si nyal transd üksiyonu n i hücreler arası İletişim 1 (sinyal İletimi 1)

Sinyal Transdüksiyonun I

Hücreler Arası İletişim 1(Sinyal İletimi 1)

Yrd. Doç. Dr. İzzet YELKOVANMart 2006

SİVAS

External sinyal iletimi: Hedef hücrelere sinyal iletimi(1) Endokrine sinyal iletimi: sinyal molekülleri (hormonlar) endokrin organ hücrelerince sentezlenirler – sentezlendikleri yerin uzağında başka bir mikroçevredeki hedef hücrelere etki ederler.(2) Parakrin sinyal iletimi: sinyal molekülleri aynı mikro-çevreyi paylaşan bir hücre veya hücre grubu tarafında salınır ve yakın çevredeki diğer hücreleri etkiler (Neurotransmitterler ve neurohormonlar).(3) Autokrin sinyal iletimi: sinyal molekülleri bir hücre veya hücre grubundan salınır ve sadece kendileri yanıt oluştururlar (bir çok büyüme faktörü).(4) Hücre – hücre ve hücre- matriks arası etkileşimlerde işe karışan moleküller.

Fig. 7.2c (TEArt)Fig. 7.2c (TEArt)

Endokrin Sinyal İletimi

Endokrin Bez Tarafından Kana Hormon(ligand) Salgılanır

Kan Danarı

Uzaktaki Hedef Hücreler

Fig. 7.2b (TEArt)Fig. 7.2b (TEArt)

Parakrin Sinyal İletimi

Komşu Hedef Hücreler

Salgı Hücresi

Fig. 7.2d (TEArt)Fig. 7.2d (TEArt)

Sinaptik Sinyal İletimi

Sinir Hücresi

Neurotransmitter

Sinaptik Açıklık

Hedef Hücre

Hücre- hücre

Geçit Bölgesi

Gap Junction

Koneksinler

Özet

(1) Sinyal üreten hücre tarafından sinyal molekülünün sentezlenmesi(2) Sinyal üreten hücre tarafından sinyal molekülünün salınması.(3) Sinyal molekülünün hedef hücreye taşınması(4) Sinyalin hedef hücrede özgül reseptör protein tarafından tutulması(5) Hücre içi sinyal transdüksiyon yolunu tetiklemesi(6) Hücre metabolizmasında veya gen ekspresyonunda değişiklikler

(hücresel yanıt).(7) Sinyalin sönümlenmesi, çoğunlukla hücresel yanıtın sonlandırılması.

• Sinyal transdüksiyonu bilginin, hücre dışından sitoplazmaya veya çekirdeğe taşınması için gerçekleşen moleküler olayların tamamıdır.

• Amplifikasyon (zaman ve nitelik) ikinci haberciler aracılığı ile sinyallerin amplifikasyonu (genellikle küçük moleküllerin turnover’leri oldukça hızlıdır)

Çoklu kontrol sinyal

Algılama - Kabul etme

Transduksiyon

Hücresel yanıtlar

Amplifikasyon

Sinyal molekülü

Reeptorproteini

Aktifadenilat siklaz

Amplification

Amplifikasyon

Amplifikasyon

Amplifikasyon

GTP G protein

2

1

3

4

5

6

7

Enzimatik ürünler

Enzim

Proteinkinaz

cAMP

İnaktif Adenilat

siklaz

• Hücresel yanıtlar özellikle sinyal iletim yollarının (pathway) açılması ile aşağıdaki hücresel değişikliklere neden olabilir:

hücre döngüsü ilerleyişi gen ekspresyonu protein trafikhücre göçühücre iskeleti mimarisihücresel konumlanmametabolizmahücresel kalımlılık

Asetilkolin (neurotransmitter’den biri)

(a)Kalp kas hücresi: kontraksiyon (kasılma) gücünde ve oranında azalma

(b) iskelet kas hücresinde: kontraksiyon(c) düz kas hücresinde: relaksiyon (d) tükrük bezi hücresinde: salgı salgılama

Farklı hücreler aynı sinyal molekülüne farklı yanıtlar üretebilirler

ReseptörlerHücre Yüzey ReseptörleriHücre İçi Reseptörler

Sitozolik ReseptörlerÇekirdek İçi Reseptörler ?

