sammendrag bi2015folk.ntnu.no/haavartl/bi2015 molekylærbiologlab... · dette gj˝r at rna...

Sammendrag BI2015

Innhold

1 Forklaringer av konsepter 21.1 Arabinoseoperonet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21.2 Bariumsulfatassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21.3 Blue/White color screening . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21.4 Dialyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21.5 DNA fingerprinting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21.6 Flytskjema for a genmodifisere bakterier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31.7 Fusjonsprotein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31.8 Gelelektroforese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41.9 GFP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41.10 Hardy-Weinberg Principle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41.11 Isoelektrisk fokusering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51.12 Kolonnekromatografi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51.13 Ligering av DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61.14 Miniprep . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61.15 Myrosinase-glukosinolatsystemet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61.16 PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.16.1 Primer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71.16.2 DNA polymerase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81.16.3 Steder PCR er benyttet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.17 Plasmider . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81.18 Receptor-like kinases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81.19 Reporter gene construct . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81.20 Restriksjonsenzymer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91.21 SDS-PAGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91.22 Transformasjon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91.23 Ulike typer DNA fragmenter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101.24 Vektor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2 Forklaring av enkeltbegreper 11

HTL BI2015 November 19, 2014

1 Forklaringer av konsepter

1.1 Arabinoseoperonet

Arabinoseoperonet er et induserbart operon som stammer fra E. coli celler. Operonet bestarav enzymer som bryter ned arabinose og er under kontroll av promotoren pBAD. araC koderfor AraC som binder seg til PBAD og inhiberer transkripsjon. Hvis det er arabinose tilstede vildenne binde seg til AraC slik at konformasjonen til AraC endres. Dette gjør at RNA polymeraseda kan binde seg og transkribere araBAD. Dette er et eksempel pa negativ genregulering.

pGLO plasmidet inneholder GFP under kontroll av arabinoseoperonet, dette gjør at GFPkun vil bli uttrykt nar arabinose er tilstede.

1.2 Bariumsulfatassay

Et av produktene i degrading av glukosinolater er sulfat. Ved a tilsett barium acetate til enprøve, som er lettløselig, kan man detektere tilstedeværelsen av sulfater. Barium vil reageremed SO4

2− som er tungtløselig og vil felle ut som et hvit stoff. Tilstedeværelsen av sulfater vilindikere tilstedeværelse av myrosinase enzymer og glukosinolater.

Sinigrin + Myrosinase −−→ glucose + SO42−

(aq) (1)

Bariumacetate(aq) + SO42−

(aq) −−→ BaSO4(s) (2)

1.3 Blue/White color screening

Bla/hvit seleksjon blir brukt for a separere bakteriekolonier med insatt ikkerekombinante plasmi-der fra bakteriekolonier med insatt rekombinerte plasmider. lacZ som koder for β-galactosidaseer inkludert i kloneplasmidet. Pa begynnelsen av lacZ genet er det inkludert en multiple cloningsite (MCS) som koder for en rekke restriksjonenzymer. Det er her det klonede genet eventueltblir insatt under ligering. Hvis det klonede genet blir insatt her vil dette ødelegge lacZ genet,og du far ikke et funksjonelt β-galactosidase.

Fungerende β-galactosidase vil splitte X-gal til et stoff som reagerer med oksygen og danneret indigo-farget stoff. En vellykket kloning av plasmidet kan derfor detekteres ved a tilsetteX-gal. Alle bakteriekolonier som har fatt insatt det ønskede genet vil ikke splitte X-gal og vilderfor være hvite. Bla kolonier vil ikke ha det ønskede genet innsatt.

lacZ genet er ekstraordinært stort, over 3000 bp, derfor vil en del av det blir plassert pagenomet til bakterien. Kalles α-komplimentering fordi den lille biten som er pa plasmidet kallesα-fragmentet.

1.4 Dialyse

Dialyse er en separasjonsteknikk som separerer molekyler basert pa størrelse. Vanligvis mastørrelsesforskjellen være pa 10- til >50-ganger. En løsning blir plassert i en dialyseslange ogdialyseslangen blir lagt ned i en bufferløsning. Dialyseslangen er semipermeabel med porer pa enviss størrelse. Kun molekyler som er mindre porene kan passere membranen. Hvis dialyseslangenblir plassert i en bufferløsning som er mye størren en volumet i dialyseslangen vil nesten alle desma molekylene diffundere ut.

