Rôle du récepteur purinergique P2X4R et de l’IL-1 dans la moelle épinière lésée

Thèse

Dominic Bastien

Doctorat en biologie cellulaire et moléculaire

Philosophiae doctor (Ph.D.)

Québec, Canada

© Dominic Bastien, 2015

iii

Résumé Les lésions de la moelle épinière (LME) entraînent l’activation de mécanismes

inflammatoires impliquant les cellules gliales et les cytokines. Les travaux présentés dans

cette thèse avaient pour but d’identifier les cellules et molécules responsables de l’initiation

de ces mécanismes pouvant entraîner des dommages tissulaires ou stimuler la réparation.

Nous avons donc examiné le rôle du récepteur purinergique P2X4R et des cytokines IL-1α

et IL-1β dans le recrutement des cellules immunitaires innées, l’étendue de la lésion et la

récupération locomotrice suite à une LME. Dans un premier temps, nous avons démontré

que P2X4R est exprimé par les neurones de la moelle épinière et que l’activation de ce

récepteur suite à une LME entraîne le clivage de la caspase-1 en sa forme active et la

production de la forme mature de l’IL-1β. Ainsi, l’absence de P2X4R chez la souris a

provoqué une diminution des niveaux d’IL-1β, réduisant par le fait même le nombre de

neutrophiles et monocytes pro-inflammatoires, dits M1, au site de lésion. Les souris

P2X4R-KO ont aussi présenté une meilleure récupération locomotrice lors des tests

comportementaux effectués, suggérant que P2X4R joue un rôle essentiel dans la

neurodégénérescence suite à une LME. De plus, nous avons démontré que l’IL-1α est

exprimée rapidement chez la microglie suite à la lésion et qu’il s’en suit l’expression de

l’IL-1β par les neutrophiles et les monocytes M1 infiltrants. Malgré le fait que ces 2

cytokines semblent déclencher des effets inflammatoires similaires, les souris IL-1α-KO

ont présenté de meilleures fonctions locomotrices aussitôt qu’à 1 jour post-lésion

comparativement aux souris sauvages et IL-1β-KO. L’analyse du transcriptome par

micropuces à ADN a permis d’identifier plusieurs gènes régulés significativement chez les

souris IL-1α-KO tel que le facteur de survie neuronale TOX3. Nous avons confirmé par

immunofluorescence que TOX3 est surexprimé chez les oligodendrocytes CC1+ des souris

IL-1α-KO. Ces résultats suggèrent que les oligodendrocytes de ces souris seraient moins

sensibles à la mort cellulaire suite à la lésion, entraînant ainsi une meilleure récupération

locomotrice ainsi que la préservation de la matière blanche de la moelle épinière.

v

Abstract Spinal cord injury (SCI) leads to neuroinflammation-mediated damage and repair. The

work presented in this thesis studied the cells and molecules initiating the inflammatory

response in the injured spinal cord, in particular glial cells and cytokines. We investigated

the role of purinergic receptor P2X4R and cytokines of the IL-1 family, IL-1α and IL-1β, in

neutrophil and proinflammatory (M1) monocyte recruitment, tissue damage and locomotor

function recovery after SCI. First, we showed that P2X4R is expressed in neurons of the

normal spinal cord, and that activation of this receptor after SCI induces caspase-1 cleavage

and production of mature IL-1β. We provided evidence that P2X4R-KO mice have

impaired caspase-1 activation, resulting in decreased IL-1β levels and reduced neutrophil

and M1 monocyte infiltration. Importantly, P2X4R-KO mice exhibited significant

improvements in tissue sparing and locomotor behavior. These results suggest that P2X4R

plays an essentiel role in neurodegeneration after SCI. Next, we showed that IL-1α is

rapidly produced by microglia after SCI, and that this is followed by production of IL-1β

by infiltrating neutrophils and monocyte-derived M1 macrophages. Despite the fact that the

infiltration of these immune cell types was equally reduced in IL-1α-KO, IL-1β-KO and

WT mice, IL-1α-KO mice exhibited significantly better locomotor recovery as early as day

1 post-SCI compared to the other two mouse lines. Transcriptome analysis of SCI tissue

identifed transcripts that were specifically regulated in IL-1α-KO mice exclusively,

including the neuronal survival factor TOX3. We confirmed by immunofluorescence that

TOX3 is overexpressed by CC1+ oligodendrocytes from IL-1α-KO mice. These results

suggest that oligodendrocytes from these mice would be less sensitive to cell death after

injury, thus leading to sparing of spinal cord white matter and better functional recovery.

vii

Table des matières

RÉSUMÉ  .......................................................................................................................................................  III  ABSTRACT  ....................................................................................................................................................  V  TABLE  DES  MATIÈRES  ...........................................................................................................................  VII  LISTE  DES  TABLEAUX  ..............................................................................................................................  XI  LISTE  DES  FIGURES  ...............................................................................................................................  XIII  LISTE  DES  ABRÉVIATIONS  ...................................................................................................................  XV  REMERCIEMENTS  ..................................................................................................................................  XIX  AVANT-­‐PROPOS  .....................................................................................................................................  XXI  CHAPITRE  1:  INTRODUCTION  ...............................................................................................................  1  

1.1.  LA  MOELLE  ÉPINIÈRE  ............................................................................................................................................  1  1.1.1.  Anatomie  de  la  moelle  épinière  ..............................................................................................................  3  

1.2.  LES  CELLULES  GLIALES  .........................................................................................................................................  6  1.2.1.  Les  microglies  .................................................................................................................................................  7  1.2.2.  Les  astrocytes  .................................................................................................................................................  8  1.2.3.  Les  oligodendrocytes  ................................................................................................................................  11  

1.3.  NEUROPATHOLOGIE  DES  LME  .........................................................................................................................  14  1.3.1.  La  lésion  primaire  ......................................................................................................................................  14  1.3.2.  Dégénérescence  secondaire  ...................................................................................................................  15  

1.4.  SIGNALISATION  INTRACELLULAIRE  DE  L’INITIATION  DE  L’INFLAMMATION  ............................................  17  1.4.1.  Les  TLRs  .........................................................................................................................................................  18  1.4.2.  Les  NLRs  .........................................................................................................................................................  21  

1.4.2.1. L’inflammasome NLRP1 ............................................................................. 23  1.4.2.2. NLRP3 (NALP3) ......................................................................................... 26  1.4.2.3. L’inflammasome AIM2 ............................................................................... 28  

1.4.3.  Les  récepteurs  purinergiques  ...............................................................................................................  29  1.4.3.1. Les récepteurs P2X4 ..................................................................................... 30  1.4.3.2. Les récepteurs P2X7 ..................................................................................... 31  

1.5.  RÔLES  DES  CYTOKINES  ET  CHIMIOKINES  SUITE  À  UN  TRAUMA  DU  SNC  ...................................................  33  1.5.1.  La  famille  de  l’interleukine-­‐1  (IL-­‐1)  ..................................................................................................  33  

1.5.1.1. L’IL-1-α ....................................................................................................... 34  1.5.1.2. L’IL-1β ........................................................................................................ 36  1.5.1.3. Les récepteurs de l’IL-1 (IL-1Rs), leurs protéines accessoires et l’antagoniste, l’IL-1Ra .............................................................................................. 38  1.5.1.4. L’interleukine-18 (IL-18) et son récepteur IL-18R ..................................... 41  1.5.1.5. L’Interleukine-33 (IL-33) ............................................................................ 44  

1.5.2.  Le  facteur  nécrosant  des  tumeurs  (TNF)  .........................................................................................  46  1.6.  RECRUTEMENT  DES  CELLULES  IMMUNITAIRES  .............................................................................................  48  1.6.1.  Neutrophiles  .................................................................................................................................................  48  

viii

1.6.2.  Monocytes/Macrophages  .......................................................................................................................  51  1.7.  PROTECTION  ET  RÉGÉNÉRATION  DU  SNC  ......................................................................................................  53  1.8.  HYPOTHÈSE  ET  OBJECTIFS  GÉNÉRAUX  ............................................................................................................  55  1.8.1.  Étude  du  rôle  du  récepteur  P2X4R  ......................................................................................................  55  1.8.2.  Étude  des  effets  de  l’IL-­‐1α  et  IL-­‐1β  .....................................................................................................  56  

CHAPITRE  2  ..............................................................................................................................................  59  2.1.  RÉSUMÉ  ................................................................................................................................................................  60  2.2.  ABSTRACT  ............................................................................................................................................................  61  2.3.  INTRODUCTION  ....................................................................................................................................................  62  2.4. CYTOKINES RELEASED AFTER NEURAL INJURY: PRODUCTION, RECEPTOR SIGNALLING PATHWAYS AND IMMUNE RESPONSES  ................................................................................................................  65  2.4.1. IL-1 FAMILY MEMBERS  ...............................................................................................................................  65  2.4.1.1.  Interleukin-­‐1α  (IL-­‐1α)  .........................................................................................................................  66  2.4.1.2. Interleukin-1β (IL-1β)  ..........................................................................................................................  68  2.4.1.3. Interleukin-1 receptor type 1 (IL-1R1)  ...........................................................................................  70  2.4.1.4. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1RA)  .................................................................................  72  2.4.1.5. Interleukin-18 (IL-18)  ...........................................................................................................................  72  

2.4.2. TNF FAMILY MEMBERS  ..............................................................................................................................  75  2.4.2.1. Tumor necrosis factor (TNF)  .............................................................................................................  75  2.4.2.2. Fas ligand (FasL)  ...................................................................................................................................  77  2.4.3. Interleukin-6 (IL-6)  ....................................................................................................................................  78  2.4.4. TGF-β family members  ............................................................................................................................  79  2.4.5. IL-10 family members  ...............................................................................................................................  80  2.4.5.1. Interleukin-10 (IL-10)  ...........................................................................................................................  81  

2.5.  CYTOKINE  EFFECTS  ON  GLIA,  ENDOTHELIAL  CELLS  AND  LEUKOCYTES  AND  CONTRIBUTION  OF  THESE  CELLS  TO  TISSUE  DAMAGE,  GLIAL  SCARRING  AND  REGENERATION  ....................................................................  84  

2.5.1. Glial cells  ......................................................................................................................................................  84  2.5.2. Endothelial cells of the neurovascular unit  .....................................................................................  87  2.5.3. Innate immune cells  ...................................................................................................................................  90  

2.6. DIFFERENCES BETWEEN THE INJURED SPINAL CORD AND PERIPHERAL NERVE  ..........................  92  2.7. CONCLUSION  .....................................................................................................................................................  96  2.8. ACKNOWLEDMENTS  ........................................................................................................................................  96  2.9. REFERENCES  ......................................................................................................................................................  97  

 CHAPITRE  3  ...........................................................................................................................................  133  P2X4  RECEPTORS  INFLUENCE  INFLAMMASOME  ACTIVATION  FOLLOWING  SPINAL  CORD  INJURY  .......................................................................................................................................................  133  

3.1.  RÉSUMÉ  .............................................................................................................................................................  134  3.2.  ABSTRACT  .........................................................................................................................................................  135  3.3.  INTRODUCTION  .................................................................................................................................................  136  3.4.  MATERIALS  AND  METHODS  ...........................................................................................................................  137  3.4.1.  Animals  .........................................................................................................................................................  137  3.4.2.  Spinal  cord  injury  .....................................................................................................................................  137  3.4.3.  Immunoblotting  .......................................................................................................................................  138  3.4.4.  Flow  cytometry  .........................................................................................................................................  138  3.4.5.  Tissue  processing  and  histology  ........................................................................................................  139  3.4.6.  Immunohistochemistry  and  quantification  of  immunolabeling  .........................................  140  3.4.7.  Behavioral  analyses  ................................................................................................................................  141  3.4.8.  Statistical  analysis  ...................................................................................................................................  141  

ix

3.5.  RESULTS  .............................................................................................................................................................  142  3.5.1.  Caspase-­‐1  and  IL-­‐1β  responses  are  decreased  in  P2X4-­‐KO  mice  following  SCI  ...........  142  3.5.2.  P2X4  is  expressed  in  neurons  of  the  dorsal  horn  and  medial  grey  .....................................  144  3.5.3.  P2X4  deficiency  in  neural  cells  reduces  inflammation  at  sites  of  SCI  ...............................  146  3.5.4.  P2X4-­‐KO  mice  show  improved  histopathological  outcomes  when  compared  to  wild  type  mice  ..................................................................................................................................................................  150  3.5.5.  Functional  recovery  after  SCI  is  improved  in  P2X4-­‐KO  mice  when  compared  to  wild  type  mice  ..................................................................................................................................................................  152  

3.6.  DISCUSSION  .......................................................................................................................................................  152  3.7.  REFERENCES  .....................................................................................................................................................  155  

CHAPITRE  4  ............................................................................................................................................  161  

IL-­‐1α  GENE  DELETION  PROTECTS  OLIGODENDROCYTES  AFTER  SPINAL  CORD  INJURY  THROUGH  UPREGULATION  OF  SURVIVAL  FACTOR  TOX3  ............................................................  161  

4.1.  RÉSUMÉ  ..............................................................................................................................................................  162  4.2.  ABSTRACT  ..........................................................................................................................................................  163  4.3.  INTRODUCTION  .................................................................................................................................................  164  4.4.  MATERIALS  AND  METHODS  ............................................................................................................................  165  

4.4.1. Animal  ...........................................................................................................................................................  165  4.4.2. Spinal cord injury  .....................................................................................................................................  166  4.4.3. Flow cytometry  ..........................................................................................................................................  166  4.4.4. Tissue processing and histology  .........................................................................................................  167  4.4.5. Immunohistochemistry and quantification  .....................................................................................  168  4.4.6. In situ hybridization (ISH)  ....................................................................................................................  170  4.4.7. Lesion volume analysis  ..........................................................................................................................  170  4.4.8. Microarray analysis  ................................................................................................................................  171  4.4.9. Real time quantitative RT-PCR (qRT-PCR)  ..................................................................................  172  4.4.10. Behavioral analysis  ...............................................................................................................................  173  4.4.11. Statistical analysis  .................................................................................................................................  173  

4.5.  RESULTS  .............................................................................................................................................................  173  4.5.1. Il-1α protein expression in the injured spinal cord precedes IL-1β and is localized in microglia at the site of injury  ...........................................................................................................................  173  4.5.2. Infiltration of neutrophils and proinflammatory “M1” macrophages is equally reduced in the injured spinal cord of IL-1α- and IL-1β-KO mice  ......................................................................  177  4.5.3. Mice harboring deletion of the IL-1α gene exhibit improved functional recovery and histopathological outcome compared to IL-1β-KO and WR mice after SCI  .................................  179  4.5.4. IL-1β-KO mice have reduced IL-1α levels in their spinal cord compared to WT mice whereas IL-1α-KO mice express IL-1β normally  ....................................................................................  180  4.5.5. Increase expression of TOX3 in the injured spinal cord of IL-1α-KO mice  .....................  182  4.5.6. Oligodendrocytes from mice lacking IL-1α upregulate the survival factor TOX3 and are protected from SCI-induced death  .................................................................................................................  185  4.5.7. Tox3 overexpression in oligodendrocytes of IL-1α-/- mice occurs at early at an early stage of the myelination process and persists through adulthood.  ....................................................  189  

4.6.  DISCUSSION  .......................................................................................................................................................  191  4.7.  REFERENCES  .....................................................................................................................................................  195  

 CHAPITRE  5  :  DISCUSSION  &  CONCLUSION  .................................................................................  205  5.1.  ÉTUDE  DU  RÔLE  DE  P2X4R  ............................................................................................................................  206  5.2.  ÉTUDE  DES  EFFETS  DES  CYTOKINES  DE  LA  FAMILLE  DE  L’IL-­‐1  :  L’IL-­‐1α  ET  L’IL-­‐1β  ........................  211  

x

5.3.  CONCLUSION  .....................................................................................................................................................  217  CHAPITRE  6  :  BIBLIOGRAPHIE  DE  L’INTRODUCTION  ET  LA  DISCUSSION  .........................  219  

xi

Liste des tableaux Tableau 2.1 Cytokine effects on glia, endothelial cells, leukocytes and neurons in the pathogenesis of spinal cord injury………………………………………………………….83

Tableau 4.1 Transcripts found to be differentially regulated exclusively in IL-1α ko mice after SCI.………………………………………………………………………………….183

Tableau 4.2 Transcripts found to be differentially regulated simultaneously in IL-1α and IL-1β-KO mice after SCI.………………… …………………..………………………...184

xiii

Liste des figures Figure 1.1 Divisions et composantes de la moelle épinière .................................................... 2 Figure 1.2 Structure de la moelle épinière .............................................................................. 4 Figure 1.3 Méninges ............................................................................................................... 5 Figure 1.4 Vascularisation de la moelle épinière .................................................................... 6 Figure 1.5: La cicatrice gliale ............................................................................................... 16 Figure 1.6: Structure des inflammasomes ............................................................................. 23 Figure 2.1 Microglia rapidly shield the site of a spinal cord lesion by first extending their cellular processes and then their cell bodies. ........................................................................ 64 Figure 2.2 Cytokine signalling pathways relevant to spinal cord and peripheral nerve injury.. ................................................................................................................................... 74 Figure 3.1 P2X4 and P2X7 expression in the normal and injured mouse spinal cord. . .... 142 Figure 3.2 Increased expression of bioactive caspase-1 and IL-1ß is reduced in the injured spinal cord of P2X4-knockout mice. .................................................................................. 143 Figure 3.3 ß-galactosidase staining is localized in neurons in the normal and injured spinal cord of P2X4-KO mice ....................................................................................................... 145 Figure 3.4 P2X4 deficiency in neural cells reduces neutrophil and M1 monocyte infiltration at sites of SCI. ..................................................................................................................... 147 Figure 3.5 P2X4 deficiency attenuates microglial/macrophage activation after SCI. A, ... 149 Figure 3.6 Spinal cord lesion volume and recovery of locomotor function are improved in P2X4-KO mice ................................................................................................................... 151 Figure 4.1 IL-1α protein expression in the injured spinal cord precedes IL-1β and is localized in microglia at the site of injury. ......................................................................... 175 Figure 4.2 IL-1deficiency reduces neutrophil and M1 monocyte infiltration in the injured spinal cord. .......................................................................................................................... 178 Figure 4.3 Recovery of locomotor function and spinal cord lesion volume are improved in IL-1-KO mice.. ................................................................................................................... 180 Figure 4.4 IL-1α and IL-1b mRNA expression levels in the spinal cord of naive and injured mice at 1 day post-SCI ........................................................................................................ 182 Figure 4.5 Expression of the survival factor TOX3 is increased in the injured spinal cord of IL-1α-KO mice ................................................................................................................... 185 Figure 4.6 IL-1α deficiency upregulates expression of the survival factor TOX3 in oligodendrocytes and protects these cells from death after SCI.. ....................................... 188 Figure 4.7 Increased mRNA expression levels of IL-1α, but not IL-1β, between postnatal day 5 and 10, coinciding with a critical period of microglial activation and the beginning of myelination ......................................................................................................................... 190

