, 18, 19, 24), but many of them arephytopathogens or have high nutritional requirementsor fail to colonize the soil and are difficult to apply forsoil bioremediation. For these reasons, there is interestin the study of new, non-pathogenic soil fungal isolates.

Penicillium species are commonly found in food,indoor air and soils. Particularly, the Penicilliumchrysogenum has been found on dried cereals, saltedmeat and many other low water activity foods, but isalso common in indoor air environments and saltysoils (22). Several members of the genus Penicilliumare good hydrocarbon-assimilating organisms andthere are many reports showing their ability to transformxenobiotic compounds into less mutagenic products(4, 10). There are many examples of that: Penicilliumsimplicissimun SK9117 was able to grow in 800 mg/lof phenol (5), P. chrysogenum CLONA 2 isolate alsocompletely degraded 300 mg/l of phenol in thepresence of sodium chloride (58.5 g/l) (4, 9). Most ofthese studies were carried out in fermentors underintensive stirring. These conditions do not necessarilyreflect those prevalent in an actual soil decontaminationprocess.

In this work, we report the isolation and bothmolecular and biochemical identification of a P.chrysogenum strain called ERK1, isolated from cropsoils in Argentina. This fungus was able to degradephenol as the only source of carbon and energy withhigh degradation rates under resting myceliumconditions. This is considered relevant for practicalapplications in soil decontamination processes wherethe fungus is also in static conditions. Degradationpotential, metabolic intermediate and phytotoxicityassays were carried out.

MATERIALS AND METHODS

Chemicals

All the reagents used during this study were of analytical grade,except for phenol and catechol that were of chromatographicgrade (purity 99 %) from Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). HPLC-grade acetonitrile was from Sintorgan (Argentina).

Microorganism isolation and growth conditions

Soil samples were collected from commercial crop soils fromBalcarce, Buenos Aires province, Argentina. The soil samples (3g weight) were mixed with 10 ml sterile water. Serial dilutions ofthe culture were prepared and spread on mineral medium agarplates supplemented only with 25 mg/l of phenol as a carbonsource. The plates were incubated at room temperature for 3days. The suspected type of colony was purified and wasmaintained in potato dextrose agar (PDA, Gibco) at roomtemperature for 14 days (without phenol).

For the degradation assays, the fungus was inoculateddirectly from the PDA plate into 150 ml of liquid minimal saltmedium (LMS) supplemented with different concentrations ofphenol as the only source of carbon and energy. The LMScontained: deionized water 1000 ml, MgSO4·7H2O 0.1 g, K2HPO4

0.1 g, NH4NO3 1 g, KCl 0.1g, and 25 µl of trace element solution(in mg/l: MnSO4 15.4, FeCl3 40, ZnSO4.7H2O 6.3, CuSO4.5H2O2.5, NH4.MO7.O2.4H2O 0.5). pH was adjusted to 6.0.

The selected isolates were identified by physiological,biochemical and molecular tests.

Morphological characteristics

The fungus was inoculated onto different culture media: MaltExtract Agar (MEA, Britania, Argentina), Czapek Yeast extractAgar (CYA, Britania, Argentina) and 25 % Glycerol Nitrate (G25N,Britania, Argentina) to observe the different morphologicalcharacteristics (colony diameter, color, pigments, exudates,etc.) for its identification according to Pitt (17), Pitt and Hocking(16) and Samson et al. (21).

Antibiotic production

In order to confirm that the fungus was a Penicilliumchrysogenum isolate, its ability to produce β-lactam antibioticswas analyzed by a diffusion bioassay using Micrococcus luteus(ATCC 9341) as described by Castellari et al. (1),since the diameterof the growth inhibition zone is characteristic for each species andis also used as a complement to identify the fungal isolate (1, 8).

The presence of β-lactam antibiotic was also analyzed inthe culture medium were P. chrysogenum was grown with phenolas the only source of carbon and energy.

Nuclear number per cell

To observe the number of nuclei per cell, small portions ofmycelia previously grown on PDA in darkness for 24 h at 25 ºCwere submerged in 0.01 % acridine orange aqueous solutionduring 10 seconds. The method applied is a modification fromthe Yamamoto and Uchida´s staining method (28). The stainedmycelium was observed under epifluorescent light with anOLYMPUS BX 51 microscope. Digital photographs were takenusing the Cool Snap-Pro System. The number of nuclei wascounted in 20 cells.

Phenol degradation in static cultures by P. chrysogenum 115

Ehrlich test

The fungal isolate was examined for production ofcyclopiazonic acid and other alkaloids reacting with Ehrlich’reagent using a filter paper method as described by Frisvadand Samson (2).

DNA extraction

The ERK1 strain was grown on potato dextrose broth (PDB)for 3 days. The mycelium obtained was dried, freezed anddisrupted with a hand-operated pellet pestle and DNA wasobtained with DNeasy Plant Mini Kit QIAGEN according to themanufacturers´ protocol. The resuspended DNA was stored at-20 ºC. The DNA was quantified by electrophoresis gel with 0.8 %agarose and NanodropTM 2000 (Thermo Scientific).

Polymerase Chain Reaction

Internal transcribed spacer (ITS). Genomic DNA wasamplified with primers ITS1 (5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´) and ITS4 (5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´) to amplifythe region ITS1-5.8s-ITS2 (33). Amplifications were performedusing 20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 0.2 mM dNTPs, 0.2 μMprimer, 3 mM MgCl2, 0.4 U Taq Invitrogen (Brazil) with 10-100ng genomic DNA in a 50 μl total volume. The amplificationprogram was as follows: 1 min at 94 ºC, 1 cycle; 15 s at 94 ºC,15 s at 58 ºC, 15 s at 72 ºC, 30 cycles; 7 min at 72 ºC, 1 cycle.

Beta-tubulin. To amplify the beta-tubulin gene, primer pairsBt2a (5´- GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3´) and Bt2b(5´- ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3´) (3) were applied.Amplifications were performed with the same conditions abovewith the amplification program reported in reference 22.

Translation elongation factor (TEF). The amplification of TEFsequences was performed using the primers/pair Ef728M(5´-CATYGAGAAGTTCGAGAAGG-3´) andEf2 (5´-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3´) following theprocedure in Samuels and Ismaiel (23).

Sequencing

The amplification products were cleaned with the Wizard®

SV Gel and PCR Clean-Up System (PROMEGA) and visualizedwith gel electrophoresis using 1 % agarose stained with ethidiumbromide. The PCR products were sequenced in both directionsunder BigDyeTM Terminator v 3.1 (Applied Biosystems) basedon the Sanger´s method. The reacted products were purifiedusing ethanol precipitation and run with Genetic Analyzer3130xlatUGB, Unidad de Genómica, Instituto de Biotecnología,INTA). Contigs were assembled using the CAP3 SequenceAssembly Program (PBIL, France) (6).

Phylogenetic Analysis

Alignments of the partial beta-tubulin gene sequences wereconstructed automatically using a built-in CLUSTALWimplementation in MEGA software version 4 (27).

Phylogenetic and molecular evolutionary analyses wereconducted using MEGA 4.1. All positions containing gaps andmissing data were eliminated from the dataset (CompleteDeletion option). The evolutionary history was inferred usingthe Maximum Parsimony method; bootstrap analysis wasperformed in 1000 replicates with random sequence addition(10 replicates) to estimate branch support. The MP tree wasobtained using the Close-Neighbor-Interchange algorithm withsearch level 3 in which the initial trees were obtained with the

random addition of sequences (10 replicates). Statisticsincluding tree length (L), consistency index (CI), retention index(RI) and composite index were also calculated. The sequencesof the beta-tubulin gene and rDNA-ITS obtained were submittedto GenBank, accession numbers HQ336382 and HQ336383.Thirteen sequences from the GenBank database were used toconstruct the phylogenetic analyses (Fig. 3); the sequenceswere chosen to represent sections of Penicillium related withthe ERK1 strain, following the classification of Samson et al.(22). Eupenicillium brefeldianum was applied as outgroup taxa.

Phenol degradation

Degradation of phenol was analized in submerged culturesin 250 ml flasks with 150 ml of LMS medium supplemented atdifferent phenol concentrations as the only source of carbon.Each flask was inoculated with 4 PDA agar discs containingthe fungal mycelium. The cultures were incubated at roomtemperature in the dark in order to avoid phenol destructionunder resting mycelium conditions.

Non-inoculated flasks with LMS supplemented with phenolwere used as controls.

At different times after inoculation the mycelium from eachflask was filtered and the dry weight was determined. Phenolcontent of the liquid medium was measured in the filtrates afterremoval of the mycelia. All experiments were carried out intriplicate. Results show the mean value of three independentexperiments.

Specific degradation rates were calculated as follows:

ΔP/Δt

B

Where: P is phenol concentration in mg/l, t is time in days, Bis biomass in mg of dry weight per litre of reactor volume.

Dry weight

Dry weight was determined by filtering the mycelium througha Whatman GF/A filter, rinsing twice with distilled water anddrying at 100 °C until constant weight. Biomass was calculatedas mg of dry weight per volume reactor (l).

Analytical methods

The concentration of phenol was measured using a WatersHPLC system (Millipore, Waters Division, Milford, Massachusetts,USA) consisting of a Model 590 pump, equipped with a UVdetector Model 484 variable-wavelength detector set at270 nm. A computer equipped with HPLC System ManagerSoftware for windows CSW 32 v.1.4 (2002 DataApex Ltd. CzechRepublic) was used to acquire and process chromatographicdata. The separation was achieved with a Water SpherisorbODS2 C18 (5 µm) 4.6 x 250 mm analytical column MilliporeCorporation, Milford, Massachusetts, USA. Deionized water:acetonitrile (70:30, vol/vol) isocratic system was used as solventand the flow rate was maintained at one ml/min. Thesecompounds were identified by comparing their retention timewith those of similarly treated external standards and by co-chromatography. Under the above conditions, the retention timeof phenol and catechol were 10.09 and 5.57, respectively.

Plate assays to assess enzymatic activity

Qualitative assays were performed on agar plates todetermine the enzymatic activity involved in phenol degradation.Laccase, peroxidase (manganese peroxidase and lignin


peroxidase) and catechol dioxigenase activit ies weredetermined as described by Rubilar-Araneda (19), Levin et al.(11) and Shiffman and Cohen (26), respectively.

Phytotoxicity studies

The toxicity of the original and the degraded phenol wasassessed by measuring the phytotoxicity effect of LMS, LMSsupplemented with phenol 400 mg/l and the residue of phenoldegradation on seed germination of wheat (Triticum aestivum),according to Osma et al. (15). Five replicates of 10 seeds wereused for each treatment. Germination index (GI) was calculatedas follows: GI=GP x La/Lc, where GP is the number ofgerminated seeds expressed as a percentage of control values(LMS). La is the average value of root length in the phenolsolutions and Lc is the average value of root length in the control.

RESULTS

Identification of the fungal isolateThe fungus was grown on MEA, CYA and G25N.

Mycelia showed white obverse color in all the mediatested (Figure 1). The reverse colors varied from whiteto yellow. In CYA at 25 °C, the fungus showed yellowexudates and colonies were radially sulcated (Figure 1).

The fungus grown in MEA medium did not showgreen color or penicillia at 25 °C. However, when theseplates were stored at 4 °C for one month, green colorand penicillia were observed (Figure 2 A). Microscopically,penicillia are terverticillate, smooth walled, the conidiawidth was 3.75 µm and phialide length 12.3 µm (Figure2 B). The nuclear number per cell was 1 nucleus inhyphal tips and 2-8 nuclei in mature hyphae.

The fungus also showed inhibitory activity againstMicrococcus luteus (ATCC 9341), producing a growthinhibition zone with a diameter of 45 mm in diffusionbioassays, suggesting the production of β-lactamantibiotics (Figure 2 C).

The isolate was observed for production ofcyclopiazonic acid and other alkaloids by the Ehrlich’stest, but no reaction was observed.

Taxonomic identification of the fungus based onPitt and Hocking (16) shows that the fungus isolatedin this work is a Penicillium strain.

Genomic DNA obtained with the extraction procedureyielded 35 ng/μl. A fragment of 600 bp in size wasobtained with ITS1/4 primer pair. A sequence of 441 bpwas obtained from the contig assembly of thesequences in both directions. The comparison withMegablast showed 100 % homology (E value 0.0)with P. chrysogenum and Penicillium comune. Afragment of 455 bp in size was obtained from theamplification with pair primers Bt2a/Bt2b. The TEFamplification product was over 500 bp in size,although the corresponding sequence obtained was265 bp in size due to technical difficulties with the pairprimers tested; therefore, it was rejected for furtheranalyses.

Figure 1. Growth of the fungus on CYA and MEA. A: CYA, 7 days, 25 °C. B: reverse CYA,25 °C. C: MEA, 7 days, 25 °C. D: reverse MEA, 25 °C.

Figure 2. Biochemical characteristics ofthe isolate. A: colony growth (one monthold) in MEA. B: Penicillin 1000X. C: Antibiotic-susceptibility test with Micrococcus luteus(ATCC 9341) (susceptible to β-lactamantibiotics). Clear zones indicate growthinhibition around the disk containing thefungal isolate.


From the Parsimony Analysis of the beta-tubulingene sequences, 4 most parsimonious trees withL=242 steps were obtained, CI=0.643836, RI=0.603053and Composite Index=0.473472. Branchescorresponding to partitions reproduced in less than 50% bootstrap replicates are collapsed. The percentageof replicate trees in which the associated taxaclustered together in the bootstrap test is shown nextto the branches. The most parsimonious assignmentsof ancestral states for site #1 are shown next to eachnode. There were a total of 359 positions in the finaldataset, out of which 64 were parsimony informative

(Figure 3). The clades corresponding to the sectionsshowed high bootstrap values, with 70 % for sectionChrysogena, 99 % for Roquefortii and 74 % forViridicata with the exception of Penicillium with 27 %.

