s. sugita et al- distinct muscarinic receptors inhibit release of gamma-aminobutyric acid and...

8/3/2019 S. Sugita et al- Distinct muscarinic receptors inhibit release of gamma-aminobutyric acid and excitatory amino acids

1/4

P r o c .N a t i .A c a d .S c i .USAVo l .8 8 ,p p .2 6 0 8 - 2 6 1 1 ,M a r c h1 9 9 1P h y s i o l o g y / P h a r m a c o l o g y

D i s t i n c tm u s c a r i n i cr e c e p t o r si n h i b i tr e l e a s e o f y - a m i n o b u t y r i ca c i da n d e x c i t a t o r ya m i n oa c i d s i nmamma l i a nb r a i n

( p r e s y n a p t i ci n h i b i t i o n /M la n dM3 r e c e p t o r s / am y g d a l a / s t r i a t um / e l e c t r o p h y s i o l o g y )

S . S U G I TA ,N . U C H I M U R A * ,Z . - G . J I A NG ,ANDR . A . N O RT H tVo l l u mI n s t i t u t e ,O r e g o nH e a l t hS c i e n c e sU n i v e r s i t y ,P o r t l a n d ,OR 9 7 2 0 1

C o m m u n i c a t e db y H a n sW .Ko s t e r l i t z ,D e c e m b e r1 2 ,1 9 9 0

ABSTRACT I n t r a c e l l u l a rr e c o r d i n g sw e r e m a d ef r o mn e u r o n so f r a t l a t e r a la m y g d a l a ,n u c l e u sa c c u m b e n s ,a n ds t r i a t u mi nv i t r o .S y n a p t i cp o t e n t i a l sm e d i a t e db y Y- a m i n o b u -t y r i ca c i da n d b y e x c i t a t o r ya m i n oa c i d sw e r ei s o l a t e dp h a r -m a c o l o g i c a l l yb y u s i n g r e c e p t o ra n t a g o n i s t s ,a n d t h e i ra m p l i -t u d e sw e r eu s e da sa m e a s u r eo ft r a n s m i t t e rr e l e a s e .M u c a n r n e

a n da c e t y l c h o l i n ei n h i b i t e dt h er e l e a s eo fb o t hy - a m i n o b u t y r i ca c i da n d e x c i t a t o r ya m i n oa c i d s ,b u t m e a s u r e m e n t so f t h ed i s s o c i a t i o ne q u i l i b r i u mc o n s t a n t sf o rt h ea n t a g o n i s t sp i r e n -z e p i n e ,11 - { 2 - [ ( d i e t h y l a m i n o ) m e t h y l ] - 1 - p i p e r i d i n y l } a c e t y l -5 , 1 l - d i h y d r o - 6 H - py r i d o [ 2 , 3 - b ] [ 1 , 4 ] b e n z o d i a z e p i n e - 6 -o n e ,m e t h o c t r a m i n e ,a n d h e x a h y d r o s i l a d i f e n i d o li n d i c a t e d c l e a r lyt h a td i f f e r e n tm u s c a r i n i cr e c e p t o r sw e r e i n v o l v e d( M Ia n dp r o b a b l yM3 , r e s p e c t i v e l y ) .T h e d i f f e r e n t i a ll o c a l i z a t i o no fd i s t i n c tm u s c a r i n cr e ce p t o r s u b t y p e so n t e r m i n a l sr e l e a s i n gt h em a j o ri n h i b i t o r ya n d e x c i t a t o r yt r a n s m i t t e r so f t h eb r a i nc o u l db e e x p l o i t e dt h e r a p e u t i c a l l yi ns o m em o v e m e n td i s o r d e r sa n dA l z h e i m e rd i s e a s e .

A c e t y l c h o l i n e( A c C h o )h a s d i v e r s e f u n c t i on a lr o l e si n t h em a m m a l i a nb r a i n ,i n c l u d i n ga c t i o n sa tm u s c a r i n i cr e c e p t o r st h a ta r ei m p o r t a n tf o rm e m o r y( 1 ) .C h o l i n e r g i cn e u r o n sa r el o s ti nA l z h e i m e rd i s e a s e ,a n do n e t h e r a p e u t i ca p p r o a c hha sb e e nt od e v e l o pd r u g st h a tm i m i ct h en e u r o t r a n s m i t t e r a c t i o no f m i s s i n gAcCho ( 1 ) .H o w e v e r ,s u c h d r u g s ,l i k eA c C h oi t s e l f ,w i l lh a v e d i f f e r e n te f f e c t sa t d i f f e r e n tm u s c a r i n i cr e c e p t o r si n t h eb r a i n ,a n d n o t a l lo f t h e s ee f f e c t sm a yb ed e s i r e d .T h r e em u s c a r i n i cr e c e p t o r s( M 1 -M 3 )c a n b e d i s t i n -g u i s h e d p h a r m a co l og i c a l l y ,b u t f i v e( m l - m S )h a v e b e e ni d e n t i f i e db y mo l e c u l a rc l o n i n g( m l - m 3c o r r e s p o n dt oM1 -M3 )( 2 - 8 ) .F i b e r sc o n t a i n i n g' y - a m i n o b u t y r i ca c i d( G A B A )a n d e x c i -

