8/7/2019 Simple Method for the Preparation of Single Cell

1/4

G u t , 1 9 7 7 , 1 8 , 3 8 2 - 3 8 5

S i m p l e m e t h o d f o r t h e p r e p a r a t i o n o f s i n g l e c e l ls u s p e n s i o n s f r o m n o r m a l a n d t u m o r o u s r a tc o l o n i c mucosaV . PERRET, R . LEV, AND W. PIGMANFrom t h e New Y o r k M e d i c a l C o l l e g e , D e p a r t m e n t s o f B i o c h e m i s t r y a n d P a t h o l o g y , V a l h a l l a ,New Y o r k 1 0 5 9 5 , USA

SUMMARY V i a b l e s i n g l e c e l l s u s p e n s i o n s f r o m r a t c o l o n i c e p i t h e l i u m were o b t a i n e d b y u s i n gp h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e c o n t a i n i n g 0 - 2 M m a n n i t o l . T h e m e t h o d , w h i c h r e q u i r e s no p r i o r enzymet r e a t m e n t , p r o v i d e s u n d a m a g e d c e l l s i n h i g h y i e l d w i t h i n on e h o u r . T h e p r o c e d u r e was a l s o a p p l i e dt o n e o p l a s t i c r a t c o l o n i c t i s s u e , w h i c h was i n d u c e d b y r e p e a t e d i n t r a r e c t a l i n f u s i o n o f N - m e t h y l - N -n i t r o s o u r e a . C o m p a r i s o n b e t w e e n n o r m a l a n d n e o p l a s t i c c e l l s h a s s h o w n t h a t t h e l a t t e r h a v e a h i g h e rn u c l e u s : c y t o p l a s m r a t i o a n d a h i g h e r m e t a b o l i c a c t i v i t y .

I n t h e c o u r s e o f t h e i s o l a t i o n o f i n t e s t i n a l e p i t h e l i u m ,i t i s a d v a n t a g e o u s t o o b t a i n v i a b l e s i n g l e c e l l s i n o r d e rt o c a r r y o u t m e t a b o l i c a n d s t r u c t u r a l s t u d i e s p e r t a i n -i n g t o m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s . A l s o , s u c h v i a b l es i n g l e c e l l p r e p a r a t i o n s a r e a p r e r e q u i s i t e f o rc o m p a r i n g n o r m a l c e l l s w i t h n e o p l a s t i c o n e s .U s u a l l y s i n g l e c e l l s u s p e n s i o n s a r e p r e p a r e d b ye x p o s i n g b i o l o g i c a l t i s s u e b r i e f l y t o p r o t e o l y t i ce n z y m e s , s u c h a s t r y p s i n ( K r u s e a n d P a t t e r s o n , 1 9 7 3 ) ,p r o n a s e ( G w a t k i n a n d T h o m s o n , 1 9 6 4 ) , c o l l a g e n a s e s( t y p e s I - I V ) ( H o w a r d e t a l . , 1 9 7 3 ) , h y a l u r o n i d a s e( P e r r i s , 1 9 6 6 ) , ( C u l l i n g e t a l . , 1 9 7 3 ) , DNAse ( M a d d e na n d B u r k , 1 9 6 1 ) , o r a c o m b i n a t i o n t h e r e o f . O t h e ra g e n t s , s u c h a s EDTA ( C u l l i n g e t a l . , 1 9 7 3 ) , d i t h i o -t h r e i t o l ( L a M o n t e t a l . , 1 9 7 4 ) , c i t r a t e ( S t e r n , 1 9 6 6 )h a v e a l s o b e e n u s e d f o r t h e d i s a g g r e g a t i o n o f c e l l s .I n o u r s t u d y c o n c e r n i n g t h e c h a r a c t e r i s a t i o n o f t h ee p i t h e l i a l l i n i n g c e l l s o f t h e l a r g e i n t e s t i n e ( c a e c u ma n d c o l o n ) , we f i r s t a p p l i e d t r e a t m e n t w i t h a n e n z y m eo r a c o m b i n a t i o n o f e n z y m e s u n d e r a v a r i e t y o fc o n d i t i o n s i n v o l v i n g a l a r g e v a r i e t y o f s i m p l e a n dc o m p l e x c u l t u r e m e d i a . I t w a s f o u n d t h a t e v e n m i l dt r e a t m e n t o f c e l l s w i t h e n z y m e s , i n d i v i d u a l l y o r i nc o m b i n a t i o n , r e s u l t e d i n d r a s t i c m o r p h o l o g i c a lc h a n g e s o f t h e c e l l p o p u l a t i o n , a s r e v e a l e d b y m i c r o -s c o p i c e x a m i n a t i o n . On t h e o t h e r h a n d , e x p o su r e t oc h e l a t i n g a g e n t s , s u c h a s EDTA, d i t h i o t h r e i t o l , a n dc i t r a t e , a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n w i t h e n z y m e s s u c ha s h y a l u r o n i d a s e ( C u l l i n g e t a l . , 1 9 7 3 ) , d i d n o t y i e l dR e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 2 2 O c t o b e r 1 9 7 6