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Liste des abréviations 5-BDBD 5-(3-bromophenyl)-1,3-dihydro-2H-benzofurol[3,2-e]-1,4-diazepin-1-one ACV accident cérébrovasculaire ADN Acide désoxyribonucléique ADNc Acide désoxyribonucliéque complémentaire AIM2 Absent in melanoma 2 AP-1 Protéine activatrice 1 ARN Acide ribonucléique ARNm Acide ribonucléique messager ASC Apoptosis-associated speck-like protein containing a carboxy terminal ATP Adénosine 5’-triphosphate BCL-2 B-cell lymphoma 2 BCL-XL B-cell lymphoma-extra large BDA Biotinylated dextran amine BDNF Facteur neurotrophique dérivé du cerveau BHE Barrière hématoencéphalique BHS Barrière hématospinale BMP Protéine morphogénétique osseuse BMS Basso Mouse Scale BrdU Bromodeoxyuridine Bz-ATP 2’(3’)-O-(4-Benzoylbenzoyl) adenosine 5’-triphosphate CARD Domaine de recrutement de la caspase Cdk5 Kinase dépendante de la cycline 5 CITED1 Transactivateur interragissant avec Cbp/p300 CLR Récepteur de type lectine CNTF Facteur neurotrophique ciliaire COX2 Cyclooxygénase-2 CREB Protéine se liant à l’élément de réponse cAMP CSPGs Protéoglycanes de type chondroïtine sulfate CST Faisceau corticospinal DA Dégénérescence axonale DAMPs Molécules associées aux dommages DW Dégénérescence Wallérienne EAE Encéphalomyélite autoimmunitaire expérimentale ERK Extracellular-signal-regulated kinases EtBr Bromure d’éthidium FADD Protéine associée à FAS avec un domaine de mort cellulaire FGF Facteur de croissance des fibroblastes GABA Acide γ-aminobutyrique Gal-3 Galectine-3 GCV Ganciclovir GFAP Protéine gliale fibrillaire acide GM-CSF Facteur stimulant les granulocytes et macrophages

xvi

GPI Glycosylphosphatidylinositol H2O2 Peroxyde d’hydrogène HIN Hématopoietic interferon inducible nuclear protein HMGB1 High-mobility group protein B1 HSP Protéine de choc thermique ICAM Protéine d’adhésion intracellulaire IL Interleukine IL-1AcP Protéine accessoire du récepteur de l’IL-1 IL-1R Récepteur de l’IL-1 IL-1Ra Antagoniste de l’IL-1 IL-18BP Protéine de liaison à l’IL-18 IFN Interféron IGF Facteur de croissance ressemblant à l’insuline IRAK Kinase associée au récepteur de l’IL IRF Facteur régulant l’IFN JNK Kinase c-jun N-terminale kDa Kilo dalton LCS Liquide cérébrospinal LPS Lipopolysaccharide LME Lésion de la moelle épinière LNP Lésion du nerf périphérique LRR Répétition riche en leucine MAG Glycoprotéine associée à la myéline MAPk Mitogen-activated protein kinase MCAO Occlusion de l’artère cérébrale moyenne MOG Glycoprotéine de la myéline d’oligodendrocytes MPO Myéloperoxydase MMP Métalloprotéinase MyD88 Gène de réponse primaire de différenciation de cellules myéloïdes 88 NF-κB Facteur nucléaire kappa B NgR Récepteur Nogo NK Cellules NK (natural killer) NMDA Acide N-méthyl-D-aspartique NOD Récepteur à domaine d’oligomérisation de nucléotides NLR Récepteur de type NOD NLRP Récepteur ressemblant à NOD (NOD-like receptor) NPC Cellules progénitrices neuronales NT-3 Neurotrophine 3 NTP Nucléoside triphosphate NTR Récepteur de neurotrophine OHDA Hydroxydopamine OL Oligodendrocyte Olig Facteur de transcription d’oligodendrocyte OPC Cellules progénitrices des oligodendrocytes OX-ATP ATP oxydé p38 MAPK protéine kinase associée à la mitogène p38 PAMPs Motif moléculaire associé aux pathogènes

xvii

PANX1 Pannexine-1 PDGFαR Récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes PPADS Acide pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2',4'-disulfonic PRRs Récepteur de reconnaissance de motifs moléculaires PYD Domaine à pyrine RLR Récepteur ressemblant à RIG-I Shh Sonic hedgehog SLA Sclérose latérale amyotrophique SNC Système nerveux central Tg Transgénique TIR Récepteur Toll/IL-1 TK Tymidine Kinase TLR Récepteur ressemblant à Toll (Toll-like receptor) TNF Facteur de nécrose tumorale TNFR Récepteur du TNF TOX3 TOX high mobility group box family member 3 TRADD Protéine de domaine de mort associée au récepteur du TNF TRAF Facteur associé au récepteur TNF TRIF Domaine TIR induisant l’IFN-β TRPV4 Récepteur potentiel transitoire vanilloide de type 1 UDP Uridine di-phosphate UV Ultraviolet VCAM Molécule d’adhésion cellulaire vasculaire VEGF Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire XIAP Protéine inhibitrice de l’apoptose liée au chromosome X

xix

Remerciements Lorsque j’ai débuté mes études doctorales, jamais je n’aurais imaginé accomplir autant au

cours des années suivantes. Comme tout bon projet de recherche, il y a eu beaucoup de

hauts et de bas autant au point de vue scientifique que personnel. Les raisons pour

abandonner et convoiter le marché du travail se sont additionnées à plusieurs occasions.

J’ai donc dû apprendre à persévérer et à ne pas lâcher face aux embûches qui se présentent.

Malgré cela, une personne m’a encouragé et guidé dans les tous les aspects de mes projets

incluant la gestion, la réflexion scientifique et sans oublier, la rédaction. Je tiens donc à

remercier mon directeur de recherche, Steve Lacroix, pour m’avoir fait confiance dès le

début. Il m’a permis d’acquérir une expérience et des compétences que je n’aurai jamais pu

obtenir sans son aide et son support. Il m’a surtout permis de grandir et d’obtenir une

maturité scientifique et personnelle.

Je tiens également à remercier tous les membres présents et passés de mon équipe. Nadia

Fortin, qui sans elle, je n’aurais pas survécu les centaines chirurgies réalisées, les études

comportementales et la coupe de tissus au cryostat. Nicolas Vallières pour son support

technique et son aide pour des analyses de tissus au microscope. Martine Lessard pour son

efficacité et sa productivité extraordinaire. Sébastien Lévesque pour avoir contribué à

plusieurs discussions scientifiques et diverti mes temps libres avec des annecdotes

coccasses de sa petite fille. Linda Xiang Wang pour son amitié, son oreille attentive et ses

péripéties rocambolesques divertissantes. Alexandre Paré pour ses qualités de caméraman

très appréciées lors des études comportementales. Et sans oublier Jorge Barreto-Reyes,

Benoit Mailhot et Victor Bellver qui sont arrivés dans notre équipe au cours de la dernière

année. Je tiens également à remercier Isabelle Pineau qui m’a transmis tout ce qu’elle savait

sur les lésions du SNC et tous les stagiaires qui m’ont aidé à réaliser mes projets.

Finalement, je veux remercier mes parents, mon frère et sa petite famile qui ont toujours été

présents pour moi et qui m’ont encouragé dans tout ce que j’entreprenais. Enfin, mon

xx

conjoint, Yannick, que j’aime beaucoup et qui a tenté de comprendre du mieux qu’il

pouvait l’ampleur de mes travaux et qui m’a soutenu tout au long de mes études.

xxi

Avant-Propos Cette thèse est rédigée sous la forme d’articles scientifiques. Elle présente les travaux

effectués lors de mon doctorat en biologie cellulaire et moléculaire au Centre de recherche

du Centre hospitalier de l’Université Laval sous la supervision du Dr Steve Lacroix. Le

chapitre 1 consiste à l’introduction des différents sujets traités dans cet ouvrage tandis que

le chapitre 5 consiste à la discussion générale des résultats obtenus et des perspectives

relatives à la suite des projets entamés. Le chapitre 2 correspond à une revue publiée dans

le journal Experimental Neurology et traite des différentes cytokines, de leurs récepteurs et

de leurs voies de signalisation dans les cellules gliales et immunitaires suite à une lésion de

la moelle épinière ou du nerf périphérique. Le chapitre 3 discute du rôle du récepteur

purinergique P2X4 dans l’activation de l’IL-1β, le recrutement des cellules immunitaires

innées et la récupération locomotrice suite à une LME. Cet article fut publié dans The

Journal of Neuroscience. Finalement, le chapitre 4 discute de l’effet des cytokines IL-1α et

IL-1β sur les dommages tissulaires et la récupération locomotrice suite à une LME. Ces 3

chapitres ont été rédigés en anglais, mais un résumé en langue française a été introduit au

début de chaque chapitre.

Le travail de rédaction du chapitre 2 a été effectué par moi-même ainsi que par Dr Steve

Lacroix. La figure 1 a été conçue par Nicolas Vallières tandis que j’ai créé le tableau 1. J’ai

aussi participé à la conception de la figure 2. L’article présenté dans le chapitre 3 a été

rédigé par Juan Pablo de Rivero Vaccari et par Dr Steve Lacroix tandis que j’ai participé à

la correction de l’ensemble du texte. Les figures 1 et 2 ont été entièrement conçues par

l’équipe de Juan Pablo de Rivero Vaccari et de Robert Keane, tandis que j’ai réalisé

l’ensemble des expériences réalisées dans les autres figures à l’exception de

l’immunofluorescence présentée dans la figure 3 qui a été effectuée par Isabelle Pineau.

L’article présenté dans le chapitre 4 a été rédigé par moi-même et Dr Steve Lacroix. J’ai

réalisé l’ensemble des expériences effectuées à l’exception de la quantification de la figure

1b et de la figure 5 qui a nécessité la participation de Martine Lessard et de Nicolas

xxii

Vallières. Toutes les expériences de culture cellulaire ont été effectuées conjointement par

moi-même et Martine Lessard. Il faut aussi noter que toutes les chirurgies et les études de

comportement de BMS ont été réalisées par Nadia Fortin tandis que j’ai réalisé l’intégralité

des tests de Grip Walk.

1

Chapitre 1: Introduction Les lésions de la moelle épinière (LME) ont affecté environ 86 000 et 273 000 personnes

au Canada (Institut Rick Hansen) et aux États-Unis (National Spinal Cord Injury Statistical

Center) respectivement en 2013. Il a été reporté qu’il se produit près de 4300 nouvelles

lésions chaque année au Canada. Les coûts associés à ces lésions représentent environ 3,6

billions $ par année en soins de santé et équipements de toutes sortes, ce qui équivaudrait à

environ 1,6 à 3,0 millions $ pour chaque individu atteint d’un handicap. Les LME sont

divisées selon 2 classes: traumatiques et non-traumatiques. Les lésions traumatiques

surviennent lorsqu’il y a un impact physique externe sur la moelle épinière. Les hommes

âgés entre 16 et 34 ans sont le groupe qui est le plus touché par ce type de lésion. Les

causes les plus fréquentes sont les accidents de véhicules motorisés, les chutes, la violence

et les accidents de sport. Les lésions non-traumatiques apparaissent quant à elles suite à une

maladie, une infection ou une tumeur. Contrairement aux lésions traumatiques, les patients

atteints de lésions non-traumatiques sont surtout des femmes âgées de plus de 40 ans. Ces

personnes sont souvent atteintes de dommages neurologiques moins sévères. Les

conséquences d’une LME peuvent être séparées en 2 classes : tétraplégie (quadraplégie) et

paraplégie. La tétraplégie consiste en une perte de fonction des membres inférieurs et

supérieurs. Les dommages tissulaires sont souvent situés au niveau des vertèbres cervicales.

La paraplégie affecte les fonctions des membres inférieurs, les dommages se situant plutôt

en dessous de la vertèbre thoracique T8. La sévérité d’une LME est évaluée par un examen

neurologique et peut être incomplète ou complète dépendamment des déficits sensoriels et

moteurs du patient. Les conséquences des dommages ne se situent pas seulement au niveau

des fonctions motrices ou sensorielles, mais des complications des systèmes urinaire,

respiratoire et sexuel peuvent aussi survenir.

1.1. La moelle épinière

Le système nerveux central (SNC) comprend l’encéphale (cerveau, cervelet et tronc

cérébral) et la moelle épinière. La moelle épinière a comme fonction de transmettre les

2

influx nerveux entre le cerveau et les différents organes et tissus du corps. Elle s’étend du

bulbe rachidien en dessous du tronc cérébral jusqu’au niveau de la vertèbre lombaire L1. La

colonne vertébrale ainsi que la moelle épinière sont divisées en 5 régions (Figure 1.1). La

région cervicale est formée de 8 paires de nerfs cervicaux (C1-C8), la région thoracique de

12 paires de nerfs thoraciques (T1-T12), la région lombaire de 5 paires de nerfs lombaires

(L1-L5), la région sacrée de 5 paires de nerfs sacrés (S1-S5) et la région coccygienne a une

paire de nerfs coccygiens (C1).

Figure 1.1 Divisions et composantes de la moelle épinière

3

Au niveau des vertèbres lombaires et sacrées, la moelle forme un paquet de racines

nerveuses appelé queue de cheval. Cette structure devient importante d’un point de vue

clinique puisque cette région permet une intervention médicale, la ponction lombaire, qui

permet de prélever le liquide cérébrospinal (LCS) dans le but d’effectuer son analyse.

Puisque cette structure présente une interruption de la moelle, les risques d’endommager le

tissu nerveux sont grandement réduits. Il est aussi possible de réaliser une anesthésie

extradurale en y injectant un médicament anesthésique qui diffuse dans l’espace

subarachnoïdien et anesthésie les racines nerveuses.

D’un point de vue purement morphologique, il est aussi possible de remarquer que la

moelle épinière ne possède pas un diamètre constant sur sa pleine longueur en raison de

l’augmentation du nombre de cellules nerveuses et de connexions qui sont présentes pour le

traitement des influx nerveux voyageant dans les membres supérieurs et inférieurs. Au

niveau des vertèbres C5-T1, il est possible d’observer un renflement cervical tandis qu’au

niveau des vertèbres L2-S3, il y a présence du renflement lombaire (Figure 1.1).

1.1.1. Anatomie de la moelle épinière

La moelle épinière comporte à son centre un canal central entouré de la substance grise et

de la substance blanche. La substance grise est constituée des corps cellulaires des

neurones. Elle est divisée en cornes dorsales, latérales et ventrales. Les neurones des

cornes dorsales sont responsables de la transmission des influx sensoriels qui entrent dans

la moelle (Figure 1.2). Les cornes latérales comprennent les motoneurones autonomes qui

innervent les organes viscéraux et pelviens. Les cornes ventrales contiennent les corps

cellulaires des neurones moteurs qui projettent vers les muscles striés.

La substance blanche est constituée des axones et entoure la substance grise. Elle est

divisée en colonnes dorsales, latérales et ventrales. Les axones de la substance blanche

empruntent des trajets descendants ou ascendants pour voyager aux différents niveaux de la

moelle. Les fibres nerveuses des voies ascendantes émergent des neurones localisés dans

4

les ganglions spinaux. Les voies ascendantes sont entre autres situées dans la colonne

dorsale et sont responsables de transporter les influx nerveux sensoriels provenant de la

périphérie (Figure 1.2). La colonne latérale comprend les fibres responsables de la

transmission des influx régulant les différents organes internes, la température et aussi la

douleur. Les voies descendantes se situent surtout dans la colonne ventrale et proviennent

des différentes aires cérébrales. La colonne ventrale véhicule donc les influx moteurs

essentiels aux mouvements des muscles.

Figure 1.2 Structure de la moelle épinière

Le tissu nerveux est entouré de trois couches de tissus protecteurs qui couvrent en totalité le

cerveau et la moelle épinière. Ces couches forment les méninges qui sont constitués de la

dure-mère, la couche la plus externe, l’arachnoïde, la couche intermédiaire, et finalement de

la pie-mère, la couche la plus interne. L’espace compris entre l’arachnoïde et la pie-mère

est l’espace subarachnoïdien et contient le LCS (Figure 1.3). Le LCS contribue entre autre à

évacuer les molécules et les déchets provenant du SNC et à protéger le cerveau et la moelle

épinière contre les chocs et les infections de par son rôle immunologique. Le cerveau et la

moelle épinière sont également irrigués par plusieurs vaisseaux sanguins. Toute l’irrigation

sanguine de la moelle épinière est assurée par les artères vertébrales provenant de

ramifications de l’aorte (Figure 1.4). Ces artères se divisent à tous les niveaux vertébraux

pour donner naissance aux artères radiculaires antérieures et postérieures et ensuite aux

5

artères spinales antérieures et postérieures. Évidemment, si l’une des ces artères est

endommagée, la circulation sanguine à travers des régions spécifiques de la moelle épinière

peut être compromise, résultant ainsi en des dommages neurologiques importants tels que

la perte de fonctions sensorielles et motrices.

Figure 1.3 Méninges

6

Figure 1.4 Vascularisation de la moelle épinière

1.2. Les cellules gliales Les cellules gliales sont les cellules de soutien du système nerveux et forment donc

l’environnement des neurones. Elles possèdent comme fonctions de maintenir

l’homéostasie, de protéger le tissu nerveux, de maintenir et réguler les connexions

synaptiques entre les neurones et d’apporter des facteurs nécessaires à la croissance et la

survie neuronale. Dans le SNC, les cellules gliales sont les microglies, les astrocytes et les

oligodendrocytes (OLs). Les prochaines sections discuteront des principales

caractéristiques de chacune de ces cellules et de leur importance dans certaines

neuropathologies.

7

1.2.1. Les microglies

La microglie, communément appelée macrophage résident du SNC, est la principale

population cellulaire possédant des propriétés inflammatoires dans le SNC. Bien que les

macrophages soient présents dans tous les organes périphériques de l’organisme, la

microglie n’est présente que dans le CNS. Les cellules microgliales sont dérivées de

cellules précurseures myéloïdes qui entrent dans le SNC au cours de l’embryogenèse

(Ginhoux et al., 2010, Schulz et al., 2012, Kierdorf et al., 2013). Au cours de cette étape, la

microglie adopte une forme plutôt améboïde (Hirasawa et al., 2005), tandis que leur forme

devient ramifiée lors des premières semaines post-natales (Ignácio et al., 2005). Dans un

cerveau adulte sain, il a été démontré que la population microgliale est maintenue

indépendamment de la contribution des progéniteurs provenant de la moelle osseuse. En

effet, la population microgliale est capable de division cellulaire autant dans des conditions

normales que pathologiques par division cellulaire de ses cellules résidentes du SNC

(Ajami et al., 2007) (Elmore et al., 2014). En utilisant l’imagerie in vivo à 2 photons, il a

été démontré que les cellules microgliales sont actives et hautement dynamiques sous leur

forme physiologique normale. Elles sont capables de surveiller leur environnement et

répondre à des changements subtils via leurs récepteurs membranaires tels que les

récepteurs purinergiques et les récepteurs de la fractalkine et des cytokines (Kreutzberg,

1996, Davalos et al., 2005, Nimmerjahn et al., 2005). Plus récemment, des analyses par

microscopie électronique ont révélé que plus de 90% des prolongements microgliaux

présentent des contacts directs avec une synapse ou une composante de la synapse. De plus,

près de 70% de ces prolongements contacte plus d’un élément synaptique (Tremblay et al.,

2010).