1.5 DNA fingerprinting

DNA fingerprinting er en metode for a skille ulike individer ved bruk av DNA. Restriksjonsen-zymer eller PCR brukes til a amplifisere enkelte DNA-sekvenser som er svært variable i lengdefra person til person. Disse prøvene settes pa en gel electroforese og det resulterende mønseret

2


vil være forskjellig fra individ til individ. De DNA-loci som testes er ofte svært variable seg-menter, det vanligste er a benytte VNTRs. VNTRs er svært variable da de pga. overkrysningofte kan variere fra generasjon til generasjon, og de transkriberes ikke sa de er ikke utsatt forkonservering ved seleksjon. Ved bruk av flere DNA-segmenter vil sikkerheten pa analysen øke.

1.6 Flytskjema for a genmodifisere bakterier

1.7 Fusjonsprotein

Et fusjonsprotein er et protein laget av en rekombinant DNA-sekvens som koder for minst todeler fra ulike proteiner. Et fusjonsprotein kan bli laget ved a legere DNA sekvensen for toproteiner som skal bli fusjonert og uttrykke denne sekvensen. Det resulterende mRNAet vilinneholde begge genene og proteinet som resulterer fra translasjonen vil besta av de to originaleproteinene fusjonert sammen.

Det er viktig a ta hensyn til at de to fusjonerte proteinene ma ivareta sin originale funksjon.F.eks. har mange proteiner en signalsekvens pa N-terminus eller C-terminus som er viktige imodifisering og lokalisering av proteinet etter translasjon. For a ivareta proteinets funksjon blirdet ofte fusjonert rett etter promotor eller pa enden av genet. Men for a overkomme problemermed signalsekvens og lignende kan det ogsa fusjoneres i midten.

3


1.8 Gelelektroforese

Gelelektroforese er en metode for a skille DNA molekyler basert pa størrelse. Fosfatryggraden iDNA gir en negativ ladning til DNA molekyler. Fordi denne ladningen er jevnt fordelt i DNAmolekylet vil DNA fragmentet bli mer negativt jo lengre det er. I en fri løsning vil alle DNAfragmenter bevege seg mot en positiv elektrode med lik hastighet. Hvis friksjon blir introdusertvil de sma fragmentene bevege seg raskere enn de store.

I gel elektroforese blir friksjon introdusert ved hjelp av en gel. Denne bestar vanligvis avagarose eller polyacrylamid. Størrelsen pa porene i gelen bestemmer hvilken størrelse pa frag-mentene som gelen best kan skille fra hverandre.

For a separere DNA fragmenter korrekt ma de være lineære og under 30 kbp. Fragmenterover 30 kbp vil bli fanget pa mange ulike mater og hindret fra a bevege seg. Sirkulære fragmentermed kun et brudd i fosfatryggraden vil være sirkulære, svært hindret fra a bevege seg i gelen ogde vil derfor vandre kort. Sirkulære fragmenter uten brudd i fosfatryggraden vil ha en supercoiletstruktur som gjør at de vandrer lengre enn lineære fragmenter pa samme størrelse.

Agarose er et lineært polysakkarid med alternerende enheter av galactose og 3,6-anhydro-galactose som er ekstrahert fra rødalger. Tørr agarose vil løse seg i vann som er nesten kokende.Hvis vann og agarose blir blandet med vann i en konsentrasjon pa 1%-3%, kokt og satt tilkjøling, vil polysakkaridet lage en blanding av porer med ulik størrelse. Høyere konsentrasjonvil gi smalere porestørrelse.

Polyacrylamide gelelectrophorese (PAGE) bruker en gel av polyacrylamide. Prosenten avpolyacrylamide kan variere fra 3 til 30 %. PAGE kan brukes til a separere DNA fragmenter nedtil enkeltbaseparoppløsning. DNA fragmenter pa over 1000 bp kan ikke ga inn i porene i gelen.

1.9 GFP

Green fluorescent protein (GFP) er protein orginalt isolert fra maneten Aequorea victoria. NarGFP blir utsatt for UV-lys lyser den opp med en grønn farge, og denne fluorisensen kan blistudert i et mikroskp. Til forskjell fra andre reporter gener er GFP ikke et enzym og det trengerikke et annet stoff som kofaktor for a fluorisere. Det at GFP i tillegg ikke er giftig gjør at deter et svært nyttig verktøy i molekylærbiologien.

Det originale GFP fra A. victoria har 238 aminosyrer og en vekt pa 27 kDa. Proteinet erhydrofobt og har en struktur som bestar av elleve β-sheets som utgjør en β-barrel struktur.Beskyttet av denne β-barrelen er en α-helix og en chromophore laget av post-translationalmodifisering av -Ser65-Tyr66-Gly67- aminosyreresiduene til en imidazole ring. Den kromoforiskestrukturen blir eksitert med UV-lys pa 395 nm og gir ut grønt lys pa 508 nm.

Det finnes ogsa modifiserte versjoner av GFP. EGFP (enhanced GFP) har sterkere fluorisens,EYFP og ECFP gir ut henholdsvis gult og cyan lys. Det har ogsa blitt laget rødt og blatt GFP.Humanisert GFP som har fatt tilpasset en kodonsekvens til mennesker finnes ogsa.