s i n g l e c e l l s u s p e n s i o n s w h i c h w e r e v i a b l e l o n g e n o u g hf o r f u r t h e r s t u d i e s . E q u a l l y u n s u c c e s s f u l w e r em e t h o d s o f m e c h a n i c a l d i s a g g r e g a t i o n ( s h a k i n g i n av a r i e t y o f m e d i a c o n t a i n i n g g l u c o s e a t 3 7 C , g e n t l es o n i c a t i o n , r u b b i n g o f t i s s u e t h r o u g h a f i n e s c r e e n ) ;t h e y i e l d o f i n t a c t c e l l s i n t h e s e i n s t a n c e s w a s l o w a n dt h e a m o u n t o f d e b r i s c o n s i d e r a b l e . H o w e v e r , wef o u n d t h a t m a n n i t o l ( K i m m i c h , 1 9 7 0 ; E v a n s e t a l . ,1 9 7 1 ) , u s e d a s o u t l i n e d b e l o w , i s a n i d e a l a g e n t f o rp r e p a r i n g v i a b l e s i n g l e c e l l s u s p e n s i o n s f r o mc o l o n i c s c r a p i n g s . T h i s r e p o r t d e s c r i b e s t h e p r o c e d u r eu s e d f o r o b t a i n i n g s u c h s u s p e n s i o n s f r o m t h es c r a p i n g o f n o r m a l l a r g e i n t e s t i n a l m u c o s a a n d f r o mc o l o n i c t u m o u r o f r a t s .M e t h o d sYoung F i s h e r r a t s , w e i g h i n g a b o u t 2 0 0 - 3 0 0 g , a r ed e c a p i t a t e d a n d b l e d a f t e r b e i n g s t u n n e d b y a b l o wo n t h e h e a d . T h e a b d o m i n a l r e g i o n o f e a c h r a t i ss h a v e d , w a s h e d w i t h 7 0 % e t h a n o l , a n d c u t o p e n . T h ec o l o n i s r e s e c t e d a n d c a r e f u l l y f r e e d f r o m a l l a d j a c e n tt i s s u e , s l i t l o n g i t u d i n a l l y w i t h s c i s s o r s , a n d t h e f a e c e sp u s h e d o f f g e n t l y w i t h f o r c e p s . I t i s t h e n w a s h e d t h r e et i m e s w i t h i c e c o l d s a l i n e c o n t a i n i n g a n t i b i o t i c s ,c o m p l e t e l y u n f o l d e d , s l i g h t l y s t r e t c h e d o u t on a c o l dg l a s s p l a t e a n d t h e i n t e s t i n a l m u c o s a s c r a p e d o f f v e r yg e n t l y w i t h a b l u n t - e d g e d g l a s s s l i d e . T h e s c r a p i n g sa r e m i n c e d b y 6 0 s t r o k e s o f s h a r p s c i s s o r s a n dw e i g h e d . T h e w e t w e i g h t o f t h e s c r a p i n g s f r o m o n ea n i m a l i s a b o u t 5 0 0 m g . T h e m i n c e d m u c o s a l s c r a p i n g