Matriks?Kromatin- DNA?

Sinyal molekülBağlanma yeri

Inhibitorprotein

DNAbağlamadomaini

Transkripsiyon-Aktive edici domain

Sinyal molekül

Sinyal molekülBağlama domaini

Reseptörler

Hücre Yüzey Reseptorleri (almaçları) dört farklı grupta toplanmışlardır.

1- Enzim Reseptörler2- Enzimli Bağlı Reseptörler3- Iyon-kanalı bağlı reseptörler4- G-protein bağlı reseptörler

1- Enzim ReseptörlerProtein kinase reseptörleri (PKR)

Inaktif enzim

Ligand Hücre zarı

Reseptör tipleri

Ligand

Aktif enzim

1- Enzim ReseptörlerProtein kinase reseptörleri (PKR)

Reseptör tipleri

Fig. 7.5b (TEArt)Fig. 7.5b (TEArt)

Enzimik reseptörler

Sinyal- Ligand

İnaktif KataliyikDomain

Aktif KatalitikDomain

1- Enzim Reseptörler

2- Enzim Bağlı Reseptörlersitokin reseptorler, büyüme hormonu reseptorleri ve

interferonlar gibi

İnaktif enzim

Reseptör tipleri

Aktif enzim

2- Enzim Bağlı Reseptörlersitokin reseptorler, büyüme hormonu reseptorleri ve

interferonlar gibi

Reseptör tipleri

3- Iyon-kanalına bağlı reseptörlerneurotransmitter-geçitli iyon kanalları

İyonlar

Reseptör tipleri


Reseptör tipleri

Fig. 7.5a (TEArt)Fig. 7.5a (TEArt)Sinyal İyonlar

3- Iyon-kanalı bağlı reseptörler

4- G-protein- bağlı reseptörlerepinefrine, serotonin ve glukagon reseptörleri

G protein enzyme

Reseptör tipleri

NH2

Ligand bağlanma yeri

COOH

G-protein- bağlanma yeri

enzyme

Reseptör tipleri


enzim

Aktif G protein

Reseptör tipleri


enzim

Reseptör tipleri


Aktif enzim

Reseptör tipleri


Fig. 7.5c (TEArt)Fig. 7.5c (TEArt)

G protein AktifG protein İnaktif Enzim

ya daiyon kanalı

Aktif Enzim ya daİyon Kanalı

G-protein bağlı receptor

4- G-protein bağlı reseptörler

Sinyal Transdüksiyonunda

Geri Dönüşümlü Fosforilasyon Önemli Bir Rol Oynar

• Hücre içi sinyal iletim pathway’leri protein kinaz’lar ve

protein fosfataz’ların oluşturduğu ve yönlendirdiği

fosforilasyon cascade’lerdir.

Bunlar hücredeki düğme-anahtarlardır

İlke (Prensip)

Protein kinazlar proteinleri fosforile ederler.

ProteinKinaz

ATP Protein ADP

P

Kinazlar & Fosfatazlar

ProteinKinaz

ATP Protein ADP

P

ProteinP

FosfatazProtein P

Protein kinazlar proteinleri fosforile ederler. Protein fosfatazlar proteinleri defosforile ederler.

Kinazlar & Fosfatazlar

• İnsanlarda 500’den fazla protein kinaz ve 100’den fazla protein tirosin fosfataz bulunur.

• Evrimsel açıdan iyi korunmuşlardır ve amino asit dizilimleri ve protein işlevleri tanımlanmıştır.

protein kinazlar

1-Ser/Thr spesifik protein kinazlar2-Tyr spesifik protein kinazlar 3-Histidin spesifik protein kinazlar (Lys ve Arg den de yapan enzimler vardır)4-Aspartat veya glutamat spesifik protein kinazlar

Deneysel Protein Kinaz(İn vitro)

Metod

• Protein kinaz

• Substrat

• ATP (radyoaktif ATP kullanılabilir, [32P]--ATP)

• Mg2+

• Tampon

Aktiviteleri protein kinazlar Aktiviteleri protein kinazlar tarafından düzenlenen moleküllertarafından düzenlenen moleküller

