โครงรางวทยานพนธ

การตรวจหาการกลายพนธทต าแหนง C580Y ของยน Kelch13 propeller ในเชอ Plasmodium falciparum โดยวธ Loop - mediated isothermal amplification

Detection of C580Y mutation in Plasmodium falciparum Kelch13 propeller gene

using Loop - mediated isothermal amplification method

อาจารยทปรกษา

รองศาสตราจารย ดร.นงเยาว สวางเจรญ

ผด าเนนการวจย

นางสาวธญชนก ค ามณ

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญา วทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาจลชววทยา

มหาวทยาลยสงขลานครนทร

2

โครงรางวทยานพนธ

ชอวทยานพนธ (ภาษาไทย) การตรวจหาการกลายพนธทต าแหนง C580Y ของยน Kelch13 propeller ในเชอ Plasmodium falciparum โดยวธ Loop - mediated isothermal amplification

(ภาษาองกฤษ) Detection of C580Y mutation in Plasmodium falciparum Kelch13 propeller gene using Loop - mediated isothermal amplification method หลกสตรและสาขาวชา วทยาศาสตรมหาบณฑต (จลชววทยา)

ประจ าปการศกษา 2558

ผด าเนนการวจย นางสาวธญชนก ค ามณ รหสนกศกษา 5810220038

อาจารยทปรกษา รองศาสตราจารย ดร.นงเยาว สวางเจรญ

อาจารยทปรกษาวทยานพนธรวม ดร.สภญญา ธนาพงษภชาต

ทมาและความส าคญ

มาลาเรยเปนโรคตดเชอปรสตทส าคญในมนษยและยงคงเปนปญหาสาธารณสขในหลายพนททวโลก พบมากทสดในทวปแอฟรกาและยงพบในอเมรกากลาง อเมรกาใต อนเดย เอเชยตะวนออก และเอเชยตะวนออกเฉยงใตรวมถงประเทศไทย ป ค.ศ. 2015 มประชากรทตดเชอมาลาเรยจากทวโลกกวา 214 ลานคน อยในทวปแอฟรการอยละ 88 รองลงมารอยละ 10 พบในภมภาคเอเชยตะวนออกเฉยงใต และมผเสยชวต 438,000 คน ซงสวนใหญเปนเดกอายต ากวา 5 ขวบ (WHO, 2016) โรคมาลาเรยพบไดในพนทตางๆ ทวโลก โดยเฉพาะในประเทศเขตรอนเนองจากขาดการควบคมการระบาดของโรคทมประสทธภาพ ปญหาการดอยาตานมาลาเรยและการดอยาฆาแมลงของยงพาหะ (Feachem et al., 2010) มาลาเรยเกดจากเชอโปรโตซวในสกล Plasmodium ม 5 ชนด ทกอโรคในคน ไดแก P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae และ P. knowlesi มยงกนปลอง (Anopheles spp.) ตวเมยเปนพาหะน าโรค เชอทพบในประเทศไทยสวนใหญเปนชนด P. falciparum และ P. vivax (Na-Bangchang and Congpuong, 2007) ส าหรบเชอ P. falciparum มความส าคญเนองจากกอโรครนแรงท าใหผปวยเสยชวตจากภาวะแทรกซอนและภาวะมาลาเรยขนสมอง สวนเชอ P. vivax เปนเชอทสามารถแอบซอนอยในตบไดเปนเวลานานเรยกวา hypnozoite ผปวยจงมอาการไขกลบ (relapse) สวน P. knowlesi เปนเชอมาลาเรยทพบในลงแสม ลงกง แตสามารถตดตอจากสตวสคนไดซงพบในแถบเอเชยตะวนออกเฉยงใต (Kantele and Jokiranta, 2011)

3 ถงแมในชวงป ค.ศ. 2000 ถง 2015 การตดเชอมาลาเรยของประชากรทวโลกจะลดลงรอยละ 18 และอตราการเสยชวตลดลงถงรอยละ 48 (World Malaria Report, 2015) แตอปสรรคส าคญในการก าจดโรคมาลาเรยใหหมดไปคอปญหาการดอยา chloroquine และยา sulfadoxine – pyrimethamine (SP) ของเชอ P. falciparum ในการรกษาผปวยทตดเชอมาลาเรยในกลมประเทศแถบลมแมน าโขงซงประกอบดวย ประเทศกมพชา ไทย พมา และเวยดนาม โดยเฉพาะบรเวณชายแดนไทยกมพชาจะเปนบรเวณทมอบตการณการดอยาและมรายงานการดอยาตานมาลาเรยหลายชนดอยางรวดเรวกอนจะแพรระบาดไปยงสวนอนของเอเชยและทวปแอฟรกา (Wongsrichanalai et al., 2002) ชวงปลายทศวรรษ 1950 มรายงานการดอยา chloroquine ในผปวยทตดเชอมาลาเรยชนด P. falciparum เปนครงแรกจากบรเวณชายแดนไทย กมพชา ในเวลาตอมาการดอยา chloroquine ไดแพรระบาดไปยงพนททมการระบาดของมาลาเรยทวโลก สงผลใหมผเสยชวตจากโรคมาลาเรยเพมขนอยางมนยส าคญ ตอมาจงเรมใชยา SP จนกระทงมรายงานดอยาเกดขนจากบรเวณเดยวกนนในชวงปลายทศวรรษ 1960 (Björkman and Phillips-Howard, 1990) และในป ค.ศ. 1985 พบการดอยา mefloquine ซงถกน ามาใชแทนยา SP เปนครงแรกจากบรเวณชายแดนไทย กมพชา (Shanks, 1994, Wongsrichanalai et al., 2001) นอกจากนยงพบวาสาเหตส าคญของการตดเชอและการระบาดของโรคมาลาเรยเพมขนมาจากการอพยพยายถนของประชากรบรเวณชายแดนจากประเทศพมาหรอกมพชาเขาสประเทศไทย (Bhumiratana et al., 2013)

ปจจบนยาขนานแรกทองคการอนามยโลกแนะน าใหใชในการรกษาผทตดเชอมาลาเรยชนด P. falciparum โดยเฉพาะในพนททมการระบาดของโรคมาลาเรย คอ Artemisinin - based combination therapy (ACT) โดยใชสารอนพนธของยา artemisinin รวมกบยาตานมาลาเรยตวอนๆ ไดแก lumefantrine mefloquine amodiaquine piperaquine และ SP (WHO, 2001) ส าหรบประเทศไทยใชยารวมกนระหวาง artesunate และ mefloquine ตงแตป ค.ศ.1995 ในพนททมการระบาดของเชอดอยา (WHO, 2001) ซงเปนยาทมประสทธภาพสามารถออกฤทธฆาเชอไดอยางรวดเรวและมความปลอดภย ทผานมาประเทศไทยประสบปญหาการดอยาตานมาลาเรยหลายชนด (multidrug resistance) พบความลมเหลวในการรกษาโรคมาลาเรยจากการใชยา artesunate - mefloquine ≥ 10% ท จงหวดกาญจนบร ระนอง ตาก และ อบลราชธาน จากการรกษาเปนเวลา 2 วน ไดเพมเปน 3 วน ซงการรกษาทไมไดผลนนมสาเหตมาจากการดอยา mefloquine สงผลใหความไวของยา artesunate ลดลง (WHO, 2014) และมรายงานวาเชอมาลาเรยมความไวตอยา artemisinin ลดลง ทจงหวดตราด เมอตดตามการรกษาพบวาอตราการหายขาดลดลงเหลอรอยละ 78.6 (Vijaykadga et al., 2006) ตอมามรายงานประสทธภาพของยา artemisinin ลดลงจากชายแดนไทย กมพชา (จงหวดไพลน ประเทศกมพชา) พบวาอตราการรกษาหายลดลงจากรอยละ 85.7 ในป ค.ศ. 2002 เหลอรอยละ 79.3 ในป ค.ศ. 2004 (Denis et al., 2006) ในป ค.ศ. 2008 มรายงานการดอยา artemisinin ของผปวยเปนครงแรกทกมพชา (Noedl et al., 2008, Dondorp et al., 2009) ซงจากการศกษาความไวของยา artemisinin ในรางกายผปวยพบวาอตราก าจดเชอออกจากกระแสเลอดชาลง ถงแมจะใหการรกษามากกวา 3 วน กยงคงตรวจพบเชอในกระแสเลอด นอกจากนยงพบวาการดอยา artemisinin มความสมพนธอยางมากกบการกบกลายพนธของยน K13 ของเชอ P. falciparum ในสวนของ Kelch

4 propeller domain (Ashley et al., 2014) ซงเปนยนทท าหนาทควบคมเอนไซม phosphatidylinisitol-3-kinase (PI3K) ทเกยวของกบการมชวตรอดของเชอมาลาเรย

เมอเดอนเมษายน ป ค.ศ. 2015 มรายงานการดอยา artemisinin ของเชอ P. falciparum เกยวของกบกลายพนธของยน K13 โดยเกบตวอยางเลอดผปวยจาก 10 จงหวด ของประเทศไทยจากบรเวณชายแดนไทยพมา ไดแก จงหวดแมฮองสอน ตาก กาญจนบร ประจวบครขนธ ชมพร และระนอง บรเวณชายแดนไทยกมพชา ไดแก จงหวดศรสะเกษ ชลบร และ ตราด รวมถงจงหวดยะลา จากการศกษาพบการกลายพนธของยน K13 ทงหมด 7 ต าแหนง คอ N458Y, R539T, E556D, P574L, R575K, C580Y และ S621F โดยอลลน C580Y พบการแพรระบาดมากทสดในประเทศไทย (Talundzic et al., 2015) และยงเปนต าแหนงการกลายพนธทถกยนยนวาการดอยา artemisinin ถกควบคมโดยยน K13 และสมพนธกบการมชวตรอดของเชอทเพมขนและอตราการก าจดเชอในกระแสเลอดลดลง (Ariey et al., 2014, Straimer et al.,2015 )

หากยาทมอยไมสามารถใชรกษาไดเนองจากเชอมาลาเรยดอยาจะท าใหผปวยมความเสยงทจะเปนมาลาเรยรนแรงมากขนและอาจเปนอนตรายถงชวตได ปญหาการดอยาตานมาลาเรยจงเปนเรองส าคญทควรตระหนก ปจจบนยงไมพบรายงานการดอยา artemisinin ของเชอ P. falciparum จากบรเวณภาคใตของประเทศไทยดงนนการเฝาระวงการดอยาจงเปนสงส าคญ ซงสามารถตรวจสอบไดจากการกลายพนธของยนK13 ดวยวธทางอณชววทยา เทคนค Loop - mediated isothermal amplification (LAMP) เปนวธทางอณชววทยาทสามารถใชเพมปรมาณสารพนธกรรมภายใตสภาวะอณหภมคงท เพยงอณหภมเดยว มความไวและความจ าเพาะสงเนองจากใชไพรเมอร 4 หรอ 6 ชดทจ าเพาะตอ 6 หรอ 8 ต าแหนงของยนเปาหมาย (Notomi et al., 2000) เปนวธทงายและรวดเรว เปนเทคนคทถกน ามาประยกตเพอใชในการตรวจวนจฉยโรคทเกดจากการตดเชอแบคทเรย ไวรส (Parida et al., 2008) รวมถงการระบชนดของเชอมาลาเรยทกอโรคในคนทง 5 ชนด จากยน 18S rRNA (Lau et al., 2016) นอกจากนยงมการน าเทคนค LAMP มาใชในการตรวจหาการกลายพนธของยนไดโดยการออกแบบไพรเมอรใหมความจ าเพาะตอยนเปาหมายทมการกลายพนธ (Zhang et al., 2016) ดงนนการศกษาครงนผวจยจงสนใจทจะพฒนาเทคนค LAMP เพอใชในการตรวจสอบการกลายพนธของยน K13 ทต าแหนง C580Y ซงสมพนธกบการดอยา artemisinin วตถประสงค

ศกษาและพฒนาเทคนค Loop - mediated isothermal amplification (LAMP) เพอใชในการตรวจสอบการกลายพนธของยน K13 ทต าแหนง C580Y ซงสมพนธกบการดอยา artemisinin

