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Estandarización del proceso de obtención de antocianinas a partir de callos de mora
(Rubus glaucus Benth) mediante la técnica de suspensiones celulares.
Kelly Johana Díaz Rincón
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS
PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA
2019
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Estandarización del proceso de obtención de antocianinas a partir de callos de mora
(Rubus glaucus Benth) mediante la técnica de suspensiones celulares.
KELLY JOHANA DIAZ RINCON
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito Para optar al título de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
Director
CHRISTIAN ANDREI CHACIN ZAMBRANO
Ing. MSc en Biotecnología Microbiana
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS
PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA
2019
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AGRADECIMIENTOS
A la Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y Agropecuarias.
A mi director de tesis: Christian Andrei Chacín Zambrano por su colaboración y apoyo
incondicional para sacar adelante este proyecto.
A Gabriela Rodríguez, y al Servicio Nacional de Aprendizaje SENA, por colaboración
durante la realización de la tesis.
A María Cañas por sus consejos, su tiempo y disposición de ayudarme en el desarrollo de este
proyecto.
A mis compañeros de universidad: Cesar Echeverría, Fabián Bermúdez, Ana María Cano,
Diego Dovale, Alejandra Castro, Brisley Mora, Eliud González Zacarías y todos aquellos que
de cualquier manera contribuyeron en este proceso.
A William Núñez, Juan Camilo Jaramillo y Gina García por su apoyo y motivación.
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DEDICATORIA
A mis padres, que son mi mayor ejemplo de esfuerzo y dedicación. Por ser un apoyo
incondicional durante este proceso, sin ellos esto no podría ser posible.
A mi hermana María Alejandra Díaz Rincón, el motor de mi familia y el milagro que Dios
nos regaló.
A Griselia Jaimes, por ser un gran apoyo, motivación y la persona más especial que la vida
me regalo.
Al doctor Jorge Luis Grosso, por creer tanto en mí, por ser un gran maestro, amigo y ser
humano, aunque ya no esté con nosotros, sé que este logro lo haría sentir orgulloso.
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Contenido
RESUMEN ................................................................................................................................. 1
ABSTRACT ............................................................................................................................... 3
INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1
1 PROBLEMA DE INVESTIGACIÒN ................................................................................. 7
1.1 Planteamiento Del Problema ........................................................................................ 7
1.2 Justificación .................................................................................................................. 9
2 MARCO TEÓRICO........................................................................................................... 11
2.1 Cultivo in vitro............................................................................................................ 11
2.2 Cultivo de células vegetales en suspensión ................................................................ 12
2.3 Metabolismo en Células Vegetales............................................................................. 13
2.3.1 Metabolitos Primarios ......................................................................................... 13
2.3.2 Metabolitos Secundarios ..................................................................................... 13
2.4 Fenoles ........................................................................................................................ 14
2.5 Ácidos fenólicos ......................................................................................................... 15
2.6 Polifenoles .................................................................................................................. 15
2.7 Flavonoides ................................................................................................................. 16
2.8 Antocianinas ............................................................................................................... 16
2.9 Biosíntesis de las antocianinas ................................................................................... 18
2.10 Factores que afectan la estabilidad de las antocianinas .......................................... 19
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2.11 Oxígeno y ácido ascórbico ...................................................................................... 20
2.12 PH ........................................................................................................................... 20
2.13 Temperatura ............................................................................................................ 21
2.14 Iluminación ............................................................................................................. 21
2.15 Biorreactores ........................................................................................................... 22
2.16 Biorreactor airlift .................................................................................................... 24
3 MARCO REFERENCIAL ................................................................................................. 26
4 HIPÓTESIS........................................................................................................................ 29
4.1 Hipótesis Nula ............................................................................................................ 29
4.2 Hipótesis Alternativa .................................................................................................. 29
5 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 30
5.1 Objetivo general ......................................................................................................... 30
5.2 Objetivos específicos .................................................................................................. 30
6 METODOLOGÍA .............................................................................................................. 31
6.1 Tipo de Investigación ................................................................................................. 31
6.2 Población y Unidad de Muestra.................................................................................. 31
6.3 Fase de Investigación.................................................................................................. 31
6.3.1 Fase I: Construcción del Biorreactor AIRLIFT .................................................. 31
6.3.2 Fase II: Determinación de las Condiciones Ideales para la Obtención de
Antocianinas. ......................................................................................................................... 31
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6.3.3 Fase III: Métodos Cuantitativos y Cualitativos ................................................... 34
7 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................... 35
7.1 CAPITULO I: CONSTRUCCIÓN DEL BIORREACTOR AIRLIFT....................... 35
7.2 CAPITULO II: DETERMINACIÓN DE LAS CONDICIONES IDEALES ............. 38
7.2.1 Preparación del inóculo ....................................................................................... 38
7.2.2 Puesta en marcha del Biorreactor Airlift con suspensiones celulares de Rubus
glaucus Benth. ....................................................................................................................... 38
7.2.3 Medición de variables en cada tratamiento ......................................................... 39
7.3 CAPITULO III: PRODUCCIÓN DE ANTOCIANINAS .......................................... 46
7.3.1 Método Cuantitativo ............................................................................................ 46
7.3.2 Método Cualitativo .............................................................................................. 50
8 CONCLUSIONES ............................................................................................................. 53
9 RECOMENDACIONES .................................................................................................... 54
10 Bibliografía..................................................................................................................... 55
11 Anexos ............................................................................................................................ 63
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estructura básica de las antocianinas ........................................................................ 17
Figura 2.Ruta general de la biosíntesis de las antocianinas ..................................................... 19
Figura 3. Efecto del pH en las antocianinas ............................................................................ 21
Figura 4. Diseño Esquemático Biorreactor .............................................................................. 37
Figura 5. Prototipo del Biorreactor airlift para la producción de antocianinas ........................ 38
Figura 6. Muestra vegetal de estudio ....................................................................................... 39
Figura 7. Resultados Peso Fresco ............................................................................................. 40
Figura 8. Comportamiento del cultivo en % BRIX .................................................................. 42
Figura 9. Concentración de azucares reductores. ..................................................................... 44
Figura 11. Comportamiento de crecimiento a diferentes pH ................................................... 47
Figura 12. Muestras método cualitativo ................................................................................... 50
file:///C:/Users/Juan%20Camilo/Desktop/TRABAJOS%20DE%20GRADO/Tesis%20kelly/Tesis%2030%20Mayo.docx%23_Toc10110934
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LISTA DE TABLAS
Tabla 1. sustituyentes presentes en el anillo B de las Antocianinas -------------------------------- 18
Tabla 2. Consecuencias del Biorreactor ----------------------------------------------------------------- 23
Tabla 3. Tratamiento 1 -------------------------------------------------------------------------------------- 33
Tabla 4. Tratamiento 2 -------------------------------------------------------------------------------------- 33
Tabla 5. Tratamiento 3 -------------------------------------------------------------------------------------- 33
Tabla 6. Listado de material de construcción del biorreactor --------------------------------------- 36
Tabla 7. Resultados del tratamiento pH diferencial --------------------------------------------------- 46
Tabla 8. Contenido de Antocianinas totales en algunas frutas -------------------------------------- 48
Tabla 9. Resultados pH diferencial (mg/100g muestra) ---------------------------------------------- 49
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LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Peso Fresco ............................................................................................................... 63
Anexo 2. Análisis Estadístico °BRIX ...................................................................................... 65
Anexo 3. Curva de Calibración de Azucares Reductores ........................................................ 68
Anexo 4. Análisis Estadístico Azúcares Reductores ................................................................ 69
Anexo 5. pH diferencial ........................................................................................................... 72
Anexo 6. Interaciones entre variable (pH diferencial) ............................................................. 73
file:///C:/Users/Juan%20Camilo/Desktop/TRABAJOS%20DE%20GRADO/Tesis%20kelly/Tesis%2030%20Mayo.docx%23_Toc10110959
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RESUMEN
TITULO: Estandarización del proceso de obtención de antocianinas a partir de callos de
mora (Rubus glaucus Benth) mediante la técnica de suspensiones celulares.
AUTOR: Kelly Johana Díaz Rincón.
PALABRAS CLAVES: Antocianinas, Cultivo in vitro, metabolitos, mora de Castilla, Rubus
glaucus benth.
DESCRIPCIÓN:
La obtención de metabolitos secundarios en la actualidad, han sido importantes en las
industrias, como la de salud y belleza y alimenticia, por tal este estudio tuvo como objetivo,
estandarizar el proceso de obtención de antocianinas a partir de Rubus glaucus Benth, mediante
de la técnica de suspensiones celulares.
El desarrollo metodológico se dividió en tres fases, la primera fue el diseño y construcción del
biorreactor Airlift, el cual tuvo como objeto simular el medio para el cultivo de células vegetales;
la segunda fase consto de la determinación de las condiciones ideales, donde se realizó la
preparación del inoculo, del medio y se definieron los tratamientos a utilizar para poner el
marcha el estudio; la última fase fue la determinación de los metabolitos secundarios, mediante
métodos cuantitativos y cualitativos, obteniendo como resultado en la primera fase, que los
criterios del diseño del biorreactor Airlift, fueron 8,6 cm de diámetro y una altura del tanque de
17,2 cm que determinaron el proceso de diseño esquemático, en la segunda fase, para preparar el
inoculo y medio de cultivo para poner en marcha el biorreactor de acuerdo a las variables de
tratamientos, y en la tercera fase, se obtuvo en el método cualitativo que varias muestra al
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transcurrir el tiempo manifestaron un color verde castaño, típico de la presencia de las
antocianinas; en el método cuantitativo.