Enzimler : Enzimler : sinyal transdüksiyon enzimleri veya ara sinyal transdüksiyon enzimleri veya ara metabolizma enzimlerimetabolizma enzimleri

Adaptör ProteinlerAdaptör Proteinler Sinyal ProteinleriSinyal Proteinleri Transkripsiyon FaktörleriTranskripsiyon Faktörleri İyon Kanallarıİyon Kanalları Transmembran ReseptörlerTransmembran Reseptörler Ribozomal Proteinler (S6)Ribozomal Proteinler (S6) Yapısal ProteinlerYapısal Proteinler Transport ProteinleriTransport Proteinleri

(A) Ekstrasellüler bölge

- Ligand bağlanır.

-Yüzlerce amino asit uzunluğunda ve çeşitli yapısal dizi motifleri taşır.Ör. Ig benzeri domainler,lösince zengin domainler.

-Çoğu reseptör PTK’lar N- ve O- bağlı olarak modifiye haldedir.

C

N

Reseptörler

(B) Transmembrane bölge

-Reseptör PTK’ların tümü tek bir transmembran bölge taşır.

-Transmembran bölgeyi birkaç bazik amino asit izler.

C

N

Reseptörler

(C) Sitoplazmik bölge

-- juxtamembrane bölgeyi oluşturur.

-Bunu protein kinaz catalitik domain izler (PTK),

-Sonra C- terminal bölgesi gelir.

C

N

Reseptörler

(C) Sitoplazmik bölge

- Protein kinaz katalitik domaini iyi korunmuş ~250 aa uzunluğundadır.

-C- terminal bölgesi tirozin fosforilasyonunun en çok meydana geldiği yerdir.

-Ancak katalitik bölgede de tirozin fosforilasyon yeri vardır, burası kinaz aktivitesi için gereklidir. C

N

Reseptörler

P

P

P

P

Reseptör Protein Tirozin Kinaz Sinyal Transdüksiyonunu Başlatır

(1) Ligand extrasellular domaine bağlanır(2) Reseptor oligomerizasyonu olur(3) Tirosine otofosforilasyona uğrar

Reseptörler

P

P

P

P

Kinaz Aktif

Diğer Proteinleri bağlar

Otofosforilasyonun iki sonucu vardır:

(1) PTK’nın katalitik aktivitesini aktive eder.(2) Konformasyonel değişiklik geçirerek sitoplazmik sinyal ileticilere bağlanılmasını sağlar.

Sin

ya

l ile

tim

i

Reseptörler

(I) Ligandın bağlanması reseptor oligomerizasyonuna neden olur

Reseptörler

• Ligand bağlanması geri-dönüşümlü, özgül ( spesifik) ve yüksek afinite’lidir.

Reseptörler



Reseptörler

• Ligand bağlanması geri-dönüşümlü, özgül ( spesifik) ve yüksek afinite’lidir.

Örnek:PDGF (platelet-derived growth faktör) (trombosit kökenli büyüme faktörü)• PDGF A ve B zincirlerinin homo ya da heterodimeri olabilir. .• PDGF A zinciri sadece a PDGF reseptörüne, B zinciri hem hem de reseptörlerine bağlanabilir. PDGF-AA ancak reseptör homodimerini, ve PDGF-AB ancak - ve - reseptör oluşumunu indükleyebilirler.

AA

A B

BBBB BBA B

A BBB AA

Reseptörler

Örnek:PDGF (platelet-derived growth faktör) (trombosit kökenli büyüme faktörü)• Farklı komposisyonları farklı hücresel yanıtların oluşmasını sağlar.

AA

A B

BBBB BBA B

Reseptörler

PP PP

PP

Örnek:EGF (epidermal growth faktör)• Ligand’lar monomerik• Reseptörler homo ve heterodimerik

Protein kinaz aktif

Otofosforilesyon (Transfosforilasyon)

Protein kinazinaktif

Konformasyondeğişimi

Reseptör oligomerisazyonu

Reseptörler

Sönümlenme- Defosforilasyon- Reseptörün alınması

-(endositoz vb)

- Fosforilasyon loop’larınca negatif feed-back

PP

PP

Phosphatase

Turning off or quenching of the receptor PTK-initiated signaling:

- dephosphorylation- receptor internalization (endocytosis, may be autophosphorylation-mediated)

- negative feedback loop by phosphorylation

PP

PP




PP

PP

P




CONCEPT• Protein modules direct specific interactions in signal transduction pathways.• Various modules are frequently found in the same proteins.