t a t o r ya m i n oa c i d ss u c ha sg l u t a m a t ep r o v i d es y n a p t i ci n p u t st ov i r t u a l l ya l lc e n t r a ln e u r o n s ;t h e r e f o r e ,i na d d i t i o nt ot h e i rd i r e c te f f e c t so n n e u r o n s( 9 ,1 0 ) ,m u s c a r i n i ca g o n i s t sw i l la l s oe x c i t eo r i n h i b i t c el l sb y a c t i n gp r e s y n a p t i c a l l yt o c h a n g er e l e a s eo f t h e s en e u r o t r a n s m i t t e r s .I n t h ep r e s e n t e x pe r i -m e n t s , t h e r e l e a s eo f GABAa n d e x c i t a t o r ya m i n oa c i d s( g l u t a m a t e )w a s a s s a y e db y r e c o r d i n gt h ea m p l i t u d eo fd e -p o l a r i z i n gs y n a p t i cp o t e n t i a l sf r o m n e u r o n si n t h r e eb r a i nr e g i o n sw h e r eAcCho i s k n o w nt o p l a ya n i m p o r t a n tf u n c -t i o n a lr o l e - t h ea m y g d a l a ,n u c l e u sa c c u m b e n s ,a n ds t r i a t u m .

METHODSA d u l tr a t sw e r ea n e s t h e t i z e dw i t h h al o t h an ea n d k i l l e db y ah e a v yb l o wt ot h ec h e s t .T h eb r a i nw a sr a p i d l yr e m o v e d ,a n da b l o c k o f t i s s u ec o n t a i n i n gn u c l e u s a c c u m b e n s ,d o r s a ls t r i a t u m ,o r a m y g d a l o i dc o m p l e xw a s s e c t i o n e dw i t ha V i -b r a t o m e .I n t r a c e l l u l a rr e c o r d i n g sw e r em a d ef r o ms l i c e s( 3 0 0, a mt h i c k )b y u s i n ge l e c t r o d e sc o n t a i n i n g2 M KC I( 1 1 - 1 3 ) .

T h e s u p e r f u s i n gs o l u t i o nw a s a b i c a r b o n a t eb u f f e rg a s s e dw i t h9 5% 0 2 / 5%CO 2a n d c o n t a i n e d2 . 5mM KC I , 2 . 4mMC a C 1 2 ,1 . 3mM MgC l 2 ,1 . 2mM N a H 2 P O 4 ,2 6mM N a H C O 3 ,1 2 6mM N a C i ,a n d1 0mM g l u c o s e .T h es l i c ew a sc o m p l e t e l ys u b m e r g e di nt h i sf l o w i n gs o l u t i o n ,w h i c hw a sp r e w a r m e dt o3 7 0 C .D r u g sw e r ea p p l i e db y c h a n g i n gt h i ss o l u t i o nt o o n e

t h a tc o n t a i n e dt h ed r u g .A b i p o l a rt u n g s t e n - i n - g l a s ss t i m u -l a t i n ge l e c t r o d ew a su s e df o r f o c a ls t i m u l a t i o n .T h e c om p o -n e n t so ft h es y n a p t i cp o t e n t i a l sm e d i a t e db y g l u t a m a t ea n dGABAw e r e b o t h d e p o l a r i z i n gb e c a u s et h er e c o r d i n ge l e c -t r o d e sc o n t a i n e dKC I ,b u t t h er e s p e c t i v ec o n t r i b u t i o n sc o u l db e r e a d i l yd i s t i n g u i s h e db y s e l e c t i v er e c e p t o r a n t a g o n i s t s( F i g .1 A ) .I n 3 0 uM b i c u c u l l i n e( o r1 0 0t t Mp i c r o t o x i n ) ,t h er e s i d u a ls y n a p t i cp o t e n t i a lw a s c o m p l e t e l yb l o c k e db y ac o m b i n a t i o no f1 0uM6 - c y a n o - 2 , 3 - d i h y d r o x y - 7 - n i t r o q ua l i n e( C N Q X )a n d 3 0 , uM 4 - a m i n o p h o s p h o n o v a l e r i ca c i d( A P V ) ,a n d t h i si s r e f e r r e dt o a s t h eg l u t a m a t e( e x c i t a t o r ya m i n oa c i d )c o m p o n e n t ;i n 3 0 uMAPVa n d 1 0 , t MCNQX,t h e r e s i d u a ls y n a p t i cp o t e n t i a lw a sc o m p l e t e l yb l o c k e db y 3 0, u Mb i c u c u l l i n e ,a n d t h i si s r e f e r r e dt o a s t h eGABAc o m -p o n e n t .M u s c a r i n es u p e r f u s i o nw a sf o r3 - 1 0m i n ,w h i c hw a s s u f -

f i c i e n t ,d e p e n d i n go n t h ef l o wr a t e ,f o rt h er e d u c t i o no f t h es y n a p t i cp o t e n t i a lt o r e a c h a s t e a d ys t a t e ;p i r e n z e p i n ew a ss u p e r f u s e df o ra t l e a s t3 0 m i np r i o rt o r e t e s t i n gt h e a c t i o no fm u s c a r i n e .Mu s c a r i n e( 3 - 1 0 0 , u M )o f t e nc a u s e dp o t e n t i a lc h a n g e si n t h ep o s t s y n a p t i cc e l l s ,w h i c hh a d r e s t i n g p o t e n -t i a l sb e t w e e n- 7 5 a n d - 9 0 mV, b u t t h em e m b r a n ep o t e n t i a lw a s r e s t o r e dt o t h e c o n t r o ll e v e lf o rm e a s u r e m e n t so fs y n -a p t i cp o t e n t i a la m p l i t u d e .( I na m y g d a l a ,2 0 %o fc e l l sw e r eh y p e r p o l a r i z e db y u p t o1 3mV, 4 2 %w e r ed e p o l a r i z e db y u pt o 1 2mV, a n d 3 0% ow e r e u n a f f e c t e d :i n a c c u m b e n sa n ds t r i a t u m ,n o n ew e r eh y p e r p o l a r i z e d ,a n d > 8 0% ow e r ed e p o -l a r i z e db yu p t o1 8m V. )T h ed e p o l a r i z a t i o nw a sa c c o m p a n i e db y a n i n c r e a s ei n i n p u tr e s i s t a n c e( 1 1 ) ,s o t h i ss h o u l dn o tc o n t r i b u t et o a n y r e d u c t i o ni n t h ea m p l i t u d eo f t h es y n a p t i cp o t e n t i a l .D i s s o c i a t i o ne q u i l i b r i u mc o n s t a n t sf o ra n t a g o n i s t sw e r ed e t e r m i n e db y G a d d u m - S c h i l da n a l y s i s( 1 4 ) .