Phenol degradationFor kinetic studies, the fungus was grown in LMS

medium supplemented with phenol as the only sourceof carbon and energy. Phenol degradation was testedat nominal values of 6, 30, 60, 200, 350, 400 mg/l underresting mycelium conditions (Figure 4). The actualvalues of phenol concentrations measured by HPLC

Figure 4. Growth and biodegradationof phenol by P. chrysogenum insubmerged culture. Degradation ofphenol was analyzed by HPLC. LMSmedium was supplemented at differentphenol concentration as the only sourceof carbon and energy and inoculated withP. chrysogenum. The cultures wereincubated in the dark at 25 °C in orderto avoid photodestruction of phenol andunder resting mycelium conditions.Noninoculated flasks with LMSsupplemented with phenol were usedas controls. A, B, C, D, E and Fcorresponding to 6, 30, 60, 200, 350 and400 mg/l of initial phenol concentrations,respectively.

Figure 3. Phylogenetic tree. Maximum parsimony consensus tree with beta-tubulin gene sequences of type strains of Penicilliumtaxa. The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (1000 replicates) isshown next to the branches. Eupenicillium brefeldianum NRRL 710 was applied as an out group. The bars at the right of thecladogram indicate the sections of subgenus Penicillium classified by Samson et al. (2004).


were 6.28, 31, 60.9, 200, 347 and 400 mg/l. Theincubation of P. chrysogenum ERK1 in the mediumcontaining phenol as the sole carbon source resultedin an increase in the dry weight of the mycelia overthe time, concomitant with the decrease in theconcentration of phenol in the culture medium (Figure 4).In the case of 60, 200, 350 and 400 mg/l of phenol,the biomass increases until reaching a plateau valuewhich means that the fungal growth has reached thestationary phase (Figure 4). Biomass yield wascalculated for each initial phenol concentration and itdecreases with the increase of the initial concentrationof phenol until 200 mg/l, after which it remained essentiallyconstant (Table 1).

No further dry weight increase was observedfollowing phenol depletion, which demonstrated theability of the organism to grow on phenol as the onlysource of carbon.

The time required for complete degradation of thephenol varied at different initial phenol concentrations(Figure 4). Degradation took longer at higher phenolconcentrations. For example, on day 6 the degradationpercentages were 100 %, 75 %, 51 %, 25.7 %, 26 %and 8 % for 6, 30, 60, 200, 350 and 400 mg/l,respectively. For the initial phenol concentration of200 and 350 mg/l, the conversion percentages weresimilar. These results agree with the degradation ratesobserved for both initial phenol concentration (Table 1).Figure 4 also shows that while the biomass remainsconstant, the degradation of phenol continues.

Specific degradation rates increase until 200 mg/l,where a maximum is observed, and then decreaseshowing an inhibitory effect (Table 1). These results agreewith that observed for biomass yield.

The inhibitory activity against M. luteus (ATCC9341) by P. chrysogenum was analyzed when phenolwas used as a carbon source. In these experimentalconditions, the fungus did not inhibit M. luteus (ATCC9341) growth, suggesting that P. chrysogenum did

not produce β-lactam antibiotic when phenol is usedas carbon source.

HPLC analysis showed that phenol was completelydegraded when used at an initial concentration of 200mg/l (Figure 5 B). Chromatographic profiles revealedthe presence of phenol metabolites formed by the fungusat very low concentrations (less than one mg/l) duringthe kinetic assay (on day 18) (Figure 5 C). One of themajor detected compounds had the same retentiontime (rt) as the external standard catechol. Otherproducts of phenol degradation were found to be minor,but could not be identified structurally. These minorcompounds showed peaks around rt: 5.9, 3.29, 3.77and 3.9, respectively.

Neither laccase nor peroxidase activities (Mn peroxidasesand Li peroxidases) were detected. However, catecholdioxigenase activity was observed in qualitativeassays (data not shown). Fungal mycelium developeda yellow color on the plate sprayed with catechol.

Phytotoxicity assayThe results of phytotoxicity showed that seed

germination was 100 % for wheat in the LMS mediumused as a control, 95 % for seeds treated with theproducts of phenol degradation and 6.25 % for 400mg/l of phenol. No root elongation was observed inthe latter case. Seeds treated with phenol degradationproducts and control seeds showed similar rootelongation, about 14 ± 7.1 mm. Therefore, GI valueswere: 100 % for both, while seeds treated with 400mg/l of phenol showed a GI value of 0.4 %.

DISCUSSION

Taxonomic identification of the fungus based onPitt and Hocking (16) shows that the fungus isolatedin this work is a Penicillium strain, which produces aβ-lactam antibiotic showing an inhibition zone in

Table 1. Kinetic and yield values as a function of substrate concentration

6 2.29±0.016 0.19±0.012

30 2.31±0.030 0.33±0.021

60 1.24±0.082 0.48±0.043

200 0.30±0.013 0.89±0.056

350 0.29±0.056 0.78±0.062

400 0.38±0.040 0.62±0.043

Biomass yield (mg ofdry weight/ mg of

phenol)

Initial phenolconcentration

(mg/l)

Specific degradation rate(mg of phenol/day/mg of dry

weight)


diffusion bioassays lacking phenol, typical of P.chrysogenum, as described by Castellari et al. (1).

The phylogenetic analysis based on beta-tubulingene sequences grouped the species belonging tothe same sections together as expected by thecomparison with the parsimony analysis performedby Samson et al. (22), although the topology of thetree obtained showed differences with SectionChrysogena as poliphyletic. ERK 1 strain grouped with93 % bootstrap with P. chrysogenum CBS 306.48.These results are consistent with the high homologyobserved when analyzed in Megablast with ITSsequences. Although the ITS sequences also yieldedhigh homology with P. commune, the sequenceanalyses of the beta-tubulin gene allowed todifferentiate it in a separate cluster from P. chrysogenum.The relevance of Samson et al’s phylogenetic analysis(22) (ibid.) lies in that the authors supported thephylogenetic clades based not only on DNA charactersbut also on phenotypic characters (morphology andcultural characters).

Therefore, from the agreement in molecular andbiochemical characterization, it has been demonstratedthat the fungal isolate is very closely related to P.chrysogenum.

There are many studies describing the biodegra-dation of phenol using Penicillium isolates (5, 9, 12, 24,25). Scow et al. (25) have described the mineralizationof phenol at low initial concentrations by a non-identified Penicillium species. On the other hand,Penicillium frequentans Bi 7/2 and P. simplicissimumSK9117 also use phenol as the only source of carbonand energy (5, 12). P. chysogenum CLONA 2 isolatealso completely degrades 300 mg/l of phenol in thepresence of sodium chloride (58.5 g/l) (9). Moreover,in this work characterization and degradation potentialof a new P. chrysogenum ERK1 strain was studied.This fungus shows high specific degradation ratesunder resting mycelium conditions; which makes itattractive for practical applications in soildecontamination processes. In addition, preliminaryresults showed that the fungus was able to grow anddegrade phenol in artificially contaminated soils (Datanot shown).

The specific degradation rates values obtained showedthat an inhibition effect occurs. The comparison of thespecific degradation rate between P. chrysogenumERK1 and Penicillium frequentans Bi 7/2 (5) indicatesthat the rates are in the same order of magnitude,between 500-1000 mg phenol/g dry weight/day. The

Figure 5. HPLC-chromatogram of phenol biodegradation by P. chrysogenum. Kinetics at 200 mg/l of initial phenol concentrationwas used for this analysis. A: time zero showing the retention time of phenol (Phe: 10.01 min). B: biodegradation of phenol after 20days. C: metabolite formed during the kinetic assay on day 18 after inoculation time.


degradation rates obtained for P. chrysogenum ERK1 are high considering that cultures were carried outunder resting mycelium conditions. In addition, theP. chrysogenum strain used in this work was notpreviously acclimated; for this reason future kineticsstudies using the fungus with a previous acclimationperiod, different inocula sizes and in the presence ofdifferent co-substrates could improve degradation rates.

Leitao et al. (9) described that the degradationability of P. chrysogenum CLONA2 did not correspondto the visible growth of the mycelia. In this work, theresults showed that there is a good correspondencebetween growth and phenol degradation until biomassremains constant. The same was observed forAspergillus fumigatus degrading 200 mg/l of phenol (7).

Biomass yield ranges between 2.2932 and 0.2965(Table 1) depending on the initial phenol concentration.These values are in range with that reported for P.frequentans Bi 7/2 by Hofritcher et al. (9). The resultsshowed that above 200 mg/l, biomass growth remainedessentially constant; however P. chrysogenumcontinues degrading phenol, suggesting that at thisstage phenol is used only for energy requirements.Guedes et al. (4) also described that phenol concentrationhigher than 300 mg/l completely inhibited fungal growthof P. chrysogenum CLONA 2.

A number of toxic compounds are formed duringindustrial processes, giving multicomponentcomposition of wastewaters. Therefore, the strainsused for decontamination processes should not onlybe highly active to one contaminant but they shouldalso be tolerant of other pollutants or possess differentbiodegradation abilities (24) and be adaptable to beused in mixed cultures. P. chrysogenum ERK1showed to produce β-lactam antibiotic. However, whenit was grown with phenol as a carbon source it did notshow antibiotic production. In addition, the fungus wasalso able to degrade 2, 4, 6-trichlorophenol (data notshown). For this reason, this fungus could be used inmixed cultures to improve phenol degradation or tocontribute to the degradation of multi-substrates.

HPLC analysis detected an intermediate productwith identical retention time to catechol; this resultsuggests that phenol metabolism could occur via orthofission of catechol. On the contrary, Leitao et al. (9)could not detect catechol as intermediary metabolite.However, they showed the presence of hydroquinonebut only when the fungus was grown in the presenceof phenol and glucose as co-substrate. When theculture had only phenol as carbon source nointermediary metabolites were detected. Marr et al.(12) identified catechol, hydroquinone and cis, cis-muconic acid as intermediary metabolites during the

mineralization of phenol by P. simplicissimum SK9117,showing that phenol degradation occurs via the beta-ketoadipate pathway. In the present work, othermetabolites were also observed in HPLC chromatograms.However, future studies have to be done to determinetheir chemical structures.

Catechol dioxigenase activity observed in plateassays agree with HPLC results, suggesting that phenolmetabolism could occur via ortho fission of catechol.

Phenolic effluents are being discharged into waterbodies and this water can be used for agriculture.These effluents may cause serious environmentalproblems and health hazards if not treatedappropriately. Thus, it is relevant to assess thephytotoxicity of the phenol before and after degradation.To this purpose, the phytotoxicity of plant growingmedia based on the germination index (GI) of seedswas evaluated as described by Osma et al. (15). Thisis one of the most common phytotoxic assays usedin the literature.

The GI combines measurements of relative seedgermination and relative root elongation that are bothsensitive to the presence of phytotoxic compounds.

Several species have been traditionally used forevaluating phytotoxicity. However there are nostandardized seed species in use worldwide (15). Forthis reason, wheat (Triticum aestivum) was used forthis assay because it is a common crop in Argentineanfields. According to Osma et al. (15), GI values lowerthan 50 % mean high phytotoxicity, while valuesbetween 50 % and 80 % mean moderate phytotoxicityand values over 80 % indicate that the material isnot phytotoxic. Therefore, phenol degradation productswere not phytotoxic for wheat.

Finally, the P. chrysogenum strain ERK1 describedin the present work degrades phenol as the onlysource of carbon and energy, with high degradationrates and satisfactory biomass yield under restingmycelium conditions. In addition, phenol degradationproducts did not show any phytotoxic effects. Thesecharacteristics make P. chrysogenum ERK1 attractiveto be used in phenol decontamination of soils.

Acknowledgements: this research was supported byUniversidad Nacional de Mar del Plata, Consejo Nacional deInvestigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), AgenciaNacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCYT),and MAPFRE foundation. Dr. Wolski, E. A. is a CONICET staffscientist. We are also grateful to Hector L. Villar for providingthe wheat seeds.


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Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 122-132ACTUALIZACIÓN

Bioprospection of marine microorganisms:potential and challenges for Argentina

RESUMEN

Bioprospección de microorganismos marinos: potencialidades y desafíos para Argentina. El medioambiente marino de la Argentina tiene una notable extensión, como así también una alta productividad biológica ybiodiversidad de macro y microorganismos. A pesar de presentar un gran potencial para aplicacionesbiotecnológicas, los microorganismos que habitan estos ecosistemas permanecen mayormente inexplorados ysus propiedades aún no explotadas. En este trabajo de revisión, estudiamos los temas de investigación y lasinteracciones entre grupos de investigación argentinos, por medio del análisis de los artículos publicados hastael momento en temáticas relacionadas con la aplicación biotecnológica de microorganismos marinos. Además,identificamos los desafíos y las oportunidades para que la Argentina tome ventaja del potencial genético de susmicroorganismos marinos. Por último, sugerimos posibles acciones que podrían mejorar el desarrollo de estecampo de estudio, como así también la utilización de este conocimiento para resolver las necesidades de lasociedad.

Palabras clave: bioprospección, microorganismos marinos, desafíos, Argentina

ABSTRACT

The marine environments of Argentina have a remarkable extension, as well as high biological productivity andbiodiversity of both macro- and microorganisms. Despite having a great potential for biotechnological applications,the microorganisms inhabiting these ecosystems remain mostly unexplored and unexploited. In this review, westudy the research topics and the interactions among Argentinean laboratories, by analyzing current articlespublished on biotechnology-related marine microbiology by researchers of this country. In addition, we identify thechallenges and opportunities for Argentina to take advantage of the genetic potential of its marine microorganisms.Finally, we suggest possible actions that could improve the development of this research field, as well as theutilization of this knowledge to solve societal needs.