Se obtuvo que la variable óptima obtenida en el estudio para la producción de antocianinas,
por el método de pH diferencial, fue con pH de 4,5 a 0,1 vvm de aireación y en un tiempo de 15
días, arrojando como valor medio 9,85 gramos de antocianinas / 0,5 gramos de muestra.
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ABSTRACT
TITLE: Standardization of the process of obtaining anthocyanins from blackberry callus
(Rubus glaucus Benth) by the technique of cell suspensions.
AUTHOR: Kelly Johana Díaz Rincón.
KEY WORDS: Anthocyanins, in vitro culture, metabolites, Mora de Castilla, Rubus glaucus
benth.
DESCRIPTION:
The obtaining of secondary metabolites at the present time, have been important in the
industries, like the one of health and beauty and food, by such this study had as objective, to
standardize the process of obtaining anthocyanins starting from Rubus Glaucus Benth, Through
the technique of cell suspensions.
The methodological development was divided into three phases, the first was the design and
construction of the bioreactor Airlift, which aimed to simulate the medium for the cultivation of
plant cells; the second phase was the determination of ideal conditions, where the preparation of
the innocuous, the environment and defined the treatments to be used to start the study; the last
phase was the determination of secondary metabolites, using quantitative and qualitative
methods, obtaining as a result in the first phase, that the design criteria of the bioreactor Airlift,
were 8.6 cm in diameter and a height of the tank 17.2 cm that determined the process of
schematic design, in the second phase, to prepare the innocuous and culture medium to start the
bioreactor according to the variables of treatments, and in the third phase, to prepare the
innocuousness and culture medium to start the bioreactor according to the treatment variables,
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and in the third phase, was obtained in the qualitative method that several sample when time
elapsed showed a brown green color, typical of the presence of anthocyanins; in the quantitative
method.
It was obtained that the variable optima obtained in the study for the production of
anthocyanins, by the method of differential pH, was with pH of 4.5 to 0.1 vvm of aeration and in
a time of 15 days, throwing as average value 9.85 grams of anthocyanins/0 5 grams of sample.
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INTRODUCCIÓN
Los metabolitos primarios son compuestos químicos que contribuyen al desarrollo y
crecimiento de organismos vivos y se encuentran conformados por elementos como el carbono,
nitrógeno, hidrogeno y oxígeno, los cuales pueden generar productos en las rutas metabólicas,
entre estos se encuentran los carbohidratos, lípidos, péptidos, vitaminas, ácidos nucleicos, que
son generados durante el crecimiento del organismo (Ávalos-García & Pérez-Urrutia, 2009) .
A partir de los metabolitos primarios se generan los metabolitos secundarios, los cuales no
tienen una relación directa con el crecimiento y funciones vitales de los organismos, puesto que
estos compuestos son generados en condiciones de estrés o son una manera de responder a
estímulos ambientales, dichos metabolitos son encontrados en pocas cantidades y se agrupan en
diferentes clases como en terpenos, compuestos fenólicos, glucósidos y alcaloides (Ávalos-
García & Pérez-Urrutia, 2009). Muchas de estas sustancias químicas son generadas en las células
vegetales por algunas especies de plantas y órganos específicos en un determinado tiempo
durante su desarrollo, cabe destacar que la producción de estos compuestos puede estar
relacionados con la forma de adaptarse al medio ambiente y la capacidad de otorgarle pigmentos
a ciertas hojas, flores y frutos (Zhao,J. Davis,LC. Verpoorte, 2005). La producción de
metabolitos ha servido de base para el desarrollo de nuevos estudios biotecnológicos e incluso la
obtención de compuestos naturales que son de alta importancia industrial. Todo esto es debido al
uso de material biológico como: plantas, bacterias, hongos, entre otros, y con el aporte de
enzimas y rutas metabólicas que presentan cada uno de los organismos.
En las últimas décadas se ha implementado la aplicación de cultivo in vitro de tejidos
vegetales que contribuyen a la regeneración y multiplicación de material vegetal libre de
patógenos con mejores características fenotípica, características genéticas específicas, y son
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considerados como una alternativa para la producción de sustancias que son útiles a nivel
comercial en industrias farmacéuticas, alimenticias, agrícolas y químicas (Allccaco, 2016).
Recientes avances en biotecnología, el cultivo de células vegetales se ha ido incrementando
puesto que a través de ellos un 80% de los 30 mil compuestos de producto natural son de origen
vegetal y un 10% de los fármacos principalmente son aislados de plantas, los cuales fueron
considerados por la OMS en el año 2000 como productos esenciales (De la Cruz & González,
2009; S.M.K, 2001). Cabe destacar la alta demanda de dichos productos naturales en el mercado,
han despertado un importante interés en la aplicación de diferentes técnicas para los cultivos de
protoplastos, células, tejidos y órganos vegetales. Otra manera de mantener y propagar células
vegetales es por medio de suspensiones celulares, que se encuentran relacionadas con el manejo
de biorreactores para la producción de metabolitos secundarios debido a que son aplicaciones de
la ingeniería genética que se están implementando de manera tradicional para la optimización
de los procesos y para incrementar la biosíntesis del metabolito deseado (Wilken et al., 2005)
Este documento está estructurado por varios capítulos, donde la primera parte se realiza una
introducción acerca de los metabolitos primarios y secundarios que han servido como base para
estudios e investigaciones. En la segunda parte se hace la descripción, se tiene en cuenta los
antecedentes del problema y justificación; posteriormente, se establecen los objetivos generales y
específicos del proyecto de investigación. Por otra parte, se describe la metodología
implementada que consta de tres fases y en los últimos capítulos se evidencian los resultados,
discusión, conclusiones, bibliografía y anexos.
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1 PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
1.1 Planteamiento del Problema
Según (Chou, Matsui, Misaki, & Matsuda, 2007), a través de los nuevos avances
biotecnológicos se permite la sustitución de productos químicos por compuestos de origen
natural, con el fin de ser utilizados en la industria; debido al gran valor agregado para el
consumo humano como colorantes naturales, bebidas, productos farmacéuticos y alimenticios
que pueden tener un importante impacto sobre la salud del consumidor (Bash, 2015) .
Recientemente, se han ido utilizando colorantes naturales del grupo de los flavonoides
conocidos como antocianinas, los cuales son pigmentos hidrosolubles y son los encargados de
conferir el color azul o rojo a las hojas, flores y frutos .La función de estos compuestos
orgánicos con características propias de grupos fenólicos en las plantas es la atracción de
polinizadores para la posterior dispersión de semillas y la protección contra los efectos de la
radiación ultravioleta e incluso contra la contaminación viral y microbiana (Garzón, 2008)
Existen dos procedimientos que se emplean para la producción de antocianinas. Una de ellas,
es la extracción de estas sustancias por procesos químicos, las cuales utilizan solventes
acidificados acuosos como acetonitrilo, etanol, metanol, entre otros, que en ocasiones generan
problemas de toxicidad en los productos alimenticios, riesgos en la salud del trabajor por el
desprendimiento de gases inflamables, contaminación al medio ambiente, e incluso si los
extractos contienen materiales lipídicos, el ácido puede causar hidrólisis parcial de las fracciones
de las antocianinas (Bash, 2015). Estudios realizados han encontrado que colorantes sintéticos
tales como el rojo Nº 40 y rojo Nº 2 son responsables de la toxicidad en algunos alimentos,
medicamentos y cosméticos (Garzón, 2008) y actualmente se encuentran prohibidos en varios
paises como: Japon, suecia, Noruega y Austria , entre otros. Por otro lado, se han reportado la
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influencia de los colorantes artificiales en casos donde a niños de edad escolar se les considera
un mal neuronal agudo debido a modificaciones en la hiperactividad (Breakey, C, & Connell,
2002; Garzón, 2008; Mora, Santos, & Campos, 2000).
Recientemente, el segundo método aplicado es por medio de técnicas biotecnológicas
mediante cultivos de células y tejidos, que se han utilizado con el fin de producir dichos
metabolitos secundarios (Vanisree & Tsay, 2007). Para llegar a la obtención de estos han
trabajado con variables condicionadas mediante, la incorporación de equipos como reactores, los
cuales brindan unas características de interacción especial al medio de cultivo (Heras, Alvis, &
Arrazola, 2013). Sin embargo, el uso de dichos compuestos antociánicos ha sido limitado debido
a la baja disponibilidad de material vegetal y poca estabilidad que tienen ante varios factores
como el pH, temperatura, oxígeno.
Uno de los cultivos de mayor producción en Santander es la mora de castilla (Rubus glaucus
Benth), puesto que posee una cantidad importante de antocianinas, aproximadamente 5000mg
Kg^(-1) (Heras et al., 2013), el cual representa un gran potencial económico en la industria
farmacéutica y alimenticia, por su capacidad antioxidante que contrarresta la formación de
radicales libres.
Actualmente, en Colombia no se ha hecho un modelo estandarizado de aprovechamiento de
las antocianinas en las industrias para la producción de productos alimentarios e incluso para el
desarrollo de diferentes estudios de investigación utilizando células vegetales, por tal se han de
realizar estudios que prueben las efectividades aleatorias de las variables como el pH, la
temperatura, la efectividad de los reactores en cuanto a la transferencia de oxígeno, para tener
una eficacia certera en el proceso. Teniendo en cuenta lo anterior se presenta la siguiente
pregunta de investigación. ¿Cuál es el efecto del pH y la transferencia de oxígeno en la
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producción de antocianinas a partir de los callos de Rubus glaucus Benth utilizando la técnica de
suspensión celular en un biorreactor airlift?