Da GFP er ikke-enzymatisk er det ofte brukt som en del av et fusion protein. Her blirdet f.eks. satt pa enden av et av proteinene i cytoskjellettet, som tubulin eller actin, slik atcytoskjelettet i cellen lyser opp.

Et problem med GFP som fusjonsprotein er at det ofte virker i dimers eller tetramers.Bruk av GFP i fusjonsprotein pa proteiner som vanligvis ikke aggregerer i cellen kan derforfa dem til a begynne a aggregerere. Et annet problem er at GFP proteinet kan bli satt inn iviktige signalsekvenser pa enden av molekylet, men dette er et problem som gjelder for allefusjonsproteiner.

1.10 Hardy-Weinberg Principle

Frekvensen til et allel som ikke utvikler seg kan bli beskrevet med Hardy-Weinberg prinsippet.Prinsippet sier at om det kun er mendeliansk genetikk og det ikke skjer noen evolusjon vil

4


frekvensen av alleler og genotyper i en populasjon være konstant fra generasjon til generasjon.For en fenotyp som blir bestemt av kun to ulike alleler (R og r), og følger Hardy-Weinberg

equilibrium, er frekvensen til genotypene i populasjonen beskrevet med følgende likning:

p2 + 2pg + q2 = 1

p2 = frekvensen av homozygoter for R (RR), 2pg=frekvensen for heterozygoter (Rr) og q2 =frekvensen av homozygoter for r (rr). Da det kun er to mulige typer alleler i denne modellen,og frekvensen av alleler ma være 1, kan frekvens av det ene allele uttrykkes med den andre:p = 1− q og q = 1− p.

1.11 Isoelektrisk fokusering

Isoelekrisk fokusering er gel elektroforese hvor proteiner blir separert pa ladning i stedet forstørrelse (som er det vanligste). En polyacrylamide gel blir satt opp med en pH-gradient. Etter-som proteinene beveger seg mot den negative polen øker pHen. Den økende pHen gjør at pro-teinene gradvis mister sin positive ladning fordi de gir fra seg protoner. Nar netto ladning paproteinet er null vil de ikke lenger bevege seg i det elektriske feltet, og de stopper opp. Proteinethar netto ladning pa sitt isoelekriske punkt (pI). Fordi ulike protiener har ulik pI vil ulike bandpa gelen representere ulike proteiner.

I isoelektrisk fokusering beholder proteiner sin 3D-struktur. Tilstedeværelsen av protein kanderfor bli testet ved a teste aktiviteten til proteinet. Hvis f.eks. et enzym blir isolert kan detdetekteres ved a tilsette et enzymspesifikt substrat og sjekke for tilstedeværelsen av produkt.Isoelektrisk fokusering kan ogsa brukes for a ekstrahere funksjonelle proteiner til seinere bruk.

1.12 Kolonnekromatografi

Den kraftigste metoden for a isolere proteiner er kolonnekromatografi. Kolonnekromatografibruker en mobil fase og en stasjonær fase. Den stasjonære fasen bestar av et porøst materialemed passende kjemiske egenskaper for a forsinke et spesifikt protein, eller en gruppe proteiner, iforhold til alle de andre proteinene. Den mobile fasen er en bufferløsning som vandrer gjennomkolonnen.

I affinitetskromatografi har kollonnemateriale en høyere affinitet for target proteinet ennandre proteiner. Spesifikke proteiner kan derfor binde seg til kolonnen, men alle de andre mate-rialene flyter igjennom. De bundete proteinene blir eluert fra kolonnen ved a endre egenskapenetil bufferen. Bindingen til kolonnen kan f.eks. skyldes at kolonnemateriale har antistoffer for pro-teinet som skal isoleres, at kolonnemateriale har substrater proteinet binder seg til eller andreliknende egenskaper.

Hydrofobic interaction chromatography (HIC) er en type affinitetskromatografi. Her binderde hydrofobe stoffene seg bedre til kolonnen enn hydrofile stoffer. De hydrofile proteinene blireluert med en saltløsning.

Genmodifisering av proteinet kan bli kombinert med affinitetskromatografi for a isolere spe-sifikke protiener. Her blir en en spesifikk aminosyre sekvens, kalt en tag, lagt til enden avproteinet. Tagen bør ha høy affinitet for enkelte molekyler som andre stoffer ikke har. Et ek-sempel er His-tagen som bestar av seks histidine residues. Tagen blir lagt til en del av protienetsom ikke pavirker proteinfunksjonen, vanligvis nær C- eller N-terminus. Histidine binder non-kovalent og med høy affinitet til visse metallioner som f.eks. Ni2+ og proteinene kan elueresmed imidazole eller histidine. Andre tags bestar f.eks. av en spesifikk aminosyresekvens somblir gjenkjent av et antistoff.

