Sclerosi laterale amiotrofica (SLA)

Descritta per la prima volta nel 1860 dal neurologo francese Jean-Martin Charcot sclerosi = "indurimento” laterale = riferito alla zona del midollo spinale che manifesta le prime alterazioni amiotrofica = a (negazione) + mio ("muscolo") + trofico ("nutrimento") : i muscoli del malato si atrofizzano per un “nutrimento insufficiente”

Jean-Martin Charcot

CLINICA

• Esordio : spinale - debolezza ad uno o più arti (di solito laterale), fascicolazioni, o bulbare – difficoltà di parola e di deglutizione

• Paralisi progressiva dovuta alla degenerazione dei motoneuroni (è anche detta malattia dei motoneuroni) spinali e corticali, ad eccezione di quelli oculomotori e del nucleo di Onuf.

• Perdita progressiva e irreversibile della capacità di deglutizione (disfagia), dell'articolazione della parola (disartria) e del controllo dei muscoli scheletrici, fino alla compromissione dei muscoli respiratori e alla morte.

• La SLA non altera funzioni sensoriali, sessuali e sfinteriali del malato. Le funzioni cognitive sono compromesse solo in una piccola percentuale dei casi (demenza fronto-temporale).

Molte delle malattie neurodegenerative presentano entrambe le classi di sintomi in qualche momento nel corso della progressione della malattia Due tipi principali di sintomi clinici DEMENZE: disordini cognitivi, associativi, caratteriali e di memoria DISORDINI DEL MOVIMENTO: Ipercinesia, acinesia, paralisi Le manifestazioni cliniche dipendono dai sistemi neuronali coinvolti nel corso della malattia

TERAPIA

Non esistono terapie in grado di arrestare il decorso della malattia.

Terapie sintomatiche per fascicolazioni, crampi, effetto pseudobulbare (attacchi di riso o pianto incontrollati), ansia, depressione.

Terapia di supporto per • insufficiente deglutizione/alimentazione (fino a PEG) • insufficiente ventilazione (respiratore, fino a

tracheotomia)

Unico farmaco approvato : riluzolo (estende la vita in media di 3 mesi in una parte dei pazienti).

EPIDEMIOLOGIA

La SLA è la malattia del motoneurone più comune. • Età media di esordio : ~ 50 anni (+ forme giovanili)

• Durata media : 3-4 anni

• Incidenza : 2-8 / 100.000 ( come Sclerosi Multipla)

FATTORI DI RISCHIO EPIDEMIOLOGICI

• Età

• Sesso maschile (lieve prevalenza)

• Pratica agonistica (calcio)

• Traumi cranici (?)

• Esposizione a tossici (metalli) (?)

• Fumo (?)

• Familiarità – 10-20% dei casi la malattia è trasmessa in modalità

Aut/Dom (raramente Aut/Rec) a penetranza completa (tutte le generazioni sono colpite)

THE LANCET Neurology Vol 2 November 2003

Putting the boot in: soccer linked to ALS?

Simone Beretta, Maria Teresa Carrì,

Ettore Beghi, Adriano Chiò, and Carlo

Ferrarese

Brain Spinal cord (anterior horns)

Prosencephalon Brain stem

Telencephalon Diencephalon Mesencephalon

Rhombencephalon

Rhinencephalon, Amygdala, Hippocampus, Neocortex, Basal ganglia, Lateral ventricles

Epithalamus, Thalamus, Hypothalamus, Subthalamus, Pituitary gland, Pineal gland, Third ventricle

Tectum, Cerebral peduncle, Pretectum, Mesencephalic duct

Metencephalon Myelencephalon Pons, Cerebellum

Medulla oblongata

CNS

ISTOPATOLOGIA

1. Neurodegenerazione di regioni cerebrali

specifiche – perdita 1° e 2° motoneurone

• Midollo spinale (corna anteriori)

• Corteccia cerebrale (lobo frontale, temporale e parietale)

In stadi avanzati : proliferazione astrocitaria e attivazione microgliale (neuroinfiammazione)

Degenerazione muscolare :

Dying back o dying forward ?