5 ประโยชนทคาดวาจะไดรบ

การวจยครงนมเปาหมายเพอพฒนาเทคนค LAMP เพอใชในการระบการกลายพนธของยน K13 ทต าแหนง C580Y ซงเปนต าแหนงทมความส าคญเกยวของกบการดอยา artemisinin ทใชเปนยาขนานแรกในการรกษาผปวยทตดเชอมาลาเรยชนด P. falciparum จะชวยใหทราบถงสถานการณการดอยาตานมาลาเรยจากบรเวณภาคใตของประเทศไทยและยงเปนขอมลทเปนประโยชนส าหรบกระทรวงสาธารณสขในการเลอกใชยาตานมาลาเรยไดอยางมประสทธภาพกบผปวย

ทบทวนวรรณกรรม 1. มาลาเรย

1.1 สาเหตของโรค

โรคมาลาเรยเปนโรคตดตอทมยงกนปลอง (Anopheles spp.) เพศเมยเปนพาหะ เกดจากเชอ โปรโตซวในกลม Plasmodium spp. เชอทกอโรคในคนม 5 ชนด ไดแก P. falciparum P. vivax P. malariae P. ovale และ P. knowlesi ในประเทศไทยสวนใหญพบชนด P. falciparum และ P. vivax

1.2 วงจรชวตของมาลาเรย

เชอ Plasmodium spp. ตองอาศยโฮสต 2 ชนด คอคนและยงกนปลอง (Anopheles spp.) เพศเมย วงจรชวตในยง มการสบพนธแบบอาศยเพศ หรอ sporogony วงจรชวตในคน มการสบพนธแบบไมอาศยเพศ หรอ schizogony แบงเปนระยะทเจรญเตบโตในเซลลตบ เรยกวา exo - erythrocytic schizogony และในเมดเลอดแดง เรยกวา erythrocytic schizogony ดงแสดงในรปท 1

รปท 1 แสดงวงจรชวตของเชอ Plasmodium spp. (CDC, 2015)

6

1.2.1 วงจรชวตในยง

เมอยงดดเลอดคนทมเชอ Plasmodium spp. จะไดรบเชอระยะ gametocyte ซงมทงตวผ (microgametocyte) และตวเมย (macrogametocyte) เขาไปในกระเพาะยง เชอตวผจะมการเปลยนแปลงทเรยกวา exflagellation คอมการแบงตวของนวเคลยสและสราง flagellum ขน จากนนแตละเซลลจะแยกตวออกและวายไปผสมกบ gametocyte ตวเมย ไดเปน zygote ตอมาจะเจรญเตบโตเปน ookinete และเคลอนทผานผนงกระเพาะอาหารของยง เจรญเตบโตเปน oocyst ซงภายในมการแบงเซลล sporozoites จ านวนมาก เมอ oocyst แตกออก sporozoites เหลานจะเคลอนทไปยงตอมน าลาย พรอมทจะถกสงเขากระแสเลอดคนเมอยงกดคนอกครง

1.2.2 วงจรชวตในคน

วงจรชวตในคนประกอบดวย 2 ระยะ แยกตามอวยวะทเชออาศยอยคอ ระยะในตบ และระยะในเมดเลอดแดง เมอคนไดรบ sporozoite จากยง ภายใน 30 นาท เชอจะเขาสเซลลตบ (hepatocyte) เพอเพมจ านวนแบบไมอาศยเพศ ได merozoite จ านวนมาก เรยกการเจรญเตบโตในเซลลตบนวา exo-erythrocytic schizogony ส าหรบ P. vivax และ P. ovale นน sporozoite บางตวเขาไปอยในซยโตพลาสซมของเซลลตบไดเปนเวลานาน เชอทอยในระยะนเรยก hypnozoite ซงท าใหเกดไขกลบ (relapse) เมอเซลลตบแตกออก merozoite จะเขาสกระแสเลอด เจรญเตบโตตอไปในเมดเลอดแดงซงแบงออกเปนระยะ ring form, trophozoite และ schizont ประมาณ 2 สปดาห merozoites ในระยะ schizont จะแตกออกมาจากเมดเลอดแดง เขาสเมดเลอดแดงใหม merozoites บางสวนจะเจรญเปน gametocyte ตวผและตวเมยแทน ซงจะมการเจรญเตบโตในยงตอไป

1.3 อาการของโรคมาลาเรย ในระยะแรกจะแสดงอาการไมชดเจน มอาการคลายไขหวด ในเดกเลกมกพบตบมามโต เนองจากในระยะแรกๆ ของการตดเชอมาลาเรย เชออาจเจรญถงระยะแกไมพรอมกน ซงอาจเปนผลมาจากไดรบเชอในเวลาตางกน ท าใหเกดมเชอหลายระยะ ดงนนการแตกของเมดเลอดแดงจงไมพรอมกน ท าใหผปวยมาลาเรยในระยะแรกอาจมไขสงไดตลอดวน แตเมอผานไประยะหนงแลวการแตกของเมดเลอดแดงพรอมกน จงเหนผปวยมการจบไขหนาวสนเปนเวลาสม าเสมอ อาการจบไขเปนอาการทเดนชดของมาลาเรยประกอบดวย 3 ระยะคอ ระยะหนาวสน ผปวยจะมอาการไขหนาวสน กนเวลาประมาณ 15 - 60 นาท จากนนจะมไขตวรอนหนาแดง อณหภมรางกายอาจถง 41ºC ผวแหงอาจมคลนไส อาเจยน เปนเวลา 2 – 6 ชวโมง และระยะสดทายผปวยจะมไขลดลงและมเหงอออกทวตว อาการไขหนาวสนตามชวงเวลาของไขมาลาเรยเกดจากการแตกออกของเมดเลอดแดงแลวมเชอระยะ schizont ออกมาในกระแสเลอด อาการอาจเปนระยะสนๆ หรอหลายวน ขนอยกบระยะเวลาการฟกตวของเชอ จ านวนของ sporozoite ทผปวยไดรบเขาไป และชนดของเชอ หากไดรบเชอ P. vivax

7

P. ovale และ P. falciparum เมดเลอดแดงจะแตกทกๆ 48 ชวโมง (tertian periodicity) P. malariae มอาการทก 72 ชวโมง (quartan period) ผปวยบางรายมอาการรนแรงซงเกดจากการตดเชอมาลาเรย P. falciparum ความรนแรงของโรคขนอยกบอายของผปวย อาการทมกพบคอ น าทวมปอด ไตวายเฉยบพลน ภาวะดซาน เลอดเปนกรด ในเดกพบโลหตจางขนรนแรงและระดบน าตาลในเลอดต า อาจมอาการชก หมดสตจากภาวะมาลาเรยขนสมองซงหากเกดกบหญงมครรภจะมอตราการตายสงและเปนอนตรายตอทารกในครรภ โดยพบการอดตนของเมดเลอดแดงทมเชอมาลาเรยในเสนเลอดฝอยในสมอง ยงพบการอดตนของเมดเลอดขาวในเสนเลอดภายในสมอง และยงเพม permeability ของเสนเลอดฝอยท าใหน าเลอดรวไหลมานอกเสนเลอด พบรายงานการเสยชวตจากภาวะมาลาเรยขนสมองมากในเดกชาวแอฟรกน นอกจากนยงมการอดตนของเสนเลอดฝอยรอบไตท าใหเลอดไปเลยงไตไดนอยลง ผปวยจงมอาการไตวายเฉยบพลนสงผลใหการท างานของอวยวะทส าคญในรางกายลมเหลว อตราการเสยชวตจะเพมขนหากมเชอมาลาเรยในกระแสเลอดมากกวา 2 % (White et al., 2014)

1.4 ยาตานมาลาเรย

1.4.1 Chloroquine (CQ) ออกฤทธฆาเชอมาลาเรยระยะไมมเพศในเลอด ไมมฤทธตอเชอมาลาเรยทอยในเนอเยอตบ

แตมฤทธยบยง cytochrome P540 ในตบระดบออนถงปานกลาง ในชวงทศวรรษท 1950 มใชยา chloroquine อยางกวางขวางและ เปนยาตวเเรกทจะใชในการรกษาผปวยมาลาเรยซงมราคาถก แตพบการดอยา chloroquine ของ P. falciparum ในภมภาคเอเชยตะวนออกเฉยงใตตามแนวชายแดนไทยกมพชาแลวแพรกระจายไปยงประเทศอนๆ ในเอเชยแลวระบาดไปยงแอฟรกา (Harinasuta et al., 1965, Young et al., 1963)

1.4.2 Sulfadoxine-Pyrimethamine (SP) ยา sulfadoxine-pyrimethamine (SP) ใชแทน CQ เปนยาออกฤทธเสรมกนในการยบยง

การสรางกรดโฟลกซงจ าเปนตอชวสงเคราะหของกรดนวคลอกของเชอมาลาเรย P. falciparum ยา SP เปนยาทมฤทธยบยงเอนไซม dihydrofolate reductase (DHFR) และ dihydropteroate syntase (DHPS) ของ P. falciparum พบวามการระบาดของการดอยาชนดนในภมภาคเอเชยตะวนออกเฉยงใตเมอกลางทศวรรษท 1960 มการกลายพนธหลายต าแหนงทงในยน Pfdhfr และยน Pfdhps โดยรปแบบการกลายพนธทพบบอย คอ codon ท 108, 51, 59 และ 164 และ codon ท 437, 540, 581 ของยน Pfdhps และ ยน Pfdhfr ตามล าดบ (Roper et al., 2003)

8

1.4.3 Mefloquine กลไกการออกฤทธของยา mefloquine ยงไมทราบสาเหตทแนชด แตมการใชรวมกบยา SP

เพอใชรกษาโรคมาลาเรยในบรเวณทมการดอยา SP ส าหรบการดอยา mefloquine พบวามความสมพนธกบการเพมขนของจ านวนชด (copy number) ของยน multidrug resistance (pfmdr1) ของเชอ P. falciparum (Price et al., 2004)

1.4.4 Artemisinin และอนพนธของ artemisinin

ใชเปนยารกษาผตดเชอ P. falciparum ในบรเวณทพบการระบาดของเชอดอยาหลายชนด ยาชนดนฆาเชอในระยะไมมเพศในเมดเลอดแดงทกระยะโดยสามารถฆาเชอ gametocyte ของเชอ P. falciparum ไดเลกนอย แตไมมฤทธฆาเชอทอยในตบ ยาสามารถผาน blood brain barrier และ blood-placenta barrier จงมความส าคญในการรกษาเชอมาลาเรย P. falciparum ทเขาสสมองได ซงกลไกการออกฤทธของ artemisinin คาดวายากลมนอาศยกระบวนการสรางอนมลอสระ คอ เชอมาลาเรยจะท าลายเมดเลอดแดงในผปวย โดยเปลยน haemoglobin (Fe3+) ใหเปน haem (Fe2+) ซง Fe2+ ทเกดขนจะไปเรงปฏกรยาเปลยน endoperoxide ring โครงสรางของยา ท าใหยามคณสมบตเปนสารอนมลอสระ จะไปจบกบโปรตนของเชอมาลาเรยท าใหเชอถกท าลาย ยาสามารถออกฤทธท าลายเชอไดอยางรวดเรวสามารถ ท าใหลดการแพรระบาดของเชอได เมอยาเขาสรางกายจะอยในรป dihydroartemisinin (DHA) ซงมคาครงชวตสนเพยง 1 ชวโมง ถงแมยาจะสามารถลดปรมาณเชอได 100 ลานตว แตยาจะถกท าลายกอนทเชอจะถกก าจดออกนอกรางกายไดหมด ยาทใชรวมกบยา artemisinin จะใชยาทมคาครงชวตยาวกวา จงสามารถก าจดเชอทเหลอในกระแสเลอดไดหมด (Pukrittayakamee et al., 2004, White, 2008)