La microglie joue un rôle important dans plusieurs pathologies telles que l’ischémie

cérébrale, l’Alzheimer, la maladie de Parkinson et la sclérose latérale amyotrophique (SLA)

(Perry et al., 2010). Leur habileté à répondre sélectivement aux molécules environnantes ou

à un changement extracellulaire leur permet de réagir rapidement suite à une condition

pathologique. Le récepteur de la fractalkine, CX3CR1, fortement exprimé chez la microglie

(Mildner et al., 2007), et son ligand, CX3CL1, sont des molécules très importantes pour la

8

maintenance des fonctions microgliales dans un tissu sain et malade (Zujovic et al., 2000,

Mizuno et al., 2003). Donnelly et al. ont démontré que CX3CR1 et son ligand sont

hautement régulés suite à une LME (Donnelly et al., 2011). La déficience de CX3CR1 chez

la souris favorise la récupération locomotrice par rapport aux souris sauvages. En effet,

62% des souris CX3CR1-knockout (KO) ont obtenu un score de 6 au test locomoteur Basso

Mouse Scale (BMS) comparativement à 13% chez les souris sauvages au temps 28 jours

post-LME. Fait intéressant, un score BMS de 6 correspond au rétablissement de la

coordination des membres postérieurs et fut corrélé dans cette même étude avec une

expression intraspinale plus accrue de CX3CR1 et une modification du phénotype des

macrophages présents au site de lésion, c’est-à-dire davantage de macrophages Ly6Clow

iNOS+ MHCII+ CD11c- chez les souris contrôles vs. plus de macrophages CCR2+ Ly6Chigh

MCHII+ CD11c+ chez les souris CX3CR1-KO. De plus, il fut observé que l’absence de ce

récepteur a pour effet de réduire les effets potentiellement neurotoxiques des microglies,

permettant ainsi de réduire les dommages tissulaires et l’inflammation suite à une ischémie

cérébrale (Dénes et al., 2008). Ces résultats suggèrent que le blocage de la voie de

signalisation CX3CR1 représenterait une thérapie sélective intéressante pour promouvoir la

neuroprotection et diminuer l’inflammation suite à une LME. Cependant, l’inhibition de

CX3CR1 chez la microglie peut aussi occasionner des effets neurotoxiques dans des

modèles de maladies neurodégénératives. En utilisant 3 différents modèles in vivo chez la

souris, soient l’injection de LPS, la maladie de Parkinson et la SLA, Cardona et al. ont

démontré qu’une déficience en CX3CR1 engendre des dommages neuronaux induits du

moins en partie par la microglie (Cardona et al., 2006), confirmant ainsi l’hypothèse

voulant que ce récepteur puisse participer au maintien de la survie neuronale (Meucci et al.,

2000) et à l’inhibition de l’apoptose induite par FasL (Boehme et al., 2000).

1.2.2. Les astrocytes

Les astrocytes sont les cellules gliales les plus abondantes du SNC. La astrocytes possèdent

plusieurs fonctions essentielles à l’activité neuronale incluant la relâche de glutamate, la

régulation des ions hydrogène et potassium et la modulation de la dynamique des cônes de

croissance (Chen and Swanson, 2003). Les astrocytes jouent aussi un rôle important dans la

9

survie des neurones et des autres cellules gliales en absence de lésion traumatique en

synthétisant des facteurs neurotrophiques comme le facteur neurotrophique dérivé du

cerveau (BDNF) et la neurotrophine-3 (NT-3) (Dreyfus et al., 1999). De plus, ils

interagissent étroitement avec les cellules endothéliales et les péricytes pour conférer à la

barrière hémato-encéphalique toute son étanchéité (Abbott et al., 2006). Comme les

microglies, les astrocytes possèdent plusieurs récepteurs de reconnaissance d’agents

pathogènes ou de signaux de dangers (PRRs) (Jack et al., 2005). D’ailleurs, ces cellules

jouent un rôle important dans l’activation et la régulation de la neuroinflammation

(Brambilla et al., 2005, Van Loo et al., 2006). Effectivement, les astrocytes réactifs

(activés) expriment et relâchent plusieurs cytokines et chimiokines (John et al., 2005).

L’activation des astrocytes est associée à leur prolifération, la propagation de leurs

prolongements ainsi que la surexpression de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), des

protéoglycanes de type chondroïtine sulfate (CSPGs) et de facteurs de croissances.

D’ailleurs, la protéine GFAP est couramment utilisée comme marqueur des astrocytes (Eng

et al., 2000). L’activation de ces cellules peut mener à la formation d’une cicatrice gliale,

un phénomène largement présent suite à un traumatisme du SNC comme les LME. Cette

cicatrice est reconnue pour présenter des effets bénéfiques de même que néfastes pour le

tissu nerveux. En effet, plusieurs études ont démontré que la cicatrice gliale présente suite à

une LME peut restreindre l’étendue des dommages tissulaires en entourant la région

lésée/nécrotique, en restaurant l’intégrité de la barrière hémato-spinale (BHS) et en limitant

l’infiltration des cellules immunitaires au site lésionel (Eddleston and Mucke, 1993,

Faulkner et al., 2004). Les effets bénéfiques et néfastes de la cicatrice gliale sont plus

amplement détaillés dans les paragraphes qui suivent.

Faulkner et al. ont utilisé un modèle de souris transgéniques (Tg) dans lesquelles le gène de

la thymidine kinase (TK) est exprimé par les astrocytes sous le contrôle du promoteur du

gène GFAP (Faulkner et al., 2004). Chez les souris GFAP-TK, l’injection de ganciclovir

(GCV) permet de dépléter sélectivement les astrocytes réactifs en division. Cette équipe a

tout d’abord évalué les fonctions de la BHS et le recrutement des cellules immunitaires 14

jours suite à une LME. Ils ont aussi montré que l’absence d’astrocytes réactifs engendre

10

une déficience dans la réparation de la BHS, tel que démontré par la diffusion massive dans

le parenchyme nerveux à proximité de la LME d’un dextran injecté par voie intraveineuse

(i.v.) chez les souris GFAP-TK traitées au GCV comparativement aux souris sauvages. De

plus, l’étude a rapporté un nombre de macrophages CD45+ sept fois plus élevé chez les

souris Tg traitées au GCV. Les souris sauvages étaient quant à elles caractérisées par la

présence de microglie CD45dim mais peu de macrophages. Faulkner et al. ont aussi examiné

l’effet de l’ablation des astrocytes sur la survie des neurones et des oligodendrocytes. Les

souris sauvages présentaient de nombreux neurones en santé dans la région qui entoure la

lésion, là où de nombreux astrocytes sont normalement présents. Par contre, les souris

GFAP-TK traitées au GCV possédaient beaucoup moins de neurones NeuN+ à proximité de

la lésion. L’absence d’astrocytes réactifs fut aussi corrélée avec une diminution de plus de

90% du nombre d’oligodendrocytes dans la matière blanche chez les souris Tg traitées au

GCV comparativement à 24% chez les souris sauvages. Parallèlement, une plus grande

zone de démyélinisation fut observée chez les souris GFAP-TK ayant reçu le GCV. Ainsi,

ces résultats démontrent que l’activation des astrocytes est essentielle à la survie des

neurones et des oligodendrocytes, minimisant du même coup l’envergure des déficits

fonctionnels. Les effets bénéfiques de la présence des astrocytes ont aussi été démontrés

dans le cadre du modèle murin de la sclérose en plaques (SP), l’encéphalite autoimmune

expérimentale (EAE) (Voskuhl et al., 2009), et d’un modèle de lésion au cerveau (Myer et

al., 2006). Toutefois, il est important de mentionner que ce modèle ne permet pas d’étudier

une voie de signalisation spécifique chez les astrocytes ce qui pourrait expliquer ces

résultats.

Paradoxalement, les astrocytes sont aussi reconnus pour exhiber des propriétés néfastes

suite à une LME. Brambilla et al. ont proposé que l’inhibition de la voie de signalisation

NF-κB chez les astrocytes pourrait être une stratégie thérapeutique intéressante pour le

traitement des LME et même de l’EAE. Afin d’étudier la contribution de cette composante

chez les astrocytes, cette équipe a généré une lignée de souris Tg chez laquelle NF-κB est

sélectivement inactivé chez les astrocytes en ciblant la forme du dominant négatif de

l’inhibiteur de κBα (IκBα) exprimé sous le contrôle du promoteur GFAP (souris GFAP-

11

IκBα-dn) (Brambilla et al., 2005). L’inactivation de NF-κB chez les astrocytes a permis

d’augmenter la récupération fonctionnelle chez les souris Tg comparativement aux souris

sauvages jusqu’à au moins 8 semaines post-lésion, ce qui correspond au dernier temps

évalué dans cette étude. Histologiquement, ceci s’est traduit par une diminution du volume

de la lésion chez les souris Tg ainsi qu’une plus faible perte de matière blanche.

L’inactivation de NF-κB a également réduit l’expression de quelques modulateurs de

l’inflammation tels que les chimiokines CXCL10 et CCL2, en plus d’augmenter

l’expression de la cytokine IL-6. Une seconde étude de Brambilla et al. a voulu pousser

encore plus loin l’investigation de l’effet de l’inactivation de NF-κB chez les astrocytes

(Brambilla et al., 2009). Ils ont donc effectué des marquages rétrogrades au Fluoro-Gold

(FG) et antérogrades à la biotine dextran-amine (BDA) afin de pouvoir visualiser les

neurones et leurs axones au temps 8 semaines post-LME. Ils ont alors démontré que le

nombre de cellules FG+ était significativement supérieur chez les souris Tg. Le nombre

d’axones corticospinaux BDA+ situés du côté caudal à la LME était également supérieur

chez les souris Tg comparativement aux souris sauvages chez qui les axones avaient

pratiquement tous dégénérés. Il est important de noter qu’une partie de ces axones co-

localisaient avec le marqueur GAP-43, une protéine présente chez les axones qui tendent à

régénérer. Ces résultats indiquent que l’inhibition de NF-κB dans les astrocytes permet

d’établir un environnement plus favorable à la survie des axones impliqués dans les

fonctions locomotrices. Plus récemment, l’inactivation de NF-κB chez les astrocytes a

permis de démontrer que l’oligodendrogenèse est favorisée chez les souris Tg, une réponse

qui fut associée à une plus grande expression des protéolipides de la myéline et du

récepteur de chimiokine CXCR4. Rappelons qu’un rôle pour CXCR4 fut démontré dans la

migration des précurseurs neuronaux, la croissance des axones ainsi que dans le maintien

des progéniteurs des oligodendrocytes (OPCs) et la remyélinisation (Bracchi-Ricard et al.,

2013).

1.2.3. Les oligodendrocytes La myélinisation des axones est un processus qui est essentiel à la bonne conduction de

l’influx nerveux. Dans le SNC, la myélinisation est possible grâce à un type de cellules

12

gliales, les oligodendrocytes. Dans le SNC adulte normal, les OLs matures sont

majoritairement situés dans la matière blanche où ils exécutent leur principal rôle. Dans la

moelle épinière, les OLs proviennent de progéniteurs neuroépithéliaux situés dans la corne

ventrale et pouvant donner naissance à la fois aux neurones et aux OLs (Mctigue and

Tripathi, 2008, Mitew et al., 2013). C’est au cours du développement que ces progéniteurs

quittent la zone progénitrice pour se différencier en précurseurs neuronaux ou

oligodendrocytaires. Les précurseurs d’OLs, appelés OPCs, se retrouvent principalement

dans la matière blanche. Dans le cerveau, il semble que la source majeure des OLs soit le

prosencéphale. Dans la moelle épinière, la migration des précurseurs des OLs est influencée

par la présence de 2 protéines, la Sonic hedgehog (SHh) produite dans la corne ventrale et

la protéine morphogénétique osseuse (BMP) provenant de la corne dorsale (Orentas et al.,

1999, Mekki-Dauriac et al., 2002, Miller, 2002, Nicolay et al., 2007). Suite à leur migration

au bon endroit, ces cellules se différencient et régulent de façon négative les marqueurs de

précurseurs tels que le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFαR)

et CSPG4, aussi appelé antigène neurone-glie 2 (NG2). Les OLs nouvellement différenciés

produisent alors de la myéline qui leur permettra d’entourer et myéliniser les axones

environnants. Dans le cerveau du rat, la myélinisation active des axones débute autour du

jour 7 post-natal, bien qu’il soit possible d’observer un faible nombre d’axones myélinisés

à des temps plus tôt après la naissance. La vitesse de myélinisation augmente ensuite

légèrement pour atteindre son maximum vers les jours 14 à 18 post-nataux. Vingt-quatre

jours après à la naissance, pratiquement toutes les régions du cerveau du rat sont

complètement myélinisées (Downes and Mullins, 2013). Suite à une LME chez la souris, le

nombre d’OLs diminue rapidement au cours des 24 premières heures pour atteindre son

niveau le plus bas à 7 jours post-lésion (Lytle and Wrathall, 2007). La mort des OLs reste

détectable pour au moins 3 semaines suivant une LME (Li et al., 1999, Casha et al., 2001).

L’apoptose et la nécrose sont les mécanismes de mort cellulaire les plus susceptibles d’être

responsables de la destruction des OLs. Une des conséquences directes de la mort des OLs

serait la démyélinisation des axones, ce qui affecte grandement la conduction de l’influx

nerveux à travers les neurones endommagés et par conséquent, les fonctions motrices et

sensorielles. Plusieurs conditions nuisibles à la survie cellulaire apparaitraient suite à une

LME et seraient responsables de la mort des OLs, comme entre autre la présence de

13

molécules oxydantes provoquant le stress oxydatif, la relâche de glutamate par les neurones

et les cellules gliales ainsi que la relâche de plusieurs cytokines pro-inflammatoires pouvant

activer différentes voies de signalisation menant à la mort cellulaire, telles que le TNF-α,

l’IL-2 et l’IFN-γ (Mctigue and Tripathi, 2008).

Dans le but de repeupler le tissu nerveux d’OLs myélinisants et favoriser la remyélinisation

des axones endommagés ou nouvellement formés, les OPC doivent être activés par les

cellules gliales. Les astrocytes et les microglies sont des sources majeures de facteurs de

croissance, comme par exemple PDGF et FGF, induisant la prolifération rapide des OPCs

suite à une lésion. La régulation de la transcription joue aussi un rôle important dans la

différenciation des OPCs en OLs myélinisants. Les facteurs de transcription possédant un

domaine hélice-boucle-hélice, comme par exemple Olig1 et Olig2, ont été démontrés

comme étant essentiels à la production des OLs et mêmes des neurones au cours du

développement (Lu et al., 2000, Zhou et al., 2000, Takebayashi et al., 2002). Étonnamment,

les cellules progénitrices des souris se développant en absence d’Olig1 et d’Olig2 (souris

Olig1/2-/-), et qui en temps normaux devraient produire des motoneurones et des OLs,

génèrent plutôt des interneurones et des astrocytes (Zhou and Anderson, 2002). Une autre

étude a démontré qu’Olig1 n’est pas requis pour le développement des neurones moteurs

mais favorise plutôt la formation et la maturation des OLs dans le cerveau, tandis qu’Olig2

est essentiel à la formation des neurones moteurs (Lu et al., 2002). Plus récemment, Hughes

et al. ont généré des souris NG2-mEGFP pour démontrer par microscopie in vivo à 2-

photons le dynamisme des OLs dans un cerveau adulte (Hughes et al., 2013). Les analyses

par microscopie ont révélé que les prolongements des cellules NG2+ sont constamment en

mouvement dans le but de surveiller leur environnement dans le cerveau sain. De plus, ces

cellules migrent de façon continue dans le cortex adulte en réorientant leurs prolongements

en direction opposée des péricytes qui eux demeurent presque toujours stationnaires.

Hughes et al. ont aussi démontré que la densité de la population d’OLs NG2+ est maintenue

par la perte cellulaire (mort ou différenciation) et l’addition continue de nouvelles cellules

(prolifération). Ensemble, ces résultats signifient que les cellules précurseurs sont

disponibles pour remplacer les OLs endommagés ou morts suite à une lésion du SNC et que

ceux-ci participent à la réparation tissulaire en favorisant la production d’OLs myélinisants.

14

1.3. Neuropathologie des LME

1.3.1. La lésion primaire Les LME sont divisées en 2 grands évènements pathologiques: la lésion primaire et la

lésion secondaire. Chez l’humain, la LME survient dans la majorité des cas suite à un

impact ou une compression prolongée sur la colonne vertébrale pouvant endommager la

moelle épinière. La force mécanique de l’impact peut aussi résulter en fracture des os,

dislocation ou rupture des disques intervertébraux risquant d’entraîner des dommages à la

moelle. Plus précisément, la lésion primaire consiste en la destruction locale des neurones

et de cellules de support de toutes sortes (ex. : cellules endothéliales, cellules gliales, etc.),

causant ainsi l’apparition d’une zone dite nécrotique (Tator, 1995). La rupture des

vaisseaux sanguins qui irriguent la moelle épinière est donc une conséquence directe d’une

LME. L’amplitude de l’hémorragie, tout comme l’ampleur des dommages tissulaires,

dépendent évidemment de la sévérité de l’impact initial survenu sur le tissu. À l’épicentre,

l’écoulement sanguin maximal se retrouve majoritairement dans la matière grise tandis qu’à

l’extérieur de l’épicentre, il se situe surtout dans la matière blanche de la corne dorsale où il

est beaucoup moindre (Mautes et al., 2000). Les changements à la structure et aux fonctions

des vaisseaux sanguins incluent la perte d’apport sanguin à la moelle épinière, l'absence

d'apport en oxygène et nutriments indispensables, la mort des cellules endothéliales et la

rupture de la BHS (Tator and Koyanagi, 1997). En effet, la rupture de la BHS survient très

tôt suite à une LME, aussitôt que 1 heure post-lésion, pour un atteindre un maximum au

temps 24 heures. L’étanchéité de la BHS se rétablit partiellement par la suite (Figley et al.,

2013). En effet, la perméabilité de la barrière à des colorants tel que Evans Blue est revenue

à un niveau basal dès 14 jours post-LME. Il a aussi été démontré par Figley et al. que

l’angiogenèse débute au troisième jour post-lésion et ce jusqu’au dixième jour, avec un

maximum à 5 jours post-LME au cours duquel il y a environ 15% des vaisseaux qui sont

Ki67+ (Ki67 est un marqueur de prolifération cellulaire). Enfin, la rupture de la BHS a pour

effet de faciliter l’influx de cellulaires immunitaires au site lésionnel. Des analyses par

immunohistochimie ont permis de déterminer que la réponse inflammatoire suite à une

lésion est significativement plus grande dans la moelle épinière que dans le cortex cérébral

(Schnell et al., 1999). L’aire de rupture de la BHS est également plus large et les dommages

15

vasculaires persistent plus longtemps dans la moelle épinière, corrélant ainsi avec une

présence soutenue des cellules immunitaires autour de l’aire de rupture.

1.3.2. Dégénérescence secondaire Suivant la lésion, les axones lésés entreprennent un processus de dégénérescence rapide qui

se déclenche en moins de 30 min et qui est caractérisé par la fragmentation de l’axone à

proximité du site lésionel (Kerschensteiner et al., 2005). Ce phénomène appelé

dégénérescence axonale aigüe (DAA) affecte principalement les segments axonaux du côté

proximal à la lésion, c.-à-d. les axones qui demeurent connectés aux corps cellulaires

neuronaux. La DAA s’apparente à la dégénérescence Wallérienne (DW). Par contre, au

cours de la DW, ce sont plutôt les segments axonaux qui sont situés du côté distal à la

lésion, et donc déconnectés de leur corps cellulaire, qui dégénèrent. La DW est caractérisée

par la désintégration du cytosquelette présent dans les axones et de la gaine de myéline. De

plus, une des étapes très importantes de ce processus est l’élimination des débris de myéline

par les cellules phagocytaires présentes dans le système nerveux (Kerschensteiner et al.,

2005). Suite à la lésion d’un nerf périphérique (LNP), l’élimination des débris de myéline

est largement complétée au cours des 14 jours suivant la lésion. Par contre, suite à une

lésion du SNC, cette élimination peut prendre plusieurs semaines voire même des années. Il

pourrait d’ailleurs s’agir de l’une des principales raisons pour laquelle la régénérescence

des axones est compromise dans le SNC suite à une lésion (Vargas and Barres, 2007). Il est

aussi important de mentionner que les OLs possèdent très peu de capacité de phagocytose,

contrairement aux cellules de Schwann, les cellules myélinisantes du SNP.