9

Motoneurone in degenerazione Motoneurone “sano”

Sclerosi laterale amiotrofica: la malattia del motoneurone, ma non solo

La malattia del motoneurone (ma non solo)

La SLA è una patologia multifattoriale

Deficit di Fattori

Neurotrofici

Eccitotossicità

Neuro- infiammazione

Alterazione del Trasporto Assonale

Fattori Genetici

Stress Ossidativo Aggregazione

Proteica

SLA

Processamento dell’mRNA

2. Presenza di depositi proteici intracellulari

Simili a corpi di Lewy o skinein-like. Positivi per ubiquitina – NON amiloidi

SOD1

unknown 2008

unknown SOD1

C9ORF72

TDP43

FUS 2009-

2012

Fattori genetici associati alla SLA familiare

“La SLA sporadica e la SLA familiare, benchè

presentino una certa

eterogeneità di manifestazione,

sono clinicamente indistinguibili”

Modelli di SLA associata alla

espressione di SOD1 mutante

Experimental models for the

study of SOD1-linked FALS

• Recombinant proteins

• Saccharomyces cerevisiae

• Transfected mouse cell lines

• Transfected human cell lines

• Transgenic Drosophila melanogaster flies

• Zebrafish

• Transgenic mice/rats

C

O

M

P

L

E

X

I

T

Y

Every model has pros and cons….

• About 20% of FALS patients carry point mutations in the gene sod1.

• More than 140 different mutations in sod1 have been described in FALS families.

• Mutations of critical residues alter metal binding ability and/or protein stability, conferring a new function.

SOD1 and FALS

wtSOD1 fALS-SOD1 G37R

> Free protein carbonyls

> Lipid peroxidation adducts

> Mitochondrial DNA oxidation adducts

> Nuclear DNA oxidation adducts

> Cytoplasmatic RNA oxidation adducts

> Protein nitration

Oxidative damage markers found

in ALS spinal cord

wtSOD1

2 H+ + O2- H2O2 H2O

SOD1-Cu1+ SOD1-Cu2+

O2 O2

-

GSH-Px

catalase

.

.

H2O2

SOD1-Cu1+ SOD1-Cu2+-OH + OH -

Oxidized

substrate

substrate + SOD1-Cu2+

OH . + SOD1-Cu2+

.

fALS-SOD1

CO.

DMPO rescues paralysis and death in fALS transgenic mice

+ DMPO

- DMPO - DMPO

+ DMPO

Liu et al. J.Neurochem. (2002)

Is SOD1-linked fALS a copper-mediated disease ?

Wt mice

Untreated G93A

G93A treated with D-penicillamine

Force-fed In food

Hottinger et al. Eur.J.Neurosci.(1997)

SOD1 monomer

Zn

+ Zn Cu,Zn SOD1

CCS Zn

Cu

Zn CCS

disulfide-linked

oligomers aggregates

H2O2

O2

+ disulfide

C57-C146

+ Cu

redox

control

intracellular aggregates

2 O2- + 2H+ H2O2 +

O2

wild-type SOD1

fALS-SOD1

Protein aggregation

Mitochondrial disfunction

N

E

U

R

O

N

A

L

D

E

A

T

H

Oxidative damage

Proteasome disfunction

SOD1 is :

• Cytosolic, mitochondrial

• abundant

• ubiquitous

• homodimeric

SOD1 aggregates are ubiquitine-positive

SOD1 Ubiquitine

merge

Trypan blue

B L PI B L PI B L PI B L PI0

50

100

150

200

250

SH

WT

G93A

H46R%

of

basal

valu

e *

*

**

Beretta et al.(2003) Neurobiol.Dis.

More than 150 different sod1 mutations have been found in FALS patients.

Do ALL mutant SOD1s share the SAME toxic function ?

Bendotti and Carrì (2004) Trends Mol.Med.

myc-hSOD1

doxycycline48hrs

mSOD1 (dimer)

myc-hSOD1(dimer)

myc-hSOD1(monomer)