3 8 2

8/7/2019 Simple Method for the Preparation of Single Cell

2/4

S i m p l e m e t h o d f o r t h e p r e p a r a t i o n o f s i n g l e c e l l s u s p e n s i o n s f r o m n o r m a l a n d t u m o r o u s r a t c o l o n i c m u c o s a 3 8 3i s d r o p p e d i n t o a 5 0 m l s i l i c o n i s e d c e n t r i f u g e t u b ec o n t a i n i n g 3 0 m l i c e c o l d PBS-M ( N a C I , 8 5 - 5 mM( 5 0 g ) ; K C l , 2 - 6 mM ( 0 - 2 g ) ; N a 2 H P O 4 , 8 - 1 mM( 1 ' 1 5 g ) ; K H 2 P O 4 , 15 mM ( 0 - 2 g ) ; m a n n i t o l , 2 0 0mM ( 3 6 - 4 g ) i n a t o t a l o f o n e l i t r e d i s t i l l e d w a t e r ; 2 0 0 Up e n i c i l l i n , 2 0 0 , u g s t r e p t o m y c i n , a n d 5 0 , u g f u n g i z o n ea r e a d d e d f o r e a c h m i l l i l i t r e o f m e d i u m ; t h e p H o f t h i ss o l u t i o n i s 7 4 ) a n d a g i t a t e d b y m i l d b ub b l i n g o fo x y g e n t h r o u g h t h e s u s p e n s i o n . A t t h i s p o i n t , t h ec e l l s a r e i n s m a l l c l u s t e r s o f t i s s u e . P i p e t t i n g u p a n dd o w n f a c i l i t a t e s d i s a g g r e g a t i o n .W i t h i n 3 0 m i n ut e s m o s t o f t h e c e l l s a r e w e l l d i s -p e r s e d . T h e s u s p e n s i o n i s now c e n t r i f u g e d a t 7 5 x gf o r t w o m i n u t e s . T h e s u p e r n a t a n t i s r e m o v e d w i t h aP a s t e u r p i p e t t e ; 2 0 m l f r e s h PBS-M a r e a d d e d t o t h el o o s e l y p a c k e d c e l l s e d i m e n t a n d t h e c e l l s a r e r e s u s -p e n d e d b y g e n t l e o x y g e n b u b b l i n g t h r o u g h t h em e d i u m f o r f i v e m i n u t e s . T h e c e n t r i f u g a t i o n a n d t h ew a s h i n g w i t h PBS-M i s r e p e a t e d o n c e m o r e a n dt h e c e l l s a r e s u s p e n d e d i n P B S - M .E v e r y o p e r a t i o n i s p e r f o r m e d a t 4 C a n d a l l o f t h eg l a s s w a r e i s s i l i c o n i s e d . D u r i n g t h e p r o c e d u r e ,s a m p l e s a r e e x a m i n e d m i c r o s c o p i c a l l y ; f i v e d r o p s o fc e l l s u s p e n s i o n a r e m i x e d w i t h o n e d r o p o f a 0 4%s o l u t i o n o f t r y p a n b l u e i n PBS-M ( K r u s e a n dP a t t e r s o n , 1 9 7 3 ) .F o r m e a s u r e m e n t s o f o x y g e n u p t a k e , 2 m ls a m p l e s a r e w i t h d r a w n f r o m t h e s u s p e n s i o n a ti n t e r v a l s o f 3 0 - 6 0 m i n u t e s , a n d t h e r a t e o f o x y g e nu p t a k e f r o m t h e e x t r a c e l l u l a r f l u i d i s m e a s u r e d a t3 7 C w i t h a C l a r k o x y g e n e l e c t r o d e ( Y e l l o w S p r i n g si n s t r u m e n t C o . , Y e l l o w S p r i n g s , O h i o ) a t t a c h e d t o aB e c k m a n g a s a n a l y s e r a n d a r e c o r d e r . T h e i n s t r u m e n ti s c a l i b r a t e d b y m e a s u r i n g t h e o x i d a t i o n o f a 0 - 2I . m o l a r g l u c o s e s o l u t i o n b y g l u c o s e o x i d a s e ; r e s u l t sa r e e x p r e s s e d a s m i c r o l i t r e s o f o x y g e n t a k e n u p p e rm i l l i g r a m c e l l p r o t e i n F e r h o u r ( Q o 2 ) .F o r s t u d y i n g t h e i n c o r p o r a t i o n o f l a b e l l e dm e t a b o l i t e s , c e l l s f r o m o n e c o l o n i c m u c o s a w e r es u s p e n d e d i n 2 0 m l PBS-M c o n t a i n i n g a n t i b i o t i c sa n d L - [ 4 , 5 - 3 H ] - l e u c i n e ( 1 0 , u C i / m l ; 5 m C i / m M ) a n dD - [ U - 1 4 C ] - g l u c o s e ( 1 , t C i / m l ; 4 - 8 6 m C i / m M ) . T h ec e l l s w e r e s h a k e n a t 2 2 C . A t v a r i o u s t i m e i n t e r v a l s ,2 - m l a l i q u o t s w e r e p r e c i p i t a t e d w i t h a n e q u a l v o l u m eo f a m i x t u r e o f 2 0 % t r i c h l o r o a c e t i c a c i d a n d 2%p h o s p h o t u n g s t i c a c i d a n d c e n t r i f u g e d . T h e p e l l e t w a sw a s h e d t w i c e w i t h 5 % t r i c h l o r o a c e t i c a c i d , d i s s o l v e di n 0 5 N NaOH a n d c o u n t e d i n B i o f l u o r ( N e wE n g l a n d N u c l e a r ) , u s i n g a N u c l e a r C h i c a g o S c i n t i l -l a t i o n c o u n t e r .C e l l s u s p e n s i o n s a n d p a r a f f i n - e m b e d d e d t i s s u e so b t a i n e d f r o m r e p r e s e n t a t i v e a r e a s o f n o r m a l mucosaa n d o f c o l o n i c t u m o u r s w e r e s t a i n e d w i t h h a e m a -t o x y l i n a n d e o s i n , a n d p e r i o d i c a c i d - S c h i f f f o rr o u t i n e m o r p h o l o g y . Some s p e c i m e n s w e r e a l s os t a i n e d w i t h 1 % a l c i a n b l u e ( p H 2 5 a n d 1 - 0 ) , h i g h