ปจจบนองคการอนามยโลกไดแนะน าใหใชกลมยา artemisinin – combination based therapies (ACTs) เปนยาขนานแรกทใชในการรกษาโรคมาลาเรยทเกดจากเชอ P. falciparum ทมอาการไมรนแรง โดยตวยาสามารถลดจ านวนเชอมาลาเรยไดภายใน 3 วนแรกของการรกษา ยาในกลม ACTs ทแนะน าใหใชยารวมกนมดงน artemether - lumefantrine, artesunate - amodiaquine, artesunate - mefloquine และ artesunate - SP ส าหรบประเทศไทยใชยารวมกนระหวาง artesunate - mefloquine

artemisinin และอนพนธของ artemisinin มฤทธเสรมกบยา mefloquine และเมอป ค.ศ. 2003 Vijaykadga และคณะ ไดรายงานการใชยา artesunate รวมกบยา mefloquine ในการรกษาผปวยในแถบชายเเดนไทยกมพชาและพมา มประสทธภาพลดลงอยางเหนไดชดเจน (Vijaykadga et al., 2006) ในป ค.ศ. 2004 และ 2006 มการศกษาการดอยา mefloquine ของเชอ P. falciparum ในแถบภมภาคลมแมน าโขง (กมพชาและไทย) พบวาการดอยา mefloquine มความสมพนธกบการเพมขนของจ านวนชด (copy number) ของยน pfmdr 1 และมเเนวโนมวาการใชยา artesunate -

9

mefloquine จะไมไดผล (Price et al., 2004, Price et al., 2006) และในป 2008 - 2009 มรายงานการดอยา artemisinin เปนครงแรกในผปวยจากประเทศกมพชา (Noedl et al., 2008, Dondorp et al., 2009) การดอยา artemisinin ของเชอ P. falciparum ท าใหการก าจดเชอออกจากรางกายชาลงและการตอบสนองตอยา artemisinin ลดลง เมอทดสอบความไวของเชอตอยาทความเขมขนตางๆ ในหลอดทดลอง (in vitro) โดยคดปรมาณเชอในระยะวงแหวนทมชวตรอด ภายใน 3 ชวโมง จาก ring stage assay survival rate (RSA0–3h ) พบวา เชอมชวตรอดเพมขนและเวลาทใชในการก าจดเชอนานขน (Witkowski et al., 2013, Amaratunga et al., 2014) มการศกษาความไวของยา artemisinin ในหลอดทดลองตอการอยรอดของเชอ P. falciparum สายพนธ F32-Tanzania พบวาเชอสามารถมชวตรอดแมความเขมขนของยาจะสงกตาม (Witkowski et al., 2010) นอกจากนการดอยายงสมพนธกบกลายพนธของยนในสวนของ K13 propeller domain ของเชอ P. falciparum (PF3D7_1343700)

2. P. falciparum kelch ( Pfkelch ) gene

ยน Kelch ของเชอ P. falciparum (PF3D7_1343700) อยบนโครโมโซมคท 13 จงเรยกยนนวา Kelch13 (K13) ถอดรหสไดกรดอะมโนจ านวน 726 ตว โปรตนนประกอบดวย 3 โดเมน คอ สวนทเปน Plasmodium - specific domain, BTB/POZ domain และ kelch propeller domain ซงสวนของ kelch propeller domain จะอยบรเวณปลาย C ของสายเปบไทดประกอบดวย kelch motif คอโปรตนทมลกษณะเปน repeated sequence ของเปบไทด จ านวน 6 สวน ทเรยงตวแบบ beta - sheet และจดเรยงโครงสรางคลายใบพดแตละใบ (blade) แตละ repeat มาประกอบกนจะมลกษณะเหมอนใบพดหรอกงหน เรยก propeller ดงรปท 2 และ รปท 3

รปท 2 แสดง kelch propeller domain ของเชอ P. falciparum (Ariey et al., 2014)

ส าหรบการศกษาหนาทของโปรตน Kelch พบวาเกยวของการตอบสนองของเซลลตอสภาวะ oxidative stress จาก pro - oxidant activity ของอนพนธของยา artemisinin และยงมความคลาย (homology) กบโปรตน KEAP1 ของมนษยทท าหนาทเกยวกบการปรบตวตอสภาวะ oxidative stress และ

10 คลายกบโปรตน KLHL12 กบ KLHL2 ซงเกยวของกบการยอยสลายโปรตน (ubiquitin-based protein degradation) ในกระบวนการแสดงออกของยนเปนโปรตน (Ariey et al., 2014)

รปท 3 แสดงโครงสรางสามมตของโปรตน kelch ของเชอ P. falciparum (Ariey et al., 2014)

พบต าแหนงการกลายพนธ 17 ต าแหนงบนยน K13 เมอท าการทดลองจากตวอยางเลอดผปวยทตดเชอมาลาเรยชนด P. falciparum จากประเทศกมพชาระหวางป ค.ศ. 2001-2012 พบอลลนทมการกลายพนธมากทสดคอ C580Y, R539T และ Y493H ซงท าใหการตอบสนองตอยา artemisinin ลดลง พบไดทงในเชอ P. falciparum ทเลยงในหลอดทดลองและทแยกไดจากผปวย (Ariey et al., 2014) มการศกษาอลลนทเกยวของกบการดอยา artemisinin จาก 10 จงหวดในประเทศไทย (แมฮองสอน ตาก กาญจนบร ประจวบครขนธ ชมพร ระนอง ศรสะเกษ จนทบร ตราด และยะลา) พบการกลายพนธ 7 ต า-เเหนง ในยน K13 คอ N458Y, R539T, E556D, P574L, R575K, C580Y, S621F และ ต าแหนงทพบความถสงสดคอ C580Y, R539T และ P574L ในขณะทการกลายพนธของ R575K และ S621F พบการรายงานเปนครงเเรกในประเทศไทย โดยอลลน C580Y จะมความเกยวของกบการดอยา artemisinin ซงพบและแพรระบาดมากทสดในประเทศไทย (Talundzic et al., 2015) เพอยนยนวาการกลายพนธของ K13 propeller เกยวของกบการดอยา artemisinin Straimer และคณะ ไดท าการทดลองโดยใช zinc-finger nucleases (ZFNs) เพอท าพนธวศวกรรมยน K13 ของเชอ P. falciparum ทงสายพนธ ท ดอและไวตอยา artemisinin รวมทงสายพนธอนทไวตอยาเพอใชเปน reference strain จากการศกษาพบวาเมอใสยน K13 ทกลายพนธไปในเชอสายพนธทไวตอยาท าใหเชอดอยา พบการกลายพนธของยนทต าแหนง Y493H, R539T, I543Tและ C580Y ซงมความส าคญและเกยวของกบการดอยา artemisinin โดยต าแหนง C580Y พบมากทสดและมผลตอการดอยา artemisinin เพมขนเมอเปรยบเทยบกบเชอสายพนธมาตรฐานทไวตอยา (Straimer et al., 2015) มการศกษาการแสดงออกของยนในระดบ mRNA (transcriptomics) ของเชอ P. falciparum ทงสายพนธทดอและไวตอยา ทแยกจากผปวยทเปนมาลาเรยแบบเฉยบพลนจ านวน 1,043 ตวอยาง เพอใหทราบถงการกลายพนธของยน K13 สงผลตอการดอยาไดอยางไร จากการวเคราะหแสดงใหเหนวาการดอยาเกยวของกบยนทท าหนาทเกยวกบการขดหรอมวนตวของและการซอมแซมโปรตน ท าใหมการแสดงออกของ unfolded protein response pathways (UPR) เพมมากขนสงผลใหการท าลายโปรตนของเชอสายพนธท

11 ดอยาลดลง และยงเกยวของกบยนทท าหนาทเกยวกบการจ าลองตวเองของ DNA จะตอบสนองนอยลงซงจะเกยวของกบการเปลยนแปลงระยะของเชอภายในเมดเลอดแดง โดยเชอทพบยนดอยาจะหยดการเจรญเตบโตอยทระยะ immature ring stage มากกวาระยะทเปน mature stages เชน trophozoites หรอ early schizonts (Mok et al., 2015)

Artemisinin ออกฤทธฆาเชอ P. falciparum ไดทงระยะ ring form และระยะตวเตมวยในเลอด โดยประสทธภาพของการออกฤทธขนกบความสามารถของยาในการฆาเชอทง 2 ระยะน ถายาสญเสยความสามารถในการฆาเชอ P. falciparum กจะท าใหประสทธภาพของการตานเชอมาลาเรยลดลง แลวท าใหเกดการดอยาได จากการศกษาของ Kyaw M Tun และคณะ พบวาเชอมการดอตอยา artemisinin ในประเทศพมาซงเปนบรเวณทมการตดเชอมาลาเรยเปนจ านวนมาก ในแถบเอเชยตะวนออกเฉยงใตและยงพบการเกด mutation ของ K13 propeller gene ทต าแหนง P574L และ C580Y ผวจยจงสนนษฐานวาการดอยาชนดนมความเกยวของกบ mutation ทเกดขน (Tun et al., 2015)

Zaw Lin และ Myo Thura Zaw ท าการศกษาพบวา ผปวยทตดเชอ P. falciparum และไดรบการรกษาดวย ACT ยาชนดนจะเขาไปยบยง P. falciparum phosphatidylinositol - 3 - kinase (PfPl3K) เมอรกษาไประยะหนงเชอเกด mutation ขนท K13 propeller gene ท าใหมการดอตอยาเพมมากขน โดยมการลดลงของการเกด polyubiquitination ของ PfPl3K ต าแหนง mutation ทพบในประเทศกมพชา พมา ภาคตะวนออกและตะวนตกของไทย สวนใหญเปน C580Y นอกจากนยงพบทต าแหนง F446I ซงพบไดบอยในเขตชายแดนจน - พมา (Lin and Zaw, 2015)

Michele D Spring และคณะ ไดท าการศกษาโดยใหยา dihydroartemisinin - piperquine ในผปวยตดเชอมาลาเรยชนด P. falciparum ทมการดอตอยา ACT ทไมมภาวะแทรกซอนในประเทศกมพชา โดยดประสทธภาพของการรกษาในวนท 3 หลงจากผปวยไดรบยา dihydroartemisinin - piperquine พบวาเกดความลมเหลวในการรกษาดวยยา dihydroartemisinin - piperquine โดยมความเกยวของกบ mutation ทต าแหนง C580Y ใน K13 propeller gene (Spring et al., 2015)

Abu Naser Mohon และคณะ ไดท าการศกษาในป ค.ศ. 2009 - 2013 เกยวกบ mutation ของ K13 ในประเทศบงกลาเทศ ซงเปนประเทศทมการแพรระบาดของเชอมาลาเรยนอย พบวา ม mutation ทต าแหนง C580Y และ A578S ซงนาจะแพรระบาดมาจากประเทศอน (Mohon et al., 2014)

มลลกา อมวงศ และคณะ ไดท าการศกษาการแพรระบาดของ P. falciparum ทมการดอยา artemisinin ในภาคตะวนออกของไทย พบวา ใหผลเหมอนกบการศกษาในฝงตะวนตกของกมพชาและตอนใตของลาว คอ สวนใหญมความเกยวของกบ K13 mutation ทต าแหนง C580Y และ R539T นอกจากนยงมการตอดอยาชนดอนๆ รวมดวย คอ chloroquine และ SP แตการเกด mutation ทต าแหนงดงกลาวพบวามการดอยา mefloquine นอยมาก (Imwong et al., 2015)

ส าหรบกลไกการดอยา artemisinin ของเชอ P. falciparum คอ ปกตยา artemisinin จะไปออกฤทธยบยงเอนไซม phosphatidylinositol - 3 - kinase (PfPI3K) ของเชอ ซงเปนเอนไซมทท าหนาทในการเตมหมฟอสเฟตบนโมดลกลของโปรตน เกยวของกบการสงทอดสญญาณภายในเซลลน าไปสการตอบสนอง

12 ของเซลลโดยเฉพาะการอยรอดและการเจรญเตบโตของเซลล โดยจะเกดกระบวนการ Ubiquitination ซงบงบอกวาเซลลอยในสภาวะ cellular stress ในกระบวนการนจะ มโปรตน (Ubiquitin) เปนตวพา เอนไซม PfPI3K ไปก าจดทงท proteasome แตในเชอทดอยา เอนไซม PfPI3K จะจบกบโปรตน PfKelch13 ไดนอยลง เก ดกระบวนการ Ubiquitination ลดลงท า ใหม เอน ไซม PfPI3K เพ มข น น า ไป ส การม phosphatidylinositol - 3 - phosphate (PI3P) ซงเปนผลผลตจากการท างานของเอนไซมชนดนสงขน และคาดวาโปรตน PI3P เกยวของกบการมชวตรอดของเชอผานกระบวนการรดอกซ กระบวนการถอดรหสและกระบวนการซอมแซม DNA แสดงกลไกการดอยาในรปท 4 นอกจากนยงพบวาเอนไซม PfPI3K จะเพมสงขนประมาณ 1.5 - 2 เทา ในสายพนธทดอยา (Mbengue et al., 2015)