1.2 Justificación
Colombia es uno de los mayores productores de cultivos frutales (Sigarroa-Rieche & García-
Delgado, 2011), entre ellos se encuentra la mora de castilla (Rubus glaucus benth); Este tiene
gran auge en Colombia, la mayor parte de su producción se encuentra especialmente en los
departamentos de Cundinamarca, Santander, Antioquia, Nariño y Boyacá (DANE, 2012)
En el departamento de Santander se tiene un rendimiento de 10,7 Ton/ha, siendo el segundo
departamento con mayor producción a nivel nacional (informe del ministro de agricultura y
desarrollo rural en marzo del 2015), debido a que genera grandes ingresos, empleo rural, oferta
alimentaria e insumos para la agroindustria.
El compuesto generado por las células vegetales, denominado antocianinas se han obtenido a
partir de varios métodos; donde se utilizaron frutos como: bayas (zarzamoras, mora, cerezas,
fresas), repollo morado, rábano, maíz morado, entre otros, en el que demuestran que estos
pigmentos antociánicos tienen efectos terapéuticos, anticancerígenos, antitumorales,
antiinflamatorios, antidiabéticos (Garzón, 2008; Kong, Chia, Goh, Chia, & Brouillard, 2003;
Longo & Vasapollo, 2006; Todaro et al., 2009), de igual forma contribuye al mejoramiento en la
agudeza visual y del comportamiento cognitivo. (Wang, Qing & Bi, 2000), reporta que varios
alimentos con altas cantidades de antocianinas contrarrestan los radicales libres.
Teniendo en cuenta esta situación y dada la importancia industrial del cultivo de mora de castilla
en Santander, se desarrolló este trabajo de investigación con el fin de estandarizar el proceso de
obtención de antocianinas a partir de la técnica de suspensiones celulares mediante el uso de
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biorreactores de tipo airlift , buscando encontrar un método óptimo del proceso industrial de estos
compuestos antociánicos los cuales provienen de origen biológico, con métodos sencillos, y que
proliferen la reproducción de la célula vegetal con un costo de inversión industrial razonable,
sustituyendo así la síntesis química, que contribuye a realizar procesos y extracciones eficientes
de estos colorantes naturales e incluso aportando a nuevos conocimientos y protocolos que
servirán como guía para estudios posteriores. Así mismo, este trabajo ayuda a la formación de
recurso humano en el área de biotecnología vegetal. Es importante resaltar que la investigación
realizada será pionero en aplicación de dicha técnica a partir de células callogénicas de mora de
castilla y favorece al desarrollo de procesos en industrias farmacéuticas, cosméticos, alimenticios
y permite ser referente en el Departamento de Santander.
Además de lo mencionado anteriormente, esta investigación permite poner en práctica, la
información recopilada durante todo el ciclo propedéutico de la microbiología industrial,
obteniendo una mayor experiencia para enfrentar el campo laboral, en diferentes mercados, como
lo puede ser la industria estética, alimenticia entre otras, propias donde se ejerzan las ramas de
acción como microbióloga, con experiencia en métodos óptimos de obtención de antocianinas en
un ambiente ecológico controlado.
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2 MARCO TEÓRICO
Algunas de las especies vegetales tienen la capacidad de sintetizar metabolitos secundarios y
utilizarlos como mecanismo de defensa ante patógenos, es decir, que pueden actuar como
pesticidas naturales (Garzón, 2008), Cada uno de los metabolitos sintetizados por plantas
contiene un grupo fenol en su estructura el cual está constituido por un anillo aromático
(benceno) unido a un grupo hidroxilo (OH). Según (Shahidi & Naczk, 2004) se han identificado
más de 8,000 compuestos fenólicos presentes en plantas con estructuras químicas variadas y
rutas metabólicas diferentes y dentro del grupo de los flavonoides se encuentran las antocianinas,
las cuales hacen parte de uno de los pigmentos principales que contiene la mayoría de las plantas
y frutos. Hasta el momento se han reportado aproximadamente 500 tipos de antocianinas, sin
embargo, solo seis tipos han sido las más estudiadas. Por lo tanto, es importante resaltar que cada
uno de estos metabolitos secundarios es una fuente ideal para la producción de fármacos,
agroquímicos, bebidas, saborizantes, colorantes naturales y aditivos alimentarios (MJ & JA,
1988; Zhao,J. Davis,LC. Verpoorte, 2005). Los compuestos fenólicos son uno de los metabolitos
secundarios más estudiados que seguirán haciendo parte de muchas de las investigaciones debido
a sus propiedades farmacéuticas y nutracéuticas (Alberto, Salinas-Moreno, Ovando-Cruz,
Arteaga-Garibay, & Martínez-Peña, 2015).
2.1 Cultivo in vitro
Es una técnica utilizada en la biotecnología moderna que permite la cultivación de tejidos
vegetales, células o protoplastos de diferentes plantas de una manera aséptica (Villalobos &
Thorpe, 1991) y generando plantas libre de enfermedades, también ayudando en la conservación
de germoplasma o banco de semillas, desarrollo genético y la capacidad de generar metabolitos
primarios y secundarios que son de alto valor medicinal en productos farmacéuticos e
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industriales como en alimentos y cosméticos (Ramachandra, R. Ravishankar, 2002). Estudios
donde se han determinado las secuencias promotoras, factores de transcripción y genes
reguladores que contribuyen en la biosíntesis de las antocianinas han sido de gran apoyo para
la producción in vitro de dicho metabolito secundario (Allan, Hellens, & Laing, 2008; Shimada,
Otsuki, & Sakuta, 2007; Streisfeld & Rausher, 2009)
2.2 Cultivo de células vegetales en suspensión
Los cultivos en suspensión son un tipo de cultivo in vitro que se realiza con el fin de producir
metabolitos de interés contando con la ventaja de llevar a cabo un mejor control de variables
como la temperatura, pH, oxígeno disuelto y entre otras (Schalatmann, Hoopen, & Heijnen,
1996) . Para llevar a cabo el sistema de suspensiones celulares se deben tener en cuenta 3
aspectos fundamentales, la primera es el uso de explantes pequeños libre de patógenos, medio de
cultivo y condiciones ambientales o para que se pueda dar el crecimiento óptimo de la biomasa y
producción de metabolitos secundarios.
El sistema de cultivos celulares en suspensión consiste en la utilización de callos friables
(mayor ritmo de división celular) que se encuentran suspendidos en un medio en constante
movimiento y suministro de nutrientes, que en algunos casos se necesitan suplementos
orgánicos, aminoácidos, auxinas como la 2,4D, entre otros. Existen tres tipos de sistemas de
cultivo: cultivo cerrado, cultivo continuo cerrado y continuo abierto (Szabados, Mroginski, &
Roca, 1991).
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2.3 Metabolismo en Células Vegetales
En las células vegetales, el metabolismo esta dado diferente a otros organismos, donde el
conjunto de reacciones químicas que ocurren en las células con gran porcentaje de carbono y
nitrógeno, son la fuente de energía de un determinado organismo; a diferencia de esto, las células
vegetales destinan cantidades determinadas, de mayor amplitud que otras, incorporando Carbono
a sus células para realizar la síntesis de moléculas orgánicas y llevar a cabo los procesos
fotosintéticos, a estos procesos se les denominan metabolitos primarios y metabolitos
secundarios (Orozco, Hoyos, & Arias, 2002).
2.3.1 Metabolitos Primarios
Son denominados así, a los compuestos como los hidratos de carbono, los aminoácidos,
ácidos grados y orgánicos que forman parte del crecimiento, desarrollo y las funciones esenciales
de las células vegetales; estos son esenciales en los procesos de formación de proteínas, ácidos
nucleicos, formación de cadenas azucaradas por tal se encuentran en todas las especies vegetales
sin excepción alguna (Montoya, Arias, Aguirre, Angarita, & Restrepo, 2019)
2.3.2 Metabolitos Secundarios
Estos son encargados de funciones no esenciales, lo contrario a los metabolitos primarios, más
sin embargo son de igual importancia, ya que intervienes en los procesos interactivos de la
ecología, es decir entre el organismo con su entorno natural (García & Carril, 2011).
Su función biológica radica, en la importancia de los subproductos que de estos se obtienen,
siendo un atractivo para las industrias de la estética por formación de ceras, saborizantes entre
otras, razón por la cual imperan las técnicas de separación de estos de las plantas, estos también
se han estudiado en la botánica, como productos medicinales de origen antibiótico, insecticida,
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de acuerdo al rol y el contexto que desempeñe en la planta y su entorno ecológico. (Montoya,
2008)
2.4 Fenoles
Estos compuestos fenólicos son los más destacados debido a sus propiedades como
antioxidantes naturales y como uno de los principales metabolitos secundarios vegetal (Creus,
2004). Este compuesto se encuentra dividido en 3 grupos: flavonoides, ácidos fenólicos y
polifenoles (Porras, Loaiza & López, 2009). Teniendo en cuenta su estructura química dichos
compuestos fenólicos tiene varios tipos de moléculas que pueden ser simples como los ácidos
fenólicos hasta polímeros complejos de alto peso molecular como por ejemplo los taninos
condensados o proantocianidinas los cuales se ha demostrado que posee la capacidad de
neutralizar radicales libres (OH) y también actúa como inhibidor no competitivo de la enzima
productora de radicales libres como la xantina oxidasa (Fine, 2000).