Det finnes ogsa kolonnekromatografi som isolerer proteiner pa størrelse. Her bestar denstasjonære fasen av kuler med sma hull i. Sma proteiner vil vandre igjennom hullene, mens destore vil vandre rett forbi. Fordi de sma kulene dermed vil vandre lengre enn de store vil størreproteiner komme ut først.

5


Det finnes ogsa kolonnekromatografi pa pH. Men kan da ikke skrive om alle. Oppløsningenpa kromatografien kan økes ved a øke trykket. Dette motvirker diffusjonen og gjør at man kanbruke en lengre kolonne og dermed far bedre oppløsning.

Under hele kolonnekromatografiprosessen kan mengden protein detekteres ved a male ab-sorbasjonen av UV-lys da proteiner absorberer UV-lys ved 280 nm. (DNA absorberer ved 260).

1.13 Ligering av DNA

DNA ligase kan lage en binding mellom en fri hydroxylgruppe pa 3’enden pa en DNA-trad ogen fosfatgruppe pa 5’enden av en annen DNA-trad. Denne reaksjonen krever energi, og kommerfra NAD+ i bakterier og ATP i dyr. DNA ligase kan bare sette sammen DNA som er en del aven dobbelhelix, ikke mellom ssDNA. Rollen til DNA ligase i organismene er først og fremst asette sammen brudd i DNA traden i dsDNA etter replikering.

Temperaturoptimum for a ligere brutt DNA er 37 ◦C, men ved denne temperaturen er sticky-ends mellom restriksjonskuttet DNA ustabilt. Optimumstemperaturen er derfor et kompromissmellom optimumstemperaturen for enzymet og optimumstemperaturen for assosiering mellomDNA fragmentene. Temperaturen for dette er vanligvis mellom 4 og 20 ◦C. Blunt end ligeringkan kun skje ved svært høye konsentrasjoner av DNA og DNA ligase fra bakteriofagen T4 villegere slikt DNA.

1.14 Miniprep

En alkalisk pH mellom 12,0 og 12,5 denaturerer linært DNA men ikke lukket sirkulært DNA.Det bakterielle kromosomet er ogsa sirkulært, men i prosessen blir dette store sirkulære mole-kylet omgjørt til lineære fragmenter. Plasmider blir ikke denaturert og kan derfor ekstraheres.Standarprosedyren for slik plasmid-isolering kalles mini-prep og er som følger:

1. Lysatet fra bakteriecellene blir lysert og tilsatt i en alkalisk løsning av natriumhydroksidog sodium dodecyl sulfate (SDS). SDS denaturerer proteinenene og ødelegger cellemem-branen. Kromosomalt DNA blir denaturert og plasmid DNA blir i løsningen.

2. Syrlig potassium acetate blir brukt for a nøytralisere løsningen. Kromosomalt DNA rena-turerer, men danner et uløselig nettverk som kan bli ekstrahert. Proteiner og store RNAmolekyler utfeller pga. høye konsentrasjoner av potassium acetate.

3. Sentrifugering fjerner de uløselige stoffene.

4. Plasmid DNA i løsningen blir bundet til en silica eller positivt ladet ioneutvekslings matrix.Andre forurensinger vil ikke binde seg til matriksen og blir vasket vekk.

5. Plasmid DNA blir eluert fra matrixen med en buffer med lav salkonsentrasjon eller vann.

1.15 Myrosinase-glukosinolatsystemet

Alle planter i Brassicaceae familien inneholder en spesiell type sekundærmetabolitt kalt glukosi-nolater. Nar glukosinolater kommer i kontakt med enzymet myrosinase splittes glukosinolatenetil et reaktivt stoff som isothiocyanate, D-glukose og sulfat, se figur 1. Ulike typer glukosinolaterog ulike forhold for reaksjonen gir ulike reaktive stoffer.

De ulike reaktive stoffene beskytter planten mot mikroorganismer og insekter. Nar de reak-tive stoffene blir spist av dyr eller mennesker kan de gi leverskade og problemer med jodoptaki thyroid. De gir ogsa den skarpe smaken av planter i Brassicaceae familien.

For a sikre at myrosinase-glukosinolatsystemet kun blir aktivert nar det trengs, uttrykkerulike celler myrosinase og glukosinolater. Nar disse cellene blir ødelagt vil substratet og enzymetkomme i kontakt med hverandre og isothiocyanater og andre reaktive stoffer blir produsert.

6


Figur 1: Strukturformler for den generelle reaksjonen katalysert av myrosinaseenzymet.

