LAAN-A-LC134

No.L428“Prominence RF-20AXS”蛍光検出器の応用（その 9 ）

アフラトキシンB1，B2，G1，G2の高感度分析Applications by the “Prominence RF-20AXS” Fluorescence Detector (Part 9)

Analysis of Aflatoxin B1, B2, G1 and G2 at High Sensitivity

アフラトキシンはAspergillus属菌が産生するカビ毒で，そ

の強い急性毒性と発ガン性から，食品において検出されて

はならないとされています1）。従来，国内のアフラトキシン

規制はアフラトキシンB1に対して行われていましたが，2011

年10月からは総アフラトキシン（アフラトキシンB1，B2，G1，

G2の総和）を対象とすることになりました2）。

ここでは，高感度蛍光検出器“Prominence RF-20AXS”

を用いて，アフラトキシン4成分（B1，B2，G1，G2）をトリフ

ルオロ酢酸による誘導体化処理後検出した場合，および誘

導体化処理なしに直接検出した場合の分析例をご紹介しま

す。

K. Watanabe A. Nomura

■トリフルオロ酢酸によるアフラトキシンの誘導体化Derivatization of Aflatoxins with Trifluoroacetic Acid

一般に，アフラトキシンB1およびG1は，蛍光強度を増大

させるために，トリフルオロ酢酸（TFA）を用いて水酸化体

であるアフラトキシンB2a，G2aに変換してHPLC分析されま

す。Fig. 1に，アフラトキシン4成分の構造式およびTFA処

理により生じるB2a，G2aの構造式を示します。

食品中のアフラトキシンを分析する際は，標準液および

試料溶液の両方をTFAで誘導体化処理します。

TFA

O

O

O O

O

O

O

CH3

O

O

O O

HO

CH3

O

O

O

O

O

O O

CH3

CH3

O

O

O

Aflatoxin B1 Aflatoxin B2a Aflatoxin B2

TFA

O

O

O

O

O

O

OCH3

O

O

O

O

HO

O

O

O

CH3

O

O

O

O

O

O

O

Aflatoxin G1 Aflatoxin G2a Aflatoxin G2

Fig. 1　アフラトキシンB1，B2，G1，G2およびトリフルオロ酢酸による誘導体（B2a，G2a）の構造式Structures of Aflatoxin B1, B2, G1, G2, and Derivatized Forms (B2a, G2a) with Trifluoroacetic Acid

No.L428

■トリフルオロ酢酸による誘導体化標準液の分析Analysis of Standard Solution after Derivatization with Trifluoroacetic Acid

Fig. 2に，アフラトキシン4成分（B1，B2，G1，G2）の標

準液をTFAにて誘導体化処理後（Fig. 4），20 µL注入した

クロマトグラムを，Table 1にその分析条件を示します。Fig. 2

（右）の標準液におけるアフラトキシンB2aのピーク面積再現性

（n=6）は1.2 %RSDであり，検出限界（SN比=3.3，20 µL

注入時）は0.4 ng/L（8 fg）と算出されました。

Fig. 3に，検量線（B1およびG1：0.004～20 µg/L，B2お

よびG2：0.001～5 µg/L）を示します。4成分共に，R2=0.9999

以上の良好な直線性が得られました。

このように，RF-20AXSを用いることにより，極微量のア

フラトキシンを高感度に精度よく検出することができます。

1

2

3

■ Peaks1. Aflatoxin B2a (B1) : 2.0 µg/L2. Aflatoxin B2 : 0.5 µg/L3. Aflatoxin G2a (G1) : 2.0 µg/L4. Aflatoxin G2 : 0.5 µg/L

1

3

4

30.0mV

10.0

15.0

20.0

25.0

0.00

5.00

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0

µV

200

300

400

0

100 24

■ Peaks1. Aflatoxin B2a (B1) : 20 ng/L2. Aflatoxin B2 : 5 ng/L3. Aflatoxin G2a (G1) : 20 ng/L4. Aflatoxin G2 : 5 ng/L

min min

B1 (B2a)G1 (G2a)

B2

G2

3000

3500

4000

0

500

1000

1500

2000

2500

15105 25200

Area

(×10

00)

1000

1200

0

200

400

600

800

6420

Area

(×10

00)