RESULTSANDDISCUSSIONM u s c a r i n er e v e r s i b l yd e p r e s s e dt h es y n a p t i cp o t e n t i a l sm e -d i a t e db y b o t hg l u t a m a t ea n dGABA( F i g .1B a n dC ) :i tw a se q u a l l ye f f e c t i v ei n i n h i b i t i n gb o t h g l u t a m a t ea n d GABAr e l e a s e .T h e c o n c e n t r a t i o n st h a tg a v e5 0 %r e d u c t i o n( E C 5 0 )

A b b r e v i a t i o n s :A c C h o ,a c e t y l c h o l i n e ;AFDX1 1 6 ,1 1 - 1 2 - [ ( d i e t h y l -a m i n o ) m e t h y l ] - 1 - p i pe r i d i n y l} a c e t y l - 5 , 1 1 - d i h y d r o -b ] [ 1 , 4 ] b e n z o d i a z e p i n e - 6 - o n e ;A P V,4 - a m i n o p h o s p h o n o v a l e r i ca c i d ;CNQX, 6 - c y a n o - 2 , 3 - d i h y d r o x y - 7 - n i t r o q u i n o x a l i n e ;E C 5 0 ,c o n c e n -t r a t i o ng i v i n gh a l f - m a x i m a le f f e c t ;GABA, - am i n o b u t y r i ca c i d ;HHSD, h e x a h y d r o s i l a d i f e n i d o l ;M cN - A - 3 4 3 ,4 - ( 3 - c h l o r o p h e n y l c a r -b a m o y l ) - 2 - b u t y n y l t r i m e t h y l a m m o n i u mc h l o r i d e .* P r e s e n tA d d r e s s :D e p a r t m e n t so fP h y s i o l o g ya n dN e u r o p s y c h i a t r y ,KurumeU n i v e r s i t yMe d i c a lS c h o o l ,6 7A s a h i - m a c h i ,Kurume 8 3 0 ,J a p a n .t T owhomr e p r i n tr e q u e s t ss h o u l db e a d d r e s s e d .

2 6 0 8

T h ep u b l i c a t i o nc o s t s o f t h i sa r t i c l ewere d e f r a y e di np a r tb yp a g ec h a r g ep a y m e n t .T h i sa r t i c l em u s tt h e r e f o r eb e h e r e b ym a r k e d" a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c ew i t h 1 8U . S . C . 1 7 3 4s o l e l yt o i n d i c a t et h is f a ct .


2/4

P r o c . N a t l .A c a d .S c i .USA8 8 ( 1 9 9 1 ) 2 6 0 9

AC o t r o l N c e QNQX&AV

C o n t r o l

BGltamte

C20 rm

c

M c a n e ( 1 0p wM( l jo I 1 1 1 4 1 1 1 , 1

CNQX&APV S i c NX &A P Y

Wash

Wash

1 5mV1 0 me

(10 I m

US.U.MWPilllW1o

F I G .1 . Mu s c a r i n ed e p r e s s e sg l u t a m a t ea n d GABAc o m p o -n e n t s o f d e p o l a r i z i n gs y n a p t i cp o t e n t i a l s .( A )P h a r m a c o l o g i c a ls e p a r a t i o n o f g l u t a ma t ea n d

GABAc o m p o n e n t s .T h e s y n a p -t i cp o t e n t i a lw a s r e d u c e di np a r tb y 3 0,M b i c u c u l l i n e( B i c )a n di n

1 0 mV p a r t b y a c o m b i n a t i o no f 1 0 , uMCNQXa n d3 0A uM4 - A P V.Whene x c i t a t o r y 'a m i n oa c i da n t a g o -n i s t sa n db i c u c u l l i n ew e r ea d d e dt o g e t h e r ,t h es y n a p t i cp o t e n t i a lw a sc o m p l e t e l yb l o c k e d .( B )S u -p e r i m p o s e ds y n a p t i cp o t e n t i a l st o s h o wc o n t r o lr e s p o n s e s ,a n dr e s p o n s e s i n t h e p r e s e n c e o fm u s c a r i n e( 0 ,3 , 1 0 ,a n d3 0AM) .H e re a n di n o t h e r f i g u r e s ,t h eg l u t a m a t ec o m p o n e n t( B L e f t )w a s r e c o r d e di n 3 0AMb i c u c u l -

l i n e( o r1 0 0, u Mp i c r o t o x i n ) ,a n dt h e ' G A B Ac o m p o n e n t( BR i g h t )w a s i n 3 0AMAPV a n d 1 0, MCNQX. ( C )T i m ec o u r s eo f a c -t i o no f m u s c a r i n et o i nh ib i ts y n -

mV a p t i cp o t e n t i a l .( CL e f t )G l u t a -m a t e c o m p o n e n t .( C R i g h t )GABAc o m p o n e n t .