5

i r o n d i a m i n e , a n d 0 - 1 % t o l u i d i n e b l u e ( p H 3 5 ) t od i f f e r e n t i a t e t h e v a r i o u s a c i d i c m u c i n s .R e s u l t sNORMAL CELLST h e t i m e i n v o l v e d f r o m k i l l i n g t h e a n i m a l t os u s p e n d i n g t h e m u c o s a l s c r a p i n g i n t h e PBS-M i sa b o u t 1 6 m i n u t e s . D i s p e r s i o n o f c e l l s b y m e a n s o fb u b b l i n g o x y g e n t h r o u g h a P a s t e u r p i p e t t e i n t o t h em e d i u m t a k e s a b o u t 3 0 m i n u t e s . T h e a v e r a g e c e l ld e n s i t y , a s r e a d i n a h a e m o c y t o m e t e r , i s a b o u t4 x 1 0 6 m l . A t y p i c a l c e l l s u s p e n s i o n i s s h o w n i n t h eF i g u r e .U n d e r t h e m i c r o s c o p e , t h e c e l l s u s p e n s i o n s s h o w ah o m o g e n e o u s p o p u l a t i o n o f c o l u m n a r - s h a p e d c e l l sw i t h s o m e f r e e f l o a t i n g n u c l e i . T h e c e l l s a r e g e n e r a l l yw e l l d i s p e r s e d , a l t h o u g h , i n a f e w i n s t a n c e s , a g g r e -g a t e s o f e p i t h e l i a l c e l l s w e r e o b s e r v e d . T h e s ea g g r e g a t e d c e l l s , h o w e v e r , a r e e a s i l y d i s p e r s e d w h e nr e a g i t a t e d i n t h e p r e s e n c e o f o x y g e n . S m a l l s e c t i o n so f l a m i n a p r o p r i a a r e a l s o o c c a s i o n a l l y s e e n . M i c r o -s c o p i c a l l y , t h e c e l l s l o o k m o r p h o l o g i c a l l y i n t a c t ;

F i g u r e S i n g l e c e l l s u s p e n s i o n o f r a t c o l o n i c m u c o s a i nPBS-M, s t a i n e d w i t h t r y p a n b l u e . P r e p a r a t i o n c o n s i s t so f c o l u m n n a r c e l l s w i t h b a s a l l y s i t u a t e d n u c l e i . x 1 2 0 0 .

