seleks - oyilmaz.orgoyilmaz.org/document/bt2.pdf · olanak tanıyan otomasyon sistemleri geli...
TRANSCRIPT
SELEKSİYONA YARDIMCI MARKERLAR(Marker Assisted Selection)
Geleneksel olarak bireylerin kendisini, atalarını ve varsa döllerinin bilgilerini içeren kriterlere göre seleksiyon yapılmaktadır. Elde edilen tüm bu bilgiler geliştirilmiş istatistik metotlar ile değerlendirilerek bireyin damızlık değeri elde edilir.
Son yıllarda moleküler genetik biliminde meydana gelen gelişmeler sayesinde belirli bir özellik için seleksiyon DNA işaretleyicilerinin sağladığı bilgiye göre yapılabilmektedir.
MAS
Seleksiyona yardımcı işaretleyiciler seleksiyonda sağlanan ilerlemeyi iki şekilde artırmaktadır bunlar;
1. İstenen özellik için hangi hayvanın en iyi nitelikte olduğu daha isabetli tahmin edilir. Böylece gerçekten nitelikli hayvanların seçimindeki isabet artar.
2. Generasyon aralığı kısalır Seleksiyona yardımcı markerlar gelecekte geleneksel
seleksiyon yönteminin yerini almasa da seleksiyona ek bilgi sağlaması bakımından önemlidir (DeNise, 1994).
MAS
Bazı durumlarda DNA’nın bir bölgesi bireyin tam olarak fenotipini belirlemektedir. Bu tip DNA bölgeleri büyük etkili kantitatif karakter lokuslarıolarak adlandırılır.
Avusturalya merinosu koyunlarında bulunan Booroola geni, Belçika mavi sığırında bulunan Çift kaslılık geni bu genlere örnek olarak verilebilir.
GEN AKTARIMI
Genomda istenilen bir dizinin izole edilip başka bir genoma aktarılması ile gerçekleştirilmektedir.
Bu teknolojide gen veya genler döllenmiş yumurtaya aktarılır.
Gen Aktarımının Çiftlik Hayvanları Yetiştiriciliğini Etkileyeceği AlanlarGenom haritalarının çıkarılması ile genler
arasındaki ilişkiler, işleyiş mekanizmaları ve Kantitatif Karakter Lokusları belirlenebilmektedir.
Hastalıklara ve parazitlere karşı direnç sağlayan genlerin hayvanlara aktarılması
insan genlerinin hayvanlara aktarımı sağlanarak insan için yararlı tıpta kullanılacak biyomedikal maddeler, hücreler, dokular ve organlar elde edilebilir.
Cinsiyetin belirlenmesinde rol alan genlerin aktarılması ile cinsiyetin kontrolü mümkün olabilecektir.
1990 yılında Tracy adında bir koyuna, insanlarda bazı akciğer hastalıklarının tedavisinde kullanılan alpha-1-antitrypsin (AAT) enziminin genetik kodu aktarılmıştır. Ve Tracy büyüdükten sonra sütünün her litresinde yaklaşık 40 gram AAT salgılamaya başlamıştır.
(http://www.yildizindunyasi.net/bilim%20dunyasi/klonlama-2.htm )
GEN AKTARIMI
GENETİK KOPYALAMA
Bir canlının bütün özellikleri o canlının her hücresinin çekirdeğindeki genlerinde bulunur.
Her canlının DNA yapısı farklı dolayısıyla özellikleri de farklıdır. Genetik kopyalama bir canlı ile aynı genetik bilgiye yani aynı DNA yapısına dolayısı ile aynı özelliklere sahip başka bir canlı üretmektir.
1997 yılında İskoçya'nın Edinburg şehrindeki RoslinEnstitüsünden Dr. Ian Wilmut ve ekibi bir koyunun meme bezinden aldıkları hücrenin çekirdeğini metafazsafhasındaki yumurta hücresine aktararak genetik kopyalamayı gerçekleştirmişler ve bunun sonucunda Dolly adlı kuzu dünyaya gelmiştir.
KOPYALAMA
Meme hücresinin alınması Hücre Çekirdeği
Ergin Koyundan Yumurta Hücresinin
Alınması
Yumurta Hücresinin Çekirdeğinin Çıkarılması
Yumurta Hücresi
İki Hücre Elektik Şoku ile Birleştirilmesi
Birleştirilmiş Hücre
Birleştirilmiş Hücrenin Normal Olarak Bölünmeye başlaması
Embriyo
Embriyonun Taşıyıcı Hayvana verilmesi
Taşıyıcı Hayvan
Klonlanmış Kuzu
Verici Hayvan
Hayvancılıkta Genetik Kopyalama
Moleküler biyoloji ve istatistik bilimindeki son
gelişmeler
Büyük etkili kantitatif karakter lokuslarının (QTL)
tanımlanması ve kullanılması
Genomik varyasyonun tanımlanmasını ve
kullanılması
Hayvansal üretimde hayvanların bireysel olarak tanımlanmasıhayvan ıslahı programları için oldukça önemlidir.