o f t h eg l u t a m a t ec o m p o n e n to ft h es y n a p t i cp o t e n t i a lw e r e1 3 0 . 9, u M( n = 3 1 ) ,9 . 7 1 . 3uM ( n = 3 0 ) ,a n d1 3 2 . 2I L M( n = 1 8 )a n d o f t h eGABAc o m p o n e n tw e r e1 2 1 . 5p .M( n= 1 0 ) ,9 . 8 2 . 0p uM( n = 1 6 ) ,a n d 1 0 2 . 7p . M( n = 1 0 )( a m y g d a l a ,a c c u m b e n s ,a n d s t r i a t u m , r e s pe c t iv e l y ) .G l u t a m i ca c i d( n= 6 )a n dGABA( n= 3 )w e r ea l s oa p p l i e d

d i r e c t l yt o t h en e u r o n sb y c h a n g i n gt oa s u p e r f u s i n gs o l u t i o nt h a tc o n t a i n e d1 0mM a g o n i s tf o r4 s s o t h a tr e p r o d u c i b l ed e p o l a r i z a t i o n sc o u l db eo b t a i n e dw i t hr e p e a t e da p p l i c a t i o n s :t h e s ed e p o l a r i z a t i o n sb y e x o g e n o u sg l u t a m a t ea n d GABAw e r eu n a f f e c t e db ymu s c a r i n e ,i n d i c a t i n gt h a tt h ed e p r e s s i o no f t h es y n a p t i cp o t e n t i a lw a sm o s tl i k e l yp r e s y n a p t i c .

7 5 -

o

0I sL0 5

c o0

25 -

CLo2 5

0

B e t h a n e c h o l( n= 3 )a n dAcCho( n= 6 )h a d e f f e c t ss i m i l a rt o t h a to f m u s c a r i n e .T h e r e l e a s eo f GABAw a s m o r es e n s i t i v et h a nt h er e l e a s eo f g l u t a ma t et oM c N - A - 3 4 3[ 4 - ( 3 -c h l o r o p h e n y l c a r b a m o y l ) - 2 - b u t y n y l t r i m e t h y l a m m o n i uc h l o r i d e ]a n d i t s4 - c h l o r oa n a l o g( F i g .2 ) ,s u g g e s t i n gt h a tt h ep r e s y n a p t i cmu s c a r i n i cr e c e p t o r so n t h et w o s e t so f n e rv et e r m i n a l sm i g h td i f f e r ;t h e s ec o m p o u n d sa r es o m e w h a ts e -l e c t i v ef o rM l r e c e p t o r si n o t h e r t i s s u e s( 1 5 ) .

1 C

- .( a

. _

a

a .

0

0 )

C ]

A g o n i s tc o n c e n t r a t i o n ,pM

F IG . 2 . M c N - A - 3 4 3( t r i a n g l e s )a n d i t s4 - c h l o r oa n a l o g( c i r c l e s )i n h i b i ts y n a p t i cp o t e n t i a l sm e d i a t e db yg l u t a m a t e( f i l l e ds y m b o l s )a n dGABA ( o p e n s y m b o l s ) .G r a p h s s h o w c o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s ec u r v e s .T h en u m b e rb e s i d ee a c hp o i n ti n d i c a t e st h en u m b e ro f c e l l s ,a n d t h ev e r t i c a lb a r ss h o wt h eSEM. D a t aw i t ht h eM c N - A - 3 4 3

4 - c h l o r oa n a l o ga r ef r o mn u c l e u sa c c u m b e n s .D a t aw i t hM c N - A - 3 4 3a r ep o o l e df r o ma m y g d a l a ,a c c u m b e n s ,a n d s t r i a t u m :t h er e s p e c t i v eE C 5 ov a l u e st od e p r e s st h eg l u t a m a t ec o m p o n e n tw e r e1 9 9 + 2 8 j LM( n= 4 ) ,1 3 0 2 9 , . &M( n = 5 ) ,a n d1 9 4+ 5 3 .M ( n= 4 )a n dt oi n h i b i tt h eGABAc o m p o n e n tw e r e3 3 9 . 0/ . M( n = 3 ) ,2 8 4 . 2I AM( n =6 ) ,a n d 3 5 9 . 0A.M( n = 3 ) .

J U A

0 0 3 1 A3

0 s . * I I. _3 1 0 3 0 1 0 0 3 0 0 1 0 0 0

1 0 0 rC

4

2 - B

D : 1 _

0 ,0

I ' I I I0 7 - 6 . 5 - 6 - 5 . 5

2 r D

a n,0

O_ L3 1 0 3 0 1 0 0 3 0 0 1 0 0 0Mu s c a r i n e ,g t M

/0 LS ' I I-8 - 7 . 5 -7 - 6 . 5P i r e n z e p i n e ,l o gM

F I G .3 . P i r e n z e p i n ed i f f e r e n t i a t e sb e t w e e nm u s c a r i n i cr e c e p t o r so n g l u t a m a t e - r e l e a s i n ga n d o n GA BA - r e l e a s i n gt e r m i n a l s .( A )C o n -c e n t r a t i o n - r e s p o n s ec u r v e s f o rm u s c a r i n et o i n h i b i tg l u t a m a t er e -l e a s ei n t h ea b s e n c ea n d p r e s e n c eo f p i re n z ep i n ea t c o n c e n t r a t i o n s( u M )i n d i c a t e db y e a c ht r a c e .R e s u l t s a r ef r o mo n ea m y g d a l an e u r o n .