The next step in PTK-mediated signaling involves interaction with cytoplasmic proteins that contain protein-protein interaction modules

P

P

P

P SH2 SH

3

Grb2

Interaction of receptors with cytoplasmic proteins

(I) Src Homology 2 (SH2) domain

• SH2 domain recognizes phosphotyrosine-containing motifs.

• SH2 = conserved regions of ~100 aa.

• First identified as homology regions between members of the Src family (see later).

• SH2 binds to phosphotyrosine and the immediate C-terminal residues (3-5) in a sequence-specific fashion.

e.g. the autophosphorylated tyrosine residue in a receptor PTK binds specifically to one or more SH2-containing proteins, but may not bind to other SH2-containing proteins.

SH2

These experiments showed that the consensus binding sequences for different SH2 domains are: pY-X-Z-X or pY-Z-X-Z (pY= phosphotyrosine, Z = specific aa, X = any aa).

Experiment: Incubation of different SH2 domains with degenerate phosphotyrosine-containing peptide library wash out unbound peptidesprotein sequencing of the bound peptides to determine binding specificity.

SH2

• 3-D crystal and NMR structural analysis reveal that SH2 domain is a folded, globular structure protubing from the rest of the protein, with N- and C-terminals close together.

• The phosphopeptide binding site is a pocket on the surface of the structure. • Like a “plug” (the phosphotyrosine-containing peptide) inserted into a “socket” (the SH2 domain) (Cell 72: 779 (1993)).

SH2

One side of the pocket is lined with conserved basic aa and binds the phosphotyrosine

The other side of the pocket is more variable and allows specific recognition of the residues at the C-terminal of the phosphotyrosine.

Variations in the nature of the hydrophobic socket in different SH2 domains allow them to bind to phosphotyrosine adjacent to different sequences.

Experiment: Substitution of the Arg175-equivalent in Abl’s SH2 domain with lysine (using site-directed mutagenesis) complete loss of phosphotyrosine binding.

The ability of SH2 to distinguish between phosphotyrosine and phosphoserine/threonine is mainly due to a conserved Arg residue in SH2 (Arg175 in Src) (this is actually the only invariant residue of the SH2). This residue is buried in the bottom of the binding pocket, and only the long phosphotyrosine side chain can achieve the optimal binding.

SH2

Meth

od

s

Site-directed mutagenesis

To change specific base(s) of a piece of DNA.

Meth

od

s


Many methods, here are some:

(I)

Meth

od

s


(I) Cut with restriction enzymes

Meth

od

s


(I) Replace with fragment containing the mutation

Meth

od

s


(II) PCR with oligonucleotide containing the mutation

Meth

od

s


(II) A second PCR using the first PCR product as one of the primers

Experiment: Substitution of the Arg175-equivalent in Abl’s SH2 domain with lysine (using site-directed mutagenesis) complete loss of phosphotyrosine binding.

The ability of SH2 to distinguish between phosphotyrosine and phosphoserine/threonine is mainly due to a conserved Arg residue in SH2 (Arg175 in Src) (this is actually the only invariant residue of the SH2). This residue is buried in the bottom of the binding pocket, and only the long phosphotyrosine side chain can achieve the optimal binding.

SH2

(II) Src Homology 3 (SH3) domain

SH3 modules bind proline-rich sequences.

SH3 domains: ~60 aa residues long.

SH3 binds to proline-rich peptides of ~10 aa long (containing the sequence X-P-p-X-P: X = tend to be aliphatic, p = tend to be proline).

Crystal structure and NMR structure of SH3 domains show that they contain elongated binding clefts, where hydrophobic pockets contact the polyproline peptide helix

- these peptides are pseudosymmetrical and can potentially bind in either orientation (Cell 76: 933 (1994)).

