selection et identification des souches telluriques
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UNIVERSITE D’ANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES
DOMAINE : SCIENCES ET TECHNOLOGIE MENTION : CHIMIE
DEPARTEMENT DE CHIMIE MINERALE ET CHIMIE PHYSIQUE
MEMOIRE DE FIN D’ETUDE
En vue de l’obtention du diplôme de
MASTER II
Parcours : Génie de l’Eau et Génie de l’Environnement (2GE)
Présenté le 23 Juillet 2015 par :
RANDRIAMISAINA Kanto Aina Natacha
Devant la commission du Jury composée de :
Président : Monsieur Mahandrimanana ANDRIANAINARIVELO, Maître de
Conférences à la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo
Rapporteur : Monsieur Rado RASOLOMAMPIANINA, Maître de Recherches au
Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement
Examinateur : Monsieur Pierre Hervé RAVELONANDRO, Professeur à la Faculté des
Sciences de l’Université d’Antananarivo
SELECTION ET IDENTIFICATION DES SOUCHES TELLURIQUES IMPLIQUEES DANS LA DEGRADATION DES
HYDROCARBURES AROMATIQUES POLYCYCLIQUES (HAP)
Remerciements
REMERCIEMENTS
En premier lieu, J'adresse mes vifs remerciements et reconnaissances pour notre
Seigneur Tout Puissant à qui je dois la vie et la santé. Sans lui, je n’aurai pu réaliser ce travail.
Gloire à DIEU !!
Le présent travail a été réalisé dans le Laboratoire de Physico-chimique et de
Microbiologie de l’Environnement du Centre National de Recherches sur l’Environnement
(CNRE), je tiens à remercier différents responsables de m’avoir accueillie dans leur équipe.
J’exprime également ma profonde gratitude aux personnes citées suivantes :
Monsieur Armand René Panja RAMANOELINA, Président de l’Université
d’Antananarivo ;
Monsieur Marson RAHERIMANDIMBY, Doyen de la Faculté des Sciences ;
Monsieur Tinasoa RAMAMONJY, Maître de Conférences à la Faculté des Sciences de
l’Université d’Antananarivo, Chef du Département de Chimie Minérale et de Chimie
Physique à la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo ;
Madame Fienena Félicitée REJO, Professeur, Directeur du Centre National de
Recherches sur l’Environnement (CNRE) de m’avoir accueillie au sein de cette
institution ;
Monsieur Mahandrimanana ANDRIANAINARIVELO, Responsable de l’option
Chimie des Maréraiux et Maître de Conférences à la Faculté des Sciences de l’Université
d’Antananarivo qui a accepté de consacrer son temps précieux afin de présider ce
mémoire ;
Monsieur Pierre Hervé RAVELONANDRO, Responsable du Parcours Génie de l’Eau
et Génie de l’Environnement (2GE) et Professeur à la Faculté des Sciences de l’Université
d’Antananarivo pour tous les efforts que vous avez déployé en vue d’orienter notre
formation dans les louables voies et de bien voulu examiner et juger cet humble travail ;
Monsieur Rado RASOLOMAMPIANINA, Maître de recherches et Chef de
Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement (LME), rapporteur de ce mémoire, qui
a consacré son temps pour me diriger dans la progression de mon travail et nous a fait
bénéficier de ses expériences et précieux conseils malgré ses multiples activités.
Monsieur, les mots ne suffiront pas pour vous exprimer mes sincères remerciements, vos
commentaires, vos encouragements et ainsi que votre patience m’ont permis d’accomplir
ce travail dans les meilleures conditions ;
Remerciements
Monsieur Yves MONG, Maître de Recherches et Chef de Laboratoire d’Analyse
Environnemental et Qualité de la vie au Centre National de Recherches sur
l’Environnement (CNRE), pour les précieux conseils que vous avez procurez lors de la
réalisation de ce travail ;
Messieurs Lala RAJOELISOA et Wega Leonard ASIMBOLARIMALALA,
Enseignants Chercheurs au Centre National de Recherches sur l’Environnement (CNRE)
pour leurs aides et leurs conseils lors de mes travaux de laboratoire ;
A toute l’équipe du Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement (LME), en
particulier, Madame Onja ANDRIAMBELOSON, Monsieur Clet Marcellin
RABENAIVO et Mademoiselle Hanitrisoa Harimisa ANDRIAMAFANA pour leurs
aides et leurs conseils lors de mes travaux de laboratoire ;
A tous les membres de Jury, qui ont bien voulu juger mon travail, malgré leurs
nombreuses occupations ;
A tous les Enseignants de la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo qui nous
ont fourni les connaissances indispensables à notre formation durant ces cinq années
d’études ;
A tous les membres de ma famille, mes ami (es) et collègues pour leurs soutiens autant
moraux que financiers et sans quoi, je n’aurais pu terminer ce mémoire.
Et enfin, je réitère une reconnaissance particulière pour une personne très spéciale à
mes yeux, c’est sa présence pendant les périodes difficiles dans l’élaboration de ce travail qui
m’a toujours encouragée à continuer. J’espère que tu apprécieras les fruits de tous les efforts
que j’ai mis dans ce livre.
Bref, je ne peux tous assez-vous remercier par ces simples phrases. C’est à travers
l’élaboration de ce mémoire que j’ai compris les intérêts de la solidarité.
Sincères reconnaissances à tous !
Table des matières
TABLE DES MATIERES
GLOSSAIRE ................................................................................................................. i
ABREVIATIONS ............................................................................................................... iv
LISTE DES TABLEAUX ....................................................................................................... vi
LISTE DES FIGURES ........................................................................................................... vii
LISTE DES PHOTOS ........................................................................................................... viii
INTRODUCTION ................................................................................................................ 1
PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ....................................................................................... 3
I.1. LES MICROORGANISMES DANS LES SOLS ........................................................ 3
I.1.1. Activités microbiennes dans les sols ......................................................................... 4
I.1.2. Interactions entre microorganismes .......................................................................... 4
I.2. LES HYDROCARBURES AROMATIQUES POLYCYCLIQUES –
GENERALITES ................................................................................................................... 4
I.2.1. Définition – classification ......................................................................................... 5
I.2.2. Propriétés physico-chimiques des HAP .................................................................... 6
I.2.2.1. Solubilité ..................................................................................................... 6
I.2.2.2. Coefficient de partage octanol/eau .............................................................. 6
I.2.2.3. Pression de vapeur ...................................................................................... 6
I.2.3. Origine des HAP ....................................................................................................... 8
I.2.4. Toxicité des HAP ...................................................................................................... 8
I.2.5. Distribution des HAP .............................................................................................. 10
I.2.6. HAP dans les sols .................................................................................................... 10
I.3. BIODEGRADATION DES HAP ............................................................................... 10
I.4. DIVERSITE DES GENRES BACTERIENS POUVANT DEGRADER LES HAP
.............................................................................................................................................. 11
I.5. LES DIFFERENTS TYPES DE VOIES DE DEGRADATION DES HAP ........... 12
Table des matières
I.6.FACTEURS INFLUENCANT LA DEGRADATION DES HAP ............................ 14
DEUXIEME PARTIE : MATERIELS ET METHODES
II.1. MATERIELS .............................................................................................................. 15
II.1.1.Site et échantillonnage de sol ................................................................................. 15
II.1.2. Milieu de culture .................................................................................................... 15
II.1.2.1. Milieu d’isolement et d’identification ...................................................... 15
II.1.2.1.1.Milieu TSA (Tryptic Soy Agar) ............................................... 15
II.1.2.1.2. Milieu King B .......................................................................... 16
II.1.2.1.3. Milieu AS1 .............................................................................. 16
II.1.2.2. Milieux d’identification de la souche de Bacillus ..................................... 16
II.1.2.2.1. Milieu Mannitol- Mobilité- Nitrate .......................................... 16
II.1.2.2.2. Milieu Hajna-Kligler (Lactose – Glucose – H2S) ................... 16
II.1.2.2.3. Milieu de SIMMONS (Citrate) ................................................. 16
II.1.2.2.4. Milieu Lysine-Fer ..................................................................... 16
II.1.2.2.5. Milieu Urée-Indole ................................................................... 17
II.1.2.2.6. Milieu à l’eau peptonée au rouge de phénol ............................. 17
I.1.2.3. Préparation des inoculums pour la pré-identification .................................. 17
II.1.2.3.1. ISP3 (International Streptomyces 3) ......................................... 17
II.1.2.4. Milieu d’identification macroscopique ....................................................... 17
II.1.2.4.1. ISP2 (International Streptomyces 2) ......................................... 17
II.1.2.4.2. ISP4 (International Streptomyces 4) ......................................... 17
II.1.2.4.3. ISP5 (International Streptomyces 5) ......................................... 17
II.1.2.5. Milieu pour la détermination des pigments mélanoïdes et des pigments
diffusibles .............................................................................................. 17
II.1.2.5.1. ISP6 (International Streptomyces 6) .......................................... 17
II.1.2.5.2. ISP7 (International Streptomyces 7) .......................................... 18
II.1.2.6. Milieu pour la détermination des caractères biochimiques ........................ 18
Recherche de nitrate réductase ……………………………………… 18
II.1.2.6.1. Bouillon nutritif ........................................................................... 18
II.1.2.7. Milieu pour la détermination des caractères physiologiques ...................... 18
Détermination de la température optimale de croissance ……………18
II.1.2.7.1. Sporulation Agar (SA) .................................................................. 18
Table des matières
Détermination du pH optimum………………………………………18
II.1.2.7.2. CYD (Casamino Acids Yeast extracts D-glucose) ........................ 18
II.1.2.8. Milieu pour la détermination du type respiratoire ...................................... 18
II.1.2.8.1. Viande Foie (VF) ............................................................................ 18
II.1.2.9. Milieu pour la détermination de la mobilité ............................................... 18
II.1.2.9.1. Mannitol–mobilité ................................................................................... 18
II.1.2.10. Milieu de dénombrement : Gélose nutritive ............................................. 18
II.1.3. Milieu pour le test de résistance des souches : bouillon nutritif ............................ 19
II.1.4. Appareil Chromatographique en Phase Gazeuse (CPG) ....................................... 19
II.2. METHODES ............................................................................................................... 20
II.2.1. Quantification du polluant étudié (HAP) ............................................................... 20
II.2.2. Isolement des souches microbiennes ..................................................................... 20
II.2.2.1. But .............................................................................................................. 20
II.2.2.2. Principe ........................................................................................................ 20
II.2.2.3. Mode opératoire ........................................................................................... 21
II.2.2.3.1. Isolement des souches de Pseudomonas fluorescents .................... 21
II.2.2.3.2. Isolement des souches d’actinomycètes ......................................... 21
a. Prétraitement des échantillons de sol................................................... 21
b. Préparation de la solution de dilution et ensemencement du milieu ... 21
II.2.2.3.3. Isolement de la flore totale cultivable ............................................. 22
II.2.3. Conservation des souches ...................................................................................... 22
II.2.4. Test de résistance des souches isolées ................................................................... 22
II.2.4.1. But .............................................................................................................. 22
II.2.4.2. Principe ....................................................................................................... 22
II.2.4.3. Mode opératoire .......................................................................................... 23
II.2.4.3.1. Préparation d’une solution mère de HAP ......................................... 23
II.2.4.3.2. Criblages des souches résistantes ..................................................... 23
II.2.4.3.3. Dénombrement des bactéries ............................................................ 23
II.2.4.3.4. Méthode de dénombrement .............................................................. 23
II.2.5. Identification des souches sélectionnées ............................................................... 24
II.2.5.1. Identification de la flore totale cultivable ................................................... 24
II.2.5.1.1. Etude des caractères culturaux.......................................................... 24
II.2.5.1.2. Etude des caractères morphologiques et structuraux ........................ 24
Table des matières
II.2.5.1.3. Etude des caractères physiologiques ................................................ 24
a. Mise en évidence des enzymes respiratoires ................................... 25
Test de catalase (SINGLETON, 1999; GASSER F, 1989)…………..25
Test de peroxydase (Singleton, 1999;Gasser, 1989) ………………...25
b. Influence de la température (Singleton, 1999) ................................. 25
II.2.5.1.4. Etude des caractères biochimiques .................................................. 25
Galerie LEMINOR …………………………………………………..25
II.2.5.2.Etude phénotypique de la souche d’actinomycète ....................................... 26
II.2.5.2.1. Etude des caractères culturaux......................................................... 26
II.2.5.2.2.Etude des caractères morphologiques ............................................... 27
Technique de culture sur lamelle (Cross, 1989) ……………………..27
II.2.5.2.3. Etude des caractères physiologiques ................................................ 27
II.2.5.2.4. Etude des caractères biochimiques ................................................... 27
II.2.6. Dosage des HAP résiduels ..................................................................................... 28
II.2.6.1. Quantification des HAP résiduels ............................................................... 28
TROISIEME PARTIE : RESULTATS ET DISCUSSIONS
III.1. TAUX DES HAP DANS L’ECHANTILLON DU SOL CONTAMINE .............. 29
III.2. ISOLEMENT DES SOUCHES MICROBIENNES .............................................. 29
III.3. TEST DE RESISTANCE DES SOUCHES ISOLEES .......................................... 30
III.4. IDENTIFICATION DES SOUCHES SELECTIONNEES .................................. 31
II.4.1. Identification de la souche A1 ............................................................................... 31
III.4.2. Identification de la souche F2 .............................................................................. 33
III.5. RENDEMENT D’ELIMINATION DE CHAQUE HAP ...................................... 34
DISCUSSIONS……………………………………………………………………………… 37
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES .......................................................... 42
ANNEXES
Glossaire
i
GLOSSAIRE
Acclimatation : Période pendant laquelle une population microbienne subit des
transformations phénotypiques et génétiques après avoir été mise en
présence de conditions nouvelles (par exemple, un apport d'éléments
nutritifs ou encore la mise en contact avec un composé xénobiotique, un
pesticide, un antibiotique, etc.…). Souvent cité sous le terme plus
général d'adaptation.
Adsorption : Phénomène de nature physique (forces de van der Wall) permettant
l'adhérence d'un composé sur des particules minérales (argiles).
Aérobie : Organisme utilisant l'oxygène pour son métabolisme.
Anaérobie : Organisme par qui l'oxygène n'est pas utilisé, ou pour qui il est létal.
Bioaccumulation : Incorporation et rétention d'un élément ou d'un composé toxique par un
organisme. Des bioaccumulations successives dans une chaîne
trophique (alimentaire) peuvent contribuer, dans les cellules du dernier
prédateur, dont l'homme, à des niveaux hautement toxiques.
Bioaugmentation : Souvent synonyme d'inoculation. Addition (dans un bioréacteur ou sur
un site pollué) de cultures bactériennes pour stimuler la biodégradation.
Bioconcentration : Augmentation cumulative de composés non biodégradables au cours de
leur transfert à travers les différents niveaux d'une chaîne trophique.
S'applique souvent aux métaux lourds, aux pesticides et aux composés
phosphorés.
Biodégradation : Décomposition partielle ou totale d'un produit par un agent biologique.
