separação das proteínas do soro de coelho por electroforese em acetato de celulose

2010/2011

29 de Março de 2011

Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose

Bioquímica I

Alunas:

Andreia Sousa

n.º 40261

Alexandra Salvado

n.º 40267

1.º Ano - 2.º Semestre

2 Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese

em Acetato de Celulose


1. Apresentação, Tratamento e

Discussão de Resultados

Tira de acetato de celulose obtido na electroforese

Imagem 1 Tira de acetato de celulose obtida na electroforese (após a transparentização).

Interpretação do electroforama obtido

A electroforese envolve o movimento de espécies carregadas em

solução sob a acção de um campo eléctrico. As macromoléculas, neste caso,

proteínas, vão se movimentar no sentido oposto à sua carga (num determinado

valor de pH). Quando as proteínas têm carga global negativa – pH superior ao

pI da proteína –,

movimentam-se para o

eléctrodo com carga positiva

(ânodo), quando têm carga

global positiva – pH inferior

ao pI da proteína –,

movimentam-se para o

eléctrodo com carga

1 – Albumina

2 – Globulinas 1

3 – Globulinas 2

4 – Globulinas

5 – Globulinas

6 – Ponto de aplicação

Imagem 2 Esquema de uma electroforese.




negativa (cátodo). A mobilidade electroforética (µ) de um composto é definida

como sendo igual à sua velocidade de migração (v) por unidade de intensidade

de campo eléctrico aplicado (E). Esta grandeza é inversamente proporcional à

carga, q, e inversamente proporcional ao tamanho da molécula e à viscosidade

do meio (ɳ) em que se processa a electroforese. No caso de a molécula ser

esférica, com um raio r, é válida a relação:

A carga das proteínas, que lhes confere a mobilidade numa

electroforese, depende do valor de pH da solução tampão em que se

encontram. Se o pH da solução for superior ao pI (ponto isoeléctrico), a

proteína ficará com carga global negativa (logo irá mover-se para o ânodo). Se

o pH da solução for superior ao pI, a proteína ficará com carga global positiva

(logo irá mover-se para o cátodo). Se o pH for igual ao pI, a proteína ficará no

ponto de aplicação, já que a sua carga global será nula – logo não migrará para

nenhum eléctrodo.

No soro de coelho normal estão presentes 15 proteínas que influenciam

o modelo electroforético. No entanto, como apresentam mobilidades

semelhantes geralmente apresentam apenas 5 bandas distintas:

Albumina;

Globulinas 1;

Globulinas 2;

Globulinas ;

Globulinas .

Como todas as proteínas ficam com carga global negativa quando em

solução tampão a pH 8,6 todas migram para o ânodo, logo a amostra foi

aplicada perto do cátodo pois assim seria mais fácil observar a diferença entre

as bandas.




Na tira de acetato de celulose apresentada acima (Imagem 1) é possível

observar 5 bandas distintas. Quanto maior a diferença entre o pH e o pI e

menor a massa relativa da proteína mais esta migra. No entanto, quando as

cargas das proteínas são semelhantes, o factor de diferenciação das moléculas

na tira vai ser a massa molecular relativa. Assim, como a que tem menor

massa relativa é a albumina e é nesta que a diferença entre o pH e o pI é

maior, é a albumina a proteína que mais migra, sendo seguida pelas globulinas

1, 2, , (esta última é a que apresenta uma diferença entre o pH e o pI

menor e a que tem maior massa). Pode-se também verificar que as

intensidades das cores são diferentes, devido às concentrações em que estão

presentes no plasma. Verifica-se, então, que a banda correspondente à

albumina é a de cor mais intensa – pois está presente no plasma em maiores

concentrações – e as menos intensas são as globulinas α, β e - as suas

concentrações no plasma são menores.

Quadro 1 Quadro com a massa relativa de cada proteína, o seu nível no plasma e o seu pI.

Proteínas Nível no plasma

(g dm-3)

Mr pI

aproximado

Albumina 40,0 66 000 4,9

Globulinas 1 4,5 40 000 – 60 000 -

Globulinas 2 6,5 100 000 – 400 000 4,9 – 6,3

Globulinas 8,5 110 000 – 120 000 -

Globulinas 11,0 150 000 – 400 000 6,3 – 7,6




Justificação do aumento da intensidade de corrente ao longo da

electroforese

Quadro 2 Medição da amperagem, registada pelos diferentes grupos, a tempos de exposição à

intensidade de corrente diferentes.

