sdh.hmu.edu.vn tat luan an.doc · web viewviệc tính toán theo công thức karber đã được...
TRANSCRIPT
1
GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Lý do chọn đề tài:
Theo WHO ước tính, mỗi năm Việt Nam cần khoảng 1,7 triệu
đơn vị máu phục vụ cấp cứu điều trị (≈ 2% dân số) [40]; ngoài máu
và các chế phẩm máu, chế phẩm huyết tương, còn phải kể đến các
chế phẩm huyết thanh như: gamma globulin, anti-HBs globulin, anti-
T lymphocyte globulin, antivenom [141],[147],[152]... trong đó,
huyết thanh kháng nọc rắn (antivenom) là loại chế phẩm rất quan
trọng, đặc biệt trong điều trị rối loạn đông cầm máu do nhiễm độc
nọc rắn (họ Vipridae).
Là nước nhiệt đới, với ¾ diện tích rừng núi và đất nông nghiệp,
bờ biển dài hơn 3000 km, Việt Nam có môi trường rất thuận lợi cho
rắn độc phát triển. Phần lớn cư dân sinh sống, làm việc trong môi
trường nông nghiệp, rừng núi, hải đảo...nguy cơ bị rắn độc cắn rất
cao (> 30.000 người /năm [21]); ngoài tổn thất nhân mạng, chi phí
điều trị rất tốn kém: nhiều nạn nhân phải thở máy hàng tháng hoặc
phải truyền hàng chục lít máu và huyết tương để cứu tính mạng; kỷ
lục, đầu tháng 6/2013, bệnh viện Bạch Mai đã phải truyền ≈ 46 lít
máu và chế phẩm để cứu một người bệnh [174].
Nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong, giảm số lượng máu và huyết
tương phải sử dụng trong điều trị rắn độc cắn, Bộ y tế đã quan tâm
chỉ đạo việc nghiên cứu, ứng dụng sản xuất huyết thanh kháng nọc
rắn (HTKNR) [6],[8]. Đến nay, đã có một số nghiên cứu rất thành
công, góp phần cứu sống hàng ngàn bệnh nhân, giảm mạnh lượng
máu và chế phẩm phải sử dụng [6],[21],[23]...
2
Tuy vậy, sau nhiều năm nỗ lực, đến nay chúng ta vẫn đang thiếu
trầm trọng nhiều loại HTKNR; hầu như ta chỉ có duy nhất hai loại
HTKNR cho rắn hổ đất và rắn lục tre [8],[165],[166],[171]. Do tính
đặc hiệu kháng nguyên nọc rắn theo vùng địa lý, mỗi quốc gia phải
tự chế tạo HTKNR cho chính quốc gia mình (khuyến cáo của WHO)
[141],[20],[6]. Để đáp ứng nhu cầu cấp cứu, điều trị rắn độc cắn,
chúng ta rất cần đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất HTKNR; đặc biệt là
các HTKNR cho các loài rắn độc nguy hiểm, thường gặp; trong các
loài đó, hàng đầu phải kể đến rắn cạp nia, chiếm 35,8% các loài rắn
độc họ rắn hổ (Elapidae) tại Việt Nam, là loài rắn độc có độc tính
cực mạnh, gây tử vong rất cao (> 80% nếu không được cấp cứu điều
trị kịp thời) [14].
Thực tế điều trị rắn cạp nia cắn ở Việt Nam từ trước đến nay
cho thấy: nước ta có hai loài rắn cạp nia thường gặp, chủ yếu là rắn
cạp nia nam (Bungrarus candidus) và rắn cạp nia bắc (Bungarus
multicinctus). Đây là hai loài rắn có hình dạng “khúc đen, khúc
trắng” rất giống nhau, thoáng nhìn rất khó phân biệt. Hai loài rắn này
khác nhau cả về độc tính nọc và biểu hiện lâm sàng, chẩn đoán rất dễ
nhầm lẫn, HTKNR đơn đặc hiệu không có tác dụng chéo và cũng
chưa có VDK để chẩn đoán xác định [15]. Nghiên cứu sản xuất
HTKNR đa giá cho cả hai loài rắn độc nguy hiểm này là giải pháp
đem lại thuận lợi cho cấp cứu điều trị bệnh nhân rắn cạp nia cắn
trong cả nước. Để tăng tính an toàn của HTKNR, dạng F(ab’)2 là tối
ưu. Đồng thời, việc hoàn thiện quy trình sản xuất, tiêu chuẩn hóa sản
phẩm là hết sức cần thiết.
3
2. Mục tiêu đề tài:
(1) Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 từ huyết tương
ngựa đáp ứng Tiêu chuẩn Việt Nam (Dược điển Việt Nam).
(2) Đánh giá chất lượng của chế phẩm trong phòng thí nghiệm.
3. Ý nghĩa của đề tài và những đóng góp mới:
3.1. Lần đầu tiên tại Việt Nam và trên thế giới đã sản xuất được chế
phẩm HTKN-RCN đa giá chống lại nọc độc hai loài RCN thường
gặp, nguy hiểm nhất Việt Nam, cũng là những loài rắn độc vào hàng
bậc nhất trên thế giới.
3.2. Lần đầu tiên hoàn thiện và chuẩn hóa được toàn bộ các công
đoạn của quy trình sản xuất, cho ra sản phẩm HTKNR đạt 8/8 Tiêu
chuẩn Quốc gia về huyết thanh kháng nọc rắn điều trị cho người. Sản
phẩm đạt 9/10 chỉ tiêu cơ bản của WHO về chất lượng.
3.3. Đã sản xuất và tinh sạch thành công HTKN-RCN đa giá dạng
F(ab’)2 là dạng chế phẩm tiên tiến, hiệu quả nhất hiện nay, loại bỏ
được Fc của phân tử IgG, giải quyết tận gốc vấn đề an toàn miễn
dịch khi điều trị.