( B )G a d d u m - S c h i l dp l o tf r o mt h er e s u l t si nA : p i r e n z e p i n ea c t sa sac o m p e t i t i v ea n t a g o n i s t .( C )S i m i l a re x p e r i m e n tf o rGABAr e l e a s ei na n o t h e r a m y g d a l an e u r o n . ( D ) G a d d u m - S c h i l dp l o ts h o w s t h a tp i r e n z e p i n ea c t sa s a c o m p e t i t i v ea n t a g o n i s tb ut h a sa h i g h e ra f f i n i t yf or t h er e c e p t o r so n GABAt e r m i n a l st h a n o n t h eg l u t a m a t et e r m i -n a l s .

P h y s i o l o g y / P h a rm a c o l o g y :S u g i t ae t a L

, E n

1 l


3/4

2 6 1 0 P h y s i o l o g y / P h a r m a c o l o g y :S u g i t ae t a l .

Ta b l e 1 . L o g a r i t h mo f K dv a l u e sf o ra n t a g o n i s mo fi n h i b i t i o no fs y n a p t i cp o t e n t i a lb y m u s c a r i n eP i r e n z e p i n e A F D X - 1 1 6 M e t h o c t r a m i n e HHSD

N e u r o n s G l u - R N GABA-RN G l u - R N G l u - R N G l u - R N GABA-RN

AMYG - 7 . 0 0 . 2 0( 9 ) - 7 . 9 0 . 0 7( 6 ) - 5 . 8 0 . 0 6( 4 ) - 7 . 8 0 . 0 1( 4 ) - 7 . 5 0 . 0 7( 4 )ACCU - 6 . 8 0 . 0 7( 7 ) - 7 . 7 0 . 0 8( 4 ) - 6 . 1 4 0 . 1 9( 5 ) - 7 . 8 0 . 1 2( 7 ) -

S T R I - 6 . 9 + 0 . 3 2( 4 ) - 7 . 5 0 . 1 5( 4 ) - - - 7 . 8 5 0 . 1 6( 3 ) -I ne x p e r i m e n t si nw h i c ht h r e eo rf o u ra n t a g o n i s t sw e r ea p p l i e dw h i l er e c o r d i n gf r o ma s i n g l en e u r o n( e . g . ,F i g s .3 a n d4 ) t h e s l o p eo ft h e

G a d d u m - S c h i l dp l o td i dn o td i f f e rf r o m 1 . T h e r e f o r e ,K d v a l u e sw e r e c o m p u t e df r o mK d = [ B ] / ( D R- 1 ) ,w h e r e[ B ]i s t h ea n t a g o n i s tc o n c e n t r a t i o na n dDRi st h er a t i oo fe q u i - e f f e c t i v ea g o n i s tc o n c e n t r a t i o n si nt h ea b s e n c ea n dp r e s e n c eo fp i r e n z e p i n e .I ft w oo rm o r ea n t a g o n i s tc o n c e n t r a t i o n sw e r ea p p l i e dt oo n en e u r o n ,a s i n g l ee s t i m a t eo ft h eK df o r t h a tc e l lw a so b t a i n e df r o mt h em e a n .E a c hn e u r o nw a su s e dt op r o v i d ea n i n d e p e n d e n te s t i m a t eo fKd ,w h e t h e ro n eo rm o r ea n t a g o n i s tc o n c e n t r a t i o n swe r ea p p l i e dt oi t ;t h en u m b e ro fn e u r o n si si np a r e n t h e s e sb e s i d ee a c h e s t i m a t e .K d v a l u e sa r ee x p r e s s e da s t h e i rl o g a r i t h m s SEM. AMYG,ACCU, a n d S T R I ,e x p e r i m e n t si n l a t e r a la m y g d a l a ,n u c l e u sa c c u m b e n s ,a n d s t r i a t u m ;G l u - R N ,g l u t a m a t e - r e l e a s i n gn e u r o n s ;GABA-RN,GABA - r e l e a s i n gn e u r o n s .

T h emu s c a r i n i cr e c e p t o r so n t h ep r e s y n a p t i ct e r m i n a l st h a tr e l e a s e dGABAw e r ed i s t i n g u i s h e db y a n t a g o n i s t sf r o mt h o s eo f t h eg l u t a m a t e - r e l e a s i n gt e r m i n a l s .F i g .3 i l l u s t r a t e se x p e r -i m e n t s t h a ts h o wt h a tm o r ep i r e n z e p i n ew a s r e q u i r e dt oa n t a g o n i z emu s c a r i n i ci n h i b i t i o no f t h er e l e a s eo f g l u ta m at et ha n o ft h er e l e a s eo fGABA.T h eh i g ha f f i n i t yo fp i r e n z e p i n e

f o rt h er e c e p t o r so n t h eG A B A - r e l e a s i n gn e r v e s i n a l lt h r e et i s s u e s( T a b l e1 )c l e a r l yi m p l i c a t e st h eM1 r e c e p t o r ,a n d t h eK d f o r h e x a h y d r o s i l a d i f e n i d o l( H H S D )d e t e r m i n e di n t h ea m y g d a l ai s c o n s i s t e n tw i t h t h i si n t e r p r e t a t i o n .P r e s y n a p t i ci n h i b i t i o nb y a c t i v a t i n gM1r e c e p t o r sh a s b e e n