Hayvanların tanımlaması için başlangıçta kullanılan kangruplarının tiplendirilmesi ve biyokimyasal polimorfizmlerinizlenmesi, DNA işaretleyicileri (marker) kadar etkili olmamıştır.
Bu DNA baz dizisinde meydana gelen varyasyonunu tanımlamak için DNA temeline dayalı çeşitli teknolojiler geliştirilmiştir. Bu teknolojiler moleküler genetik işaretleyiciler (Marker) olarak bilinmektedir.
Moleküler Markerların
kullanımı
DNA baz sıralarının
belirlenmesiBabalık testleri
Gen haritaları
çıkarılması
Genlerin tespiti
RekombinantDNA
teknolojisiQTL Tespiti
Hayvasal ürünlerin
orjinlerinin belirlenmesi
Evrim tarihi
Genetik Varyasyon
tanımlanması
RAPDRastgele
Çoğaltılmış Polimorfik
DNA
RAPDRastgele
Çoğaltılmış Polimorfik
DNA
RFLPKesilmiş Parça
Uzunluk Polimorfizmi
RFLPKesilmiş Parça
Uzunluk Polimorfizmi
AFLPÇoğaltılmış
Parça Uzunluk Polimorfizmi
AFLPÇoğaltılmış
Parça Uzunluk Polimorfizmi
STRMikrosatellit
STRMikrosatellit
SNPTek NükleotitPolimorfizmi
SNPTek NükleotitPolimorfizmi
RAPD Yöntemi (Rasgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA)
İlk olarak Williams ve arkadaşları tarafından 1990 yılında insan DNA’sında kullanılan RAPD yöntemi nükleotit dizileri hakkında herhangi bir bilgiye gereksinim duyulmadan şansa bağlı primerler kullanılarak her canlı türünde uygulanabilmektedir.
Bu teknikte genellikle 10 nükleotid uzunluğundaki primer(başlatıcı) kullanılarak genom üzerinde rastgele bölgelerin DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir.
Reaksiyon şartlarının spesifik olmaması rastgele çoğaltıma izin verir.
Üretimi yapılan DNA parçaları (amplikon) agaroz jel üzerinde elektroforeze tabi tutulduğunda bazı parçaların bazı genotiplerde üretilip bazılarında üretilmediği gözlenir
DNA üzerinde tesadüfi bölge çoğaltılmasını sağlar Düşük miktarda DNA yeterlidir (5–50ng)Çabuk sonuç veren bir analiz yöntemidir Diğer tekniklere göre düşük maliyetlidir Yüksek polimorfizm gösterirÇok yönlü bantlar üretir Diğer yöntemlerin aksine radyoaktif madde kullanılmaz
RAPD YÖNTEMİNİN AVANTAJLARI
RAPD YÖNTEMİNİN DEZAVANTAJLARI
Saf, yüksek molekül ağırlıklı DNA gerektirir DNA parçalarının çoğaltılabilmesi için tesadüfi primerler
kullanılır Reaksiyon hassas olduğundan deneme için kullanılan
yöntemin son derece standartize olması gerekir Polimorfizm oranı diğer işaretleyicilerden düşüktür Tekrarlanabilirliği zayıftır.
RAPD YÖNTEMİNİN HAYVANCILIKTA KULLANIMI
Genetik Çeşitlilik Çalışmaları Binbaş ve Cemal, 2006; Elmacı ve ark., 2007; Ali, 2003; Kumar ve ark., 2008
Akrabalık Düzeyinin Belirlenmesi Bhattacharya, 2003Genom Haritalarının Çıkarılması Botstein ve ark., 1980.Genetik Markerların Tespiti Rao, ve ark., 1996Hayvansal Ürünlerin OrjinlerininBelirlenmesi
Ahmed, 2005
RFLP YÖNTEMİ(Kesilen Parça Uzunluk Polimorfizmi)
RFLP yöntemi 1960’lı yıllarda restriksiyon endonükleazlarınkeşfini takiben geliştirilmiştir.
İlk başarılı genetik haritalama çalışmalarında RFLP işaretleyicileri kullanılmıştır.
DNA’da oluşan mutasyonları veya polimorfizmi ortaya koyan ve restriksiyon enzimi ile kesim sonucu oluşan değişik boydaki DNA segmentlerini belirlemeye yönelik bir yöntemdir.