3.4. Vấn đề hiệu lực kháng nọc rắn của chế phẩm: đã được giải quyết
thành công với các giải pháp đồng bộ: chọn lựa đúng chủng loại rắn,
lấy nọc có chất lượng, làm mất độc lực nọc nhưng vẫn giữ được tính
KN; đảm bảo lịch trình miễn dịch, liều lượng KN + tá dược; theo dõi
chăm sóc để ngựa sinh KT tốt nhất, huyết tương có hiệu giá KT cao;
theo dõi hình thành KT đặc hiệu; đảm bảo lấy máu vô trùng; tinh chế
mảnh F(ab’)2 vẫn giữ được tính hoạt động sinh học; tinh sạch các
F(ab’)2 có nồng độ cao nhất...
4
4. Bố cục của luận án:
Luận án gồm 128 trang, ngoài phần đặt vấn đề và kết luận, luận án
có 4 chương chính:
- Đặt vấn đề: 2 trang
- Chương 1: Tổng quan (38 trang).
- Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (18 trang).
- Chương 3: Kết quả nghiên cứu (31 trang).
- Chương 4: Bàn luận (37 trang).
- Kết luận & Kiến nghị: 2 trang
Luận án có: 29 bảng, 4 biểu đồ và sơ đồ, 63 ảnh và hình vẽ (48 ảnh
phụ lục), 176 tài liệu tham khảo (40 Tiếng Việt, 114 Tiếng Anh, 22
website), 4 phụ lục.
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Một số điểm cần lưu ý về Máu và Huyết tương
1.2. Các loại chế phẩm máu và chế phẩm huyết tương
1.3. Phương pháp tách chiết các thành phần huyết tương
1.3.1. Phương pháp tủa lạnh bằng ethanol.
1.3.2. Phương pháp tủa bằng muối
1.3.3. Phương pháp sắc ký
1.3.4. Phương pháp miễn dịch hấp thụ.
1.3.5. Phương pháp lọc qua màng ma trận với các chất rắn.
1.4. Huyết thanh kháng nọc rắn:
1.4.1. Khái niệm
1.4.2. Lịch sử phát minh
1.4.3. Cơ sở miễn dịch học
5
- Kháng nguyên nọc rắn.
- Kháng thể chống nọc rắn
1.4.4. Các giai đoạn của quy trình sản xuất HTKNR
1.5. Tai nạn do RCN và tình hình NC sản xuất HTKN-RCN
1.5.1. Tình hình tai nạn do RCN tại Việt Nam
1.5.2. Chi rắn cạp nia (Bungarus) tại Việt Nam
1.5.3. Đặc điểm nọc rắn cạp nia và cơ chế bệnh sinh
1.5.4. Tình hình NC, sản xuất HTKN-RCN ở Việt Nam & Thế giới.
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP
2.1. Đối tượng & vật liệu nghiên cứu:
- Đối tượng NC: Nghiên cứu trên các động vật thí nghiệm: rắn cạp
nia bắc và rắn cạp nia nam, ngựa, thỏ, chuột lang, chuột nhắt trắng.
- Vật liệu NC: nọc RCN bắc và nọc RCN nam đông khô: 3,1 gam.
2.2. Phương pháp nghiên cứu:
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: NC labo + thực nghiệm trên động vật
2.2.2. Tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm cần đạt:
Bảng 2.1: Tiêu chuẩn Quốc gia (Dược điển Việt Nam IV, 2009)
TT Tên các chỉ tiêu Tiêu chuẩn cần đạt
1 An toàn chung Đạt an toàn chung2 Vô khuẩn Không có vi khuẩn, vi nấm3 Chí nhiệt tố Không có chất gây sốt4 Hiệu giá KT/lọ Đạt > 100 LD50/lọ (5ml)5 pH 6 - 76 Merthiolat ≤ 0,01%7 Sodium chlorid 0,85 % - 0,9%8 Nitơ toàn phần ≤ 15 %
6
Bảng 2.2: Tiêu chuẩn cần đạt theo WHO guidelines, 2008.
TT Tên các chỉ tiêu Tiêu chuẩn cần đạt
1 An toàn chung Đạt an toàn chung
2 Vô khuẩn Không có vi khuẩn, vi nấm
3 Chí nhiệt tố Không có chất gây sốt
4 Hiệu giá KT/lọ Đạt tiêu chuẩn đăng ký
5 pH 6 – 7
6 Hàm lượng chấtbảo quản
Phenol < 2,5 g/lCresols < 3,5 g/l
7 Sodium chlorid 0,85 % - 0,9%
8 Nitơ toàn phần ≤ 100 g/l
9 Albumin ≤ 1 %
10 Globulin > 90%
2.2.3. Nội dung nghiên cứu:
2.2.3.1. Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2
- Chế tạo KN nọc rắn cạp nia đa giá giảm độc lực.
- Gây mẫn cảm ngựa, theo dõi hình thành KT đặc hiệu.
- Lấy máu, thu huyết tương, truyền trả khối hồng cầu.
- Tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2, xác định mức độ tinh sạch
của sản phẩm.
2.2.3.2. Đánh giá chất lượng HTKN-RCN trong phòng thí nghiệm:
- Kiểm định cơ sở, đánh giá tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm.
- Kiểm định quốc gia, đánh giá an toàn, hiệu lực, đặc điểm lý hóa.
- Sơ bộ tính giá thành sản xuất, đánh giá hiệu quả kinh tế, xã hội.
7
2.2.4. Các phương pháp kỹ thuật nghiên cứu:
- Tuyển chọn RCN, lấy nọc, bảo quản nọc theo phương pháp của
Trần Kiên, David Warell [21],[23],[24].
- Chế tạo KN và đánh giá chất lượng theo phương pháp của Trịnh
Xuân Kiếm, khuyến cáo của WHO, 2008 [151] & Dược điển VN.