1.16 PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR) er en metode for a amplifisere en malsekvens in vitro fra ettemplat DNA fra noen fa molekyler til mange millioner kopier. Metoden krever kun følgendekomponenter: DNA template med malesekvens, to primere, DNA polymerase (og kofaktorersom Mg2+), nucleotide triphosphates og en PCR-maskin kalt en thermocycler.

PCR er en syklisk reaksjon med 3 trinn med ulike temperaturer som blir repetert til duhar en stor nok mengde target DNA. Temperaturen blir kontrollert av thermocycleren. Førstetrinn er a varme opp DNA til 90 ◦C i et minutt eller to slik at dsDNA separerer. Andretrinn er a senke temperaturen til 50-60 ◦C (annhealing temperatur) slik at primeren kan bindeseg til malsekvensen. Tredje trinn er a øke temperaturen igjen til rundt 70 grader som ertemperaturoptimum for DNA polymerase slik at DNA kan blir amplifisert sa effektivt sommulig. Denne prosessen bli repetert til du har en stor nok mengde malsekvens DNA.

1.16.1 Primer

DNA polymerase kan kun legge til nukleotider til 3’enden av en allerede eksisterende nukle-otidtrad. Det trengs derfor en primer for en fungerende PCR reaksjon. En PCR primer eren oligonucleotide typisk 18-24 bp lang som har en komplimentærsekvens til begynnelsen avmalsekvensen. Under det andre trinnet i PCR blir temperaturen senket til annealing tempera-tur. Dette er optimaltemperaturen for at primeren skal binde seg til malsekvensen.

For en PCR reaksjons a trengs det to primere. En av primerne bestemmer begynnelsen avtarget sekvensen, den andre bestemmer enden. En av konsekvensene av dette er at malsekvensenkun finnes som en egen enhet i den tredje syklusen av PCR-reaksjonen.

En lengre primer vil gi en mindre fraksjon av annealed primers i annealing trinnet. PCRreaksjonen er en eksponentiell amplifisering sa selv en liten ineffektivitet vil amplifisere til ensignifikant minkning i amplifisert produkt.

Annealing temperatur til PCR ma være nær smeltetemperauren (Tm) til primer-DNA-hybridet for god primer spesifisitet. Den beste annealing temperaturen er et par grader underTm. Annealing temperatur blir blant annet bestemt av lengden pa primeren og innholdet avbaser. Ulike baser i DNA binder seg med ulike mengder hydrogenbindinger, A:T binder medto og G:C binder med tre. G:C er derfor en sterkere binding enn A:T. Tm kan regnes ut medformelen 2(AC) + 4(GC). Det beste forholdet er 50 % GC.

Den siste nukleotiden pa primeren er ogsa viktig i PCR reaksjonen fordi DNA polymeraselegger til nye nukleotider pa 3’enden. Det er derfor viktig at minst de 5-6 siste nukleotidenematcher perfekt med malsekvensen.

Primeren ma ogsa ikke være palindromic og de to primerne ma ikke være komplementære.For a designe en primer ma starten og slutten av DNA sekvensen være kjent. For a finne

denne sekvensen kan DNAet først sekvenseres, man kan bruke informasjon om genet fra liknendearter eller man kan dedusere en mulig aminosyresekvens fra aminosyresekvensen i proteinet.DNAet kan ogsa bli gjort om til en sirkulær form, slik at du kun trenger a vite startsekvensen.

7


1.16.2 DNA polymerase

Et krav for DNA polymerasen som benyttes i PCR er at den ma tale de røffe forholdene.En særlig stor utfordring er a overleve den høye temperaturen som kreves for a denaturereDNA. Løsningen pa dette var a ekstrahere en DNA polymerase fra en termofil bakterie. DNApolymerase fra Thermus aquaticus, kalt Taq polymerase, taler temperaturer helt opp til 95 ◦C,og har en optimumstemperatur pa 74 ◦C. Enzymet har en 5’-3’ polymerase aktivitet og 5’-3’exonuclease aktivitet, men den mangler 3’-5’ exonuclease aktivitet. Taq polymerase gir altsa endel feil. Taq polymerase legger ofte ogsa til en nukleotid, som oftest adenosine, pa 3’enden avden nye DNA-traden.

Selv om Taq polymerase er mest brukt finnes det ogsa mange andre termostabile polymera-ser. F.eks. Pfu polymerase fra pyrococcus furiosis har ogsa 3’-5’ proffreading activity. Dessverreer denne mye treigere enn Taq polymerase.

1.16.3 Steder PCR er benyttet

Eksempler pa steder hvor PCR er til nytte: molekylær kloning, DNA sekvensering, arkeologi,kriminalsaker, amplifisering av ukjente sekvenser, klinisk patologi, genetisk diagnose, karrakte-risering av ukjente mutasjoner, DNA fingerprinting og genomanalyse.

