Accelerated clinical course of prion disease in mice compromised

in repair of oxidative DNA damage

Clara M.O. Jallanda, Sylvie L. Benestad, Cecilie Ersdal, Katja Scheffler, RajikalaSuganthand, Yusaku Nakabeppue, Lars Eidec, Magnar Bjørås, Michael A. Tranulis

Vanessa Perez Carrillo y Manuela Munoz GomezEstudiantes de Medicina, III Semestre

• When purines suffer oxidation of the ring atom, mutagenic 8-oxoG isformed.

• Chronic oxidative stress leads to develop some diseases

• The brain of patients with Creutzfeldt-Jakob disease.

• PrP protein show an antioxidant function.

• Phases of the disease.

Dímeros de pirimidina

Residuos de guanina

alquilada

Reversión directa del DNA

dañado

Adición de grupos metilo

y etilo

Bloquea transcripción o

replicación

Fotorreactivación

-Reparación por escisión: Se elimina elnucleótido, base nitrogenada osegmento de DNA defectuoso y sereemplaza por una secuencia correcta.

NER BER

Reconocimiento lesión

Hidrolisis enlaces

DNA polimerasa

DNA ligasa

Lesiones sutiles

Causan graves daños

-Reparación de roturas de doble hélice: Reparaerrores causados en la replicación o que la

impiden.

Recombinación

Apareamiento incorrecto

Reconocer bases mal apareadas

Eliminarlas

Reponerlas

Errores en replicación o

recombinación

Se repara con una hebra hija

sana

Son agentes que nocontienen DNA o RNA,se propagan infectandoproteínas normales.

Se presenta en los genes ogg1 que repara bases por escisión y remueveel 8oxoG que se forma por la exposición a los ROS y mutyh que seencarga de reparar el daño oxidativo del DNA, cortando bases deadenina que están mal apareadas con G, C.8oxoG formado por oxidación del anillo de las purinas y causaapareamientos incorrectos.

Understand the action of prions in different organs of thebody and the way in which the disease develops.

• Ética

• Ratones

• Inoculo

• Diseño experimental

• Inmunohistoquímica

• Western Blot para detectar PrPSc

• Detección de daños en el DNA

• El estudio se llevó a cabo de acuerdo conel Reglamento noruego sobreexperimentación animal.

• Fue aprobado por el Comité de Ética dela experimentación animal y por laAutoridad de Investigación de Animalesde Noruega.

30 Ratones

12 C57Bl/6Y (wild-type)

18 transgenic ogg1 / mutyh / mice

Criterios de inclusión: Ratones hembra con peso de20g en la inoculación.

SSBP/1 sacado de ovejas scrapie

Cabras RML Ratón C57Bl/6Y

Ratones - controlesAnestesiados e

inoculados

Grabados y monitoreados en busca

de signos

Fueron sacrificadosy se extrajeron los

órganos

Corte longitudinal del cerebro

Inmunohistoquímicae histopatología

En busca de PrPSc y GFAP que marca

astrocitos

La otra mitad del cerebro se congeló

Western Blot para buscar PrPSc

Luego de la fijación, se deshidratan tejidos y se meten en parafina

Sumergir tejido en acido fórmico, lavarlo y

esterilizarlo

Analizar: la corteza del colículo superior,

hipotálamo, tálamo, núcleo septal

Determinargrado de

vacuolización 0-5

Tinciónpara GFAP

Aplicar coctel de anticuerpos para visualizar PrPSc

Exponer a proteinasa K

Es la identificación de un tejido por medio de una interacción antígeno-anticuerpo, donde el anticuerpo esta marcado y se colorea la célula para demostrar la presencia y localización de una molécula de interés.

Se usa para determinar proteínas de una muestra especifica. Lasproteínas son separadas por electroforesis en gel según su tamaño,por medio de SDS-PAGE, se disuelven con SDS cargado negativamente,las proteínas van a unfiltro que tieneanticuerpos yreaccionan con laproteína de interés.

Las muestras del cerebro se

echaron en buffer

Se incubaron con anticuerpo y un segundo anticuerpo se uso para visualizar las bandas con

imagen de fluorescencia

La actividad peroxidasa serevelo con un sustrato dequimioluminiscencia.

La inmunodeteccion se hizo usando anticuerpo monoclonal en el que se reconocia el aminoacido YEDRYYRE, que corresponde a los codones 145-152 en PrP humana.

• Determina la expresión de genesen diversos tejidos. Amplificaciónde RNA a través de la síntesisprevia de su cDNA, usando unatranscriptasa inversa, seguido devarios ciclos de PCR convencional.

• Se realiza PCRrt para detección dedaño en el DNA nuclear ymitocondrial.

RESULTADOS

AUTHOR WHAT DID HE SAY? ARE THEY AGREE? YES OR NO

(Wang, X et al., 2010) “Because neurons in different brain

areas differ in their vulnerability to ROS-

mediated damage, it might be assumed

that the regional distribution of prion

pathologies could be influenced by

reduced BER enzyme activities.”

YES

(B. Dalhus, et al., 2009

M.L. Hegde, et al.; 2008)

“BER is the major pathway for removal

of DNA bases damaged by reactive

oxygen species, in both the nucleus and

the mitochondria.”

YES

(J. Tatzelt, et al.; 1995) “It has previously been

documented in cell culture

experiments that prion replication

selectively modifies cellular stress

responses.”

YES

(S. Akhtar, et al

G. Tamguney, et al.; 2008)“Many previous studies have

identified genetic elements that

influence the incubation period of

experimental prion disease”

YES

We think that is really importantand also interesting to know about

how ROS can affect and make a certain damage in our DNA, causinglot of deseases and thus try to stop

it.

We liked understanding our

complex regulation system

based on BER, that is the major

pathway for removal of damage

DNA bases by reactive oxygen

species in the nucleus and in

the mitochondria, and when it is

affect may be because a lost or

a deletion in the enzymes that

leads to the manifestation of

some important illness.

It is absolutely engaging to knowthe reason of a lot ofneurodegenerative diseases thatappear in our society likeAlzheimer disease (AD),Parkinson disease, Huntingtondisease, and the prion diseases,such as Creutzfeldt–Jakob disease(CJD) and the most importantthing is that knowing why theyoccur we can treat all of them.

• We also think that is very important to evaluate

and analyzed the brain areas to generate the

lesion profile caused by the prions: dorsal half

of the medulla oblongata, cerebellar cortex of

the folia, cortex of the superior colliculus,

hypothalamus, thalamus, hippocampus, septal

nuclei, cerebral cortex dorsal to the corpus

callosum, and cerebral cortex dorsal to the

septal nuclei, look for the degree of

vacuolization and finally make a conclusion of

which is the area that prions affect the most and in which they have more affinity.

A DREAM IS A WISH YOU COME TRUE