De plus, les lésions secondaires survenant après la lésion primaire peuvent être causées par

le déclenchement de différents mécanismes moléculaires et cellulaires qui entrainent

ultimement la mort des neurones et des cellules gliales, des réponses qui sont à l’origine

d’une partie des dommages tissulaires. Ces dommages secondaires contribuent à une plus

grande perte des fonctions locomotrices et contreviennent donc à la récupération et la

réadaptation d’un patient atteint d’une LME. Les cellules gliales sont impliquées de très

près dans l’évolution de ces mécanismes. Un des phénomènes reliés à l’activation des

16

astrocytes, appelé astrogliose, est la formation de la cicatrice gliale constituant une cause

majeure de l’échec de la régénérescence axonale suite à une lésion du SNC. Les

conséquences plus exactes de l’activation des astrocytes et de la formation de cette cicatrice

ont été discutées plus en détails à la section 1.2.2 qui porte sur le rôle des astrocytes dans

un modèle de LME. En plus des astrocytes, la cicatrice gliale est formée d’une population

hétérogène de cellules interagissant ensemble au cœur de la lésion (Figure 1.5). Le site

lésionnel est notamment envahi par des OPCs NG2+, des fibroblastes, des microglies de

même que des cellules immunitaires pro-inflammatoires telles que les macrophages (Cregg

et al., 2014). La région la plus externe de la cicatrice est quant à elle majoritairement

composée d’astrocytes réactifs.

Figure 1.5: La cicatrice gliale

Les axones tentant de se régénérer en pénétrant la cicatrice gliale et la lésion semblent avoir

un peu plus de difficulté à repousser. La présence d’une grande quantité de CSPGs, une

famille de protéines de la matrice extracellulaire comprenant notamment NG2, neurocane,

aggrécane, brévicane, versicane et phosphacane, y jouerait un rôle clé puisque ces

molécules sont maintenant reconnues comme étant de puissants inhibiteurs de la repousse

axonale (Silver and Miller, 2004). En effet, la dégradation de la chaîne de

17

glycosaminoglycane contenue dans les CSPGs par la chondroitinase ABC a permis de

promouvoir la régénération d’axones projetant dans les voies sensorielles ascendantes et

corticospinales descendantes (Bradbury et al., 2002). Plusieurs protéines associées aux OLs

et contenues dans la myéline ont aussi été identifiées comme étant des inhibiteurs de la

croissance axonale: la glycoprotéine associée à la myéline (MAG), la glycoprotéine

d’oligodendrocytes (OMgp), Nogo (David et Lacroix, 2003), l’éphrine (Benson et al. ,

2005) et la sémaphorine (Moreau-Fauvarque et al., 2003) (Yiu and He, 2006) (Shim et al.,

2012). Trois de ces molécules se lient au même récepteur, le récepteur Nogo (NgR), présent

sur les neurones. NgR est une protéine liée au GPI (glycosylphosphatidylinositol) qui

nécessite la formation d’un complexe avec une protéine transmembranaire comme p75NTR,

Troy ou Lingo1 pour assurer la transmission du signal inhibiteur de ces ligands, menant

ainsi à l’échec de la croissance axonale (David et Lacroix, 2003, Schwab et Strittmatter,

2014). L’inhibition de cette voie de signalisation pourrait représenter une thérapie

intéressante pour favoriser la régénérescence axonale suite à une lésion du SNC

(Domeniconi et al., 2002, Lee and Zheng, 2012, Schwab and Strittmatter, 2014). En effet,

plusieurs études ont rapporté que l’injection d’un anticorps dirigé contre Nogo-A (anti-

Nogo-A) chez le rongeur a pour effet d’améliorer la récupération des fonctions

locomotrices de l’animal suite à une LME (Zörner and Schwab, 2010, Pernet and Schwab,

2012). De même, des singes ayant subi une lésion cervicale et traités avec cet anticorps ont

récupéré une plus grand dextérité et habileté de leur mains que les sujets contrôles non

traités (Freund et al., 2009). De plus, il a été démontré que la combinaison du traitement de

l’anti-Nogo-A avec la chondroitinase ABC serait encore plus efficace qu’une simple

injection d’anti-Nogo-A pour améliorer la récupération suite à la lésion (Zhao et al., 2013).

1.4. Signalisation intracellulaire de l’initiation de l’inflammation L’inflammation est très importante pour la régulation des phénomènes de dégénérescence

et de régénérescence discutés dans les sections précédentes (e.g. formation de la cicatrice

gliale, maintien de la BHS, prolifération des oligodendrocytes et activation des microglies).

En effet, le système immunitaire effectue une surveillance permanente dans le SNC où

l’initiation de l’inflammation prend place en réponse à différents stimuli. La reconnaissance

18

des antigènes des micro-organismes pathogènes (PAMPs; pathogen-associated molecular

patterns) ou de molécules endogènes associées au danger (DAMPs; damage-associated

molecular patterns) est essentielle pour l’induction d’une réponse immunaire efficace. Les

mécanismes de reconnaissance sont médiés par une série de récepteurs membranaires ou

intracellulaires qui permettent l’activation de l’inflammation. Ces récepteurs sont appelés

récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires (PRRs; pattern recognition receptors).

Ces récepteurs incluent les récepteurs de type Toll (TLRs; Toll-like receptors) et les

récepteurs de type NOD (NLRs; NOD-like receptors). Les prochaines sections discuteront

de ces différents récepteurs ainsi qu’un autre type de récepteur impliqué dans l’initiation de

l’inflammation, les récepteurs purinergiques de type P2X (P2XRs). D’autres PRRs ont

aussi été identifiés tels que les RIG-like helicases (RLRs) et les C-type lectin receptors

(CLRs) mais ceux-ci ne seront pas décris dans cette thèse étant donné leur rôle moins

prédominant suite à une LME.

1.4.1. Les TLRs Les membres de la famille des TLRs sont responsables de la détection des pathogènes

présents à l’extérieur ou à l’intérieur de la cellule (Akira et al., 2006). Les TLRs sont

caractérisés par la présence d’une extrémité N-terminale riche en leucine (LRR) et d’un

domaine cytoplasmique Toll/IL-1R (TIR) présentant une grande similarité avec le récepteur

de type 1 de l’IL-1 (IL-1R1). Dix et douze TLRs ont été identifiés chez l’humain et la

souris respectivement. Les différents TLRs sont capables de reconnaître différents motifs

présents chez les microorganismes ou les composantes du soi. Les TLRs 1, 2 et 6 semblent

détecter les lipides tandis que les TLRs 7, 8 et 9 reconnaissent plutôt les acides nucléiques.

D’autres TLRs sont capables de détecter une panoplie de ligands. Par exemple, le TLR4

reconnaît aussi bien l’endotoxine bactérienne lipopolysaccharide (LPS) et le taxol que des

molécules du soi telles que les protéines de choc thermique (HSPs), le fibrinogène et les

oligosaccharides d’acide hyaluronique (Takeda and Akira, 2005). La liaison d’un PAMP

par les TLRs conduit rapidement à la transcription de différents gènes pro-inflammatoires.

En effet, les TLRs sont capables d’activer différentes voies signalétiques via des molécules

adaptatrices se liant au domaine TIR du récepteur (Takeuchi and Akira, 2010). Les 2

19

principales voies sont régulées par des molécules adaptatrices comme le gène de réponse

primaire de différenciation de cellules myéloïdes 88 (MyD88 ; myeloid differentiation

primary 88) et le domaine TIR induisant l’IFN-β (TRIF ; TIR domain-containing adaptor

inducing IFN-β). Ces molécules adaptatrices activent des facteurs de transcription comme

le facteur nucléaire NF-κB (NF-κB ; nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of

activated B cells), les MAP-kinases (MAPK) et les facteurs régulant l’IFN (IRFs ; IFN-

regulatory factors), entraînant du même coup la transcription de cytokines telles que l’IL-1,

l’IL-6, le TNF-α et l’IFN-β (Casanova et al., 2011).

Les TLRs sont exprimés sur la majorité des cellules du système immunitaire incluant les

lymphocytes B (Gerondakis et al., 2007) et T (Sutmuller et al., 2007), les neutrophiles

(Sabroe and Whyte, 2007), les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques

(Kaisho and Akira, 2006). Ils sont également exprimés par les cellules gliales et les

neurones du SNC et peuvent donc reconnaître des ligands endogènes et déclencher

l’inflammation (Lee et al., 2013). Étant donné que la microglie est l’une des premières

cellules à répondre à un pathogène dans le SNC, il va de soit que cette population cellulaire

exprime une panoplie de TLRs de toutes sortes qui sont nécessaires à l’activation de la

réponse immunitaire (Lehnardt, 2010). Toutefois, dans certains contextes, les réponses

engendrées par l’activation des TLRs semblent aller au-delà de la réponse inflammatoire, et

ce bien qu’il soit parfois difficile d’évaluer les conséquences indirectes de l’inflammation.

Par exemple, l’activation de TLR4 par la LPS peut entrainer la mort des neurones corticaux

par un mécanisme qui dépend de la microglie (Lehnardt et al., 2003). En effet, en absence

de microglies, la LPS n’a aucun effet sur la mort de neurones en culture puisque ceux-ci

n’expriment pas le TLR4. Par contre, l’ajout de microglies purifiées puis traitées à la LPS

provoque la mort neuronale. Il fut aussi démontré que l’ARNm codant pour le TLR2 est

exprimé dans certaines cellules du SNC, principalement dans les microglies (Laflamme et

al., 2001). Une étude plus récente a confirmé que le streptocoque de groupe B (GBS) peut

causer des dommages aux neurones via un mécanisme dépendant du TLR2 exprimé chez la

microglie (Lehnardt et al., 2006). Ces résultats suggèrent donc que les TLR peuvent exercer

des effets neurotoxiques dans des cas d’infection du SNC, comme lors d’une méningite par

20

exemple. La plupart des TLRs furent aussi détectés dans des cultures primaires d’astrocytes

murins ou humains (Lee et al., 2013). Par contre, l’expression des TLRs dans ces mêmes

cellules in vivo est plutôt limitée. Dans le cerveau de rats naïfs, la présence de TLR2 et

TLR4 dans les astrocytes est indétectable, suggérant que ces récepteurs ne sont pas

exprimés chez les astrocytes non-réactifs. Au contraire, le TLR4 fut détecté chez les

astrocytes situés à l’intérieur de lésions cérébrales chez des patients atteints de SP mais pas

dans les régions non-atteintes de la matière blanche, démontrant du même coup que TLR4

est seulement exprimé chez les astrocytes activés (Bsibsi et al., 2002). Ces résultats

suggèrent que les TLRs pourraient être des médiateurs importants de l’activation des

astrocytes. Supportant cette possibilité sont les travaux montrant que la stimulation

d’astrocytes en culture à la LPS, un activateur de TLR4, déclenche l’astrogliose et la

relâche de cytokines pro-inflammatoires (IL-1β, IL-6 et TNF) via un mécanisme dépendant

de la voie de signalisation NF-κB (Maezawa et al., 2006).

Les TLRs sont impliqués dans le développement et dans plusieurs maladies du système

nerveux. Par exemple, les TLRs jouent un rôle important au cours de l’embryogenèse plus

précisément dans le développement et la formation neuronale. En effet, les cellules

progénitrices neurales (NPCs) expriment les TLRs 2, 3 et 4 et ceux-ci seraient

vraisemblablement impliqués dans la prolifération et la différenciation des NPCs. Ces

récepteurs semblent donc influencer plusieurs aspects de la physiologie neuronale chez

l’adulte comme la neurogenèse et la plasticité, suggérant que les TLRs pourraient moduler

les fonctions cognitives (Okun et al., 2011). Paradoxalement, des études ont démontré

l’effet néfaste de l’activation des TLRs dans des modèles de maladies neurodégénératives

ou suite à une lésion du SNC (Bell et al., 2013) (Li et al., 2014). En effet, l’expression de

TLR 4 et la présence de microglies activées furent observées près des zones hémorragiques

suite à une contusion de la moelle corrélant avec une sur-régulation de NF-κB, une

présence accrue de cellules apoptotiques et la rupture de la BHS (Zhang et al., 2013). Bien

que les microglies ont été identifiées comme étant un type cellulaire contribuant à la

neurotoxicité suite à une stimulation des TLR 2 et 4 en augmentant la relâche de glutamate

et de cytokines pro-inflammatoires (Lehnardt et al., 2002), Stirling et al. ont rapporté que la

21

microglie activée via le TLR 2 est bénéfique suite à une LME (Stirling et al., 2013). En

effet, le traitement de la moelle épinière lésée, maintenue viable ex vivo, avec un

antagoniste de TLR 2, Pam2CSK4, a permis d’augmenter l’activation microgliale et de

réduire la dégénérescence axonale favorisant ainsi la formation d’un cône de croissance et

la régénérescence axonale. L’ajout d’agonistes de TLR 4, tels que la LPS et le zymosan, ne

fut pas en mesure de reproduire ces effets. L’étude du mécanisme sous-jacent les effets

bénéfique du traitement au Pam2CSK4 a démontré que cet agoniste de TLR2 provoque une

activation alternative de la population microgliale, suggérant du même coup que le

phénotype de la cellule immunitaire puisse réguler la fine balance entre dommages

tissulaires et réparation tissulaire. De plus, Kigerl et al. ont démontré que la délétion des

gènes codant pour TLR 2 et 4 entraîne des déficits locomoteurs suite à une LME qui sont

associés avec une augmentation de la démyélinisation, de l’activation des astrocytes et des

macrophages et une expression accrue de l’ARNm de l’IL-1β (Kigerl et al., 2007).

Ensemble, ces résultats suggèrent que la régulation spécifique de l’activation des cellules

gliales composant le SNC peut présenter autant des effets neuroprotecteurs que néfastes

suite à une LME.

1.4.2. Les NLRs

Les NLRs font partie d’une famille de récepteurs intracellulaires parmi lesquels on retrouve

pas moins de 34 membres chez la souris et 23 membres chez l’humain. La fonction

principale connue pour ces récepteurs consiste à procéder au clivage de l’interleukine-1β

(IL-1β), de l’interleukine-18 (IL-18) et de l’interleukine-33 (IL-33) grâce à l’activation de

la caspase-1. De façon générale, les NLRs possèdent à l’extrémité N-terminale un domaine

effecteur pyrine (PYD) ou caspase activation and recruitment domain (CARD),

responsable il va s’en dire du recrutement et de l’activation de la caspase. On retrouve à

l’extrémité C-terminale un domaine LRR tandis que la section intermédiaire (centre)

dispose d’un site de liaison aux nucléotides et d’oligomérisation (domaine NOD ou

NACHT). Le domaine LRR semble interagir avec les ligands et jouer un rôle dans

l’autorégulation de la protéine, tandis que le domaine NACHT lie les nucléotides et par le

fait même régule l’oligomérisation et l’assemblage d’un complexe protéique appelé

22

inflammasome responsable de l’activation de la caspase-1 et de la caspase-11 (souris) ou

caspase-5 (humain). Les domaines PYD et CARD N-terminaux médient les interactions

protéine-protéine de ce complexe (Latz, 2010, Schroder and Tschopp, 2010).

L’analyse des membres de la famille des NLRs permet la distinction de 3 sous-familles:

NODs, NLRPs (ou NALPs) et IPAF. Le domaine effecteur N-terminal PYD ou CARD

permet de différencier les membres de chacune de ces familles. Ces domaines font partie

d’une superfamille incluant, en plus de PYD et CARD, le domaine de mort cellulaire (DD;

death domain) et le domaine effecteur de mort cellulaire (DED; death effector domain)

(Park et al., 2007). Dans la majorité des cas, un domaine DD interagit avec un autre

domaine DD, CARD avec CARD, DED avec DED et PYD avec PYD. De cette manière,

ces domaines recrutent d’autres molécules dans le but d’activer une cascade signalétique.

La molécule adaptatrice apoptosis-associated speck-like protein containing a carboxy-

terminal domain (ASC ou Pycard) s’ajoute à ce complexe et lie le NLR à la caspase-1

grâce à ses domaines PYD et CARD situés à chacune de ses extrémités N- et C- terminales.

La molécule adaptatrice ASC régule donc l’activation de la caspase-1 et la formation de

l’inflammasome (Masumoto et al., 1999, Martinon et al., 2002, Mariathasan et al., 2004).

ASC possède un rôle spécifique dans le clivage et la relâche de l’IL-1β, l’IL-18 et l’IL-33,

mais n’affecte pas la sécrétion d’autres cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF et

l’IL-6 (Mariathasan et al., 2004). En effet, des macrophages déficients en ASC stimulés

avec la LPS et l’ATP produisent une quantité normale de TNF et d’IL-6, mais moins d’IL-

1β. À ce jour, 4 NLRs sont connus pour être capable de former, in vivo, un inflammasome

dit fonctionnel (Kanneganti, 2010)(Lamkanfi and Dixit, 2009). L’équipe de Tschopp a été

la première à mentionner l’existence de ce type de complexe multi-protéique d’environ 700

kDa (Martinon et al., 2002).

La Figure 1.6 (Schroder and Tschopp, 2010) illustre ces 4 différents inflammasomes :

NACHT domain-, LRR-, and PYD-containing protein 1 (NLRP1), NLRP3 (aussi connu

sous le nom de cryopyrine), IL-1β-converting enzyme protease-activating factor (IPAF) et

23

absent in melanoma 2 (AIM2; un récepteur de la famille hematopoietic interferon-inducible

nuclear protein ou HIN). Les sections suivantes discuteront de façon plus détaillée de ces 4

inflammasomes ainsi que du rôle de la molécule adaptatrice ASC à l’intérieur de ces

complexes.

Figure 1.6: Structure des inflammasomes

1.4.2.1. L’inflammasome NLRP1 Le premier inflammasome identifié fut NLRP1 (NALP1). En plus de contenir les domaines

PYD, NACHT et LRR, NLRP1 contient à son extrémité C-terminale un domaine CARD

supplémentaire. La formation de l’inflammasome NLRP1 recrute la molécule adaptatrice

24

ASC, la caspase-1 ainsi que la caspase-5 (humain) ou caspase-11 (souris) via son domaine

CARD (Martinon et al., 2002). En effet, il a été démontré, par immunoprécipitation dans un

système libre de cellules (cell-free system) que NLRP1 interagit faiblement avec la caspase-

5, entraînant malgré tout le clivage et l’activation de cette caspase. De plus, l’étude à

démontré qu’ASC interagit fortement avec la caspase-1 via son domaine CARD, produisant

ainsi le clivage et l’activation de la caspase-1 et par le fait même, le clivage de l’IL-1ββ .

ASC est indispensable dans ce mécanisme puisque les cellules exprimant seulement le

domaine PYD d’ASC, c.-à-d. un dominant négatif Pycard capable d’interagir seulement

avec NLRP1 et agissant comme un inhibiteur du recrutement de la caspase-1, produisent de

très faibles niveaux d’IL-1β clivée. Dans une étude plus récente, Faustin et al. ont suggéré

qu’ASC n’est pas requise pour le clivage et l’activation de la caspase-1, mais que sa

présence en combinaison avec NLRP1 a pour effet de doubler l’activité catalytique de

caspase-1 (Faustin et al., 2007). Le domaine CARD supplémentaire à l’extrémité C-

terminale de NLRP1 lui confère donc la possibilité de lier et activer la caspase-1 par lui-

même sans l’aide d’ASC. Faustin et al. ont aussi mis de l’avant un mécanisme en 2 étapes

au cours duquel un activateur de NLRP1, tel que le cofacteur bactérien muramyl dipeptide

(MDP), induirait un changement conformationel de NLRP1 qui permettrait la liaison d’un

nucléotide à trois phosphates (NTP), tel que l’ATP, et l’oligomérisation de l’inflammasome

menant à l’activation des caspases 1 et 5.

