Molecular epidemiology and characterization of virulence genes of

commnunity-acquired and hospital-acquiredmethicillin-resistant Staphylococcus aureus

in Colombia

Bibiana Chavarro Portillo, Jaime Enrique Moreno, Nancy Yomayusa, Carlos Arturo Álvarez, Betsy Esperanza Castro Cardozo, Javier Antonio Escobar

Pérez, Paula Lucía Díaz, Milciades Ibañez, Sebastián Mendez-Alvarez, Aura Lucía Leal, Natasha Vanegas Gómez

Manuela Rendón DíezDaniel Peña Tobón

*INTRODUCTION

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Kind Virulence Factors

Staphylococcus

Strucutaralcomponents

Enzymes

Toxins

Genus Methicillin

Aureus Beta Lactamantiobiotic

INTRODUCTION

INTRODUCTION

Stap

hyl

oco

ccu

sFrom the Greck sthapylé meaning bunch of grapes

Gram Positive Bacteria

Facultative bacteria growth: growing in aerobic and anaerobic enviroments

Microorganims in the skin and mucous of humans and animals

Cell wall: pollysaccharide capsule to protect fromphagocytosis

Secreat liquid with monosaccharides, proteins and peptides: to increase their bond sterenght

Au

reu

sFacultative anaerobic bacteria

Gram Positive Bacteria

Produce diseases like

Main cause of nosocomial infections: passingeasily into the bloodstream

Pollysaccharide cell envelope: increase adhesioncapacity, prevents recognition, reinforces it´santiphagocytic effect

INTRODUCTION

Benign skin infections: folliculitis

Benign mucosalinfections: conjunctivitis

Life threateningdiseases: ostomyelitis, meningitis, sepsis, pneumonia

INTRODUCTION

Methicillin

Beta-lactamantiobiotic

Was used totreat

infections

Caused bygram positive

bacteria

That produce beta-

lactamase

INTRODUCTION

Methicillin

MODE OF

ACTION

Inhibiting the synthesis of bacterial

cell walls

Inhibitioncompetitive of transpeptidase

enzyme

Prevents formation of

bonds between the

peptidoglycan chains

INTRODUCTION

Virulence factors

Structural components

Virulence factors Action

Capsule Inhibits chemotaxis and phagocytosis

Extracelular pollysaccharides

Facilites adhesion

Peptidoglycan Stimulates cell lysis and production of endogenous pyrogens

Teichoic acid Staphylococcus adhesion to fibronectin

MSCRAMM Increase tissue adhesion

Protein A Inmune response decreases

INTRODUCTION

Virulence factors

Enzymes

Virulence factors Action

Coagulase Transformation of fibrinogen to fibrin (inmune response decreases)

Hyaluronidase Destruction of hialuronic acid to the spread of s.aureus

Fibrinolysin Dissolves fibrin clots

Lipases Lipid hydrolisis: acumulation of s.aureus

Endonucleases/DNAsa DNA hydrolysis

Beta lactamases

INTRODUCTION

Virulence factors

Toxins

Virulence factors Action

Cytotoxins Destroys cells

Exfoliative toxins Cutaneous damages

Enterotoxins Gastrointestinal problems by openin channels

TSST-1 Toxic shock: lymphocyte activation for citokine production

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)

Infection that doesnt improve with the first line of antibiotics

Acquired in the hospital or in the community

HAChilean clone

Brazilian clone

CA USA 300

Virulence factors: severity of infectionsProteolytic activity, toxic and litic effects

Frequent in patients with weakenedinmune systems

INTRODUCTION

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)

INTRODUCTION

Symptoms and sings

Skin: red, swollenand sore

Secretionof pus

Woundsthat dont

heal

Chestpain

Cough

Shortnessof breath

Fatigue

*OBJECTIVE

OBJECTIVE

To determine the molecular epidemilogy and presence of virulence genes in community-acquired (CA) and hospital-acquired (HA) methicillin-resistant Staphylococus aureus

(MRSA) insolates and their relationship to clinical outcomes.

*Materiales y métodos

MATERIALES Y MÉTODOS

Población de estudio

Junio 2006-Diciembre 2007

Mayores de 18 años

Hospitales de 3° nivel

Muestras clínicas

Enviadas a la laboratorio de referencia

Datos clínicos

Infección

Resultado

Recaída

Mejora

Muerte

30 días

Sangre

Secreciones

Tejidos blandos

Heridas

Aislados bacterianos y cepas de referencia

Mu50

TC146

USA 300-0114

JCSC4744

JCSC2172

81/108

JCSC4469

NPS123

USA500

FRI1151

MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES Y MÉTODOS

PRC: Reacción en cadena de polimerasa

*Kary Mullis --- > 80´s

*Amplificación directa de un gen o un fragmento de DNA*Incremento en el número de copias de un DNA en corto tiempo

MATERIALES Y MÉTODOSPRC

DESNATURALIACIÓN

HIBRIDACIÓN

REPLICACIÓN

MATERIALES Y MÉTODOS

PRC: ¿Qué necesito?

*DNA plantilla*Primer*DNA polimerasa*Buffer

PRC: ¿Para qué?

*Clonación*Establecer polimorfirmos*Dx enfermedades genéticas*Medicina Forense*Detección de microorganismos infecciosos

PRC y el staphylococcus aureus resistente a la meticilina???

MATERIALES Y MÉTODOS

Confirmar especie y resistencia a meticilina.