Key words: bioprospection, marine microorganisms, challenges, Argentina

HEBE M. DIONISI*, MARIANA LOZADA, NELDA L. OLIVERA

Centro Nacional Patagónico (CONICET-CENPAT), Boulevard Brown 2915, Puerto Madryn (U9120ACD), Chubut, Argentina.*Correspondence. Email: [email protected]

INTRODUCTION

Marine microorganisms remain comparativelyuntapped in relation to those from terrestrial andfreshwater environments. As the extent of marinemicrobial biodiversity, and consequently natural productpotential, seems to be limitless (31), marine ecosystemsconstitute invaluable sources for bioprospection (33).The partnership between biotechnology and theconceptual framework of microbial ecology (41, 69)provides a golden opportunity for bioprospection of theseunexplored environments. The use of moleculartechniques for further improvement of these naturalcapabilities, poses few conceptual limits to the servicesthat these communities might provide. In Argentina,microbial communities inhabiting marine environmentsremain mostly unexplored and unexploited. In the secondpart of this review we will recount potential environmentsfor bioprospection in this country, describe the current

research lines in this field as well as identify thechallenges and opportunities for Argentina to takeadvantage of its genetic potential.

MARINE ENVIRONMENTS OF ARGENTINA

On the South Western Atlantic Ocean, Argentina hasthe most extensive continental margin of South America,with an area of approximately 2,000,000 km2 (60). Thecontinental shelf, located between the shoreline andthe continental brake, accounts for approximately halfof this area (37). It widens progressively to the south,reaching a maximum width of 860 km at 51º S (39). Thecontinental shelf terminates to the east in a sharp break,located between 110 and 165 m water depth (73). Thecontinental slope is intersected by approximately 50canyons of variable widths and depths (60, 73). Thecontinental rise presents a gentle slope crossed by

Bioprospection of marine microorganisms 123

various submarine canyons and valleys, locatedbetween 3,200 and 5,000 m water depth (60). To theeast, the continental rise is connected with theabyssal plain, which reaches a maximum water depthof 6,212 m (32).

Water circulation in the Argentine Sea is driven bystrong tides, large freshwater discharges such as theLa Plata River plume, high wind speeds and, mostimportantly, by the influence of two boundary currents:Brazil and Malvinas (39, 59). The Malvinas current ispart of the northern branch of the Antarctic CircumpolarCurrent flowing northward along the continental shelfbreak. These high latitude waters are not as stratifiedas tropical waters, and thus they are rich in nutrientsdue to more efficient upward mixing. Warm, nutrient-poor and salty waters of the Brazil current collide withcold, nutrient-rich and relatively fresh waters of theMalvinas current at the Brazil/Malvinas Confluence (25).The location of the collision of these two currents variesseasonally between 30 and 46º S over Buenos Airesprovince, Argentina. This confluence creates a regionof high variability of water mass properties, at a scaleof 100-200 km (39). A highly complex vertical stra-tification structure is formed as a result of the mixing ofSubtropical and Subantarctic waters, creating one ofthe most energetic regions of the world’s oceans (74).Intense intrusions of Malvinas current waters into thenorthern Patagonia continental shelf occur near 41º S(63). The most obvious evidence of the entry of thesenutrient-rich waters is the high level of biological activityfound in the Patagonia region, which is considered aClass I marine ecosystem with a productivity rate largerthan 300 grC/m2 yr-1 (39). This high productivity hasconsequences on higher trophic levels as well. Forexample, fish catch in the Patagonian shelf is oneorder of magnitude higher than in Southern Brazilianwaters (39).

The extension of the continental shelf of Argentinaallows for the development of a great diversity ofmarine fronts covering several scales of space andtime, in particular from 32º southward (1). Fronts canbe defined as a narrow zone with enhanced horizontalgradients of water properties (temperature, salinity,nutrients, etc.) that separates broader areas withdifferent water masses or a different vertical structure(6). Fronts play a paramount role in ecological processesallowing for an exceptionally large primary production,and in many cases enhanced biological activity athigher trophic levels as well (1, 8). In addition, theyoffer adequate feeding and/or reproductive habitatsfor nektonic species and they act as retention areasfor larvae of benthic species promoting theestablishment of adult beds (1). Their main forcing are

current convergence, tides, continental run-off, wind,solar heating, bathymetry, among others (1).

With more than a century of presence in Antarctica,Argentina maintains a territorial claim in an area locatedfrom south of the 60º S latitude to the South Pole, andfrom 25º to 74º W, which includes the AntarcticPeninsula. Argentina maintains 13 stations in this area,six of them year-round. The productivity of the marineecosystem surrounding the Antarctic Peninsula islimited by the extreme weather conditions and low lightpenetration that characterize this area(www.lme.noaa.gov). The Antarctic Peninsula is one ofthe most rapidly warming regions on Earth, havingexperienced a 2 ºC increase in the annual meantemperature and a 6 ºC rise in the mean wintertemperature since 1950 (23). The glacially sculptedcoastline along the west coast of the Antarctic Peninsulais highly convoluted and characterized by deepembayments that are often interconnected by channels,facilitating the transport of heat and nutrients (23).During the ice-free season, a nearshore southwardflow circulation is observed along this coast. Thiscurrent, called the Antarctic Peninsula CoastalCurrent, might be critical for providing a favorableenvironment for biological production in this marineecosystem (47). The circulation at the Weddell Sea,located east of the Antarctic Peninsula, is dominatedby the Weddell Gyre. During this clockwise circulationthe water loses a significant amount of heat as ittravels from the eastern Weddell to the northern tip ofthe Antarctic Peninsula (72). South of the Weddell Sea,the Filchner-Ronne Ice Shelf is floating over thecontinental shelf (50). In these structures, ice fragmentsare usually calved off as icebergs from the ice front, orthe ice is melted from the shelf base (50). Interestingly,free-drifting icebergs of the Weddell Sea have beensuggested to be hot spots of continual micronutrientrelease that could serve as areas of increased produc-tion and sequestration of organic carbon (77).

The Argentinean marine environments, with theirnotable extension, complex topography and watercirculation patterns, as well as high biological productivityand biodiversity, hold numerous niches extremelyvaluable for the bioprospection of microorganisms withbiotechnological potential. In particular, Subantarctic andAntarctic marine regions, remote and mostly pristine,contain microbial communities adapted to extremeclimates that are remarkably suitable for bioprospection.In addition, marine fronts offer an exceptional concentrationof microbiological life with strong annual cycle (71).In the next sections, research performed by Argentinean


researchers on marine microorganisms withbiotechnological potential, as well as challenges andopportunities in this field, will be reviewed.

CURRENT RESEARCH LINES

In Argentina, scientific research is contributing tothe knowledge of marine microorganisms withbiotechnological potential in areas such as food andpharmaceutical industries, as well as environmentalprotection. Table 1 shows, to the best of our knowledge,the studies published in periodic journals or booksduring the last two decades in biotechnology-related

marine microbiology. Out of a total of 42 articles, 11characterized marine microorganisms isolated fromSubantarctic and Antarctic regions, and/or theirenzymes (Table 1). The characterized enzymes frommarine isolates include hydrolases of wide industrialuse such as glycosidases (15, 17) and proteases (16,24, 54, 80-84). Cold-adapted enzymes characteristicallyshow high catalytic efficiency at low temperatures andthe possibility of heat inactivation, which make themsuitable candidates for many biotechnologicalpurposes, including food and feed industry, textile andcleaning industries, biofuel production, fine chemicalsynthesis, among others (13).

Biotechnologicalinterest Microorganisms Source Research topic/Application References

Industrial Lactic acid Fresh anchovies (Eugraulis anchoita) Characterization of (5)Biotechnology bacteria Leuconostoc and Lactobacillus

strains for the developmentof anchovy-based products

Psychrotolerant Munida subrrugosa intestinal content, Cold-active ß-glucosidases (15, 17)bacteria Beagle Channel, Tierra del Fuego, for use as food additives(Shewanella sp. G5) Argentina

Psychrotolerant Seawater and alimentary tracts of Cold-active α-L- (28)bacteria various benthonic organisms, Ushuaia rhamnosidases for use as

coast, Tierra del Fuego, Argentina food additives

Psychrotolerant Seawater and the intestines of Cold-active proteases (16)and psychrophilic benthonic organisms collected from with industrialbacteria the Beagle Channel, Argentina applications

Psychrotolerant Subantarctic sea Intracellular α-L- (40)bacteria rhamnosidase as(Pseudoalteromonas debittering agentssp.) for fruit juices

Subantarctic Intertidal sediments, Isla de los Cold active proteases (54)bacteria Estados, Argentina (diverse industrial applications)

Psychrotrophic Intestinal tract of hake (Merluccius Cold active proteases (24)(Pseudoalteromonas hubbsi), San Jorge Gulf, Chubut, (diverse industrialsp.) Argentina applications)

Antarctic bacteria Seawater, sediments and dead Cold active proteases (80-84)marine animals, Antarctica (diverse industrial applications)

Microalgae Native species Lipid extraction and characterization (64)for biodiesel production.

Pharmaceutical Fungi (Acremonium Intertidal sediments, Buenos Aires Amides of D-allo- and L- (26)Biotechnology furcatum) coast, Argentina isoleucine derivatives

with antifungal activityfor plant biocontrol

Fungi Intertidal marine sediment, Long-chain and α,β- (27)(Cladosporium sp.) San Antonio Oeste, Rio Negro, unsaturated aldehydes

Argentina with antibacterial activity

Fungi Marine sediments Ureido sorbicillinol derivative (9)(Paecilomyces (antimicrobial)marquandii)

Lactic acid bacteria Odontesthes platensis intestinal Lactococcal bacteriocin (75)(Lactococcus lactis tract, northeast coast of Chubut, (aquaculture antimicrobial)TW34) Argentina

Table 1. Published research articles in biotechnology-related marine microbiology


The extensive campaigns carried out by Argentineanresearchers at remote, high-latitude marine environ-ments were fundamental to the success of biopros-pection in these cases.

A major subject of study is the role of marinemicrobiota in pollutant biodegradation in coastalenvironments of Argentina. Research studies haveinvolved the analysis of hydrocarbon degradation byisolates, consortia and microbial communities (18, 19,21, 57, 58, 66, 67), production of lipid storage compounds

by hydrocarbon-degrading bacteria (2) as well asproduction of microbial surfactants to facilitatebiodegradation (20, 48, 56, 58). In addition, bioremediationof bilge waste has been achieved in reactor systems(51-53). More recently, culture-independent techniques,including metagenomics, have been used for anassessment of the diversity of hydrocarbon-degradingbacterial populations and their catabolic pathways, aswell as the estimation of biodegradation potential inPatagonian marine sediments (22, 35, 36, 38). The

Biotechnologicalinterest Microorganisms Source Research topic/Application References

Pharmaceutical Lactic acid bacteria Intestinal tract, tegument and gills of Antilisterial activity (79)Biotechnology marine fish, Chubut coast, Argentina

Lactic acid bacteria Intestinal tract, tegument and gills of Antimicrobial activity against fish (76)fish, sediments and water, Bahía Blanca pathogensestuary, Argentina

Microalgae - Optimization of methods to increase (12)(Phaeodactylum eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5n-3)tricornutum) recovery (various medical applications)

Environmental Psychrotrophic and Superficial seawater, San Jorge Gulf Analysis of lipid storage (2)Biotechnology psychrophilic oil- coast, Chubut, Argentina compounds (biofuels and otherBioremediation degrading bacteria applications)

Bacteria Seawater and sediments, Comodoro Hydrocarbon-degradation potential (66, 67)Rivadavia coast, Argentina and microbial community

composition (bioremediation)

Bacteria Polluted and pristine intertidal Alkane biodegradation (57)sediments, Chubut, Argentina (bioremediation)

Bacteria (Bacillus Intertidal sediments, San Antonio Lipopeptide biosurfactant (20, 48, 55, 56)subtilis 09) Oeste, Rio Negro, Argentina (bioremediation)

Bacteria Intertidal sediments, Aristizábal Alkane biodegradation and (58)and Gravina Peninsulas, Chubut, biosurfactants (bioremediation)Argentina

Bacteria Sediments, Bahía Blanca estuary, Hydrocarbon biodegradation (18, 19)Argentina (bioremediation)

Bacteria Oily bilge waste, Chubut, Argentina Hydrocarbon (51, 52, 53)biodegradation(bioremediation)

Bacteria Water, Rio de la Plata estuary, Linear alkylbenzene (62)(Aeromonas, Argentina sulfonate biodegradationPseudomonas, (bioremediation)Vibrio)

Uncultured Marine sediments from Chubut and Characterization and (22, 36, 38)environmental Tierra del Fuego provinces, Argentina quantification of PAHbacteria biodegradation genes

(bioremediation)

Bacteria Intertidal sediments from Patagonia, Naphthalene dioxygenase (70)Pseudomonas sp. Argentina activity (bioremediation)J26

Halomonas spp. Salt brine samples from Bahía Blanca Chemotactic response to (21)Estuary and seawater from gas oil (bioremediation)Mar del Plata, Argentina

Various Microalgae Strain LFF Pt 01, Lab. Carbon metabolism with applications (3)technological (Phaeodactylum Fermentaciones, FBCB, UNL in aquaculture, polyunsaturatedapplications tricornutum) fatty acids, pharmaceutical industry

Table 1. Published research articles in biotechnology-related marine microbiology (continued)


biodegradation of other water pollutants such as linearalkylbenzene sulfonates by marine and estuarineisolates from the Rio de la Plata has also beendescribed (61, 62). Studies in this area led to theidentification or isolation of indigenous microorganismswhich are particularly valuable for in-situ bioremediationstrategies, avoiding environmental safety concerns ofusing allochthonous inocula.

Another important topic addressed by Argentineanresearchers is the study of novel antimicrobialcompounds produced by marine microorganisms suchas fungi (9, 26, 27) or lactic acid bacteria (75, 76,79). For instance, the latter produce antimicrobialcompounds (e.g. bacteriocins) which can be used asbiological control agents or food bio-preservatives (10,29). Another research line developed in Argentinarevealed the potential of lactic acid bacteria asfunctional starter cultures for the development ofanchovy-based products (5). Lastly, an issue thatpresents great potential is the cultivation and study ofmarine microalgae. These microorganisms havevarious commercial uses such as animal feedstock,as source of fatty acids for biodiesel and nutraceuticals,and as a source of other high-value biomolecules [(3,64), Leonardo Curatti, personal communication].Despite the lack of formal bioprospecting programs inArgentina, in contrast with other countries (42, 68),national research groups have discovered manyvaluable macromolecules and activities with potentialbiotechnological applications based on individual-basedefforts during the last 20 years.