Restriksiyon enzimleri, restriksiyon bölgeleri olarak bilinen çift zincirli DNA'nın sadece spesifik baz dizilerini tanımakta ve diziyi bu bölgelerden kesmektedir.
RAPD yöntemine göre iki kat fazla bilgi sağlar Prob olarak cDNA klonları kullanılabilir. Laboratuarlar arasındaki uyum oldukça iyidir
RFLP YÖNTEMİNİN AVANTAJLARI
Diğer marker metotlarına göre pahalı ve zaman alıcıdır. Her prob ile sadece bir polimorfizm ortaya konmaktadır. Bazı durumlarda mutasyonlar restriksiyon endonükleaz
tanımlama bölgesinde herhangi bir değişime neden olmaz bu nedenle bazı mutasyonlar bu yöntemle tanımlanamazlar
RFLP YÖNTEMİNİN DEZAVANTAJLARI
RFLP YÖNTEMİNİN HAYVANCILIKTA KULLANIMI
Genetik PolimorfizmlerinTanımlanması
Yılmaz ve ark., 2014a; Yılmaz ve ark., 2014b; Yılmaz ve ark., 2013; Sevim ve ark., 2012, Cemal ve ark., 2009; Ahmed, 2005
Rekombinant DNA teknolojisi Solak ve ark., 2000Genom Haritalarının Çıkarılması Botstein ve ark., 1980.
AFLP YÖNTEMİ(Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi)
Bu yöntem SRAF (Selective Restriction FragmentAmplification) olarak da bilinmektedir.
Genomik DNA’nın restriksiyon enzimi ile kesimi sonucu oluşan DNA parçalarının bir grubunun selektif çoğaltılması esasına dayanan bir genotipleme metodudur
Bu teknik RFLP'den daha hızlı çalışır ve Değişken sayılı bitişik tekrar (VNTR) polimorfizmlerine dayalı alellerayırdedilir, bunlar poliakrilamit jel elektroforezi ile ayrıştırılır.
Bantlar gümüş boyaması ile görülür. Analiz jelde yapıldığı için, çok yüksek sayılı tekrarlar jelin üst kısmında sıkışabilirler ve birbirlerinden ayırdedilmeleri zor olabilir.
AFLP YÖNTEMİNİN AVANTAJLARI
Daha önceden baz dizilerinin bilinmesine gereksinim yoktur.
Her reaksiyonda çok fazla miktarda polimorfizmtanımlanabilir.
Güvenilir bir yöntemdir. Standardizasyonu sağlanabilir. Elde edilen ürün sürekli olarak çoğaltılabilir.
AFLP YÖNTEMİNİN DEZAVANTAJLARI
Sadece seçilen alleller tanımlanır.Genomların büyüklüğüne göre adapte edilebilen farklı
kitlere gereksinim duyarlar.
AFLP
AFLP YÖNTEMİNİN HAYVANCILIKTA KULLANIMI
Genetik PolimorfizmlerinTanımlanması
Foulley ve ark., 2006; Shengve ark., 2004
Parmak izi teknolojisi Marsan ve ark., 1997; Negrinive ark., 2007; Utsunomiya ve ark., 2014
Mikrosatelitlerin bulunması Nijiman ve ark., 1999, Santanave ark., 2009
Genetik haritalama ve QTL tarama
Otsen ve ark., 1996; Barendseve ark., 1994
MİKROSATELİTLER (STR)
Birçok ökaryotik genomunda nispeten homojen aralıklarla bulunan, 2-5 bazlık ardışık basit tekrarlardan oluşan kısa DNA zincirleri mikrosatellit olarak adlandırılmaktadır.
Yapılan çalışmalarda mikrosatelitlerin genellikle dinükleotittekrarları şeklinde olduğu bildirilmiştir
Mikrosatellitler standart PCR yöntemleri ile çoğaltılabilirler Yüksek düzeyde polimorfizm gösteren mikrosatellitler
mutasyonların detaylı olarak analizine olanak tanır.
Mikrosatellitlerle yapılan analizlerde, alleller arasındaki küçük farklılıklar oldukça önemlidir bu nedenle alleluzunluklarının belirlenmesinde genetik analizörler gibi otomasyon sistemlerinin kullanılması çalışmanın hassasiyetini artırmaktadır.
Mikrosatellitler; DNA’nın kodlanmayan bölgelerinde tüm genoma yayılmış durumda bulunurlar ve çok sayıda kodominant allele sahiptirler.