L’inflammasome NLRP1 semble aussi interagir avec 2 molécules anti-apoptotiques

importantes, Bcl-2 et Bcl-XL (Bruey et al., 2007, Faustin et al., 2009). La 1ière étude a tout

d’abord démontré que NLRP1, mais pas NLRP2, -3 et -4, est capable de lier Bcl-2 et BCL-

XL chez des macrophages in vitro. Lorsque NLRP1 est lié à Bcl-2 et BCL-XL, NLRP1 est

incapable de s’associer à ASC, résultant alors à une diminution de l’activation de la

caspase-1 et de l’IL-1β mature. Bien que ces 2 molécules anti-apoptotiques empêchent

l’assemblage fonctionnel de l’inflammasome, elles ne modifient pas les niveaux

d’expression de ses composantes. La seconde étude a mis en évidence un mécanisme

d’inhibition plus détaillé. Cette équipe a démontré que Bcl-2 et BCL-XL inhibent, via un

court domaine en boucle (loop domain), la liaison de l’ATP à NLRP1 nécessaire à son

oligomérisation et son activation. La délétion de cette région en boucle n’a toutefois pas

25

permis à ces protéines de procéder à l’inhibition de l’inflammasome et, par conséquent,

l’inhibition de caspase-1. Bcl-2 et BCL-XL agissent donc comme inhibiteurs compétitifs

directs de NLRP1 puisque leur action est dépendante de leur concentration, un résultat

observé à l’aide d’une analyse de leur activité enzymatique. Ces résultats suggèrent que les

mécanismes impliqués dans l’inflammation et l’apoptose pourraient être fortement inter-

reliés.

NOD2, un NLR répondant à MDP, tout comme NLRP1, est capable de s’associer à NLRP1

et de former un complexe menant à l’activation de la caspase-1 et au clivage de l’IL-1ββ

(Hsu et al., 2008). Hsu et al. ont démontré que NOD2 est requis pour la sécrétion de l’IL-

1β par les macrophages péritonéaux suite à une induction au MDP. Bien que NLRP1

augmente la capacité de NOD2 à stimuler la sécrétion d’IL-1β et que NOD2 augmente la

liaison de NLRP1 à la caspase-1, NOD2 est aussi capable d’interagir directement avec la

caspase-1 et de procéder à son activation via son domaine N-terminal CARD. Enfin, le rôle

de NOD2 dans la maturation de l’IL-1β fut démontré in vivo chez des souris infectées avec

la toxine de Bacillus anthracis, une bactérie responsable du développement de l’anthrax,

puisque les souris Nod2-/- relâchent des niveaux plus faibles d’IL-1β.

En plus de l’expression de NLRP1 dans les cellules immunitaires, il a été rapporté que

certains types de neurones du SNC expriment NLRP1 et qu’une LME a pour effet de

stimuler la formation de cet inflammasome (de Rivero Vaccari et al., 2008, Abulafia et al.,

2009, de Rivero Vaccari et al., 2009). En effet, il a été démontré que les différentes

composantes de l’inflammasome NLRP1, comprenant la caspase-1, caspase-11, ASC,

NLRP1 et XIAP, sont exprimées dans les neurones moteurs de la moelle épinière de rats

naïfs et lésés (de Rivero Vaccari et al., 2008). Suite à une LME, ces composantes sont

rapidement sur-exprimées sauf pour NLRP1 dont les niveaux d’expression demeurent

inchangés. L’assemblage de l’inflammasome NLRP1 suite à une LME entraîne l’activation

de la caspase-1 et de XIAP ainsi que le clivage de l’IL-1β et l’IL-18. L’injection d’un

anticorps neutralisant spécifique à ASC chez des rats ayant subi une LME provoque une

diminution du clivage de la caspase-1 et de XIAP ainsi qu’une diminution du clivage de

l’IL-1β et de l’IL-18. Fait intéressant, ce traitement causant la réduction de l’activité des

26

inflammasomes ASC-dépendants a permis de réduire le volume des dommages tissulaires

se traduisant par une préservation de la matière blanche et une préservation de la

morphologie des neurones moteurs. L’injection d’anti-ASC a aussi facilité la récupération

des fonctions locomotrices suite à la LME. Ces résultats ont été plus tard confirmés par le

même groupe dans un modèle de lésion traumatique du cerveau (de Rivero Vaccari et al.,

2009) et dans un modèle d’accident vasculaire cérébral (AVC) (Abulafia et al., 2009). Dans

ce dernier article, il fut démontré que les composantes de l’inflammasome NLRP1 sont

aussi présentes dans les macrophages, les microglies, les astrocytes et les neurones suite à

l’AVC. La neutralisation de NLRP1 avec un anti-NLRP1 a permis de réduire l’activation

de la caspase-1, l’assemblage de l’inflammasome et par le fait même de diminuer les

dommages tissulaires causés par ce type de lésion du cerveau. Les altérations des niveaux

intracellulaires d’ATP et de la concentration en potassium et autres composants cellulaires

(ATP, ARN, ROS) pourraient avoir contribué à l’activation de l’inflammasome, tel que

discuté dans d’autres articles (Mariathasan and Monack, 2007, Pétrilli et al., 2007).

Ensemble, ces résultats suggèrent que les inflammasomes ne sont pas seulement impliqués

dans les fonctions pro-inflammatoires des cellules immunitaires mais aussi dans celles des

cellules du SNC. Les inflammasomes semblent également jouer un rôle important dans les

dommages infligés au tissu nerveux suite à une lésion.

1.4.2.2. NLRP3 (NALP3) L’inflammasome NLRP3 est sans contredit celui qui a été le plus étudié. NLRP3 est

fortement exprimé par la plupart des cellules myéloïdes, tandis que les cellules lymphoïdes,

éosinophiles et dendritiques plasmacytoïdes expriment faiblement cet inflammasome

(Guarda et al., 2011). Son expression génique peut être sur-régulée chez les monocytes

humains ou macrophages murins en présence de molécules inductrices qui seront discutées

plus bas (O'Connor et al., 2003, Guarda et al., 2011). Son gène code pour un domaine PYR,

un domaine central nucleotide binding domain (NBD) ainsi qu’un domaine C-terminal

LRR (Hoffman et al., 2001). NLRP3 interagit avec la molécule adaptatrice ASC via une

interaction avec le domaine PYR. Cet oligomère nouvellement formé recrute par la suite la

pro-caspase-1 via les domaines CARD situés sur les molécules ASC et pro-caspase-1,

causant ainsi le clivage et l’activation de la caspase-1 (Gross et al., 2011).

27

Bien qu’on retrouve une expression basale de NLRP3 chez des cellules immunitaires non-

stimulées ou au repos, cela n’est pas suffisant pour la formation du complexe protéique

(Bauernfeind et al., 2009). Deux stimuli semblent nécessaires pour l’activation et la

formation de l’inflammasome NLRP3 (Franchi et al., 2009, Latz, 2010). D’abord, les

récepteurs appartenant à la famille des récepteurs TLR/IL-1R doivent lier leur ligand et

ensuite recruter la molécule adaptatrice MyD88, entraînant du même coup la synthèse de

différents médiateurs pro-inflammatoires dont la pro-forme de l’IL-1β. Le deuxième signal

consiste en l’activation d’un récepteur purinergique tel que P2X7R (Mariathasan et al.,

2006). Mariathasan et al. ont démontré dans un modèle in vitro de macrophages stimulés à

la LPS, un agoniste du TLR4, et à l’ATP, un ligand de P2X7R, que l’absence de NLRP3

entraîne une plus faible activation de la caspase-1 et de la relâche de l’IL-1β. La stimulation

du P2X7R induit aussi un efflux de K+ nécessaire à l’activation de l’inflammasome. Par

contre, cette baisse de potassium intracellulaire occasionnée par la présence d’ATP n’est

pas suffisante en soi pour conduire au clivage et à la relâche de l’IL-1β. La stimulation à

l’ATP sans LPS n’entraîne pas non plus l’activation de la caspase-1, démontrant encore une

fois la nécessité des deux signaux pour l’obtention d’une réponse IL-1β adéquate. De plus,

la présence de fortes concentrations extracellulaires en potassium (130 mM) a pour effet

d’abolir la relâche d’IL-1β chez des macrophages humains et murins (Pétrilli et al., 2007).

L’inflammasome NLRP3 peut être activé par une panoplie de molécules différentes comme

les PAMPs, DAMPs, l’acide urique, la silice, l’ATP, l’alun et les radiations UV (Lamkanfi

and Dixit, 2012). Par conséquence, cet inflammasome a été décrit comme étant impliqué

dans le développement de diverses maladies telles que l’arthrite, la goutte, le syndrome

Muckle-Wells, l’amiantose et la SP (Agostini et al., 2004, Martinon et al., 2006, Dostert et

al., 2008, Gris et al., 2010). Dans le cas de la goutte, ce serait les dépôts de cristaux d’acide

urique que nous retrouvons dans certaines articulations qui stimuleraient l’inflammasome

NLRP3, l’activation de la caspase-1 et la production d’IL-1β et d’IL-18 (Martinon et al.,

2006). Ce mécanisme entraînerait un influx de cellules immunitaires innées telles que les

neutrophiles et macrophages au site inflammatoire, causant ainsi des dommages tissulaires

aux articulations. Ceci fut d’ailleurs démontré chez des souris Asc-/- où l’absence de la

28

molécule adaptatrice ASC cause une diminution du recrutement en neutrophiles en réponse

à la présence de cristaux d’acide urique. Les niveaux d’expression de l’ARNm codant pour

NLRP3 sont également fortement induits dans le modèle murin de la SP, l’EAE (Gris et al.,

2010). Les souris Nlrp3-/- présentent une réduction de l’infiltration de cellules immunitaires

telles que les macrophages, cellules dendritiques et cellules T CD4+ et CD8+ dans leur

moelle épinière. Les coupes histologiques de moelles épinières provenant de ces animaux

montrent d’ailleurs une plus faible démyélinisation et une plus forte astrogliose. Les souris

Nlrp3-/- exhibent aussi un délai dans l’apparition de la maladie et une réduction dans la

sévérité des symptômes. Ce mécanisme semble être dépendant de la production d’IL-18

puisque l’absence de NLRP3 entraîne une plus faible synthèse de cette cytokine et que les

souris Il-18-/- développent l’EAE de façon identique aux souris Nlrp3-/-.

1.4.2.3. L’inflammasome AIM2 L’inflammasome AIM2 est un membre de la famille hematopoietic interferon-inducible

nuclear protein with a 200-amino acid repeat (HIN-200). Il est le seul inflammasome à ne

pas faire partie de la famille des NRLs. Bien que les membres de la famille HIN-200 soient

principalement considérés comme étant des régulateurs de la transcription lors de la

proliferation et de la différenciation cellulaire, AIM2 est localisé dans le cytoplasme de la

cellule et reconnaît l’ADN cytosolique double brin via son domaine HIN-200.

L’inflammasome AIM2 est composé des protéines AIM2, ASC et caspase-1 et est capable

d’induire la maturation de l’IL-β via un mécanisme dépendant de caspase-1. AIM2 est

d’ailleurs le seul membre de la famille HIN-200 à se lier à ASC (Hornung and Latz, 2010).

La structure de AIM2 possède un domaine PYD qui se lie à ASC via une interaction PYD-

PYD, ce qui permet à ASC de recruter la pro-caspase-1 via le domaine de liaison CARD.

Le rôle de AIM2 dans la reconnaissance de l’ADN double brin a été démontré grâce aux

souris Aim2-/-. Il a été démontré que les macrophages de souris Aim2-/- présentent des

déficits dans l’activation de la caspase-1 et la sécrétion d’IL-1β en réponse à une infection à

la bactérie Francisella tularensis ou en présence d’ADN cytoplasmique d’origine virale

(Rathinam et al., 2010) (Fernandes-Alnemri et al., 2010). L’inflammasome AIM2 a aussi

29

été impliqué dans les mécanismes de mort cellulaire comme l’apoptose et la pyroptose

(Sagulenko et al., 2013, Adamczak et al., 2014). Dans ce cas, AIM2 est capable d’activer la

caspase-8 via le recrutement de la molécule adaptatrice ASC. Des analyses par

immunofluorescence et co-immunoprécipitation ont démontré qu’ASC se lie à la caspase-8

grâce à son domaine PYD suite à une stimulation à la nigéricine.

1.4.3. Les récepteurs purinergiques Les nucléotides jouent un rôle très important dans plusieurs fonctions physiologiques de

l’organisme, comme par exemple lors de la régulation de l’inflammation (Ferrari et al.,

2006), des fonctions musculosquelettiques (Burnstock et al., 2013), des fonctions

neuronales et gliales (Fields and Burnstock, 2006, Del Puerto et al., 2013) et des fonctions

rénales (Craigie et al., 2013). Le nucléotide le plus important dans la régulation des

fonctions du système nerveux est l’ATP. Dans des conditions physiologiques, la

concentration extracellulaire d’ATP est de l’ordre du micromolaire (Köles et al., 2011). Par

contre, dans des conditions pathologiques telles que l’ischémie cérébrale ou les LME, sa

concentration peut atteindre l’ordre du millimolaire. Suite à une lésion, la principale source

d’ATP provient des cellules endommagées ou nécrotiques, exposant ainsi les cellules

environnantes à des concentrations élevées de ce nucléotide. L’ATP et les autres

nucléotides extracellulaires (ex. : ADP, adénosine, UDP, UTP) exercent leurs fonctions

biologiques via 2 types de récepteurs membranaires purinergiques (P2R). Ces récepteurs

sont divisés en 2 grandes classes : les récepteurs purinergiques couplés à une protéine G

(P2YRs) et les récepteurs ionotropes (P2XRs). Il existe 8 différentes sous-classes de P2YRs

(P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11-14; (Abbracchio et al., 2006) et 7 sous-classes de P2XRs

(P2X1-7; (North, 2002). Les P2YRs et les P2XRs sont connus pour exister sous forme

d’oligomères (homomères ou hétéromères) (Burnstock, 2007).

Les P2XRs présentent une homologie de séquence protéique de 30% à 50% et possèdent 2

régions transmembranaires (TM1 et TM2) impliquées dans l’ouverture du pore ionique et

le passage des ions à travers la membrane cellulaire, 2 régions C- et N-terminales, une

boucle de 10 résidus de cystéines formant une série de ponts disulfures ainsi qu’un site de

liaison à l’ATP (Burnstock, 2007). Toutes les sous-classes de P2XRs possèdent une

30

séquence pour la glycosylation qui semble être essentielle à leur trafic vers la membrane

cellulaire (North, 2002).

Les 2 prochaines sections de cet ouvrage discuteront des 2 principaux récepteurs

purinergiques, P2X4R et P2X7R, puisque ceux-ci semblent jouer un rôle prédominant dans

les pathologies du SNC.

1.4.3.1. Les récepteurs P2X4 Le récepteur P2X4 est connu pour être un important modulateur de la douleur

neuropathique (Tsuda et al., 2003, Ulmann et al., 2008, Beggs et al., 2012). Tsuda et al.

furent les premiers à démontrer que bloquer P2X4R avec un inhibiteur (TNP-ATP) a pour

effet de diminuer l’allodynie causée par une lésion du nerf périphérique (LNP) (Tsuda et

al., 2003). Des études effectuées par la même équipe ont aussi révélé que l’expression de

P2X4R est augmentée suite à une LNP et que les microglies OX42+ sont exclusivement

responsables de son expression (Tsuda et al., 2003). Un mécanisme possible voudrait que le

développement de la douleur soit médié par la relâche du facteur neurotrophique brain-

derived neurotrophic factor (BDNF) par les microglies suite à leur stimulation par l’ATP,

entraînant ainsi une dépolarisation dans le potentiel d’inversion (Eanion) des neurones

spinaux et une désinhibition des récepteurs GABA (Coull et al., 2005). De plus récentes

études ont démontré une implication de P2X4R dans la relâche du BDNF suite à une LNP

(Ulmann et al., 2008), un effet qui dépendrait semble-t-il de l’activation de la p38-MAPK

(Trang et al., 2009). En effet, la délétion du gène P2X4R chez les souris P2x4r-/- a pour

conséquence d’augmenter les niveaux intracellulaires en BDNF chez les microglies et

d’inhiber la relâche de la neurotrophine. Malgré l’absence de P2X4R, le seuil d’activation

des microglies semble inchangé chez les souris P2x4r-/- suite à une LNP, tel que suggéré

par la détection de forts niveaux d’expression du marqueur microglial Iba-1, possiblement

en raison de mécanismes compensatoires résultant en l’augmentation de l’expression de

P2X7R (Ulmann et al., 2008). P2X4R est également sur-exprimé à la suite d’une LME chez

le rat (Schwab et al., 2005). Dans ce modèle expérimental, les cellules P2X4R+

s’accumulent dès les premières 24 heures pour atteindre un maximum à 7 jours post-lésion.

31

Celles-ci sont principalement localisées au site lésionnel et dans les régions adjacentes où la

mort neuronale est à son maximum. Les analyses en immunofluorescence ont révélé que les

macrophages et les microglies de même que les neurones sont les cellules qui expriment

P2X4R. Dans de rares occasions, ce récepteur fut aussi détecté dans les vaisseaux sanguins.

Ces résultats démontrent que P2X4R est induit et sur-exprimé suite à un dommage tissulaire

infligé au SNC ou au SNP et qu’il est capable de réguler l’inflammation de par ses effets

directs sur les cellules microgliales et les neurones.

Il est connu que les récepteurs purinergiques sont capables de s’assembler pour former des

homo- ou hétérodimères (North, 2002). Cette hétérodimérisation peut changer les

propriétés fonctionnelles et pharmacologiques des P2XRs.

1.4.3.2. Les récepteurs P2X7 Le gène de P2X7R code pour un polypeptide contenant 2 domaines transmembranaires

situés aux extrémités N- et C- terminales dans la portion cytoplasmique de la protéine

(Ferrari et al., 2006). La boucle extracellulaire du récepteur possède un site de liaison à

l’ATP (Gu et al., 2004). Le récepteur P2X7 est principalement exprimé chez les cellules

immunitaires du sang, principalement les monocytes, les macrophages tissulaires et la

microglie (Bianco et al., 2006). D’autres études récentes ont rapporté son expression chez

les astrocytes (Narcisse et al., 2005), les oligodendrocytes (Matute et al., 2007) et les

neurones (Anderson and Nedergaard, 2006). Tout comme P2X4R, P2X7R est activé par

l’ATP extracellulaire ce qui entraîne le clivage et la relâche de la forme mature de l’IL-1β

(Ferrari et al., 1997, Di Virgilio et al., 2009). Par contre, son effet s’avère aussi être

dépendant de la sortie d’ions posstassium à l’extérieur de la cellule étant donné que le

clivage et la relâche de l’IL-β sont inhibés par l’inhibition de la sortie d’ion K+ (Sanz and

Di Virgilio, 2000, Kahlenberg and Dubyak, 2004). De plus, la voie de signalisation de ce

récepteur semble être plus complexe puisque des études ont reporté que P2X7R peut former

un complexe avec la Pannexin-1 (Panx1), un canal membranaire perméable à des ions

comme le potassium et le calcium (Pelegrin and Surprenant, 2006, Silverman et al., 2009).