1.17 Plasmider

Plasmider er ekstra-kromosomale DNA fragmenter som er stabile fra en generasjon til en anneni sin ekstra-kromosomale tilstand. Finnes i størrelse fra 1500 bp til 300 kbp. De fleste plasmiderfinnes i lukkede sirkulære dsDNA. Plasmidene vil ogsa som oftest gi bakterien en fenotype,f.eks. resistanse mot et tungmetall eller antibiotika. Plasmider kan ikke replikere utenfor enorganisme. 50 % av alle bakterier inneholder minst et plasmid.

Størrelsen og antallet plasmider i en celler varierer. Antallet kopier av et plasmid i en celleblir kalt copy number. Størrelsen av plasmider i Escherichia coli varierer fra 1 % til 10 % avkromosomet. Hvis plasmidet ikke gir cellen noen fordeler vil cellen raskt degradere eller misteplasmidet. Noen store plasmider har derfor funksjoner som dreper bakterien hvis plasmidetblir tapt. En annen taktikk er a ha et gen som gir bakterien en fordel, f.eks. resistanse motantibiotika.

1.18 Receptor-like kinases

Plante reseptor-like kinases (RLKs) er transmembrale proteiner med et ekstracellulær amino-terminal domene og et karboksylterminal intracellulært kinase domene. RLKs likner svært myepa dyrs receptor tyrosine kinases. RLKs er involvert i en rekke prosesser i planter inkludertsykdomsresistens, self-versus-nonself recognition, hormongjenkjenning og utvikling.

1.19 Reporter gene construct

Et reporter gene construct kan bli brukt for a undersøke hvor i en multicellulær organisme etspesifikt gen er uttrykt. Et eksempel er β-glukuronidase (GUS) reporter system, se figur 2. I GUSreporter system vil promotoren for det studerte genet bli plassert foran DNA sekvensen for β-glukuronidase, og den resulterende gensekvensen blir klonet inn i planten. Der hvor promotorenblir uttrykt i organismen vil ogsa GUS enzymet bli produsert. GUS bryter ned X-glucose til etblatt uløselig stoff. Tilstedeværelsen av dette bla stoffet kan dermed bli undersøkt og den blafargen vil representere uttrykk av promotoren som blir studert.

En av de mange fordelene med GUS-reporter construct er at det ikke pavirker veksten tilplanten som studeres. Hvis man f.eks. i stedet hadde brukt en gene-knocout metode for a studeregenet ville organismen ha dødd hvis genet man studerer haddde vært nødvendig for organismen.

8


Figur 2: The GUS reporter system. PX = testet promotor. GUS = DNA sekvensen for enzymet β-glukuronidase.

1.20 Restriksjonsenzymer

Restriksjonsenzymer er bakterielle enzymer som kutter fosfatryggraden til begge DNA tradeneved en spesifikk DNA sekvens. Disse spesifikke DNA sekvensene er 4-8 nukleotider lange ogblir kalt restriksjonsseter. Restriksjonsenzymer utviklet seg antakeligvis som et forsvarssystemmot fremmed DNA. Alle restriksjonssetene som er native i bakterielt DNA blir merket med enmetylgruppe av et modifiseringsenzym. Pa denne maten blir ikke bakterielt DNA degradert avrestriksjonsenzymet. Hvis virus DNA, eller annet fremmed DNA, med et restriksjonssete, garinn i cellen, vil et restriksjonsenzym kutte DNAet og det vil bli ødelagt.

De fleste restrikssjonssetene er inverterte repitisjoner, det betyr at top strand sekvensen erlik som bottom strand sekvensen.

Fordi restriksjonsenzymene kutter DNA pa spesifikke steder er de svært nyttige verktøyi molekylærbiologi. Kutting pa spesifikke steder kan brukes til a sette inn gener i plasmider,gjenkjenne ulike fenotyper (RFLP) eller andre ting.

Restriksjonsenzymer kan enten kutte DNA traden pa det samme stedet pa begge tradene(blunt end), eller med et lite overheng (sticky end). Hvis to DNA fragmenter skal ligeres sammenvil det være mye lettere a bruke sticky ends som har overlapp. De to fragmentene vil da bindeseg til hverandre i en hvis grad og gjøre jobben lettere for DNA ligase.

1.21 SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) er en versjon av gelelektroforese som brukes for a separere proteiner pa størrelsen. Sodium dodecyl sulfate er basiskstoff med en negativ ladning og et protein vil binde omtrent 1,4 gagner sin molekylære vekt avSDS. Bundet SDS denaturerer proteinets 3D struktur, men for a sørge for komplett denatureringav proteinet vil ogsa sma sulfhydryl reagenter, som fjerner disulfidbroene i proteiner, bli tilsatt.Bundet SDS gir en stor negativt ladning som skjuler den originale ladningen til proteinet.Mengden SDS bundet til proteinet er ogsa proporsjonal med lengden til proteinet. Vanlig gelelectrophorese med en polyacrylamid gel blir deretter utført. Fordi alt proteinet har en omtrentlik ladning og form vil SDS-PAGE separere proteinene nesten eksklusivt pa størrelse.