- Gây mẫn cảm ngựa, theo dõi hình thành KT đặc hiệu bằng thử
nghiệm Ouchterlony và điện di miễn dịch huyết thanh với nọc RCN.
- Lấy huyết tương theo phương pháp plasmaferesis.
- Tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab')2 theo phương pháp cắt Fc của
- globulin bằng pepsin, tủa phân đoạn với ammonium sulphate,
thẩm tích với nước cất, lọc Seize (WHO, 2008 [151]).
- Kiểm định cơ sở: đánh giá bằng thử nghiệm an toàn chung, chí
nhiệt tố, cấy khuẩn, cấy nấm, xác định LD50 và hiệu giá (ED50).
- Sau khi đạt chất lượng ở kiểm định cơ sở, đóng lọ vô khuẩn 5ml/lọ
và yêu cầu Kiểm định Quốc gia.
- Kiểm định cơ sở gồm: thử nghiệm an toàn chung (Safety test), thử
nghiệm chất gây sốt (Pyrogens test), thử nghiệm vô khuẩn (Sterility
test), thử nghiệm công hiệu (Potency test). Thử công hiệu gồm 2
bước: xác định LD50 của nọc RCN theo công thức Karber, sau đó xác
định ED50 của HTKN-RCN đã sản xuất.
- Kiểm định Quốc gia: theo quy trình của Viện KĐQGVX&SPYT,
gồm: 1. Thử nghiệm an toàn chung. 2. Thử nghiệm vô khuẩn. 3. Thử
nghiệm chí nhiệt tố. 4. Thử nghiệm công hiệu (hiệu giá). 5. Nồng độ
Protein toàn phần. 6. pH. 7. Nồng độ NaCl. 8. Nồng độ chất bảo
quản (Merthiolat).
8
2.3.5. Thời gian, địa điểm nghiên cứu:
- Thời gian nghiên cứu: 6/2008 – 11/2011.
- Địa điểm tiến hành: tại Đơn vị nghiên cứu HTKN, Trung tâm
chống độc Bệnh viện Bạch Mai, Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin và
Sinh phẩm y tế, Trung tâm nghiên cứu dã ngoại thực nghiệm HVQY,
Viện HH-TMTW, Bệnh viện 103, Bệnh viện Bạch Mai và một số địa
điểm nghiên cứu tại Thư Phú, Lệ Mật (Hà Nội), Vũng Tàu...
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HTKN - RCN ĐA GIÁ F(ab’)2:
3.1.1. Chế tạo KN, đánh giá chất lượngKN
Bảng 3.1: Kết quả tuyển chọn và lấy nọc RCN
Số rắn lấy nọc (con)
Cạp nia bắc Cạp nia namSL rắn (con)
SL nọc(gam) SLNTB SL rắn
(con)SL nọc(gam) SLNTB
Lần 1(114) 84 0,5 5,9 30 0,3 10Lần 2 (185) 130 0,6 4,6 55 0,5 9,0Lần 3 (122) 62 0,5 8,0 60 0,7 11,6Cộng (421) 276 1,6 5,79 145 1,5 10,3
* Chú thích: SLNTB:số lượng nọc trung bình của một con rắn/lần lấy nọc
Bảng 3.2: Đánh giá sơ bộ về mức độ thường gặp của chi RCN ở VN
Loài rắn
Vùng
Bungarusfasciatus
Bungaruscandidus
Bungarusmulticinctus
Bungarusslowinskii
Bungarus flaviceps
Miền Bắc (++) (-) (+++) (+) (-)Miền Nam (+) (+++) (-) (-) (-)
* Chú thích: Không gặp: (-); Gặp nhưng số lượng rất ít: (+)
Thường gặp, số lượng ít: (++); thường gặp, số lượng nhiều: (+++)
9
Bảng 3.3: Thể tích KN và lượng nọc được khử độc.
Loại lọ
KN
Thể tích KN / lọ (ml)
0,1 0,3 0,5 1 2 3 4 5 6Số lượng lọ KN 12 12 12 22 12 12 12 12 12Số mg nọc/lọ ≈ 1,1 3,3 5,5 11 22 33 44 55 66Thể tích (ml)
(tổng: 272,8 ml) 1,2 3,6 6 22 24 36 48 60 72
Bảng 3.4: Thử nghiệm an toàn với KN.
ChuộtlangTN
Trọnglượng
(g)
KN(ml)
SL nọc (mg)
Thay đổi bất thường Tăng TL(g)Sốt Rụng
lôngTL (g)
1 230 2,30 25,3 0 0 240 102 235 2,35 25,8 0 0 250 153 250 2,50 27.5 0 0 260 10
4 (chứng) 245 0,0 0 0 0 255 10
Bảng 3.5: Thử nghiệm chí nhiệt tố với KN.
ThỏTN
TLthỏ (kg)
KN(ml)
SL nọc(mg)
Nhiệt độ trước/sau tiêm KN(oC) Thay đổi
nhiệt độcao nhấtKhởi
đầuSau
1 giờSau
2 giờSau
3 giờ
1 2,1 2,1 23,1 38,5 38,9 39,0 38,5 0,5oC
2 2, 3 2,3 25,3 39,1 39,8 39,2 39,1 0,7 oC
3 2,2 2,2 24,2 39,3 39,5 39,8 39,3 0,5 oC
Bảng 3.6. Kết quả cấy khuẩn, cấy nấm KN.
Môi trường Sabouraud (37oC) Môi trường Thioglycolate (20-25oC)
Ngày thứ 3
Ngày thứ 7
Ngày thứ 14
Ngày thứ 1
Ngày thứ 2
Ngày thứ 3
Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
10
3.1.2.Kết quả gây mẫn cảm ngựa & theo dõi đáp ứng miễn dịch:
Bảng 3.7: Liều lượng KN và tá dược gây mẫn cảm ngựa. Lần miễn dịch
Liều lượng1 2 3 4 5 6 7 8 9
KN (ml) 0,1 0,3 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0Tá dược CFA (ml) 0,1 0,3 0,5 0 0 0 0 0 0Tá dược IFA (ml) 0 0 0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0KN + tá dược (ml) 0,2 0,6 1 2 4 6 8 10 12
Số vị trí tiêm 1 3 5 2 4 6 8 10 12Bảng 3.8: Thay đổi sức khỏe ngựa sau gây mẫn cảm.