MİKROSATELLİT YÖNTEMİNİN HAYVANCILIKTA KULLANIMI
Irk içi ve ırklar arası genetik çeşitliliğin saptanmasında
Yilmaz ve ark., 2014; Yilmazve ark., 2015; Cemal ve ark., 2013; Öner ve ark., 2014; Hoda ve Marsan, 2012; Özşensoy ve Kurar, 2014
Babalık Testleri Yılmaz ve Karaca, 2012; Araujo ve ark., 2010; Tian ve ark., 2008; Sherman ve ark., 2004
Tehlike altındaki populasyonlarındurumlarının belirlenmesinde
Whitehouse ve Harley, 2001; Mahmoudi ve ark., 2012; Mahmoudi ve ark., 2013
Genom Haritalama Groenen ve ark., 2000; Rohrerve ark 1994;
DNA’daki tek nükleotit değişiklikleri olarak adlandırılır. Genetik koddaki tek bir nükleotit değişimine bağlı olması
nedeniyle SNP’deki DNA varyasyonunun formu mikrosatellitlere göre daha basittir.
SNP (Tek Nükleotit Polimorfizmi)
Genetik varyasyonun %90’ını oluşturan SNP’lerotomasyona yüksek düzeyde uyum sağlamaları ve diğer işaretleyicilere göre daha duyarlı analizlerin yapılmasına olanak tanımaları nedeniyle hayvancılıkta son yıllarda oldukça geniş bir kullanım alanı bulmuşlardır.
Gen kodlayan bölgelerde görülen SNP varyantları, bir proteinin amino asit sekansını değiştirmekte ve protein fonksiyonunu doğrudan etkilemektedir
Gen kodlayan bölgelerdeki SNPs’in sayısının 10000-50000 dolaylarında olduğu tahmin edilmektedir.
Günümüzde aynı anda çok fazla sayıda SNP’in analizine olanak tanıyan otomasyon sistemleri geliştirilmiştir.
Meydana gelen bu gelişmeler sayesinde yüksek çözünürlüğe sahip SNP çipleri sayesinde genom boyu ilişki analizleri gerçekleştirilebilmektedir.
Elde edilen bilgiler ışığında genomik seleksiyon olanaklı bir hale gelmiştir.
SNP YÖNTEMİNİN HAYVANCILIKTA KULLANIMI
Genetik Çeşitlilik Pariset ve ark., 2006; Pryce ve ark., 2012
Babalık Testleri Hill ve ark., 2008; Harlizius ve ark., 2011; Heaton ve ark., 2014
Genomik Seleksiyon Çalışmaları Daetwyler ve ark., 2012; Eggen, 2012; Goddard ve Hayes, 2007; Slack-Smith ve ark., 2010
Genom Haritalama Kijas ve ark., 2009
RAPD RFLP AFLP STR SNPTarama Yöntemi
PCR PCR PCR PCR PCR
Primer Tipi Rastgele Primer
Diziye Özel Primer
Diziye Özel Primer
Diziye Özel Primer
Diziye ÖzelPrimer
Polimorfizm Tipi Orta-Yüksek
Düşük Orta-Yüksek
Yüksek Yüksek
Otomasyona uyum
Evet Evet Evet Evet Evet
Güvenilirlik Düşük Yüksek Orta Yüksek YüksekFenotipikifadesi
Dominant Kodominant
Dominant Kodominant
Kodominant
MOLEKÜLER İŞARETLEYİCİLERİN KARŞILAŞTIRILMASI
DNA DİZİ ANALİZİ ?Gen yapısı ve genetik kontrol
mekanizmaları hakkında bir çok bilgi edinmemizi sağlamıştır
Herhangi bir canlıya ait DNA örneğindeki baz diziliminin ortaya çıkartılması işlemidir.
Bir bölgenin dizilimi çıkartılabileceği gibi canlıya ait tüm genom dizilişi de çıkartılabilmektedir
DNA Dizi Analizi İle İlgili Çalışmalar1964- Robert HOLLEY 74 nükleotidlik bir tRNA molekülünün dizi analizi1977- Allan MAXAM - Walter GILBERT1977- Frederick SANGER1982- Akiyoshi WADA (Otomatik Analiz Önerisi)1986- Leroy HOOD ve Llyod SMITH -Tam otomatik analiz makinasının
bulunması1990 -Edward UBERBACHER tarafından bir gen bulma programı olan
GRAİL kullanılmaya başlanmıştır1992- 21. kromozomun DNA Dizi Analizi tamamlanmıştır2000- İnsan Genom Projesi katılımcıları ve Celera’ nın insan gen
haritası taslağını tamamladığı açıklanmıştır.2003- yılında Whitehead Enstitüsünde görevli David PAGE ve
arkadaşları Y kromozomunun dizi analizini tamamlamışlardır
DNA DİZİ ANALİZİDNA DİZİ ANALİZİ
Geleneksel Yöntem Geleneksel Yöntem
Maxam ‐ GilbertMaxam ‐ Gilbert Sanger ‐ CoulsonSanger ‐ Coulson
Yeni Nesil YöntemlerYeni Nesil Yöntemler
Her iki geleneksel yöntem üç temel basamaktan oluşmaktadır.• DNA’nın hazırlanması• Reaksiyonlar• Yüksek voltajlı jel elektroforezi
Günümüzde Sanger – Coulson yöntemi daha yaygın kullanılmaktadır.