1.22 Transformasjon

Transformation er overføring av DNA uten andre biologiske makromolekyler fra ekstern mediumtil inn i en bakterie. DNAet kan bli inkorporert i bakterien. Ingen celle til celle kontakt ellervirus trengs til forskjell fra henholdsvis konjugering eller transduksjon.

I praksis er transformasjon først og fremst en laboratorieteknikk, det skjer sjeldent i naturen.Noen bakterier, kalt kompetente bakterier, tar opp DNA uten forhandsbehandlign. Andre kreverkjemisk behandling for a ta opp DNA via transformasjon.

9


En metode er heat-shock treatment, vanligvis brukt pa E.coli. Bakterien blir avkjøl sammenmed metallioner, spesielt med høy konsentrasjon av Ca2+. Bakterien blir deretter varmet opp ien kort periode. Denne prosessen skader celleveggen og DNAet kan ga inn i cellen.

En annen metode er electroshock treatment, vanligvis brukt pa gjærceller. Her blir or-ganismen eksponert for en høy-volts spenning over kort tid i en electroporator. Dette apnercelleveggen og gjør at DNA kan ga inn i cellen.

1.23 Ulike typer DNA fragmenter

SINEsShort interspersed elements er korte sekvenser funnet i flere kopier som utgjør en stor del avhøyt eller middels repetert DNA i pattedyr. De fleste av disse sekvensene har ingen funksjon savidt vi vet. Den best kjente SINE er Alu element.

Alu elementAlu element er en SINE og et transposon i primaters DNA som ikke blir transkribert og errepetert i høy grad pa tilfeldige steder i genomet. Alu elementet er pa ca. 300 bp og utgjør 6-8% av genomet. Disse binder seg til RNA polymerase II og undertrykker genuttrykk.

LINEsLong interspersed elements er lange sekvenser funnet i mange kopier som utgjør mestepartenav moderat repetert (hundrevis til tusenvis av kopier) DNA i pattedyr. Kommer antakeligvisfra retrovirusliknende forfedre. Den vanligste i det mammalske genom er L1 som bestar av 7000bp og to kodende sekvenser.

Satellitt DNASatellitt DNA er svært repetert DNA i eukaryoter som blir funnet som clustere av tandemrepeats og er permanent coilet i heterochromatin. Mengden varierer svært fra organisme til or-ganisme, mus har 8 %, Drosophilia har nesten 50%. En stor del av satellite DNA er a finne rundtcentromere i mennesker (kalt alpha DNA) og har derfor antakeligvis en strukturell funksjon.

VNTRSVariable number of tandem repeats bestar av korte DNA sekvenser som er repetert i et uliktantall, men antall kopier er mye mindre enn for satellitt DNA. Repetisjoner pa rundt 25 bpblir kalt minisattelitter, og pa mindre enn 13 blir kalt microsattelitter. En av de vanligste mini-sattelittene blir funnet i telomerer. VNTRs blir ikke uttrykt. De er fordelt rundt om kring idet menneskelige genom. Fordi VNTRs er repeterte sekvenser vil overkrysning ofte føre til ulikdistribusjon i lengde av VNTRene.

1.24 Vektor

En vektor er en DNA sekvens som replikerer som en egen enhet og kan bli brukt for a frakteDNA fragmenter. De fleste vektorer er enten basert pa plasmider eller bakteriofag lambda (λ).En vektor som ofte blir brukt for a klone gener blir kalt for en cloning vector, mens en vektorsom blir i hovedsak brukt for a uttrykke gener kalles en expression vector. For a være nyttigevektorer ma en vektor kunne selvreplikere og ha en karrakteristikk som gjør at vi kan kjenneigjen transformerte celler fra utransformerte celler. I tillegg har de fleste vektorer minst et re-striksjonssete slik at DNA fragmenter relativt lett kan bli klonet inn i vektoren.

Fem egenskaper en ekspresjonsvektor bør inneholde:

1. oriT. Vektoren ma ha et startsted for replikering slik at den kan replikere.

10


2. Antibiotikaresistensgen, slik som bla som koder for β-lactamase som gir ampicillinresi-stanse. Dette er nødvendig for a skille transformerte celler fra ikke transformerte celler.

3. Promotor. Plasmidet ma ha en ledig promotor som kan brukes for a uttrykke genet duskal uttrykke. Det er ekstra nyttig om denne er inducible slik at du kan kontrollere nargenet blir uttrykt.