s h o w ni nb r a i na n do t h e rt i s s u e s( 1 6 ,1 7 ) ,i n c l u d i n gt h e r e l e a s eo f GABA( 1 8 ) .T h e p r e s e n c eo f M1 r e c e p t o r so n GABA-c o n t a i n i n gn e u r o n si n t h e s et h r e eb r a i nr e g i o n si s q u i t ec o n s i s t e n tw i t h t h ef i n d i n gt h a tt h e y a l le x p r e s sm o d e r a t e l yh i g hl e v e l so f m l r e c e p t o rRNA ( 8 )b e c a u s em o s to f t h eGABAt e r m i n a l sa r i s ef r o mi n t r i n s i cGABAn e u r o n s .T h e d i s s o c i a t i o nc o n s t a n t( K d )f o rp i r e n z e p i n ea s a n a n -

t a g o n i s to fmu s c a r i n ei n h i b i t i o no fg l u t a m a t er e l e a s e( T a b l e1 )d o e sn o t a g r e ew e l lw i t ht h ea f f i n i t yo f p i r e n z e p i n ef o rM1o rM2 r e c e p t o r sb u t i s c l o s e rt o t h ev a l u e sr e p o r t e df o rt h em3

a n d m 5r e c e p t o r s ,c l o n e da n d e x p r e s s e di n o o c y t e s( 1 9 )o rC h i n e s eh am s t e r o v a ryc e l l s( 2 0 ) .E x p e r i m e n t sw i t h m o r es e l e c t i v ea n t a g o n i s t s w e r e t h e r e f o r e c a r r i e do u t . I na m y g d a l a ,11 - { 2 - [ ( d i e t h y l a m i n o ) m e t h y l ] - 1 - p i p e r ia c e t y l - 5 , 1 1 - d i h y d r o - 6 H -p y r i d o [ 2 , 3 - b ] [ 1 , 4 ] b e n z oo n e ( A F D X - 1 1 6 ;r e f .5 ) a n d HHSD ( 7 )b o t h c o m p e t i t i v e l y

a n t a g o n i z e dt h e a c t i o no f m u s c a r i n e ,a n d t h eK d v a l u e s( T a b l e1 )a g r e e dw e l lw i t h t h o s e f o rt h eM3 ( a n d e x p r e s s e dm 3 )r e c e p t o r( 5 ,7 , 1 9 - 2 1 ) .I na c c u m b e n s ,m e t h o c t r a m i n e( 6 )a n dHHSDw e r e u s e da s a n t a g o n i s t s :t h eK d v a l u e sd e t e r -m i n e dw e r ea l s ov e r yc l o s et ot h o s er e p o r t e df o rM3r e c e p t o r s( 6 ,1 9 - 2 1 ) .T h eK do f m e t h o c t r a m i n es u g g e s t sM3r a t h e rt h a nm4 ( 1 9 ,2 0 ) ,a n d BM - 5 ,a n a g o n i s ts e l e c t i v ef o rm2 a n dm4r e c e p t o r s( 2 2 ) ,w a s i n e f f e c t i v ea t 3 0 - 3 0 0AM( n = 6 ) .H o w -e v e r ,t h er e s u l t sw i t h t h e s ea n t a g o n i s t sd o n o td i s t i n g u i s hu n e q u i v o c a l l yb e t w e e nM3 ( m 3 ) ,m 4 , a n dm5 r e c e p t o r so r ac o m b i n a t i o no f t h e s e .G l u t a m a t e - c o n t a i n i n gf i b e r s t ot h ea c c u m b e n s ,d o r s a ls t r i a t u m ,a n da m y g d a l aa r i s ei np a r tf r o mc e l lb o d i e si n c o r t i c a lc e l ll a y e rV ( 23 , 2 4 ) ,a n dm3 r e c e p t o rmRNA i s s t r o n g l ye x p r e s s e di n t h i sl a y e r( 8 ) :m5mRNAi se x p r e s s e di n t h eCA1 r e g i o no f t h eh i p p o c a m p u s( 2 5 ) ,w h i c h

A

1 0 0 _ 1 l

C0) ~ I I IX L - - L 3 1 0 30 1 0 0 3 0 0 1 0 0 0C . )

c ol0

B

10

A FDX - 11 6

3 1 03I 1 0 33 1 0 3 0 100 300

1 0 0 C

0 _ T , a

1 UI

g*I

0 L )

_ l ~ ~ ~ I* I II O3 1 0 30 1 0 0 30 0 1 0 0 0 1 3 lU

M u s c a r i n ec o n c e n t r a t i o n ,j iM3 0 1 0 0 3 0 0

1H H 8 0 D M e t h o c t r a m i n e

I e a I I A

- 8 - 7 - 6A n t a g o n i s t ,l o gM

F I G .4 . G l u t a m a t er e l e a s ei s i n h i b i t e dt h r o u g hM 3 - l i k er e c e p t o r s .T h e i n h i b i t i o no f g l u t a ma t er e l e a s eb y m us c a ri n ewas m e a s u r e d ,a n d t h i swas a n t a g o n i z e db y HHSD( A a n d C) A F D X - 1 1 6( B ) ,a n d m e t h o c t r a m i n e( D ) .C o n c e n t r a t i o n s( j i M )o fa n t a g o n i s tp r e s e n t i n e a c h c a s e a r ei n d i c a t e d .F o u rd i f f e r e n tn e u r o n s w e r e u s e d :a m y g d a l ai nA a n dB a n da c c u m b e n si nC a n dD . ( E a n dF ) G a d d u m - S c h i l dp l o t sf r o me x p e r i m e n t si nA-D.