Concentration (μg/L) Concentration (μg/L)

Aflatoxin Standard Solution

Evaporation by N2 gas0.2 mL TFA

Standing in dark at room temperature for 15 min0.8 mL Water / Acetonitrile = 9/1 (v/v)

HPLC (20 μL)

Fig. 2　トリフルオロ酢酸による誘導体化アフラトキシン標準液のクロマトグラム （20 µL注入）（左）B1およびG1 : 2.0 µg/L，B2およびG2 : 0.5 µg/L，（右）B1およびG1 : 20 ng/L，B2およびG2 : 5 ng/LChromatograms of Aflatoxin Standard Solutions after Derivatization with Trifluoroacetic Acid (20 µL injected)(Left) B1 and G1 : 2.0 µg/L, B2 and G2 : 0.5 µg/L, (Right) B1 and G1 : 20 ng/L, B2 and G2 : 5 ng/L

Fig. 3　トリフルオロ酢酸による誘導体化アフラトキシン標準液の検量線（B1およびG1 ： 0.004～20 µg/L，B2およびG2 ： 0.001～5 µg/L，各20 µL注入）Calibration Curves of Aflatoxin Standard Solutions after Derivatization with Trifluoroacetic Acid(B1 and G1 : 0.004-20 µg/L, B2 and G2 : 0.001-5 µg/L, 20 µL injected)

Fig. 4　TFAによる誘導体化Derivatization with TFA

Table 1　分析条件Analytical Conditions

Column : Shim-pack FC-ODS (150 mm L.×4.6 mm I.D., 3 μm)Mobile Phase : Water / Methanol / Acetonitrile = 6 / 3 / 1 (v/v/v)Flow Rate : 0.8 mL/minColumn Temp. : 40 °C Detection : RF-20AXS, Ex at 365 nm, Em at 450 nmRF Cell : Conventional Cell Cell Temperature : 25 °C Injection Volume : 20 μL

No.L428

■直接検出による標準液の分析Analysis of Standard Solution by Direct Detection

Fig. 5に，TFA誘導体化処理を行わずにアフラトキシン4

成分（B1，B2，G1，G2）の標準液を20 µL注入したクロマ

トグラムを示します。分析条件は，Table 1と同一です。

Fig. 5（右）のクロマトグラムにおけるアフラトキシンB1のピー

ク面積再現性（n=6）は2.7 %RSDであり，検出限界（SN比

=3.3，注入量20 µL）は3 ng/L（60 fg）と算出されました。

このことから，RF-20AXSを用いれば，アフラトキシンB1

およびG1はTFAによる誘導体化処理を行わずとも，試験に

必要な濃度を十分な感度で直接検出可能なことがわかりま

す。

Fig. 6に，検量線（B1：0.004～20 µg/L，G1：0.02～20 µg/L，

B2およびG2：0.001～5 µg/L）を示します。4成 分共に，

R2=0.9999以上の良好な直線性が得られました。

8.00mV

2 2

4.00

6.00

1

3

4

20.0

40.0

60.0

μV

1

3

4

0.0 5.0 10.0

0.00

2.00

0.0 5.0 10.0 15.015.0

0.00

■ Peaks1.Aflatoxin B1 : 2.0 μg/L2.Aflatoxin B2 : 0.5 μg/L3.Aflatoxin G1 : 2.0 μg/L4.Aflatoxin G2 : 0.5 μg/L

■ Peaks1.Aflatoxin B1 : 20 ng/L2.Aflatoxin B2 : 5 ng/L3.Aflatoxin G1 : 20 ng/L4.Aflatoxin G2 : 5 ng/L

minmin

B1

G1

B2

G2600

700

800

0

100

200

300

400

500

1050 2015

Area

(×10

00)

Area

(×10

00) 800

1000

1200

0

200

400

600

6420

Concentration (μg/L) Concentration (μg/L)

25

Fig. 5　直接検出によるアフラトキシン標準液のクロマトグラム （20 µL注入）（左）B1およびG1 ： 2.0 µg/L，B2およびG2 ： 0.5 µg/L，（右）B1およびG1 ： 20 ng/L，B2およびG2 ： 5 ng/LChromatograms of Aflatoxin Standard Solutions by Direct Detection (20 µL injected) (Left) B1 and G1 : 2.0 µg/L, B2 and G2 : 0.5 µg/L, (Right) B1 and G1 : 20 ng/L, B2 and G2 : 5 ng/L