SH3

ligand and SH3 domain binding

http://pkr.sdsc.edu/html/3D/xray/sh3/sh3ligand.html

http://pkr.sdsc.edu/html/3D/xray/sh3/sh3ligand.html

http://pkr.sdsc.edu/htm//3D/xray/sh3/sh3ligand.html

Peyton Rous (1911) discovered that fibrosarcoma could be transmitted between chickens in cell-free extracts of the tumor.

Subsequently (1970), the viral oncogene v-src was discovered that could cause cellular transformation (see Cancer lectures) . This gave way to the discovery of proto-oncogenes and much of signal transduction pathways.

As one of the first proto-oncogene and tyrosine kinase described, SRC has provided a prototype for understanding signal transduction involving tyrosine phosphorylation.

But even now, the exact functions of SRC in normal cells are still unclear.

Signal Transduction by the SRC Family

SRC family of Protein tyrosine kinases: 8 known members of the family: SRC, LCK, BLK, HCK, FGR,YES, LYN, FYN

- with 60-75% amino acid identity between them (outside the unique region - see below).

SRC

Sequences: (a) myristylation sequence(b) unique region(c) SH3 domain(d) SH2 domain(e) catalytic domain(f) regulatory region

SH3 SH2 Protein kinaseUnique

Myr

isty

latio

n

Membrane

Y Y

SRC


Myr

isty

latio

n

Membrane

Y Y

Myristylation sequence• All SRC family members are membrane associated - although they do not have any hydrophobic transmembrane nor membrane anchor sequences.• The membrane association is due to co-translational addition of the 14-carbon fatty acid myristic acid to the glycine residue at position 2 (conserved in the SRC family), follows the proteolytic removal of the initiator methionine.

SRC


Myr

isty

latio

n

Membrane

Y Y

Myristylation sequenceThe N-terminal sequences of SRC are sufficient for myristylation. • Addition of residue 1-7 of SRC to the N-terminal of pyruvate kinase is sufficient to make the fusion protein being myristylated.• Mutation of SRC from Gly2 to Ala2 no myristylation.

SRC


Myr

isty

latio

n

Membrane

Y Y

Myristylation sequenceMyristylation is necessary, but not sufficient, for stable association of SRC with cell membranes.

e.g. fusion protein of pyruvate kinase with residue 1-7 of SRC can be myristylated, but it is not associated with membranes.

SRC


Myr

isty

latio

n

Membrane

Y Y

Unique region• This region is thought to be involved in the interaction of SRC family with specific cellular proteins, some of which may be substrates of SRC protein kinases.

• This is the region that differs the most between different members of the SRC family.

SRC


Myr

isty

latio

n

Membrane

Y Y

SH3 and SH2• as discussed above

SRC


Myr

isty

latio

n

Membrane

Y Y

Catalytic domain• Catalyze transfer of -phosphate from ATP to tyrosine residues on protein.

SRC


Myr

isty

latio

n

Membrane

Y Y

Catalytic domain• Catalyze transfer of -phosphate from ATP to tyrosine residues on protein.

• Autophosphorylation site (Tyr416 in SRC) enhances kinase activity.

SRC


Myr

isty

latio

n

Membrane

Y Y

Regulatory domain• The C-terminal 16-19 residues of SRC family contain site of tyrosine phosphorylation (Tyr527 in SRC) that plays a key role in the regulation of the activity of SRC.

• Phosphorylation of Tyr527 inhibition of kinase activity.

SRC

• The viral oncogenes products of v-src, v-yes, and v-fgr all are

truncated versions of their normal proto-oncogene that lack the

C-terminal Try527. These viral oncogene products have higher

catalytic activity than the normal protein.

Evidence

SH3 SH2 Protein kinaseUniqueY Y

P

SH3 SH2 Protein kinaseUniqueY

Kinase activity

+

+++P

SRC

• Mutation of Try527 in SRC family increase kinase activity

Evidence


P

Kinase activity

+

+++SH3 SH2 Protein kinaseUniqueY FP

SRC

• Dephosphorylation of Tyr527 by phosphatase increase

kinase activity

Evidence


P

Kinase activity

+

+++SH3 SH2 Protein kinaseUniqueY Y

PhosphataseP

SRC

Tyr527 is not phosphorylated by SRC itself.