c

CO0 )0.0 )a

- 5

P r o c . N a t l .A c a d .S c i .USA8 8 ( 1 9 9 1 )

) I

2 1

_w


4/4

P r o c . N a t l .A c a d .S c i .USA8 8 ( 1 9 9 1 ) 2 6 1 1

a l s op r o v i d e s some e x c i t a t o r yi n p u tt o a c c u m b e n sa n da m y g d a l a .T h ep o w e r f u lp r e s y n a p t i ci n h i b i t o r ya c t i o n so f m u s c a r i n e ,

a t c o n c e n t r a t i o n ss i m i l a rt o o r l o w e rt h a n t h o s e n e e d e dt op r o d u c ed i r e c tp o s t s y n a p t i ce f f e c t s( 1 1 ) ,s u g g e s t t h a tt h e

p r e s y n a p t i cr e c e p t o r sw i l lb e a n i m p o r t a n ts u b s t r a t eb o t hf o rp h y s i o l o g i c a l l yr e l e a s e dAcCho a n d f o re x o g e n o u s l ya d m i n -i s t e r e dd r u g s .A s e l e c t i v eM1 a n t a g o n i s tw o u l di n h i b i tt h ec e l l sb y i n c r e a s i n gGABAr e l e a s ew h e r e a sa s e l e c t i v eM3a g o n i s tw o u l di n h i b i tt h ec e l l sb y d e c r e a s i n gg l u t a m a t er e -l e a s e .I nt h ec a s e o f t h ea c c u m b e n sa n d s t r i a t u m ,t h i sm i g h tb e n e f i tc e r t a i nd y s k i n e s i a s( 2 6 ) .I nt h ec a s e o f t h ea m y g d a l a ,s e l e c t i v ei n h i b i t i o no f t h e s en e u ro n s c ou l db e h e l p f u li nc e r t a i ne p i l e p s i e s ;t h ea m y g d a l ai s a m o n gt h em o s tr e a d i l yk i n d l e do f b r a i nr e g i o n s ,a n d t h i si s b l o c k e db y m u s c a r i n i ca n t a g o n i s t s( 2 7 ,2 8 ) .C o n v e r s e l y ,s e l e c t i v ea g o n i s t sa t M1r e c e p t o r sw o u l db e e x p e c t e dt o e x c i t et h ep r i n c i p a lc e l l so ft h e s er e g i o n sb y d i r e c te x c i t a t i o n( 1 1 ,2 9 )a n db y r e d u c t i o no fG A B A - m e d i a t e df e e d b a c ki n h i b i t i o n ,w h i l eh a v i n gn o e f f e c to n t h ee x c i t a t o r yd r i v et o t h ec e l l sm e d i a t e db y g l u t a m a t e .T h ec h o l i n e r g i ci n n e r v a t i o no f t h ea m y g d a l af r o mt h en u c l e u sb a s a l i si s o n e s i t eo f t h et y p i c a ln e u r o d e g e n e r a t i v ec h a n g e sa s s o c i a t e dw i t h A l z h e i m e rd i s e a s e( 1 ,3 0 ) ,a n d t h ep r e s e n tf i n d i n g st h e r e f o r ep o i n tt o t h ep o s s i b l e v a l u eo fM 1a g o n i s t sa n dM3a n t a g o n i s t si n t h i sd i s e a s e .

Wet h a n kD r .G . L a m b r e c h ta n dD r . R. Hammerf o rg i f t so fd r u g s .Th i sw o r kw a ss u p p o r t e db y U . S .D e p a r t m e n to f H ea l t ha n dHumanS e r v i c e sG r a n t sD A 0 3 1 6 1a n dMH 4 0 4 1 6 .

1 . B a r t u s ,R. T . , D e a n ,R. L . & F l i c k e r ,C . ( 1 9 8 7 )i n P s y c h o -p h a r m a c o l o g y :T h eT h i r dG e n e r a t i o no fP r o g r e s s ,e d .M e l t z e r ,H . Y . ( R a v e n ,NewYo r k ) ,p p .2 1 9 - 2 3 2 .

2 . H a m m e r ,R . , B e r r i e ,C. P . , B i r d s a l l ,N . J . M. , B u r g e n ,A . S .V . & H u l m e ,E .C .( 1 9 8 0 )N a t u r e( L o n d o n )2 8 3 ,9 0 - 9 2 .

3 . B o n n e r ,T . I . ( 1 9 8 9 )T r e n d sP h a r m a c o l .S c i .S u p p l .9 , 1 1 - 1 5 .4 . B o n n e r ,T . I . ( 1 9 8 9 )T r e n d sN e u r o s c i .1 2 ,1 4 8 - 1 5 1 .5 . G i ac h et t i , A . ,M i c h e l e t t i ,R . & M o n t a g n a ,E . ( 1 9 8 6 )L i f eS c i .

3 8 ,1 6 6 3 - 1 6 7 2 .6 . M e l c h i o r r e ,C . ,C a s s i n e l l i ,A . & Q u a g l i a ,W. ( 1 9 8 7 )J . M e d .

C h e m .3 0 ,2 0 1 - 2 0 4 .

7 . M u t s c h l e r ,E . & L am b r e c h t ,G . ( 1 9 8 4 )T r e n d sP h a r m a c o l .S c i .S u p p l .5 , 3 9 - 4 4 .