MAXAM‐GİLBERT YÖNTEMİ(Kimyasal Kırılma Yöntemi)
Allan MAXAM ve Walter GILBERT tarafından geliştirilmiş bir yöntemdir.
DNA’nın kimyasal yöntemlerle istenen bazlardan kırılması ve hedef nükleotidlerden kırılmış DNA parçaları elde edilmesine dayalı bir yöntemdir.
Walter GILBERT
Purin bazlarının (G-A) kırılmasında dimetilsülfat
Pirimidin bazlarının (C-U-T) kırılması ise hidrazinenzimi ile yapılır.
a. Baz sıraları saptanması istenen DNA, spesifik restriksiyon endonukleaz (Örn., EcoRI) ile kesilerek değişik boylarda çift iplikçikli DNA fragmentleri elde edilir.
b. Nükleotid dizisi saptanacak olan DNA fragmenti 5’-ucundan 32P ile ya da floresan bir boya ile işaretlenir.
c. Radyoktif fosforla işaretli olan bu çift iplikçikler çeşitli yöntemlerle (ısı, NaOH, vs.) denatüre edilerek tek iplikçiklihale getirilirler. • Bu denatüre süspansiyon, 4 eşit kısma ayrılarak tüplere
taksim edilirler. • Tüplerin her birine, çok kontrollü miktar ve süre de spesifik
bazları parçalayan bazı kimyasal maddeler (dimetil sulfat, hidrazin, formik asit, piperidin, vs.) katılarak etkilemeleri sağlanır. Bu maddeler, bir DNA segmentinde sadece bir tür baza etkileyecek tarzda ayarlanmışlardır.
Birinci tüpteki işaretli ve tek iplikçik DNA fragment süspansiyonuna guaninine (G) etkileyen dimetil sülfat (DMS) eklersek bu madde bir segmentte bulunan guaninlerden birine etkileyecek diğerleri ise sağlam kalacaktır.
İkinci tüpe hem guanin (G) ve hem de adenini (A) etkileyen kimyasal maddeler katılır ve reaksiyonunun sağlanması beklenir. Reaksiyonunun sonunda DNA segmentlerindeki hem guanin ve hem de adenin bazları parçalanır.
Üçüncü tüpe sadece timini (T) etkileyen madde katılır. Bu baz parçalanır.
Dördüncü tüpe ise hem timin (T) ve hem de sitozini(C) etkileyen maddeler katılarak reaksiyona bırakılır. Bu tüpte timin ile sitozinbazları parçalanır.
G G+A T T+C
Bu 4 tüpte reaksiyonların sonunda çok değişik boylarda DNA segmentleri meydana gelecektir. Ancak, bunların içinde uçları 32P ile işaretlenmiş
olanlar önemlidir. Birinci tüpte değişik boyda ve sadece G-
bazlarından kesilmiş segmentler bulunacaktır, İkinci tüpte, hem G ve hem de A bazlarından
kesilmiş fragmentler vardır.Üçüncü tüpte,sadece T-bazlarından kesilmiş
fragmentler bulunur. Dördüncü tüpte de, hem T- ve hem C bazlarından
kesilmiş DNA segmentleri vardır.
Bu tüpler ayrı ayrı agarosegel elektroforezise (veya poliakrilamid gel elektroforezis, PAGE) tabi tutularak, elektriksel ortamda, boylarına göre (molekül ağırlıklarına göre) büyükten küçüğe doğru bir seperasyona tabi tutulurlar. Jel üzerinde, büyük segmentler baş tarafta ve küçük segmentler de karşı uç da yer alacaklardır.
Dört tüp için elde edilen bantlar birbirleriyle karşılaştırılır ve değerlendirilmesi yapılır.
1.tüpe ait sütunda, 3 tane G bandı, 2. tüpe ait sütunda, 3 tane G bandı ve 3 tane de A bandı (toplam 6 bant), 3. tüpe ait sütunda, 2 tane T bantı, 4. tüpe ait sütunda, 2 tane T bantı ve 2 tane de C bandı bulunacaktır (toplam 4 bant).