รปท 4 แสดงกลไกการดอยา artemisinin ของเชอ P. falciparum (Mbengue et al., 2015)

3. การตรวจวนจฉยโรค

เนองจากอาการของโรคมาลาเรยในชวงแรกมกแสดงอาการไมจ าเพาะ มกมอาการคลายไขหวด มไขต าๆ ดงนนการวนจฉยผปวยทมไขและอาศยอยในพนทระบาดของมาลาเรยหรอเดนทางไปยงพนททมการระบาดอาจสงสยวาตดเชอมาลาเรย ควบคกบการตรวจทางหองปฏบตการ( Moody, 2002) การตรวจเพอยนยนโรคมาลาเรยทางหองปฏบตการไดแก

3.1 การตรวจหาเชอดวยกลองจลทรรศน วธมาตรฐานในการตรวจวนจฉยโรคมาลาเรยคอการตรวจเชอมาลาเรยจากแผนฟลมเลอดโดยใชกลอง

จลทรรศนแบงเปนชนดฟลมหนา (thick blood film) และชนดฟลมบาง (thin blood film) วธนสามารถดปรมาณและจ าแนกระยะ ชนดของเชอได ใชเวลาไมนาน คาใชจายต า แตตองอาศยผช านาญในการดกลองและแยกชนดของเชอมาลาเรยไดอยางถกตอง

13

3.2 การตรวจหาเชอดวยวธทางภมคมกนวทยา โดยใชชดตรวจ (rapid diagnostic test) อาศยการตรวจหาแอนตเจนหรอเอนไซมทจ าเพาะตอเชอมาลาเรย สวนใหญจะจ าเพาะตอ P. falciparum ไดแก Histidine rich protein -2 (HRP-2) , เอนไซม lactate dehydrogenase จงเหมาะสมในการแยกระหวางการตดเชอ P. falciparum กบ non - P. falciparum เปนวธทสะดวก งายและรวดเรว 3.3 การตรวจหาเชอดวยวธทางอณชววทยา วธการตรวจหา DNA ของเชอมาลาเรย โดยเพมปรมาณ DNA ของเชอโดยวธ polymerase chain reaction (PCR) สามารถแยก species ของเชอไดจงเปนวธทมความไว (sensitivity) และความจ าเพาะ (specificity)สง

3.3.1 Polymerase chain reaction (PCR) เทคนค PCR เปนเทคนคทางอณชววทยาสามารถเพมขยายปรมาณ DNA ทตองการจาก

ปรมาณนอยใหมปรมาณมากกวาเดมเปนพนถงลานเทาได ถกพฒนาขนในปค .ศ.1983 โดย Kary Mullis นกชวเคมชาวอเมรกา (Rahman et al., 2013) ปจจบนเปนเทคนคทนยมใชกนมากในการวนจฉยทางการแพทยและงานวจยดานตางๆ โดยตองอาศยปฏกรยาทตอเนองหลายรอบเพอเพมปรมาณดเอนเอซงเครองควบคมอณหภม (thermal cycler) และสวนประกอบทจ าเปนในการท า PCR ไดแก

1. สายดเอนเอตนแบบ (DNA template) หรอ cDNA ทมชนสวนของ DNA ทตองการเพมปรมาณ 2. Primer ทมล าดบเบสคสมกบสวนตนและสวนทายของ DNA เปาหมาย อยางนอย 1 ค 3. เอนไซม Taq polymerase สามารถทนอณหภมสงได ท าหนาทสราง DNA สายใหมตอจาก primer เมอมนวคลโอไทดมาเตม 4. dNTPs ประกอบดวย dATP dTTP dCTP และ dGTP 5. บฟเฟอรทมไอออนทเหมาะสม

ขนตอนในปฏกรยา PCR 1. ขนตอน denaturation อณหภมประมาณ 94 - 96°C DNA สายคแยกออกจากนเปนสายเดยว 2. ขนตอน annealing อณหภมลดลงเปน 50 - 60 °C ท าให primer สามารถจบกบสาย DNA ได อณหภมชวงนขนกบคา melting temperature (Tm) ของ primer 3. ขนตอน extension อณหภมประมาณ 70 - 75 °C เอนไซม Taq polymerase ท างานสรางสาย DNA จากทศทาง 5’ ไป 3’

Nested PCR เปนเทคนคการเพมปรมาณยนดวยวธ PCR อาศย primer 2 ค ส าหรบปฏกรยา PCR 2

ขนตอนโดย PCR ขนตอนแรกและ primer คแรก จะอยบรเวณรอบนอกของของยนเปาหมายซงมยน

14

เปาหมายอยในล าดบเบสของ PCR product ส าหรบ PCR ขนตอนทสองและ primer คทสอง ซงจ าเพาะกบยนเปาหมายและเพมปรมาณตรงยนเปาหมายทตองการโดยใช PCR product จาก PCR รอบแรกเปนตนแบบ จงเปนวธทมความจ าเพาะมากกวา conventional PCR 3.3.2 Isothermal amplification methods

ในปจจบนวธทางอณชววทยาทใชส าหรบเพมปรมาณกรดนวคลอกเปาหมาย (DNA หรอ RNA) เขามามบทบาทส าคญในงานวจยทางดานวทยาศาสตรและใชกนอยางแพรหลายเพราะเปนวธทมประสทธภาพ มความไวและความจ าเพาะสง นอกจากนยงมประโยชนทางดานการแพทย ท าใหการตรวจวนจฉย การท านายโรคหรอการตดตามการรกษา มประสทธภาพและแมนย ามากขน เทคนค PCR ถกน ามาประยกตใชอยางแพรหลายในงานสาขาตางๆ เปนเทคนคการเพมปรมาณ DNA เปาหมาย จาก DNA ตนแบบ ภายในหลอดทดลองในระยะเวลาไมนานและได DNA สายใหมเกดขนเปนลานเทาจากการเกดปฏกรยาหมนเวยนกนหาลายรอบภายใตการปรบเปลยนอณหภมซงเปนไปตามขนตอนทตงไวโดยอาศยเครองควบคมอณหภม อยางไรกตามปจจบนมการพฒนาเทคนคส าหรบการเพมปรมาณยนมากมายซงมความไวและความจ าเพาะสงเชนเดยวกนเพอลดขอจ ากดบางประการของวธทใชอย วธการ Isothermal amplification เปนเทคนคการเพมปรมาณยนทสนใจโดยใชอณหภมคงทเพยงอณหภมเดยว เปนวธทรวดเรวและไมตองอาศยเครองควบคมอณหภม ซงมดวยกนหลายวธ ตวอยางเชน nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), loop-mediated isothermal amplification (LAMP), helicase - dependent amplification (HDA), rolling circle amplification (RCA) และ strand displacement amplification (SDA) (Asiello and Baeumner, 2011, Yan et al., 2014)

Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) วธการเพมขยายปรมาณ RNA ทอณหภม 41ºC โดยปฏกรยาสามารถสรางสาย RNA ทม

ล าดบเบสคสมกบ RNA เปาหมายไดประมาณ 1 พนลานสาย ภายในเวลา 1.5 ชวโมง โดยใช primer 2 เสนทจ าเพาะตอ RNA เปาหมาย เสนหนงจะประกอบดวยสวนทเปน T7 promotor ทดานปลาย 5’ ของ primer และใชเอนไซม 3 ชนดในการด าเนนของปฏกรยา ไดแก reverse transcriptase, RNase H และ T7 DNA-dependent RNA polymerase (DdRp) เมอ primer ทม T7 promotor จบกบ RNA เปาหมาย เอนไซม reverse transcriptase จะสรางสายลกผสมของ cDNA - RNA จากนนเอนไซม RNase H จะท าหนาทยอยสาย RNA เหลอแคเสนทเปน cDNA เมอ reverse primer เขาจบจะท าหนาทสรางสาย dsDNA สายใหมทมสวนของ T7 promotor อย จากนนเอนไซม T7 DdRp ใช dsDNA เปนตนแบบในการสราง complementary RNA ออกมาจ านวนมาก ssRNA ทเกดขนสามารถตรวจวดไดโดยวธ hybridization-based methods เชน lateral flow assay, electrochemiluminescence NASBA จงเปนอกหนงวธทางเลอก

15

นอกเหนอจาก RT-PCR ทมประสทธภาพในงานวจยทางดาน RNA และการวนจฉยโรคตดเชอทม RNA เปนสารพนธกรรม นอกจากนยงถกประยกตใชในงานดานสงแวดลอมและอาหารอกดวย

Strand displacement amplification (SDA) SDA อาศยคณสมบต strand displacement ของเอนไซม DNA polymerase ทขาด

คณสมบต exonuclease (exo – Klenow) เอนไซมตดจ าเพาะ และ primer จ านวน 4 เสน ประกอบดวย forward กบ reverse primer ทถกออกแบบใหมต าแหนงตดจ าเพาะของเอนไซม HincII exonuclease ทปลาย 5’ และ forward กบ reverse bumper primer โดยหลงจากขนตอน denature ท าให dsDNA แยกเปนสายเดยว forward primer จะจบกบ DNA เปาหมายในบรเวณทจ าเพาะและเหลอสวนปลาย 5’ overhang สาย DNA ถกสรางตอโดยเอนไซม DNA polymerase จากนน bumper primer เขามาจบกบ DNA เปาหมายเสนเดยวกนนเมอมการสรางสาย DNA ตอจาก forward bumper primer กจะปลดปลอย DNA product ทเกดจาก primer ทมต าแหนงตดจ าเพาะ product นจะถกจบดวย reverse primer และ reverse bumper primer ซงเกดการสรางสาย DNA แทนทและปลดปลอยสาย DNA เกดขนเชนเดยวกน จนได dsDNA ทมบรเวณตดจ าเพาะของเอนไซมทปลายทงสองขางของสาย DNA เมอเอนไซมตดจ าเพาะตดตรงบรเวณต าแหนงตดจ าเพาะจะเกดชองวางแลว DNA polymerase สรางสาย DNA ตอจากชองวางทเกดขนและท างานวนเชนนเปนวงจรเพอเพมปรมาณ DNA มการประยกตใชเทคนคนเพอตรวจหาการตดเชอ Chlamydia trachomatis และ Neisseria gonorrhoeae

Helicase-dependent amplification (HDA) ปฏกรยาเลยนแบบกลไกการจ าลองตวเองของ DNA ตามธรรมชาต โดยอาศยเอนไซม DNA

helicase จะคลายเกลยวสาย dsDNA ใหแยกออกจากกนขณะเดยวกนจะม single strand binding protein มาจบสาย DNA ทแยกออกไมใหมาจบเขาคกนไดใหมในระหวางขนตอน จากนน primer จะจบกบสาย DNA แลวสรางเปน DNA สายใหมโดยการท างานของเอนไซม DNA polymerase วธการนยงถกน ามาประยกตใชรวมกบวธ lateral flow assay เพอตรวจหาเชอ HIV ของมนษย

Rolling circle amplification (RCA) เปนวธเพมปรมาณ DNA โดยใช padlock probe ซงมลกษณะเปน circular DNA สายเดยว

ทปลาย 3’ และ 5’ มล าดบเบสคสมกบ DNA และมชวงวางบรเวณกงกลางสายซงจะถกเชอมใหตอกนดวยเอนไซม ligase ซง circular DNA ถกใชเปนแมแบบเพอสราง DNA สายใหม สามารถเกดขนอยางตอเนองโดยอาศยเอนไซม DNA polymerase และท าใหได DNA product สายเดยวทมความยาวและประกอบไปดวยล าดบเบสทซ ากนเปนชด (tandem repeat) จ านวนมากทมาจากสวนทมล าดบเบสคสมกบ DNA ตนแบบ วธ RCA ถกน ามาใชเพอเพมปรมาณ DNA virus ทมจโนมเปนแบบ circular นอกจากนยงใชเพอการตรวจวนจฉยโรคทเกดจากความผดปกตของยน เชน ตรวจการกลายพนธของยน CFTR ของโรค cystic fibrosis