- Mutation of SRC in the ATP binding site, render the enzyme inactive, is still fully phosphorylated on Tyr527 when expressed in cells.


P


K

ATP binding site

RP

Note: No autophosphorylation, but Tyr527 still phosphorylated

SRC

i.e. other kinase(s) is responsible for phosphorylation of SRC Tyr527.

One may be CSK (for c-SRC kinase or C-terminal SRC kinase).

Evidence:- CSK can phosphorylate SRC and related proteins’ Tyr527 in vitro and in vivo.- In cell lines from CSK KO mice (targeted deletion of CSK genes; which die in utero), SRC has increased kinase activity.

SRC

Crystal structure of SRC

SRC

SH3 SH2Unique

Y

P

INACTIVE

Interacton of SH3 with the proline-rich sequence present between SH2 and catalytic domain (the linker region) is not shown here (see previous slide)

Intramolecular interaction

SRC

SH3 SH2 Protein kinaseUniqueY YP

ACTIVE

SRC

Adapted from Schwartzberg (1998) Oncogene 17:1463

SRC

If the above model is correct, how do you expect the kinase activity will change if the SH2 domain of SRC is mutated?

?SRC

Functions of SRC family

• Different members of the SRC family have different patterns of expression.• Patterns of expression provides some indications of the function.

T cells B cells NK cells Monocytes Granulocytes Platelets Fibroblasts

Src - - + + + +++++ ++

Yes + - -/+ -/+ -/+ ++ +

Fyn ++ + + + + + +

Lck ++++ -/+ +++ - - - -

Fgr - - + ++ ++ + -

Hck - ++ - +++ ++ + -

Lyn - +++ + + ? + -/+

Blk - +++ - - - - -

When a protein is highly expressed in one type of cells but not the others, what does that suggest??

SRC


Potential substrates of SRC

• Transformation by activated forms of SRC is accompanied by increased tyrosine phosphorylation of a number of cellular proteins, some of which must be substrates of SRC and are critical for the oncogenic capability of SRC.

What are substrates for protein kinases? ?

SRC


Potential substrates of SRC

(a) Signal transducing proteins- many potential substrates are identified; discuss typical transfection experiments in signal transduction research - what are the problems?

(b) Cytoskeletal proteins- on activation, a portion of SRC become associated with cytoskeleton.- nonactivated SRC and nontransforming mutants of v-SRC are not associated with cytoskeleton.- transformation is associated with large changes in cytoskeleton organization (see Transformation lectures).

SRC


Src in PDGF signalingQuiescent cells + PDGF PDGF binds to PDGF receptor receptor oligomerization and phosphorylation (see above) SRC, YES, and FYN binds to Tyr579 and Tyr581 in the juxtamembrane domain of PDGF receptor.

BB

BB

Src

BB

Y579Y581

Signal Transduction pathwayleads to gene expression and cell cycle progression

SRC


SRC family in heamopoietic signal transduction

• First observed that T cell surface glycoproteins CD4 and CD8 were physically associated with LCK; later on it was shown that SRC family of PTK are involved in a number of signal transduction pathways that are initiated through a diverse group of cell surface proteins.

• Cross-linking of CD4 on T cells with anti-CD4 antibodies stimulation of LCK activity.

• The role of LCKK-CD4 in T cells appears to be the augmentation of signals initiated by T cell receptors.

SRC


SRC family in heamopoietic signal transduction

FYN is important in T cell signaling.

• FYN co-immunoprecipitated with T cell receptors.

• Transgenic mice overexpressing FYN in thymocytes T cell

receptors became hyper-responsive; and overexpression of an

kinase-inactive FYN suppressed T cell receptors response.

• Thymocytes from FYN-/- knockout mice did not response to T

cell receptors stimulation.

SRC

Randy Y.C. PoonDepartment of BiochemistryHong Kong University of Science and TechnologyClear Water BayHong Kong

[email protected]

si nyal transd üksiyonu n i hücreler arası İletişim 1 (sinyal İletimi 1)

Documents