GCAGTACGAT
GCAGTACGAT
SANGER‐COULSON YÖNTEMİ(Zincir Sonlandırma Yöntemi)
DNA dizi analizinde kullanılan diğer bir yöntem de Fred SANGER ve arkadaşlarının geliştirdiği yöntem olan zincir sonlanma yöntemidir (Sanger et al., 1977).
Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır ve günümüzün en yaygın kullanılan DNA dizi analizi tekniğidir.
Bu yöntemde dizisi saptanacak olan DNA ipliği yeni sentezlenecek iplik için kalıp olarak kullanılır.
Fred SANGER
Bu yöntem için;dNTP’lereddNTP’lereTek iplikli kalıp DNA’yaKlenov, Taq DNA polimeraz , ters transkriptaz
veya sekuenaz enzimineSerbest OH grubu içeren primere ihtiyaç duyulur
Sanger metodu PCR’ın işleyişine benzemektedir. DNA tek zincir haline getirilir. Reaksiyona girecek olan
karışımda 4 çeşit normal nükleotid bol miktarda bulunur. Bunlar: dATP - dGTP – dCTP - dTTP
Karışımda aynı zamanda dizilimi rastgele sonlandırmak için farklı renklerde floresan ile işaretlenmiş dideoxynucleotidler bulunmaktadır. Bunlar ddATP –ddGTP – ddCTP - ddTTP
Sekanslama reaksiyon karışımı İşaretli primer Kalıp DNA’yı içerir. Hem çift, hem de tek zincirli
DNA kullanılabilir. Yöntemin birinci aşamasında polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tekniği ile elde edilen ve çoğaltılan DNA parçası kalıp DNA olarak adlandırılır
Sekanslanacak kalıp bölgesi
-3′ OHTCGACGGGC…
5′OP-
Primer
Kalıp DNA
Dideoksinükleotidler dört tüpün her birine ayrı ayrıilave edilmiştir
ddATP + ddADÖRT (4) dNTPs dAdGdCdTdGdCdCdCdG
ddCTP + dAdGddCdAdGdCdTdGddCdAdGdCdTdGdCddCdAdGdCdTdGdCdCddC
ddGTP + dAddGdAdGdCdTddGdAdGdCdTdGdCdCdCddG
ddTTP + dAdGdCddTdAdGdCdTdGdCdCdCdG
A
C
G
T
DÖRT (4) dNTPs
DÖRT (4) dNTPs
DÖRT (4) dNTPs
ddGTP ddATP ddCTP ddTTP
1.Tüp 2. Tüp 3. Tüp 4. Tüp
-3′ OH5′OP-
Primer
DNA Polimeraz
Kalıp DNA
dNTPs
Sanger Yöntemi
Enzim eklenir (DNA polymerase), primer ddNTP’lerkarşılaşıncaya kadar uzatılır.
Zincir ddNTP’lerin birleşmesi ile son bulur. Sonlanan zincirlerin sonunda reaksiyona eklenen
ddNTP’ler bulunmaktadır. Toplanan fragmentler sekanslama merdivenini
(sequencing ladder) oluşturur. Sonlanan zincirler elektroforez yöntemi ile gözlenebilir
G A T C
3′GGTAAATCATG5′
Uzun fragmentler
Kısa fragmentlerddG
ddG
Otomatik DNA cihazlarının gelişmesi ile poliakrilamid jellerin yerini polikarbon bileşikleri olan polimerler almıştır. Bu polimerler yoğunluklarına göre farklı ayrım gücüne sahiptirler.
Kullanılan polimer otomatik cihazlarda çapları milimetreden küçük olan cam kapilerler içine yüklenirler. Cihazlarda kapillerelektroforez gerçekleştirilir.
Kapiller elektroforez degrade DNA’larla yapılan çalışmalarda, düşük miktarda PCR ürünü bulunduğu durumlarda geleneksel jel elektroforezine göre daha etkin sonuç vermektedir.
Bu yöntemin standart sapması 0,075-0,1175 baz çifti arasında değişmektedir.
Bu nedenle kapiller elektroforez standart sapması 0,2 baz çifti olan geleneksel jel elektroforezinden daha etkin ayrım yapılabilmektedir.
ABI 310 Genetik Analiz Cihazı (5 farklı flüoresan) veya BeckmanCoulter cihazı (4 farklı flüoresan) rengi aynı anda algılayabilir. Bu özelliği nedeniyle dizi analiz reaksiyonu tek bir reaksiyon tüpünde gerçekleştirilir.
Genotip belirlemede çoklu renk algılama sistemi değişik renklerle işaretlenmiş çeşitli büyüklüklerdeki birden fazla PCR ürününü aynı anda inceleme imkanı sağlar.