Le terme de biodégradation sous-entend l'élimination complète d'un
composé avec comme seuls rejets des produits simples tels que H2O,
CO2, CH4, H2, chlorure (pour un organochloré), ou encore de l'acétate,
des produits de fermentation. Elle est souvent mise en évidence par
l'emploi de molécules marquées par le 14C et la production de gaz
carbonique radioactif.
Glossaire
ii
Biotransformation: Transformation chimique d'un composé par un agent biologique. Cette
notion implique généralement un métabolisme incomplet du substrat et
non une véritable assimilation. Une oxydation, une hydrolyse, une
déhalogénation, un méthylation, etc…, sont des biotransformations
quand elles sont réalisées par un microorganisme.
Cométabolisme : Métabolisme bactérien par lequel le substrat peut être dégradé, mais qui
ne peut subvenir seul à la croissance cellulaire (car il ne constitue pour
le microorganisme ni une source de carbone, ni une ressource
énergétique).
Humus: Polymères complexes, souvent mal définis, mais de nature phénolique
et quinonique, provenant de la dégradation et de l'oxydation de la
lignine. Ils sont généralement récalcitrants à toute attaque biologique.
Minéralisation: Biodégradation dans laquelle l'étape ultime est la formation de CO2.
Cette notion implique généralement qu'une partie du composé a été
assimilée par l'organisme concerné (et pour lequel il a constitué un
"substrat").
Mycélium : appareil végétatif du champignon et d’Actinomycète constitué d'un
ensemble de filaments appelés hyphes
Ubiquitaire : se dit de substances, en particulier d'antigènes, présentes dans différents
milieux organiques.
Persistant : Un composé est qualifié de récalcitrant ou de persistant quand son
élimination par des voies biologiques est impossible (récalcitrant vrai),
ou très lente … ou encore qu'il n'a pas été possible de mesurer sa vitesse
de dégradation, tant elle est lente ! Ces termes s'appliquent le plus
souvent aux produits xénobiotiques, mais des composés naturels
peuvent aussi être récalcitrants (exemple, l'humine). La persistance d'un
composé est généralement estimée par le temps nécessaire pour que sa
concentration initiale diminue de 90%. Cette valeur est
approximativement égale à 3,5 fois la demi-vie.
Glossaire
iii
Xénobiotique: Traduit du grec : "étranger au monde vivant". Composé organique
résultant de l'activité humaine (non naturel, et absent des biotopes
naturels non pollués).
Abréviations
iv
ABREVIATIONS
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
ARN: Acide RiboNucléique
AS1 : Antibiotic Selection One
CE : Cadre Européenne
CPG : Chromatographie en Phase Gazeuse
CYD : Casamino acids Yeast extracts D-glucose
DAS : Daw Agro Sciences
EDS : Eau Distillé
EPA : Environmental Protection Agency
EPA-TSCA: Environmental Protection Agency-Toxic Substances Control Act
HAP : Hydrocarbure Aromatique Polycyclique
IARC : Centre International de Recherche sur le Cancer
ISP2 : International Streptomyces Two
KOW : coefficients de partage octanol/eau
LCPE : Loi Canadienne sur la Protection de l'Environnement
LDC : Lysine DéCarboxylase
LDA : Lysine DésAminase
MO : Matière Organique
MEL: Marine Environment Laboratory
NPP : Nombre les Plus Probables
OMS : Organisation Mondial de la Santé
PBS : Phosphate Buffer Saline
SA : Sporulation Agar
Abréviations
v
TSA : Triptic Soy Agar
TDA : Tryptophane DésAminase
UFC : Unité Formant Colonie
UV : Ultraviolet
VF : Viande Foie
Liste des tableaux
vi
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1. Abondance des microorganismes dans les sols (Bonneau et Souchier,
1994). …………………………………………………………………………..4
Tableau 2. Propriétés physico-chimiques des HAP .............................................................. 7
Tableau 3. Toxicité des HAP ............................................................................................... 9
Tableau 4. Conditions environnementales affectant la biodégradation (Vidali, 2001) ....... 14
Tableau 5. Modalité d’ensemencement, de lecture et d’interprétation de la galerie
LEMINOR…………………………………………………………………….26
Tableau 6. Les différents HAP présents dans le sol de Tsimororo .................................... 29
Tableau 7. Dénombrement de colonies de la souche A1 à chaque temps de prélèvement
sur milieu bouillon nutritif mélangé avec les HAP 1500 mg/L.... .................... 31
Tableau 8. Dénombrement de colonies de la souche F2 à chaque temps de prélèvement sur
milieu bouillon nutritif mélangé avec les HAP 1500 mg/L………………......31
Tableau 9. Caractéristiques culturales de la souche d’actinomycète A1 ............................ 32
Tableau 10. Caractères morphologiques, physiologiques et biochimiques de la souche
A1……………… ............................................................................................. 32
Tableau 11. Caractère culturaux, morphologiques et physiologiques de la souche F2 ....... 33
Tableau 12. Caractère biochimiques de la souche F2 .......................................................... 33
Tableau 13. Rendement d’élimination des HAP en pourcentage (%) pour chaque durée
d’élimination ………………………………………………………………....34
Liste des figures
vii
LISTE DES FIGURES
Figure 1. Structure des 16 HAP de la liste EPA ................................................................ 5
Figure 2. Evolution d'un sol brun structuré en 3 horizons (A, B et C) remanié en
technosol.. ......................................................................................................... 10
Figure 3. Voie de dégradation bactérienne du phénanthrène (Pseudomonas sp. 47
p1,s7k5) d'après la base de données Biocatalysis/biodegradation .................... 13
Figure 4. Localisation de Tsimiroro ................................................................................ 15
Figure 5. Schéma de la description d’un ensemble chromatographique ......................... 19
Figure 6. Rendement d’élimination de huit HAP en pourcentage (%) en fonction de
durée d’incubation pour l’espèce Streptomyces sp. .......................................... 35
Figure 7. Rendement d’élimination de huit HAP en pourcentage (%) en fonction de
durée d’incubation pour l’espèce Bacillus simplex .......................................... 36
Liste des photos
viii
LISTE DES PHOTOS
Photo 1. Souches pures de Pseudomonas fluorescents sur le milieu King B ................. 30
Photo 2. Variétés des souches d’actinomycètes isolées sur milieu AS1 ........................ 30
Introduction
INTRODUCTION
Introduction
1
INTRODUCTION
Avec l’accélération du développement économique, l’homme est de plus en plus
responsable de la pollution de l’environnement par ses activités industrielles, économiques et
sociales (comme l'industrialisation ainsi que d'autres exploitations), générant ainsi une
multitude de composés plus ou moins toxiques pour les organismes vivants.
Un des problèmes majeurs à Madagascar étant l’absence de cadre légal spécifique et
précis régissant la prise en charge ou la gestion des sites et sols pollués. Très peu de systèmes
de dépollution concrète ont été appliqués durant ces décennies d’activités industrielles
existantes, ce qui a laissé un héritage lourd en matière de pollution de l’environnement.
Actuellement, de nombreuses industries génératrices de boues huileuses (contaminées
par des hydrocarbures) sont également implantées au pays et cette situation nous laisse
prévoir encore à la détérioration progressive de la qualité environnementale suite à des
accumulations prévisibles des polluants toxiques tels que les « Hydrocarbures Aromatiques
Polycycliques » (HAP).
Les HAP sont parmi les polluants les plus dangereux pour les êtres vivants et pour
l’homme en particulier dans la mesure où ils ont des propriétés cancérigènes et/ou mutagènes.
Ce sont des composés ubiquitaires issus de la combustion incomplète de matières organiques,
surtout générés dans l’exploitation des produits pétroliers. Ils ont tendance à s’adsorber dans
les sols et les sédiments à cause de leur caractère hydrophobe et leur persistance dans les
écosystèmes. Or, de nombreuses études ont montré que les sols constituaient le principal point
de fuite environnementale des HAP (LCPE, 1994) du fait de leur caractère rémanent et
toxique. Il serait donc nécessaire de surveiller et de limiter cette pollution.
C'est dans cette optique que ce travail de mémoire a été mené pour réduire les impacts
générés par l’omniprésence des hydrocarbures aromatiques polycycliques dans les sols et sur
la reprise de la bio-fonctionnalité du sol pollué, la technique de bioremédiation est désormais
la technologie de traitement fortement conseillée pour remédier les eaux ou les sols
contaminés par ces types de polluants (Ballerini et Vandecasteele, 1999). Elle a l’avantage de
ne pas utiliser des agents dépolluants agressifs, contrairement aux autres techniques, qui sont
susceptibles d’engendrer encore plus d’effets dégradants sur le milieu à dépolluer. Le principe
est basé sur l’utilisation des microorganismes vivants pour assurer la dégradation des chaines
polluantes piégées dans les eaux/ sols à décontaminer.
Introduction
2
L’utilisation de ces bactéries pour la bioremédiation est aujourd’hui reconnue comme
une action complémentaire des voies chimiques et physiques pour la dégradation ultime des
polluants dans l’environnement et considérée comme un traitement efficace, économique et
écologique, est largement mise en œuvre (Tarayre, 2012 ; Mi Jin et al., 2013).
De ce fait, l’objectif principal de cette étude est de rechercher et de mettre au point un
procédé de bioremédiation des HAP dans les sols, en tenant compte des microorganismes
telluriques pouvant être optimisé. Nos approches consistent, à sélectionner et à identifier les
souches telluriques résistantes à une gamme croissante de concentration de mélange HAP
étudiés dans des milieux de culture spécifique puis à suivre les cinétiques de dégradation des
polluants par ces microorganismes en évaluant le taux d’hydrocarbures restants à chaque
expérience.
Ainsi, pour ce faire, ce mémoire a été divisé en trois parties, à savoir : la première
partie qui résumera les données bibliographiques, la deuxième partie qui décrira les matériels
et méthodes utilisés et la troisième partie qui exposera les résultats et discussions. La première
partie est précédée par une introduction générale et la dernière partie est terminée par la
conclusion ainsi que les perspectives.
Synthèse bibliographique
SYNTHESE
BIBLIOGRAPHIQUE
Synthèse bibliographique
3
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I.1. LES MICROORGANISMES DANS LES SOLS Le sol est un milieu vivant (Kilbertus, 1980). Il figure parmi les habitats les plus
diversifiés et renferme certains des assemblages les plus variés d’organismes vivants comme
les bactéries, les actinomycètes, les champignons, les algues, les parties souterraines des
plantes, ainsi qu’une faune très variée allant des protozoaires aux mammifères essentiellement
les nématodes, les annélides et les arthropodes (Paul et Clark, 1989).
Les bactéries : sont les organismes les plus nombreux du sol, leur densité est de
l’ordre de 109 par gramme de sol. Il existe plus de 200 genres bactériens différents. Parmi les
plus représentés dans le sol, on peut citer (Alexander, 1977) : les Arthrobacter, Gram
variables à croissance lente, qui peuvent représenter 5 à 60% des colonies, les Pseudomonas,
Gram négatif mobiles, représentant 3 à 20% des UFC (unités formant colonie), le genre
Bacillus, bâtonnets sporulant Gram positif ou Gram variables, souvent mobiles, qui est
également bien représenté dans les sols: de 7 à 67%, les Clostridium, bactéries anaérobies
utilisées pour la production d'alcool et de solvants.
Les actinomycètes : ce sont des microorganismes hétérotrophes qui forment une
structure végétative de type mycélien, ils peuvent atteindre jusqu’à 107 unités par gramme de
sol. Dans le sol, les genres les plus fréquents sont les Streptomyces qui représentent jusqu'à
90% des genres identifiés, et les Nocardia.
Les champignons : bien que moins nombreux que les bactéries dans les
dénombrements sur boîte de Pétri, les organismes hétérotrophes eucaryotes que sont les
champignons sont les principaux responsables de la décomposition des résidus organiques
dans les sols.
Les algues et les protozoaires : la densité des algues est de l’ordre de 105 par gramme
de sol et ce sont toutes des espèces de Cholorophyceae, de Cyanophyceae et des Diatomées,
dont certaines sont fixatrices d’azote. Quant aux protozoaires, ce sont les moins nombreux
avec une densité de 103 par gramme de sol (Morel, 1996).
Le tableau 1 ci-dessous montre l’abondance des microorganismes dans les sols.
Synthèse bibliographique
4
Tableau 1. Abondance des microorganismes dans les sols (Bonneau et Souchier, 1994).
L’ensemble de ces organismes font partie intégrante du système sol et participe par
leur activité à la formation et à l’évolution des sols.
I.1.1. Activités microbiennes dans les sols
L'activité des microorganismes du sol ne se manifeste que si les conditions
énergétiques et nutritionnelles sont satisfaites. Les nutriments doivent répondre à 3 besoins :
- fournir de l'énergie pour la croissance cellulaire ;
- fournir des matériaux pour la synthèse des constituants cellulaires ;
- être utilisables comme accepteurs des électrons libérés au cours de la
production d'énergie.
I.1.2. Interactions entre microorganismes
De façon générale, les microorganismes du sol influencent diverses composantes liées
à la qualité du sol comme la matière organique et la structure. Le sol ne peut dès lors plus se
concevoir comme une matrice homogène mais plutôt comme un assemblage hétérogène
d’entités physiques formées par l’activité microbienne à la surface des matières organiques en
décomposition et qui sont en interaction avec les particules minérales du sol.
La croissance des microorganismes a été le plus souvent étudiée et modélisée dans des
conditions de culture pure (Slater et al., 1979) alors que dans les sols, ils se développent en
présence d'autres organismes (microorganismes, animaux, racines) et dans un système poreux
où ils sont le plus souvent fixés sur des constituants minéraux, organiques et organo-
minéraux.
I.2. LES HYDROCARBURES AROMATIQUES POLYCYCLIQUES–GENERALITES Les Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP) constituent une classe
importante de polluants issus de l’activité industrielle. Ce sont des molécules ubiquistes,
ORGANISMES NOMBRE (UFC/g de sol sec)
Bactéries 108
Actinomycètes 105 à 106
Champignons 105
Algues 104 à 105
Protozoaires 104
Synthèse bibliographique
5
persistantes et toxiques qui figurent sur la liste des polluants prioritaires de l’Agence
Américaine de la Protection de l'Environnement (EPA) (Keith et Telliard, 1976). Ces
polluants récalcitrants sont aussi répertoriés comme des composés néfastes pour l'homme et
l'environnement par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) et la Communauté
Européenne (CE).
I.2.1. Définition – classification
Les HAP sont des composés aromatiques hétérocycliques constitués d’atome de
carbone et d’hydrogène. Ils sont constitués de cycles aromatiques accolés en nombre croissant
allant de deux (2) cycles (naphtalène) jusqu’à six (6) cycles (benzo(g,h,i)pérylène). Les
structures des 16 HAP retenus comme polluants prioritaires par l’American Environmental
Protection Agency (EPA) sont présentés dans la figure 1.
Figure 1. Structure des 16 HAP de la liste EPA
Ces HAP sont classés en deux groupes selon le nombre de cycle benzéniques qui les
compose et l’état de condensation de ces noyaux de type phénol :
• les HAP légers (2 à 3 cycles) de masse molaire comprise entre 150 et 180 g/mol ;
• les HAP lourds (4 cycles ou plus) de masse molaire supérieure à 200 et 280 g/mol.