No inicio da electroforese, os dois compartimentos (que continham

solução tampão) tinham a mesma carga, logo as proteínas não migravam. Para

que elas começassem a migrar era necessário criar uma diferença de potencial

entre eles (um tinha de ficar com carga positiva – ânodo – e outro com carga

negativa – cátodo), logo ligou-se os eléctrodos da tina à fonte de alimentação e

regulou-se a diferença de potencial para 200V. Como consequência, ao

ligarmos os dois compartimentos através da tira de acetato de celulose houve

uma corrente eléctrica no sentido do cátodo para o ânodo.

Esta corrente só existe enquanto houver diferença de potencial entre os

compartimentos – para que continue a existir corrente eléctrica é necessário

manter ligada a fonte de alimentação.

Durante a realização da electroforese verificou-se um aumento da

intensidade de corrente, 6 mA, como se pode observar no quadro 2. O

aumento da intensidade de corrente deve-se não só ao número de tiras, pois a

área por onde passa a corrente eléctrica é maior (pela equação , onde

é a corrente eléctrica, é a área, é a velocidade de impulso e é a carga)

como também ao aumento da temperatura (devido a energia dissipada) que

Tira nº Tempo(min) I (mA)

0 9

1 45 13

2 50 14

3 60 15

4 70 -

5 90 6

6 100 3




tem como consequência uma diminuição da viscosidade da solução tampão, o

que se traduz numa diminuição da resistência, pela lei de Ohm ( , sendo

que corresponde ao potencial eléctrico, à resistência e à intensidade da

corrente) para uma diferença de potencial constante e uma diminuição da

resistência, aumenta a intensidade da corrente e, portanto, o aumento da

mobilidade dos iões na solução.

Quando se retirou a terceira tira (no total de seis) é possível observar

que a intensidade de corrente começou a baixar, isto deve-se ao facto de haver

menos tiras a ligar os dois compartimentos (a área por onde passa a corrente

eléctrica é menor).

Função do Ponceau S

Imagem 3 Fórmula estrutural da solução de Ponceau S.

Quando se retirou as tiras de acetato de celulose, no final da

electroforese, estas foram mergulhadas em solução de Ponceau S. Este

reagente permite corar as proteínas, pois liga-se aos grupos amina (carregados

positivamente) e às regiões apolares da proteína. Desta forma, numa tira de

acetato de celulose é possível observar bandas vermelhas (que são as

proteínas coradas) num fundo transparente.

A coloração das proteínas tornou possível visualizar com maior

facilidade as cinco bandas referidas acima, bem como determinar a que estava

em maior ou menor concentração – a com cor mais intensa é que existia em

maior concentração.




Comparação dos resultados obtidos pelos diferentes grupos

Quadro 3 Resultados obtidos pelos diferentes grupos.

Tiras Resultado

1

(45 minutos)

2

(50 minutos)

3

(60 minutos)

4

(70 minutos)

5

(90 minutos)

6

(100 minutos)

A electroforese realizada na aula prática foi deixada a decorrer durante

tempos diferentes para os diferentes grupos, de modo a podermos comparar os

resultados da eficiência de uma electroforese.

O tempo pré-definido fora os 45 minutos – tempo ao qual foi retirada a

primeira tira. A partir daí as tiras foram retiradas de 10 em 10 minutos,

aproximadamente.




O primeiro grupo foi aquele cujos resultados foram menos visíveis – a

tira deste grupo esteve exposta a uma corrente eléctrica durante um curto

tempo, quando comparada com as restantes tiras. As bandas das proteínas

não são claramente visíveis e são difíceis de distinguir (pouca migração das 5

proteínas) por esse mesmo motivo (fraca exposição à corrente eléctrica)

Após 50 minutos do início da electroforese, foi retirada a segunda tira.

Aqui a intensidade de corrente era praticamente idêntica à que se verificava

quando se retirou a primeira tira, pelo que a corrente eléctrica a que esta tira foi

exposta também foi fraca o que, somando ao pouco tempo da sua exposição,

resulta numa fraca distinção das bandas, assim como uma fraca migração das

5 proteínas.

Dez minutos depois foi retirada a terceira tira. Esta tira ainda se

apresentava na condição atrás mencionada: pouco tempo de exposição á

corrente eléctrica. Por esse motivo, nesta tira também não foi possível

distinguir com facilidade as 5 bandas das diferentes proteínas do soro de

coelho e não se observou uma boa migração por parte das mesmas.

Aos 70 minutos foi retirada a quarta tira. Nesta tira podemos assumir que

a corrente eléctrica foi mais fraca, uma vez que havia menos tiras na tina de

electroforese. No entanto, devido ao maior tempo de exposição, podemos

afirmar e observar que se conseguiu distinguir mais facilmente as 5 bandas

distintas de proteínas e a migração das mesmas também foi mais eficaz.