Lần miễn dịch
Ngựa 1 Ngựa 2Toàn thân
Tại chỗToàn thân Tại
chỗVận động
Hô hấp Tiêu hóa Vận
động Hô hấp Tiêu hóa
1 Yếu BT Bỏ ăn BT Yếu BT Bỏ ăn BT
2 Yếu BT Bỏ ăn Loét Yếu BT Bỏ ăn Loét3 Yếu BT Ăn kém Loét Yếu BT Ăn kém Loét4 BT BT BT BT BT BT BT BT
5 BT BT BT BT BT BT BT BT
6 BT BT BT BT BT BT BT BT
7 BT BT BT BT BT BT BT BT
8 BT BT BT BT BT BT BT BT
9 BT BT BT BT BT BT BT BT
* Chú thích: BT: bình thườngBảng 3.9: Hiệu giá KT kháng nọc RCN sau miễn dịch ngựa.
Ngựa miễn dịch
Hiệu giá KT sau mỗi lần miễn dịch
Lần 1
Lần 2
Lần 3
Lần 4
Lần 5
Lần 6
Lần 7
Lần8
Lần 9
No 1 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/2048 1/2048
No 2 1/8 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/2048
11
Ảnh 3.4. Vết tủa KN-KT trên thạch agarose 1,5% (ảnh trái)Ảnh 3.5. Xác định KT đặc hiệu bằng điện di miễn dịch.
3.1.3. Lấy máu, tách huyết tương giàu KT, truyền trả khối HC:
Bảng 3.10: Khối lượng máu, huyết tương, khối hồng cầu thu
được.
Số lượng
Ngựa NC
Máu ngựa
(lit)Huyết
tương (lit)Khối hồng
cầu (lit)
Ngựa 1 Lần 1 3,6 2,2 1,4Lần 2 5,1 3,1 2,0
Ngựa 2 Lần 1 2,3 1,4 0,9Lần 2 5,5 3,3 2,2
Cộng cả 2 lần 16,5 10,0 6,5
Bảng 3.11: Lượng máu lấy và phản ứng của ngựa trong khi lấy
máu.
Số lượng máu lấy
(lit)
Biểu hiện của ngựa
Bình thường Choáng nhẹ Shock
Ngựa 1
Lần 1 3,6 X X
Lần 2 5,1 X X
Ngựa Lần 1 2,3 X
12
2 Lần 2 5,5 X X X
3.1.4. Kết quả tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2:
3.1.4.1. Cắt Fc, tủa phần protein không có KT với ammonium sulphate 14%, lọc bỏ tủa, thu dịch lọc chứa nhiều mảnh F(ab’)2:
Bảng 3.12: Thể tích dịch lọc có F(ab’)2 thu được.Chỉ số NC
Lô NCHuyết tươngSản xuất (ml)
Dịch lọc có KT (ml)
Tỷ lệ dịch lọc/huyết tương sx (%)
Lô 1 3600 2900 80,6%Lô 2 6400 5140 80,3%
Cộng : 10.000 8040 80,4%
3.1.4.2. Tủa F(ab’)2 với ammonium sulphate 22%, lọc thu tủa, thẩm tích và lọc vô trùng tạo HTKN-RCN F(ab’)2.
Bảng 3.13 : Lượng tủa có F (ab’)2 thu được. Chỉ số NC
Lô NC Dịch lọc có F(ab’)2
(ml)Tủa có F (ab’)2
(gam)
Lô 1 2900 210Lô 2 5140 395
∑ 2 lần tinh chế 8040 605
Bảng 3.14: Lượng dịch thẩm tích & HTKN-RCN bán thành phẩm
Chỉ số NC
Lô NC
Dịch thẩm tích (ml)
HTKN-RCN bán thành phẩm (ml)
Lượng dịch thẩm tích bị hao hụt (ml)
Lô 1 190 165 25 (13,1%)
Lô 2 510 485 25 (5,2%)
∑ 2 lần 700 650 50 (7,7%)
Bảng 3.15 : Số lượng HTKN-RCN F(ab’)2 đã sản xuất.
Tên sản phẩm Đơn vị Thể tích Số lượng
13
(ml) (lọ)HTKN-RCN bán thành phẩm 500 ml 650 2
HTKN-RCN F(ab’)2 5 ml 650 130
3.1.4.3. Xác định độ tinh sạch của HTKN-RCN bán thành phẩm:
Bảng 3.17: Định lượng protein, albumin, globulin, IgG, IgG, IgM, tỷ lệ A/G huyết thanh ngựa và HTKN-RCN F(ab’)2 .
Xét nghiệm Huyết thanh ngựa
HTKN-RCN F(ab’)2
Số lượng Tỷ lệ
Protein (g/l) 87,1 49,8 100 %Albumin (g/l) 28,7 1,4 2,8 %Globulin (g/l) 58,4 48,4
100% 97,2 %
IgG (mg/dl) 865 203 2,141 g/l
≈ 4,4%IgM (mg/dl) 67,8 8,6IgA (mg/dl) 6,3 2,5Tỷ lệ A/G 0,49 0,03
Hình 3.6. So sánh hình ảnh điện di protein huyết thanh ngựa (trái) và
điện di protein huyết thanh HTKN-RCN F(ab’)2 (phải):
14
(Hình ảnh hai đỉnh rõ rệt của albumin, globulin đã không còn trên điện di
HTKN-RCN, chỉ còn lại hình ảnh thuần nhất một đỉnh tương ứng với dải
phân bố albumin - trong khi định lượng albumin chỉ còn một lượng nhỏ
2,8%. Điều này cho thấy F(ab’)2 chiếm tỷ lệ cao gần như tuyệt đối).