Synthèse bibliographique
6
I.2.2. Propriétés physico-chimiques des HAP
Les propriétés physico-chimiques des HAP varient selon la masse moléculaire, le
nombre et l’assemblage des cycles qui composent la molécule. La transformation et la
mobilité des HAP dans l’environnement sont principalement contrôlées par leur faible
solubilité, leur hydrophobicité et leur pression de vapeur saturante.
I.2.2.1. Solubilité
La solubilité correspond à la concentration du produit en phase aqueuse à l’équilibre et
elle augmente avec la température. La plupart des HAP sont pratiquement insolubles dans
l’eau (Edwards, 1983), leur solubilité étant inversement proportionnelle au nombre de cycles
de la molécule (taille et angularité) (Haesseler, 1998) (tableau 2).
Leur solubilité en milieu aqueux est notable pour le naphtalène (30 mg/L) mais décroît
ensuite très rapidement avec le nombre de cycles aromatiques (160 μg/L pour le pyrène, 4
μg/L pour le benzo(a)pyrène).
I.2.2.2. Coefficient de partage octanol/eau
Le coefficient de partage octanol/eau (log KOW) traduit la répartition d’une molécule
de soluté entre la phase lipophile (octanol) et la phase hydrophile (eau). Il évalue
l’hydrophobicité d’une molécule et son potentiel lipophile. Il permet de connaître la capacité
de la molécule organique (Fu et al., 1994) à s’accumuler dans les êtres vivants au niveau des
tissus adipeux et des membranes phospholipidiques. Par sa détermination, il est possible
d’estimer l’adsorption du composé au niveau des régions hydrophobes du sol (matière
organique, cires, lipides, matières particulaires) (Weissenfels et al., 1992 ; Marschner, 1999)
qui se fait via des liaisons hydrophobes plus ou moins stables, lui permettant de persister dans
l’environnement (Bouwer et Zehnder, 1993 ; Hartmann, 1996 ; Van Brummelen et al., 1996).
Les log KOW des HAP sont relativement élevés, variant de 3,37 à 6,5 (Makay et al.,
1992), selon le nombre de noyaux aromatiques du composé (tableau 2), et indiquent ainsi la
nécessité d’utiliser des solvants organiques ou des tensioactifs pour leur extraction.
I.2.2.3. Pression de vapeur
La pression ou tension de vapeur permet de connaître la capacité d’un produit à passer
d’une phase gazeuse à une phase aqueuse. A partir de 105 kPa, les composés sont considérés
comme volatils. Les tensions de vapeur des HAP de deux (2) à trois (3) cycles indiquent que
Synthèse bibliographique
7
ces molécules sont volatiles, enrichissant ainsi relativement le milieu en HAP de fort poids
moléculaire (tableau 2).
Tableau 2. Propriétés physico-chimiques des HAP
Composés Formule
semi-développée a
Nombre de cycle
a
Formule brute a
Masse molaire
a (g/mol)
Solubilité dans l’eau
a 25 °C Sw (mg/L)
Coefficient de partage octanol/eau
a log KOW
Pression de vapeur saturante
a (Pa)
Temps de demi-vie b (j : jours, a : ans)
Naphtalène
2 C8H10 128,2 31 3,4 36,8 16 j – 48 j
Acénaphtylène
3 C12H8 152,2 16,1 4,0 4,14 Non étudié
Acénaphtène
3 C12H10 154,2 3,8 3,9 1,52 Non étudié
Fluorène 3 C13H10 166,2 1,9 4,2 0,715 32 j – 60 j
Phénanthrène
3 C14H10 178,2 1,1 4,6 0,113 16 j – 200 j
Anthracène 3 C14H10 178,2 0,05 4,5 0,0778 50 j – 1,3 a
Fluoranthène
4 C16H10 202,3 0,26 5,2 8,72.10-3 140 j – 1,2 a
Pyrène
4 C16H10 202,3 0,13 5,2 0,0119 210 j – 5,2 a
Benzo(a)anthracène
4 C18H12 228,3 0,01 5,9 6,06.10-4 102 j – 1,9 a
Chrysène
4 C18H12 228,3 0,002 5,6 8,4.10-7 1 a – 2,7 a
Benzo(b)fluoranthène
5 C20H12 252,3 0,002 5,8 6,7.10-5 Non étudié
Benzo(k)fluoranthène
5 C20H12 252,3 0,001 6,0 4,12.10-6 2,5 a – 2,9 a
Benzo(a)pyrène
5 C20H12 252,3 0,004 6,0 2,13.10-5 Non étudié
Dibenzo(a,h)anthracène
5 C22H14 278,4 0,0006 6,8 9,16.10-8 361 j – 2,6 a
Indénol(1,2,3,c,d)pyrène
6 C22H12 276,3 0,062 6,6 1,3.10-8 1,6 a – 2 a
Dibenzo(g,h,i)pérylène
6 C21H16 268,4 0,0003 6,5 2,25.10-5 0,25 a – 1,8 a
a : Makaya et al., 1992 ;b : IARC, 1997, 2000.
Synthèse bibliographique
8
I.2.3. Origine des HAP
Les HAP ont pour origine différents processus : la combustion incomplète de la
matière organique, la diagenèse, la biogenèse. Les sources naturelles d’émission de HAP dans
l’environnement sont les feux de forêt, les éruptions volcaniques, mais aussi les réactions
biogènes générées par les plantes et les microorganismes (formation de l’humus et
minéralisation de la matière organique) (Henner et al., 1997 ; Juhasz et Naïdu, 2000 ; Wilcke,
2000), ainsi que les réactions géologiques associées à la formation du fuel fossile (Wilson et
Jones, 1993).
La plus importante source de HAP d’origine anthropique est l’activité industrielle par
la combustion incomplète des combustibles fossiles (Wilds et Jones, 1995 ; Vierle et al., 1999
; Samantha et al., 2002). Les mécanismes mis en jeu lors de leur formation font intervenir la
production de radicaux libres par pyrolyse à haute température (≥500°C) de la matière fossile
(pétrole, fuel, matières organiques…) dans des conditions déficientes en oxygène.
L’émission de HAP se produit notamment lors de l’extraction et du raffinage du
pétrole (Hill et Goshal, 2002), de l’aluminerie, de la sidérurgie, de la cokéfaction (Menzie et
al., 1992 ; Arzayus et al., 2001; Hill et Goshal, 2002) et lors du stockage d’hydrocarbures de
goudron et de bitume (Colline, 2000).
I.2.4. Toxicité des HAP
Les HAP possèdent un fort pouvoir d’adsorption sur les particules élémentaires en
suspension dans l’air (mais aussi dans l’eau) ainsi qu’un fort potentiel de bioconcentration
dans les organismes. En revanche, en raison de leurs structures, les HAP sont très
hydrophobes (à l’exception du naphtalène). La toxicité des HAP varie fortement d’un
composé à l’autre. Ainsi plusieurs HAP ont des effets mutagènes et cancérogènes. Dans
l’organisme, les HAP deviennent toxiques après oxydation enzymatique, laquelle conduit à la
formation des métabolites électrophiles solubles. Les métabolites, à leur tour, forment des
adduits sur les acides nucléiques ARN, ADN et sur les protéines et provoquent une
perturbation sur le mécanisme de division cellulaire et à la formation de tumeurs (Szeliga et
al. 1998).
Le tableau 3 suivant présente les principales données de toxicité des HAP suivant la
classification utilisée par le CIRC pour l’évaluation des risques de cancérogénicité sur
l’homme:
Synthèse bibliographique
9
• Groupe 1 : L’agent est cancérogène pour l’homme ;
• Groupe 2A : L’agent est probablement cancérogène pour l’homme ;
• Groupe 2B : L’agent est peut être cancérogène pour l’homme ;
• Groupe 3 : L’agent est inclassable quant à sa cancérogénicité pour l’homme ;
• Groupe 4 : L’agent n’est probablement cancérogène pour l’homme.
Tableau 3. Toxicité des HAP
IARC : Centre International de Recherche sur le Cancer
EPA-TSCA: Environmental Protection Agency-Toxic Substances Control Act
Nom Toxicité Cancérogénicité Mutagénèse Rapporté dans
Benzo(a)pyrène Toxique pour
l’homme 1 Constatée (Cavalieri et
al.,1988 ; CIRC, Health Canada)
Benzo(a)anthracène Toxique pour
l’environnement 2B Constatée EPA-TSCA, CIRC, Health
Canada
Benzo(b)fluoranthène Toxique pour l’homme 2B Constatée
Amin et al.,1984; Emura et al.,
1980 ; Hermann, 1981 ; CIRC,
Health Canada Benzo(g,h,i)pérylène 3 Constatée CIRC
Benzo(k)fluoranthène Toxique pour l’homme 2B Constatée
EPA-TSCA, CIRC, Health
Canada
Benzo(j)fluoranthène Toxique pour l’homme 2B Health Canada
Fluoranthène Toxique pour l’environnement 3 Constatée
EPA-TSCA, CIRC, Health
Canada
Indéno(1,2,3,c,d)pyrène Toxique pour l’homme 2B Constatée
EPA-TSCA, CIRC, Health
Canada
Pyrène Toxique pour l’environnement 3 Constatée
EPA-TSCA, CIRC, Health
Canada
Anthracène Toxique pour l’environnement 3 Constatée
EPA-TSCA, CIRC, Health
Canada
Phénanthrène Toxique pour l’environnement 3 Constatée
EPA-TSCA, CIRC, Health
Canada
Dibenzo(a,h)anthracène Toxique 2A Constatée EPA-TSCA, CIRC
Chrysène 2B Constatée (JOCE, 2004), CIRC
Synthèse bibliographique
10
I.2.5. Distribution des HAP
Par leur nature hydrophobe, les HAP contenus dans les milieux aquatiques sont
principalement liés aux particules organiques et minérales en suspension dans l’eau (Herbes,
1977). Bien que la majorité des HAP soit émise dans l’atmosphère (Wild et Jones, 1995), le
sol et les sédiments constituent le principal point de fuite environnemental de ces polluants
(Wilcke, 2000). Wild et Jones (1995) estiment que 90% des HAP émis dans l’environnement
sont stockés dans les sols, sans comptabiliser ceux des sites industriels. En effet, la
contamination des sols à proximité des sites industriels est importante.
I.2.6. HAP dans les sols
Le sol est un système hétérogène et complexe à l’interface entre la géosphère,
l’atmosphère et la biosphère. Les HAP dans les sols peuvent interagir avec les constituants
minéraux, organiques, les organismes vivants, la phase gazeuse et la phase liquide. De par ses
caractéristiques physico-chimiques et biologiques, le sol est structuré en horizon.
Lors de l’installation de sites industriels et du remaniement des terres, les procédés
pédologiques intègrent les matières anthropiques et créent de nouvelles associations organo-
minérales (Monserie et al., 2009). Ces technosols ne font plus apparaître de structure en
horizons des sols (figure 2).
Figure 2. Evolution d'un sol brun structuré en 3 horizons (A, B et C) remanié en
technosol
I.3. BIODEGRADATION DES HAP Actuellement, les techniques de traitement des sols pollués sont classées en quatre
grandes catégories : les procédés physico-chimiques, les procédés thermiques, les procédés
biologiques (ou bioremédiation), le confinement (Ballerini et al., 1998). Mais lors de cette
Synthèse bibliographique
11
étude, nous avons choisi les procédés biologiques pour la dégradation des HAP en prenant en
compte les raisons suivantes :
• intérêt environnemental : réduire les impacts environnementaux ;
• intérêt économique : coûts de traitement réduits ;
• intérêts techniques : traitement d’une gamme diversifiée de polluants (organiques,
minéraux), possibilité de préparer des microorganismes spécialisés, capacité des
microorganismes à vivre dans des conditions extrêmes (pH, oxygénation,
concentrations élevées de polluant, etc.), nombreux microorganismes identifiés et
caractérisés ;
• tests en laboratoire concluants.
En réalité, la dégradation naturelle des matières organiques polluantes est généralement
un processus lent et dépend certainement de la nature, de la toxicité, du taux de
nutriments disponibles dans le milieu ainsi que de la concentration des polluants piégés dans
le sol. Tout cela constitue un facteur ralentissant, voire même inhibant, pour l’activité
dégradante qui devrait y avoir lieu et être assurée par des microorganismes vivants dans le
sol. La bioremédiation, qui est une méthode basée sur l’activité de la capacité naturelle
que possèdent de nombreux organismes, sont généralement soit des bactéries, des micros
algues ou des champignons dégradant les polluants en composés inertes, comme l’eau et
le gaz carbonique. Ces organismes peuvent être déjà présents dans la zone polluée
(indigènes) ou ajoutés au milieu (exogène), ou encore prélevés sur le site contaminé,
cultivées au laboratoire puis réintroduits dans le sol. Elle se déroule généralement en
condition d’aérobie ; toutefois, l’application des systèmes de bioremédiation en condition
d’anaérobie permet de dégrader un certain nombre de molécules récalcitrantes (Chedly, 2006).
I.4. DIVERSITE DES GENRES BACTERIENS POUVANT DEGRADER LES HAP Divers microorganismes sont capables de dégrader les hydrocarbures comme les
bactéries et les champignons mais la culture de bactéries étant plus rapide, ajouté au fait que
les bactéries assimilent mieux certaines molécules donc, l’usage de ces derniers est préféré.
Dans cette optique, cette synthèse traitera donc des bactéries dégradant les hydrocarbures.
Dans plusieurs expériences, les souches favorables à la bioremédiation sont celles isolées du
sol contaminé en question ou isolées à partir des points des rejets industriels à traiter (Dong et
al., 2008 ; Cordova-Rosa et al., 2009). Ces microorganismes appartiennent à des genres
Synthèse bibliographique
12
variés, les Pseudomonas ayant été particulièrement étudiées, isolées sur naphtalène (Grund
and Gunsalus, 1983; Kurkela et al., 1988; Simon et al., 1993; Yang et al., 1994).
Mahmoud et Rama Rao ,1993 ont quant à eux étudié l'abondance microbienne et la
dégradation d’HAP (anthracène, phénanthrène, chrysène, pyrène, fluoranthène) dans des sols
pollués. Ils ont observé une attaque préférentielle de l'anthracène et du phénanthrène (le plus
rapidement dégradé). Les bactéries dominantes appartenaient aux genres Pseudomonas,
Agrobacterium et Bacillus subtilis.
Kastner et al., 1994 ont étudié l'existence de bactéries dégradant des HAP sur
différents sols pollués en utilisant la méthode développée par Kiyohara et al., 1982. Ils ont
mis en évidence des populations bactériennes capables de croître sur l'anthracène, le
phénanthrène, le fluoranthène ou le pyrène de 103 à l05 UFC/g de sol sec dans les sols pollués
par des HAP, mais n'ont pas trouvé d'isolat capable de croître sur le pérylène, le triphénylène,
le benzo(a)pyrène ou le chrysène. Les actinomycètes nocardioformes (Rhodococcus,
Nocardia, Mycobacterium) représentaient la majeure partie de la microflore du sol capable de
minéraliser complètement des HAP.