8/7/2019 Simple Method for the Preparation of Single Cell

3/4

A . H e r p , V . P e r r e t , R . L e v , a n d W . P i g m a nt h e i r n u c l e i a r e s l i g h t l y s t a i n e d b y t r y p a n b l u e . Whenc e l l s a r e k e p t f o r s e v e r a l h o u r s a t r o o m t e m p e r a t u r e ,t r y p a n b l u e s t a i n i n g b e c o m e s c o n s i d e r a b l y m o r ei n t e n s e , a n d o c c u r s t h r o u g h o u t t h e c e l l . When l e f to v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e , t h e c e l l s a r e s t i l l w e l lp r e s e r v e d . I n c u b a t e d i n t h e c o l d , m o s t o f t h e c e l l s( 9 0 % Y . ) a r e s t i l l i n t a c t a f t e r 7 2 h o u r s a n d s h o w o n l yf a i n t t r y p a n b l u e s t a i n i n g o f t h e i r n u c l e i .I n o r d e r t o d e t e r m i n e c o n t a m i n a t i o n b y c o n n e c t i v et i s s u e , c e l l s u s p e n s i o n s ( - 1 g w e t w e i g h t ) w e r ea n a l y s e d f o r h y d r o x y p r o l i n e ( S t e g e m a n n , 1 9 5 8 ) o na c i d h y d r o l y s e d s a m p l e s a n d f o r u r o n i c a c i d( B i t t e r a n d M u i r , 1 9 6 2 ) a f t e r p a p a i n a n d t r y p s i nd i g e s t i o n o f s c r a p i n g s . T h e s e a n a l y t i c a l m e t h o d s ,w h i c h d e t e c t a c o n t a m i n a t i o n g r e a t e r t h a n 4% o f t h em a c r o m o l e c u l a r c o n s t i t u e n t s o f t h e c o r r e s p o n d i n gc o n n e c t i v e t i s s u e , w e r e n e g a t i v e f o r h y d r o x y p r o l i n ea n d s h o w e d o n l y t r a c e s o f u r o n i c a c i d p o s i t i v em a t e r i a l .I n o r d e r t o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t s o f t i m e o n t h em o r p h o l o g y o f t h e PBS-M s u s p e n d e d c e l l s , 5 m la l i q u o t s o f a c o l o n i c c e l l p r e p a r a t i o n w e r e p i p e t t e di n t o b u f f e r e d f o r m a l i n a t 3 0 m i n u t e s , 6 0 m i n u t e s , f o u rh o u r s , a n d 2 4 h o u r s ; p a r a f f i n - e m b e d d e d s e c t i o n sw e r e m a d e w h i c h w e r e t h e n s t a i n e d . E x a m i n a t i o n o ft h e s l i d e s s h o w e d t h a t t h e c e l l s m a i n t a i n e d t h e i ri n t e g r i t y t o t h e e x t e n t o f 80% e v e n a f t e r 2 4 h o u r sw h e n k e p t i n t h e c o l d . S i n g l e c e l l s u s p e n s i o n s w e r ea l s o i n c u b a t e d a t 3 7 C i n E a g l e ' s MEM ( G i b c o ,c a t a l o g u e N o . 1 0 9 G ) c o n t a i n i n g 10% f e t a l c a l fs e r u m a n d p e n i c i l l i n ( 1 0 0 U / m l ) , s t r e p t o m y c i n ( 1 0 0, u g / m l ) , a n d m y c o s t a t i n ( 2 5 U / m l ) , i n d e p r e s s i o ns l i d e s s e a l e d w i t h p a r a f f i n a n d p e r i o d i c a l l y e x a m i n e df o r c e l l i n t e g r i t y . T h e c e l l s s h o w e d n o m o r p h o l o g i c a lc h a n g e s f o r a t l e a s t 1 0 d a y s w i t h o u t c h a n g i n g t h em e d i u m , a l t h o u g h t h e y d i d n o t d e v e l o p i n t o c o n -f l u e n c y . When c u l t u r e d i n i n c u b a t i o n f l a s k s , a t 3 7 C ,c e l l s b e c a m e a t t a c h e d t o t h e w a l l w i t h i n 2 4 h o u r s ,b u t n o & g r o w t h o c c u r r e d .C e l l s u s p e n s i o n s w e r e e x a m i n e d f o r b a c t e r i a lc o n t a m i n a t i o n , u s i n g n u t r i e n t a g a r a n d b l o o d a g a rp l a t e s . B o t h t e s t s w e r e n e g a t i v e i n t h e p r e s e n c e o fa n t i b i o t i c s , b u t i f p l a t i n g w e r e p e r f o r m e d o n c e l ls u s p e n s i o n s w h i c h d i d n o t c o n t a i n a n t i b i o t i c s ,b a c t e r i a l g r o w t h w a s i n t e n s e ( E . c o l i , P r o t e u s ,P e s u d o m o n a s , S t a p h y l o c o c c u s a l b u s , e t c . ) .C e l l s s u s p e n d e d i n PBS-M w e r e l a y e r e d u p o n a d i s -c o n t i n u o u s F i c o l l g r a d i e n t o f 1 % t o 6% i n PBS-Ms o l u t i o n a n d c e n t r i f u g e d f o r 1 0 m i n u t e s a t 9 5 x g .W i t h a 1 , 3 , 5 % F i c o l l g r a d i e n t i n P B S - M , a l l o f t h ec e l l s s e t t l e d i n t h e 3 % l a y e r . When t h e d i s c o n t i n u o u sg r a d i e n t c o n s i s t e d o f 2 , 4 , 6% F i c o l l i n PBS-Ms o l u t i o n , t h e c e l l s w e r e l a y e r e d a t t h e i n t e r p h a s eb e t w e e n t h e 2 a n d 4% F i c o l l c o n c e n t r a t i o n . M i c r o -s c o p i c a l l y , t h e s e c e l l s d i d n o t s h o w a n y d i f f e r e n c e i na p p e a r a n c e , a s c o m p a r e d w i t h t h e o r i g i n a l c e l l

s u s p e n s i o n . T h e a p p a r e n t d e n s i t y o f s i n g l y s u s p e n d e dc e l l s , a s d e t e r m i n e d a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e b y t h eF i c o l l g r a d i e n t , w a s 1 0 2 5 g / c m 3 , w h i l e c o p p e rs u l p h a t e a n d s u c r o s e g r a d i e n t s b o t h g a v e a v a l u e o f1 - 0 2 0 g / c m 3 .O x y g e n u p t a k e , a t 3 7 C , o f c e l l s s u s p e n d e d i nPBS-M w a s n e g l i g i b l e ; i n a PBS-M s o l u t i o n c o n -t a i n i n g g l u c o s e ( 1 1 mM ( 2 m g / m l ) ) , t h e Q 0 2 w a s 1 1 - 2 5, 1 0 2 x h - 1 x m g - ' c e l l p r o t e i n .T h e r a t e o f i n c o r p o r a t i o n o f l a b e l l e d l e u c i n e a n dl a b e l l e d g l u c o s e w a s f o u n d t o b e l i n e a r w i t h t i m e f o ra t l e a s t 9 0 m i n u t e s . F o r t h e a m i n o a c i d , t h e s l o p e w a s1 3 0 + 1 8 1 a n d f o r 1 4 C - g l u c o s e , 1 3 5 2 1 1 cpm xm g - ' c e l l p r o t e i n x m i n - ' o f i n c u b a t i o n .