En effet, la présence d’un siRNA ciblant Panx1 a inhibé l’entrée dépendante de P2X7R

32

d’un dérivé de l’uridine, le BrdU, à l’intérieur de macrophages stimulés à l’ATP (Pelegrin

et al., 2006) . Il a aussi été démontré dans cette étude que le clivage de la caspase-1 et la

relâche de la forme mature de l’IL-1β en réponse à l’activation de P2X7R requièrent la

présence de Panx1.

P2X7R est impliqué dans plusieurs pathologies affectant le SNC telles que la sclérose en

plaques (Chen et Brosnan, 2006, Sharp et al., 2008), (Kim et al., 2013), la maladie

d’Alzheimer (Diaz-Hernandez et al., 2012) et les LME (Wang et al., 2004, Peng et al.,

2009). En effet, Chen et al. ont démontré que les souris P2x7r-/- développent des

symptômes d’EAE plus sévères que les souris sauvages (Chen et Brosnan, 2006). De plus,

les souris chimériques générées avec un animal hôte sauvage irradié et dont leur moelle

osseusse a été reconstituée avec des cellules provenant de souris P2x7r-/- ont présenté une

plus grande susceptibilité à developper la maladie, indiquant que les cellules sanguines

jouent un rôle important la régulation des mécanismes développant la maladie. Cette étude

suggère donc que ces effets sont causés par une perte de l’activité apoptotique chez les

lymphocytes corrélant avec une diminution des niveaux d’IFN-γ et de NO chez ces cellules.

NF-κB a été reconnu comme étant un facteur de transcription important pour la

transcription de gènes induits par l’IL-1β. P2X7R est capable d’activer la phosphorylation

de NF-κB dans les neurones et astrocytes et ainsi de contribuer aux dommages neuronaux

(Kim et al., 2013).

L’expression de P2X7R est également observée dans les neurones de la moelle épinière. Par

conséquent, ce récepteur pourrait induire la mort neuronale suite à une LME. L’inactivation

de ce récepteur pourrait donc être un moyen efficace afin de réduire les déficits survenant

suite à la lésion. Supportant cette possibilité sont des études démontrant que l’injection

d’antagonistes de P2X7R a pour effet d’augmenter la récupération locomotrice chez la

souris et le rat (Wang et al., 2004, Peng et al., 2009). Wang et al. ont de plus démontré que

l’injection d’OxATP protège la souris contre les dommages secondaires et la perte

neuronale qui surviennent suite à une LME, comme le démontre une réduction du nombre

de cellules TUNEL+ et une réduction de la sévérité des déficits locomoteurs (Wang et al.,

2004). Plus récemment, l’administration intravaineuse de BBG (Brillant Blue G), un autre

33

antagoniste de P2X7R, a pareillement diminué le volume de lésion du tissu nerveux et la

perte des fonctions motrices en réduisant le nombre de cellules microgliales activées

(CD68+), l’intensité de l’astrogliose et le recrutement de neutrophiles suite à la LME (Peng

et al., 2009). La régulation de l’activation de ce récepteur pourrait donc être un moyen très

efficace pour traiter les patients humains affligés par ce genre de lésion.

1.5. Rôles des cytokines et chimiokines suite à un trauma du SNC

Les cytokines et chimiokines sont un groupe de protéines principalement connues pour leur

rôle dans la régulation de l’inflammation suite à une infection à des microorganismes tels

que les bactéries et les virus. Cependant, les cytokines jouent aussi un rôle très important

dans le contrôle du métabolisme, de la différenciation et de la mort cellulaire ainsi que dans

plusieurs fonctions des organes internes. Ces molécules sont donc impliquées dans une

panoplie de maladies telles que le cancer, le diabète, l’obésité, l’arthrite et les maladies

neurodégénératives. Une cytokine se lie à son récepteur spécifique et déclenche une voie de

signalisation intracellulaire. Elle peut se lier aux récepteurs de la membrane de la cellule

qui l’a sécrétée, elle exerce alors une action autocrine. Elle peut aussi exercer une action

paracrine si elle se lie aux récepteurs d’une cellule située près de la cellule productrice. Si

elle se fixe aux récepteurs d’une cellule éloignée et voyage par le sang, elle exercera alors

une action endocrine. Les prochaines sections discuteront des principales cytokines ayant

des effets pro-inflammatoires ou anti-inflammatoires suite à une LME.

1.5.1. La famille de l’interleukine-1 (IL-1)

Il y a un peu plus de 50 ans, l’interleukine-1 (IL-1) fut la première cytokine décrite comme

étant une substance pyrogène relâchée par les leucocytes et capable d’induire la fièvre. En

1984, deux ADNc furent clonés puis séquencés. Les noms d’IL-1α et d’IL-1β furent

donnés aux 2 clones. Les gènes codant pour ces cytokines sont localisés sur le chromosome

2 (Dinarello, 1994). Aujourd’hui, la famille de l’IL-1 comprend 11 membres dont l’IL-1α,

34

IL-1β, IL-1Ra, IL-18 et IL-33. Étant moins bien connues, les autres cytokines de cette

famille (IL-36, IL-37 et IL-38) ne seront pas discutées dans cet ouvrage.

1.5.1.1. L’IL-1-αα

Bien que les séquences d’acides aminés de l’IL-1α et l’IL-1β possèdent une homologie de

25 à 30%, ces 2 cytokines présentent une structure tridimensionnelle et des propriétés

biologiques semblables (Graves et al., 1990, Dinarello, 1991). En effet, l’IL-1 entraine la

surexpression des molécules d’adhésion sur les cellules endothéliales, l’extravasation des

leucocytes provenant du sang et induit la production des métabolites de l’acide

arachidonique. Ces ligands sont aussi capables d’induire la production de chimiokine,

entrainant ainsi le recrutement et l’activation des différentes cellules immunitaires dans le

but de combattre une infection ou de stimuler la réparation tissulaire suite à une lésion.

L’IL-1α est synthétisée sous une forme précurseure de 31 kDa. Cette pro-forme (pro-IL-

1α) est capable de se lier à son récepteur, l’IL-1R1, et est, par conséquent, biologiquement

active (March et al., 1985, Mosley et al., 1987). Il fut toutefois démontré que la calpaïne,

une protéase dépendante du calcium, est capable de procéder à la protéolyse de la pro-IL-

1α dans le but de produire une forme clivée mature de 17 kDa (mIL-1α) (Kobayashi et al.,

1990, Carruth et al., 1991). Bien qu’il fut initialement avancé que ce clivage n’a que très

peu d’effets sur l’activité biologique de l’IL-1α, des études récentes ont démontré que son

clivage entraînerait une augmentation de son activité pro-inflammatoire (Afonina et al.,

2011, Zheng et al., 2013). Afonina et al. ont confirmé que l’IL-1α est un susbtrat pour une

protéase retrouvée dans les granules des cellules NK et les cellules T cytotoxiques, la

granzyme B. Leurs résultats ont aussi suggéré que cette protéase clive l’IL-1α à la position

Asp 103, libérant ainsi la partie N-terminale de la protéine. De plus, cette équipe a mesuré

la capacité de mIL-1α à induire la production d’IL-6 et IL-8 chez les cellules Hela et

HUVECs, démontrant que la forme clivée présente une activité pro-inflammatoire jusqu’à

10 fois plus importante que sa pro-forme. Zheng et al. ont aussi démontré que la forme p17

présente une plus grande activité pro-inflammatoire. En outre, ils ont reporté que le clivage

de l’IL-1α est régulé par sa liaison avec une forme intracellulaire de l’IL-1R de type II (IL-

1R2). En effet, l’IL-1R2 serait capable de lier l’IL-1α et de prévenir son clivage par la

35

calpaïne. Par contre, une fois l’IL-1R2 clivé par la caspase-1, l’IL-1α serait relâchée,

permettant ainsi son clivage. Contrairement à ces résultats, il fut démontré que la forme

précurseure p33 de l’IL-1α est capable d’induire le recrutement de leucocytes in vitro suite

à sa relâche par des cellules hypoxiques [Rider, 2011]. Cependant, il n’est pas connu si la

forme précurseure de l’IL-1α possède les mêmes fonctions biologiques que la forme

mature de 17 kDa.

L’IL-1α fait partie d’une classe de cytokines capables d’exercer leurs fonctions dans le

noyau mais aussi dans l’environnement extracellulaire. Cette molécule possède une

séquence de localisation nucléaire (SLN) dans sa région N-terminale qui lui permet de

transloquer vers le noyau, l’endroit où elle agirait comme facteur de transcription

(Buryskova et al., 2004, Werman et al., 2004). Dans le noyau, l’IL-1α peut être associée à

la chromatine où elle serait retenue dans les corps apoptotiques lors de la mort cellulaire par

apoptose. Lors d’une toute autre situation où les cellules meurent par nécrose, l’IL-1α se

détacherait de la chromatine et serait relâchée avec les composantes cellulaires, stimulant

ainsi l’inflammation (Luheshi et al., 2009, Cohen et al., 2010). Ce type de molécules

intracellulaires est appelé alarmines ou danger-associated molecular patterns (DAMPS).

Plusieurs alarmines ont été décrites, parmi lesquelles nous retrouvons aussi HMGB1, S100,

les protéines de choc thermique (HSP) et l’IL-33 (Hirsiger et al., 2012, Pittman et Kubes,

2013). La sécrétion de l’IL-1α ou d’une alarmine par les cellules nécrotiques se produit

suite à un traumatisme cellulaire, un phénomène appelé inflammation stérile. L’IL-1α

possède de fortes propriétés pro-inflammatoires lorsque relâchée lors de la nécrose. En

effet, les souris ayant reçu une injection de cellules nécrotiques présentent une forte

diminution du recrutement en neutrophiles lorsque traitées avec un anticorps anti-IL-1α

comparativement à des souris traitées avec l’anti-IL-1β ou un anticorps contrôle (Chen et

al., 2007). Une seconde étude a démontré l’importance de la relâche de l’IL-1α par des

cellules nécrotiques pour la sécrétion de la chimiokine CXCL1, une chimiokine clé pour le

recrutement des neutrophiles (Eigenbrod et al., 2008).

36

Comme bien des cytokines, l’IL-1α est exprimée en culture par plusieurs types cellulaires

tels que les lymphocytes B et T, monocytes, macrophages, cellules endothéliales et

fibroblastes (Dinarello, 2009). In vivo dans le SNC, les plaquettes et la microglie furent

identifiées comme étant une source importante d’IL-1α (Thornton et al., 2010, Luheshi et

al., 2011). Ces études ont aussi démontré que l’IL-1α provoque l’induction des molécules

d’adhésion ICAM-1 et VCAM-1 ainsi que le relâche de CXCL1 et la migration des

neutrophiles. Ce mécanisme serait important pour médier l’inflammation dans le cerveau

suite à un accident cérébrovasculaire. L’IL-1α est aussi exprimée dans les microglies près

de la lésion très tôt (4 h post-lésion) suite à une ischémie cérébrale (Luheshi et al., 2011).

Par contre, son absence chez la souris IL-1α-KO n’est pas suffisante pour réduire le volume

de la lésion suite à une ischémie. Au contraire, les deux formes d’IL-1, l’IL-1α et l’IL-1β,

doivent être absentes in vivo pour entraîner une neuroprotection significative (Boutin et al.,

2001). Ces résultats suggèrent la possibilité qu’il existe des mécanismes de compensation

au niveau de ces deux cytokines. L’IL-1α fut aussi identifiée comme étant un joueur clé

dans le recrutement des neutrophiles dans un modèle in vitro d’injection de cellules

nécrotiques chez la souris (Rider et al., 2011). Au contraire, l’IL-1β serait plutôt

responsable du recrutement des macrophages. Cette étude suggère également que l’IL-1α

serait impliquée beaucoup plus tôt dans le recrutement des leucocytes comparativement à

l’IL-1β (24 h vs. 5 jours). Ces données indiquent que cette cytokine aurait comme principal

rôle d’initier l’inflammation. Une investigation plus approfondie sera toutefois nécessaire

pour mieux comprendre les mécanismes distinguant les fonctions immunitaires et

neurologiques de l’IL-1α et de l’IL-1β.

1.5.1.2. L’IL-1ββ Comme l’IL-1α, l’IL-1β est une protéine synthétisée sous une pro-forme de 31 kDa. Par

contre, contrairement à la pro-IL-1α, la pro-IL-1β est incapable de se lier à son récepteur,

l’IL-1R1, et est par conséquent biologiquement inactive. Son clivage par la caspase-1, selon

les mécanismes discutés dans les sections précédentes (sections 1.4.2 et 1.4.3), et la

production d’une forme bioactive de 17 kDa sont nécessaires pour la liaison à son

37

récepteur. Comme bien des cytokines, l’expression de l’IL-1β est induite par une variété de

stimuli comme la présence d’une infection (bactérienne, fongique ou virale), d’une lésion

tissulaire, d’une condition d’hypoxie ou de produits biologiques (ex. : acide urique, LPS,

ATP, β-amyloïde, alun, silice). Par conséquent, l’IL-1β est impliquée dans une panoplie de

pathologies ou de conditions médicales telles que l’Alzheimer, le Parkinson, l’épilepsie,

l’ischémie cérébrale, les lésions du cerveau et de la moelle épinière, la SP, la goute,

l’arthrite, le psoriasis, l’asthme, etc.

Plus précisément, dans le SNC, cette cytokine affecte les leucocytes, les cellules gliales (c.-

à-d. les astrocytes, microglies, OLs), les neurones et les cellules endothéliales. L’IL-1β

favorise la prolifération des astrocytes, un phénomène appelé astrogliose, ainsi que la

relâche de glutamate, de radicaux libres, d’ions potassium (K+) et de cytokines et

chimiokines qui pourraient être potentiellement néfastes pour la survie neuronale (Basu et

al., 2004). Par contre, l’activation des astrocytes par l’IL-1β peut conférer des changements

neuroprotecteurs puisque ces cellules régulent la restauration de la barrière hémato-

encéphalique (BHE) en augmentant son étanchéité (Norenberg, 1994, Bush et al., 1999,

Sofroniew, 2005). Ces effets sont contradictoires avec d’autres études démontrant l’effet

néfaste de l’IL-1β sur la BHE. Zhu et al. ont démontré que l’IL-1β perturbe la stabilité de

l’endothélium dans un modèle de culture in vitro de cellules humaines via un mécanisme

impliquant la GTPase, ARF6, son activateur ARNO et la molécule adaptatrice MyD88

(Zhu et al., 2012). De plus, une analyse par micropuce à ADN d’astrocytes en culture

stimulés par l’IL-1β pendant 24 h a permis d’identifier près de 1500 gènes comme étant

régulés de façon positive ou négative par la dite cytokine (John et al., 2005). Ces gènes

comprennent des cytokines, chimiokines, métalloprotéinases (MMPs), molécules

d’adhésion (CAMs), protéines du cytosquelette et des facteurs de croissance cellulaire.

Certaines de ces molécules ont déjà été soupçonnées d’avoir des effets bénéfiques sur la

survie neuronale et la réparation tissulaire mais aussi des effets neurotoxiques.

L’IL-1β peut aussi lier l’IL-1R1 exprimé à la surface des microglies, ce qui résulte en

l’expression et la relâche de plusieurs molécules comme les prostanglandines E2 (PGE2) et

des cytokines et chimiokines proinflammatoires. La microglie peut aussi exprimer l’IL-1β

38

permettant par le fait même la relâche de CNTF par les astrocytes suite à une lésion du

cerveau chez la souris (Herx et al., 2000). De plus, il fut démontré que l’IL-1β permet

l’activation de la microglie suite à une lésion de la moelle épinière ou lors du processus de

DW chez la souris (Perrin et al., 2005, Sato et al., 2012). En effet, l’absence d’IL-1β a pour

effet de diminuer les niveaux d’expression de la protéine Ym1, un marqueur d’activation

des macrophages et microglies, aux temps 7 et 14 jours post-LME (Sato et al., 2012).

Mason et al. ont suggéré que l’IL-1β pourrait aussi exercer des effets sur les OLs en

favorisant notamment la remyélinisation (Mason et al., 2001). En utilisant le modèle de

démyélinisation à la cuprizone, ce groupe a démontré que l’absence d’IL-1β chez la souris

entraîne une réduction de la remyélinisation suite à une démyélinisation aigüe. Ce

phénomène fut corrélé avec une diminution de la présence d’OLs matures chez les souris Il-

1β-/- comparativement aux souris sauvages et ce bien que la présence de progéniteurs était

semblable chez les 2 groupes. Cette étude a aussi démontré que l’absence d’IL-1β suite au

traitement à la cuprizone a pour effet de diminuer le nombre de microglies et d’astrocytes

produisant le IGF-1 (facteur de croissance ressemblant à l’insuline 1), un facteur de

croissance important pour la différenciation et la survie des OLs.

Un autre rôle de l’IL-1β consiste à promouvoir l’activation et le recrutement des cellules

immunitaires dans le parenchyme du SNC en stimulant la production de cytokines,

chimiokines, CAMs, prostaglandines et MMPs (Allan et al., 2005). Ensemble, ces études

démontrent que l’IL-1β affecte une vaste gamme de cellules dans le SNC et stimule

l’expression de plusieurs molécules différentes impliquées autant dans les mécanismes de

neurodégénération que de réparation tissulaire.

1.5.1.3. Les récepteurs de l’IL-1 (IL-1Rs), leurs protéines accessoires et l’antagoniste, l’IL-1Ra

Comme mentionné précédemment, le récepteur capable de lier à la fois l’IL-1α et l’IL-1β

et de conférer une activité biologique pro-inflammatoire est l’IL-1R1. Ce récepteur contient

un domaine extracellulaire d’immunoglobuline ainsi qu’un domaine TIR dans sa portion

39

cytosolique. Ce récepteur fait donc partie de la superfamille de l’IL-1R/TLR (O'Neill et

Dinarello, 2000). L’IL-1R2, la seconde forme de l’IL-1R, possède seulement un court

domaine intracellulaire et est reconnu pour être biologiquement inerte. Bien que l’IL-1R2

puisse être rapidement relâché dans le milieu extracellulaire, il conserve néanmoins sa

capacité à lier l’IL-1 et peut l’empêcher d’interagir avec l’IL-1R1 situé à la surface d’une

cellule avoisinante (Arend et al., 2008). Dans une étude récente, il fut démontré que l’IL-

1R2 est capable de lier l’IL-1α dans le but de prévenir son clivage par la calpaïne (Zheng et

al., 2013).

La liaison de l’IL-1 à l’IL-1R1 exprimé à la surface externe de la membrane cellulaire

permet le recrutement d’une sous-unité, la protéine accessoire de l’IL-1R1, appelée IL-

1RAcP. Ce complexe hétérodimaire induit, via le domaine intracellulaire TIR, le

recrutement de la molécule adaptatrice MyD88. MyD88 recrute à son tour la kinase

associée à IL-1R (IRAK) et le récepteur du facteur tumoral nécrosant (TNF) associé au

facteur 6 (TRAF-6). Cette cascade permet l’activation de voies de signalisation telles que

NF-κB, protéine activatrice-1 (AP-1), kinase c-jun N-terminale (JNK) et protéine kinase

associée à la mitogène p38 (p38 MAPK) (O'Neill et Dinarello, 2000, Sims et Smith, 2010).