Após 90 minutos desde que se retirou a primeira tira, retirou-se a quinta

tira. Esta tira apresenta uma intensidade de corrente eléctrica semelhante à

registada quando se retirou a quarta tira, pelo que o factor determinante na

distinção das 5 bandas e a sua migração foi o tempo. Como esta tira esteve

mais tempo exposta a uma passagem de corrente eléctrica, foi possível

distinguir-se com alguma facilidade as diferentes bandas de proteínas assim

como o diferente nível das suas migrações.

Aos 100 minutos, foi retirada a sexta e a última tira. Esta tira, em

semelhança às últimas duas, também esteve exposta a uma menor intensidade




de corrente eléctrica e, mais uma vez, o factor determinante na distinção das 5

bandas e a sua migração foi o tempo. Como esta tira esteve ainda mais tempo

exposta a uma passagem de corrente eléctrica, foi possível distinguir-se com

mais facilidade as diferentes bandas de proteínas assim como o diferente nível

das suas migrações.

Em conclusão, podemos dizer que quanto mais tempo estiver exposta e

mais forte for a passagem de corrente eléctrica, mais fácil se torna a distinção

das bandas assim como o diferente grau das suas migrações.

2. Bibliografia

Quintas, A., Halpern, M.J., Freire, A.P. Eds., “Bioquímica –

Organização Molecular da Vida”, Lidel, Lisboa, 2008

http://www.angelfire.com/clone2/fouad/techniques/ponceau_S_sol

ution.pdf (2 de Abril de 2011, às 15:04 h)




3. Questões a desenvolver

As instruções para a realização de uma electroforese em papel indicam

que a amostra deve ser aplicada numa tira de papel 10x10cm,

previamente impregnada de uma solução tampão de fosfato de sódio (pH

6,5) 1mM, e sujeita depois a 10mA durante 1h a 0ºC. Preveja as

consequências das seguintes acções, justificando:

Por engano, usou-se um tampão de fosfatos de sódio (pH 6,5)

100mM na separação;

Ao usar um tampão com maior concentração aumenta-se a força iónica

da solução. Ao aumentar a força iónica da solução provoca-se uma super

condutividade eléctrica que gera calor (energia dissipada). Este calor tem como

consequência uma diminuição da viscosidade da solução tampão, o que se

traduz numa diminuição da resistência, pela lei de Ohm ( , sendo que

corresponde ao potencial eléctrico, à resistência e à intensidade da

corrente) para uma diferença de potencial constante e uma diminuição da

resistência, aumenta a intensidade da corrente e, portanto, o aumento da

mobilidade dos iões na solução. Desta forma, a electroforese decorreria mais

rapidamente, o que iria provocar que as proteínas mergulhassem na solução

tampão.

Por engano, não se ligou o sistema de refrigeração do aparelho;

Ao não se ligar o sistema de refrigeração do aparelho a temperatura

aumentaria logo, a viscosidade da solução tampão diminuiria bem como a sua

resistência. Ao diminuir a resistência de acordo com a lei de Ohm ( ,

sendo que V corresponde ao potencial eléctrico, R à resistência e I à

intensidade da corrente), para uma diferença de potencial constante e uma

diminuição da resistência, aumenta a intensidade da corrente o que leva a que




as proteínas da amostra possam atravessar totalmente a tira de acetato de

celulose mergulhando na solução.

Um compartimento do aparelho de electroforese tinha um volume

maior de solução tampão do que o outro.

Se num dos compartimentos houvesse um volume maior de solução

tampão, haveria a tendência para que esta se deslocasse no sentido de

equilibrar os volumes. A diferença entre os volumes levaria a uma maior

pressão na extremidade da tira de acetato de celulose em relação à outra

extremidade. Esta diferença de pressão conduziria a um movimento de iões da

solução da zona de maior pressão para a de menor pressão, até que a pressão

nas duas extremidades da tira se igualassem, situação que corresponde a

equilíbrio.

Este facto iria afectar os resultados da electroforese pois:

1. Se o sentido da migração das proteínas e o sentido do

deslocamento do volume fossem iguais: as proteínas migrariam

mais rapidamente, podendo mergulhar na solução.

2. Se o sentido da migração das proteínas e o sentido do

deslocamento do volume fossem opostos: as proteínas migrariam

no sentido contrário ao que deveriam (sentido da sua carga) e por

isso o resultado obtido seria errado.

separação das proteínas do soro de coelho por electroforese em acetato de celulose

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