*Enterotoxina*Exfoliativa*Hemolisina*Shock Tóxico*Protíenas adhesivas

Presencia de

PFGE: Electroforesis en gel de campo pulsátil

MATERIALES Y MÉTODOS

*Schwartz y Cantor: 1984

MATERIALES Y MÉTODOS

PFGE: Electroforesis en gel de campo pulsátil

ELECTROFORESISUtilización de corriente eléctrica

controlada

Separación de biomoléculas según:

Carga Tamaño

MATERIALES Y MÉTODOS

PFGE: Electroforesis en gel de campo pulsátil

*Reducción del movimiento de las moléculas utilizando un medio que oponga resistencia =GEL

Los fragmentos son sometidos a cargas eléctricas en diferentes direcciones.

MATERIALES Y MÉTODOS

PFGE: Electroforesis en gel de campo pulsátil

*Separación de grandes fragmentos de DNA

Induce reordenamiento por cambios eléctricos periódicos constantes

Duración en el campo eléctrico determina el tamaño del fragmento.

MATERIALES Y MÉTODOS

Susceptibilidad antimicrobiana Métodos para determinar la susceptibilidad de los organismos a

agentes antimicrobianos.

*Oxacilina*Gentamicina*Rifampicina*Eritromicina*Ciprofloxacina*Vancomicina*Linezoild*Tetraciclina*Clindamicina*Trimetropim*Sulfametoxazol

MATERIALES Y MÉTODOS

Susceptibilidad antimicrobiana

Recomendaciones para establecer la terapia mas

adecuada para un paciente

MATERIALES Y MÉTODOS

Análisis estadístico

Basándose en:Mejoría

Mortalidad

*RESULTADOS

RESULTADOS

Se obtuvieron diferentes patrones de los 270

aislados

• F, U, D, G, H, K,O y P

Por PFGE buscando relación genética con

• Clon Chileno, Clon USA300-0114, Clon pediátrico

RESULTADOS

• 162 (60 %)

• Clon Chileno -relación genética (>78,8%)

PATRÓN F

• 86(31,8%)

• USA300-0114 –relación genética (>79%)

PATRÓN U

• 4(1,5%)

• Clon pediátrico–relación genética (79%)

PATRÓN D

RESULTADOS

• ST1110 - 2 aislamientos

Clon Chileno – gen arcC

• ST1111 – 1 aislamiento

Clon Pediátrico – gen arcC

ANÁLISIS POR MLST

RESULTADOS

RESULTADOS

TIPIFICACION POR SCCmec

Patrón U

82 – Tipo IVc / 3 – Tipo IVa / 1 – Tipo IVb

Patrones F y D

Tipo I y IV

Patrón G

9 – Tipo II

1- Tipo I

RESULTADOS

Factores de Virulencia

• Genes sem, sen y seo (184), seg (173), sei (154) ------- Grupo de genes de la enterotoxina ( EGC )

• Toxina exfoliativa A (52 CA-MRSA y 171 HA-MSRA)

• Toxina exfoliativa B (4)

• Genes sej and seg (2 HA-MRSA)

• Genes sek, seq y lukF-PV/luckS-PS (CA –MRSA)

• Proteínas de unión a fibronectina A y B (CA-MRSA)

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOS

MORTALIDAD • Relación entre la mortalidad y lainfección por HA – MRSA encomparación con CA-MRSA ( 21 vs10,6 %)

• Aumento en mortalidad en pacientescon bacteriemia (45,9%), neumonía (43,8%), en comparación con infecciónen el sitio quirúrgico (10,8%)

• Existen relación directos entrefactores de virulencia y patologíasdesarrolladas

*DISCUSSION

DISCUSSION

INVESTIGATORS IDEA AGREE OR DISAGREE

Ferry T, Thomas D, Genestier AL, Bes M, et al.

Described a greaterprevalence of the egc –positive isolates recoveredfrom surfaces infectionscompared to invasiveinfections.

Ferry T, Thomas D, Genestier AL, Bes M, et al

Observed a negativerelationship between theegc cluster and clinicalseverity

DISCUSSION

INVESTIGATORS IDEA AGREE OR DISAGREE

Van Belkun A, Melles DC, Snijders SV et al

They did not find anyevidence of an associationof the egc cluster withmortlity in patients withMRSA- related bacteremia.

Bae IG, Tonthat GT, Stryjewsky ME et al

They found a paradoxicallyhigther rate of clinicalhealing through thepresence of some adhesivegenes

*CONCLUSIONS

CONCLUSIONS

*Staphylococcus aureus is a microorganismthat causes problems in hospitals, becausewhen people go to the hospital for manysurgeries can be infected with the organism

*The high quantity of isolates of MRSA are a major problem for atreatment, this microorganism is difficult to eradicate because when wewant kill the pathogen agent, we found that each clones of MRSA has aimportant number of isolates with genomic differences between its.

CONCLUSIONS

*The types of MRSA ( USA300-0114, pediatric yChilean ) has many genes that generate thedifferent between its, that to permite separatethe isolates in families. The genetic variabilityis essential as a survival mechanism of theorganism.

*This article is very important because the investigators developed astudy for explain the molecular and genetic causes in Staphylococcusaureus infection, based in identify the genetic variability, then whenthey identified the genes that generate differences between clones, theinvestigators found the relationship between genes and diseases

Manuela Rendón Díez