3.2. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM HTKN-RCN ĐA
GIÁ F(ab’)2 TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM:
3.2.1. Kiểm định chất lượng tại cơ sở:
Bảng 3.18: Thử nghiệm an toàn trên chuột lang.
TTTrọng lượng(gam)
HTKN(ml)
Theo dõi chuột thí nghiệm Tăng trọng lượng(gam)
Rụng lông
Trọng lượngTuần
1Tuần
2Tuần
3
1 310 3,1 0 320 325 340 +302 330 3,3 0 343 350 355 +253 350 3,5 0 358 363 370 +20
Bảng 3.19: Tìm chất gây sốt trong HTKN-RCN đa giá F(ab’)2
TTthỏ
Trọng lượng (kg)
Thể tích HTKN
(ml)
Nhiệt độ thỏ trước/sau khi tiêmHTKN RCN (oC) Chênh
lệch(oC)Trước Sau 1 h Sau 2 h Sau 3 h
1 2,8 2,8 39,3 39,6 39,8 39,3 + 0,52 2,8 2,8 39,4 39,7 39,8 39,4 + 0,43 3,0 3,0 39,6 39,8 39,9 39,6 + 0,3
Bảng 3.20: Kiểm tra mức độ vô khuẩn của HTKN-RCN đa giá.
Lô HTKN-
RCN
Môi trường Sabouraud (37oC)
Môi trường thạch máu (20oC – 25oC)
Ngày 3
Ngày 7
Ngày 14
Ngày 3
Ngày 5
Ngày 7
15
Lô I Âm tính
Âm tính
Âm tính
Âm tính
Âm tính
Âm tính
Lô II Âm tính
Âm tính
Âm tính
Âm tính
Âm tính
Âm tính
Bảng 3.21: Xác định liều chết 50% (LD50) của nọc RCN Việt Nam.
TTNồng độ
nọc(µg/ml)
Số nọc/chuột(µg)
Theo dõi chuột thí nghiệm
Tỷ lệchuột chết
(%)Chết Sống Tổng số
1 22,50 4,5 8 0 8 100,00
2 15,00 3,00 7 1 8 87,50
3 10,00 2,00 4 4 8 50,00
4 6,66 1,33 1 7 8 12,50
5 4,44 0,88 0 8 8 0,00
6 0 0 0 8 8 0,00
Bảng 3.22: Xác định Hiệu lực (công hiệu) của HTKN rắn cạp nia.
LôHTKN-RCN(ml)
ĐệmBPS
Nọc RCN 40 LD50
(ml)
Số LD50/ chuột
Tình trạngchuột NC
Chết Sống +
1 0.000 2.000 0.000 0 0 8 8
2 0.000 1.000 1.000 4 8 0 8
3 0.060 0.940 1.000 4 6 2 8
4 0.070 0.930 1.000 4 4 4 8
5 0.080 0.920 1.000 4 0 8 8
3.2.2. Kết quả kiểm định quốc gia về chất lượng HTKN-RCN:
Bảng 3.23: Kết quả Kiểm định Quốc gia về chất lượng HTKN-RCN
16
TT Tên thử nghiệm Kết quả1 An toàn chung Đạt yêu cầu2 chất gây sốt Đạt yêu cầu3 Vô khuẩn Đạt yêu cầu4 Hiệu giá 267,5 LD50/lọ5 NaCl 0,87%6 pH 7.0127 Nồng độ protein 7,43 mg/ml8 Nồng độ merthiolate 0 g%
Chương 4: BÀN LUẬN
4.1. BÀN VỀ SẢN XUẤT HTKN-RCN ĐA GIÁ F(ab’)2 THEO
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM, DƯỢC ĐIỂN VIỆT NAM IV, 2009:
4.1.1. Chế tạo KN:
- Tuyển chọn rắn, lấy nọc: tuyển chọn rắn, lấy nọc là công đoạn đầu
tiên rất quan trọng của quy trình sản xuất. Nọc rắn của hai loài RCN
dự định chế tạo HTKN-RCN đa giá phải có chất lượng tốt, đại diện
cho quần thể cả hai loài RCN ở Việt Nam. Sau 6 lần tiến hành thu
gom đã lấy đủ số lượng nọc cần thiết của cả hai loài RCN bắc và
nam. Nọc của RCN ít, khó lấy và rất nguy hiểm (Bảng 3.1).
- Xác định các loại rắn khoang thường gặp ở Việt Nam: Việt Nam
có nhiều loài rắn khoang “khúc đen, khúc trắng”, dễ nhầm lẫn với
nhau (Bảng 3.2) là B. candidus, B. multicinctus và Rắn khoang sông
Hồng (B. slowinskii), trong đó RCN nam và RCN bắc là hai loài
thường gặp, có số lượng nhiều nhất trong tự nhiên, cần sản xuất
antivenom phục vụ điều trị, các loài khác ít gặp.
- Kết quả chế tạo KN nọc rắn cạp nia đa giá, giảm độc lực:
17
Sử dụng 3 g nọc nguyên chất của cả hai loài RCN, chế tạo được
272,8 ml dung dịch KN nọc RCN giảm độc lực. Đã phân chia số
lượng KN ra các loại thể tích khác nhau căn cứ vào liều KN miễn
dịch trong lịch trình dự kiến và trọng lượng của ngựa nghiên cứu.
Đóng lọ theo từng nhóm có thể tích từ 0,1 ml đến 6 ml, chia ra 9 bậc
cho 9 tháng gây mẫn cảm cho ngựa. Số lượng KN chế tạo đủ dùng
trong nghiên cứu, phòng tình huống ngựa chết, nghiên cứu thất bại
và lưu trữ phục vụ kiểm tra chất lượng HTKNR (Bảng 3.3).