Les espèces bactériennes capables de dégrader les HAP sont montrées en Annexe 4.
I.5. LES DIFFERENTS TYPES DE VOIES DE DEGRADATION DES HAP Il y a plusieurs types de voies pour biodégrader les HAP :
• Par voie abiotique : qui se fait par la volatilisation en phase gazeuse des polluants à
l’interface eau-air dans les sols, avec dégazage vers l’atmosphère et la transformation
où la dégradation des HAP par voie chimique se fait soit par oxydation chimique, soit
par photo-oxydation sous l’action des rayonnements ultraviolets (UV), de l’ozone, du
peroxyde d’hydrogène, du dioxygène ou de radicaux –OH (Heitzer et Sayler , 1993 ;
Letho et al., 2003) ;
• Par voie biotique : ce mécanisme convertit une substance métabolisable en un
composé plus simple qui peut être moins ou plutôt toxique que le composé d’origine
(biotransformation) et aboutît à un produit final qui est le dioxyde de carbone
(minéralisation). Lors de cette dégradation, le composé peut servir ou non d’unique
source de carbone aux microorganismes (Grady, 1985 ; Lappin et al., 1985) ;
• Par voie bactérienne : le métabolisme bactérien est le processus majeur de
dégradation des HAP dans les sols (Cerniglia, 1997). Cette dégradation peut être plus
Synthèse bibliographique
13
ou moins partielle et met en jeu de nombreuses genres bactériens Gram positif et
Gram négatif : Pseudomonas, Acinobacter, Bacillus, Sphingomonas, Burkholderia, et
mycobactérium (Johnsen et al., 2005). L’étude de la biodégradation des HAP par des
souches bactériennes isolées à partir de sols contaminés a permis d’établir des voies
métaboliques de dégradation, d’analyser l’organisation et la régulation des gènes qui
code les enzymes impliquées dans la dégradation (Saito et al., 2000) ;
Les voies de dégradation, comme le naphtalène et le phénanthrène, ont été largement
étudiées depuis de nombreuses années (Treccani et al,. 1954; Davis et Evans, 1964; Evans et
al,. 1965). A partir du phénanthrène et de la dihydroxylation du cycle aromatique par une
enzyme dioxygènase, il existe à l'intérieur de la bactérie une succession de réactions
cataboliques chacune synthétisée par une enzyme spécifique, lesquelles produisent de
nombreux métabolites dont le 1-hydroxy-2-naphtoate et le phtalate (Kiyohara et Nagao, 1978;
Seo et al,. 2006). La dégradation des composés aromatiques fournit des intermédiaires du
cycle de Krebs (pyruvate, succinate, etc.) et produit de l'énergie pour la bactérie (figure 3). Au
fur et à mesure des réactions, le nombre de carbone du polluant diminue, le déchet ultime est
le dioxyde de carbone lequel est rejeté à l'extérieur de la bactérie.
Figure 3. Voie de dégradation bactérienne du phénanthrène (Pseudomonas sp. 47
p1,s7k5) d'après la base de données Biocatalysis/biodegradation
Synthèse bibliographique
14
I.6. FACTEURS INFLUENCANT LA DEGRADATION DES HAP Plusieurs facteurs vont influencer la dégradation des polluants par les
microorganismes. Les conditions environnementales doivent être optimales pour obtenir une
croissance et une activité microbienne garantissant l’efficacité du procédé de bioremédiation.
Les nutriments doivent être présents en quantité suffisante : les valeurs optimales du rapport C
: N : P doivent être égales à 100 :5 :1 et la présence d’oligo-éléments est requise pour assurer
leur croissance.
L’efficacité du traitement par bioremédiation peut être ainsi limitée par la perméabilité
des sols, la teneur en silt et argile ne devant pas dépasser un certain seuil. Les sols à traiter ne
peuvent contenir de substances toxiques susceptibles d’empêcher le développement bactérien.
Le tableau 4 qui suit montre les conditions environnementales la biodégradation des
polluants par les microorganismes.
Tableau 4. Conditions environnementales affectant la biodégradation (Vidali, 2001)
Matériels et méthodes
MATERIELS ET METHODES
Matériels et méthodes
15
II.1. MATERIELS
II.1.1.Site et échantillonnage de sol
L’échantillon de sol utilisé pour cette étude a été collecté dans un site industriel d’un
grand gisement d’huile lourde de Tsimiroro situé au Nord-Ouest de Madagascar et
approximativement à 100 km Ouest de la côte de Madagascar, dans le bassin sédimentaire de
Morondava, au sud de Bemolanga et de Morafenobe (figure 4).
Source : Madagascar Oil, Etude d’Impact Environnemental de Tsimiroro, BD 500 FTM
Figure 4. Localisation de Tsimiroro
L’échantillon est prélevé à une profondeur située entre 10cm et 20cm. Cette zone
correspond à la zone d’hyperactivité biologique au niveau du sol. Environ 1 kg de sol sont
prélevés avec une spatule stérile et conditionnés dans des sachets de prélèvement. Les
échantillons sont conservés à la température ambiante jusqu’au laboratoire.
II.1.2. Milieu de culture
II.1.2.1. Milieu d’isolement et d’identification
II.1.2.1.1.Milieu TSA (Tryptic Soy Agar)
Le milieu solide est habituellement employé pour la culture et dénombrement de la
flore totale cultivable.
Matériels et méthodes
16
II.1.2.1.2. Milieu King B
Le milieu King B est un milieu contenant comme source de carbone la polypeptone.
Ce milieu est habituellement utilisé pour isoler et conserver les souches de Pseudomonas
fluorescents à partir de l’échantillon de sol.
II.1.2.1.3. Milieu AS1
Le milieu AS1 est un milieu solide utilisé pour l’isolement et la conservation des
souches d’actinomycètes.
Ce milieu est additionné de 3 antibiotiques pour l’isolement des actinomycètes :
• la triméthoprime (inhibiteur des champignons) ;
• le cycloheximide (inhibiteur des bactéries) ;
• l’acide nalidixique (inhibiteur des bactéries Gram négatif).
II.1.2.2. Milieux d’identification de la souche de Bacillus
Ce sont des milieux qui permettent de mettre en évidence les caractères biochimiques
des bactéries. Pour cela, le portoir de LEMINOR constitué par les milieux suivants a été
utilisé.
II.1.2.2.1. Milieu Mannitol- Mobilité- Nitrate
Il s’agit d’un milieu semi - mou permettant de mettre en évidence l’utilisation du
mannitol, la réduction du nitrate par les bactéries et leur mobilité à partir de la ligne
d’ensemencement.
II.1.2.2.2. Milieu Hajna-Kligler (Lactose – Glucose – H2S)
C’est un milieu solide utilisé pour la mise en évidence de la fermentation du glucose
et du lactose, de la production de sulfure d’hydrogène (H2S), de la production de gaz et de la
recherche de ß– galactosidase.
II.1.2.2.3. Milieu de SIMMONS (Citrate)
C’est un milieu solide également, contenant comme source de carbone le citrate. Ce
milieu permet de rechercher l’utilisation du citrate par les bactéries.
II.1.2.2.4. Milieu Lysine-Fer
C’est un milieu solide qui permet de mettre en évidence simultanément la lysine
décarboxylase (LDC), la lysine désaminase (LDA), l’utilisation du glucose et la formation
d’ H2S.
Matériels et méthodes
17
II.1.2.2.5. Milieu Urée-Indole
Le milieu urée indole est un milieu liquide permettant de rechercher l’uréase, le
tryptophane désaminase (TDA) et la production d’indole par les bactéries.
D’autres milieux sont aussi utilisés pour identifier les microorganismes des
saucissons, outre ceux cités dans le portoir de LEMINOR.
II.1.2.2.6. Milieu à l’eau peptonée au rouge de phénol
C’est un milieu liquide contenant comme milieu de base l’eau peptonée additionnée
d’un indicateur coloré qui est le rouge de phénol. Il permet d’étudier l’utilisation par les
bactéries de certains composés glucidiques ajoutés stérilement dans le milieu.
II.1.2.3. Préparation des inoculums pour la pré-identification
II.1.2.3.1. ISP3 (International Streptomyces 3)
C’est un milieu solide contenant de la solution d’avoine. Il est utilisé pour la
préparation des inoculums et pour la pré-identification des souches d’actinomycètes.
II.1.2.4. Milieu d’identification macroscopique
II.1.2.4.1. ISP2 (International Streptomyces 2)
C’est un milieu de culture solide contenant comme source de carbone le glucose. Ce
milieu est habituellement utilisé pour l’identification macroscopique des souches
d’actinomycètes.
II.1.2.4.2. ISP4 (International Streptomyces 4)
C’est un milieu solide contenant de l’amidon soluble. Il est employé pour identifier
macroscopiquement les souches d’actinomycètes.
II.1.2.4.3. ISP5 (International Streptomyces 5)
C’est un milieu solide contenant du glycérol. Il est aussi utilisé lors de l’identification
macroscopique des souches d’actinomycètes.
II.1.2.5. Milieu pour la détermination des pigments mélanoïdes et des
pigments diffusibles
II.1.2.5.1. ISP6 (International Streptomyces 6)
C’est un milieu solide à base de peptone utilisé pour déterminer la présence de
pigments dans les souches d’Actinomycètes.
Matériels et méthodes
18
II.1.2.5.2. ISP7 (International Streptomyces 7)
C’est un milieu solide contenant comme source de carbone le glycérol. Il est aussi
utilisé pour déterminer la présence de pigments dans les souches d’actinomycètes.
II.1.2.6. Milieu pour la détermination des caractères biochimiques
Recherche de nitrate réductase
II.1.2.6.1. Bouillon nutritif
C’est un milieu nutritif liquide dépourvu d’agar. Ce milieu est utilisé pour revivifier
les souches de microorganismes et pour rechercher la présence d’enzyme nitrate réductase.
II.1.2.7. Milieu pour la détermination des caractères physiologiques
Détermination de la température optimale de croissance
II.1.2.7.1. Sporulation Agar (SA)
C’est un milieu solide contenant de l’extrait de levure et de l’extrait de viande, il est
utilisé pour déterminer la température de croissance optimale des souches d’actinomycètes.
Détermination du pH optimum
II.1.2.7.2. CYD (Casamino Acids Yeast extracts D-glucose)
C’est un milieu solide mis au point par Crawford en 1993 pour déterminer le pH
optimum de croissance des souches d’actinomycètes.
II.1.2.8. Milieu pour la détermination du type respiratoire
II.1.2.8.1. Viande Foie (VF)
C’est un milieu de culture riche contenant un gradient de pression partielle en
dioxygène, il est utilisé pour l’étude du type respiratoire d'une bactérie.
II.1.2.9. Milieu pour la détermination de la mobilité
II.1.2.9.1. Mannitol–mobilité
C’est un milieu semi-solide permettant de mettre en évidence la réduction du nitrate
par les bactéries et leur mobilité à partir de la ligne d’ensemencement.
II.1.2.10. Milieu de dénombrement : Gélose nutritive
La gélose nutritive est habituellement employée pour la culture et le dénombrement
des microorganismes ; il permet de détecter la pureté des souches ainsi que d’assurer leur
conservation.
Matériels et méthodes
19
II.1.3. Milieu pour le test de résistance des souches : bouillon nutritif
C’est un milieu nutritif liquide dépourvu d’agar. Ce milieu est utilisé pour le test
l’acclimatation des souches isolées. La composition de chaque milieu est présentée en annexe
1.
II.1.4. Appareil Chromatographique en Phase Gazeuse (CPG)
La chromatographie en phase gazeuse est une méthode de séparation de composés
susceptibles d’être vaporisés par chauffage (sans décomposition).
La séparation se fait dans une colonne soit par partage soit par adsorption. Elle
permet :
• la microanalyse (de µg au mg) ;
• la séparation de mélanges complexes ;
• l’analyse qualitative et quantitative aisée ;
• des analyses dans de nombreux domaines d’application
La figure 5 montre le schéma de la description d’un ensemble chromatographique,
l’appareil CPG comprend schématiquement trois (3) modules spécifiques : un injecteur (1),
une colonne contenue dans une enceinte thermostatée (four) (2) et un détecteur (3) relié à un
intégrateur ou un ordinateur (4) sur lequel apparaît le chromatogramme.
Figure 5. Schéma de la description d’un ensemble chromatographique
1
2
3
4
Matériels et méthodes
20
II.2. METHODES
II.2.1. Quantification du polluant étudié (HAP)
Le taux des HAP dans le sol contaminé de Tsimiroro a été évalué par la méthode
Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) élaboré par Marine Environment Laboratory
(MEL) International Atomic Energy Agency en 2007 ; les étapes de l’analyse des HAP dans
le sol contaminé a été comme suit : l’échantillon du sol de Tsimiroro a été mélangé avec du
sulfate de sodium anhydre (Na2SO4) et avec de l’étalon interne ensuite conçu à l’extraction
par Soxhlet continu liquide - solide en utilisant l’hexane et le dichlorométhane comme solvant
puis la solution ainsi obtenu a été purifié par colonne avec du gel de silice et de l’alumine et
enfin la solution concentrée de HAP a été injecté dans le CPG pour pouvoir quantifier les
HAP présents dans le sol.
Le protocole détaillé lors du dosage des HAP par CPG est présenté en annexe 3.
La concentration des HAP présents dans le sol de Tsimiroro a été calculée par la
formule suivante :
𝐶𝐶𝑚𝑚,𝐸𝐸𝐸𝐸ℎ =𝑚𝑚𝐸𝐸𝐸𝐸 × 𝑚𝑚𝐸𝐸𝐸𝐸 × 𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸
, × 𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸ℎ𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸 × 𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸 × 𝑚𝑚𝐸𝐸𝐸𝐸
, × 𝑀𝑀𝐸𝐸𝐸𝐸ℎ×
100𝑀𝑀𝑆𝑆
𝐶𝐶m,Ech R: Concentration massique de l’échantillon 𝑚𝑚𝐸𝐸𝐸𝐸 : Masse de l’étalon ; 𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸
, : Surface de l’étalon interne de l’échantillon 𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸ℎ : Surface de l’échantillon ; 𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸 : Surface de l’échantillon aromatique 𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸 : Surface de l’échantillon interne ; 𝑚𝑚𝐸𝐸𝐸𝐸
, : Masse de l’étalon interne dans l’échantillon 𝑀𝑀𝐸𝐸𝐸𝐸ℎ : Masse brute de l’échantillon 𝑀𝑀𝑆𝑆 : Masse sèche.
II.2.2. Isolement des souches microbiennes
II.2.2.1. But
Le but de cette étape est d’isoler et d’avoir le maximum de souches microbiennes
contenues dans l’échantillon de sol.
II.2.2.2. Principe
Cette méthode consiste à isoler les souches microbiennes à partir de l’échantillon de
sol contaminé en utilisant des milieux spécifiques additionnés d’antibiotiques.