TUMOUR CELLST h e a b o v e m e t h o d w a s u s e d t o p r e p a r e s u s p e n s i o n sf r o m c o l o n i c t u m o u r c e l l s . F o r t u m o u r i n d u c t i o n ,4 0 - d a y - o l d f e m a l e F i s h e r r a t s ( C h a r l e s R i v e r , N o r t hW i l l m i n g t o n , M A ) , w e i g h i n g a b o u t 1 0 0 g , w i t h f r e ea c c e s s t o P u r i n a l a b o r a t o r y c h o w a n d t a p w a t e r , w e r ei n j e c t e d i n t e r - r e c t a l l y w i t h N - m e t h y l - N - n i t r o s o u r e a( i n 0 ' 5 m l o f s a l i n e , p H 6 ) , e s s e n t i a l l y a s d e s c r i b e d b yN a r i s a w a e t a l . ( 1 9 7 6 ) . T h e c o m p l e t e t r e a t m e n tc o n s i s t e d o f 4 4 d o s e s o f 2 - 5 mg c a r c i n o g e n e a c h . A tv a r i o u s t i m e s d u r i n g t h e e x p e r i m e n t a l p e r i o d ,a n i m a l s w e r e k i l l e d a n d t h e i r l a r g e i n t e s t i n e c a r e f u l l ye x a m i n e d f o r t u m o u r g r o w t h .Up t o 3 2 i n j e c t i o n s , n o g r o s s c h a n g e s w e r eo b s e r v e d . I n s o m e i n s t a n c e s , h o w e v e r , s e v e r a l f o c i o fi n s i t u c a r c i n o m a o r s m a l l e r a r e a s o f e p i t h e l i a l a t y p i aw e r e f o u n d o n h i s t o l o g i c a l e x a m i n a t i o n o f r a n d o ms e c t i o n s o f s u c h c o l o n s . T h e i n s i t u l e s i o n s c o n s i s t e do f c u p - s h a p e d a g g r e g a t e s o f m a l i g n a n t g l a n d s c o m -p o s e d o f b a s o p h i l i c c e l l s s h o w i n g l o s s o f n u c l e a rp o l a r i t y , e n l a r g e d h y p e r c h r o m a t i c n u c l e i , i n c r e a s e dn u m b e r s o f m i t o s e s , a n d r e d u c e d i n t r a c e l l u l a r m u c u s .A l l o f t h e 1 2 r a t s w h i c h h a d r e c e i v e d t h e c o m p l e t et r e a t m e n t o f 4 4 d o s e s h a d d e v e l o p e d l a r g e i n t e s t i n a lt u m o u r s .G r o s s e x a m i n a t i o n o f c o l o n s o b t a i n e d f r o m t h e s ea n i m a l s s h o w e d o b v i o u s t u m o u r s r a n g i n g f r o m 0 1 t o1 - 7 cm i n g r e a t e s t d i m e n s i o n . T h e y w e r e f o u n dp r e d o m i n a n t l y i n t h e d i s t a l h a l f o f t h e c o l o n , w e r ep o l y p o i d f o r t h e m o s t p a r t , a n d s h o w e d a v a r i a b l ed e g r e e o f l u m e n a l o b s t r u c t i o n a n d p e n e t r a t i o n o f t h em u s c l e w a l l o f t h e c o l o n . No m e t a s t a s e s w e r e f o u n di n t h e r e g i o n a l l y m p h n o d e s . M i c r o s c o p i c e x a m i n a -t i o n o f t h e c o l o n i c t u m o u r s i n d i c a t e d t h a t t h e s e w e r ea d e n o c a r c i n o m a s , s o m e o f w h i c h h a d a p a p i l l a r yp a t t e r n . I n m o s t c a s e s , m u c u s p r o d u c t i o n w a sr e d u c e d o r a b s e n t i n t h e s e t u m o u r s ; w h e r e p r e s e n t ,t h e m u c u s a p p e a r e d a s f o c a l c o l l e c t i o n s o f a t y p i c a ls m a l l i n t r a c y t o p l a s m i c m u c i n d r o p l e t s . More r a r e l y ,' V a l u e s a r e m e a n s s t a n d a r d d e v i a t i o n o f s i x e x p e r i m e n t a lr e s u l t s .