- Kiểm tra chất lượng KN: các Bảng 3.4, 3.5, 3.6 cho thấy: chất
lượng KN đạt yêu cầu về an toàn chung, vô khuẩn, không có chất
gây sốt khi gây mẫn cảm cho động vật thí nghiệm. Với loại độc tố có
độc lực rất mạnh với sinap thần kinh – cơ như nọc RCN, chế tạo KN
để gây mẫn cảm nếu không đảm bảo, sẽ gây chết động vật. Khử độc
tính nọc rắn, chỉ giữ lại tính KN độc tố là mục đích của chế tạo KN.
Quá trình khử độc với glutheraldehyde, các vi khuẩn đã bị tiêu diệt
một phần lớn; những vi khuẩn, vi nấm bị loại bỏ bằng lọc qua màng
lọc Ø 0,2 µm. Trong quá trình chế tạo KN (lấy nọc, khử độc nọc, tiến
hành ly tâm, bỏ cặn, thu dung dịch KN, lọc vô trùng, chiết vào các lọ
nhỏ, đóng nắp lọ,..), yêu cầu vô khuẩn, loại trừ chất gây sốt đã được
tuân thủ nghiêm túc (Bảng 3.5, 3.6).
4.1.2. Quy trình gây mẫn cảm ngựa, theo dõi đáp ứng miễn dịch:
- Lịch trình miễn dịch ngựa, liều lượng KN và tá dược:
Cách 1 tháng/lần là khoảng thời gian bảo đảm an toàn cho ngựa sau
miễn dịch (liền vết loét, mệt, yếu,..) đồng thời là khoảng thời gian
cần thiết cho quá trình đáp ứng miễn dịch xảy ra (theo WHO, cần từ
18
3 - 8 tuần). Liều KN gây mẫn cảm tăng dần, kết hợp với tá dược
Freund gây kích thích đáp ứng miễn dịch thứ phát của hệ miễn dịch
ngựa. Tá dược Freund được sử dụng gồm một trong 2 loại: CFA hoặc
IFA. Đây là một huyền dịch KN được nhũ hóa (emulsify) trong dầu
khoáng, để tăng cường độ đáp ứng miễn dịch (immunopotentiator).
Nhiều tác giả đã sử dụng phương pháp kết hợp KN và CFA để tăng
mạnh hiệu giá KT cho thấy hiệu quả rất rõ rệt. Pratanaphon R. và
cộng sự (1997), đã trộn lẫn KN nọc rắn hổ đất Thái Lan và với các tá
dược khác nhau như: CFA đơn thuần (50% CFA + 50% KN), CFA
với tỷ lệ 25% (75% KN và 25% CFA), KN + vắc xin nội độc tố uốn
ván (tetanus toxoid), KN + vắc xin nội độc tố bạch hầu (diphtheria
toxoid ) với tỷ lệ khác nhau, đã thu được kết quả tốt, hiệu giá KT
tăng cao mạnh mẽ trong thời gian ngắn so với nhóm chứng chỉ dùng
KN và tá dược là bentonite gel.
- Theo dõi sức khỏe ngựa sau mỗi lần miễn dịch: Tiêm KN và tá
dược CFA lần thứ nhất ở cả hai ngựa đều thấy ngựa mệt mỏi, bỏ ăn,
yếu bại, nằm tại chỗ hoặc lười vận động; tại chỗ tiêm bình thường.
Lần tiêm thứ 2 và 3 nhắc lại sau 1 tháng, thấy ngựa bỏ ăn hoặc ăn
kém, tại chỗ tiêm xuất hiện vết loét, đường kính 3 - 7 cm. Những lần
tiêm với tá dược IFA, không xảy ra loét chỗ tiêm; biểu hiện toàn thân
bình thường, ngựa vẫn đi lại, ăn uống tốt, dáng điệu khỏe mạnh.
Hiện tượng loét da xảy ra sau miễn dịch ngựa bằng tá dược CFA lần
thứ 2,3 nhưng không loét ở những lần gây mẫn cảm với tá dược IFA
(Bảng 3.8) (do CFA có BCG chết). Theo WHO, chỉ tiêm một lần
CFA và hạn chế tiêm tại một điểm số lượng lớn KN + tá dược, tuy
19
nhiên nhóm nghiên cứu đã không thực hiện như vậy, ngựa vẫn sống
và đáp ứng miễn dịch xảy ra bình thường, song việc chăm sóc vất vả
hơn; cũng không chứng minh được hiệu quả đáp ứng miễn dịch cao
hơn so với hướng dẫn của WHO.
- Theo dõi hiệu giá KT sau miễn dịch: Sau miễn dịch 9 lần, hiệu giá
KT đặc hiệu với KN nọc RCN tăng lên mức 1/2048 ở cả 2 ngựa và
ổn định sau lần miễn dịch thứ 8 và 9. Như vậy, có thể lấy máu sớm
hơn sau 7 lần miễn dịch bằng KN nọc RCN và tá dược. Kết quả
Bảng 3.9 cũng cho thấy, với hai ngựa khỏe, có cân nặng tương đương
và được nuôi ở hai địa điểm khác nnhau, cùng một liệu trình miễn
dịch với liều lượng như nhau, có thể cho kết quả hiệu giá KT khác
nhau. Điều này gợi ý: chế độ chăm sóc và dinh dưỡng đóng vai trò
quan trọng trong đáp ứng miễn dịch của ngựa.