Entre este grupo fenólico se puede encontrar los flavonoides que está constituido por
compuestos hidroxilos fenólicos y con propiedades antagónicas de hierro y metales pesados, lo
que les otorga un papel importante como antioxidante ante cualquier daño oxidativo y varias
enfermedades.
Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente se han ido implementando estudios para
realizar la cuantificación de los metabolitos secundarios que son derivados de los grupos
fenólicos, de esta manera evaluando diferentes propiedades que contienen dichos compuestos, en
las cuales la más destacada es sus propiedades como antioxidantes (Gil, Barberán, Hess, &
Kader, 2002).
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2.5 Ácidos fenólicos
Los ácidos fenólicos son moléculas sencillas, provenientes de diferentes especies vegetales y
son encontrados en los alimentos como ácido gálico, p-hidroxibenzoico, vainillinico y vainillina
(Martínez, 2000). Según shahidi y Naczk en el 2004, hacen énfasis sobre la presencia de los
ácidos fenólicos en frutas y hortalizas que se encuentran principalmente en forma libre, pero que
en algunos cereales son encontrados en forma conjugada o ligada (liu,2007). Estudios realizados
se han encontrado que en extractos derivados de la flor de Jamaica (Hibiscus Sabdariffa) y otras
variedades, son una fuente importante de ácidos fenólicos (libre o conjugados) y otro grupo de
los flavonoides con propiedades antioxidantes(Reyes,2015).
2.6 Polifenoles
Este grupo de sustancias químicas son metabolitos secundarios sintetizados por plantas por
medio de dos rutas principales que proporcionan diferentes compuestos; la ruta del ácido
shikímico y la de los poliacetatos. Dentro este grupo de los Polifenoles, lo más destacados son:
estilbenos, lignanos, alcoholes fenólicos, flavonoides y ácidos fenólicos (Bravo, 1998).
Dicho compuesto se divide en flavonoides o no flavonoides y es uno de los compuestos más
sintetizados en la mayoría de los vegetales, frutas, entre otras. En su estructura química los
Polifenoles tienen uno o más anillos aromáticos a los que pueden unirse diferentes grupos
sustituyentes como los hidroxilo (OH), carboxilo y metoxilo e incluso pueden formar
copigmentos uniéndose a las antocianinas que son pertenecientes al grupo de los flavonoides;
por lo tanto, ambos compuestos están relacionados con sus propiedades como antioxidantes y
efectos protectores ante situaciones de estrés ambiental como hídricos, luminoso, etc (Quiñones,
2012).
-
16
2.7 Flavonoides
El consumo de los flavonoides en la ingesta diaria se reporta entre 20 mg y 500 mg por
medio de frutas, vegetales, manzana, entre otros; hasta el momento se han registrado 9,000 tipos
de flavonoides presentes en plantas (Rakers, 2014). Este pigmento natural es conocido también
como bioflavonoide y consta en su estructura química de varios anillos aromáticos
denominados A, B y se encuentran unidos a un anillo C que contiene 3 carbonos, (Isoda, 2014),
los cuales son biosintetizados por la ruta metabólica del ácido shikímico. Dependiendo del estado
de oxidación, el enlace entre el anillo aromático B al C y el grupo funcional del anillo C, se
encuentran clasificados en varias subclases (shahidi y Naczk, 2004).Los flavonoides más
comunes en vegetales son los flavonoles, antocianidinas, flavanoles, isoflavonas,catequinas,
charconas y flavandioles(Hertog et al.,1992).
2.8 Antocianinas
Las antocianinas son pigmentos solubles en agua y son los encargados de conferir el color
azul o rojo a las hojas, flores, frutos y se encuentran localizadas en las vacuolas de las células
vegetales. Estos pigmentos pertenecen al grupo de los flavonoides y su función en las plantas es
la atracción de polinizadores para la posterior dispersión de semillas y la protección contra los
efectos de la radiación ultravioleta e incluso contra la contaminación viral y microbiana (Garzón,
2008).
Las seis antocianinas más comunes en las plantas son: la pelargonidina(Pg), peonidina(Pn),
Cianidina(cy),malvidina(Mv),Petunidina(Pt),delfinidina (Df) y cada una de las antocianinas se
diferencia y es nombrada según la posición , cantidad de hidroxilos(OH) presentes en el anillo
B en las posiciones 3,4 y 5 (imagen 1)(Kong et al ., 2003) y también de los azucares que van
unidos a la molécula aglicona como la D-glucosa, D-galactosa,L-ramnosa,L-arabinosa,D-xilosa
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17
y D-glucurónico. En las frutas se encuentran antocianinas como son los 3-monoglucósidos de
Cianidina, delfinidina, peonidina, pelargonidina y Petunidina, también la Cianidina-3 galactósido
y la Cianidina 3-arabinósido (Robards, 1999).
La antocianinas están presentes en muchos de los cultivos de frutas y hortalizas de mayor
demanda en el mercado , que representa un gran potencial económico en la industria
farmacéutica y alimenticia, principalmente por su capacidad antioxidante que contrarresta la
formación de radicales libres y a su vez, son utilizados como suplemento alimenticio, en bebidas
y colorantes naturales (Aguilera, 2011).Es por esto que el interés en los pigmentos antociánicos
se ha incrementado recientemente debido a sus propiedades farmacológicas y terapéuticas
(Astrid, 2008).
Fuente: (Garzón Gloria A., 2008)
Figura 1. Estructura básica de las antocianinas
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18
Tabla 1. Sustituyentes presentes en el anillo B de las Antocianinas
Fuente: (Garzón Gloria A., 2008)
2.9 Biosíntesis de las antocianinas
La biosíntesis de las antocianinas es generada a través de dos precursores principales como la
fenilalanina y el acetato, las cuales son elaboradas en el citoplasma y acarreadas en la vacuola
uniéndose a una proteína, generando inclusiones citoplasmáticas ( Zhang et al., 2004).
Según Delgado en el 2000, la biosíntesis general de las antocianinas (Figura 2) es
biosintetizados a través de la ruta del ácido malónico en el anillo A, por medio de la
condensación de tres moléculas de malonil-COA y en el anillo B se produce a través de la ruta
del ácido Shikiquimo que produce la fenilalanina por la actividad de la enzima fenilalanina
amonio liasa que posteriormente pierde una molécula de amonio (NH4+) para transformar en
acido Para-cumárico.
La condensación de Para-cumaril-COA ocurre con tres moléculas de malonil COA que se
transforma en una chalcona de 15 Carbonos con la ayuda de la enzima chalcona sintasa, luego
por isomerización se vuelve en una flavona. Por último, dicha molécula (flavona) hace parte del
Aglicona Sustituyentes Max ג (nm)
R1 R2 Espectro visible
Pelargonidina H H 494 ( naranja)
Cianidina OH H 506(naranja-
rojo)
Delfinidina OH OH 508(azul -rojo)
Peonidina OCH3 H 506(naranja-
rojo)
Petunidina OCH3 OH 508(azul-rojo)
Malvidina OCH3 OCH3 510(azul-rojo)
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19
subgrupo de flavonoides, se modifica en antocianidina por hidroxilación en el carbono 3 y
ocurre la reacción de deshidratación se puede estabilizar ya sea por glicosilación del heterociclo
o por metilaciones de OH después de la alcanoilación.
Figura 2.Ruta general de la biosíntesis de las antocianinas
Fuente: (Delgado,2000)
2.10 Factores que afectan la estabilidad de las antocianinas
Existen diferentes factores que afectan la estabilidad de los pigmentos antociánicos debido a
que es un compuesto inestable que se degrada por cambios en el pH, oxígeno, luz, temperatura,
ácido ascórbico, reguladores de crecimiento y oxígeno que causa bajos rendimientos y
degradación de los pigmentos.
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20
2.11 Oxígeno y ácido ascórbico
Estos dos compuestos influyen en la estabilidad de las antocianinas debido a que la mayoría
de las frutas contienen ácido ascórbico y dependiendo también de las condiciones (luz, madurez)
y disponibilidad de oxígeno en las que se encuentre dicha fruta va a provocar una degradación
de las antocianinas a causa de la formación de peróxido de hidrogeno durante la oxidación.
2.12 PH
La estructura de las antocianinas se puede ver afectadas por cambios en el pH, en algunos
casos dichas transformaciones son reversibles a medida que el pH varia debido a que estos
compuestos antociánicos son más estables a medios con pH acido, de esta manera se mantiene la
estructura y coloración roja del ión flavilio , es por ello que son utilizados como colorantes
naturales en alimentos ya que son más estables a pH que estén por debajo de
3.5(Kendrick,2012).Sin embargo, cuando se someten a pH básicos o neutros la coloración se ve
afectada puesto que el ion flavilio es sensible a reacciones de tipo nucleofílico por parte del agua,
generando un equilibrio entre la forma pseudobase carbinol (incolora) y chalcona (amarilla)
(Hutchings,1999).
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21
Figura 3. Efecto del pH en las antocianinas
Fuente: (Suganya et al., 2012)
2.13 Temperatura
Durante el procesamiento y almacenamiento de las antocianinas, la temperatura es un factor
influyente en la estabilidad de dicho compuesto, debido a que a temperaturas que sobrepasan los
40°C causan la ruptura hidrolítica que genera la formación de chalconas y por otro lado la
hidrolisis del enlace glucosidico que provoca la formación de la aglicona (Timberlake,2009).