3 8 4

8/7/2019 Simple Method for the Preparation of Single Cell

4/4

S i m p l e m e t h o d f o r t h e p r e p a r a t i o n o f s i n g l e c e l l s u s p e n s i o n s f r o m n o r m a l a n d t u m o r o u s r a t c o l o n i c m u c o s a 3 8 5i n c r e a s e d a m o u n t s o f m u c u s w e r e f o u n d i n t h et u m o u r s i n t h e f o r m o f l a r g e c o l l e c t i o n s o f e x t r a -c e l l u l a r m u c u s ' l a k e s ' i n w h i c h s i g n e t r i n g s c o u l do c c a s i o n a l l y b e i d e n t i f i e d . O c c a s i o n a l l y , p a t c h e s o fb e n i g n - l o o k i n g c o l u m n a r c e l l s , r e s e m b l i n g a d e n o -m a t o u s e p i t h e l i u m f o u n d i n b e n i g n c o l o n i c p o l y p s i nh u m a n s , w e r e i n t e r m i n g l e d w i t h t h e f r a n k l y m a l i g -n a n t g l a n d s .D i s a g g r e g a t i o n o f c a n c e r o u s t i s s u e i n PBS-Mp r o v e d t o b e m o r e d i f f i c u l t t h a n n o r m a l c o l o n i ce p i t h e l i a l t i s s u e . N e v e r t h e l e s s , i f t h e m i n c e d t u m o u rt i s s u e w a s p a s s e d w i t h a g l a s s p e s t l e t hr ou g h a 4 0m e s h s t a i n l e s s s t e e l s c r e e n , w e l l d i s a g g r e g a t e d c e l ls u s p e n s i o n s w e r e o b t a i n e d i n PBS-M w i t h i n a 3 0m i n u t e p e r i o d . T h e s e s u s p e n s i o n s s h o w e d a g r e y i s h -w h i t e c o l o u r , q u i t e d i f f e r e n t f r o m t h e p i n k s h a d e o fs u s p e n s i o n s f r o m n o r m a l t i s s u e . A b o u t 30% o f t h ec e l l s w e r e s p h e r i c a l i n s h a p e w i t h a l a r g e r n u c l e u st h a n t h a t o f n o r m a l c o l o n i c e p i t h e l i a l c e l l s . T h ed i a m e t e r o f t h e n u c l e u s o f n e o p l a s t i c e p i t h e l i a l c e l l sw a s 4 - 3 5 0 2 5 4 2 a s c o m p a r e d w i t h 3 7 2 0 - 1 3 3p , 2 f o r c e l l s d e r i v e d f r o m n o r m a l t i s s u e . T h e r a t i o :a r e a o f n u c l e u s w a s 0 - 7 8 4 a n d 0 . 3 3 2 2 f o r c a n c e r o u st o t a l c e l l a r e aa n d n o r m a l a n i m a l s , r e s p e c t i v e l y .C e l l s u s p e n s i o n s f r o m c o l o n i c t u m o u r s w e r ei n c u b a t e d , l i k e t h e n o r m a l c e l l s , w i t h PBS-M m e d i u mc o n t a i n i n g a n t i b i o t i c s a n d 1 0 , u C i / m l o f 3 H - l e u c i n ea n d 1 , u C i / m l o f 1 4 C - g l u c o s e . I n r e p e a t e d e x p e r i m e n t sf o r w h i c h t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n s w e r e s i m i l a r t ot h o s e f o r n o r m a l c e l l s , t h e r a t e o f i n c o r p o r a t i o nw a s a b o u t t w i c e a s h i g h a s f o r s u s p e n s i o n s o f s u r -r o u n d i n g n o n - c a n c e r o u s c o l o n i c t i s s u e t a k e n f r o mt h e s a m e a n i m a l .F u r t h e r d e t a i l s o f t h e s e s t u d i e s w i l l b e p u b l i s h e d i na s e p a r a t e p a p e r .T h e a u t h o r s t h a n k Dr J . W e i s b u r g e r f r o m t h eA m e r i c a n H e a l t h F o u n d a t i o n , V a l h a l l a , New Y o r k ,u n d e r w h o s e d i r e c t i o n t h e t u m o u r i n d u c t i o n w a sc a r r i e d o u t , a n d Mr L . Q u i n l a n f r o m t h e D e p a r t -m e n t o f M i c r o b i o l o g y , D i v i s i o n o f L a b o r a t o r i e s ,M e t r o p o l i t a n M e d i c a l C e n t e r , New Y o r k C i t y , f o rs S t a n d a r d d e v i a t i o n , b a s e d on 1 2 m e a s u r e m e n t s .