- Xác định tính đặc hiệu của KT ngựa với KN nọc: Dùng thử
nghiệm Ouchterlony kiểm tra sau gây mẫn cảm, thấy xuất hiện các
vết tủa KN - KT trên thạch, chứng tỏ trong máu ngựa đã hình thành
KT chống KN nọc RCN. Pha huyết thanh với nồng độ khác nhau để
xem xét mức độ hình thành KT. Khi sản xuất được HTKN-RCN đa
giá F(ab’)2, làm điện di miễn dịch với KN nọc RCN, thấy xuất hiện
rất rõ vết tủa KN-KT trên thạch, điều này khẳng định hiệu lực sinh
KT đặc hiệu của KN là rất tốt (Hình 3.4, 3.5)
4.1.3. Lấy máu, tách huyết tương, truyền trả khối hồng cầu:
- Lấy máu vô trùng, máu không bị đông, không vỡ HC, ngựa được
lấy máu đảm bảo an toàn; máu lấy xong tách huyết tương ngay để
truyền trả lại khối HC cho ngựa (Bảng 3.10).
20
- Khi thu huyết tương cần chú ý lượng máu lấy và sức khỏe của
ngựa; máu lấy đủ để sản xuất và ngựa vẫn bình thường. Theo bảng
3.11, khi lấy máu ít hơn 3,5 lít, cả 2 ngựa đều không có biểu hiện gì.
Khi lấy 3,6 --> 5,4 lít máu, tùy theo từng ngựa, khả năng chịu đựng
khác nhau, các mức độ phản ứng với lấy máu khác nhau. Trong
khoảng khối lượng máu lấy ở trên, khi có biểu hiện bất thường, xử lý
dừng lấy máu kịp thời, ngựa đều an toàn, không nguy hiểm. Mức độ
lấy máu nhiều hơn 5,5 lít/ngựa, nếu không chú ý sẽ xảy ra mất an
toàn cho ngựa do shock mất máu.
4.1.4. Để tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đạt chất lượng cao:
- Cắt Fc, tủa phần protein không phải KT kháng nọc RCN, lọc bỏ
tủa, thu dịch lọc chứa nhiều F(ab’)2: Phân tử KT IgG nguyên vẹn
có mảnh Fc, là nguyên nhân của các phản ứng không mong muốn
trên lâm sàng, nhất là shock phản vệ. Fc mang thụ thể gắn các tế bào
mastocyte, bạch cầu ưa kiềm...là kho chứa các chất trung gian hóa
học histamin, serotonin, bradykinin... gây phản vệ, loại phản ứng
nguy hiểm nhất trong kháng huyết thanh trị liệu. Chúng tôi sử dụng
pepsin để cắt bỏ Fc, giữ lại phần F(ab’)2. Tỷ lệ thu lại huyết tương
giàu F(ab’)2 với 2 lần tinh chế là 80,4% (Bảng 3.12). Như vậy, ~
20% lượng tủa của huyết tương chứa các thành phần không có KT và
F(ab’)2 . Đây là sự cần thiết đầu tiên cho tinh sạch sản phẩm. Tủa
ammonium sulfate có lợi điểm: giữ được nguyên tính chất của các
phân tử KT, F(ab’)2, song hiệu xuất thu lại KT kém hơn so với các
kỹ thuật tinh chế khác như sắc ký trao đổi ion (Ion-exchange
chromatography) và sắc ký ái lực (Affinity chromatography).
21
Ammonium sulfate có khả năng hòa tan rất cao tới nồng độ 4M,
trong khi ở nồng độ 3,2 M, hầu hết các loại protein đều đã bị tủa. Chỉ
sau 30-60 phút hòa tan ammonium sulfate theo từng nồng độ chọn
lọc, toàn bộ protein tương ứng đã bị tủa. Khi tái hòa tan hạt protein
kết tủa trong đệm mới, cấu trúc phân tử và hoạt tính sinh học của
protein vẫn được giữ nguyên. Một số muối cùng tủa theo protein,
được loại bỏ bằng thẩm tích. Như vậy, dung dịch protein thành phẩm
(thí dụ: HTKNR) vừa tinh sạch vừa được cô đặc, nhưng vẫn giữ
nguyên được chức năng sinh học của KT. Tất nhiên, ngoài nồng độ
và tính chất của ammonium sulfate ra, tủa protein còn phụ thuộc vào
pH và nhiệt độ của dung môi. Ở pH = 4,2 và nhiệt độ 20oC, với nồng
độ ammonium sulfate = 14%, mọi thành phần protein không phải
KT, kể cả Fc và lipid đều bị tủa, được loại bỏ bằng giấy lọc
Whatman; dịch lọc chứa F(ab')2 được thu lại.
- Tủa F(ab’)2 với ammonium sulfate, lọc thu tủa bằng giấy lọc
Whatman, thẩm tích và lọc vô trùng tạo HTKN-RCN F(ab’)2.
Khi điều chỉnh pH dịch lọc lên 6,8/20oC, rồi thêm ammonium sulfate
tới 36%, trộn đều, sau 60 phút sẽ tủa toàn bộ F(ab')2 cùng với muối
ammonium sulfate (Bảng 3.13). Thẩm tích loại bỏ ammonium sulfate
khỏi tủa giàu F(ab’)2 . Lọc vô trùng bằng màng lọc cellulose acetatae
có kích thước lỗ lọc 0,2 µm, tạo HTKN-RCN F(ab')2 dạng bán thành
phẩm. Bảng 3.14 cho thấy: lọc nhiều huyết tương một lần sẽ tiết
kiệm hơn. Ở đây, một lần lọc sẽ giảm được 25 ml HTKN-RCN dạng
F(ab’)2, tương đương 5 lọ, mỗi lọ có giá sản xuất chừng 70 USD
(Bảng 3.24), đã là giảm một khoản chi phí đáng kể (do dùng máy lọc
22
Seiz, kiểu cũ; nếu lọc với máy mới, ngoài chất lượng tốt hơn, thời
gian lọc nhanh hơn, còn tiết kiệm được nhiều HTKNR hơn). Bảng
3.15 chỉ ra một số hóa chất chính đã sử dụng tinh chế HTKN-RCN.