Matériels et méthodes
21
II.2.2.3. Mode opératoire
II.2.2.3.1. Isolement des souches de Pseudomonas fluorescents
Les Pseudomonas fluorescents sont isolés et dénombrés selon la technique décrite par
King et al., (1954). Cette technique est basée sur l’observation sous lumière ultraviolette à
254 nm de la pyoverdine, un pigment fluorescent qui représente la majeure partie des
sidéphores produites par ces bactéries.
Pour cela, 1 g de chaque échantillon de sol est donc pesé puis, des dilutions en cascade
(avec 9 ml de PBS) sont réalisées. L’ensemencement est effectué en surface. Les boîtes
ensemencées sont incubées à 30°C pour une durée d’incubation de 24 à 48 heures. Toutes les
colonies fluorescentes sont dénombrées et prélevées à l’aide de « cure-dents » préalablement
stérilisées puis repiquées dans de nouvelles boîtes de Pétri contenant du milieu King B.
II.2.2.3.2. Isolement des souches d’actinomycètes
Les actinomycètes sont des microorganismes faciles à cultiver. Par ailleurs, leur
croissance lente et leur faible nombre dans les échantillons de sol sont souvent masqués par
les bactéries et les champignons à croissance rapide lors de l’isolement. Par conséquent,
l’utilisation d’un milieu spécifique (AS1) additionné d’antibiotiques combiné à des
traitements des échantillons de sol facilite l’isolement de ces groupes de microorganismes. Un
prétraitement des échantillons de sol est entrepris avant l’isolement.
a. Prétraitement des échantillons de sol
Une semaine avant leur utilisation, les échantillons de sol sont distribués dans des
boîtes de Pétri stériles et laissés dans un dessiccateur sous vide contenant du silicagel qui
absorbe l’humidité. Cette étape préliminaire permet de sélectionner les actinomycètes dans
l’échantillon de sol.
b. Préparation de la solution de dilution et ensemencement du milieu
Un (1) gramme de sol est dilué dans 9 ml d’EDS puis agité au vortex deux fois
pendant 5 min ; cette suspension constitue la dilution 10-1.
Une série de dilutions décimales (jusqu’à 10-3) est effectuée pour chaque échantillon.
Le milieu est ensemencé en surface à raison de 0,1 ml par dilution par boîte de Pétri. Les
boîtes de Pétri sont incubées à 30°C et observées quotidiennement pendant une durée de 4
semaines.
Matériels et méthodes
22
Les colonies d’actinomycètes sont repérées par leur aspect macroscopique
caractéristique (colonies dures incrustées dans la gélose). La pureté des souches
d’actinomycètes est vérifiée par repiquages successifs sur de nouveaux milieux AS1 sans
antibiotiques.
II.2.2.3.3. Isolement de la flore totale cultivable
La flore totale est constituée, en grande partie, par des bactéries qui peuvent se
développer sur le milieu TSA (Triptic Soy Agar).
A l’aide d’une pipette stérile, 0,1 ml de chaque dilution décimale 10-1 à 10-4 sont
ensemencés sur milieu TSA. La culture est incubée à l’obscurité à 28°C. La lecture est faite
après 24 heures, 48 heures et 72 heures d’incubation et toutes les colonies formées sont
repiquées dans des boîtes de Pétri contenant du milieu TSA pour la purification.
II.2.3. Conservation des souches
Une colonie de chaque isolat est cultivée sur milieu King B liquide pour les
Pseudomonas, sur milieu TSA pour la flore totale cultivable et sur un milieu AS1 liquide pour
les Actinomycètes. Ces cultures en milieu liquide sont ensuite incubées à 30°C dans un bain
marie avec agitation pendant 24 heures pour les Pseudomonas et la flore totale cultivable et
pendant 4 à 7 jours pour les actinomycètes.
Un millilitre (1 ml) de chaque culture est prélevé par la suite à l’aide d’une
micropipette stérile et introduit dans un cryotube stérile contenant 1 ml de glycérol à 20%
(V/V) stérilisée à l’autoclave à la température 121°C pendant 20 min et à une pression de 1,5
bar (Isik et al., 1999). Les cryotubes contenant la culture ont été conservés dans le congélateur
à -80°C.
II.2.4. Test de résistance des souches isolées
II.2.4.1. But
Le but de cette partie étant de sélectionner des souches jugées comme étant résistantes
et efficientes après leur soumission volontaire dans une condition extrême de stress (milieux
de croissance dopés par des polluants).
II.2.4.2. Principe
Une quantité connue de population microbienne a été inoculée dans un milieu de
culture synthétique préalablement pollué par une quantité connue de mélange de HAP. Le
comportement des microorganismes à se développer dans de tel milieu est mis en évidence
Matériels et méthodes
23
ainsi que leur intérêt à utiliser les carbones des polluants comme source d’énergie et de
carbone pour leur métabolisme.
II.2.4.3. Mode opératoire
II.2.4.3.1. Préparation d’une solution mère de HAP
Des mélanges de 100 mg de chaque HAP (Naphtalène, Acénaphtène, Fluorène,
Phénanthrène, Anthracène, Fluoranthène, Pyrène, Benzo(a) anthracène) sont dissous dans 25
ml de solvant acétone. La concentration en Σ8HAP correspondante est ensuite calculée, c’est-
à-dire : 800 mg dans 25 ml soit 32000 mg/L (ou 32000 ppm).
La concentration correspondante à chacun des HAP est donnée en annexe 2.
II.2.4.3.2. Criblages des souches résistantes
Différentes concentrations de solution de HAP (250 mg/L ; 500 mg/L ; 1000 mg/L ;
1500 mg/L) sont préparées à partir de la solution mère. Pour chaque concentration, un volume
de solution de HAP est versé dans des tubes préalablement stériles puis laissés pendant 12
heures sous hotte. Ceci permet l’évaporation complète du solvant utilisé. Dix millilitres (10
ml) de bouillon nutritif sont ensuite ajoutés et le mélange est vortexé pendant quelques
secondes. Une suspension microbienne de 100 µl (qui correspond à 109 UFC/ml) est
additionnée et le mélange est incubé à 30°C sur un agitateur orbital à une vitesse de 150
rpm/s.
II.2.4.3.3. Dénombrement des bactéries
La croissance microbienne a été suivie pendant 10 à 65 jours selon la méthode de
Nombre les Plus Probables (NPP) (Rattanasomboon et al., 1999). A des intervalles de temps
qui dépendent de la croissance des souches, 1 ml de chaque culture ou de chaque dilution
décimale est ensemencé en profondeur sur milieu TSA avec trois répétitions. La culture est
incubée dans une étuve à 28°C pendant 24 à 48 heures et toutes les colonies formées sont
dénombrées.
II.2.4.3.4. Méthode de dénombrement
Le dénombrement consiste à compter les colonies présentes sur les boites en Unité
Formant Colonie (UFC). Le comptage se fait macroscopiquement. En tenant compte des
caractéristiques des colonies sur son milieu approprié, seules les boites ayant 30 à 300 UFC
sont retenues.
Matériels et méthodes
24
Le nombre d’Unité Formant Colonie est déterminé selon la formule :
𝑵𝑵 =𝑪𝑪𝟏𝟏 + 𝑪𝑪𝟐𝟐
𝑽𝑽(𝒏𝒏𝟏𝟏 + 𝟎𝟎,𝟏𝟏𝒏𝒏𝟐𝟐)𝒅𝒅
𝐶𝐶1 + 𝐶𝐶2 : Somme de toutes les colonies apparues sur les deux boites retenues ;
𝑉𝑉 : Volume de l’inoculum appliqué à chaque boite ;
𝑑𝑑 : Taux de dilution correspondant à la première dilution retenue ;
𝑛𝑛1 : Nombre de boîtes retenues à la première dilution ;
𝑛𝑛2 : Nombre de boîtes retenues à la deuxième dilution.
II.2.5. Identification des souches sélectionnées
II.2.5.1. Identification de la flore totale cultivable
L’identification des souches actives est effectuée avec une culture pure. Elle comporte
un certain nombre d’étapes suivant un ordre déterminé. C’est ainsi que l’identification des
bactéries comprend généralement :
• l’étude des caractères culturaux ;
• l’étude des caractères morphologiques et structuraux ;
• l’étude des caractères physiologiques ;
• l’étude des caractères biochimiques.
II.2.5.1.1. Etude des caractères culturaux
L’étude des caractères culturaux permet d’observer macroscopiquement l’aspect des
colonies (forme, taille, couleur, …) cultivées sur milieu solide TSA et l’aspect de la culture
cultivée sur milieu liquide (bouillon nutritif).
II.2.5.1.2. Etude des caractères morphologiques et structuraux
Cette étude permet en général de différencier la morphologie, la mobilité, le mode de
groupement et éventuellement la mode de reproduction végétative de la souche bactérienne.
La mise en évidence de ces caractères est réalisée grâce à une étude microscopique des
bactéries qui comprend un examen à l’état frais (Marchal, 1985) et un examen après fixation
et coloration de frottis (Marchal, 1985 ; Singleton, 1999).
II.2.5.1.3. Etude des caractères physiologiques
Cette étude permet de déterminer le comportement des bactéries vis-à-vis de certains
facteurs du milieu (température, enzymes respiratoires,…).
Matériels et méthodes
25
a. Mise en évidence des enzymes respiratoires
Test de catalase (SINGLETON, 1999; GASSER F, 1989)
Certaines bactéries peuvent dégrader le peroxyde d’hydrogène en eau et en oxygène
moléculaire par production d’un enzyme appelé catalase selon la réaction :
2H2O2 2H2O + O2
Peroxyde d’hydrogène Eau oxygène
moléculaire
Pour le mettre en évidence, la souche est mise en contact avec une solution fraîche de
peroxyde d’hydrogène à 10 volumes. Un dégagement gazeux abondant sous forme de mousse
ou de bulles traduit la décomposition de peroxyde d’hydrogène sous l’action de la catalase.
Test de peroxydase (Singleton, 1999; Gasser, 1989)
Ce test consiste à déterminer la présence ou non d’un type de cytochrome dans la
chaîne respiratoire d’une bactérie. Pour cela, 1 ml de mélange à partie égale d’une solution de
benzidine à 1% dans l’acide acétique N et de l’eau oxygénée à 1% est ajouté dans une culture
bactérienne sur bouillon nutritif de 24 heures. Une coloration bleu-noir survenant
immédiatement traduit la présence de peroxydase dans le système enzymatique du germe.
b. Influence de la température (Singleton, 1999)
Les microorganismes selon les espèces peuvent se développer dans un large intervalle
de température. L’étude consiste à incuber la souche à étudier à différentes températures, les
autres paramètres étant maintenus constants. Les températures d’incubation sont : 4°C – 8 °C
– 15 °C – 30 °C 37 °C et 45 °C. La croissance bactérienne appréciée par la turbidité du milieu
est observée tous les jours.
II.2.5.1.4. Etude des caractères biochimiques
Cette étude permet de distinguer différents genre ou espèces bactériens en se basant
sur la différence de métabolisme.
Galerie LEMINOR
La galerie LEMINOR permet de :
• déterminer l’équipement enzymatique du genre ;
• étudier la fermentation des sucres par les bactéries ;
• caractériser les réactions cataboliques.
Catalase
Matériels et méthodes
26
Elle est réalisée à partir d’une colonie bactérienne prélevée à partir d’une culture pure.
Cette colonie est homogénéisée dans un tube de 10 ml d’eau distillée stérile.
Les modalités d’ensemencement, de lecture et d’interprétation de la galerie LEMINOR
sont résumées dans le tableau 5 qui suit.
Tableau 5. Modalité d’ensemencement, de lecture et d’interprétation de la galerie
LEMINOR
Milieu Ensemencement Lecture après incubation 24 heures à 30°C Réaction + Réaction -
Mannitol Mobilité Nitrate
Piqûre centrale
Virage au jaune Diffusion de la culture
Précipité rouge après ajout de réactif de Griess : nitrate +
Pas de virage Pas de diffusion de culture
Pas de précipité après ajout de réactif de Griess: nitrate -
Hajna Kligler
Pente en stries
ascendantes et piqûre centrale
Culot jaune : glucose + Pente jaune : lactose +
Présence de bulles : gaz + Présence de précipité noir :
bactérie H2S +
Culot rouge : glucose – Pente rouge : lactose –
Absence de bulles : gaz – Absence de précipité noir :
bactérie H2S - Lysine
Fer
Pente en stries ascendantes et piqûre
centrale
Culot jaune : LDC – Pente jaune : LDA +
Culot violet : LDC + Pente violette : LDA -
Citrate de Simmons
Pente en stries ascendantes Virage au bleu Pas de virage
Urée
indole
Quelques gouttes de suspension
bactérienne dans 1 ml du milieu
Virage au rouge : uréase + Formation d’un anneau rouge à la surface après ajout de réactif
de Kovacs : indole +
Pas de virage : uréase – Pas d’anneau après ajout de
réactif de Kovacs : indole –
+ : positif LDC : lysine décarboxylase H2S:sulfure d’hydrogène –: négatif LDA : lysine désaminase
II.2.5.2. Etude phénotypique de la souche d’actinomycète
L’identification de la souche d’actinomycète par étude phénotypique nécessite l’étude
des différents caractères de la souche tels que les caractères culturaux, les caractères
morphologiques, les caractères physiologiques et les caractères biochimiques.
II.2.5.2.1. Etude des caractères culturaux
Cette étude permet d’observer macroscopiquement l’aspect des colonies sur milieu
solide. Les caractères culturaux sont déterminés sur des milieux de culture spécifiques : ISP2,
ISP4, ISP5 (Shriling et Gottlieb, 1966), le milieu AS1, le milieu Amidon-Caséine agar, le
milieu Nutrient agar, et le milieu sporulation agar. L’inoculum préparé précédemment est
ensemencé en stries sur ces différents milieux. L’importance de la croissance, le
Matériels et méthodes
27
développement du mycélium de substrat et du mycélium aérien ainsi que la recherche de la
présence des pigments diffusibles dans la gélose autres que les pigments mélanoides, sur
chaque milieu sont notés après 07, 14 et 21 jours d’incubation à 30°C.
II.2.5.2.2.Etude des caractères morphologiques
Technique de culture sur lamelle (Cross, 1989)
Cette étude consiste en l’observation microscopique de la morphologie des spores, du
mycélium de substrat et du mycélium aérien d’une culture de souches d’actinomycètes sur
lamelle. Une lamelle stérile est insérée délicatement dans un milieu gélosé (ISP2), de manière
à former un angle d’environ 45°. Une goutte de l’inoculum est déposée contre la lamelle en
contact avec le milieu. Après 14 jours d’incubation à 30°C, la lamelle est retirée
soigneusement de la gélose, déposée sur une lame et examinée au microscope à immersion à
l’objectif x 100.