2.14 Iluminación
Se hace referencia a que la luz es un factor que desestabiliza la pigmentación de las
antocianinas debido a que la sustitución del hidroxilo en C-5 que genera a los pigmentos
antociánicos mayor sensibilidad a la fotodegradación. No obstante ,la copigmentación que es un
fenómeno de interacción molecular que tienen las antocianinas con otro copigmentos que
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22
pueden ser los flavonoides, alcaloides, ácidos orgánicos, nucleótidos, polisacáridos,
aminoácidos, metales y antocianinas ,sirven para evitar ataques nucleofílicos del agua que genera
la decoloración de dicha sustancia.
Además, algunos autores mencionan que ocurren asociaciones donde las antocianinas
elaboran copigmentos con algunos compuestos orgánicos o iones metálicos como el cobre,
aluminio y hierro que generan cambios en la intensidad y coloración, lo que puede llegar a ser
una buena alternativa para llevar a cabo la estabilización del color, influyendo también en
cambios de longitud de onda y absorbancia (Boulton, 2001).
2.15 Biorreactores
Un biorreactor es un sistema que se utiliza para diferentes procesos industriales. Por medio de
este equipo se cultivan microorganismos (levaduras, bacterias, células animales, células
vegetales) y se mantienen en unas condiciones controladas dependiendo de los requerimientos y
según el tipo de célula o tejido a trabajar.
Actualmente, los biorreactores son de gran utilidad para el desarrollo de estudios por medio
de la ingeniería de tejidos, implementando recipientes que sirvan como biorreactor que
contengan sensores y controladores para mantener diferentes variables (pH, temperatura,
oxígeno, velocidad de agitación, concentración, etc) y se tenga una buena eficiencia bajo
condiciones óptimas.
Dentro de los procesos y metodologías técnicas de implementación para los cultivos de
células vegetales, los biorreactores son un ítem fundamental de la industria ya que con la
mediación de estos se pueden obtener metabolitos secundarios de una determinada especie
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23
(Perez-Alonso & Jiménez, 2011), a continuación se presenta la tabla 2, donde se evidencia las
principales consecuencias del uso de los biorreactores en determinados procesos.
Tabla 2. Consecuencias del Biorreactor
Características Células
Microbianas
Células Vegetales
Diferenciadas Consecuencias en el biorreactor
Tamaño 2-10 mm 10-200 mm Rápida sedimentación, mayor
sensibilidad al corte
Células
Individuales
Pueden
Obtenerse forman agregados Rápida sedimentación,
Velocidad de
Crecimiento
Alta
td 1-2 horas
Baja
td 2-5 dias
Largos procesos, problemas para
mantener esterilidad
Densidad del
Inóculo Pequeño 5-20 %
Problemas de manipuleo.
Dificulta la posibilidad de
escalado
Sensibilidad al
esfuerzo de
corte
No sensitivo sensitivo / tolerante Disminución de la velocidad de
agitación
Aireación Alta Baja Baja demanda de oxígeno,
bajo Kla
Fuente: (Universidad Veracruzana, 2018)
El diseño de los Biorreactores forma parte de la bioingeniería, siendo estos procesos sencillos
de asimilar, pero complejo al momento de diseñar, puesto que la eficiencia de estos debe estar en
un rango de confianza para los cultivos de análisis, es decir sus condiciones ambientales han de
ser estables, como los flujos de gases y otras variables, las cuales se han de monitorear
constantemente.
Clasificación de los Biorreactores
Los biorreactores se pueden clasificar en operativos, biológicos y operativo-biológico, los
primeros se clasifican en discontinuo, semicontinuo y continuo, este tipo de clasificación aplica
para todas las clases de reactores, tanto químicos como biológicos y dependen de los parámetros
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24
de atributos de los cultivos de análisis. Los reactores biológicos tienen como característica
principal su interacción con el entorno para poder determinar el crecimiento y desarrollo del
cultivo de estudio, estos se clasifican en anaeróbico, facultativo y aeróbico.
2.16 Biorreactor airlift
En la literatura se ha descrito que existen varios tipos de biorreactores que pueden ser con:
agitación neumática, columna de burbujeo y tipo airlift. El biorreactor airlift es el mejor para
trabajar con cultivos de células vegetales en suspensión (Orozco, 2002) generando un buen
mezclado y poco estrés de corte sin perjudicar la viabilidad celular. El mecanismo es similar al
biorreactor de columna de burbujas, a diferencia de que el biorreactor airlift contiene un tubo
draft que puede ser interno o externo y de esta manera crea dos zonas (ascendente y descendente)
por lo que es esencial el uso de una corriente de aire en el sistema que homogenice los nutrientes
necesarios . El aire es inyectado en el fondo del biorreactor generando un fuerte impulso y
burbujas en el medio, que posteriormente producirá una corriente de flujo hacia arriba y al llegar
el medio a la superficie del biorreactor pierde velocidad debido a la liberación de la burbuja,
aumentando densidad y por gravedad vuelve a fluir hacia abajo con poca cantidad de aire
disuelto y haciéndolo recircular (Barrientos, 2014).
El biorreactor Airlif, utilizado en técnicas de obtención de metabolitos secundarios ha tenido
resultados favorables debido a que existe una sensibilidad frente al esfuerzo de corte de las
células vegetales en suspensión (Camargo, 2005). Este además proporciona la cantidad de aire
necesaria para poder remover el calor metabólico obtenido, en el cual también hay presente
metabolitos volátiles ocluidos entre las moléculas, incluye este también dentro de sus ventajas el
efecto regulador de humedad y de acuerdo a su configuración geométrica, recircula el medio de
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25
cultivo otorgando así mayor eficiencia en cualquier tipo de fermentación que se realice (Orozco
et al., 2002).
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26
3 MARCO REFERENCIAL
Para el presente documento se tomaron como base, una serie de artículos científicos cuyas
variables se asemejan a los factores que pueden influir en la estabilidad de las antocianinas, las
cuales son el objeto de este estudio, mediante la aplicación de diferentes metodologías, con otros
frutos, cereales y vegetales, que sirven como modelo estudio.
Para llevar a cabo la obtención de antocianinas, se han ido desarrollando investigaciones
utilizando diferentes tipos de vegetales y frutas, entre ellas se encuentran los arándanos. Según el
artículo de (Zapata et al., 2014), donde se realizó una optimización de extracción de
antocianinas por medio de solventes acidificados como: el ácido cítrico, etanol al 1%, también
utilizando proporciones de materia prima y solvente e incluso con condiciones de temperatura
36±1ºC y tiempo de extracción de 2 horas; la cantidad de antocianinas obtenidas fue de 879.0±
12.9 mg Cianidina-3-glucósido/100 mL. A manera de conclusión los investigadores resaltan que
todas estas variables fueron tomadas en cuenta para mitigar cambios estructurales que afectan la
estabilidad de las antocianinas, lo que conlleva a realizar extracciones eficientes. Un estudio
similar fue implementado con maíz morado por (Gutierrez et al., 2009) utilizando como solvente
de extracción el etanol al 20% a un pH 2, además teniendo en cuenta la temperatura y tiempo
de extracción; se reporta que las condiciones óptimas de extracción se dieron en tiempos que
van desde 120 y 240 minutos a una temperatura de 75ºC.
Otro estudio relacionado con esta temática es el realizado por (Guillén-Sánchez, Mori-
Arismendi, Luz, & Paucar-Menacho, 2014) donde se hace referencia del alto contenido de
antocianinas y compuestos fenólicos que contiene el maíz morado y muchos de los beneficios
que aportan debido a sus propiedades como antioxidantes naturales . Además, (Moreno-Loaiza,
Paz - Aliaga, Mamani-Choquepata, Mamani-Quispe, & Manchego-Rosado, 2013) utilizaron
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27
ratas de laboratorio y demostraron que la suplementación dietaría con arándanos y fresas puede
contribuir a la mejora de funciones neurales y comportamiento cognitivo.
Como antecedentes a este estudio está el trabajo realizado por (Saboya Moreno, 2017),
llamado : extracción química de antocianinas del fruto de Acai Colombiano (Euterpe Oleracea
Mat) , donde se evaluó la extracción de antocianinas a partir de dicho fruto cultivado en la zona
del pacifico Colombiano, en esta investigación se demostró que las condiciones con las que se
logra una mayor extracción son a temperaturas de 30 ˚C en soluciones acuosas de etanol al 96%
y a un pH 3, obteniéndose 0,49 mg de antocianinas /100 g fruto . Agregando a lo anterior, se
determina que el factor más importante para la estabilidad química de las antocianinas y su
actividad antioxidante es el pH.
Por otra parte, (Castañeda-Sánchez & Guerrero-Beltrán, 2015), en el que se hace énfasis a las
frutas y hortalizas de color rojo presentan un alto contenido de pigmentos, destacando las
antocianinas . Se realiza una descripción de su actividad antioxidante debido a que disminuye el
daño oxidativo causado por radicales libres y se relacionan con la actividad cancerígena,
antiinflamatoria y antitumoral. También se hace énfasis en los factores que pueden afectar la
estabilidad de las antocianinas como el pH, temperatura y luz.