16

3.3.3 เทคนค Loop mediated isothermal amplification (LAMP) วธการเพมขยายยนดวยเทคนค LAMP ถกพฒนาขนในป ค.ศ.2000 โดยนกวจยชาวญปนชอ

Tsugunori Notomi และคณะ (Notomi et al., 2000) โดยวธนสามารถเพมปรมาณสารพนธกรรมใชเวลาทดสอบนอยกวาเทคนค PCR พบวาสามารถเพมขยายไดถง 109 เทาในเวลานอยกวา 1 ชวโมง ไมตองอาศยเครอง PCR เนองจากปฏกรยาของ LAMP สามารถเกดไดทอณหภมเดยวประมาณ 60 - 65 °C โดยใช primer จ านวน 4 เสน สามารถตรวจสอบยนทมความจ าเพาะถง 6 ต าแหนงของยนเปาหมาย การเพมขยายยนจะใชอณหภมคงทและใชปฏกรยา strand displacement ของเอนไซม Bst DNA polymerase .ในปฏกรยา LAMP จะเกดสาร pyrophosphate ซงจะไปจบกบ magnesium ion กลายเปน magnesium pyrophosphate ตกเปนตะกอนสขาว สามารถมองเหนดวยตาเปลา

Primer ทใชในปฏกรยาประกอบดวย outer primer จ านวน 2 เสน ประกอบดวย F3 และ B3 ท าหนาทชวยใหเกด strand displacement ในขนตอน initial step และ inner primer จ านวน 2 เสน ท าหนาทในการสราง loop ประกอบดวย forward inner primer (FIP) และ backward inner primer (BIP) โดย FIP ประกอบดวย F1c กบ F2 และ BIP ประกอบดวย B1c กบ B2 นอกจากนการม loop primer จะชวยใหปฏกรยาเกดไดดยงขน (Nagamine et al., 2002) ปฏกรยาของ LAMP ประกอบดวย 2 ขนตอนทส าคญ คอ LAMP non - cyclic step และ cyclic amplification step (Notomi et al., 2000, Parida et al., 2008) แสดงดงรปท 5

1) Non - cyclic step เปนขนตอนการสราง stem loop ทงสองขางของยนเปาหมาย เรมจากเอนไซม Bst DNA polymerase ซงท างานไดดทอณหภมระหวาง 60-65 °C ท าหนาท สงเคราะหสาย DNA โดยอาศยคณสมบต strand displacement activity โดย inner FIP primer ดาน F2 จะเขา จบกบ F2c และท าการสงเคราะหทปลาย 3’ ของ primer F2 จากนน F3 primer เขามาจบในต าแหนง F3c แลวท าการ สงเคราะหโดย DNA polymerase จะท าการแยกสาย FIP-link complementary strand ซงสายนจะเกดการ form เปน loop ทปลาย 5’ โดยเกดจาก F1c จบกบ F1 และ BIP ดาน B2 จะเขาจบกบ B2c และ ท าการสงเคราะหทปลาย 3’ ของ B2 primer จากนน B3 primer เขามาจบในต าแหนง B3c แลวท าการสงเคราะหโดย DNA polymerase ท าการแยกสาย BIP-link complementary strand ซงสายนจะเกดการ form เปน loop ทปลาย 5’ โดยเกด จาก B1c จบกบ B1 ซงการเกด loop ของดาน FIB และ BIP ซงมรปรางคลาย dumbbell เพอเปนโครงสรางเรมตนในการเพมขยายยนตอไป

2) Cyclic amplification step เปนปฏกรยาทเกดซ าในขนตอนแรก โดย inner primer จะเขาจบตรงบรเวณ loop ของสาย DNA และ Bst DNA polymerase เตมเบสคสมทางดานปลาย 3’ ของ primer ได DNA สายใหมซงจะถกแทนทและถกรดออกเพอใชเปน DNA ตนแบบ ตอไป การท างานจะเกดขนอยางตอเนอง และท าใหไดยนเปาหมายหลากหลายขนาดแตกตางกน สามารถเพม

17

ขยายยนไดถง 109 เทาภายในเวลานอยกวา 1 ชวโมง ส าหรบการตดตามproduct ทไดจากปฏกรยา LAMP มดวยกนหลายวธดงน

1. การดความขนดวยตาเปลา ดผลของปฏกรยาจากตะกอนสขาวของ magnesium pyrophosphate ทเกดจาก การจบกนของ pyrophosphate ion กบ magnesium ion เกดตะกอนสขาวขนทไม ละลายน า ซง pyrophosphate เปน product ทปลอยออกมาระหวางการสงเคราะหสาร พนธกรรม ตะกอนดงกลาวสามารถมองเหนไดดวยตาเปลา 2. การดสฟลออเรสเซนต โดยใชสารฟลออเรสเซนต เชน SYBR Green I, calcein หรอ ethidium bromide เตมหลงจากเกดปฏกรยา LAMP แลว หากใช SYBR Green I ถาม product เกดขนจะเปลยนจากสสมเปนสเขยวเมอดภายใตแสง UV (302 nm) สวนสาร calcein สามารถเตมไดตงแตเรมการทดสอบ โดย calcein จะจบกบ magnesium ดงนนเมอม product เกดขนจากปฏกรยากจะเกดสาร pyrophosphate ดวยเชนกน สาร pyrophosphate จะสามารถแยงจบกบ magnesium ท าใหสาร calcein เปนอสระและ เปลงแสงฟลออเรสเซนตออกมา 3. ทดสอบโดยใช gel electrophoresis สามารถน า product จากเทคนค LAMP ไป run gel electrophoresis เพอดยนท เพมขยายไดโดยจะเหน product มหลาย band เนองจากม product เกดขนหลายขนาดท

18

รปท 5 แสดงขนตอนการเกดปฏกรยาของวธ Loop - mediated isothermal amplification (LAMP) (Yan et al., 2014)

19

ปจจบนมการศกษาทน าเอาเทคนค LAMP มาประยกตเพอใชในการวนจฉยโรคตดเชอมากมายรวมถงการวนจฉยการตดเชอมาลาเรย การตรวจหาเชอ P. falciparum จากยนเปาหมาย 18S rRNA จากตวอยางเลอดทใหความรอน 99 ºC 10นาท แลวน าสวนใสมาทดสอบดวยวธ LAMP โดยตรงพบวาไมมตวยบยงปฏกรยาเมอทดสอบดวยวธ LAMP ตางจากวธ PCR ท heme จากตวอยางเลอดจะมผลตอปฏกรยาได และสวนหนงเปนเพราะ Bst DNA polymerase ทใชใน LAMP ทนทานกวา DNA polymerase ทใชใน PCR จากการทดสอบใหคาความไวและความจ าเพาะของวธ LAMP เทากบ 95% และ 99% ตามล าดบ และยงตรวจเจอเชอทความเขมขนต าไดทประมาณ 6 parasites ตอเลอด 1 ไมโครลตร ทงนเมอเทยบกบการดดวยกลองจลทรรศนซงเปนวธมาตรฐานมตวอยางทใหผลลบปลอมของวธ LAMP จงถกน ามายนยนดวยวธ PCR พบวาเปนเชอมาลาเรยชนด P. malariae ทงหมด แสดงใหเหนถงการวนจฉยผดพลาดจากการดดวยกลองจลทรรศน และเกดผลบวกปลอม 1 ตวอยาง ซงใหผลตรงกบวธ PCR จงนาจะเกดจากในตวอยางมเชอในปรมาณนอยมากจงไมสามารถตรวจเจอจากการสองดวยกลองจลทรรศน (Poon et al., 2006) ตอมามรายงานการใชเทคนค LAMP เพอตรวจหาการตดเชอมาลาเรยทง 4 ชนด ไดแก P. falciparum, P. vivax, P. malariae และ P. ovale จากยนเปาหมาย 18S rRNA โดยออกแบบ primer ใหจ าเพาะตอสปชรตางๆเมอทดสอบความไวของวธพบวาตรวจหาเชอ P. malariae และ P. ovale ไดทความเขมขนต าสดท 10 copies และตรวจหาจนส Plasmodium, P. falciparum และ P. vivax ไดทความเขมขนต าสด 100 copies (Han et al., 2007) โดยการตรวจใชเวลาไมเกน 1 ชวโมง สามารถอานผลดวยตาเปลาจากความขนทเกดขน เมอป ค.ศ. 2016 มรายงานการใชวธ LAMP ส าหรบตรวจหาเชอมาลาเรยทกอโรคในมนษยทง 5 สปชส สามารถตรวจเจอเชอ P. falciparum, P. vivax และ P. malariae ทความเขมขนต าสดเพยง 1 copy (Lau et al., 2016)

นอกจากนเทคนค LAMP ยงถกน ามาเพอตรวจหาการกลายพนธของยน มรายงานของ Badolo และคณะเมอป ค.ศ. 2012 ประสบความส าเรจในการตรวจหาการกลายพนธ(point mutation)ทต าแหนง L1014F ของยน kdr ซงเกยวของกบการดอยาฆาแมลงกลม pyrethroid ของยงกนปลอง โดยออกแบบใหปลายของ BIP มล าดบเบสทเปลยนแปลงไปสามารถตรวจสอบต าแหนงทเกดการกลายพนธได และยงเพม mismatch nucleotide ทต าแหนงถดเขาไปจากต าแหนงทเบสทเกดการกลายพนธเพอเพมความจ าเพาะของวธ LAMP (Badolo et al., 2012) และตรวจสอบการกลายพนธของยน ace-1 ทต าแหนง G119S ซงเกยวของกบการดอยาฆาแมลงกลม organophosphate และ carbamater (Badolo et al., 2015) พบวาวธ LAMP มความไวและความจ าเพาะในการตรวจสอบหายนกลายพนธ และไพรเมอรทออกแบบมความจ าเพาะตอต าแหนงการกลายพนธสามารถแยกความแตกตางระหวางสายพนธปกตและสายพนธทดอยาไดอยางชดเจน อกทงเปนวธทงาย สะดวกและรวดเรว

มรายงานการใชวธ LAMP เพอตรวจหา SNP จาก genomic DNA ของมนษยของยน CYP2C19 เปนเอนไซมในตบเกยวของกบการท าลายยาซงมความหลากหลายมาก ท าใหความสามารถในการท างานของเอนไซมชนดนมความแตกตางกนไปในแตละบคคล ผลการศกษาพบวาการออกแบบ primer ใหจ าเพาะตอ

20 ต าแหนง SNP สามารถใชแยกความแตกตางระหวางยนปกตกบยนดอยาได และสามารถตรวจสอบยนไดท 10 copies จะเหนไดวา LAMP เปนวธทมความไวสงมาก (Zhang et al., 2016)

LAMP จงเปนเทคนคทมประสทธภาพเพมปรมาณ DNA ไดสง ภายใตสภาวะอณหภมเดยว เปนวธทมความไวและความจ าเพาะมาก ถกน ามาประยกตใชกนอยางกวางขวาง ในหองปฏบตการทงดานงานวจยทางชวโมเลกล ดานการแพทย การวนจฉยโรคตดเชอ ตรวจหาความผดปกตของยน เชน การกลายพนธ ส าหรบการดอยาตานมาลาเรย artemisinin ของเชอ P. falciparum เกยวของกบการกลายพนธของยน Kelch13 ดงนนผวจยจงสนใจทจะศกษาและพฒนาเทคนค LAMP เพอใชตรวจสอบการกลายพนธของยน Kelch13 ทต าแหนง C580Y ซงเปนต าแหนงทมความส าคญเกยวของกบการดอยา artemisinin ของเชอ P. falciparum และเปนต าแหนงการกลายพนธทพบการแพรระบาดมากทสดในประเทศไทย