Fig. 6　直接検出によるアフラトキシン標準液の検量線（B1 ： 0.004～20 µg/L，G1 ： 0.02～20 µg/L，B2およびG2 ： 0.001～5 µg/L，各20 µL注入）Calibration Curves of Aflatoxin Standard Solutions by Direct Detection (B1 : 0.004-20 µg/L, G1 : 0.02-20 µg/L, B2 and G2 : 0.001-5 µg/L, 20 µL injected)

島津コールセンター  0120-131691TEL:075-813-1691

2011年7月

No.L428

■食品試料の分析Analysis of Food

食品試料への応用として，市販トウモロコシ粉にアフラト

キシン標準液を添加して分析を行いました。Fig. 7に，試料

の前処理手順を示します。夾雑成分の除去には，多機能カ

ラムを用いました。アフラトキシン標準液は，試料中にB1お

よびG1は0.8 µg/kg，B2およびG2は0.2 µg/kgになるよう添

加しました。分析は，TFAによる誘導体化処理をした場合と，

誘導体化処理なしの直接検出の両方で行いました。

アフラトキシン標準液添加/添加なし（ブランク）の市販ト

ウモロコシ粉について，誘導体化処理し分析したクロマトグ

ラムをFig. 8に，誘導体化処理をせず，直接検出により分

析したクロマトグラムをFig. 9に示します。

200 mL Water/Acetonitrile=1/9 (v/v)

(Aflatoxin Standard Solution)

Sample 50 g

Standing in darkat room temperature for 5 min

Mixing for 30 min

Filtration

(8 mL)

Clean-up by multi-functional column“MycoSep 226 AflaZon+”

Fraction

Evaporation by N2 gas

(1 mL)

0.1 mL TFA

(1 mL)

Evaporation by N2 gas

Standing in dark at roomtemperature for 15 min

0.4 mL Water/Acetonitrile=9/1 (v/v)

Sample solution for Fig. 8

0.5 mL Water/Acetonitrile=9/1 (v/v)

Sample solution for Fig. 9

1

3

0.0 5.0 15.010.0min

mV

5.0

7.5

10.0

12.5

0.0

2.5

Unspiked (Blank)

24

Spiked

■ Peaks1. Aflatoxin B2a (B1)2. Aflatoxin B2

3. Aflatoxin G2a (G1)4. Aflatoxin G2

Unspiked (Blank)

1

2

3

4

Spiked

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

mV

0.0 5.0 10.0 15.0min

■ Peaks1. Aflatoxin B1

2. Aflatoxin B2

3. Aflatoxin G1

4. Aflatoxin G2

Fig. 7　前処理Sample Preparation

Fig. 8　トウモロコシ粉のクロマトグラム-TFAによる誘導体化処理（20 µL注入）（上段）アフラトキシン標準添加，（下段）添加なし

Chromatograms of Corn Flour-After Derivatization with TFA (20 µL injected)(Upper) Aflatoxin Standard Spiked, (Lower) Unspiked

Fig. 9　トウモロコシ粉のクロマトグラム-直接検出（20 µL注入）（上段）アフラトキシン標準添加，（下段）添加なしChromatograms of Corn Flour-Direct Detection (20 µL injected)(Upper) Aflatoxin Standard Spiked, (Lower) Unspiked

Table 2　分析条件Analytical Conditions

Mobile Phase : A; Water / Methanol / Acetonitrile = 6 / 3 / 1 (v/v/v)B; Acetonitrile

Time Program : B.Conc = 0 % (0.00-15.00 min) →90 % (16.00-23.00 min) → 0 % (24.00-34.00 min)

＊ 他の分析条件はTable 1と同一

［参考文献］1） 「カビ毒（アフラトキシン）を含有する食品の取扱いについて」（昭和

46年3月16日厚生労働省環食第128号，改正平成14年3月26日食監発第0326001号）

2） 「アフラトキシンを含有する食品の取扱いについて」（平成23年3月31日厚生労働省食安発0331第5号）

3100-07101-570-IK2011.7