4. Multiple cloning site (MCP). Ved siden av promotoren ma cellen ha et restriksjonskutte-sete som kan brukes for a sette inn ditt gen etter promotoren. Det er ekstra nyttig om deter mulighet for a bruke flere ulike restriksjonsenzymer, insetting av en MCP tillater dette.

5. I tillegg ma ekspresjonsvektoren ha genet du ønsker a replikere, slik at du faktisk far etprodukt. (Jeg er litt usikker pa dette punktet, men dette er det beste jeg kom fram til.)

2 Forklaring av enkeltbegreper

Agrobacterium tumefaciens er en jordbakterie som gir crown gall disease ved a sette inndeler av sitt DNA (fra et plasmid kalt T-DNA) inn i en plante. Mye brukt til genetisk modifi-sering av planter.

Divalente kofaktorer trengs for de fleste DNA-enzymer, dette inkluderer f.eks. Mg2+.

Etidium bromide (EtBr) er et mye brukt fluoriserende stoff for a detektere DNA moleky-ler, nar det blir utsatt for UV-lys fluoriserer det med en oransje farge. Fluorisensen øker meddet 20-dobbelte nar det binder seg til DNA. Legger seg i gropene i DNA-heliksen. Svært kreft-fremkallende.

Electroporation er en metode for a indusere transformasjon i celler, vanligvis gjærceller. Cel-lene blir utsatt for et høy-volts elektrisk støt i kort tid og dette skader celleveggen nok til atDNA kan bli tatt opp av cellen.

Heat-shock er en metode for a indusere transformasjon i celler. Bakterier blir først behandletmed divalente ioner og kjølt ned. Deretter blir bakterien i kort tid varmet opp. Denne prosessenfremmer transformasjon.

”Hot-start”-PCR. Taq polymerase har 5’-3’ eksonucleaseaktivitet. Da PCR-reagentene ofteblir satt sammen pa is vil oppvarming av løsningen til denatureringstemperatur av DNA pa etpunkt na optimumstemperaturen til Taq polymerase. Ved denne temperaturen vil Taq polyme-rase begynne a degradere primere før PCR-reaksjonen har satt i gang med sin 5’-3’ eksonuc-leaseaktivitet. For a forhindre dette kan man tilsette Taq-polymerase først nar blandingen ervarmet opp eller man kan tilsette et antistoffer eller andre proteiner som gjør at Taq-polymerasesin aktivitet blir inhibert ved lavere temperaturer.

Isoenzym er enzymer som har ulik aminosyresekvens men som katalyserer den samme re-aksjonen. Disse enzymene har ofte ulike kinetiske parametre og/eller ulik regulering.

Kompetente celler er celler som kan ta opp DNA via transformasjon uten a bli behand-let først.

Mismatching primers er en primer som kun er delvis komplimentær til malsekvensen.

11


Negativ kontroll er regulering av gener nar tilstedeværelsen av et spesifikt stoff hindrer gen-uttrykk av et eller flere gener.

Periplasma er mellomrommet mellom den cytoplasmiske membranen og den ytre membra-nen i gram-negative bakterier.

Positiv kontroll er regulering av gener nar tilstedeværelsen av et spesifikt stoff fremmer gen-uttrykk av et eller flere gener.

PV92 er en locus pa kromosom 16 hvor det i mange individer har skjedd en insersjon avAlu elementet i det menneskelige genom.

Rekombinant protein er et protein translert av recombinant DNA. Recombinant DNA erDNA som stammer fra flere ulike kilder satt sammen i en DNA-trad.

Sekundærmetabolitt er organiske stoffer produsert av en organisme som vanligvis ikke erinkludert i normal vekst, utvikling eller reproduksjon. Et eksempel er glukosinolater.

Seleksjonsmarkør er en egenskap, ofte bestemt av et enkelt gen, som gjør det mulig a skille enorganisme med denne egenskapen fra en organisme som ikke har den egenskapen. Et eksempelpa en seleksjonsmarkør er antibiotikaresistens.

T4 DNA ligase er en DNA ligase fra bacteriophag T4, og er den mest brukte DNA liga-sen i laboratorier. Denne kan ligere dsDNA, DNA-RNA-hybrider og ligerer blunt ends DNAmye mer effektivt enn DNA ligase fra E. coli.

Virulensgener er gener som gjør at en organisme er patogen. Et eksempel er at de flestestammene av E. coli er ufarlige, men enkelte stammer har virulensgener som gjør dem patoge-ne, f.eks. gjelder dette EPEC (enteropatogenic E. coli).

12

sammendrag bi2015folk.ntnu.no/haavartl/bi2015 molekylærbiologlab... · dette gj˝r at rna...

Documents