21 วธการด าเนนการวจย

สกด DNA ของเชอ P. falciparum จากหยดเลอดแหงบนกระดาษกรอง

โดยใชชดสกด QIAamp DNA Mini Kit

ตรวจยนยนการตดเชอ P. falciparum ดวยวธ nested PCR (Snounou et al., 1993)

ตรวจหาต าแหนงการกลายพนธ C580Y ดวยวธ semi - nested PCR และการวเคราะหหาล าดบนวคลโอไทด (DNA sequencing)

โคลนยน PfKelch13 ทมต าแหนง C580Y โดยใชเวกเตอร pCR®2.1-TOPO และน าเขาสเซลล TOP10 E. coli

ออกแบบไพรเมอรส าหรบ LAMP technique เพอตรวจหาต าแหนงการกลายพนธ C580Y ของยน PfKelch13

ศกษาหาสภาวะทเหมาะสม (optimal condition): ทดสอบหาอณหภมและระยะเวลา

ทเหมาะสมในการท าปฎกรยา

ความไว (sensitivity) และความจ าเพาะ (specificity) ของเทคนค LAMP

สรปผลการทดลอง

22 1. ตวอยางทใชในการศกษา

ตวอยางทใชในการศกษาไดรบจากส านกปองกนและควบคมโรคท 11 นครศรธรรมราช ซงไดรวบรวมมาจากพนททมการระบาดของเชอมาลาเรยในบรเวณภาคใต ชวงระยะเวลาตงแต เมษายน - ตลาคม 2555 ซงตวอยางเลอดนตดเชอมาลาเรยชนด P. falciparum จากการตรวจวนจฉยดวยกลองจลทรรศน เจาหนาทเปนผท าการเจาะเลอดจากปลายนวผปวยประมาณ 100 - 200 ไมโครลตร (ประมาณ 2 หยด) หยดลงบนกระดาษกรอง (Whatman เบอร 3) ทงไวแหงทอณหภมหอง เกบใสถงพลาสตก

1.1 การสกดสารพนธกรรม (DNA) สกด DNA จากหยดเลอดแหงบนกระดาษกรองดวยน ายาส าเรจรป QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Hidden, Germany) ตดกระดาษทมจดเลอดแหง 1 จด เปนชนเลกๆ ลงในหลอด 1.5 ml microcentrifuge tube หลงจากนนเตมน ายา ATL 180 ไมโครลตร น าไป incubate ท 85°C เปนเวลา 10 นาท แลวจงเตมน ายา proteinase K 20 ไมโครลตร ผสมใหเขากนดวยเครอง vortex น าไป incubate ท 56°C เปนเวลา 1 ชวโมง เมอครบเวลาแลวจงเตมน ายา AL 200 ไมโครลตร และ vortex อกครง น า microcentrifuge tube นไป incubate ท 70°C เปนเวลา 10 นาท เมอครบเวลา จงเตม ethanol (96–100%) 200 ไมโครลตร ลงในสารละลายผสมกนอยางรวดเรวโดยการใช pipette ดดขน ลง ยายสารละลายลง QIAamp Mini spin column น าไปปนเหวยงทความเรว 8,000 rpm เปนเวลา 1 นาท เทสารละลายทตกลงดานลางทง เตม 500 ไมโครลตร ของ buffer DW1 ลงใน column เดม น าไปปนเหวยงทความเรว 8000 rpm เปนเวลา 1 นาท เพอลาง spin column membrane เท สารละลายทตกลงดานลางทงและเตม 500 ไมโครลตร ของ buffer DW2 น าไปปนเหวยงทความเรว 14,000 rpm เปนเวลา 3 นาท ปนเหวยง spin column membrane ใหแหงเพอใหแนใจวาไมม ethanol เหลออย ทความเรว 14,000 rpm เปนเวลา 1 นาท จากนนยาย QIAamp Mini spin column ลงใน microcentrifuge tube อนใหมขนาด 1.5 ml เตม elution buffer 100 ไมโครลตร ลงในspin column membrane ปดฝา บมทอณหภมหองเปนเวลา 10 นาท และปนเหวยงทความเรว 8,000 rpm เปนเวลา 1 นาท เกบสารละลาย DNA ไวท -20°C จนกวาจะใชงานตอไป

1.2 การแยกชนดของเชอ Plasmodium spp. ดวยวธ nested PCR เพอตรวจวนจฉยยนยนการตดเชอ P. falciparum ผวจยจะใชวธ nested PCR โดย DNA ของเชอจะถกเพมจ านวนบนยน 18s ribosomal RNA (18S rRNA) ตามวธของ Snounou et al., 1993 ใชprimer ทจ าเพาะตอ genus และ species ของเชอมาลาเรย ขนแรกใช genus-specific primer ค rPLU1/rPLU5 ใน PCR รอบท 1 และรอบท 2 ใช primer ค rPLU3/rPLU4 ล าดบ oligonucleotide primer แสดงดงตารางท 1 องคประกอบในการท าปฏกรยา PCR ในปรมาตร 20 µl และ PCR condition แสดงในตารางท 2 และ 3 ตามล าดบ ถา genomic DNA จากตวอยางมเชอมาลาเรย Plasmodium spp. จะเหน PCR product ทขนาด 240 bp จากนนจะใช 1.5 ไมโครลตร ของ PCR

23

product ทไดจาก genus-specific primer มาเปน template ส าหรบท า PCR เพอแยกชนด species ของเชอ Plasmodium spp. (species-specific PCR) ซงจะใชค primer ทเฉพาะเจาะจงตอเชอชนด P. falciparum คอ rFAL1 และ rFAL2 และ P. vivax คอ rVIV1 และ rVIV2 แสดงล าดบ oligonucleotide primer ในตารางท 1 องคประกอบในการท าปฏกรยา PCR ในปรมาตร 20 µl และ PCR condition แสดงในตารางท 2 และ 3 ตามล าดบ P. vivax จะแสดงขนาด PCR product ท 120 bp ถาเปนชนด P. falciparum จะแสดงขนาด PCR product ท 205 bp หลงจากนนน า PCR product ทไดมาตรวจสอบดวย gel electrophoresis ใช 2% agarose gel กระแสไฟฟาความตางศกยท 120 โวลล เปนเวลา 55 นาท แลวน าไปยอมดวย ethidium bromide ความเขมขน 0.5 µl/ ml เปนเวลา 5 นาท แลวน าไป destaining ดวยน ากลน 10 นาท ตรวจสอบขนาด PCR product ภายใตแสง UV และบนทกภาพ เกบ genomic DNA ท –20o C จนกวาจะใชงาน ตวอยางเลอดทแสดงการตดเชอเฉพาะ P. falciparum เทานน ทจะน ามาศกษาตอไป

ตารางท 1 แสดง primer ทใชในแยกชนดของเชอมาลาเรยดวยวธ Nested PCR

Primer

Sequence 5’->3’

PCR (Cycles)

Annealing temp. (°C) และ Product size

Genus-specific

Nested1

rPLU1: 5’-TCAAAGATTAAGCCATGCAAGTGA-3’

rPLU5: 5’-CCTGTTGTTGCCTTAAACTCC-3’ 25 58, 1,640 bp

Nested2

rPLU3: 5’-TTTTTATAAGGATAACTACGGAAAAGCTGT-3’

rPLU4: 5’-TACCCGTCATAGCCATGTTAGGCCAATACC-3’ 30 58, 240 bp

Species- specific

Nested2

rFAL1: 5’-TTAAACTGGTTTGGGAAAACCAAATATATT-3’

rFAL2: 5’-ACACAATGAACTCAATCATGACTACCCGTC-3’ 30 58, 205 bp

rVIV1: 5’-CGCTTCTAGCTTATTCCACATAACTGATAC-3’

rVIV2: 5’-ACTTCCAAGCCGAAGCAAAGAAGGTCCTTA-3’ 30 58, 121 bp

24 ตารางท 2 องคประกอบของสารเคมในปฏกรยาทใช ในปฏกรยา PCR

PCR รอบท 1 (ใช genus specific primer)

PCR รอบท 2 (ใช species specific primer)

สวนผสม ปรมาตร (µl) สวนผสม ปรมาตร (µl)

1x PCR buffer (1.5 mM MgCl2) 0.5 mM MgCl2 0.25 µM primer 1.25 µM dNTPs 0.4 U Taq polymerase nuclease free water

2.00 0.40 2.00 1.00 0.08 14.52

1x PCR buffer (1.5 mM MgCl2) 0.5 mM MgCl2 0.25 µM primer 1.25 µM dNTPs 0.4 U Taq polymerase nuclease free water

2.00 0.40 2.00 1.00 0.08 14.52

ปรมาตรรวม 20 ปรมาตรรวม 20 2 µl of DNA template 1.5 µl of PCR product Nested1

ตารางท 3 แสดง PCR condition ของ nested PCR เพอแยกชนดเชอ Plasmodium

PCR condition PCR รอบท 1 PCR รอบท 2 Initial denaturation

Denaturation Annealing Extension

Final extension Keep

95ºC , 5 min 94ºC , 1 min 58ºC , 2 min 72ºC , 2 min 72ºC , 5 min

4ºC

95ºC , 5 min 94ºC , 2 min 58ºC , 2 min 72ºC , 2 min 72ºC , 5 min

4ºC Number of cycles 25 30

2. การตรวจสอบการกลายพนธของยน Kelch13 (k13) คนหาการกลายพนธทต าแหนง C580Y บนยน P. falciparum Kelch13 (PfKelch13) และน าชนสวนท มต าแหนงการกลายพนธดงกลาวเพมปรมาณในเซลล TOP10 E. coli ดวยวธ TOPO cloning

ท าการตรวจหาต าแหนงการกลายพนธท C580Y บนยน K13 ดวยวธ semi - nested PCR จากเชอ P. falciparum (3D7_1343700) ยน K13 มความยาวทงสน 2,238 bp ต าแหนงการกลายพนธทผวจยสนใจศกษาคอต าแหนงนวคลโอไทดท 1,739 (amino acid ต าแหนง 580) ดงนนผวจยจงออกแบบ primer เพอเพมปรมาณยนบรเวณดงกลาว ดงรปท 6

รปท 6 แสดงขนาดยน Kelch13 ของเชอ P. falciparum (3D7_1343700)

G1740A

25 ผวจยท าการออกแบบ oligonucletide primer เพอเพมปรมาณยนบรเวณทมต าแหนงการกลายพนธซงตรงกบต าแหนงนวคลโอไทด ท 1,739 จะครอบคลมนวคลโอไทดต าแหนงท 1,397 ถง 2,143 bp มความยาว 751 bp ในการออกแบบ oligonucletide primer ขนแรกผวจยจะคนหาล าดบนวคลโอไทดของ P. falciparum Kelch13 จาก plasmoDB (www.plasmoDB.org) และจะท าการออกแบบ oligonucletide primer ส าหรบท า semi-nested PCR ซงไดแสดงล าดบนวคลโอไทดดงแสดงในรปท 7

ตารางแสดง oligonucletide primer, อณหภม annealing และขนาดของผลตภณฑ PCR แสดงในตารางท 4 หลงจากนนน า PCR product ทไดมาตรวจสอบดวย gel electrophoresis ใช 2% agarose gel กระแสไฟฟาความตางศกยท 120 โวลล เปนเวลา 55 นาทแลวน าไปยอมดวย ethidium bromide ความเขมขน 0.5 µl/ ml เปนเวลา 5 นาท แลวน าไป destaining ดวยน ากลน 10 นาท ตรวจสอบขนาด PCR product ภายใตแสง UV และบนทกภาพ

1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Kelch Pf 3D7 chromosome 13

TTTATGGTATTAAATTTTTACCATTCCCATTAGTATTTTGTATAGGTGGATTTGATGGTGTAGAATATTTAAATTCGATGGAATTATTAGATATTAGTCA

1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1500

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Kelch Pf 3D7 chromosome 13

ACAATGCTGGCGTATGTGTACACCTATGTCTACCAAAAAAGCTTATTTTGGAAGTGCTGTATTGAATAATTTCTTATACGTTTTTGGTGGTAATAACTAT

1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Kelch Pf 3D7 chromosome 13

GATTATAAGGCTTTATTTGAAACTGAGGTGTATGATCGTTTAAGAGATGTATGGTATGTTTCAAGTAATTTAAATATACCTAGAAGAAATAATTGTGGTG

1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1700

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Kelch Pf 3D7 chromosome 13

TTACGTCAAATGGTAGAATTTATTGTATTGGGGGATATGATGGCTCTTCTATTATACCGAATGTAGAAGCATATGATCATCGTATGAAAGCATGGGTAGA

1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Kelch Pf 3D7 chromosome 13

GGTGGCACCTTTGAATACCCCTAGATCATCAGCTATGTGTGTTGCTTTTGATAATAAAATTTATGTCATTGGTGGAACTAATGGTGAGAGATTAAATTCT

1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Kelch Pf 3D7 chromosome 13

ATTGAAGTATATGAAGAAAAAATGAATAAATGGGAACAATTTCCATATGCCTTATTAGAAGCTAGAAGTTCAGGAGCAGCTTTTAATTACCTTAATCAAA

1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Kelch Pf 3D7 chromosome 13

TATATGTTGTTGGAGGTATTGATAATGAACATAACATATTAGATTCCGTTGAACAATATCAACCATTTAATAAAAGATGGCAATTTCTAAATGGTGTACC

2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Kelch Pf 3D7 chromosome 13

AGAGAAAAAAATGAATTTTGGAGCTGCCACATTGTCAGATTCTTATATAATTACAGGAGGAGAAAATGGCGAAGTTCTAAATTCATGTCATTTCTTTTCA

2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170 2180

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.