CHALLENGES AND OPPORTUNITIES

Bioprospecting, in its modern form, involves theuse of advanced technologies to develop differentproducts exploiting biodiversity (4). In particular, somekey technologies, such as omics-driven approachesand novel cultivation strategies, have the potentialto generate major breakthroughs in the field, as theyallow the access to the yet-to-be-cultured microbialmajority. These techniques are usually costly, andfor marine bioprospection there are additional highcosts associated with the field work. In developingcountries, the resources needed to make use of theirbiodiversity are not always readily available (43).Building and strengthening research capacities inthese countries in disciplines such as -omics,systems biology and bioinformatics is essential toallow them to actively participate in the developmentand commercialization of new products from theiroften vast microbial biodiversity (78). Besidesinvestments, the implementation of national and

regional collaborative research networks optimizes theuse of the often scattered available resources, andencourages the utilization of multidisciplinaryapproaches, essential to this field. Finally, partnershipsbetween research institutions and the local biotechindustry as well as research conducted by the privatesector constitute an essential gear in this machinery.

Argentina belongs to the group of developingcountries with an established scientific capacity (30).In particular, science and technology investments inArgentina have significantly increased over the lastyears. From 2004 to 2008, the proportion of thecountry gross domestic product (GDP) assigned toscience and technology-related activities increasedfrom 0.49 to 0.61 % (46). Although still far from theproportion allocated by developed nations, only Braziland Chile exceed this level of investment amongSouth American countries. Unlike developedcountries, funding of research and development inArgentina mainly comes from the public sector.Government research funding is mainly provided bythe National Agency for the Promotion of Scienceand Technology (ANPCyT) and the National ResearchCouncil (CONICET), dependent on the recentlycreated Ministry of Science, Technology andProductive Innovation (MINCyT). Industry only funds26.5 % of the total investment, representing 0.14 %of the country GDP, while in countries with high-incomeeconomies it funds an average close to 65 %, 1.5 %of their GDP (46). Of an equivalent of approximately57,000 full-time trained human resources, includingresearchers, PhD students and technicians workingin R&D in Argentina in 2008, only 15 % correspondedto private companies (46).

In the National Strategic Plan on Science, Technologyand Innovation 2006-2010, biotechnology was definedas a priority area, and under this frame the ANPCyTfunded 117 biotechnology-related projects during the2006-2008 period (45). Furthermore, in 2007 a law waspromulgated in Argentina to promote the developmentof biotechnology innovation and production processes(LEY 26270, (65)). Argentina´s most developedbiotechnological field is agricultural biotechnology dueto its export-oriented agricultural sector, key for theeconomy of the country (30). As a consequence, publicand private investments in the biotechnological fieldhave been mostly allocated in relation to these interests.One example is the creation of INDEAR (Instituto deAgrobiotecnología de Rosario, www.indear.com) anArgentina-based agricultural biotechnology companyoriginated in a private-public partnership. This companyrecently acquired a second-generation sequencer(Roche 454 GS-FLX Titanium) to address questions


about soil biodiversity and agricultural sustainability.This acquisition positioned Argentina as the secondcountry in South America, after Brazil, having thistechnology available. Although originally obtainedthrough an agricultural biotechnology research project,this instrument is available as a sequencing servicefor both the Argentinean scientific community andprivate companies, and could potentially benefit thefield of marine biotechnology. Similarly, an IlluminaMiSeq system will be available in 2012 at thesequencing service of the Biotechnology Institute,National Institute of Agropecuary Technology (INTA).Another investment that is relevant for applied marinemicrobiology, in this case covered by public funds, isthe recent relaunching of oceanographic campaignsto the Argentine Sea and Antarctica aboard the PuertoDeseado Oceanographic vessel (www.conicet.gov.ar).This is an excellent opportunity for the bioprospectionof marine microorganisms from yet-to-be exploredhabitats such as benthic environments.

Considering the extension of the marineenvironments in Argentina and the diversity of nichesavailable for bioprospection, there are relatively fewresearch articles published in this field (Table 1).Microbiologists have historically focused mainly onbasic and biomedical issues, being research inenvironmental microbiology much less developed.Within this field, the majority of the research work hasfocused on microorganisms from terrestrial environments.As an example, in three Argentinean scientificmeetings held from October 2010 to May 2011 [46th

Annual Meeting, Argentinean Society for Biochemistryand Molecular Biology Research (SAIB) MicrobiologySection, XII Argentinean Congress of Microbiology - ICongress of Agricultural and Environmental Microbiology(AAM), and VII General Microbiology ArgentineanCongress (SAMIGE)] there were approximately 8 timesmore abstracts of soil-related environmental microbiologystudies than those focused on marine microorganisms,being the former mostly related to agricultural issues.Nonetheless, there has been an important increase inthe number of publications in biotechnology-related marinemicrobiology in the last years, as more than 50 % of thearticles were published after 2008 (Figure 1). Theincrease in the number of presentations at localscientific meetings also evidences this trend. Althoughin Argentina the research activity is highly centralizedin major cities, such as Buenos Aires (46), 34 out of42 articles have researchers outside Buenos Aires cityas corresponding authors (Table 2). The PatagonianNational Research Center (CENPAT-CONICET) located

in Puerto Madryn, Province of Chubut, leads the field,followed by PROIMI-CONICET from San Miguel deTucumán city, Province of Tucumán (Figure 2).Furthermore, an active collaboration amongArgentinean institutions is evidenced by coauthorship(Figure 2). Interestingly, the only two articles with acorresponding author from a foreign institution werepublished before the year 2000 (Table 1). In subsequentyears, although coauthorship with foreign groups hasbeen frequent, the corresponding authors wereArgentinean, evidencing the consolidation of researchgroups in the field. The private sector, in contrast, is apartner in only one full-length publication, in which thecorresponding author is from Spain, and the privatepartner is a Spanish company (Table 2). However, theproducts of these partnerships are not always reflectedin publications, due to confidentiality issues.

Published articles in applied marine microbiologyshow a concentration of research interests, with themajority of the publications focusing on the study ofcold-active enzymes, antibacterial compounds orhydrocarbon biodegradation from coastal environments.The existence of few subjects of study in a rathersmall scientific community has the advantage ofallowing the development of productive collaborationswithin the country, as can be seen in Figure 2.However, this will certainly leave a great number ofunexplored issues, and as a consequence, unmetsocietal needs, for example the development ofpharmaceutical products, nutraceuticals or enzymesapplicable in green chemical synthesis. It is importantto notice that most of the research lines are still earlyin their exploration, studying applied issues but not

Figure 1. Productivity of Argentinean researchers in appliedmarine microbiology. The cumulative number of ar ticlespublished in scientific journals was plotted as a function of time,considering January 1994 to July 2011 time frame.


close to producing patents or products. In Argentina,biotechnological patents are still mostly held byforeign individuals and entities. The dependence index(number of patents solicited by non residents/numberof patents solicited by residents) for biotechnologicalpatents was 17.7 in 2007-2008 (45). This value issignificantly higher than the index for the total ofpatents in the country, which is 5.5 for the same period(46). As research is an essential prerequisite for thefurther development of biotechnology (68), it istherefore crucial to stimulate basic and appliedresearch. Product development through private-publicpartnerships is also fundamental in order to decreasethe level of dependence in this field. One example ofsuch collaboration is the one between the ArgentineanAntarctic Institute and Bio Sidus S.A. This collaborationaims at isolating bacteria from Antarctica, sequencingtheir genomes and investigating their cold adaptedenzymes useful for industrial purposes(www.biosidus.com.ar/biodiversidad.php). So far, thishas resulted in the isolation of a new Antarctic marinebacterial species, Bizionia argentinensis JUB59(EU021217) and the complete sequence of its genome(GenBank accession number AFXZ01000000) (7, 34).Large scale initiatives for the bioprospection of marinemicroorganisms including research groups fromvarious fields, government institutions, non-government organizations as well as industry wouldhave an even larger impact, driving marine microbialbiotechnology research beyond individual-basedefforts.

CONCLUSIONS AND POSSIBLE ACTIONS

The extreme diversity of the microbial life inhabitingArgentinean marine environments represents a uniquesource of genetic information that could provide keybiotechnological products and processes, if theirpotential is unveiled. In Argentina, the bioprospectionof marine microorganisms is gaining momentum, asdemonstrated by the increase in the number ofpublished articles in this field over the last years.Recent increases in funding and research capabilitiessuch as the availability of oceanographic vessels willbe fundamental for the exploitation of yet-to-beexplored habitats. Active policies tending tostrengthen existing scientific capacities, to favor theirconnections with the private sector and to encouragethe creation and development of start-up companiesare essential for moving beyond this point, and as aconsequence for the development of marine

Figure 2. Productivity and collaboration among

Argentinean research institutions and with foreign

institutions. Research institutions, in alphabetical order:CEIMA-UNPSJB: Centro de Estudios e Investigación enMicrobiología Aplicada - Universidad Nacional de la PatagoniaSan Juan Bosco. CENPAT-CONICET, Centro NacionalPatagónico-CONICET; CERELA-CONICET, Centro deReferencia para Lactobacilos – CONICET; CERZOS-CONICET-UNS, Centro de Recursos Naturales Renovables de la ZonaSemiárida – CONICET – UNS; CRIDECIT-UNPSJB, CentroRegional de Investigación y Desarrollo Científico Tecnológico -Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco sedeComodoro Rivadavia; FCEyN-UBA, Facultad de CienciasExactas y Naturales-Universidad de Buenos Aires; FFyB-UBA,Facultad de Farmacia y Bioquímica-Universidad de BuenosAires; IAA, Instituto Antártico Argentino; IAL-UNL-CONICET,Instituto de Agrobiotecnología del Litoral- Universidad Nacionaldel Litoral-CONICET; INIDEP, Instituto Nacional de Investigacióny Desarrollo Pesquero; PLAPIQUI-CONICET-UNS, Planta Pilotode Ingeniería Química-CONICET-UNS; PROIMI-CONICET,Planta Piloto de Procesos Industriales y Microbiológicos-CONICET; UNLP, Universidad Nacional de La Pampa; UNMdP:Universidad Nacional de Mar del Plata. UNPSJB Trelew,Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco sedeTrelew; UNS, Universidad Nacional del Sur; UNT, UniversidadNacional de Tucumán.


biotechnology in the country. It is acknowledged thatboth a top-down innovation environment (wheregovernments provide large investments required forfacilities and capabilities), and a bottom-up innovationenvironment (led by individuals and organizationsengaged in innovation and production) are needed inorder for a country to be successful in innovation (14).In fact, bottom-up innovation can also be stimulatedby government policies, such as efficient intellectualproperty policies, transparent and consistent regulations,and tax laws favorable to R&D investment (14).

In many countries, the development of marinebiotechnology is considered a key strategy for solvingsignificant environmental and societal challenges.Assessments of the situation as well as recommen-dations for the development of marine biotechnology

are periodically released (11, 42, 44, 49, 68).Optimally, the current Argentinean situation shouldbe analyzed by a committee integrated by experts ofvarious sectors, in order to elaborate specificrecommendations for Argentina. However, some ofthe actions suggested in other countries that we feelcould apply to Argentina include: (a) to conductsurveys in the private sector in order to detect currentindustry needs and opportunities, to better concentrateresearch efforts; (b) to promote mutually beneficialinteraction and collaboration between academicresearch and industry, and create technology transferpathways; (c) to enhance the development of new biotechcompanies by creating marine biotechnologicalinstitutes or biotech poles co-located with marinelaboratories and/or universities; (d) to include

Main Institution Other collaborating Institutions Number of publications

CENPAT-CONICET, Pto. Madryn, Chubut PLAPIQUI-CONICET, Bahía Blanca, Bs. As. (3) 12Universidad Nacional de Luján, Luján, Bs. As. (2)PROIMI-CONICET, S.M. de Tucumán, Tucumán (2)UNPSJB, Trelew, Chubut (2)

PROIMI-CONICET, S.M. de Tucumán, Tucumán Universidad Nacional de Tucumán, S.M. de Tucumán, Tucumán (3) 6Universidad Nacional de la Pampa, Santa Rosa, La Pampa (3)CENPAT-CONICET, Pto. Madryn, Chubut (1)Friedrich-Schiller-Universität, Germany (2)Universitá di Catania, Italy (1)

Instituto Antártico Argentino, Cdad. de Buenos Aires FFyB-UBA, Cdad. de Buenos Aires (5) 5

UNS, Bahía Blanca, Bs. As. CENPAT-CONICET, Pto. Madryn, Chubut (2) 4PROIMI-CONICET, S.M. de Tucumán, Tucumán (1)

FCEyN-UBA, Cdad. de Buenos Aires Universidade Estadual de Campinas, Sao Paulo, Brazil (2) 3

CRIDECIT-UNPSJB, C. Rivadavia, Chubut UFZ Leipzig-Halle GMBH, Germany (1) 2

INIDEP, M. Del Plata, Bs. As. CRIDECIT-UNPSJB, Comodoro Rivadavia, Chubut 1CENPAT-CONICET , Puerto Madryn, ChubutComisión Nacional deEnergía Atómica, Cdad. de Buenos Aires

CEIMA-UNPSJB, C. Rivadavia, Chubut 1

Universidad Nacional de Mar del Plata, Argentina 1

Universidad Nacional de la Pampa, La Pampa, Argentina PROIMI-CONICET, S.M. de Tucumán, Tucumán 1

CERELA-CONICET, S.M. de Tucumán, Tucumán University of Helsinki, Finland 1

Instituto de Agrobiotecnología del Litoral- UNL-CONICET, 1Santa Fe, Santa Fe

UNPSJB, Trelew, Chubut CENPAT-CONICET, Puerto Madryn, Chubut 1

CERZOS-CONICET, Bahía Blanca, Bs. As. UNS, Bahía Blanca, Bs. As. 1PLAPIQUI-CONICET, Bahía Blanca, Bs. As.