Otra de las investigaciones relacionadas, es la optimización del proceso de extracción de
antocianinas y evaluación de la capacidad antioxidante de Berenjena (Solana melonera L),
realizado por los investigadores (Heras et al., 2013) donde se tuvo en cuenta la concentración del
etanol al 1%, el ácido ortofosfórico entre 50 a 90% v/v y el tiempo de extracción (4-12h) a una
temperatura que va desde 30 a 60ºC . Los resultados obtenidos, demostraron que las condiciones
ideales para llevar a cabo la extracción de antocianinas fueron utilizando un 50% del etanol en un
-
28
proceso de 4 horas y a una temperatura de 30ºC, evidenciando 62 mg/100g de antocianinas
provenientes de Berenjena.
Otro estudio elaborado por (Montoya et al., 2019), el cual tuvo como objetivo determinar los
aspectos ingenieriles para el cultivo in vitro de células vegetales para la producción de
metabolitos secundario, obteniendo como resultado toda una recopilación de fuentes de
información secundaria, que compete a los procesos que se llevan a cabo en la producción de los
metabolitos, llegando a la conclusión que con el pasar de los años, nuevas tecnologías y métodos
se han implementado como aporte al estudio de tejidos de células vegetales, más sin embargo
son poco los grupos que trabajan en esta área investigativa, por tal los autores sugieren renovar
constantemente los métodos explicados en el documento.
Un último artículo a tener en cuenta en el presente estudio, fue realizado por los
investigadores del Servicio Nacional Aprendizaje de Rionegro, Colombia (Echeverri et al.,
2017), en el cual se elabora una guía de los métodos de extracción de antocianinas de la Gulupa,
los usos y subproductos que surgen a partir de ella, por tal el libro se divide en 7 partes
específicas, iniciando por mencionar el origen y ecología de la Gulupa, seguidamente los autores
explican la composición molecular y química de las antocianinas, y finalizando con una
evaluación de los procesos de extracción de la gulupa, proponiendo con este un modelo de
producto final para la venta al público.
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29
4 HIPÓTESIS
4.1 Hipótesis Nula
El pH y la transferencia de oxígeno no genera un efecto en la producción de antocianinas a
partir de los callos de Rubus glaucus Benth utilizando la técnica de suspensión celular en un
biorreactor airlift
4.2 Hipótesis Alternativa
El pH y la transferencia de oxígeno genera un efecto en la producción de antocianinas a partir
de los callos de Rubus glaucus Benth utilizando la técnica de suspensión celular en un
biorreactor airlift
-
30
5 OBJETIVOS
5.1 Objetivo general
Estandarizar el proceso de obtención de antocianinas a partir de Rubus glaucus Benth (mora
de castilla) por medio de la técnica de suspensiones celulares.
5.2 Objetivos específicos
a. Construir un Biorreactor tipo airlift para la producción de antocianinas.
b. Determinar las condiciones ideales del proceso para la obtención de antocianinas de
Rubus glaucus Benth a partir del biorreactor airlift.
c. Cuantificar preliminarmente la cantidad de antocianinas generadas mediante métodos
cualitativos y cuantitativos.
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31
6 METODOLOGÍA
6.1 Tipo de Investigación
La investigación fue experimental porque el investigador hizo énfasis en los procesos de
observación y práctica en el laboratorio para luego sistematizar los resultados y la información
obtenida de cada una de las pruebas realizadas propias de la aplicación del método científico
(Bernal, Cesar, 2010) para llegar a la obtención de las antocianinas a partir de los callos de mora
de castilla (Rubus glaucus benth), mediante la alteración de las variables simulando diversas
condiciones ambientales, dentro de un sistema controlado.
6.2 Población y Unidad de Muestra
Población: Mora de castilla (Rubus glaucus Benth)
Muestra: Callos de mora
6.3 Fase de Investigación
Para el presente estudio se plantearon una serie de actividades que llevaron a cumplir cada
uno de los objetivos específicos mencionados anteriormente, por tal se hicieron 3 fases para
obtener los resultados de cada una, y culminar el objetivo general.
6.3.1 Fase I: Construcción del Biorreactor AIRLIFT
Se construyó un biorreactor airlift tomando como guía del estudio realizado por Bedoya, J.
2010 y Acuña, 2004, para el proceso de obtención de metabolitos secundarios por medio de
suspensiones celulares.
6.3.2 Fase II: Determinación de las Condiciones Ideales para la Obtención de
Antocianinas.
Para la realización de esta fase se plantearon las siguientes actividades:
-
32
a. Preparación del inóculo
Se utilizaron callos maduros (4 semanas) de Rubus glaucus Benth procedentes del laboratorio
de tejidos vegetales de la Universidad de Santander. A estos tejidos se le realizó un proceso de
desinfección de acuerdo al estandarizado por (Galvis, K y Chacín, 2016). Posteriormente se
dejaron en agua destilada estéril hasta la puesta en marcha del biorreactor airlift. La cantidad de
callo que se usó como inóculo fue de 0,5 g de callo por tratamiento.
b. Preparación del medio de cultivo líquido para la obtención de antocianinas
Se trabajó a partir del medio basal Murashige and Skoog (MS) el cual fue formulado y
estandarizado en el laboratorio de tejidos vegetales mediante un proyecto de tesis de grado
(Galvis, K y Chacín, C, 2016).
c. Puesta en marcha del Biorreactor Airlift con suspensiones celulares de Rubus glaucus
Benth
Las células de mora de castilla se cultivaron en el biorreactor de 1 litro, con un volumen
efectivo de trabajo de 400ml, y se adicionó el inóculo establecido (callos). La siembra de cada
uno de los callos se hizo bajo condiciones de asepsia utilizando una cámara flujo laminar a
temperatura de 20˚C, realizando 9 ensayos en 3 diferentes tratamientos de pH y transferencia de
oxígeno.
d. Medición de variables en cada tratamiento
Para determinar el mejor rendimiento en los tratamientos se realizó la medición de las
siguientes variables de acuerdo a las especificaciones de las tablas 3, 4 y 5 utilizando diferentes
pH y transferencia de oxígeno.
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33
Tabla 3. Tratamiento 1
pH Transferencia de
Oxigeno
(vvm)
4.5 Sin oxigeno
4.5 0,1
4.5 0,3
Fuente: La Autora
Tabla 4. Tratamiento 2
pH Transferencia de
Oxigeno
(vvm)
3 Sin oxigeno
3 0,1
3 0,3
Fuente: La Autora
Tabla 5. Tratamiento 3
pH Transferencia de
Oxigeno
(vvm)
4.5 Sin oxigeno
4.5 0,1
4.5 0,3
Fuente: La Autora
Se realizó seguimiento en los tratamientos previamente nombrados, analizando las variables
de peso fresco, grados BRIX y azúcares reductores, con el fin de determinar cuál de estos es el
más óptimo para la obtención de antocianinas.
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34
6.3.3 Fase III: Métodos Cuantitativos y Cualitativos
i. Separación de biomasa al extracto
Para la separación, se realizó un proceso de filtración convencional del extracto crudo producto
del proceso, para llevar a cabo la cuantificación de compuestos antociánicos.
e. Ensayo Cualitativo de Antocianinas.
Se adicionó a 1 mL del medio de cultivo, NaOH al 20% hasta llegar a obtener un pH de 9, para
luego ser analizadas visualmente, para determinar la coloración especifica que indicara presencia
de antocianinas en el medio.
ii. Ensayos para la cuantificación de antocianinas
Se utilizó el siguiente método para llevar a cabo la cuantificación preliminar de antocianinas:
i. Cuantificación de antocianinas por pH diferencial
La cantidad de antocianinas se determinó por el método de pH diferencial (Kuskoski et al
,2005). Es un método espectrofotométrico que se basa en la transformación estructural de las
antocianinas con el cambio de pH (pH 1 coloreadas y pH 4.5 incoloras). Para tal se hizo la curva
de calibración en el espectrofotómetro, con el fin de generar la ecuación de la regresión lineal, y
poder aplicar los modelos matemáticos de pH diferencial y determinar la concentración de
antocianinas en el medio de cultivo
-
35
7 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Teniendo en cuenta el diseño metodológico aplicado, se presentan los resultados de cada fase
con su respectivo análisis de la siguiente manera:
7.1 CAPITULO I: CONSTRUCCIÓN DEL BIORREACTOR AIRLIFT
Para la construcción del biorreactor Airlift, fue necesario establecer las medidas y materiales a
utilizar, por tal en la tabla 5, se evidencian los materiales requeridos para el diseño del
biorreactor. En cuanto a las medidas fue necesario acudir a ecuaciones y métodos matemáticos
para determinar las variables de diseño para capacidad de 1 litro; estas fueron
Ecuación 1. Relación altura diámetro
𝐻
𝐷= 2
Donde:
H: es la altura del tanque
D: diámetro del tanque
Arrojando como resultados que H = 17,2 cm y Dt = 8,6 cm; seguidamente para determinar los
datos de altura de trabajo, de la columna se efectuaron las siguientes ecuaciones respectivamente:
Ecuación 2. Altura de trabajo (Ht)
𝐻𝑡 =𝐷𝑡
𝐻
Ecuación 3. Altura de columna interna (Hd)
𝐻𝑑 = 𝐷𝑐 ∗ 𝐻𝑡
Donde se obtuvo como resultados:
-
36
Ht: altura de trabajo = 11,18 cm
Hd: altura de la columna interna (tubo Draft) = 7,37 cm
A partir de estos cálculos se procedió a realizar el diseño esquemático en el software
solidworks, con el fin de evidenciar los valores obtenidos en el modelo matemático, ver figura 4
Tabla 6. Listado de material de construcción del biorreactor
Fuente: Autora
Materiales Cantidad
Mangueras 2
Recipiente de vidrio 12
Bomba de aire
(pecera)
4
Difusores 18
Conectores 12
Tapas 12
Parafilm 1
Reguladores de aire 18
-
37
Figura 4. Diseño Esquemático Biorreactor
Fuente: La autora
El diseño del biorreactor Airlift a utilizar en el laboratorio, tiene dos zonas principales de flujo
de aire, una ascendente y otra descendente que favorece la homogenización del medio y el aire
que se le inyecto al sistema, este prototipo cuenta con una fuente de alimentación de 12 V de
corriente directa, un motor tipo Airpo modelo D20285, en su estructura contiene un termómetro
que garantiza la estabilización de la temperatura y un regulador de pH que calibra el sistema (ver
figura 5).