II.2.5.2.3. Etude des caractères physiologiques
L’étude des caractères physiologiques permet de déceler le comportement des
bactéries vis-à-vis de certains facteurs de milieu (température, pH, tolérance en sel,…). Pour
la détermination de la température optimale, la croissance est estimée après 21 jours
d’incubation à 5°C, 15°C, 20°C, 30°C, 37°C, 45°C et 55°C. Le pH optimum de croissance a
été étudié sur milieu CYD tamponné à différents pH (Crawford et al., 1993). La tolérance
maximale au Na Cl est réalisée sur milieu AS1 (Tresner et al., 1968). Le type respiratoire se
fait sur milieu viande-foie (VF) selon la méthode décrite par Guiraud en 1998. La
détermination de la mobilité des actinomycètes a été réalisée sur milieu mannitol-mobilité
(Guiraud, 1998). La mise en évidence des pigments mélanoides produits par les souches
représentatives est réalisée sur les milieux ISP6 et ISP7 en gélose inclinée (Shirling et
Gottlieb, 1966 ; Mochevaetal.,2002).
II.2.5.2.4. Etude des caractères biochimiques
Cette étude permet de distinguer différents genres ou espèces d’actinomycètes en se
basant sur la différence de métabolisme. Elle est basée sur la recherche de l’enzyme la
catalase, la recherche de l’uréase et de la production d’indole, l’hydrolyse de la caséine
(Williams et Cross, 1971 ; Gordon et Smith, 1953) et l’hydrolyse de l’amidon (Gordon et
Smith, 1953) et la fermentation des différentes sucres selon la méthode décrite par Pridham et
Gottlieb en 1948.
Matériels et méthodes
28
II.2.6. Dosage des HAP résiduels
II.2.6.1. Quantification des HAP résiduels
Dans cette étape, seules les souches résistantes à la solution des HAP à la
concentration de 1500 mg/L sont à considérer. Pour cela, le même protocole que dans la
deuxième étape est appliqué. Un milieu liquide propre sans HAP et sans microorganismes est
réservé pour servir de témoin négatif.
A chaque prélèvement, la suspension bactérienne (ainsi que le blanc) est filtrée en
utilisant du papier filtre en fibre de verre. Le filtrat ainsi obtenu est ensuite utilisé pour
l’extraction des HAP résiduels.
Cette extraction se déroule en 2 étapes :
• Extraction des HAP résiduel : le filtrat additionné de trois volumes égaux de solvant
d’extraction (acétate d’éthyle) sont versés dans une ampoule à décanter de 100 ml et
agités vigoureusement pendant au moins 5 min puis laisser décanter pendant 15 min.
La phase organique est récupérée dans un ballon à fond rond de 100 ml.
• Pré-concentration : L’extrait est évaporé à l’aide d’un évaporateur rotatif jusqu’à
obtenir un volume de 2 ml environ. Puis l’extrait est évaporé de nouveau avec un flux
d’azote pour obtenir exactement un volume final de 0,5 ml. L’extrait final est transféré
à l’aide d’une micro-seringue en verre dans un tube de 1,5 ml de contenance puis
passé à la GC et quantifié, il est ensuite conservé au congélateur.
Résultats
RESULTATS
Résultats
29
III.1. TAUX DES HAP DANS L’ECHANTILLON DU SOL CONTAMINE L’analyse chromatographique en phase gazeuse (CPG) de l’échantillon de sol de
Tsimiroro a permis de mettre en évidence la présence de quatorze (14) HAP composé de
naphtalène, acénaphtylène, acénaphtène, fluorène, phénanthrène, anthracène, fluoranthène,
pyrène, benzo[a]anthracène, chrysène benzo[b]fluoranthène, benzo[k]fluoranthène, benzo[a]
pyrène, dibenzo[a,h]anthracène.
Le tableau 6 suivant montre les différents HAP et leurs concentrations présentes dans
l’échantillon de sol de Tsimiroro après le dosage chromatographique :
Tableau 6. Les différents HAP présents dans le sol de Tsimororo
N° Noms des composés Formule brute
Nombre de cycle
Concentration (mg/kg)
1 Naphtalène C10H8 2 2,985 2 Acénaphtylène C12H8 3 1,436 3 Acénaphtène C10H10 3 0,002 4 Fluorène C13H10 3 0,765 5 Phénanthrène C14H10 3 0,374 6 Anthracène C14H10 3 0,418 7 Fluoranthène C16H10 4 0,105 8 Pyrène C16H10 4 0,247 9 Benzo[a]anthracène C18H12 4 0,156
10 Chrysène C18H12 4 3,805 11 Benzo[b]fluoranthène C20H12 5 0,649 12 Benzo[k]fluoranthène C20H12 5 1,755 13 Benzo[a] pyrène C20H12 5 0,983 14 Dibenzo[a,h]anthracène C22H14 5 0,251
III.2. ISOLEMENT DES SOUCHES MICROBIENNES Vingt-six (26) souches microbiennes ont été isolées à partir de sol pollué par les
hydrocarbures dans un site industriel d’un grand gisement d’huile lourde de Tsimiroro dont
quatre (4) Pseudomonas fluorescents (numérotées de P1 à P4), dix (10) actinomycètes
(numérotées d’A1 à A10) et douze (12) flores totales cultivables (numérotées de F1 à F12).
Les isolats de Pseudomonas fluorescents sont reconnaissables par le reflet d’un
pigment fluorescent sous la lumière ultraviolette de longueur d’onde 254 nm (photo 1).
Résultats
30
Photo 1. Souches pures de Pseudomonas fluorescents sur le milieu King B
Les souches d’actinomycètes isolées sont morphologiquement identiques c’est-à-dire les
colonies sont opaques, de forme arrondie, de petite taille, à bords irréguliers et incrustées dans
le milieu de culture. Les souches se différencient par la couleur du mycélium aérien et celle
du mycélium végétatif, leurs tailles et la production de pigments (photo 2).
Souche d’actinomycète Souche pure d’actinomycète Souches d’actinomycètes produisant des pigments sur milieu AS1 de différents couleurs
Photo 2. Variétés des souches d’actinomycètes isolées sur milieu AS1
III.3. TEST DE RESISTANCE DES SOUCHES ISOLEES Les résultats des tests de résistance ont montré que parmi les 26 souches, seulement
deux souches (codées A1 et F2) sont résistantes au milieu hautement contaminé. C’est-à-dire
que ces souches ont de la capacité de se développer en milieu contaminé par les HAP
(Σ8HAP) à une teneur de 1500 mg/L. Les dénombrements des colonies s’effectuent
régulièrement; le temps de prélèvement dépend de la croissance de chaque souche étudiée.
Les résultats ont montré que la population microbienne augmente au cours de
l’expérience. Pour la souche F2, il y a augmentation rapide de la population microbienne du
début de l’expérience jusqu’à 12ème jours d’incubation. La croissance se stabilise au 20ème jour
jusqu’à 45ème jour. Par contre, la souche A1 croit progressivement au cours de test. Les
Résultats
31
tableaux ci-dessous présentent les résultats de dénombrement de la souche A1 et de la souche
F2 pour chaque temps de prélèvement en milieu contaminé par les HAP 1500 mg/L.
Tableau 7. Dénombrement de colonies de la souche A1 à chaque temps de prélèvement sur
milieu bouillon nutritif mélangé avec les HAP 1500 mg/L
Durée d’incubation (en jours)
Dénombrement 1j 7j 15j 27j 34j 48j 55j 62j
A1 (UFC/ml) 4,2.108 8,9.108 2,6.109 3,5.109 5,3.109 8.108 4,5.108 4,7.107
Tableau 8. Dénombrement de colonies de la souche F2 à chaque temps de prélèvement sur
milieu bouillon nutritif mélangé avec les HAP 1500 mg/L
Durée d’incubation (en jours)
Dénombrement 1 j 4 j 7 j 12 j 20 j 25 j 32 j 39 j 45 j
F2 (UFC/ml) 1,4.108 9,1.109 5,3.1010 6,1.1010 7,6.109 7,6.109 109 6,8.108 2,5.108
III.4. IDENTIFICATION DES SOUCHES SELECTIONNEES Ces deux souches ont fait l‘objet d’une identification culturales, morphologiques,
physiologiques et biochimiques.
II.4.1. Identification de la souche A1
L’ensemble des caractères culturaux, morphologiques ainsi que les caractères
physiologiques et biochimiques étudiées de la souche A1 a permis de classer les souches dans
le genre Streptomyces. En se référant à la 9ème édition du Manuel de Bergey, l’isolat A1 se
rapproche à l’espèce Streptomyces sp.
Les caractères culturaux, morphologiques, physiologiques et biochimiques de cette
souche sont donnés dans les tableaux ci- après.
Résultats
32
Tableau 9. Caractéristiques culturales de la souche d’actinomycète A1
ISOLAT A1 :
Milieux Croissance Sporulation Mycelium de substrat
Mycelium aérien
Pigment diffusible
ISP2 ++ + brunâtre blanc - ISP4 ++ + brunâtre blanc - ISP5 ++ + brunâtre blanc -
Nutrient agar - - - - - AS1 +++ + Brun blanc - SCA +++ + Blanc blanc -
Sporulation agar ++ + Brun blanc -
Tableau 10. Caractères morphologiques, physiologiques et biochimiques de la souche A1
Caractéristiques Isolat
Caractéristiques Isolat
A1 A1 Production de pigment
mélanoïde : Température de croissance:
ISP6 - 4°C - ISP7 + 15°C ++
Activité enzymatique : 20°C +++ Hydrolyse de l’amidon + 30°C +++ Hydrolyse de caséine + 37°C ++
Catalase + 44°C - Uréase - Croissance à pH:
Coagulation du lait écrémé + 3,3 - Peptonisation du lait écrémé - 5,3 ++
Production d’indole - 7,3 +++
Type respiratoire Aérobie
strict 9,3 +++
Mobilité - 12,3 - Tolérance en NaCl: Source de carbone:
0% + Mannitol - 1% +++ Glucose + 3% ++ Galactose + 5% - Tréhalose - 7% - Maltose + 9% - Arabinose -
10% - Dulcitol + Saccharose + Rhamnose -
- : négatif, inhibition de la croissance / + : positif, croissance faible / ++ : croissance
modérée +++ : croissance abondante
Résultats
33
III.4.2. Identification de la souche F2
L’étude des caractéristiques culturales, morphologiques, physiologiques et biochimiques a
permis de rapprocher la souche F2 à l’espèce Bacillus simplex. Les caractères culturaux,
morphologiques, physiologiques et biochimiques de ces trois souches sont donnés dans les
tableaux ci- après.
Tableau 11. Caractère culturaux, morphologiques et physiologiques de la souche F2
Souches Test F2
Caractères culturaux
Croissance : rapide Couleur : crème
Surface et texture : brillante Contour : irrégulier
Hauteur: légèrement surélevé Diamètre: 3- 6 m après 2 jours d’incubation
Caractères morphologiques
Gram + Bacille
0,7 -0,9 µm de diamètre Mobile
Caractère physiologiques Influence de la Température
4 °C - 8 °C +
20 °C ++ 30 °C +++ 37 °C ++ 45 °C -
pH 7 Enzymes respiratoires Catalase +
- : négatif + : croissance faible ++ : croissance moyenne+++ : croissance abondante
Tableau 12. Caractère biochimiques de la souche F2
Souches Milieu F2
Utilisation des sucres :
L-arabinose + Fructose +
Milieu urée indole
Uréase - Xylose + Indole - Raffinose +
SIMMONS Citrate perméase + Ribose +
Mannitol mobilité nitrate
Mannitol + Sucrose + Mobilité Mobile Trehalose + Nitrate
réductase + Sorbitol +
Lysine -fer LDA - D-xylose - LDC - Rahmnose -
Hajna-Kligler
Glucose + D-manose - Lactose + D-arabinose -
H2S - Cellulose - Gaz +
- : réaction négative / + : réaction positive
Résultats
34
III.5. RENDEMENT D’ELIMINATION DE CHAQUE HAP Les genres Streptomyces sp. et Bacillus qui ont été identifiées, sont utilisés pour le
dosage des HAP résiduels dans le milieu de culture mélangé avec les HAP à la concentration
de 1500 mg/L. Chaque souche est étudiée séparément. Les suivis des concentrations
s’effectuent régulièrement, le temps de prélèvement dépend de l’état d’évolution de
concentration en HAP dans le milieu lors de l’incubation. Si la dégradation est rapide, les
prélèvements ont été effectués à des intervalles de temps courts et à l’inverse, si la
dégradation est modeste, les prélèvements sont effectués toutes les semaines ou tous les dix
jours. Le tableau ci-dessous présente les rendements d’élimination de chaque HAP pour
chaque temps de prélèvement. Pour mieux visualiser les résultats, ces données sont présentées
en forme de graphe (figure 6 et figure 7).
Tableau 13. Rendement d’élimination des HAP en pourcentage (%) pour chaque durée
d’élimination
Pourcentage d’élimination (%) des HAP en fonction de leur durée d’incubation (en jours)
Streptomyces sp. (A1)
HAP 0j 1j 7j 18j 28j 45j 51j 58j 62j 75j
Naphtalène 0 23,74 50,33 62,24 75,32 73,15 69,12 80,32 83,79 85,38
Acénaphtène 0 13,50 34,55 46,23 68,29 71,44 70,43 77,65 80,10 82,36
Fluorène 0 19,11 41,18 45,66 52,73 57,26 48,32 65,25 68,51 73,27
Phénanthrène 0 21,42 49,31 53,60 69,99 73,22 68,45 70,95 74,98 76,19
Anthracène 0 15,33 29,61 50,33 55,91 61,22 51,47 61,26 66,59 71,86
Fluoranthène 0 0 3,76 17,33 31,44 34,15 33,23 36,17 38,55 40,17
Pyrène 0 0 2,79 15,12 32,75 30,41 29,36 42,13 47,56 50,28
Benzo(a)anthracène 0 0 1,32 10,24 27,40 29,12 26,48 27,68 30,31 32,42
Bacillus simplex (F2)
HAP 0j 1j 7j 15j 25j 46j 53j 59j 63j 72j
Naphtalène (2) 0 0 6,45 68,59 74,41 78,74 82,15 86,35 91,63 95,32
Acénaphtène (3) 0 0 4,21 39,20 48,61 60,32 64,26 70,13 74,29 78,41
Fluorène (3) 0 0 5,22 47,76 61 ,02 65,44 72,09 78,56 80,63 83,45
Phénanthrène (3) 0 0 8,73 55,39 72,52 81,11 85,90 89,31 88,30 86,66
Anthracène (3) 0 0 7,22 72,31 76,22 79,16 82,19 84,72 86,1 89,31
Fluoranthène (4) 0 0 2,30 26,22 32,44 47,31 50,88 51,25 52,38 54,22
Pyrène (4) 0 0 3,71 31,66 40,21 50,23 52,16 54,19 56,33 58,37
Benzo(a)anthracène 0 0 1,97 12,65 19,95 24,63 31,44 36,79 40,36 45,21
Résultats
35
La figure 6 présente l’évolution de rendement d’élimination des 8 HAP par le
Streptomyces sp. en fonction de la durée d’incubation. Le rendement d’élimination augmente
linéairement au début de l’expérience jusqu’à 28ème jours d’incubation pour les 8 HAP puis la
dégradation semble moins vite, la courbe semble atteint le plateau au bout de 75 jours
d’incubation. Cette espèce dégrade plus efficacement et plus rapidement les HAP légers : le
naphtalène, l’acénaphtène, le fluorène, le phénanthrène et l’anthracène (cycles aromatiques ≤
3) que les HAP lourds (le fluoranthène, le pyrène et le benzo(a)anthracène). Ces résultats
montrent que Streptomyces sp. est une espèce potentielle pour éliminer les HAP dans le
milieu de culture.