Universidad de Almería, Almería, Spain UNPSJB, Comodoro Rivadavia, Chubut 1Derivados del Etilo S.A., Almería, Spain

Wilhelms-Universität Münster, Münster, Germany UNPSJB, Comodoro Rivadavia, Chubut 1

Total articles 42

Table 2. Research productivity (measured as number of publications) of Argentinean institutions in biotechnology-related marinemicrobiology. Articles are described and cited in Supplementary Table 1. The main institution was inferred from the correspondingauthor´s affiliation. Secondary institutions are listed in order of importance taking into account number of joint publications with themain institution (between parentheses). Country of origin is Argentina unless otherwise noted


biotechnology training in undergraduate and graduateprograms with emphasis in building an interdisciplinaryexpertise, (e) to implement awareness programs inmiddle-level education, for students to explorebiotechnology-related career options, and (f) todevelop a legal framework aiming to regulate theexploitation of marine genetic resources as well as todefine rights and intellectual property issues derivedfrom bioprospection of marine microorganisms. Theimplementation of a national strategy for thedevelopment of marine biotechnology with emphasisin microbiology has the potential of contributing tothe creation of highly qualified jobs through the furtherdevelopment of the biotech industry. This developmenthas the added value of being able to respond tosocietal needs by exploiting the country’s readilyavailable marine resources in a sustainable way.

Acknowledgements: We are in debt with all the Argentineanresearchers that answered our survey about their researchlines. We thank Patricia Dell’Arciprete for her kind contributionwith base maps of Argentina, and Andrés L. Rivas for hiscomments on oceanographic topics. HMD, ML and NLO areresearchers from CONICET. HMD and ML (EnvironmentalMicrobiology Laboratory, CENPAT-CONICET) are supportedby grants from CONICET, ANPCyT, Secretary of Science,Technology and Innovation from Chubut Province, Argentina,and the Community Sequencing Program, Joint GenomeInstitute, US Depar tment of Energy. NLO (MicrobiologyLaboratory, CENPAT-CONICET) is financed by grants fromCONICET and ANPCyT.

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Recibido 9/8/2011 − Aceptado 24/10/2011

Endosimbiosis de Arcobacter butzleri en Acanthamoeba castellanii 133

Endosimbiosis de Arcobacter butzleri en Acanthamoeba castellanii

Endosymbiosis of Arcobacter butzleri in Acanthamoeba castellanii

ISSN 0325-7541Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 133IMÁGENES MICROBIOLÓGICAS

Las amebas de vida libre (AVL), por alimentarseprincipalmente de bacterias, ejercen un rol importanteen el control de las comunidades microbianas delambiente. Dentro de las AVL se destacan las especiesdel género Acanthamoeba y, en especial, Acanthamoebacastellanii (2).

El género bacteriano Arcobacter, propuesto en 1991por Vandamme et al. (3), está formado por 13 especies,entre las que se destaca Arcobacter butzleri por ser la deaislamiento más frecuente y por ser considerada unenteropatógeno emergente de carácter zoonótico (1).

Diversas investigaciones han documentado laendosimbiosis entre diferentes especies bacterianas yamebas del género Acanthamoeba. Se ha comprobadoen A. castellanii una marcada sobrevida del complejoBurkholderia cepacia, Mycobacterium bovis, Vibriocholerae, Vibrio parahaemolyticus y Campylobacterspp. (3).

BIBLIOGRAFÍA1. Fernández H, Flores S, Inzunza F. Arcobacter butzleri strains isolated from different sources display adhesive capacity to

epithelial cells in vitro. Acta Scientiae Veterinariae 2010; 38: 283-7.2. Khan N, (editor). Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. Norfolk UK, Caister Academic Press, 2009.3. Vandamme P, Falsen E, Rossau R, Hoste B, Segers P, Tytgat R, De Ley J. Revision of Campylobacter, Helicobacter, and Wolinella

taxonomy: emendation of generic descriptions and proposal of Arcobacter gen. nov. Int J Syst Bacteriol 1991; 41: 88-103.

Heriberto Fernández*, María Paz Villanueva, Gustavo Medina

Instituto de Microbiología Clínica. Universidad Austral de Chile Casilla 567, Valdivia, Chile.*E-mail: [email protected]

Figura 3. Microscopía electrónicade transmisión (aumento 8200X):trofozoíto de A. castellanii mostrandocélulas de A. butzleri en el interiorde una vacuola (flecha)

Agradecimientos: este trabajo contó con el apoyo financiero de los proyectos FONDECYT 1110202 y S-2007-37 DID-UACH.

Tanto A. butzleri como A. castellanii son de carácterubicuo y también pueden compartir nichos ecológicos,en particular ambientes húmedos (1, 3).

Como se desconoce la relevancia de los potencialesreservorios protozoarios con los cuales A. butzleripuede interactuar en la naturaleza y su significaciónen la dinámica de la epidemiología de esta bacteria,estudiamos en un modelo in vitro la posibilidad deque exista una relación simbiótica entre A. castellaniiy A. butzleri. Los resultados preliminares indican queA. butzleri puede ingresar en las amebas y ubicarseen el interior de vacuolas (Figuras 1, 2 y 3). Además,dentro de ellas puede sobrevivir al menos por 10días, de lo que se infiere que A. castellanii podríaconstituir un eventual reservorio de A. butzleri en elmedio ambiente y actuar como vector, vehiculizandoa la bacteria de un ambiente o de un hospedero aotro.

Figura 1. Microscopía de contraste de fase (aumento1250X): trofozoíto de A. castellanii mostrando célulasde A. butzleri en el interior de vacuolas (flecha)

Figura 2. Microscopía de campo claro(tinción de Gram, aumento 1000X):trofozoíto de A. castellanii mostrandocélulas de A. butzleri en el interior deuna vacuola (flecha). En el recuadroaumentado se observa la presencia deseis células bacterianas

134 Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 134ISSN 0325-7541

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 134IMÁGENES MICROBIOLÓGICAS

Querión de Celso - Kerion celsi

Paciente de 5 años que presentaba celulitis de cuero cabelludo en la región temporal izquierda y una tumoracióneritematosa, indurada, con secreción purulenta que drenaba por múltiples bocas (en espumadera); con costras de tipomelicéricas, alopecia y pediculosis asociada (Figura 1). El paciente se encontraba afebril y sin dolor. Se inició tratamientoantibiótico con cefadroxilo. Debido a la mala evolución se tomó biopsia para estudios microbiológicos. El examenmicroscópico directo y el cultivo para gérmenes comunes fueron negativos, al igual que el examen microscópico directopara la búsqueda de hongos. Se rotó el tratamiento a ampicilina-sulbactama y corticoides. Posteriormente, ante la faltade mejoría y la persistencia de la supuración y la flogosis, se decidió iniciar empíricamente tratamiento antifúngico congriseofulvina por diagnóstico presuntivo de querión de Celso. A las 48 h de iniciado el esquema antifúngico se evidenciómejoría de las lesiones. Luego de 10 días de incubación de los cultivos en los medios de Lactrimel y Sabouraud seobtuvo desarrollo de un hongo que fue identificado por sus características culturales y microscópicas como Trichophytonmentagrophytes. En la Figura 2 se observa la lesión al cabo de 10 días de tratamiento.

La tiña de la cabeza o tinea capitis es una dermatomicosis del cuero cabelludo frecuente en niños de 3 a 7 años,y es muy rara en adultos. Algunos de los factores asociados a su presentación son la higiene personal deficiente, elhacinamiento y el bajo nivel socioeconómico (2, 4). El kerion o querión de Celso es una forma clínica supurativa dela tinea capitis, producida principalmente por Microsporum canis y T. mentagrophytes. La reacción inflamatoria esmuy intensa, la lesión sobresale y drena pus por orificios foliculares (1). El nombre de querión (que en griegosignifica panal) se atribuye a Celso y surgió en Roma, alrededor del año 30 a. C. Durante el siglo XIX, la tiña de lacabeza era un problema de salud pública muy importante y presentaba carácter epidémico. Al parecer, los europeosla introdujeron en el continente americano (4).

Trichophyton mentagrophytes es un dermatofito zoófilo que suele producir infecciones inflamatorias en los humanos.En los cultivos, las colonias son granulosas o vellosas, el color del anverso puede ser blanco, crema o amarillento;el reverso suele ser ocre o rojizo (Figura 3). En las preparaciones microscópicas se ven microconidios globulososdispuestos en racimos y macroconidios de pared fina y lisa en forma de cigarro, con tabiques transversales. Sepueden observar hifas espiraladas en un tercio de las cepas (1, 2, 3) (Figura 4). El tiempo de desarrollo en loscultivos puede variar entre 7 a 10 días o más en algunos casos (2,3).

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4. Rebollo N, López Barcenas A, Arenasv R. Tiñade la cabeza. Actas Dermosifilogr 2008; 99:91-100.

Figura 4. Vista microscópica a 400Xobtenida a partir del disgregado del cultivo.Se observan microconidios globulososdispuestos en racimos e hifas en espiral

Figura 1. Aspecto de la lesión antes del tratamiento antifúngico;

drenaje por múltiples bocas (en espumadera)

Figura 2. Aspecto de la lesión luego de 10 días de tratamiento

antifúngico

Mónica S Saiz 1,Lorena P Uribe1, Andrés GallardoMartínez2.1Área Laboratorio de Microbiología; 2ÁreaInfectología, Clínica San Lucas. Alcorta 752(8300) Neuquén, Argentina.E-mail: [email protected]

Figura 3. Aspecto de las coloniasen el medio Lactrimel luego de 10días de incubación


La Revista Argentina de Microbiología (RAM) es una publicación trimestral editada por la Asociación Argentina de Microbiologíay destinada a la difusión de trabajos científicos en las distintas áreas de la Microbiología. La Asociación Argentina de Microbiologíase reserva los derechos de propiedad y reproducción del material aceptado y publicado.

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Deben especificarse en la sección agradecimientos las fuentes de financiación para la tarea experimental descrita en el manuscrito,ya sean éstas institucionales, oficiales o privadas. También se deberán especificar en esta sección las afiliaciones comerciales o losvínculos tales como consultorías, así como la copropiedad de licencias con fines comerciales por parte de uno o más autores. El material será analizado por el Comité Editor y sometido a la consideración de dos árbitros científicos designados para cadacaso. El Comité Editor se reserva el derecho de rechazar aquellos manuscritos cuyos contenidos se superponen total o parcialmentecon trabajos ya publicados, o cuyas temáticas no se correspondan con las de la RAM. Asimismo, son motivos de rechazo la falta decumplimiento de las reglas editoriales, violaciones éticas, baja calidad científica y un uso pobre del idioma, sea éste inglés o español.El Comité Editor se reserva el derecho de efectuar las modificaciones gramaticales o de estilo que considere necesarias.

ORGANIZACIÓN Y FORMATO La RAM acepta artículos originales, informes breves, artículos especiales, imágenes microbiológicas, editoriales y también editasuplementos. Se solicita leer cuidadosamente las especificaciones de cada formato a los efectos de elegir el más apropiado y deesta manera agilizar el proceso de evaluación. Los manuscritos podrán redactarse indistintamente en español o en inglés, aunque el Comité Editor estimula a los autores aescribir los trabajos en inglés para favorecer su difusión y lectura a nivel internacional. Artículos originales. Son trabajos de investigación completos y deben redactarse respetando las siguientes secciones: Título(en español y en inglés) y Título abreviado, Resumen y Palabras clave (en español y en inglés), Introducción, Materiales y métodos,Resultados, Discusión, Agradecimientos y Bibliografía. El manuscrito no deberá exceder las 8000 palabras incluyendo a todas lassecciones, con hasta 6 tablas o figuras. Informes breves. Son trabajos de menor extensión, entre los que se incluyen casuísticas, casos clínicos y descripciones detécnicas o dispositivos nuevos, avalados por trabajos experimentales concluyentes. Se debe omitir la división del texto en seccionesy todo el manuscrito no podrá exceder las 3000 palabras, con un máximo de quince citas bibliográficas y de tres tablas o figuras. Esnecesario un análisis cuidadoso de la presentación de los datos para evitar su reiteración en el texto, en las tablas y en las figuras,a fin de mantener la característica de brevedad de este tipo de artículos. Artículos especiales. Son actualizaciones o consensos de grupos de trabajo acerca de temas de gran interés en el ámbitoregional o internacional. Sus autores deben ser especialistas en la materia y el texto debe incluir una revisión bibliográfica amplia yactualizada. Los artículos especiales admiten hasta 10 000 palabras, 8 tablas o figuras y no más de 100 citas bibliográficas. Imágenes microbiológicas. Pueden corresponder a fotos de bacterias, hongos, parásitos o virus, tomadas de exámenesen fresco o con coloraciones, y observadas bajo microscopía óptica, electrónica o de fluorescencia. También se admiten otrasimágenes fotográficas, por ejemplo, microorganismos en medios de cultivo, lesiones ilustrativas en pacientes o en animales deexperimentación, imágenes radiográficas y ecográficas, de tomografías computarizadas, de resonancia magnética nuclear, etc.Estas imágenes, de gran valor didáctico y no necesariamente excepcionales, deben estar acompañadas de un texto explicativoy de flechas indicadoras, cuando corresponda. El conjunto no debe exceder una página impresa. Los requisitos de calidad parael envío de las imágenes se describen bajo el ítem “Figuras”.

INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES



Cartas al Editor. Pueden corresponder a comentarios o nuevos datos. Los primeros consisten en observaciones sobre losartículos publicados en la revista; los segundos están destinados a comunicar hallazgos concisos que no son apropiados para supublicación como trabajo completo o informe breve. Ambas clases de contribuciones no deben exceder las 500 palabras, deben tenertítulo en español e inglés, no deben llevar resumen y pueden contener no más de una figura o tabla. Los autores y sus filiacionesaparecerán al pie de la carta. Se debe proporcionar solo la filiación primaria de cada autor. Los comentarios deben hacer mencióndel volumen y el número en que se publicó el artículo comentado, de su título completo y del apellido del primer autor. Asimismo,deben contener referencias bibliográficas que apoyen el argumento de quien envía la carta. Para considerar la publicación de uncomentario, se solicitará primero una respuesta al autor de correspondencia del artículo publicado; la aprobación final y publicaciónde ambas quedará a criterio del editor. En el caso de una contribución presentada como nuevos datos, ésta se asignará a un editorexperto en la materia, quien junto con revisores externos se encargará de su evaluación. Se debe tener en cuenta que algunos delos servicios de indexación no incluyen las Cartas al Editor en sus bases de datos.

Editoriales. Abordan tópicos científicos de gran actualidad y particular relevancia para la comunidad científica especializada en laMicrobiología, o trabajos de opinión sobre política científica. La oportunidad y autoría de los editoriales, así como sus lineamientosgenerales, quedan exclusivamente a criterio del Comité Editor.

Suplementos. Corresponden a revisiones extensas de un tema específico realizadas por una o varias sociedades científicaso universidades, o a los resúmenes de las contribuciones efectuadas en el marco de eventos científicos organizados por la AsociaciónArgentina de Microbiología o alguna de sus Divisiones o Filiales (comunicaciones orales, paneles, conferencias, mesas redondas,etc.). Los suplementos estarán a cargo de editores invitados; sus propuestas temáticas y lineamientos generales deberán seraceptados por el Comité Editor.

La revisión de los manuscritos correspondientes a los suplementos estará a cargo de revisores elegidos por el Comité Editor(revisiones extensas) y de los editores invitados (resúmenes de eventos). El suplemento deberá ser financiado en su totalidad porla entidad que ha organizado la reunión científica, la que tendrá en cuenta que el suplemento deberá ser accesible a todos losparticipantes del evento o a todos los socios de la Asociación Argentina de Microbiología (por suscripción y on-line). Con respectoa la edición, el suplemento deberá respetar exactamente el formato y el estilo de la Revista Argentina de Microbiología en todossus aspectos (tapa, tipo de papel, impresión, tablas, figuras, fotos, etc.), tal como se describe en este instructivo. Los suplementoscorrespondientes a los resúmenes de los eventos deben incluir en este orden: nómina de los miembros del Comité Editor de laRevista Argentina de Microbiología, datos de presentación del evento (título completo, lugar y fecha), índice en español y en inglés,agradecimientos, nómina de las autoridades del evento y mensaje/s del/de los presidente/s. A continuación se presentarán losresúmenes numerados desde el uno con números arábigos. Al final del suplemento debe incluirse el índice alfabético de autores ylas “Instrucciones para los autores” de la Revista Argentina de Microbiología, en español y en inglés. El programa esquemático delevento sólo se podrá incluir en forma de tríptico, suelto en el interior del suplemento.

ELABORACIÓN DE LOS MANUSCRITOSLos manuscritos se deben escribir en hoja A4 con márgenes de 3 cm de lado. Se deberá utilizar formato de fuente Times New

Roman, estilo regular, tamaño 12 puntos, a doble espacio. Las letras en negrita o itálica se usarán sólo cuando corresponda. A partirdel resumen, se deberán numerar consecutivamente las páginas (en el ángulo inferior derecho) y las líneas del manuscrito. Esto seaplicará tanto para el texto como para las tablas, figuras y leyendas, y también para la bibliografía. Las páginas correspondientesa las tablas, figuras y leyendas se incluirán después de la sección de bibliografía.

Carátula. En la primera página se debe indicar el título del trabajo (sólo la primera letra en mayúscula, el resto en minúscula); losautores (primer nombre completo, iniciales de los nombres restantes y apellidos completos de todos los autores); lugar de trabajo(nombre de la institución y dirección postal) y título abreviado del trabajo, de hasta 50 caracteres, para cabeza de página. Si el trabajoincluye autores con distintos lugares de trabajo, se colocarán superíndices numéricos (no encerrados entre paréntesis) junto a losnombres, de manera de identificar a cada autor con su respectivo lugar de trabajo. El autor responsable de la correspondencia seindicará con un asterisco en posición de superíndice ubicado junto al nombre; se detallará su dirección de correo electrónico. Enaquellos casos en que uno o varios de los autores hayan cambiado de filiación, se debe consignar la filiación donde se realizó eltrabajo y al pie de página, su lugar de trabajo actual.

Resúmenes. Se incluirán sólo en los artículos originales, informes breves y artículos especiales y podrán tener una extensiónmáxima de 250 palabras para los artículos originales y de 150 palabras para los informes breves. El primero de ellos estará redactadoen el idioma empleado en el trabajo; el segundo, en el otro idioma y estará encabezado por el título completo del trabajo. Cada unode ellos estará seguido de una lista de tres a seis palabras clave en el idioma correspondiente. Se debe evitar en los resúmenes eluso de abreviaturas y de citas bibliográficas. Dado que el resumen puede ser publicado separadamente por servicios bibliográficos,se deberá asegurar que resulte comprensible aun en ausencia del texto completo.

Introducción. Debe suministrar suficiente y adecuada información sobre el tema en cuestión, como para permitir su comprensiónal lector no especializado. Asimismo debe incluir la hipótesis o la base científica que guió el diseño experimental y los objetivos deltrabajo definidos con claridad. Las referencias citadas en esta sección deberán ser elegidas muy cuidadosamente y ser las másimportantes del tema.

Materiales y Métodos. Debe contener una adecuada descripción de los métodos, aparatos, reactivos y procedimientos utiliza-dos, con el detalle suficiente como para permitir la reproducción de los experimentos. Los procedimientos o técnicas comunes y deutilización de rutina pueden citarse por medio de una referencia (ej., determinación de la CIM según el CLSI, 2010). Los métodosnuevos o desarrollados especialmente para el trabajo deben ser descritos con detalle, como así también la fuente de drogas pococomunes o materiales biológicos (cepas bacterianas, virales, fúngicas, plásmidos, etc.). La marca y la procedencia de los reactivos,de los medios de cultivo y de los equipos deben consignarse en el texto la primera vez que se los cita identificando marca, ciudad/estado (si correspondiera) y país de origen.

Resultados. Debe incluir el diseño experimental y su base científica, así como los resultados obtenidos presentados en formaconcisa como texto (preferentemente) o como tabla(s) o figura(s). Evite el uso innecesario de tablas y figuras para mencionar datosque podrían ser presentados en el texto. No duplique la misma información incluyéndola en el texto y en las tablas o figuras. Limiteel número de fotografías a las mínimas necesarias para mostrar los resultados experimentales. Numere las tablas y figuras en elorden en el que se citan en el texto. Se deben evitar las repeticiones y destacar sólo los datos importantes. Se debe dejar para lasección Discusión la interpretación más extensa.

Discusión. Debe hacer énfasis sobre los aspectos más importantes y novedosos del estudio, e interpretar los datos experimentalesobtenidos en relación con los ya publicados. Indique las conclusiones a las que se arribó y evite la reiteración de datos y conceptosya vertidos en secciones anteriores. Se admite la presentación de Resultados y Discusión como una sección conjunta.

Agradecimientos. Esta sección se debe presentar en un solo párrafo, en un tamaño de letra menor al usado en el texto del


manuscrito (Times New Roman, tamaño 11 puntos). Se mencionarán en esta sección las fuentes de financiación y los individuoso instituciones que hayan contribuido con reactivos, materiales biológicos o discusión de resultados.

Bibliografía. En todos los manuscritos es conveniente que el 70 % de las citas bibliográficas corresponda a los últimos 10 añosy el 30 % restante se distribuya entre los trabajos clave publicados durante los años anteriores. Las citas bibliográficas se debenescribir en hoja aparte y presentarse en orden alfabético de autores, numeradas correlativamente empleando números arábigos.En el texto, las citas deben aparecer con números entre paréntesis, en correspondencia con el número con que aparecen en labibliografía. Las referencias a comentarios personales y a trabajos inéditos deberán mencionarse en el texto como comunicaciónpersonal, escrito entre paréntesis.

Para las referencias, se deberán citar la totalidad de los autores y seguir los siguientes modelos:a. Publicaciones periódicasHéritier C, Poirel L, Lambert T, Nordmann P. Contribution of acquired carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem

resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 3198-202.Los títulos de las revistas serán abreviados según el Index Medicus (el listado puede obtenerse en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

sites/entrez?db=journals).b. Capítulos de libros/módulosMartins Teixeira L, Siqueira Carvalho M da G, Facklam RR. Enterococcus. En: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML,

Pfaller MA, editors. Manual of Clinical Microbiology, 9th edition. Washington DC, ASM Press, 2007, p. 430-42.c. Presentaciones en congresos u otros eventos científicosAguilar M, Punschke K, Touati D, Pianzzola MJ. Estudios fisiológicos y genéticos en la bacteria sulfato reductora Desulfoar-

culus baarsii. Terceras Jornadas Rioplatenses de Microbiología, 1997, Resumen J2, p. 102, Ciudad Autónoma de Buenos Aires,Argentina.

d. Presentaciones en congresos u otros eventos científicos reproducidas dentro de un suplemento publicado por unarevista de publicación periódica.

Fellner MD, Correa RM, Durand K, Teyssié AR, Picconi MA. Análisis del ADN circulante de virus Epstein-Barr (EBV) en pacien-tes inmunosuprimidos con y sin linfomas asociados. VIII Congreso Argentino de Virología, Resumen 10416. Rev Argent Microbiol2005; 37 Supl 1: 95.

e. InstitucionalesClinical and Laboratory Standards Institute. Disk diffusion. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 15th

Informational Supplement, 2005; M100-S15. Wayne, PA, EE.UU.f. TesisBrizzio A. Aplicación de una PCR múltiple para la identificación de cepas de Staphylococcus aureus toxigénicas. Tesis de Maestría

en Microbiología Molecular 2009. ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” y Universidad Nacional de San Martín.g. Referencias on-line1. Para libros on-lineSullivan CJ, editor. 1999-2001. Fungi: an evolving electronic resource for the microbiological community. ASM Press. [On-line]

http://link.asmusa.de/link/service/books/91090. Consultado el 7 de setiembre de 2001.2. Para versiones on-line de revistas disponibles en forma impresa.van der Zeiss L, Danziger VB. History of clinical microbiology. Clin Microbiol 1999; 100: 123-234. [On-line]3. Para revistas únicamente disponibles on-lineZellnitz F, Foley PM. October 1998, posting {or revision} date. History of virology. Am Virol J 1998; 1: 30-50. [Online] http://www.

avj.html.4. Para trabajos publicados on-line como manuscritos de publicación adelantadaZheng Z, Zou J. 5 September 2001. The initial step of the glycerolipid pathway: identification of glycerol-3-phosphate/dihydroxy-

acetone phosphate dual substrate acyltransferases in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 10. 1074/jbc.M104749200.h. Los ítems, referencias a trabajos o a resúmenes de congresos no publicados, en proceso de publicación o bajo revisión;

comunicaciones personales; patentes en aplicación o en trámite; bases de datos y páginas web deben ser citadas en el texto entreparéntesis como se muestra:

… resultados similares (Gómez H, resultados no publicados)… nuevo protocolo de detección empleado (González JL, enviado para su publicación).… concentraciones de droga (López GO, 34th Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother; abstr. 114, 1994).… nueva especie de bacteria celulolítica (Márquez W, comunicación personal)… comentados previamente por diversas fuentes (http://fcen.uba.edu.ar)Tablas. Se presentarán en hoja aparte, numeradas consecutivamente con números arábigos, encabezadas con un breve título

explicativo (que en lo posible no reitere los títulos de las filas y las columnas), con las leyendas y/o aclaraciones que correspondanal pie. Las llamadas para las aclaraciones al pie se harán empleando números arábigos entre paréntesis y superíndice. Sólo losbordes externos de la primera y la última fila y la separación entre los títulos de las columnas y los datos se marcarán con líneacontínua. No se marcarán las filas ni los bordes de las columnas.

Figuras. Se presentarán en hoja aparte, con el número de figura en el margen superior izquierdo y en el orden que aparecen enel texto. Los dibujos deberán estar en condiciones que aseguren una adecuada reproducción. Los números, letras y signos tendrándimensiones adecuadas para ser legibles cuando se hagan las reducciones necesarias. Las referencias de los símbolos utilizadosen las figuras deberán incluirse dentro de la misma figura y no en el texto de la leyenda. Las fotografías podrán ser realizadas encolor o en blanco y negro, en el formato JPEG o TIFF. Las resoluciones mínimas requeridas son 300 dpi para las imágenes y foto-grafías en color y escala de grises, 600 dpi para las imágenes de arte de combinación (letras e imágenes) y 1200 dpi para lasimágenes de arte de línea (gráficos y dibujos). Nota: es muy importante que se use una adecuada resolución de archivo. Todaslas imágenes individuales que se importan en un archivo gráfico deben estar en la resolución correcta antes de su carga. Tengaen cuenta, sin embargo, que cuanto mayor sea la resolución más grande será el archivo y más tiempo demandará su envío pormedios electrónicos. Las leyendas de las figuras se presentarán reunidas en una hoja aparte, ordenadas consecutivamente connúmeros arábigos.

Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos. Las secuencias nuevas comunicadas a través de la publicación en estarevista deberán ser depositadas en una base de datos y sus números de acceso incluidos en el manuscrito, no más tarde de laetapa de revisión. Los números de acceso deberán ser incorporados en un párrafo separado al final de la sección “Materiales ymétodos” en el caso de trabajos originales, o luego del texto en el caso de informes breves. La información sobre bases de datosactualmente disponibles es la siguiente: DDBJ: Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan National Institute ofGenetics; e-mail. [email protected]; URL, http://www.ddbj.nig.ac.jp


EMBL: EMBL Nucleotide Sequence Submissions, European Bioinformatics Institute; e-mail. [email protected]; URL,http://www.ebi.ac.uk

GenBank: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine; e-mail. [email protected]; URL,http:// www.ncbi.nlm.nih.gov

En lo que respecta a la presentación de nuevas secuencias de ácidos nucleicos, aquellas de hasta 50 nucleótidos pueden serpresentadas en cualquier estilo. Las secuencias de longitud importante deben ser presentadas como Figuras para reducir espacio,indicando 80 a 120 nucleótidos por línea, en un tipo de letra que lo haga fácilmente legible en las condiciones de publicación (16cm, ancho de dos columnas de la RAM). De ser posible, se dividirán las líneas de la secuencia en bloques de 10 o 20 nucleótidosseparados por un espacio o por números indicativos encima de la secuencia. Las líneas deberán estar numeradas, indicando elnúmero correspondiente a la izquierda de la primera base de cada línea. Las anotaciones necesarias se marcarán en negrita,subrayadas o entre paréntesis. Si se requiriere presentar la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica,se indicará mediante el uso de símbolos de una letra aceptados como indicativos de aminoácidos, los que se localizarán debajodel primer nucleótido del codón codificante.

Siglas. Las siglas y demás abreviaciones (cuando esto corresponda) deberán ser explicitadas después de su primera menciónen el texto. Las unidades de medida se expresarán siguiendo las normas del Système International d´Unités.

ENVÍO DE LOS MANUSCRITOSLos manuscritos podrán ser enviados por correo electrónico ([email protected]) o por correo postal (Deán Funes 472, C1214AAD,

Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina), incluyendo una versión electrónica en CD-ROM, el que deberá estar identificadocon una etiqueta o rótulo que indique el nombre del trabajo y los programas (y versiones) usados para confeccionar el texto, lasfiguras y las fotografías, así como el nombre de los archivos que contiene.

Se recomienda incluir todo el texto del artículo en un solo archivo; en caso de haber imágenes, éstas deben enviarse en archivosseparados. Se recomienda además tipear las mayúsculas, los espacios entre palabras, las itálicas y las negritas tal como se desease muestren luego en el impreso; no dejar espacios antes y después de los subtítulos; justificar el texto y usar la tecla de tabulacióny no la barra espaciadora para encolumnar las tablas.

Se recomienda a los autores revisar la lista de chequeo que figura a continuación de estas instrucciones y verificar que se hacumplido con todos los requisitos allí señalados. Antes de enviar un manuscrito, es también recomendable consultar algún ejem-plar reciente de la RAM para verificar si se han seguido las pautas requeridas de formato y estilo y, eventualmente, efectuar lasmodificaciones necesarias.

Se aconseja a los autores eliminar de las propiedades de los archivos que envíen todo tipo de información que identifique suautoría.

PROCESO EDITORIALUna vez que el manuscrito ha cumplido el proceso editorial y se encuentra listo para su publicación, se enviará por correo

electrónico al autor responsable el archivo en formato pdf de la prueba de galera, para que realice las correcciones tipográficasque correspondieran. No podrá cambiar conceptos ni modificar párrafos que alteren el formato de la impresión. Se deberá imprimirel documento, realizar las correcciones sobre el texto y devolverlo por fax o como archivo escaneado por correo electrónico. Lascorrecciones también pueden ser enviadas por correo electrónico, especificando claramente la página, el párrafo y la línea que sedesea corregir. La corrección deberá ser devuelta en un plazo no superior a los siete días corridos de remitida la prueba de galera,caso contrario se considerará como declinada su publicación. En ese momento se le enviará al autor el monto que deberá abonarpara que el artículo pueda ser publicado.

La Revista Argentina de Microbiología apoya las políticas para el registro de ensayos clínicos de la Organización Mundial de laSalud (OMS) y del International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), reconociendo la importancia de estas iniciativas parael registro y la divulgación internacional de información sobre estudios clínicos, en acceso abierto. En consecuencia, solamente seaceptarán para publicación los artículos de investigaciones clínicas que hayan recibido un número de identificación en uno de losRegistros de Ensayos Clínicos validados por los criterios establecidos por la OMS y el ICMJE, cuyas direcciones están disponiblesen el sitio del ICMJE. El número de identificación se deberá registrar al final del resumen.

Costo de la página. Por cada página publicada se cobrarán $ 75 o $ 200 si ésta incluye fotografías en color (Argentina, sociosde la AAM), $ 200 o $ 600 (Argentina, no socios de la AAM) y USD 70 o USD 180 (otros países).

Formas de pagoSi es socio y abona sus cuotas por débito, puede suscribirse abonando con débito con solo solicitarlo por mail a [email protected] copia a [email protected]

Secretaria: Deán Funes 472, (C1214AAD) Ciudad Autónoma de Buenos Aires - Argentina; Tel.: (54-11) 4932-8858 y(54-11) 4932-8948; e-mail. [email protected]; http://www.aam.org.ar

SUSCRIPCIÓN ANUAL (4 números)

Socios AAM $ 120Argentina no socios $ 240América Latina USD 100Otros países USD 200

Por depósito enBanco Galicia, (cualquier sucursal),cta. cte. Nº 10980/6 007/1, CBU 0070007820000010980619, enviándonos la fotocopia de la boletade depósito por fax, aclarando nombre, domicilio y concepto del pago, a los TE/FAX: 011 4 932-8858 y 8948 -CUIT: 30-60746436-3 oescaneada por mail a [email protected] Nación, (cualquier sucursal), cta. cte. Nº 000969700035/74 suc. Bulnes, CBU: 0110697420069700035747, CUIT: 30-60746436-3enviándonos la fotocopia, idem instrucciones para Bco. Galicia.

ISSN 0325-7541Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 139

Guía para la preparación de los manuscritos

La siguiente lista está destinada a servir de guía para la preparación y revisión de su manuscrito de acuerdo con el estilo y formatode la revista. Para más detalles consultar las Instrucciones a los Autores (http://www.aam.org.ar). Los manuscritos que no cumplancon el formato especificado serán devueltos a los autores, retrasándose el proceso de evaluación y publicación.

Título Sí No Nocorresponde

Incluye título en españolIncluye título en inglésIncluye título abreviado

Autores

Identifica al autor responsableIncluye dirección, teléfono y correo electrónico del autor responsableIncluye a todos los autoresIncluye el lugar de trabajo de cada autorIncluye nota de presentación del manuscrito por el autor responsable

Resúmenes

No supera el máximo de palabras permitidasIncluye resumen en españolIncluye palabras clave en españolIncluye resumen en inglésIncluye palabras clave en inglés

Texto

No supera el máximo de palabras permitidasNo supera el máximo de tablas y/o figuras permitidasContiene las secciones correspondientesHace uso correcto de las abreviacionesCita la marca y procedencia de los reactivos, de los medios de cultivo y de los equiposCita el número de acceso de las nuevas secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos

Tablas y Figuras

Incluye cada una en hoja aparte

Los títulos son claros y concisosIncluye las leyendasLas citas en el texto se corresponden con el número de cada tabla y figuraExplica las abreviaciones no convencionales al pie de las tablasEnvía las figuras y fotografías en archivos adjuntos

Bibliografía

Respeta estrictamente el formato requerido por la revistaOrdena las citas bibliográficas en forma alfabéticaIncluye las referencias en el texto en correspondencia con el número con elque aparecen en esta sección

Agradecimientos

Cita las fuentes de financiamiento

140 Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 00-00REVISTA ARGENTINA DE

INSTRUCTIONS TO AUTHORS

Revista Argentina de Microbiología (RAM) is published by the Asociación Argentina de Microbiología on a quarterly basis. The aimof this journal is to publish current scientific works in the different areas of Microbiology. The Asociación Argentina de Microbiologíareserves the right to use, reproduce and publish the accepted material.

GENERAL REQUIREMENTSManuscripts submitted for publication in RAM should be original research articles. Submitting a manuscript for publication implies

that the authors have been authorized by the corresponding institutions to publish relevant data and that neither the manuscript norone with substantially similar content has been previously published, except in the case of partial presentations at scientific meetings,or is being considered for publication by another journal. If necessary, original data should be submitted to the Editorial Board. Itshould also be made clear that results come from projects approved by the Biosafety and Bioethics Committees of the participatinginstitutions, and that when those results include patient information they conform to the Habeas Data Act.

SUBMISSION OF ORIGINALS AND COPYRIGHTManuscripts should be addressed to the Editorial Board of Revista Argentina de Microbiología accompanied by a cover letter

according to the following model:“Dear Editors of Revista Argentina de Microbiología,As corresponding author (to whom correspondence should be addressed), hereby declare that the coauthors have accepted to be

represented by myself before RAM with regard to the submission of the manuscript “…Title…”, and they are jointly responsible with mefor the contents of this work. Neither this manuscript (nor any other with similar contents) has been previously published or isbeing considered for publication by another journal. I also agree to transfer copyright to Revista Argentina de Microbiología oncepublished”.

All the authors of a manuscript should explicitly authorize its publication and will be responsible for the truthfulness of its contents.They should also express their agreement regarding the choice of one of them to become the corresponding author for editorial pur-poses. Furthermore, they should express their agreement with respect to their position in the list of authors, indicating their academicaffiliation. A change of the corresponding author or in the order of the list of authors shall only be considered by a note signed by allthe authors to that effect. The authors shall also disclose any existing conflict of interests that might affect the manuscript assess-ment on an attached letter. The Editorial Board shall treat all received manuscripts in strict confidence.

Funding sources for research work described in the manuscript, either from public or private institutions, commercial affiliationsor consultancies, as well as co-ownership of patents for business purposes by one or more authors shall be indicated under theAcknowledgements Section.

Contributions will be assessed by the Editorial Board and submitted to the consideration of two scientific referees appointed foreach case. The Editorial Board reserves the right to reject those manuscripts whose contents partially or totally overlap with worksalready published or whose topics are irrelevant to those of RAM. Furthermore, reasons for rejection are non-compliance ofeditorial requirements, ethical violations, low scientific quality and poor use of language, either English or Spanish. The Editorial Boardreserves the right to make all necessary grammatical and style modifications.

ORGANIZATION AND FORMATRAM accepts original articles, brief reports, special articles, microbiological images, editorials and supplements. Careful reading

of the specifications for each special format is recommended in order to choose the most adequate one and therefore, to expeditethe evaluation proceedings.

Manuscripts shall be written in Spanish or English. The Editorial Board encourages authors to use English as their language ofchoice so that their work reaches wider international scope and readership.

Original articles. They are full research papers which must be submitted in accordance to the following sections: Title (in Spanishand English) and Short Title, Abstract and Key words (in Spanish and English), Introduction, Materials and Methods, Results,Discussion, Acknowledgements and References. Manuscripts shall not exceed 8,000 words including all the sections and shallinclude a maximum of 6 tables or figures.

Brief reports. They are less extensive works. They include case reports, descriptions of new tecniques or equipment based onconclusive experimental work. Manuscripts should not be divided into sections and shall not exceed 3,000 words. References shouldbe limited to fifteen citations and tables and figures to a maximum of three. Careful analysis of data presented should be observedso as to avoid their repetition in the text, tables and figures, in order to maintain the typical concision in style that characterizes thistype of articles.

Special articles. They are updates or workshop results on topics of regional and international weight. Their authors must bespecialists in their field of study. Texts must include updated and comprehensive bibliography. Updates may include up to 10,000words, 8 tables or figures. References should be limited to 100 bibliographic citations.

Microbiological images. They may include high-quality pictures of bacteria, fungi, parasites and viruses, from direct observationor staining under optical, electronic or fluorescent microscopy. They may also include other photographic images of microorganisms inculture media, lesions in humans or laboratory animals, x-ray and ultrasound images, computed tomography scans, nuclear magneticresonance, etc. These images having great instructional value though not necessarily ground-breaking, should be accompanied byan explanatory text and indicating arrows when necessary. The set of images should fit one printed page at most. Quality require-ments for images are described under the “Figures” section below.

Letters to the Editor. Letters can include either comments or new data. The comments consist in observations made on the articlespublished in the journal; the latter are aimed at communicating short pieces of work which do not have the appropriate length to bepublished as a complete work or brief report. Both contributions must not exceed 500 words, they should include the title in Spanish


and English, they must not have an abstract, and may contain only one figure or table. The authors’affiliations should be placed at thebottom of the letter. Only the primary affiliation of each author should be indicated. The comments should mention the volume andissue number where the article was published, as well as the complete title and the first author’s last name. Furthermore, the sendershould mention the bibliographical references that support the letter contents. In order to publish a comment, the correspondingauthor of the published article will be first consulted, the final decision and publication will remain at the editor‘s discretion.

Contributions of new facts will be submitted to a specialist editor with knowledge in the subject matter, who along with externalreviewers will assess the information. It should be noted that some journal indexing services do not include Letters to the Editorin their databases.

Editorials. They focus on current scientific topics of special relevance to the scientific community specialized in Microbiology, orare opinion works on scientific policies. This section is the sole domain of the Editoral Board, who will determine editorial policy andauthorship, as well as the general guidelines.

Supplements. They will consist of detailed reviews of a specific subject conducted by one or several scientific organizations oruniversities, as well as abstracts of contributions presented at scientific meetings or universities organized by the Asociación Argentinade Microbiología or any of its divisions or branches (oral communications, boards, lectures, round tables,etc.), and chaired by guesteditors. Topics to be considered in the supplements and general outlines should be approved by the Editorial Board.

Revision of manuscripts under the Supplements section will be in charge of reviewers appointed by the Editorial Board in thecase of extensive reviewing, and of guest editors in the case of abstracts of meetings. Supplements will be wholly financed by thebody organizing the scientific meeting, which will bear in mind that supplements should be distributed among participants to themeetings and all members of the Asociación Argentina de Microbiología either by subscription or on-line. As regards style and for-mat, supplements shall strictly conform to the standards of Revista Argentina de Microbiología in all respects (cover, paper quality,printing, tables and figures, illustrations, etc.), as described in the “Instructions to Authors” section. Supplements correspondingto abstracts of meetings shall include the following information in this order: names of members of the Editorial Board of RevistaArgentina de Microbiología, data about the event (complete title, venue and date), content list of meetings (in Spanish and English),acknowledgements, names of organizing officers and message delivered by the Chair/s. Abstracts consecutively numbered in Arabicnumerals as from 1 (one) should subsequently follow. An alphabetical index of authors and the English and Spanish versions of theinstructions to authors of Revista Argentina de Microbiología should be printed next. The meeting schedule will only be included in theSupplement as a separate leaflet in the form of a triptych.