Kelch Pf 3D7 chromosome 13

CCAGATACAAATGAATGGCAGCTTGGCCCATCTTTATTAGTTCCCAGATTTGGTCACTCCGTTTTAATAGCAAATATATAA

รปท 7 แสดงล าดบนวคลโอไทด ของ primer ทใชในการเพมปรมาณยน K13 ของเชอ P. falciparum

Pf3F1 Pf3F2

Pf3R1

26

ตารางท 4 แสดงล าดบ oligonucleotide primer ส าหรบเพมปรมาณยน K13 ของ P. falciparum (3D7_1343700), อณหภม annealing และขนาดของผลตภณฑ PCR

gene Primer Sequence (5’-->3’) Annealing

Temperature (°C) Product Size (bp)

K13

Pf3F1 GTCAACAATGCTGGCGTATG 53

765

Pf3R1 CGGAGTGACCAAATCTGGG

53 751 Pf3F2 CGTATGTGTACACCTATGTCTACC

น า PCR product ทปรากฎแถบ PCR บน agarose gel electrophoresis ขนาด 751 bp ของเชอ P. falciparum เพอวเคราะหหาล าดบสารพนธกรรมโดย บรษท Macrogen ตอไป ซงจะท า PCR purification กอนดวยชดน ายาสกด QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN เรมจากการใส PCR product 100 ไมโครลตร ผสมกบ binding buffer ปรมาตร 100 µl ลงใน 1.5 ml microcentrifuge tube ผสมใหเขากนดวย vortex แลวน าไป spin down ยายสวนผสมทงหมดใสลงใน QIAquick column น าไปปนเหวยงท 14,000 rpm 1 นาท เทของเหลวสวนลางทงแลวเตม wash buffer ปรมาตร 700 µl น าไปปนเหวยงท 14,000 rpm 1 นาท เทของเหลวสวนลางทงจากนนน าไปปนเหวยงอกครงท 14,000 rpm 1 นาท แลวจงยาย QIAquick column ใสลงใน 1.5 ml microcentrifuge tube จากนนเตม elution buffer ปรมาตร 50 ไมโครลตร น าไป incubate ทอณหภมหอง เปนเวลา 1 นาท แลวน าไปปนเหวยงท 14,000 rpm 1 นาท จากนนน าไปวเคราะห PCR purification product ดวยวธ gel electrophoresis อกครงหนง และเกบไวทอณหภม – 20 oC เพอรกษาสภาพระหวางรอสงไปตรวจหาล าดบนวคลโอไทด วเคราะหผลการทดลองโดยน าล าดบนวคลโอไทดของตวอยางทไดมาเปรยบเทยบ (alignment) รวมกบ Pf3D7_1343700 เชอสายพนธอางองดวยโปรแกรม BioEdit เพอหาต าแหนง mutation ทเกดขน นอกจากนผวจยจะน า pcr product ขนาด 751 bp ของเชอ P. falciparum มาใชเปน DNA ตนแบบส าหรบวธ LAMP และท าตามวธทผวจยไดศกษาและออกแบบ primer เพอตรวจสอบการกลายพนธของยน K13 ทต าแหนงการกลายพนธท C580Y และเปรยบเทยบผลทไดกบวธ DNA sequencing 3. การโคลนยน Pfkelch13 ทมต าแหนงการกลายพนธท C580Y เพอเพมปรมาณยน K13 ทมการต าแหนงการกลายพนธท C580Y ผวจยจะท า DNA cloning โดยใชเวกเตอร pCR®2.1-TOPO และน าเขาสเซลล TOP10 E. coli มขนตอนดงน น าชนสวนยนทมต าแหนงการกลายพนธท C580Y ท า DNA ligation แลวท าการน าสงเขาไปใน TOP10 E. coli (chemically competent E. coli) โดยการใชความรอน (heat shock) ท 42ºC เปนเวลา 45 วนาทและแชในน าแขง 2 นาท แลวน าเซลลไปเลยงใน Luria - Bertani (LB) agar ทผสมยาปฏชวนะชนด kanamycin ความเขมขน 50 µg/mL ทอณหภม 37 ºC เปนเวลา 14 - 16 ชวโมง หลงจากนนคดเลอก recombinant colonies โดยเลอกโคโลนทขนบน LB agar 10 - 15 โคโลน น าไปตรวจสอบดวยวธ PCR โดยใชค oligonucleotide primer Pf3F2/Pf3R1 เพอยนยนการมชนสวน

27 ของยนทตองการภายในพลาสมด หลงจากนนเลอกโคโลนทตรวจสอบแลวไปเลยงตอใน LB broth ทม kanamycin ความเขมขน 50 µg/mL เปนเวลา 14 - 16 ชวโมง หลงจากนนสกดพลาสมดโดยใชชดน ายาส าเรจรปและน าพลาสมดทไดไปตดดวยเอนไซมตดจ าเพาะ EcoRI เพอยนยนวามการตดตอยนเขาไปในพลาสมดเวคเตอรส าเรจ จากนนสงไปหาล าดบการเรยงตวของนวคลโอไทด (DNA sequencing) และใชพลาสมดเปน DNA ตนแบบส าหรบการตรวจสอบการกลายพนธของยน K13 ทต าแหนง C580Y ดวยวธ LAMP ตอไป นอกจากนไดท าการโคลนยน K13 ของ P. falciparum (3D7_1343700)

4. การออกแบบ primer ส าหรบ LAMP ออกแบบ primer โดยใชโปรแกรม Primer Explorer version 4 ดงแสดง ในการศกษาครงน ผวจยไดออกแบบ primer ส าหรบ LAMP เพอตรวจสอบต าแหนงการกลายพนธท C580Y และ ตรวจสอบสายพนธอางอง ดงแสดงในรปท 8

รปท 8 แสดงล าดบ DNA ของยน Kelch13 ทระบต าแหนงทเกดการกลายพนธ (ตวอกษรหนาสแดง) เบส G ส าหรบยน wild type และเบส A ส าหรบยนกลายพนธ รวมทงต าแหนงของ primer ส าหรบ LAMP

28 ตารางท 5 แสดงล าดบ oligonucleotide ของ primer ทใชท าปฏกรยา LAMP

Primer Sequence (5’-->3’) F3 GTGGTGTTACGTCAAATGGTAG B3 CTCACCATTAGTTCCACC FIP-K13(F1c-F2) CGATGATCATATGCTTCTACATTCGG – GGGATATGATGGCTC Primer for Kelch13 (mutant) BIP-K13r(B1c-B2) GGTGGCACCTTTGAATACCC – TTATTATCAAAAGCAACAA

Primer for Kelch13 (wild type) BIP-K13s(B1c-B2) GGTGGCACCTTTGAATACCC – TTATTATCAAAAGCAACAG

5. ศกษาสภาวะทเหมาะสมในการท า LAMP

ศกษาสภาวะทเหมาะสมของปฏกรยา LAMP โดยใชพลาสมดทมยน PfKelch13 C580Y และพลาสมดทมยน PfKelch13 wild type (negative control) น าไปเพมจ านวนในสภาวะทเหมาะสม (optimal condition) ใน PCR tube โดยมสวนประกอบของสารทเปน final concentration คอ ทดสอบความเขมขนตงแต 0.2 - 0.8 uM outer primer (F3, B3), inner primer (FIP, BIP), 1× thermopol buffer (20 mM Tris–HCl (pH 8.8), 10mM KCl, 10mM (NH4)2 SO4 , 0.1% Triton X-100), ทดสอบความเขมขนตงแต 2-10 mM MgSO4 , ทดสอบความเขมขนตงแต 0.2 - 0.6 mM dNTP, ทดสอบความเขมขนตงแต 0.2 - 0.6 mM betaine เตมตวอยางปรมาตร 1 ไมโครลตร (ประมาณ 50 นาโนกรม) และเตมน ากลนปราศจากเชอเพอให solution mixture มปรมาตรสทธ เปน 25 ไมโครลตร จากนนน า PCR tube ไปท าขนตอน denaturation เพอแยกสาย DNA จากสายคใหเปนสายเดยวทอณหภม 95°C เปนเวลา 5 นาทเมอครบเวลาน าออกมาแชน าแขงทนท แลวเตม Bst polymerase (8.0 U) ปรมาตร 1 ไมโครลตร หลงจากนนน าสวยผสมทงหมดไปท าปฏกรยาทอณหภม 59, 61, 63 และ 65°C เปนเวลา 10, 20, 30, 40, 50 และ 60 นาท เพอทดสอบหาอณหภม และระยะเวลาทเหมาะสมในการท าปฏกรยา จะหยดท าปฏกรยาท 80°C เปนเวลา 5 นาท ตรวจสอบผลทไดดวยการวดความขนดวยเครองLoopamp 6. ศกษาความไว (sensitivity) ของวธ LAMP เพอทดสอบหาปรมาณความเขมขนต าสดของพลาสมดทม PfKelch13 C580Y ทเทคนค LAMP สามารถตรวจพบได เมอไดสภาวะทเหมาะสมในการท าปฏกรยา LAMP น า plasmid DNA ทม PfKelch13 C580Y มาท า 10 fold serial dilution ตงแต 105 – 10-5 ng/µl ใชเปนตนแบบในการท า LAMP จากนนน า LAMP product ทไดมาวเคราะหความขนดวยเครอง Loopamp

29 7. ศกษาความจ าเพาะ (specificity) ของวธ LAMP เพอตรวจสอบหาความจ าเพาะของ primer ทออกแบบของวธ LAMP เพอคนหา PfKelch13 C580Y โดยจะท าทดสอบกบพลาสมดทมยน PfKelch13 wild type, gDNA ของเชอ P. falciparum (3D7_1343700), gDNA ของเชอ P. vivax และ gDNA ของเชอ P. falciparum ทมต าแหนงการกลายพนธ C580Y ของยน K13

ระยะเวลาการวจย

ระหวางเดอนมกราคม 2559 ถงเดอนมนาคม 2560

แผนการด าเนนงานตลอดโครงการ

ขนตอนการด าเนนงาน เดอน

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1. สกด DNA จากตวอยาง 2. Genotyping ของยน K13 และ sequencing และโคลนยน K13 ทมการกลายพนธ 3. ศกษาสภาวะทเหมาะสมของเทคนค LAMP 4. ตรวจหาการกลายพนธของยน K13 ดวยเทคนค LAMP 5. วเคราะหขอมลและผลการทดลอง

สถานทวจย ทดลองหรอเกบขอมล

ภาควชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร

30

เอกสารอางอง

Amaratunga, C., Witkowski, B., Khim, N., Menard, D., and Fairhurst, R. M. 2014. Artemisinin resistance in Plasmodium falciparum Malaria. The Lancet Infectious Diseases. 14(6): 449-450.