Figure 6. Rendement d’élimination de huit HAP en pourcentage (%) en fonction de
durée d’incubation pour l’espèce Streptomyces sp.
La figure 7 ci-dessous présente le pourcentage d’élimination des 8 HAP par Bacillus
simplex en fonction de la durée d’incubation. Des résultats similaires que précédemment ont
été observés. Cette espèce de Bacillus simplex élimine plus facilement les HAP composés de
cycles aromatiques ≤ 3 que les HAP lourds. Cependant, le Bacillus simplex dégrade le
naphtalène et l’anthracène plus rapidement que les autres HAP.
En égard aux résultats obtenus, l’espèce de Bacillus simplex semble pouvoir dégrader
ces HAP plus vite que l’espèce de Streptomyces sp.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 1 7 18 28 45 51 58 62 75
Pour
cent
age
d'él
imin
atio
n (%
)
Durée d'incubation (jours)
Naphtalène
Acénaphtène
Fluorène
Phénanthrène
Antrhacène
Fluorenthène
Pyrène
Benzo(a)anthracène
Résultats
36
Figure 7. Rendement d’élimination de huit HAP en pourcentage (%) en fonction de
durée d’incubation pour l’espèce Bacillus simplex
0
20
40
60
80
100
120
0 1 7 15 25 46 53 59 63 72
Pour
cent
age d
'élim
inat
ion
(%)
Durée d'incubation (jours)
Naphtalène
Acénaphtène
Fluorène
Phénanthrène
Antrhacène
Fluorenthène
Pyrène
Benzo(a)anthracène
Discussions
DISCUSSIONS
Discussions
37
DISCUSSIONS
L’objectif de cette étude était (i) de sélectionner les souches résistantes à une gamme
croissante de concentration de mélange HAP étudiés dans des milieux de culture spécifique et
(ii) de suivre la cinétique de dégradation des polluants en mettant en œuvre différents
microorganismes sélectionnés.
Dans la première partie de l’étude dont les activités visent principalement à
sélectionner des souches jugées comme étant résistantes et efficientes après leur soumission
volontaire à une condition extrême de stress (milieux de croissance dopés par des polluants).
Pour y parvenir, plusieurs étapes de travaux ont été poursuivies.
Diverses espèces de microorganismes (bactéries, champignons) ont été identifiées
comme étant capable de dégrader ces composés mais d’une façon limitée. Dans notre étude,
trois (3) groupes de microorganismes (le genre Pseudomonas, les actinomycètes et la flore
totale cultivable) ont été isolés à partir de sol pollué par les hydrocarbures. Ces trois types de
microorganismes ont déjà été rapportés comme étant capables de dégrader les HAP dans le
sol (Kurkela et al., 1988; Simon et al., 1993; Mahmoud et Rama, 1993 ; Yang et al., 1994).
L’isolement des microorganismes rhizosphériques nécessite des techniques permettant
d’obtenir un nombre considérable des isolats à partir de sol pollué par les hydrocarbures. A
cette fin, l’utilisation des méthodes d’isolement sélectives a été une étape cruciale.
L’isolement sélectif des microorganismes n’est pas exactement facile pour les souches
d’actinomycètes. Les substrats apportés par les produits utilisés pour le milieu favorisent non
seulement la croissance des actinomycètes mais aussi d’autres bactéries à croissance rapide et
des champignons. De ce fait, la présence de ces derniers empêche un isolement facile des
actinomycètes qui ont un temps de génération relativement long (Williams et al., 1982;
Crawford et al.,1993). L’utilisation de milieu contenant de la chitine, de l’amidon, de
l’arginine, de l’asparagine, de la caséine conduit à un isolement sélectif des actinomycètes
alors que la croissance des bactéries et des champignons est faible (Williams et Davies, 1965).
Ce qui explique le choix du milieu AS1 pour l’isolement, ce milieu contient de
l’amidon, de l’arginine et de l’asparagine. L’AS1 est surtout utilisé pour l’isolement des
souches d’Actinomycètes telluriques. Il a été utilisé par le Laboratoire de Daw Agro Sciences
(DAS) pour l’isolement des souches d’actinomycètes à partir du sol.
Les techniques d’isolement utilisées consistent en un prétraitement par la chaleur de
l’’échantillon et à l’addition dans le milieu d’isolement, d’antibiotiques inhibant la croissance
Discussions
38
de germes envahisseurs (Larpent et Sanglier, 1989; Ouhdouche et al., 2001; Hilali et al.,
2002 ; Jung Yeoplee, 2002). Cependant, l’utilisation d’antibiotiques lors de l’isolement est un
sujet controversé. Certains auteurs pensent que les antibiotiques inhibent beaucoup
d’actinomycètes (Porter et al., 1960) et d’autres au contraire suggèrent l’emploi d’un mélange
antifongique et antibactérien (Dulaney et al.,1955 ; Williams et Davies ,1965).
Dans cette étude, trois (3) antibiotiques ont été utilisés : l’acide nalidixique qui permet
l’élimination des bactéries à Gram négatif selon Suzuki et al. (1999). Les actinomycètes
peuvent résister à l’acide nalidixique jusqu’à une concentration de 10 μg/ml. La
triméthoprime quant à elle, inhibe les bactéries à croissance rapide (Labeda et Shearer, 1990).
Et la cycloheximide qui est un inhibiteur utilisé pour l’isolement des actinomycètes (Wang et
al., 1999).
L’ajout d’antibiotiques dans le milieu d’isolement n’a pas empêché la croissance de
quelques petites colonies de champignons mais ce sont surtout les bactéries à Gram positif qui
posent problème : elles ne peuvent pas être éliminées et envahissent la gélose, gênant ainsi la
croissance des actinomycètes.
Pour les Pseudomonas fluorescents, l’isolement a été effectué sur milieu de culture
King B (King et al., 1954). Cette technique est basée sur l’observation sous lumière
ultraviolette à 254 nm de la pyoverdine, un pigment fluorescent qui représente la majeure
partie des sidéphores produites par ces bactéries. Connus pour être abondants dans les sols
rhizosphériques (Kragelund et Nybroe, 1996), les Pseudomonas fluorescents ont une densité
dépendant beaucoup de son statut symbiotique et de la nature de la plante (Founoune et
Duponnois, 2002). Ces derniers auteurs ont confirmé que ce groupe de bactéries est
particulièrement abondant autour des racines mycorhizées.
Les flores totales sont des microorganismes faciles à cultiver. Elles sont constituées,
en grande partie, par des bactéries à croissance rapide qui peuvent se développer sur le milieu
TSA. Par conséquent, l’utilisation d’un milieu à base de peptone sans antibiotiques permet
facilement l’isolement de ces groupes de microorganismes.
Ces différentes méthodes ont été utilisées afin de récupérer un maximum de
microbiennes viables et cultivables. Le protocole adopté s’est ainsi avéré efficace. En effet,
vingt-six (26) souches microbiennes ont été isolées et purifiées. Douze (12) souches des flores
totales cultivables, dix (10) souches d’actinomycètes et quatre (4) souches de Pseudomonas
fluorescents proviennent d’un échantillon de sol contaminé par les hydrocarbures. D’une
Discussions
39
manière générale, le nombre des souches isolés à partir de sol contaminé par les
hydrocarbures est largement élevé pour effectuer de test d’acclimatation et la suivi cinétique
de la dégradation des molécules des HAP. La présence d’un nombre moins élevé de souche de
Pseudomonas fluorescent dans le sol indique que la croissance de ce genre de bactérie est
inhibée à un certain seuil de HAP dans le sol. Il est possible également que le taux de
nutriments dans le sol est épuisé et influence cette inhibition en présence de toxicité élevée de
HAP.
En ce qui concerne l’effet des polluants sur la biomasse, nos résultats montrent
clairement la capacité de certaines souches isolées à résister et à se développer en milieu
contaminé par une gamme croissante de concentration de mélange HAP. Les populations
microbiennes indigènes d’un écosystème pollué ne présentent pas tous les outils métaboliques
permettant de réaliser une dégradation complète des polluants dans le cadre d’une atténuation
naturelle. L’acclimatation (ou bio-stimulation) est une méthode utilisée pour améliorer ce
processus de biodégradation en modifiant les conditions environnementales par adjonction de
surfactants, de nutriments, d’eau, de donneurs ou d’accepteurs d’électrons. Les conditions
favorables pour la croissance des microorganismes sont tout de même fournies au maximum
afin d’assurer leur viabilité.
Lors de cette acclimatation, la survie de la souche A1 (actinomycète) et la souche F2
(flore totale cultivable), en présence de concentration élevée de HAP (1500 mg/L), révèle déjà
leur résistance ainsi que leur efficacité dans le processus de biodégradation. Elles s’adaptent
facilement à ce type d'environnement tant du point physiologique et que génétique. Le fait
que le taux de population microbienne augmente au cours cette expérience démontre la
capacité de ces deux souches à utiliser les carbones des polluants comme source de carbone et
d’énergie.
Ces deux (2) souches ont fait l’objet d’une identification phénotypique. La souche F2
a été identifiée par plusieurs caractères tels que les caractères culturaux, les caractères
morphologiques, les caractères physiologiques et les caractères biochimiques. En
l’occurrence, l’ensemble de ces caractères a permis de rapprocher la souche F2 à l’espèce de
Bacillus simplex. C’est une espèce particulière que l’on retrouve dans les endroits chauds tels
qu’en Afrique. Leur croissance bactérienne peuvent avoir lieu jusqu’à 43°C (Sikorski et
Nevo, 2007).
Discussions
40
Pour la souche d’actinomycète A1, l’identification a été effectuée au niveau de
l’espèce selon la méthode préconisée par l’International Streptomyces Project, par des
analyses phénotypique. L’étude macroscopique et microscopique des isolats sur différents
milieux de culture, permet de suivre le développement et l’arrangement des mycéliums de
substrat et aérien ainsi que la formation des spores, elle permet aussi d’observer la forme et
l’aspect des colonies. L'ensemble des caractères culturaux, morphologiques ainsi que les
caractères physiologiques et biochimiques étudiés, a permis de classer cette souche dans
l’espèce Streptomyces p. D’autant plus, les résultats obtenus seront utiles pour optimiser les
conditions de culture afin d’augmenter la capacité de cette souche à résister et à se développer
dans de milieu hautement contaminé par les HAP.
Pour cette étude, les informations apportées par les études phénotypiques ne sont pas
suffisantes pour l’identification au niveau de l’espèce. D’autres techniques sont ainsi
suggérées pour l’identification de ces deux genre bactériens, à savoir les séquences
intergéniques répétitives d'ADN (rep-PCR) (Sadowsky et al., 1996), PCR- RFLP du gène
codant la protéine du choc thermique 65-kDa (Steingrube et al., 1997), ou le séquençage du
gène rpoB codant la sous unité β de l’ARN polymérase (Kim et al., 2004).
Dans la deuxième partie de l’étude, l’objectif était de suivre la cinétique de
dégradation des polluants par les souches sélectionnées de Streptomyces sp. et de Bacillus
simplex.
Les genres Actinomycètes et Bacillus sont connus pour leur capacité à dégrader les
molécules HAP dans le sol. Nos résultats montrent que ces deux espèces de bactéries ont des
forts potentiels dans l’élimination de HAP dans le milieu. Les deux souches dégradent plus
efficacement et plus rapidement les HAP légers (cycles aromatiques ≤ 3) par rapport aux HAP
composés de quatre (4) cycles aromatiques. Les deux souches sélectionnées ont pu utiliser les
carbones de naphtalène, d’acénaphtène, de fluorène, de phénanthrène et d’anthracène comme
source de carbone et d’énergie. Les résultats lors de cette étude sont conformes à ceux trouvés
dans la littérature qui ont indiqué que les souches d’actinomycètes et de Bacillus telluriques
dégradent facilement les HAP composés de deux (2) et trois (3) cycles aromatiques (Das and
Mukhjee, 2007 ; Jacques et al., 2008).
Quant au HAP composés de quatre (4) cycles aromatiques, la capacité de ces isolats à
minéraliser, décomposer ou transformer les HAP en substances moins nocives est réduite.
Discussions
41
Cela est surement dû à l’hydrophobicité élevée de HAP (fluoranthène, le pyrène et le
benzo(a)anthracène). Ainsi, ils ne sont pas bio-disponibles pour ces deux souches.
Selon la littérature, les HAP lourds sont difficilement dégradés si des bactéries
individuelles sont mises en en œuvre. De nombreuses études ont montré que l’emploi de
consortium de bactérie est plus efficace pour la dégradation des matières polluantes (Ghazali
et al., 2004 ; Goux et al., 2003) et que la combinaison avec une phytoremédiation augmente
le pourcentage de dégradation (Jingchant Tang et al., 2010). Jacques et al., (2008) ont
déjà évalué la capacité de consortium de six (6) souches (Mycobacterium fortuitum,
Bacillus cereus, Mycrobactérium sp., Gordonia polyisoprenivorans, Microbacteriaceae
bactérium et Fusarium oxysporum) et qui ont pu dégrader et minéraliser l’anthracène, le
phénanthrène et le pyrène dans le sol avec un taux de dégradation allant de 96% à 99% au
bout de 70 jours. Une liste de type de microorganismes sélectionnés pour des essais de
bioaugmentation des sols contaminés par les composés aromatiques est détaillée dans le
travail de Agnieszka Mrozik et al., 2010.
Conclusion générale et perspectives
CONCLUSION GENERALE ET
PERSPECTIVES
Conclusion générale et perspectives
42
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Le présent travail portant sur « Sélection et identification des souches telluriques
impliquées dans la dégradation des Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques», nous a
permis de :
de maitriser les techniques usuelles en microbiologie et en physico-chimique,
d’apporter des informations sur l’abondance des souches microbiennes dans le
sol pollué par les hydrocarbures,
de mettre en place une banque de souches microbiennes utilisable dans les
recherches à venir,
d’apporter des informations sur la potentialité des microorganismes telluriques
à résister et à dégrader les HAP,
de mettre en évidence la diversité phénotypique des souches sélectionnées.
Nous avons mis en évidence l’activité dégradante des microorganismes telluriques
sélectionnés de milieu pollué par une quantité connue de mélange de HAP aussi bien les HAP
légers composés de deux (2) et trois (3) cycles aromatiques que les HAP lourds composés de
quatre (4) cycles aromatiques. Cependant, cette étude est loin d’être finie. A l’avenir, nous
envisagerons d’entreprendre les travaux de recherche sur :
la caractérisation moléculaire des souches sélectionnées par PCR des gènes
16S ribosomal,
l’expérimentation de décontamination de sols pollués (expériences en
microcosmes) et suivi de cinétique de dégradation de polluants en utilisant les
souches sélectionnées (utilisé en consortium),
le développement et optimisation des méthodes d’extraction et de
quantification de HAP,
l’isolement d’autres groupes de microorganismes (bactéries, champignons)
identifiés comme étant capable de dégrader les molécules des HAP dans le
sol,
la sélection des consortiums microbiens efficaces et le suivi de la dynamique
des souches d’intérêts utilisées.