L’importance de la protéine adaptatrice MyD88 dans la signalisation et la fonction de l’IL-

1R1 a bien été étudiée dans différents modèles. En effet, l’absence de MyD88 entraine une

perte de fonction du récepteur (Adachi et al., 1998, Chen, 2006, Pineau et al., 2010). Plus

spécifiquement, la voie de signalisation MyD88/IL-1R1 joue un rôle majeur dans le

recrutement de cellules immunitaires comme les neutrophiles et monocytes pro-

inflammatoires de type 1 (M1) suite à une LME en favorisant entre autre l’expression des

chimiokines CXCL1 et CXCL2 par les astrocytes (Pineau et al., 2010). De plus, un variant

d’épissage de la protéine accessoire IL-1AcP, IL-1RAcPb, fut identifié dans le SNC,

principalement dans les neurones (Smith et al., 2009, Nguyen et al., 2011). Bien que l’IL-

1RAcPb soit capable de lier l’IL-1R1 par un mécanisme IL-1-dépendant, il est important de

savoir que cette liaison ne permet pas de recruter les protéines adaptatrices MyD88 et

IRAK4, suggérant par le fait même qu’il est incapable de stimuler la voie habituelle de

signalisation de l’IL-1 (Smith et al., 2009). Bien qu’une forte expression de l’ARNm de

l’IL-1RAcPb fut détectée dans les neurones, l’absence de cette protéine dans des cellules

40

neuronales en culture n’a pas eu d’effet sur la relâche de l’IL-6 en réponse à l’IL-1α et l’IL-

1β. Par contre, la phosphorylation de p38 induite par l’IL-1α fut significativement

diminuée par la délétion du gène codant pour l’IL-1RAcPb comparativement aux cellules

contrôles et celles traitées à l’IL-1β (Nguyen et al., 2011). Ces résultats indiquent que l’IL-

1RAcPb régule, du moins en partie, l’activité neuronale en réponse à l’IL-1α. Cette réponse

pourrait jouer un rôle important dans les fonctions inflammatoires de l’IL-1 dans le SNC.

D’autres études ont aussi rapporté l’implication de l’IL-1R1 dans les lésions du cerveau et

de la moelle épinière. Suite à une lésion du cerveau, les souris Il-1r1-/- présentent une

diminution du nombre de macrophages/microglies activés et d’astrocytes réactifs autour du

site de lésion (Basu et al., 2002). De plus, au niveau moléculaire, Basu et al. ont rapporté

une diminution de l’expression de l’IL-6 et de la cyclooxygénase-2 (COX-2) ainsi que de

l’ARNm de VCAM-1, une molécule d’adhésion. Bien que la déficience en IL-1R1 suite à

une lésion du cerveau semble affecter l’activation des astrocytes, causant une diminution de

l’expression de GFAP, d’autres réponses semblent être indépendantes de la voie de

signalisation de l’IL-1R1 comme par exemple l’expression des CSPGs, de la tenascine, de

S100β et du transporteur du glutamate. Ceci suggère que plusieurs fonctions des astrocytes,

comme leur capacité à éliminer le glutamate et réguler le niveau de calcium, ne dépendent

pas de ce récepteur (Lin et al., 2006).

Le traitement de plusieurs maladies se fait par le blocage de l’activité de l’IL-1R1 par son

antagoniste, IL-1Ra (Dinarello et al., 2012). L’anakinra est la forme recombinante de l’IL-

1Ra naturel, un inhibiteur compétitif de l’IL-1R1 largement utilisé en clinique. De part ses

effets secondaires minimes, sa courte demi-vie ainsi que les nombreuses voies

d’administration possibles, ce médicament permet de traiter une grande variété de maladies

telles que l’arthrite rhumatoïde, la goutte, certaines maladies auto-immunes, le diabète de

type 2 et même l’insuffisance cardiaque (Larsen et al., 2007, Abbate et al., 2008) (Van

Tassel et al., 2012). L’injection sous-cutanée de l’IL-1Ra aurait des effets neuroprotecteurs

suite à une ischémie cérébrale chez le rat en diminuant de 33% les dommages tissulaires

causés par l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO) (Greenhalgh et al., 2010). Le

traitement avec l’antagoniste a aussi permis de réduire l’étendue des dommages et de

41

diminuer la rupture de la BHE chez des rats ischémiques (Pradillo et al., 2012). De plus,

l’administration d’IL-1Ra au cours de la reperfusion suite à une MCAO a pour effet de

réduire la perméabilité de la BHE, le nombre de neutrophiles MMP-9+ recrutés, le nombre

de microglies Iba-1+ activées de même que la relâche d’IL-6 dans le cerveau. Un traitement

à l’IL-1Ra absorbé dans une éponge de gélatine déposée sur la moelle épinière lésée du rat

a pour effet d’améliorer la récupération des fonctions locomotrices sur une période d’au

moins 4 semaines post-LME (Zong et al., 2012). Il fut aussi démontré que l’injection

intrathécale d’IL-1Ra chez le rat ayant subi une LME réduit l’expression de l’IL-1β ainsi

que l’activation de la caspase-3 et l’apoptose, augmentant du même coup la récupération

locomotrice au temps 30 jours post-lésion (Nesic et al., 2001). Ces résultats suggèrent que

l’IL-1Ra pourrait être un traitement potentiel efficace pour le traitement de maladies

neurologiques initiées par l’inflammation.

1.5.1.4. L’interleukine-18 (IL-18) et son récepteur IL-18R

L’IL-18 possède une structure similaire à celle des autres cytokines de la famille de l’IL-1.

Elle fut longtemps connue sous le nom d’interferon-γ-inducing factor. Comme ce nom

l’indique, l’IL-18 est requise pour la production d’IFN-γ, contrairement à l’IL-1β. Par

contre, de façon semblable à l’IL-1β, l’IL-18 est synthétisée sous une forme biologique

inactive de 23 kDa qui peut être clivée entre les acides aminés Asp35 et Asn36 par la

caspase-1, générant ainsi une forme de 18 kDa (Ghayur et al., 1997, Gu et al., 1997). La

forme active de l’IL-18 est exprimée chez différents types cellulaires dont notamment chez

les macrophages (Tsutsui et al., 1999), les cellules dendritiques (Sakaki et al., 2013) et les

kératinocytes (Roth et al., 2012), tandis que la pro-forme ou son ARNm sont exprimés de

façon constitutive (Nakanishi et al., 2001). Chez les macrophages, cette cytokine est aussi

induite par l’endotoxine LPS ou le ligand de Fas (Fas-L), appartenant à la famille du TNF,

via un mécanisme caspase-1 indépendant (Tsutsui et al., 1999).

La polarisation de cellules T activées en Th1 est une caractéristique importante de l’IL-18

grâce à l’IFN-γ qu’elle induit. Cette polarisation est permise grâce à une sur-expression du

récepteur de l’IL-18, l’IL-18R, à la surface des cellules T naïves occasionnée par l’IL-18.

42

La sur-expression de l’IL-18R peut aussi être causée par une autre cytokine majeure dans le

processus de polarisation des cellules Th1, l’IL-12, qui agit en synergie avec l’IL-18

(Nakanishi et al., 2001, Dostert et al., 2013). Au contraire, en absence d’IL-12 et en

présence d’IL-2, l’IL-18 est capable d’induire la polarisation des cellules T naïves en Th2.

Ceci a été démontré en stimulant des cellules T naïves CD4+ avec de l’IL-2 et de l’IL-18

pendant 4 jours, entraînant ainsi la production d’IL-4 nécessaire à la formation des cellules

Th2 (Yoshimoto et al., 2000). D’autres exemples d’effets de l’IL-18 similaires à ceux de

l’IL-1 consistent en l’augmentation de l’expression de CAMs, la production d’oxyde

nitrique et la synthèse et relâche de chimiokines (Dinarello, 2007). L’IL-18 régule

également la synthèse d’IL-2, de GM-CSF et de TNF (Dinarello, 1999). L’IL-18 exogène

peut aussi activer les cellules NK nécessaires à l’élimination des cellules cancéreuses via la

relâche d’IFN. Par conséquent, l’absence d’IL-18 chez la souris a pour effet d’entrainer une

diminution d’IFN-γ et de l’activité cytotoxique des cellules NK. Ce phénomène peut être

renversé par l’injection d’une forte dose d’IL-12, ramenant ainsi les niveaux de l’activité

lytique à des niveaux de base, c.-à-d. comparables à ceux de souris contrôles (Takeda et al.,

1998).

L’IL-18 joue un rôle important, bien que souvent néfaste, dans diverses pathologies du

système nerveux comme la LME, la douleur neuropathique, la SP et son modèle animal

l’EAE. L’analyse de cerveaux de rats atteints d’EAE a d’ailleurs démontré la présence de

niveaux élevés de l’ARNm codant pour l’IL-18 au tout début et durant la maladie (Jander

and Stoll, 1998). Les souris Il-18-/- présentent une réduction des symptômes de l’EAE qui

corrèle avec une diminution des niveaux d’IL-17 et d’IFN-γ en comparaison avec les souris

sauvages (Gris et al., 2010). Dans un même ordre d’idée, l’injection d’un anticorps

neutralisant anti-IGIF (facteur induisant l’IFN-γ) a pour effet de réduire la production

d’IFN-γ chez les cellules T réactives contre la protéine basique de myéline (MBP),

bloquant ainsi le développement de l’EAE induite de façon passive ou active (Wildbaum et

al., 1998). Toutefois, ce ne sont pas toutes les études qui sont consistantes quant au rôle de

l’IL-18 dans l’EAE. En effet, Gutcher et al. ont démontré que les souris Il-18-/- sont autant

susceptibles de développer l’EAE que des souris contrôles et présentent des zones

d’inflammation et de démyélinisation similaires en dimension (Gutcher et al., 2006). Au

43

contraire, les souris Il-18rα-/- présentent très peu d’infiltrations leucocytaires et de zones de

démyélinisation, corrélant avec des symptômes fortement diminués. Les différences entre

ces résultats peuvent être expliquées par le fait qu’il pourrait y avoir un ligand autre que

l’IL-18 capable de se lier à l’IL-18Rα et entraîner l’induction de la pathologie ou bien que

les études ont été réalisées à des stades différents de la maladie.

Tel que mentionné plus tôt, il est connu que l’IL-1β est impliquée dans la remyélinisation

suite à une démyélinisation au cuprizone (Mason et al., 2001). Jha et al. ont rapporté que

l’IL-18 est aussi impliquée dans ce mécanisme (Jha et al., 2010). Cette étude a démontré

que des réponses telles que la démyélinisation, la mort des OLs et l’activation des

microglies et des astrocytes sont retardées suite à un traitement de 3 semaines à la

cuprizone chez des souris Il-18-/-, attribuant un rôle néfaste à l’IL-18. À 8 semaines post-

traitement, la remyélinisation est elle aussi retardée dans le modèle de la cuprizone. Dans le

cas d’une lésion d’un nerf périphérique, l’IL-18 est sur-exprimée dans les cellules

microgliales situées dans la corne dorsale de la moelle épinière et ce dès le premier jour

post-lésion via un mécanisme impliquant la voie de signalisation p38/MAPK (Miyoshi et

al., 2008). Cette étude a aussi démontré que cette cytokine possède un rôle important dans

le développement de la douleur neuropathique suite à une lésion du nerf sciatique chez la

souris puisque le blocage de l’IL-18 avec un anticorps neutralisant a permis de diminuer

l’hypersensitivité mécanique. De plus, le blocage de l’IL-18R avec un anticorps a permis

d’amoindrir la douleur occasionnée par la lésion en diminuant la phosphorylation de NF-κB

chez les astrocytes. Une surexpression de la pro-IL-18 a aussi été détectée dans la moelle

épinière suite à une LME et ce dès les premières 15-30 minutes post-lésion. Bien que les

niveaux de la forme active de l’IL-18 étaient beaucoup plus faibles que ceux de la pro-

forme, l’expression de la forme clivée était elle aussi augmentée très tôt suite à la lésion

pour ensuite diminuer et ré-augmenter autour des jours 1-3 post-lésion (de Rivero Vaccari

et al., 2008). Cette augmentation corrèle avec la formation et l’activation de

l’inflammasome NALP1 dans les neurones spinaux.

Les rôles et les fonctions de l’IL-18 sont entièrement médiés par son récepteur IL-18R et la

protéine accessoire IL-18 binding protein (IL-18BP). L’IL-18R est très similaire à l’IL-

44

1R1. La chaîne liant la cytokine est appelée IL-18Rα et doit se lier à un co-récepteur, l’IL-

18Rβ. Par la suite, ce complexe recrute différentes molécules intracellulaires comme

MyD88, IRAK et TRAF6 dans le but d’activer les voies de signalisation NF-κB, JNK et

p38 MAPK (Thomassen et al., 1998). L’expression de l’IL-18R, plus particulièrement celle

de la chaîne IL-18Rβ, est modulée par plusieurs cytokines telles que l’IL-2, l’IL-12 et l’IL-

23 (Yoshimoto et al., 1998, Sareneva et al., 2000). De son côté, IL-18BP peut lier la forme

mature de l’IL-18, mais pas sa pro-forme, avec une forte affinité, lui conférant ainsi un rôle

d’inhibiteur naturel en empêchant l’IL-18 d’agir sur son récepteur IL-18Rα (Kim et al.,

2000). De plus, la production de l’IL-18BP semble être induite par l’IFN-γ dans les cellules

épithéliales, suggérant que l’IL-18 puisse réguler l’expression de son propre inhibiteur

(Paulukat et al., 2001). Les cellules endothéliales, monocytes et macrophages représentent

aussi des sources non négligeables de l’IL-18BP (Corbaz et al., 2002).

1.5.1.5. L’Interleukine-33 (IL-33)

L’IL-33 est le 11e membre et dernière cytokine de la famille de l’IL-1 à avoir été

caractérisée. Elle est synthétisée sous une pro-forme de 30 kDa. L’IL-33 recombinante peut

être clivée par la caspase-1 pour générer une forme active de 18 kDa in vitro (Schmitz et

al., 2005). Par contre, la pro-IL-33 humaine ne possède pas de site défini pour la caspase-1.

Une étude récente a toutefois démontré que la calpaïne pourrait cliver la pro-IL-33 en une

forme mature dans les cellules épithéliales et endothéliales (Hayakawa et al., 2009). Ce

même clivage peut être bloqué par l’ajout d’un inhibiteur de la calpaïne. Cependant, Cayrol

et al. ont récemment rapporté que la pro-IL-33 est biologiquement active, mais que la

forme clivée par la caspase-1 est inactive dans le modèle murin (Cayrol and Girard, 2009,

Talabot-Ayer et al., 2009). En effet, les deux produits obtenus suite au clivage par la

caspase-1 sont incapables d’activer le récepteur de l’IL-33, contrairement à la pro-IL-33, tel

que démontré par l’absence d’activation de la voie NF-κB et l’absence d’expression de

l’IL-6 dans des mastocytes in vitro (Cayrol and Girard, 2009).

L’IL-33 est aussi connue comme étant une alarmine relâchée par les cellules nécrotiques ou

endommagées (Cayrol and Girard, 2009, Russell and Walsh, 2012). Comme l’IL-1α et

45

HMGB1, elle peut agir en tant que molécule régulatrice de la transcription dans le noyau ou

comme cytokine pro-inflammatoire lorsque relâchée. L’IL-33 fut démontrée comme étant

capable de s’associer à l’hétérochromatine dans des cellules endothéliales in vivo chez des

patients atteints d’arthrite ou de la maladie de Crohn et fut même retrouvée en association

avec les chromosomes mitotiques. De plus, cette cytokine semble posséder des propriétés

de répresseur de la transcription (Carriere et al., 2007). Plus récemment, la même équipe a

rapporté qu’une petite séquence peptidique de l’IL-33 est suffisante pour se lier à la

chromatine et moduler la structure de celle-ci en formant des ponts hydrogènes avec le

dimère H2A-H2B situé à la surface nucléosomale (Roussel et al., 2008). Des études de co-

immunoprécipitation effectuées chez des cellules surexprimant l’IL-33 ont révélé que la

pro-IL-33, mais pas la forme mature, peut interagir avec le facteur de transcription NF-κB

via la sous-unité p65 de NF-κB. La conséquence biologique de cette interaction serait

l’inhibition de la liaison de la sous-unité p65 avec l’ADN, causant une déficience dans la

transcription des gènes normalement régulés par NF-κB, tels que le TNF et IκBα (Ali et

al., 2011).

L’IL-33 fut identifiée comme étant un ligand du récepteur T1/ST2, un récepteur orphelin de

la famille de l’IL-1. Il est clair aujourd’hui que ce récepteur membranaire est impliqué dans

la polarisation des lymphocytes T naïfs en Th2 et qu’il constitue un marqueur de ces

mêmes cellules chez la souris et chez l’humain (Trajkovic et al., 2004). T1/ST2 serait aussi

fortement exprimé par les mastocytes au cours de leur différeniation (Moritz et al., 1998).

Ce récepteur existe également sous une forme soluble (sST2) qui ne possède ni de domaine

transmembranaire ni de domaine intracellulaire de type IL-1R/TLR. sST2 serait produit par

épissage alternatif de l’ARNm du récepteur T1/ST2. Cette isoforme de T1/ST2 est

dorénavant connue en tant qu’inhibiteur de la voie de signalisation activée par l’IL-33

(Hayakawa et al., 2007). En effet, le recombinant soluble exprimé par des cellules

HEK293T et sécrété dans le milieu extracellulaire est capable d’empêcher l’IL-33

recombinant de lier son récepteur T1/ST2 et d’induire la voie NF-κB.

L’expression de l’IL-33 est fortement stimulée par la LPS chez les cellules endothéliales et

les astrocytes tandis que son récepteur est présent chez les microglies et les astrocytes

46

(Yasuoka et al., 2011). Un traitement à l’IL-33 pendant 3 jours a permis notamment

d’augmenter la prolifération de cellules microgliales in vitro (Yasuoka et al., 2011). Cette

étude a aussi démontré que l’IL-33 est capable de stimuler la production microgliale de

diverses cytokines telles que l’IL-1β, le TNF et l’IL-10 de façon dose-dépendante. L’IL-33

fut détectée dans le plasma et le cerveau de patients atteints de SP (Christophi et al., 2012).

Cette sur-expression fut corrélée avec une augmentation de l’expression de NF-κB. Dans

les dernières années, un polymorphisme de l’IL-33 fut associé à un risque accru de la

maladie d’Alzheimer au cours de laquelle la production de l’IL-33 se retrouve diminuée

dans le cerveau de patients atteints de cette maladie (Han et al., 2011). Puisque l’IL-33

cause l’activation microgliale et augmente la capacité de ces cellules à phagocyter

(Yasuoka et al., 2011), et puisque la microglie phagocyte la β-amyloïde dans la maladie

d’Alzheimer (Lee and Landreth, 2010), l’IL-33 pourrait jouer un rôle dans la

neuroprotection mais aussi dans les dommages tissulaires survenant dans diverses maladies

neurodégénératives.

1.5.2. Le facteur nécrosant des tumeurs (TNF) Comme l’IL-1, le TNF exerce des effets neuroprotecteurs et neurotoxiques dans une

panoplie de maladies du SNC (Sriram and O'Callaghan, 2007). Le TNF est synthétisé sous

une forme membranaire de 26 kDa et clivé en sa forme mature de 17 kDa par l’enzyme de

conversion du TNF-α (TACE, communément appelée ADAM17) qui est exprimée dans le

SNC (Kärkkäinen et al., 2000). Son effet biologique est dépendant de sa liaison à un de ses

récepteurs membranaires, TNFR1 et TNFR2. Ces récepteurs signalisent via le facteur de

transcription NF-κB ou les protéines kinases JNK, ERK-1/2 et p38 MAPK (Cabal-Hierro et

al. 2012). TNFR1 est exprimé dans la plupart des cellules du SNC tandis que TNFR2 est

principalement exprimé chez la microglie et les cellules endothéliales. Le complexe formé

de TNF et de TNFR1 peut soit recruter le TNF-associated death domain (TRADD) et

réguler l’expression de protéines anti-apoptotiques ou recruter TRADD et FAS-associated

death domain (FADD) et stimuler la mort cellulaire par apoptose ou d’autres formes de

mort cellulaire programmée (Micheau et Tschopp, 2003).