Yeni nesil sekanlama yöntemlerinde Sanger’in DNA dizilimi çözme yöntemi geliştirilerek her bir tepkimede kullanılan ddNTP’ler değişik renkli floresanlarla etiketlenir.
Bu teknoloji ile binlerce nükleotidlik bir DNA’nın dizilimi birkaç saatte çözümlenmektedir.
Bu sayede daha büyük DNA dizilimleri bulunmaya başlanmıştır
Yeni Nesil Analiz Sistemlerinden Bazıları
ABI 310 Beckman Coulter SEQ 8000-8800-GXP ABI Solid Illumina Solexa Roche 454 HeliScope Ion Torrent
Full insan genom sekanslaması için çıkarılmıştır. Çalışma prensibi olarak pH metre ile aynı prensibi
kullanmaktadır. Çipin içine sekanslayacağımız örneği yükleriz. Yüklediğimiz örnek, çipin altındaki çok sayıdaki
kuyucuklara şansa bağlı bir şekilde dağılır.
Cihaz bu kuyucukların içine her bir seferde dNTP’lerden(A,T,C,G) birini gönderir.
İçerideki tek iplik halinde bulunan DNA’nın komplomentlerinioluştururken bağlanan baz ile birlikte H+ iyonu açığa çıkar.
Bu açığa çıkan H+ iyonu sayesindeki meydana gelen pHdeğişimi ile cihaz kuyuya gönderilen NTP (A,T,C,G) bazlarından hangisinin bağlandığını tespit eder.
Aynı bazın birden fazla bulunduğu durumlarda çıkan H+ iyonuna göre oluşan pik yüksekliği kaç bazın ard arda bulunduğunu gösterir.
Çiftlik Hayvanlarında DNA Dizi Analizi
Hayvan genomunda varyasyonların varlığının saptanmasından sonra moleküler genetikte verimlerden sorumlu genlerin yerlerinin tespitinde kullanılan başlıca yöntemler bağlantı ve asosiasyon analizlerini içeren LD (Linkage Disequilibrium) haritalaması yöntemleridir.
Bu yöntemlerin hedefi gen işlevi hakkında bir önbilgi olmadan verim veya hastalık ile ilişkili olan genlerin genomdaki adreslerinin belirlenmesidir.
DNA dizi analizi ile bütün genomun veya bazı DNA bölgelerinin dizilişi çıkartılarak verimle ilişkilendirilmeye çalışılmaktadır.
DNA dizi analizi temelli yeni yöntemler gen-verim veya gen-hastalık bağlantılarının kurulmasında LD-haritalama yöntemlerinin yerini almaya başlamıştır.
Genom diziliminin çıkartılması bireyler arası tek nükleotid farklılıklarının (SNP: Single Nucleotide Polymorphisms) belirlenmesine ve bu farklılıklarla verim ilişkilerinin belirlenmesine olanak tanımıştır.
Son zamanlarda geliştirilen SNP çipleri ile aynı anda bir DNA örneğinde yüz binlerce hatta birkaç milyon nükleotid farklılığının belirlenmesi, bu bilgilerin ıslah programlarında kullanılmasının yolunu açmıştır.
Tüm bu gelişmeler doğrultusunda DNA dizi analizinin çiftlik hayvanlarında uygulanması ile; Babalık testleri yapılabilmekte Irklar arası farklılık daha ayrıntılı tanımlanmakta Irklarda bireyler arası farklılıklar belirlenmekte SNP çipleri ile genotipleme yapılabilmekte Verimlerle ilgili genom bölgeleri belirlenebilmekte Akrabalık ilişkileri tanımlanabilmekte Fenotipe dayalı bilgilerin yanında genom bilgileri de
kullanılarak daha isabetli damızlık değer tahmini yapılabilmektedir.
Gen İfadesi (Ekspresyon)
Gen ifadesi veya gen ekspresyonu, genetik materyalde (DNA) şifrelenen bilginin ürüne dönüştürülmesini yani ilgili genin fonksiyonunu sergilemesidir. Transkripsiyon ve translasyon olaylarının toplamı olarak da tanımlanabilir.
Transkripsiyon: DNA’da saklanan genetik bilgilerin RNA molekülü (mRNA, tRNA, rRNA) sentezi ile kopyalanması veya yazılmasını ifade eder.
Translasyon: Transkripsiyon ile RNA’ya kopyalanan genetik bilginin bir polipeptit zincir (protein) haline dönüştürülmesini ifade eder.