8 . B u c k l e y ,N . J . ,B o n n e r ,T . I . & B r a n n ,M . R . ( 1 9 8 8 )J . N e u -r o s c i .8 , 4 6 4 6 - 4 6 5 2 .

9 . C h r i s t i e ,M . J . & No r t h , R. A . ( 1 9 8 7 )T r e n d sP h a r m a c o l .S c i .S u p p l .8 , 3 0 - 3 4 .

1 0 . No r t h ,R. A . ( 1 9 8 9 )i n T h eMu s c a r i n i cR e c e p t o r s ,e d .B r o w n ,J . H . ( H u m a n a ,C l i f t o n ,N J ) , p p .3 4 1 - 3 7 5 .1 1 . U c h i m u r a ,N . & N o r t h , R . A . ( 1 9 9 0 )J . P h y s i o l .4 2 2 ,3 6 9 - 3 8 0 .1 2 . U c h i m u r a ,N. , C h e r u b i n i ,E . & No r t h , R . A . ( 1 9 8 9 )J . N e u r o -

p h y s i o l .6 2 ,1 2 8 0 - 1 2 8 6 .1 3 . U c h i m u r a ,N . ,H i g a s h i ,H . & N i s h i ,S . ( 1 9 8 6 )B r a i nR e s . 3 7 5 ,

3 6 8 - 3 7 2 .1 4 . S c h i l d ,H . 0 . ( 1 9 4 9 )B r .J . P h ar m a co l . C he m o t h e r.4 ,2 7 7 - 2 8 0 .1 5 . B r o w n ,J . H. , e d .( 1 9 8 9 )T h eMu s c a r i n i cR e c e p t o r s( H u m a n a ,

C l i f t o n ,N J ) .1 6 . E l t z e ,M. , Gm e l i n ,G . ,We s s ,J . , S t r o h m a n n ,C . ,Ta c k e ,R . ,

M u t s c h l e r ,E .& L a m b r e c h t ,G . ( 1 9 8 8 )E u r . J . P h a r m a c o l .1 5 8 ,2 3 3 - 2 4 2 .

1 7 . Wi l l i a m s ,S . H . & C o n s t a n t i ,A . ( 1 98 8 ) B r .J . P h a r m a c o l .9 3 ,8 4 6 - 8 5 4 .

1 8 . H a s u o ,H. , G a l l a g h e r ,J . P . & S h i n n i c k - G a l l a g h e r ,P . ( 1 9 8 8 )

B r a i nR e s . 4 3 8 ,3 2 3 - 3 2 7 .1 9 . A k i b a ,I . ,K u b o ,T . ,M a e d a ,A . ,B u j o ,H. , N a k a i ,J . ,M i s h i n a ,M . & N u m a ,S . ( 1 9 8 8 )FEBS L e t t .2 3 5 ,2 5 7 - 2 6 1 .

2 0 . B u c k l e y ,N . J . ,B o n n e r ,T . I . ,B u c k l e y ,C. M . & B r a n n ,M . R .( 1 9 8 9 )Mo l .P h a r m a c o l .3 5 ,4 6 9 - 4 7 6 .

2 1 . L a z a r e n o ,S . & R o b e r t s ,F . F . ( 1 9 8 9 )B r .J . P h a r m a c o l .9 8 ,3 0 9 - 3 1 7 .

2 2 . B a u m g o l d ,J . & D ro bn i c k, A .( 1 9 8 9 )Mo l . P h a r m a c o l .3 6 ,4 6 5 - 4 7 0 .

2 3 . C h r i s t i e ,M. J . , S u m m e r s ,R . J . , S t e p h e n s o n ,J . A . , C o o k ,C . J . & B e a r t ,P .M . ( 1 9 8 7 )N e u r o s c i e n c e2 2 ,4 2 5 - 4 3 9 .

2 4 . J o n e s ,E .G . ,C o u l t e r ,J . D . ,B u r t o n ,H . & P o r t e r ,R. ( 1 9 7 7 )J .C o m p .N e u r o l .1 7 3 ,5 3 - 8 0 .

2 5 . Vi l a r o ,M . T . ,P a l a c i o s ,J . M . & M e n g o d ,G . ( 1 9 9 0 )N e u r o s c i .L e t t .1 1 4 ,1 5 4 - 1 5 9 .

2 6 . We i n e r ,W. J . & L a ng , A .E . ( 1 9 8 9 )Movemen tD i s o r d e r s :AC om p r e h e n s i v eS u r v e y( F u t u r a ,NewYo r k ) .

2 7 . M c N a m a r a ,J . 0 . ( 1 9 8 4 )F e d . P r o c . 4 3 ,2 5 1 6 - 2 5 2 0 .2 8 . We s t e r b e r g ,V . & C o r c o r a n ,M . E . ( 1 9 8 7 )E x p . N e u r o l .9 5 ,

1 9 4 - 2 0 6 .2 9 . D o d t ,H . U . & M i s g e l d ,U . ( 1 9 8 6 )J . P h y s i o l .3 0 , 5 9 3 - 6 0 8 .3 0 . J a m a d a ,M . & Me h r a e i n ,P . ( 1 9 6 8 )A r c h .P s y c h i a t r .Ne r v e n k r .

2 1 1 ,3 0 8 - 3 2 4 .

P h y s i o l o g y / P h a r m a c o l o g y :S u g i t ae t A

s. sugita et al- distinct muscarinic receptors inhibit release of gamma-aminobutyric acid and...

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