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Annexes
ANNEXES
Annexes
ANNEXE I : COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE
1- MILIEU D’ISOLEMENT
• Milieu d’isolement de Pseudomonas fluorescent
King B
Polypeptone.......................................................................... 20 g
Glycérol ............................................................................. 10 ml
Phosphate bipotassique anhydre ........................................ 1,5 g
Sulfate de magnésium ........................................................ 1,5 g
Eau distillée ................................................................... 1000 ml
Agar ..................................................................................... 15 g
pH = 7,2±0,2
• Milieu d’isolement des souches d’actinomycètes
AS1 (Antibiotic Selection One)
Bacto Yeast Extract................................................................ 1 g
Arginine ............................................................................. 0,2 g
Alanine ............................................................................... 0,2 g
Asparagine monohydrate ................................................... 0,5 g
Difco soluble starch ............................................................... 5 g
NaCl .................................................................................... 2,5 g
Sulfate de sodium ................................................................. 10 g
Eau distillée ................................................................... 1000 ml
Agar ..................................................................................... 15 g
pH=7,0
Les antibiotiques
Pour 1 L de milieu AS1, on ajoute :
- 10 ml de Cycloheximide (0,02g dilué dans 10ml de DMSO) ;
- 10ml de Triméthoprime (0,05g dilué dans 10ml d’ED) ;
- 10 ml d’Acide nalidixique (0,05 g dilué dans 10 ml d’ED) ;
• Milieu d’isolement pour la flore totale cultivable
TSA (Tryptic Soy Agar)
Peptone de caséine ............................................................... 15 g
Annexes
Peptone de soja ...................................................................... 5 g
NaCl ....................................................................................... 5 g
CaCl2, 2H2O ...................................................................... 0,04 g
Agar...................................................................................... 15 g
Eau distillée .................................................................... 1000 ml
pH=7,2
• Milieu pour le test de résistance des souches
BN (Bouillon nutritif)
Extrait de levure .................................................................... 5 g
Peptone ................................................................................ 15 g
NaCl ..................................................................................... 15 g
Agar...................................................................................... 13 g
Eau distillée ................................................................... 1000 ml
pH=7,3
2- MILIEU DE DENOMBREMENT
Gélose nutritive
Extrait de viande .................................................................... 3 g
Peptone .................................................................................. 5 g
NaCl ...................................................................................... 15g
Eau distillée ................................................................... 1000 ml
pH=7,3
3- MILIEU D’IDENTIFICATION DES SOUCHES
Eau peptonnée au rouge de phénol
Peptone ................................................................................ 10 g
NaCl ....................................................................................... 5 g
Eau peptonnée
Eau distillée ................................................................... 1000 ml
NaOH ................................................................................. 80 ml
Indicateur coloré
Rouge de phénol .................................................................... 2 g
Annexes
Eau distillé stérile ............................................................. 950 ml
Eau peptonnée au rouge de phénol
Eau peptonnée ................................................................ 1000 ml
Rouge de phénol ................................................................ 12 ml
pH=7,5±0,2
• Milieu urée indole
L-tryptophane ...................................................................... 0,3 g
Phosphate monopotassique ................................................. 0,1 g
Phosphate dipotassique ....................................................... 0,1 g
Na Cl ...................................................................................... 5 g
Urée ........................................................................................ 2 g
Alcool 90° ....................................................................... 0,25 ml
Rouge de phénol 1% ....................................................... 0,25 ml
Eau distillée stérile ........................................................... 950 ml
pH=7,4±0,2
• Milieu de Simmons
Sulfate de magnésium ......................................................... 0,2 g
Phosphate monoammoniaque ................................................ 1 g
Phosphate bipotassique .......................................................... 1 g
Na Cl ...................................................................................... 5 g
Citrate de sodium ................................................................... 1 g
Bleu de bromothymol ........................................................ 0,08g
Agar...................................................................................... 15 g
Eau distillée ................................................................... 1000 ml
pH=7,1±0,2
• Milieu mannitol-mobilité-nitrate
Hydrolysat trypsique de caséine .......................................... 10 g
Nitrate de potassium .............................................................. 1 g
Mannitol .............................................................................. 7,5 g
Rouge de phénol 10% ....................................................... 0,04 g
Agar..................................................................................... 3,5 g
Annexes
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH=7,6±0,2
• Milieu lysine fer
Peptone bactériologique ......................................................... 5 g
Extrait de levure ..................................................................... 3 g
Glucose .................................................................................. 1 g
L-lysine ................................................................................ 10 g
Citrate de fer ammoniacal ................................................... 0,5 g
Thiosulfate de sodium ....................................................... 0,04 g
Pourpre de bromocrésol .................................................... 0,02 g
Gélose ............................................................................... 14,5 g
Eau distillée ................................................................... 1000 ml
pH= 6,7 ±0,2
• Milieu Hajna-Kligler
Peptone ................................................................................. 15 g
Extrait de viande .................................................................... 3 g
Extrait de levure ..................................................................... 3 g
Peptone pepsique de viande ................................................... 5 g
Na Cl ...................................................................................... 5 g
Sulfate ferreux ..................................................................... 0,2 g
Thiosulfate de sodium ......................................................... 0,3 g
Lactose ................................................................................. 10 g
Glucose ................................................................................... 1g
Rouge de phénol .............................................................. 0,24ml
Agar...................................................................................... 11 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH= 7,5±0,2
• Milieu ISP2
Extrait de levure ..................................................................... 4 g
Extrait de Malt ..................................................................... 10 g
D glucose ............................................................................... 4 g
Agar...................................................................................... 20 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH = 7,3
Annexes
• Milieu ISP4
Amidon soluble .................................................................... 10 g
K2HPO4 .................................................................................. 1 g
Mg SO4, 7H2O ....................................................................... 4 g
(NH4)2SO4 .............................................................................. 2 g
Na Cl ....................................................................................... 1g
CaCO3 .................................................................................... 2 g
Solution saline 1 ................................................................... 1 ml
Agar...................................................................................... 20 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH = 7,0
• Milieu ISP5
Glycérol................................................................................ 10 g
L-aspargine ............................................................................ 1 g
K2HPO4 .................................................................................. 1 g
(NH4)2SO4 .............................................................................. 2 g
Na Cl ....................................................................................... 1g
Solution saline 1 ................................................................... 1 ml
Agar...................................................................................... 20 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH = 7,0
• Milieu Starch Casein agar
Amidon soluble .................................................................... 10 g
Caséine ................................................................................... 1 g
K2HPO4 ............................................................................... 0,5 g
Agar...................................................................................... 15 g
Eau distillée ................................................................... 1000 ml
pH = 7,0
• Milieu Sporulation agar
Extrait de levure ..................................................................... 1 g
Extrait de viande .................................................................... 1 g
Annexes
Trypose .................................................................................. 2 g
Glucose ................................................................................ 10 g
Agar...................................................................................... 15 g
Eau distillée ................................................................... 1000 ml
pH = 7,2
• Milieu ISP6
Peptone ................................................................................. 15 g
Protéose peptone ................................................................... 5 g
Cittrate de fer ammoniacal .................................................. 0,5 g
Thiosulfate de sodium ....................................................... 0,08 g
Extrait de levure ...................................................................... 1g
K2HPO4 .................................................................................. 1 g
Agar...................................................................................... 20 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH = 7,0
• Milieu ISP7
Glycérol................................................................................ 15 g
L-aspargine ............................................................................ 1 g
K2HPO4 ............................................................................... 0,5 g
Na Cl .................................................................................... 0,5g
Fe2SO4 ............................................................................... 0,01 g
Agar...................................................................................... 20 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH = 7,2
• Milieu ISP9
(NH4)2SO4 ......................................................................... 2,64 g
K2HPO4 ............................................................................. 2,38 g
K2HPO4 ............................................................................. 5,65 g
Mg SO4.................................................................................... 1g
Solution saline 2 ................................................................... 1 ml
Agar...................................................................................... 20 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH= 6,8
Annexes
• Milieu CYD
Casamino acids ................................................................... 0,5 g
Extrait de levure ................................................................. 0,3 g
D-glucose ............................................................................ 0,4 g
K2HPO4 .................................................................................. 2 g
Mg SO4................................................................................... 1 g
Solution saline 2 ................................................................... 1 ml
Agar...................................................................................... 20 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH= 7,2
• Milieu de viande foie
Extrait de viande .................................................................. 10 g
Peptone ................................................................................. 20 g
Extrait de levure .................................................................. 10 g
Glucose .................................................................................. 2 g
Solution saline 2 ................................................................... 1 ml
Agar...................................................................................... 20 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH= 7,6
• Milieu mannitol-mobilité
Peptone ................................................................................. 20 g
Nitrate de potassium .............................................................. 1 g
Mannitol ................................................................................. 2 g
Rouge de phénol .............................................................. 40 mg
Agar........................................................................................ 4 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH= 8,1
• PBF (Phosphate Buffer Saline)
Na Cl ...................................................................................... 8 g
K Cl ..................................................................................... 0,2 g
Na2HPO4, 12H20 ............................................................... 1,44 g
K2HPO4 .......................................................................... 0,24 mg
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
Annexes
ANNEXE II : CONCENTRATION CORRESPONDANTE A CHACUN DES HAP
HAP Masse HAP (mg) Volume solvant (ml) Concentration
(mg/L) Naphtalène 100 25 4000
Acénaphtène 100 25 4000
Fluorène 100 25 4000
Phénanthrène 100 25 4000
Anthracène 100 25 4000
Fluoranthène 100 25 4000
Pyrène 100 25 4000 Benzo(a) anthracène 100 25 4000
[Σ8HAP] (mg/L ou ppm) 32 000
Annexes
ANNEXE III : PROTOCOLE DETAILLEE DE L’ANALYSE DES HAP DU SOL DE
TSIMIRORO PAR CPG
Etape 1 : Préparation du sol
Mélanger l’échantillon du sol avec du Na2SO4 et avec de l’étalon interne.
Etape 2 : Extraction du solvant par Soxhlet
Extraire à l’aide d’un ballon de 200 ml le mélange d’hexane/dichlorométhane (50/50)
par la méthode Soxhlet, une prise d’essai environ 2 g et attendre 8heures.
Extraction par Soxhlet
Etape 3 : Evaporation
Transvase le solvant dans un ballon de 250 ml en vue d’évaporation (30°C jusqu’à
environ 10 ml).
Etape 4 : Chromatographie sur colonne
Glisser un petit coton jusqu'à l'extrémité d'une colonne de purification. Remplir la
colonne de purification avec de l’alumine et de silicagel puis avec 1 cm de sulfate de sodium
anhydre. déposer 2 ml de la solution ainsi obtenue en éluant avec 30 ml d’hexane afin
d’obtenir la fraction aliphatique. La 2ème fraction s’obtient avec 40 ml de
hexane/dichlorométhane (90/10) pour la fraction aromatiques.
Annexes
Purification par colonne
Etape 5 : Concentration finale par soufflage à l’Azote
Souffler le tube contenant la fraction aromatique par N2 jusqu’à 0,5 ml.
Etape 6 : Injection sur la chromatographie en phase gazeuse
Régler l’appareil CPG puis injecter la solution concentrée afin de voir le
chromatogramme correspondant aux HAP.
Injection par CPG
Annexes
ANNEXE IV : DIVERSITE DES ESPECES BACTERIENNES CAPABLES DE DEGRADER
LES HAP
Titre : Sélection et identification des souches telluriques impliquées dans la
dégradation des Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP)
Nom et Prénoms : RANDRIAMISAINA Kanto Aina Natacha Adresse : LOT IVY 245 Ilanivato Ampasika Tel : +261 33 18 540 39 E-mail : [email protected] Nombre de page : 49 ; Nombre des tableaux : 13 ; Nombres des figures : 7 ; Nombres des photos : 2
RESUME Une collection de vingt-six (26) souches microbiennes ont été isolées à partir des sols pollués
par les hydrocarbures dans un site industriel d’un grand gisement d’huile lourde de Tsimiroro dont quatre (4) Pseudomonas fluorescents, dix (10) actinomycètes et douze (12) flores totales cultivables. Ces souches ont été testées pour leurs capacités à développer en milieu de culture synthétique préalablement pollué par une quantité connue de mélange de HAP (Σ8HAP) à différentes concentrations (250 mg/L ; 500 mg/L ; 1000 mg/L ; 1500 mg/L). La croissance microbienne a été suivie pendant soixante-cinq (65) jours selon la méthode de Nombre les Plus Probables (NPP). Parmi toutes les souches, seulement deux isolats A1 et F2 ont la capacité à résister et à développer en milieu contaminé par les HAP d’intérêt à une teneur de 1500 mg/L. Une augmentation de la population microbienne a été observée au cours de cette expérience. L’étude des caractéristiques culturales, morphologiques, physiologiques et biochimiques de ces deux souches ont permis de rapprocher l’isolat A1 à l’espèce Streptomyces sp. et l’isolat F2 à l’espèce Bacillus simplex. Le dosage des HAP résiduels dans le milieu de culture mélangé avec les HAP à la concentration de 1500 mg/L a montré que ces deux souches peuvent dégrader assez rapidement les HAP légers composés de deux (2) et trois (3) cycles aromatiques (naphtalène, l’acénaphtène, le fluorène, le phénanthrène et l’antrhacène) que les trois HAP lourds de quatre (4) cycles aromatiques : le fluoranthène, le pyrène et le benzo(a)anthracène.
Mots-clés : Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques, Microorganismes telluriques, Bioremédiation, Identification.
ABSTRACT
A collection of twenty-six (26) microbial strains were isolated from polluted soil by the hydrocarbons in an industrial site of a large heavy oil gisement of Tsimiroro including four (4) fluorescent Pseudomonas, ten (10) actinomycetes and twelve (12) total cultivable strains. These strains were tested for their ability to grow in synthetic culture media previously contaminated by a mixture of PAH (Σ8PAH) with different concentrations (250 mg/L; 500 mg/L; 1000 mg/L 1500 mg/L). The microbial growth was evaluated during sixty five (65) days according to the More Probable Number Method (MPN). Among all strains, only two isolates A1 and F2 were resistant and developed on media contaminated by the interest PAH at 1500 mg/L. An increase of microbial population was observed during this experiment. Cultural, morphological, physiological and biochemical characteristics of the two strains indicated that the isolate A1 was closely related to Streptomyces sp. and the isolate F2 to Bacillus simplex. The quantification of residual PAH in the culture media with PAH at 1500 mg/l showed that these two strains may degrade quite rapidly lighter PAHs compounds two (2) and three (3) aromatic cycles (naphtalene, acenaphtene, fluorene, phenanthrene and anthracene) than the three PAH compounds four (4) aromatic cycles : fluoranthene, pyrene and benzo(a)anthracene.
Key words : Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, Telluric microorganisms, Bioremediation, Identification.
Encadreur : Monsieur Rado RASOLOMAMPIANINA, Maître de Recherches et Chef de Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement (LME)