Ariey, F., Witkowski, B., Amaratunga, C., Beghain, J., Langlois, A. C., Khim, N., Kim, S., et al. 2014. A molecular marker of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum malaria. Nature. 505(7481): 50-55.

Ashley, E. A., Dhorda, M., Fairhurst, R. M., Amaratunga, C., Lim, P., Suon, S., Sreng, S., et al. 2014. Spread of artemisinin resistance in Plasmodium falciparum malaria. New England Journal of Medicine. 371(5): 411-423.

Asiello, P. J., and Baeumner, A. J. 2011. Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review. Lab on a Chip. 11(8): 1420-1430.

Badolo, A., Bando, H., Traore, A., Ko-Ketsu, M., Guelbeogo, W. M., Kanuka, H., Ranson, H., et al. 2015. Detection of G119S ace-1 (R) mutation in field-collected Anopheles gambiae mosquitoes using allele-specific loop-mediated isothermal amplification (AS-LAMP) method. Malaria Journal. 14: 477-484.

Badolo, A., Okado, K., Guelbeogo, W. M., Aonuma, H., Bando, H., Fukumoto, S., Sagnon, N., et al. 2012. Development of an allele-specific, loop-mediated, isothermal amplification method (AS-LAMP) to detect the L1014F kdr-w mutation in Anopheles gambiae s. l. Malaria Journal. 11: 227-233.

Bhumiratana, A., Intarapuk, A., Sorosjinda-Nunthawarasilp, P., Maneekan, P., and Koyadun, S. 2013. Border malaria associated with multidrug resistance on Thailand-Myanmar and Thailand-Cambodia borders: transmission dynamic, vulnerability, and surveillance. Biomed Research International. 2013: 363417-363429.

Björkman, A., and Phillips-Howard, P. 1990. The epidemiology of drug-resistant malaria. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 84(2): 177-180.

CDC. 2015. Malaria: Laveran and the Discovery of the Malaria Parasite. http://www.cdc.gov/malaria/about/history/laveran.html (accessed 10 November).

Denis, M. B., Tsuyuoka, R., Poravuth, Y., Narann, T. S., Seila, S., Lim, C., Incardona, S., et al. 2006. Surveillance of the efficacy of artesunate and mefloquine combination for the treatment of uncomplicated falciparum malaria in Cambodia. Tropical Medicine and International Health. 11(9): 1360-1366.

31 Dondorp , A. M., Nosten , F., Yi , P., Das , D., Phyo , A. P., Tarning , J., Lwin , K. M., et al. 2009.

Artemisinin Resistance in Plasmodium falciparum Malaria. New England Journal of Medicine. 361(5): 455-467.

Feachem, R. G., Phillips, A. A., Hwang, J., Cotter, C., Wielgosz, B., Greenwood, B. M., Sabot, O., et al. 2010. Shrinking the malaria map: progress and prospects. The Lancet. 376(9752): 1566-1578.

Han, E.-T., Watanabe, R., Sattabongkot, J., Khuntirat, B., Sirichaisinthop, J., Iriko, H., Jin, L., et al. 2007. Detection of four Plasmodium species by genus-and species-specific loop-mediated isothermal amplification for clinical diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 45(8): 2521-2528.

Harinasuta, T., Suntharasamai, P., and Viravan, C. 1965. Chloroquine-resistant falciparum malaria in Thailand. The Lancet. 286(7414): 657-660.

Imwong, M., Jindakhad, T., Kunasol, C., Sutawong, K., Vejakama, P., and Dondorp, A. M. 2015. An outbreak of artemisinin resistant falciparum malaria in Eastern Thailand. Scientific Reports. 5: 17412 - 17418.

Kantele, A., and Jokiranta, T. S. 2011. Review of cases with the emerging fifth human malaria parasite, Plasmodium knowlesi. Clinical Infectious Disease. 52(11): 1356-1362.

Lau, Y.-L., Lai, M.-Y., Fong, M.-Y., Jelip, J., and Mahmud, R. 2016. Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Identification of Five Human Plasmodium Species in Malaysia. American journal of tropical medicine and hygiene. 94(2): 336-339.

Lin, Z., and Zaw, M. T. 2015. Molecular determinants of artemisinin resistance in k13 gene of Plasmodium falciparum. British Microbiology Research Journal. 9(4): 1-11.

Mbengue, A., Bhattacharjee, S., Pandharkar, T., Liu, H., Estiu, G., Stahelin, R. V., Rizk, S. S., et al. 2015. A molecular mechanism of artemisinin resistance in Plasmodium falciparum malaria. Nature. 520(7549): 683-687.

Mohon, A. N., Alam, M. S., Bayih, A. G., Folefoc, A., Shahinas, D., Haque, R., and Pillai, D. R. 2014. Mutations in Plasmodium falciparum K13 propeller gene from Bangladesh (2009–2013). Malaria Journal. 13(1): 431-436.

Mok, S., Ashley, E. A., Ferreira, P. E., Zhu, L., Lin, Z., Yeo, T., Chotivanich, K., et al. 2015. Population transcriptomics of human malaria parasites reveals the mechanism of artemisinin resistance. Science. 347(6220): 431-435.

Moody, A. 2002. Rapid Diagnostic Tests for Malaria Parasites. Clinical Microbiology Reviews. 15(1): 66-78.

32 Na-Bangchang, K., and Congpuong, K. 2007. Current malaria status and distribution of drug

resistance in East and Southeast Asia with special focus to Thailand. Tohoku Journal Experimental Medicine. 211(2): 99-113.

Nagamine, K., Hase, T., and Notomi, T. 2002. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16(3): 223-229.

Noedl , H., Se , Y., Schaecher , K., Smith , B. L., Socheat , D., and Fukuda , M. M. 2008. Evidence of artemisinin-resistant malaria in western Cambodia. New England Journal of Medicine. 359(24): 2619-2620.

Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N., and Hase, T. 2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28(12): E63.

Parida, M., Sannarangaiah, S., Dash, P. K., Rao, P. V., and Morita, K. 2008. Loop mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Reviews in Medical Virology. 18(6): 407-421.

Poon, L. L., Wong, B. W., Ma, E. H., Chan, K. H., Chow, L. M., Abeyewickreme, W., Tangpukdee, N., et al. 2006. Sensitive and inexpensive molecular test for falciparum malaria: detecting Plasmodium falciparum DNA directly from heat-treated blood by loop-mediated isothermal amplification. Clinical chemistry. 52(2): 303-306.

Price, R. N., Uhlemann, A.-C., Brockman, A., McGready, R., Ashley, E., Phaipun, L., Patel, R., et al. 2004. Mefloquine resistance in Plasmodium falciparum and increased pfmdr1 gene copy number. The Lancet. 364(9432): 438-447.

Price, R. N., Uhlemann, A.-C., van Vugt, M., Brockman, A., Hutagalung, R., Nair, S., Nash, D., et al. 2006. Molecular and pharmacological determinants of the therapeutic response to artemether-lumefantrine in multidrug-resistant Plasmodium falciparum malaria. Clinical Infectious Diseases. 42(11): 1570-1577.

Pukrittayakamee, S., Chotivanich, K., Chantra, A., Clemens, R., Looareesuwan, S., and White, N. J. 2004. Activities of artesunate and primaquine against asexual- and sexual-stage parasites in falciparum malaria. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48(4): 1329-1334.

Rahman, M. T., Uddin, M. S., Sultana, R., Moue, A., and Setu, M. 2013. Polymerase chain reaction (PCR): a short review. Anwer Khan Modern Medical College Journal. 4(1): 30-36.

33 Roper, C., Pearce, R., Bredenkamp, B., Gumede, J., Drakeley, C., Mosha, F., Chandramohan, D., et

al. 2003. Antifolate antimalarial resistance in southeast Africa: a population-based analysis. The Lancet. 361(9364): 1174-1181.

Shanks, G. D. 1994. 1993 Sir Henry Wellcome Medal and Prize recipient. The rise and fall of mefloquine as an antimalarial drug in South East Asia. Military Medicine. 159(4): 275-281.

Snounou, G., Viriyakosol, S., Zhu, X. P., Jarra, W., Pinheiro, L., do Rosario, V. E., Thaithong, S., et al. 1993. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and Biochemical Parasitology. 61(2): 315-320.

Spring, M. D., Lin, J. T., Manning, J. E., Vanachayangkul, P., Somethy, S., Bun, R., Se, Y., et al. 2015. Dihydroartemisinin-piperaquine failure associated with a triple mutant including kelch13 C580Y in Cambodia: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 15(6): 683-691.

Straimer, J., Gnädig, N. F., Witkowski, B., Amaratunga, C., Duru, V., Ramadani, A. P., Dacheux, M., et al. 2015. K13-propeller mutations confer artemisinin resistance in Plasmodium falciparum clinical isolates. New York Science Journal. 347(6220): 428-431.

Talundzic, E., Okoth, S. A., Congpuong, K., Plucinski, M. M., Morton, L., Goldman, I. F., Kachur, P. S., et al. 2015. Selection and spread of artemisinin-resistant alleles in Thailand prior to the global artemisinin resistance containment campaign. PLoS Pathogens. 11(4): e1004789.

Tun, K. M., Imwong, M., Lwin, K. M., Win, A. A., Hlaing, T. M., Hlaing, T., Lin, K., et al. 2015. Spread of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum in Myanmar: a cross-sectional survey of the K13 molecular marker. The Lancet Infectious Diseases. 15(4): 415-421.

Vijaykadga, S., Rojanawatsirivej, C., Cholpol, S., Phoungmanee, D., Nakavej, A., and Wongsrichanalai, C. 2006. In vivo sensitivity monitoring of mefloquine monotherapy and artesunate-mefloquine combinations for the treatment of uncomplicated falciparum malaria in Thailand in 2003. Tropical Medicine and International Health. 11(2): 211-219.

White, N. J. 2008. Qinghaosu (artemisinin): the price of success. Science. 320(5874): 330-334. White, N. J., Pukrittayakamee, S., Hien, T. T., Faiz, M. A., Mokuolu, O. A., and Dondorp, A. M.

2014. Malaria. The Lancet. 383(9918): 723-735. WHO. 2001. Antimalarial drug combination therapy. Report of a WHO technical consultation. WHO. 2014. World malaria report 2014. Geneva: WHO; 2014. WHO. 2016. World malaria report 2015: summary. Geneva: WHO; 2016.

34 Witkowski, B., Amaratunga, C., Khim, N., Sreng, S., Chim, P., Kim, S., Lim, P., et al. 2013. Novel

phenotypic assays for the detection of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum malaria in Cambodia: in-vitro and ex-vivo drug-response studies. The Lancet Infectious Diseases. 13(12): 1043-1049.

Witkowski, B., Lelievre, J., Barragan, M. J., Laurent, V., Su, X. Z., Berry, A., and Benoit-Vical, F. 2010. Increased tolerance to artemisinin in Plasmodium falciparum is mediated by a quiescence mechanism. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54(5): 1872-1877.

Wongsrichanalai, C., Lin, K., Pang, L. W., Faiz, M. A., Noedl, H., Wimonwattrawatee, T., Laoboonchai, A., et al. 2001. In vitro susceptibility of Plasmodium falciparum isolates from Myanmar to antimalarial drugs. American journal of tropical medicine and hygiene. 65(5): 450-455.

Wongsrichanalai, C., Pickard, A. L., Wernsdorfer, W. H., and Meshnick, S. R. 2002. Epidemiology of drug-resistant malaria. The Lancet Infectious Diseases. 2(4): 209-218.

Yan, L., Zhou, J., Zheng, Y., Gamson, A. S., Roembke, B. T., Nakayama, S., and Sintim, H. O. 2014. Isothermal amplified detection of DNA and RNA. Molecular BioSystems. 10(5): 970-1003.

Young, M. D., Contacos, P. G., Stitcher, J. E., and Millar, J. 1963. Drug Resistance in Plasmodium falciparum from Thailand. American journal of tropical medicine and hygiene. 12(3): 305-314.

Zhang, C., Yao, Y., Zhu, J.-L., Zhang, S.-N., Zhang, S.-S., Wei, H., Hui, W.-L., et al. 2016. Establishment and application of a real-time loop-mediated isothermal amplification system for the detection of CYP2C19 polymorphisms. Scientific Reports. 6: 26533-26539.