PREPARATION OF MANUSCRIPTSManuscripts should be written in A4 paper format with 3 cm margins on each side, using Times New Roman font, regular, 12,

and double-spaced. Bold and italics printing types should be used when necessary. Counting from the abstract section of themanuscript onwards, all pages should be consecutively numbered in the lower right margin, as well as the manuscript lines. Thisshall also apply to text, tables, figures, legends and references. Pages including tables, figures and legends shall be included afterthe References section.

Front or title page. The first page shall include the manuscript title using capitals only for the first letter and lowercase for therest, the author’s names (complete first name, initials of other names and surname of all authors); place of work (institution nameand mailing address), and a short title of the work with a maximum of 50 characters as running head. If authors have differentworking places, the institutional affiliation of each autor shall be indicated by numerical superinscriptions added to their names (notbetween parenthesis) to identify each author with his/her affiliation. The name of the corresponding author shall be marked by anasterisk in superscript position next to his/her name. The corresponding author’s e-mail shall also be included. If one or severalauthors have changed his/her/their affiliation, the current affiliation where work was performed should be indicated and thecurrent place of work in a footer.

Abstracts. They will only be included in original articles, brief reports and special articles and shall have a maximum of 250words for original and special articles, and 150 words for brief reports. The first abstract will be written in the language used in thework and the second in the other language. It shall be headed by the complete title of the work. Abstracts shall be followed by a list ofthree to six key words in the corresponding language. Abbreviations and bibliographic citations should be avoided. A clearunderstanding of abstracts should be ensured since they may be separately published by bibliographic services.

Introduction. It should provide sufficient and relevant information on the topic to be analyzed to allow the understanding ofnon-specialized readers. It should also include the hypothesis or scientific background that guided the experimental layout of thework as well as its clearly defined objectives. References mentioned in this section should be the most relevant ones with respectto the topic and must be carefully chosen.

Materials and Methods. This section should include an accurate and detailed description of the methods, equipment, reagentsand procedures used, so that the experiments could be replicated. Frequently used or routine procedures and techniques may bementioned by specific reference (eg., MIC determination by the CLSI methods, 2010). New methods or those especially developedfor the study should be described in detail, as well as infrequent drug sources or biological materials (bacterial, viral, fungal strainsand plasmids, etc.). Trademarks and origin of reagents, culture means and equipment should be indicated in the text the first timethey are mentioned, identifying the commercial brand name, state and country of origin.

Results. It should include the experimental layout and its scientific background as well as the results obtained presented in aconcise way preferably as text, or as table/s or figure/s). Unnecessary use of tables and figures to mention data should be avoidedwhen they could be included in the text. Do not repeat the same information in the text and in the tables or figures. Limit the numberof photographs to the minimum necessary to support experimental results. Number the tables and figures in the order they arementioned in the text. Avoid repetitions and include only most relevant data. In-depth interpretation will be included in the Discus-sion section.

Discussion. Emphasis should be placed on important cutting-edge findings; experimental data should be examined in the lightof previously published works. Conclusions should be presented avoiding unnecessary repetition of data and concepts alreadyincluded in preceding sections. Results and Discussion can be presented as a joint section.

Acknowledgements. This section shall be typed in smaller printing characters than those used in the manuscript (Times NewRoman, 11). Financing sources and names of individuals and/or institutions contributing with reagents, biological material or resultdiscussions should be briefly mentioned.

References. It is convenient that 70 % whenever possible of bibliographic citations in all manuscripts correspond to the last10 years and the remaining 30 % be distributed in key works from previous years. Names of authors cited shall be listed in


alphabetical order and numbered in sequence with Arabic numerals on a separate page. Citations in the text should appear innumbers placed between parenthesis, to coincide with the number they have in the References section. Reference to personalcomments and un-published works should be presented as personal communication, written between parenthesis.

References should include the name of all the authors and conform to the following models:a. Periodical publicationsHéritier C, Poirel L, Lambert T, Nordmann P. Contribution of acquired carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem

resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 3198-202.Names of journal titles shall be abbreviated according to Index Medicus, a list of which can be obtained at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

sites/entrez?db=journals.b. Chapters of books/modulesMartins Teixeira L, Siqueira Carvalho M da G, Facklam RR. Enterococcus. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML,

Pfaller MA, editors. Manual of Clinical Microbiology, 9th edition. Washington DC, ASM Press, 2007, p. 430-42.c. Presentations in scientific meetings or other eventsAguilar M, Punschke K, Touati D, Pianzzola MJ. Estudios fisiológicos y genéticos en la bacteria sulfato reductora Desulfoarculus

baarsii. Terceras Jornadas Rioplatenses de Microbiología, 1997, Abstract J2, p. 102, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.d. Presentations in congresses or other scientific meetings in a supplement published by a periodic academic journalFellner MD, Correa RM, Durand K, Teyssié AR, Picconi MA. Análisis del ADN circulante de virus Epstein-Barr (EBV) en pacien-

tes inmunosuprimidos con y sin linfomas asociados. VIII Congreso Argentino de Virología, Abstract 10416. Rev Argent Microbiol2005; 37 Supl 1: 95.

e. Institutional publicationsClinical and Laboratory Standards Institute. Disk diffusion. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 15th

Informational Supplement, 2005; M100-S15. Wayne, PA, USA.f. ThesesBrizzio A. Aplicación de una PCR múltiple para la identificación de cepas de Staphylococcus aureus toxigénicas. Tesis de Maestría

en Microbiología Molecular 2009. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” y Universidad Nacional de San Martín.g. On-line references1. For on-line BooksSullivan CJ, editor. 1999-2001. Fungi: an evolving electronic resource for the microbiological community. ASM Press. (On-line)

http://link.asmusa.de/link/service/books/91090. Accessed 7 September 2001.2. For on line versions of printed journalsvan der Zeiss L, Danziger VB. History of clinical microbiology. Clin Microbiol 1999; 100: 123–234. (On-line)3. For journals only available on-lineZellnitz F, Foley PM. October 1998, posting {or revision} date. History of virology. Am Virol J 1998; 1: 30-50. (On-line) http://

www.avj.html.4. For manuscripts published on line in advance of their publicationZheng Z, Zou J. 5 September 2001. The initial step of the glycerolipid pathway: identification of glycerol-3-phosphate/dihydroxy-

acetone phosphate dual substrate acyltransferases in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 10. 1074/jbc.M104749200.g. Items, references to works or congress abstracts not yet published, about to be published or under revision, personal

communications, existing or pending patents, databases and web pages shall be mentioned in the text between parenthesis asshown:

… similar results (Gómez H, unpublished results)… new detection protocol used (González JL, Submitted for publication).… drug concentrations (López GO, 34th Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother, abstr. 114, 1994).… new type of cellulolytic species (Márquez W, personal communication)... previously commented by different sources (http://fcen.uba.edu.ar)Tables. They should be included on separate pages, consecutively numbered with Arabic numerals, preceded by an explanatory

title, with captions and/or the corresponding explanations below. Reference marks for explanations in the form of footnotes shall usesuperscripted Arabic numbers betweeen parenthesis. Lines shall only be used in the external borders of the first and last row, andto separate the headings of the columns from the data. Rows and column borders shall not be inserted.

Figures. They will be included on separate pages with the figure number in the upper left margin and in the order they arementioned in the text. Drawings should be clear enough to ensure suitable reproduction. Numbers, letters and signs shall have theadequate size to be readable once reduced as needed. References to symbols used in the figures shall be included within the samefigure and not in the text legend. Photographs may be in colour or black and white, in JPEG or TIFF formats. Minimum photo resolu-tion requirements are 300 dpi for color and grayscale images and photo prints, 600 dpi for combined art images (letters and images)and 1200 dpi for images composed of lines (graphs and drawings). Note: It is very important to use the adequate file resolution. Allindividual images imported in a graphic file should be in the correct resolution before uploading them. Bear in mind that the higherthe resolution, the larger the file and the longer it will take to send it electronically. Captions to the illustrations should be includedon a separate page, in consecutive order using Arabic numerals.

Aminoacid and nucleic acid sequences. New sequences informed by publication in this journal should be deposited in adatabase and their accession number included in the manuscript, no later than revision stage. The mentioned accession numbersshould be included in a separate paragraph at the end of the Materials and Methods section in the case of original works or at theend of the text in the case of brief reports. The information about currently available databases is the following:

DDBJ: Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan, National Institute of Genetics; e-mail. [email protected];URL, http://www.ddbj.nig.ac.jp

EMBL: EMBL Nucleotide Sequence Submissions, European Bioinformatics Institute; e-mail. [email protected]; URL,http://www.ebi.ac.uk

GenBank: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine; e-mail. [email protected]; URL,http:// www.ncbi.nlm.nih.gov

Nucleic acid sequences of up to 50 nucleotides included in the work developed in the manuscript may be presented in any stylewhatsoever. Significantly long sequences should be presented as Figures so as to reduce space, printing those having 80 to 120nucleotides per line in a readable font according to publishing guidelines (16 cm, width of two RAM columns). If possible, the sequence


AAM members $ 120Argentina non members $ 240Latin America USD 100Other countries USD 200

should be divided into blocks of 10 to 20 nucleotides separated by a space or by indicative numbers placed above the sequence.Lines should be numbered, indicating the corresponding number to the left of the first pair on each line. Any necessary commentsshall be bold-typed, underlined or written between parentheses. If it is necessary to include the amino acid sequence encoded bythe nucleotide sequence, it shall be indicated by the use of one-letter symbols accepted as amino acid indicators placed under thefirst nucleotide of the encoding codon.

Abbreviatons. They must be made explicit when mentioned for the first in the text. Units of measurements will be expressedaccording to the standards of Système International d´Unités.

SUBMITTANCE OF MANUSCRIPTSManuscripts may be submitted by e-mail ([email protected]) or ordinary mail to Deán Funes 472, C1214AAD, Ciudad Autónoma

de Buenos Aires, Argentina, including a CD-ROM electronic version, with a label or inscription indicating: title of work, the programand program version used for the text, figures, photographs and the title of all the files it contains.

The complete text of the article should be included in only one file. If there are images, they should be sent on separate files.Besides, it is advisable that capital letters, spaces between words, italics and bold letters are typed in the same way they appear inthe printed version. There should be no spaces before and after subheadings, the text should be justified and tab-setting should beused instead of the spacing bar for columns in tables.

Authors should revise the check list shown after these instructions and see that all the requirements therein have been fulfilled.Before submitting the manuscripts, authors should also examine one of the latest RAM issues in order to verify if all guidelines havebeen followed as regards format and style and to make all necessary modifications if neccessary.

Authors should delete from file properties all kind of information that could identify their authorship.

EDITORIAL PROCESSOnce the manuscript has completed the editorial process and is ready for publication, a file in pdf format with the galley proof shall

be sent by e-mail to the corresponding editor for making the corresponding typing corrections. He/she should not change conceptsnor modify paragraphs which could alter the print format. The document should be printed after making the corrections on the textand sent by fax or as a scanned file by e-mail. Corrections may also be sent by e-mail, clearly specifying the page, paragraph andline to be corrected and should be returned within seven running days of reception, otherwise it shall be assumed that its publicationhas been declined.

At that moment, the amount to be paid for the publication of the article will be sent to the author.Revista Argentina de Microbiología follows the policies for clinical trial registration of the World Health Organization (WHO) and

of the International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), acknowledging the importance of those initiatives for the inter-national dissemination of information on clinical research in open access format. Therefore, only articles referring to trialspreviously registered with an identifying number in one of the Clinical Trial Registers that meet WHO and ICMJE requirements will beaccepted for publication. Their addresses are available in the ICMJE site. The identifying registration number shall be publishedat the end of the abstract.

Publishing charges. Each published page will cost $ 75 or $ 200 (pesos) when the page includes color photographs (AAMmembers in Argentina,), $ 200 o $ 600 (pesos) (AAM non-members in Argentina) and U$S 70 o U$S 180 (in other countries).

The Secretary: Deán Funes 472, (C1214AAD) Ciudad Autónoma de Buenos Aires - Argentina; Tel.: (54-11) 4932-8858 and(54-11) 4932-8948; e-mail. [email protected]; http://www.aam.org.ar

Payment: By check or money order, to the order of Asociación Argentina de Microbiología. Price includes mail postage.

ANNUAL SUBSCRIPTION (4 issues)


Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 144

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Impreso en el mes de marzo de 2012

Title Yes No Does notapply

Includes title in SpanishIncludes title in EnglishIncludes abbreviated title

Authors

Identifies corresponding authorIncludes corresponding author´s address, telephone number and e-mail adressIncludes all the authorsIncludes author´s affiliationsIncludes cover letter for manuscript submission signed by corresponding author

Abstracts

Each abstract does not exceed the maximun number of words allowedIncludes an abstract in SpanishIncludes key words in SpanishIncludes an abstract in EnglishIncludes key words in English

Text

Does not exceed the maximum number of words allowedDoes not exceed the maximun number of tables and/or figures allowedHas the corresponding sectionsMakes correct use of abbreviationsMentions trademarks and origin of reagents, culture media and equipmenMentions accession number of new amino acids and nucleic acids sequences

Tables and Figures

Each of them is included on a separate page

Titles are clear and conciseLegends are includedCitations in the text correspond with the numbers of each table and figureAbbreviations are explained as a table footnoteFigures and photographs are sent in attached files

References

Strictly adheres to the format required by the journalItems in this section are listed in alphabetical orderCitations in the text correspond with numbers appearing in this section

Acknowledgements

Funding sources are mentioned