t h e b a c t e r i o l o g i c a l d i a g n o s i s . T h i s w o r k w a s s u p -p o r t e d b y G r a n t N o . 5 R26 C A 1 7 1 6 8 - 0 2 f r o m t h eN a t i o n a l C a n c e r I n s t i t u t e t h r o u g h t h e N a t i o n a lL a r g e B o w e l C a n c e r P r o j e c t .R e f e r e n c e sB i t t e r , T . , a n d M u i r , H . M . ( 1 9 6 2 ) . A m o d i f i e d u r o n i c a c i dc a r b a z o l e r e a c t i o n . A n a l y t i c a l B i o c h e m i s t r y , 4 , 3 3 0 - 3 3 4 .C u l l i n g , C . F . A . , R e i d , P . E . , T r u e m a n , L . S . , a n d D u n n ,W. L . ( 1 9 7 3 ) . A s i m p l e m e t h o d f o r t h e i s o l a t i o n o f v i a b l ee p i t h e l i a l c e l l s o f t h e g a s t r o i n t e s t i n a l ( G I ) t r a c t . P r o c e e d i n g so f t h e S o c i e t y f o r E x p e r i m n e n t a l B i o l o g y a n d M e d i c i n e , 1 4 2 ,4 3 4 - 4 3 8 .E v a n s , E . M . , W r i g g l e s w o rt h , J . M . , B u r d e t t , K . , a n d P o v e r ,W. F . R . ( 1 9 7 1 ) . S t u d i e s o n e p i t h e l i a l c e l l s i s o l a t e d f r o mg u i n e a p i g s m a l l i n t e s t i n e . J o u r n a l o f C e l l B i o l o g y , 5 1 , 4 5 2 -4 6 4 .G w a t k i n , R . B . L . , a n d T h o m s o n , J . L . ( 1 9 6 4 ) . Anew m e t h o df o r d i s p e r s i n g t h e c e l l s o f m a m m a l i a n t i s s u e s . N a t u r e , 2 0 1 ,

1 2 4 2 - 1 2 4 3 .H o w a r d , R . B . , L e e , J . C . , a n d P e s c h , L . R . A . ( 1 9 7 3 ) . T h ef i n e s t r u c t u r e , p o t a s s i u m c o n t e n t , a n d r e s p i r a t o r y a c t i v i t yo f i s o l a t e d r a t l i v e r p a r e n c h y m a l c e l l s p r e p a r e d b y i m -p r o v e d e n z y m a t i c t e c h n i q u e s . J o u r n a l o f C e l l B i o l o g y , 5 7 ,6 4 2 - 6 5 8 .K i m m i c h , G . A . ( 1 9 7 0 ) . P r e p a r a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f m u c o -s a l e p i t h e l i a l c e l l s i s o l a t e d f r o m s m a l l i n t e s t i n e o f t h ec h i c k e n . B i o c h e m i s t r y , 9 , 3 6 5 9 - 3 6 6 8 .K r u s e , P . F . , J r , a n d P a t t e r s o n , M. K . , J r ( 1 9 7 3 ) . T i s s u eC u l t u r e : M e t h o d s a n d A p p l i c a t i o n s . A c a d e m i c P r e s s : NewY o r k .L a M o n t , J . T . , W e i s e r , M. M . , a n d I s s e l b a c h e r , K . J . ( 1 9 7 4 ) .C e l l s u r f a c e g l y c o s y l t r a n s f e r a s e a c t i v i t y i n n o r m a l a n d n e o -p l a s t i c i n t e s t i n a l e p i t h e l i u m o f t h e r a t . C a n c e r R e s e a r c h , 3 4 ,3 2 2 5 - 3 2 2 8 .M a d d e n , R . E . , a n d B u r k , D . ( 1 9 6 1 ) . P r o d u c t i o n o f v i a b l es i n g l e c e l l s u s p e n s i o n s f r o m s o l i d t u m o r s . J o u r n a l o f t h eN a t i o n a l C a n c e r I n s t i t u t e , 2 7 , 8 4 1 - 8 5 5 .N a r i s a w a , T . , W o n g , C . , M a r o n p o t , R . R . , a n d W e i s b u r g e r ,J . H . ( 1 9 7 6 ) . L a r g e b o w e l c a r c i n o g e n e s i s i n m i c e a n d r a t sb y s e v e r a l i n t r a r e c t a l d o s e s o f m e t h y l n i t r o s o u r e a a n d n e g a -t i v e e f f e c t o f n i t r i t e p l u s m e t h y l u r e a . C a n c e r R e s e a r c h , 3 6 ,5 0 5 - 5 1 0 .P e r r i s , A . D . ( 1 9 6 6 ) . I s o l a t i o n o f t h e e p i t h e l i a l c e l l s o f t h e r a ts m a l l i n t e s t i n e . C a n a d i a n J o u r n a l o f B i o c h e m i s t r y , 4 4 , 6 8 7 -6 9 3 .S t e g e m a n n , H . ( 1 9 5 8 ) . M i k r o b e s t i m m u n g von H y d r o x y -p r o l i n m i t C h l o r a m i n - T u n d p - D i m e t h y l a m i n o b e n z a l -d e h y d . H o p p e S e y l e r ' s Z e i t s c h i f t f u r P h y s i o l o g i e u n dC h e m i e , 3 1 1 , 4 1 - 4 5 .S t e r n , B . K . ( 1 9 6 6 ) . Some b i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f s u s p e n -s i o n s o f i n t e s t i n a l e p i t h e l i a l c e l l s . G a s t r o e n t e r o l o g y , 5 1 , 8 5 5 -8 6 4 .