Kết hợp với Bảng 3.24, thấy số lượng kinh phí cho công đoạn tinh
chế không lớn. Đây là một kỹ thuật dễ thực hiện, đơn giản, quy mô
nhỏ, phục vụ nhu cầu của đối tượng BN không lớn. Bảng 3.16 cho
thấy đã tinh chế được 650 ml HTKN-RCN F(ab’)2 dạng bán thành
phẩm và sau khi kiểm định cơ sở đạt yêu cầu, đóng lọ 5 ml, được
130 lọ HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 thành phẩm.
- Xác định độ tinh sạch của HTKN-RCN đa giá F(ab’)2:
Theo tiêu chuẩn Việt Nam về chất lượng HTKNR, yêu cầu chỉ số
protein toàn phần phải < 150 g/l (tiêu chuẩn của WHO là < 100g/l)
(bảng 2.1, 2.2). Sản phẩm HTKNR sản xuất có lượng protein là
49,8g/l (Bảng 3.17), đạt tiêu chuẩn Việt Nam và cả WHO. Lượng
F(ab’)2 đặc hiệu chống nọc RCN chiếm 95,6% (= 46,26 g/l) trong
tổng số lượng protein 49,8 g/l cho thấy kết quả tinh chế rất hiệu quả,
HTKN-RCN được chế tạo có độ tinh sạch cao; lượng albumin chiếm
1,4 g/l (= 2,8%) (Bảng 3.17) vẫn đạt tiêu chuẩn Việt Nam nhưng
chưa đạt tiêu chuẩn của WHO.
4.2. BÀN VỀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG HTKN-RCN ĐA GIÁ
F(ab’)2 TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM:
4.2.1. Kiểm định cơ sở & vấn đề kiểm soát chất lượng:
4.2.1.1. Tính “An toàn” của chế phẩm:
Kết quả thử nghiệm an toàn trên chuột lang Cobay (Bảng 3.18), thử
nghiệm chí nhiệt tố (Bảng 3.19) trên thỏ, và kết quả cấy khuẩn (Bảng
23
3.20) cho thấy HTKN-RCN nghiên cứu sản xuất đã đạt tiêu chuẩn an
toàn, vô khuẩn và không có chất gây sốt.
4.2.1.2. Hiệu lực của chế phẩm nghiên cứu:
- Xác định LD50: theo Bảng 3.21, đã xác định liều chết trung bình
của nọc RCN Việt Nam (gồm cả hai loài RCN bắc và RCN nam) là
2,17 µg/chuột nhắt trắng (18 - 20g). Việc tính toán theo công thức
Karber đã được lựa chọn do dễ sử dụng, dễ tính toán hơn so với các
công thức tính LD50 khác mà vẫn đảm bảo độ chính xác.
- Xác định ED50:. Xác định hiệu lực trung hòa nọc 50% (ED50) của
HTKNR là tiêu chuẩn so sánh HTKNR giữa các lô của một cơ sở sản
xuất cũng như với các cơ sở khác. Chuột nhắt trắng nên dùng nhóm 5
- 6 con, trọng lượng 18 - 20 g/con. Dung dịch nọc cố định trộn đều
với HTKNR (tăng dần). Theo dõi số lượng chuột sống 50% sau khi
tiêm tĩnh mạch hỗn dịch nọc - LD50 và HTKNR/24 giờ để xác định
khả năng bảo vệ (hay hiệu lực) của HTKNR. Bảng 3.22 cho thấy,
liều hiệu lực trung hòa, có khả năng giải độc cứu người của HTKN
cạp nia (ED50) = 57.14 LD50/ml = 124.2 µg/ml. Kết quả này phù hợp
với “Phiếu trả lời kết quả kiểm định số: 00610/SPĐT-NC (Bảng
3.23) của Viện Kiểm định quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, Bộ y
tế Việt Nam, ngày 1/12/2010.
4.2.2. Kiểm định chất lượng cấp Quốc gia:
Kết quả ở Bảng 3.23 cho thấy: HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 của đề tài
nghiên cứu đạt toàn bộ các tiêu chuẩn chất lượng Việt Nam, theo
Dược điển Việt Nam IV, 2009 như mục tiêu nghiên cứu đề ra. Tham
khảo và đối chiếu với Tiêu chuẩn chất lượng HTKNR của WHO,
24
2008 (Bảng 2.2), thấy: HTKN-RCN của đề tài đạt 9/10 tiêu chuẩn
quan trọng nhất theo tiêu chuẩn của WHO (Bảng 2.2 và Bảng 3.17).
KẾT LUẬN
1. Đã xác lập quy trình sản xuất và sản xuất thành công lần đầu tiên
tại Việt Nam và trên thế giới HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 của hai loài
RCN Bungarus multicinctus và Bungarus candidus. Sản phẩm đã
được chuẩn hóa theo Tiêu chuẩn quốc gia, Dược điển Việt Nam IV,
2009 về HTKNR dùng cho người và theo Khuyến cáo của WHO,
(Guidelines, 2008). Phương pháp tinh chế có hiệu quả cao trong tập
trung cô đặc và tinh sạch mảnh F(ab’)2, một yếu tố cần thiết để trung
hòa độc tố nọc RCN, với mức độ cô đặc globulin đạt 97,2%; trong
đó F(ab’)2 chiếm 95,6%; lượng albumin được loại bỏ gần như hoàn
toàn (chỉ còn 2,8%).
2. HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 từ ngựa đã khẳng định tính “An toàn”
và “Hiệu lực” trong phòng thí nghiệm qua Kiểm định chất lượng cấp
cơ sở và Kiểm định quốc gia. Sản phẩm được xác nhận đạt tất cả các
chỉ tiêu (8/8) về tính an toàn (an toàn chung, chí nhiệt tố, vô khuẩn
và các tiêu chuẩn lý hóa: pH, nồng độ merthiolat, nồng độ NaCl, hàm
lượng protein) và có hiệu giá 267,5 LD50/lọ (5ml), trung hòa được
620 µg nọc rắn cạp nia.