E1

33

D15

D90

A11

G9

3A

22

D12

5H

8

S1

34

N5

G8

5R

13

A4

V12

G3

7R

4

H48

R9

H80

R18

H46

R8

no

nT

G7

WT

18

- + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - +

mSOD1

D12

4V

9

fALS-SOD1s behave differently in motoneuronal cells

hSOD1-myc hSOD1

mit

o/c

yto

SO

D1

0

0.4

0.8

1.2

1.6 W

T

A4

V

G3

7R

H46

R

H48

Q

H80

R

G8

5R

D90

A

G9

3A

D12

4V

D12

5H

E1

33

D

S1

34

N

WT

G9

3A

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

*

*

* *

* *

* * * * * *

*

ALL mutSOD1s localize into mitochondria

M C M C M C M C M C M C M C M C M C M C M C M C M C

WT

A4V

G37R

H46R

H48Q

H80R

G85R

D90A

G9

3A

D124V

D125H

E133

D

S134

N

Ferri et al. PNAS 103,13860-5 (2006)

Do mutant SOD1s exert their toxic function

INSIDE (or IN ASSOCIATION with) MITOCHONDRIA ?

Mitochondria are damaged early in patients (and models)

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1 2 3 4 5 6 7

0h

24h

48h

72h

* * * * *

wtSOD1 G93A mito

wtSOD1

mito

wtSOD1

mito

G93A

mito

G93A

ctrl

OD

49

0n

m (

% c

on

tro

l)

Increasing the fraction of mutSOD1 in mitochondria is toxic

Cozzolino et al. ARS 2009

Cu

Zn CCS

reduced SOD1

monomer

IMS matrix

disulfide-linked

oligomers

WT

C6F

C111S

G

93A

C6F

C111S

C6F/

C111S

C M C M C M C M C M C M C M

hSOD1-myc

Hsp60

G93A

C57S

C M C M

WT

C111S

C6F

C6F/

C111S

G93A

mit

o/

cit

o S

OD

1

(U

.A.)

0

0.4

0.8

1.2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1 2 3 4 5 6

C57S

Cys111 mediates mutSOD1s association with mitochondria

WT G93A H80R

mutSOD1 induces mitochondrial fragmentation

CT

RL

WT

-SO

D1

G9

3A

-SO

D1

OPA1

Drp1

nm

ol/m

in/m

g p

rote

in Complex I

Complex II-III

Complex IV W

T

WT

WT

A4

V

H4

6R

H8

0R

D9

0A

D1

25

H

G93A

A4V

H4

6R

H8

0R

D9

0A

D1

25

H

G93A

A4

V

H4

6R

H8

0R

D9

0A

D1

25

H

G93A

0

50

100

150

200

250

300

350

400

* *

* *

* *

* * *

* * *

*

*

*

*

*

*

ALL mutSOD1s damage mitochondria

0

1

2

3

4

5

6

7

*

* *

0

2

4

6

AT

P

(nm

ol/

mg

)

0

1

2

3

4

5

6

7

mSOD1 Doxy

(mg/ml)

hSOD1-myc

WT H80R

0

0.0

5

0.2

1

0

0.0

5

0.2

1

Doxy

AT

P

(nm

ol/m

g)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

WT

H8

0R

D9

0A

G93A

D1

25

H

+ - + - + - + - + - 0

2 4

6 8

10 *

* * *

Ferri et al. PNAS 2006

ALL mutSOD1s damage mitochondria

ALL mutSOD1s alter mitochondrial redox state

WT

H80

R

D90

A

G9

3A

D12

5H

A4

V

G3

7R

H46

R

H48

Q

E1

33

Δ

S1

34

N

D12

4V

G8

5R

Doxy

GS

H/G

SS

G

+ + + + + + - - - - - + - + + + + + - - - - - - - + + -

WT

+ -

G9

3A

0

2

4

6

8

10

12

* *

*

* *

* *

* **

*

* *

hSOD1-myc

Ferri et al. PNAS (2006)

ctr

l

wt

G93A

wt

G93A

150

hSOD1 input

mito soluble

SOD1

SOD1

hSOD1

VDAC

30

ctr

l

wt

G93A

wt

G93A

mito insoluble

150 30

-b-ME

+b-ME

mutSOD1 progressively aggregates into mitochondria

also in transgenic G93A mice (spinal cord)

Age (days)

Cozzolino et al. ARS 2009

effector caspases

Apaf1

cyt c

casp9

apoptosome

SOD1

SOD1

ROS

SOD1

Ca2+ Bcl-2

family caspase-

independent cell death

apoptosis

Deficit in RNA processing

Excitotoxicity

Neuroinflammation

Impairment of Axonal Transport

Oxidative Stress

Protein Aggregation

ALS is a multifactorial disease

Mitochondrial damage

Genetic Factors

mutSOD1

inflammatory

mediators

motor neuron

astrocyte

ims

EAAT2

Ca2+

glutamate

motor neuron

astrocyte

SOD1

Motor neurons express a large number of Ca2+-permeable receptors lacking the GluR2 subunit. Thus, glutamatergic stimulation increases the intracellular Ca2+ concentration and because of the low Ca2+-buffering capacity of motor neurons part of this Ca2+ will be taken up by mitochondria.