RNA Polimeraz
RNA
DNA kalıbının ilgili bölgesinin kopya dizilimi yani mesajcı RNA (mRNA) RNA Polimeraz enzimi aracılığıyla çıkartılır
Hücrede Protein Sentezi
Protein = Polipeptit zincir Polipeptid büyüklüğü Ortalama
500-550 aa En büyük polipeptid Titin 38138
kodon En küçük polipeptidler onlarca aa
(küçük hormonlar) (aa: amino asit)
mRNA sentezi
• mRNA sentezi sırasında ilk elde edilen RNA molekülü “splicing” işlemi ile işlenerek olgun RNA molekülü elde edilir. Splicing işlemi sırasında “intron” bölgelerine ait bilgiler ayıklanır ve sadece “exon” bölgelerini içeren bilgiler kalır.
Diğer kodlama yapmayan RNA’lar telomer sentezi, X-kromozom inaktivasyonu, proteinlerin ER’ a transferi gibi süreçlerde rol oynarlar
RNA Tipleri ve GörevlerimRNA Haberci RNA, proteinleri kodlarrRNA ribozomal RNA, ribozomların yapısında yer alır ve protein sentezini katalize
edertRNA transfer RNA, aminoasitleri bağlayarak protein sentezinde rol oynarsnRNA küçük nüklear RNA, pre-mRNA kesilmesi ve diğer bazı nükleus içi süreçlerde
rol oynarsnoRNA küçük nükleolar RNA, rRNA modifikasyonunda rol oynarscaRNA küçük kajel RNA, snoRNA ve snRNA modifikasyonumiRNA mikro RNA, gen ekspresyonu regülasyonusiRNA küçük interferans RNA, gen ekspresyonu regülasyonu
DNA kalıbı kullanılarak tamamlayıcı yani komplementer RNA molekülünün
oluşturulmasına “transkripsiyon”, oluşan RNA molekülüne ise “transkript” denir.
Gen Ekspresyonu analizleri• Gen ekspresyonu analizleri ile hangi dokularda hangi genlerin
aktif olduğu belirlenebilmektedir.
• Analizler için önce ilgili dokulardan RNA ekstraksiyonuyapılmaktadır.
• RNA ekstraksiyonu sonrasında mRNA’dan revers transkriptazenzimi kullanılarak tamamlayıcı yani komplementer(complementer) DNA (cDNA) sentezi yapılmaktadır.
• Ardından istenirse cDNA dizilimi (sekansı) çıkartılabilmekte veya bilinen DNA bölgelerinin var olup olmadığı problar aracılığıyla belirlenebilmektedir.
• Microarray çipler aracılığıyla aynı anda binlerce genin ekspresyon gösterip göstermediği belirlenebilmektedir.
Çiftlik hayvanları bağlamında kantitatif teorileri temel alan fenotipik performans verilerine dayalı genotip tahminleri esas alınarak yürütülen klasik ıslah yöntemleri günümüzde de başvurulan en temel yöntemlerdendir.
Kantitatif genetik teoride hayvanların damızlık değerleri fenotipikveriler kullanılarak tahmin edilmektedir
Özellikle fertilite, ömür uzunluğu, yemden yararlanma yeteneği gibi karmaşık ve ölçülmesi zor özellikler söz konusu olduğunda klasik ıslah yöntemlerinin etkinliği azalmaktadır.
Türlerin genetiğine yönelik bilgilerin artması ve DNA düzeyinde tanımlamalara ulaşılması, fenotipe göre işletilen seleksiyon programlarına, genotipe yönelik bilgilerin de eklenmesi ile genetik ilerleme daha üst seviyelere çıkartılabilmektedir
Bu teknikler ile ırklar içi ve arası genetik varyasyon tanımlanabilmekte, gen haritaları çıkarılabilmekte, pedigrikayıtlarının doğrulukları kontrol edilebilmekte ve genomikseleksiyon çalışmaları gerçekleştirilebilmektedir.
Bu tekniklerin klasik ıslah yöntemleri ile birlikte kullanımı önemli bir bilgi birikimini birlikte getirecektir.
Genetik işaretleyicilerin devreye girmesi daha erken yaşlarda bazı özellikler bakımından genetik yapının tam doğrulukla belirlenmesine ve erken yaşta damızlık seçimine olanak tanıyabilmektedir.
29
Ülkemizde mevcut yerli ırkların moleküler genetik düzeyde tanımlanması, ve elde edilen bilgilerin yürütülen / yürütülecek ıslah çalışmalarında kullanılması önemli kazanımlar sağlayacaktır.
Yerli hayvanlarımıza ait DNA örneklerinin bir DNA bankasında depolanması sağlanmalıdır.
Hayvancılık için çok önemli olan ve halen etkin olarak devrede olan klasik ıslah yöntemlerinin DNA belirteçleri ile beraber kullanımı seleksiyon programlarını daha da etkin kılacaktır.
30