-
38
Figura 5. Prototipo del Biorreactor airlift para la producción de antocianinas
Fuente: La Autora
7.2 CAPITULO II: DETERMINACIÓN DE LAS CONDICIONES IDEALES
7.2.1 Preparación del inóculo
Se realizó un proceso de desinfección a los callos de mora, el cual consistió en añadir
inicialmente solución jabonosa (20 minutos), alcohol (10 minutos) y con lavados intermedios de
agua destilada estéril (5 minutos), esto se hizo teniendo en cuenta el protocolo establecido por el
laboratorio de tejidos vegetales de la Universidad de Santander UDES.
7.2.2 Puesta en marcha del Biorreactor Airlift con suspensiones celulares de Rubus
glaucus Benth.
Luego de tener el medio de cultivo en óptimas condiciones se transfirieron las muestras de
callos de mora de castilla, al biorreactor Airlift, donde previamente se realizó un ajuste de pH;
las características de la muestra vegetal, eran callos friables de 4 semanas, con una coloración
amarillenta clara (ver figura 6), seguidamente se le inyectó aire al sistema dependiendo de cada
tratamiento, para luego dejar en incubación a temperatura ambiente, por 20 días, donde se le
-
39
realizó monitoreo cada 5 días, para luego ser retirados y realizar el respectivo análisis de los
resultados obtenidos.
Figura 6. Muestra vegetal de estudio
Fuente: La Autora
7.2.3 Medición de variables en cada tratamiento
Para establecer el mejor tratamiento se analizaron variables específicas, tales como brix, Peso
fresco y azúcares reductores.
7.2.3.1 Peso fresco
Este proceso se hizo mediante el pesaje de las células vegetales previamente lavadas con agua
destilada y con su respectivo papel filtro; A partir de los resultados obtenidos, se presentan las
siguientes figuras que tuvieron como objetivo, evidenciar el comportamiento de los callos de
acuerdo a la variación del pH y la aireación del sistema.
-
40
Figura 7. Resultados Peso Fresco
Fuente: Los Autores
Nota: las figuras corresponden a los siguientes tratamientos (A: 0 vvm; B: 0.1vvm, C: 0.3 vvm )
En la figura Nº 7, Se observa la producción de biomasa (peso fresco) en cada uno de los
tratamientos con respecto a la división celular activa. A partir del análisis estadístico, se puede
evidenciar diferencias significativas de crecimiento en los tres tratamientos con las diferentes
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 5 10 15 20
Bio
mas
a (g
cel
)
Tiempo
A
pH 2 pH 3 pH4,5
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 5 10 15 20
Bio
mas
a (g
cel
)
Tiempo
B
pH2 pH3 pH4,5
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 5 10 15 20
Bio
mas
a (g
cel
)
Tiempo
C
pH2 pH3 pH4,5
-
41
concentraciones de oxígeno aplicadas (p
-
42
7.2.3.2 Brix (Cantidad de azúcar disponible en el medio)
Los grados brix obtenidos mediante el uso del refractómetro arrojo las siguientes gráficas, de
acuerdo a la variación de flujo de aire de cada uno de los tratamientos. Ver figura 8.
Figura 8. Comportamiento del cultivo en % BRIX
Fuente: La Autora
Nota: las figuras corresponden a los siguientes tratamientos (A: 0 vvm; B: 0.1vvm, C: 0.3 vvm )
0
2
4
6
8
10
5 10 15 20
Bri
x(%
)
tiempo (dias)
A
pH2 pH3 pH4,5
0
2
4
6
8
10
5 10 15 20
Bri
x (
%)
tiempo (días)
B
pH2 pH3 pH 4,5
0
2
4
6
8
10
5 10 15 20
Bri
x(%
)
tiempo (días)
C
pH2 pH3 pH 4,5
-
43
Los grados Brix, hacen referencia a la cantidad de solidos solubles totales que existen en la
célula vegetal. A partir del análisis estadístico, se puede evidenciar diferencias significativas en
los diferentes tratamientos en cuanto a las variables tiempo y la aireación (p < 0,05) ver anexo 2.
En la aireación, se observa que a 0,1 vvm, presenta la mayor concentración de sólidos disueltos
con una media de 7.56 °Brix con respecto a 0,3 vvm y sin aire, que registraron un promedio de
7,05 y 6,36 ºBrix respectivamente. Este elevado contenido de sólidos se debe a la segregación de
subproductos de la actividad metabólica de los callos, generando un crecimiento celular a partir
de la producción de otros compuestos (Angulo Montoya, et al 2013), especialmente en el día 15,
que con pH de 4,5 registró un 9,66 ºBrix. Así mismo, la reducción que se presenta en pH 4,5 se
asocia a que los Brix decrecen a causa de la utilización de azúcares por el tejido vegetal en su
proceso metabólico, es decir para generar energía (Ayala et. al 2013). En cuanto al pH, pese a
que no son un factor que afectan significativamente la producción de Brix, es una variable que
ayudan con la estabilización de los callos para el proceso de producción de antocianinas (Gómez,
Celedon & Jímenez, 2011).
7.2.3.3 Azúcares Reductores
Para la medición de azúcares reductores se elaboró la curva de calibración de glucosa DNS,
mediante soluciones patrones, estimando la ecuación de la recta con un valor de R de 0,994 (ver
Anexo 3), a partir de esta, se determinó la concentración de glucosa liberada en g/L en cada uno
de los tratamientos, obteniendo la figura 9.
-
44
Figura 9. Concentración de azúcares reductores.
Fuente: La Autora
Nota: las figuras corresponden a los siguientes tratamientos (A: 0 vvm; B: 0.1vvm, C: 0.3 vvm )
De acuerdo a la figura 9, se puede observar diferencias significativas en la producción de
azúcares reductores entre los tratamientos (p
-
45
Además del análisis estadístico de los datos, a partir de procesos de observación en el
laboratorio, se identificó que la muestra sometida a una longitud de onda de 540 nm, tiene una
mayor apreciación del color característico de acuerdo a las concentraciones de azucares
reductores, es decir, de acuerdo con la literatura, en la reducción del DNS el cual tiene un color
amarillo, debido a la glucosa y al acido 3-amino-5-nitrosalicilico, virando a una coloración roja,
haciendo el cambio perceptibles por los sentidos del investigador. Cabe mencionar, que un
estudio realizado por (Bedoya, 2010), evaluó la producción de un metabolito secundario,
Azadiractina índica, las cuales fueron sometidas a diferentes condiciones de aireación y
agitación en un biorreactor, donde se determinó la concentración de azúcares reductores en el
medio, arrojando como resultados que durante los primeros 15 días hay mayor producción de
azucares reductores, para luego entrar en una fase de decline o estacionara, a causa de la falta de
fuentes de carbono y energía. Después de este tiempo, se observa una fase de latencia, donde hay
hidrolisis extracelular de la sacarosa, debido a las secreciones enzimáticas en el medio, que
contribuye a la formación de glucosa y fructosa, además este es un fenómeno común que
presentan las células vegetales (Bello GIL, Daniel; Carrera B., Emilia; Diaz M., 2006) . Esto
corrobora los resultados generado en este estudio, donde se demuestra que, a menor
concentración de oxígeno, la producción de azúcares reductores será mayor.
-
46
7.3 CAPITULO III: PRODUCCIÓN DE ANTOCIANINAS
7.3.1 Método Cuantitativo
7.3.1.1 pH diferencial
Para obtener los datos de absorbancia, se realizó el análisis de las muestras a pH de 2, 3 y 4.5,
variando la longitud de onda, y aplicando las ecuaciones respectivas (ver ecuación 4) para
obtener, la concentración de antocianinas, arrojando como resultados los contemplados en la
tabla 7.
Ecuación 4. Concentración por pH diferencial
𝐴 = (𝐴𝜆 𝑉𝑖𝑠−520 − 𝐴𝜆700)𝑝𝐻1 − (𝐴𝜆 𝑉𝑖𝑠−520 − 𝐴𝜆700)𝑝𝐻 4,5
𝐴𝑡 =𝐴´(𝑃𝑀)(𝐹𝐷)(1000)
𝐸 (1)
Tabla 7. Resultados del tratamiento pH diferencial
Variación
[vvm]
Días pH 2 [mg/0,5 g
muestra]
pH 3 [mg/0,5 g
muestra]
pH 4,5 [mg/0,5 g
muestra]
0
5 0,2003 0 0
10 1,452 0,734 1,068
15 2,003 1,052 1,686
20 0 0 0,066
0,1
5 0 4,1246 3,256
10 1,469 0 1,219
15 1,436 7,731 9,852
20 1,853 4,652 3,957
0,3
5 0,016 0,417 0,283
10 0 0,247 1,536
15 2,371 0,066 1,085
20 1,1021 0,1001 1,736
Fuente: La Autora
De acuerdo a estos datos, se presentan las gráficas de producción de antocianinas en mg/0.5 g
de muestra.