Mutant SOD1 severely disrupts

mitochondrial Ca2+ regulation in SH-SY5Y cells

Carrì et al. FEBS lett. (1997)

WT

G93A

G93A

G93

A

WT

WT

Jaiswal, et al. BMC Neurosci. 2009

ER stress occurs when the ER–mitochondria calcium cycle is

disturbed and misfolded proteins accumulate in the ER.

Prell et al. EJN 2012

Activation of markers of ER stress/UPR is detectable in

mutated SOD1G93A motor neurons.

Meccanismo In modelli In pazienti Terapia ?

Stress ossidativo SI SI Non funziona

Metalli SI FORSE Non provato

Aggregati proteici SI SI Non provato

Danno

mitocondriale

SI SI Non funziona ?

Eccitotossicità SI SI Non funziona

Alterazioni

geniche

SI SI ?

Are experimental models “good”

representations of the situation in patients ?

From experimental models to man…a difficult step

La malattia del motoneurone (ma non solo)

IL FUTURO DELLA TERAPIA PER LA SLA

Terapia “combinata”

Target :

• Aggregazione proteica

• Danno mitocondriale

• Proteine mutanti

• Fattori trofici

mRNA transcription and processing

mature mRNA

siRNAs

target gene

translation

protein

association with ribosomes

mRNA degradation

siRNA therapy

motor neuron

muscle

viral

vector

injection

retrograde

transport exogenous protein/siRNA

spinal cord

Retroviral therapy

motor neuron

muscle

injection

spinal cord

NPCs NSCs

NPCs NSCs

trophic

factors

trophic

factors

Stem cell therapy

In vivo veritas

Reversion of mitochondrial damage:

Testing the hypothesis in G93A mice

SOD1-G93A p66Shc-/-

SOD1-G93A/p66Shc-/-

muscle

bra

in

spin

al cord

SOD1

Shc p66

p52

p46

muscle

bra

in

spin

al cord

G93A p66 +/+

G93A p66 -/-

Model of p66Shc redox activity during mitochondrial apoptosis

Giorgio et al. Cell 2005

p66 Ser36-P

Cys59

EE132/133

Ablation of p66Shc improves mitochondrial function

in the spinal cord of G93A mice

Complex IV GSH/GSSG

nm

ol/m

in/m

g p

rote

in

0

40

120

160

200

240

80

Ctr

l

p66S

hc-/

-

90 120 150

G93A p66+/+

90 120 150 days 0

20

40

60

80

100

120

140

1

* *

0

2

4

6

8

10

12

G93ACTRL

G93A 90gg

G93A 120gg

G93A 150 gg

shc-/-Ctrl

shc-/- G93A 90gg

shc-/- G93A 120gg

shc-/- G93A 150gg

GS

H/G

SS

G

Ctr

l

p6

6S

hc-/

-

90 120 150 90 120 150 days

* *

*

0

2

6

8

10

12

4

G93A p66 -/-

G93A p66+/+

G93A p66 -/-

G93A p66Shc -/-

G93A p66Shc +/+

Ablation of p66Shc

ameliorates ALS

phenotype in G93A mice

24 < n < 32

118.96±10.98, days vs.

98,07±8,9 days, p< 0.0001

157,50± 9.11 days vs.

141.26 ± 14,42 days, p< 0.0001

0

50

100

150

200

250

300

350

81 88 96 104 112 119 126 133 140 147 154 163

0

50

100

150

250

200

300

350

81 126 88 104 96 112 119 154 133 140 147 163

days

days

days

aver

age

of

per

form

ance

(se

c)

surv

ival

pro

bab

ilit

y (

%)

on

set

pro

bab

ilit

y (

%)

A putative

mitochondrial

modulator,

dexpramipexol

e

increases the

efficiency of

oxidative

phosphorylation