-
47
Figura 10. Comportamiento de crecimiento a diferentes pH
Fuente: La Autora
Nota: las figuras corresponden a los siguientes tratamientos (A: 0 vvm; B: 0.1vvm, C: 0.3 vvm )
De acuerdo a la figura 10, se puede observar diferencias significativas entre los tratamientos
(p< 0,05) ver anexo 5, donde el mejor rendimiento y producción de antocianinas se presenta con
un pH de 4,5 con una transferencia de aire de 0,1 vvm y a los 15 días, con una media de 9,85
mg/0,5 g de muestra a diferencias de las otras condiciones. Esto datos se corroboran según
(Gómez, Celedon & Jímenez, 2011) ya que en su análisis de los métodos de obtención de
antocianinas, indican que a un mayor pH y menor aireación, la producción de antocianinas
0
0,5
1
1,5
2
2,5
5 10 15 20
pro
ducc
ión (
mg/0
,5 g
mues
tras
)
tiempo (días)
A
pH2 pH3 pH4,5
0
2
4
6
8
10
5 10 15 20
pro
ducc
ión (
mg /
0,5
g m
ues
tra)
tiempo (días)
B
pH 2 pH3 pH4,5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
5 10 15 20
pro
ducc
ión (
mg/0
,5 m
ues
tras
)
tiempo (días)
C
pH2 pH3 pH 4,5
-
48
aumenta; sin embargo toca tener en cuenta otras variables, como las hormonas del medio de
cultivo que actúan como reguladores de crecimiento, ya que estas dependiendo de su naturaleza,
pueden afectar o beneficiar dicha producción. Así mismo, para confirmar que las condiciones de
operación generadas fueron las correctas, se realizó un análisis estadístico de entre los
tratamientos y sus respectivas interacciones prediciendo las mismas condiciones establecidas en
el estudio (anexo 6).
Con el fin de evidenciar los valores obtenidos de antocianinas más cercanos a los rangos que
estipula la literatura, (Moyer, Hummer, Finn, Frei, & Wrolstad, 2002), en su artículo, establece
una serie de rangos de concentración dependiendo del cultivo, entre ellos se encuentra el género
Rubus el cual se utilizó como referencia para establecer un comparativo con los resultados
obtenidos (ver tabla 8).
Tabla 8. Contenido de Antocianinas totales en algunas frutas
Taxonomia Nombre Común
Concentración
(mg/100 g de
celula vegetal)
Estándar Referencia
Vaccinium
Uliginosum L. Arándano alpino
256 Mv-3-glu Andersen (1987)
Rubus occidental
L. Frambuesa negra 627 CY-3glu
Moyer et al.
(2002) V. parvifolium Arándano rojo 34 CY-3glu
R. nigrum cv Grosella negra 411 CY-3glu
Sambucus nigra Cauco negro 200-1000 CY-3glu
Bridle et al. (1997) V. vinifera Uva de vid 30-750 CY-3glu
Citrus Sinensis Naranjo dulce 200 CY-3glu
Mv: Malvidina ; Cy: Cianidina ; Glu: Glucosa
Fuente: (Moyer et al., 2002)
A partir de la tabla de referencia, se procedió a comparar utilizando métodos de conversión de
unidades, para poder establecer un patrón, es decir dentro de los resultados obtenidos la
producción de antocianinas está dada en [mg/ 0,5 g de callos de mora de castilla y la literatura de
-
49
muestra la obtiene en [mg/100g de fruta], por tal se efectuaron las siguientes operaciones para
tener el valor de comparación
𝐴𝑛𝑡𝑜𝑐𝑖𝑎𝑛𝑖𝑛𝑎𝑠 [𝑚𝑔] → 0,5 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑙𝑙𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑟𝑎
𝑋 ← 100 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑙𝑙𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑟𝑎
A partir de la realización de la ecuación generada se obtuvo el siguiente resultado:
Tabla 9. Resultados pH diferencial (mg/100g muestra)
Tiempo Variación pH2 pH 3 pH 4,5
5 0,1 0 824,92 651,2
10 293,8 0 243,8
15 287,2 1546,2 1970,4
20 370,6 930,4 791,4
5 0,3 3,2 83,4 56,6
10 0 49,4 307,2
15 474,2 13,2 217
20 220,42 20,02 347,2
5 0 40,06 0 0
10 290,4 146,8 213,6
15 400,6 210,4 337,2
20 0 0 13,2
Fuente: La Autora
Se logra predecir que el comportamiento generado en la producción de antocianinas son
similares a los de la literatura, aunque cabe recalcar, que la dispersión de estos depende del tipo
de metodología de extracción, las condiciones edáficas y ambientales del fruto. Por ejemplo un
estudio realizado con Acai por (Rojano,2005) encontró concentraciones de antocianinas de
268,5 mg /100g muestra en el 2011, luego otro investigador toma como referencia la misma
industria colombiana, para realizar el reporte del contenido de antocianinas presente en dicho
fruto, con un valor de 4,58 mg/100g de muestra, llegando a la conclusión que es necesario
-
50
recurrir a estudios físico químicos de mayor profundidad, para comparar la variación de
resultados, siendo un mismo sitio y fruto de análisis.
7.3.2 Método Cualitativo
Este método está basado en la observación de cada una de las muestras con la variación de
propiedades como la pigmentación. Para la presentación de los resultados obtenidos, se
evidencian las imágenes de cada uno del tratamiento de acuerdo al flujo de aire inyectado, tal
como se aprecian en la figura 11.
Figura 11. Muestras método cualitativo
Fuente: La Autora
A B
C
-
51
Nota: las figuras corresponden a los siguientes tratamientos (A: 0.1 vvm; B: 0.3vvm; C: 0 vvm )
A partir del ensayo para identificar la presencia de flavonoides, se hizo mediante la adición de
NaOH al 20%, del cual se determinó que la variación ligera de color a verde y amarillo, se debió
principalmente a la presencia de betalaínas, específicamente las betaxantinas, que son las que se
asocian a tonalidad derivadas del amarillo verdoso (Saboya Moreno, 2017).
De acuerdo a las características entre antocianinas y betalaínas, son similares, puesto que
dentro de los procesos industriales sus usos comunes son: la función de antioxidantes, reducción
y control de enfermedades cardiovasculares y degenerativas, inclusive se alcanzan a categorizar
como anticancerígenas(Saboya Moreno, 2017), su uso alimentario; además de esto las
betacianinas tienen dentro de su estructura molecular compuestos nitrogenados que actúan como
pigmentadores, haciendo que estas sean similares a las antocianinas en su apreciación física.
Las betalaínas además de dar coloración a los frutos, estas son reconocidas por dar lugar a
otro tipo de actividades biológicas, debido a que contiene una enzima denominada Quinona
reductasa que contribuye a la detoxificación en la quimio prevención del cáncer (Azeredo 2009),
y también en actividad anti proliferativas de células de melanoma maligno (wu et al, 2006)
Otra discusión se debe, a que, si hay presencias de antocianinas en el cultivo, pero este pudo
presentar deficiencias en el metabolismo de la planta, principalmente en la obtención del hierro,
que dentro de su actividad funcional da paso a oxidación y reducción del ion (Fe+3) a (Fe +2),
reacción que logra hacer más fuerte el color del fruto, obteniendo en el análisis del laboratorio, la
tendencia a variar u oscilar en colores derivados del verde(Gutierrez et al., 2009).
-
52
-
53
8 CONCLUSIONES
Se diseñó el prototipo de biorreactor Airlift, con regulación de oxígeno, pH, y en condiciones
ideales para llevar a cabo la producción de metabolitos secundarios como las antocianinas, a
partir de callos de mora de castilla (Rubus Glaucus Benth).
Se determinó que a menor cantidad de oxígeno que son sometidas las células vegetales de
estudio, mayor cantidad de azucares reductores en el medio, donde se obtuvo que a 0 vvm la
producción máxima se llevó a cabo a los 15 días de estudio con un total de 8,05 g/L de azúcares
reductores.
Se obtuvo que la variable óptima en el estudio para la producción de antocianinas, por el
método de pH diferencial, fue con pH de 4,5 a 0,1 vvm de aireación y en un tiempo de 15 días,
arrojando como valor medio 9,85 gramos de antocianinas / 0,5 gramos de muestra.
Mediante el análisis cualitativo se obtuvo que, de acuerdo a la literatura, los pigmentos
observados viraron a una tonalidad propia de las betalaínas, específicamente las betaxantinas,
cuya coloración es verde castaño.
-
54
9 RECOMENDACIONES
Mejorar el protocolo de desinfección para los callos de mora de Castilla hasta obtener un 90%
de explantes sanos o un porcentaje mayor a este.
Se recomienda que, para próximos estudios, la variable de pH, se aumente con el fin de
corroborar la hipótesis, de que, a mayor pH, mayor será la concentración de antocianinas. Y
demostrar la influencia que tienen las hormonas del crecimiento en los medios de cultivo, con el
fin de establecer unas condiciones ideales para las células vegetales.
-
55
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