47

Le TNF est rapidement produit par les microglies, les astrocytes, les OLs et les neurones

suite à une LME chez le rat et la souris (Yan et al., 2001, Yune et al., 2003, Pineau and

Lacroix, 2006). Ses récepteurs sont principalement exprimés par les astrocytes, les OLs et

les neurones (Yan et al., 2003). La neutralisation du TNF durant la phase aiguë post-LME

chez le rat grâce à l’injection d’etanercept a pour effet d’engendrer de nombreux effets

bénéfiques tels qu’une diminution de l’apoptose des OL et des neurones, une diminution

des dommages tissulaires et de la démyélinisation, entraînant par le fait même une

amélioration de la récupération des fonctions locomotrices (Chen et al., 2011). Un anticorps

se liant au TNF, l’infliximab, a aussi permis de réduire l’inflammation, les dommages

neurologiques et l’apoptose suite à une LME chez la souris (Genovese et al., 2008). Par

contre, d’autres études ont plutôt démontré que le TNF présente des effets neuroprotecteurs

dans des modèles animaux d’ischémie cérébrale et d’épilepsie (Bruce et al., 1996). En effet,

chez des souris où les deux types de récepteurs du TNF furent supprimés, l’activation des

cellules microgliales est réduite et le stress oxydatif et les dommages neuronaux sont

augmentés. Plus récemment, ces résultats furent confirmés par Lambersten et al. qui ont

démontré que le volume lésionnel suite à une ischémie cérébrale est augmenté et que les

fonctions motrices se détériorent chez des souris Tnf-/- (Lambertsen et al., 2009). Cette

étude a aussi établi que les effets du TNF d’origine microgliale sont médiés par un

mécanisme dépendant du TNFR1. Bruce et al. avaient préalablement proposé que

l’activation des voies de signalisation du TNF ne sont pas nécessaires chez les astrocytes

suite à une ischémie cérébrale (Bruce et al., 1996). Par contre, Chu et al. ont rapporté que

des rats Tg sur-exprimant le TNF présentent un plus grand nombre d’astrocytes activés et

une plus forte expression de GFAP suite à une LME, et que ces résultats corrèlent avec une

plus faible perte de tissu nerveux comparativement aux rats contrôles (Chi et al., 2008). Ces

résultats suggèrent que le TNF peut présenter autant des fonctions bénéfiques que néfastes

dans diverses pathologies du SNC. Les mécanismes régulateurs sous-jacents les fonctions

biologiques de cette cytokine restent donc mal compris et devront être mieux caractérisés

afin de développer des traitements cliniques plus efficaces.

48

1.6. Recrutement des cellules immunitaires Une lésion du SNC, plus particulièrement une LME, déclenche une réponse inflammatoire

forte et rapide qui permet le recrutement et l’infiltration de différents types de cellules

immunitaires au site lésionnel. Cette réponse inflammatoire est majoritairement induite par

l’activation des cellules gliales du SNC qui représentent une source importante de

cytokines pro-inflammatoires. Les mécanismes de recrutement des cellules immunitaires

suite à une LME ont été largement étudiés à travers les années dans divers modèles

animaux (Popovich et al., 1997, Stirling and Yong, 2008) et chez l’humain (Fleming et al.,

2006). Les prochaines sections discuteront des principales cellules recrutées au site de

lésion et de leurs effets sur le tissu nerveux.

1.6.1. Neutrophiles Les neutrophiles sont les premières cellules immunitaires à être recrutées à un site

infectieux ou lésionnel. Les neutrophiles proviennent des cellules souches

hématopoïétiques de la moelle osseuse au cours d’un processus appelé hématopoïèse. La

production des neutrophiles s’effectue à un flux de 1 à 2 x 1011 cellules par jour chez un

individu sain (Borregaard, 2010). Leur demi-vie est de 5,4 jours dans le sang (Pillay et al.,

2010). Le facteur de croissance granulocytaire (G-CSF) est essentiel à la production des

neutrophiles dans la moelle osseuse (Semerad et al., 2002, Roberts, 2005). Cette cytokine

est aussi connue pour jouer un rôle important dans la régulation de l’efflux des neutrophiles

de la moelle osseuse vers le sang (Semerad et al., 2002). Le G-CSF est d’ailleurs

grandement utilisé pour traiter les cas de neutropénie, une maladie caractérisée par un taux

relativement bas de neutrophiles sanguins (Roberts, 2005). Il peut aussi exercer son action

sur la lignée des macrophages, résultant en une augmentation du nombre de monocytes et

de macrophages (Bermudez et al., 1998). De plus, le G-CSF a la capacité d’entraîner une

baisse d’expression de l’ARNm et des niveaux protéiques de cytokines pro-inflammatoires

telles que l’IL-1β et le TNF suite à une LME chez le rat. Cette fonction anti-inflammatoire

permet d’atténuer la perte de matière blanche dans la moelle épinière lésée et de préserver

un plus grand nombre d’OLs. Ces effets ont pour conséquence d’améliorer les fonctions

locomotrices chez le rat (Kadota et al., 2012). D’autres études ont également démontré

49

l’efficacité d’un traitement au G-CSF dans la protection des neurones suite à une ischémie

cérébrale (Schäbitz et al., 2003, Chen et al., 2008) et chez des souris ayant reçu une

injection intracérébrale de l’agent neurotoxique 6-OHDA (Huang et al., 2007). Pris dans

leur ensemble, ces résultats confirment que le G-CSF peut réguler l’inflammation et la

survie neuronale suite à une lésion.

CXCR4 est une autre molécule essentielle à la maintenance des neutrophiles dans la moelle

osseuse (Lapidot and Kollet, 2002). L’absence de CXCR4 chez la souris cause une

redistribution des neutrophiles de la moelle osseuse vers le sang (Eash et al., 2009). Malgré

la présence accrue de neutrophiles sanguins, une déficience en CXCR4 résulte en une

altération du recrutement des neutrophiles en réponse au G-CSF ou à GROβ.

Les neutrophiles sanguins répondent à une panoplie de molécules inflammatoires incluant

les chimiokines CXCL1 (KC) et CXCL2 (MIP-2). Ces deux chimiokines sont reconnues

par un récepteur commun, CXCR2, exprimé à la surface des neutrophiles, monocytes et

cellules endothéliales (Charo and Ransohoff, 2006). Les neutrophiles provenant de souris

Cxcr2-/- sont incapables de répondre à la présence de CXCL1 et de CXCL2 lors d’une

infection (Kielian et al., 2001). Les neutrophiles sont indispensables à la défense de

l’organisme contre les microorganismes. Les produits générés par ces microorganismes

guident les neutrophiles au site d’infection, là où ceux-ci produiront divers agents anti-

microbiens (myéloperoxydase, protéases, espèces réactives de l’oxygène et de l’azote) et

des médiateurs inflammatoires (cytokines, chimiokines, prostaglandines), ceci en plus de

phagocyter les débris microbiens (Wright et al., 2010). Les neutrophiles répondent aussi

très fortement à la stimulation générée par les cellules nécrotiques présentes suite à un

trauma ou une pathologie inflammatoire de type stérile. Ce recrutement de neutrophiles en

absence d’infection semble être dépendant de la voie de signalisation de l’IL-1R1 et de la

protéine adaptatrice MyD88. En effet, les souris Il-1r1-/- et Myd88-/- présentent une

réduction du nombre de neutrophiles suite à l’injection de cellules nécrotiques EL4 (Chen

et al., 2007). Afin de déterminer lequel des deux ligands de l’IL-1R1 est impliqué dans

cette réponse, Chen et al. ont de plus traité des souris sauvages avec des anticorps

neutralisant contre l’IL-1α ou l’IL-1β et mesuré le recrutement neutrophilique en réponse à

50

ces mêmes cellules nécrotiques. Ils ont observé que l’anti-IL-1α a pour effet d’inhiber la

réponse inflammatoire tandis qu’aucun effet ne fut observé avec l’anti-IL-1β. Une étude

plus récente a identifié la pro-forme de l’IL-1α comme étant celle qui est responsable de

l’initiation de l’inflammation stérile en stimulant le recrutement de neutrophiles, tandis que

l’IL-1β entraîne plutôt la mobilisation des macrophages (Rider et al., 2011).

Dans un contexte de LME, les neutrophiles ont longtemps été reconnus comme étant des

contributeurs majeurs des dommages secondaires et de la perte du tissu nerveux. La

neutralisation de ICAM-1, une CAM impliquée dans le recrutement des neutrophiles,

entraîne une réduction de l’activité myéloperoxydase (MPO) et de la perte des fonctions

locomotrices dès le temps 24 heures post-LME (Hamada et al., 1996). L’injection d’un

anticorps neutralisant dirigé contre la P-sélectine, une autre CAM qui médit l’interaction

entre les neutrophiles et les cellules endothéliales, a pour effet de réduire l’infiltration

neutrophilaire, l’activité MPO et les signes d’hémorragie à la suite d’une LME chez le rat

(Taoka et al., 1997). Par contre, une étude plus récente de Stirling et al. a démontré que la

déplétion des leucocytes Gr-1+ à l’aide d’un anticorps a réduit de 90% le nombre de

neutrophiles circulants à 12 heures post-LME mais contribue à aggraver les déficits

neurologiques, suggérant ainsi que ces cellules favorisent la réparation tissulaire (Stirling et

al., 2009). La migration et l’adhésion des neutrophiles ainsi que l’astrogliose furent réduits

chez les souris traitées avec l’anticorps déplétant. Ces réponses furent corrélées avec un

plus grand volume de lésion et un plus grand nombre d’axones endommagés. Cependant, il

est essentiel de préciser que l’anticorps utilisé dans cette étude a ciblé toutes les cellules

exprimant l’antigène Gr-1 (Ly6C/G). Il est donc fortement probable que ce traitement a

causé la déplétion d’autres types cellulaires tels que les monocytes et les lymphocytes. Les

effets observés chez ces souris pourraient donc être attribuables à l’absence de neutrophiles

mais aussi à l’absence de différents sous-types de monocytes et lymphocytes. Plus

récemment, une équipe a tenté d’examiner les conséquences d’une déplétion plus

spécifique des neutrophiles et de monocytes sur les fonctions neurologiques chez la souris

suite à une LME (Lee et al., 2011). L’anticorps anti-Ly6G fut utilisé pour la déplétion des

neutrophiles tandis que les monocytes furent éliminés par des injections répétées de

liposomes dans lesquels furent encapsulé le chlodronate, un produit toxique pour les

51

cellules l’ayant ingéré. Cette étude a démontré que seulement la déplétion simultanée, mais

pas individuelle, des 2 types cellulaires est bénéfique à la récupération des fonctions

locomotrices à long terme. Ceci suggère donc une certaine redondance dans les fonctions

de ces 2 populations cellulaires durant la pathologie.

1.6.2. Monocytes/Macrophages En plus des neutrophiles, les cellules myéloïdes de l’immunité innée comprennent les

monocytes et les macrophages que l’on retrouve respectivement dans le sang et les tissus.

Des études suggèrent qu’un sous-type de monocytes pro-inflammatoires appelé M1

pourrait se différencier en cellules dendritiques (DCs) une fois infiltré dans des tissus où

l’inflammation prévaut (Geissmann et al., 2010). Les DCs représentent une lignée cellulaire

spécialisée dans la présentation des antigènes aux lymphocytes T (Zozulya et al., 2010).

Les macrophages sont les phagocytes résidents des tissues lymphoïdes et non-lymphoïdes.

Ils sont aussi impliqués dans l’homéostasie de l’organisme via l’élimination des corps

apoptotiques et la production de cytokines telles que l’IL-1β, IL-6, IL-10 et TNF-α. Ces

cellules possèdent également des récepteurs de chimiokines et de CAMs qui leur

permettent de migrer du sang vers les tissus ou à l’intérieur de ceux-ci, là où ils ont la

capacité de produire des médiateurs servant à l’élimination des microorganismes présents

lors d’une infection (Gordon, 2002).

Chez l’humain et la souris, 2 sous-groupes de monocytes ont été identifiés basé selon leur

expression de différents marqueurs immunophénotypiques. Chez l’homme, les monocytes

CD14+ CD16- représentent environ 80 à 90% des monocytes. Ils expriment fortement le

récepteur de chimiokine CCR2 mais très faiblement CX3CR1. Ils sont caractérisés comme

étant des monocytes pro-inflammatoires puisqu’ils produisent les cytokine pro-

inflammatoire IL-1β et TNF-α en réponse à la LPS in vitro. Au contraire, les monocytes

CD14-CD16+ expriment fortement CX3CR1 et les molécules MHC de classe II mais très

faiblement CCR2. Ils sont alors reconnus comme étant des monocytes anti-inflammatoires

(Gordon and Taylor, 2005). Chez la souris, les sous-groupes de monocytes sont identifiés

grâce à l’expression de CD115 et de Gr1 (Ly6C/Ly6G). Les monocytes CD115+ Ly6CHigh

Ly6G- expriment le marqueur CCR2 mais de très bas niveaux de CX3CR1. Les monocytes

52

CD115+ Ly6CLow Ly6G- expriment fortement CX3CR1 mais très peu CCR2. Ces

monocytes sont appelés monocytes résidents et se retrouvent tant bien dans les tissus sains

que dans les tissus inflammés. Ces monocytes sont souvent comparés aux monocytes

humains CD14- CD16+ pour leurs propriétés anti-inflammatoires (Geissmann et al., 2003,

Gordon and Taylor, 2005, Auffray et al., 2009). Les monocytes CX3CR1High sont capables

de patrouiller les tissus en rampant sur les cellules endothéliales via un mécanisme

CX3CR1-dépendant, ce qui permettrait leur recrutement rapide en cas d’infection ou de

blessure (Auffray et al., 2007).

Il a été rapporté que les monocytes Ly6CLow CX3CR1High sont impliqués dans le processus

de réparation tissulaire (Nahrendorf et al., 2007). En effet, Nahrendorf et al. ont démontré

qu’une lésion du myocarde entraîne le recrutement des 2 types de monocytes, soient les

cellules Ly6CHigh Ly6G- au cours d’une première phase et les cellules Ly6CLow Ly6G- qui

arrivent un peu plus tard au cours d’une deuxième phase de mobilisation. Les 2 sous-

groupes de monocytes possèdent la même activité phagocytaire in vivo. Par contre, les

cellules Ly6CHigh présentent une forte expression de cytokines pro-inflammatoires (TNF et

IL-1β) ainsi qu’une activité élevée en protéinases impliquées dans la rupture de la matrice

extracellulaire. En contrepartie, les monocytes Ly6CLow expriment de hauts niveaux du

facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) et de faibles niveaux de TNF et

d’IL-1β, ce qui leur confère des propriétés angiogéniques et anti-inflammatoires.

La présence de ces différents types de monocytes/macrophages devient également une

caractéristique importante suite à une LME. Popovich et al. ont démontré que la déplétion

des macrophages via l’injection de chlodronate encapsulé dans des liposomes entraîne une

amélioration de la récupération locomotrice ainsi que de la réparation tissulaire chez le rat

suite à une LME (Popovich et al., 1999). Plus récemment, leur équipe a identifié la

présence de 2 types de macrophages suite à la LME (Kigerl et al., 2009). En effet, elle a

démontré que la lésion induit l’expression de gènes capables de polariser les macrophages

vers un phénotype M1 pro-inflammatoire (iNOS, CD32, CD86) ou un phénotype anti-

inflammatoire M2 (Arg1, CD14, CD206). De plus, lorsque co-cultivés avec des neurones

primaires, les macrophages M1 possèdent un effet neurotoxique diminuant ainsi la survie

53

cellulaire tandis que les macrophages M2 stimulent la régénérescence et la croissance

axonale. Enfin, Thawer et al. ont prouvé que le recrutement de macrophages M1

Ly6ChighF4/80low a lieu majoritairement dans la phase aigüe suivant la lésion (jours 1 à 3),

bien que ces cellules semblent revenir à nouveau 6 semaines post-LME (Thawer et al.,

2013). De leur côté, les macrophages M2 Ly6ClowF4/80high répondent plutôt entre les jours

7 et 14 post-LME. Ces résultats suggèrent que la régulation du recrutement des

macrophages à différents moments suivant la lésion peut avoir des effets soit bénéfiques

soit néfastes suite à une LME.

1.7. Protection et régénération du SNC La méthylprednisolone (MP), un anti-inflammatoire stéroïdien (corticostéroïde), fut le

premier traitement à être utilisé officiellement en clinique pour le traitement des LME chez

l’humain, et ce depuis le début des années 90 (Bracken et al., 1990) (Bracken et al., 1997).

Ses effets consistent en des effets anti-oxydants, l’inhibition de l’inflammation ainsi que la

peroxydation des lipides. La MP permet également de diminuer la mort apoptotique des

OLs, mais pas celle des neurones, et la démyélinisation suite à un traitement avec AMPA,

un agoniste des récepteurs du glutamate (Lee et al., 2008). Par contre, ce médicament a ses

limites puisque la MP doit absolument être administrée dans les 8 premières heures suite à

la LME pour que le traitement soit efficace chez l’humain (Sayer et al., 2006). Ses effets

secondaires et une interprétation erronée de plusieurs études cliniques ont amené depuis

quelques années les cliniciens a reconsidérer l’utilisation de la MP pour le traitement des

LME (Sayer et al., 2006, Juknis et al., 2012, Priestley et al., 2012).

Dans les dernières années, plusieurs autres études ont tenté de manipuler la réponse

inflammatoire dans le but de réduire les déficits locomoteurs occasionnés par la lésion.

Mais étant donné la complexité et les effets divergents de la réponse neuroinflammatoire,

les thérapies à l’essai en études pré-cliniques et cliniques ont donné des résultats tantôt

bénéfiques tantôt néfastes. Parmi celles-ci, la minocycline, qui fut démontrée comme ayant

des effet anti-inflammatoires et neuroprotecteurs chez les rongeurs (Kwon et al., 2011,

Wilson et al., 2013). L’injection de minocycline a pour effet de réduire le nombre de

microglies et d’oligodendrocytes en apoptose, corrélant avec une diminution de la

54

dégénérescence antérograde aiguë des fibres axonales situées à proximité de la LME

(Stirling et al., 2004). L’érythropoiétine, un facteur de croissance hématopoiétique, fut

démontré comme capable de réduire l’apoptose et l’inflammation et de promouvoir la

réparation vasculaire (Gorio et al., 2002). D’autres études ont utilisé des anticorps dirigés

contre l’intégrine CD11d, une protéine exprimée à la surface des macrophages et des

neutrophiles, et rapporté une baisse de la production de radicaux libres (ROS) et de

l’activité myéloperoxydase (MPO) chez le rat ayant subi une suite LME, entrainant par le

fait même une amélioreration des fonctions locomotrices et sensorielles (Gris, 2004, Bao et

al., 2005).

Parmi les études qui ont tenté de développer des stratégies thérapeutiques axées sur le

concept de régénération axonale, on retrouve les nombreuses études visant à comprendre

les mécanismes d’inhibition de la repousse axonale. Les molécules ayant cet effet sont

MAG, MOG, Nogo et les CSPGs. La chondroitinase ABC (ChABC) est une enzyme

capable de cliver les CSPGs (Crespo et al., 2007, Sharma et al., 2012). Lorsqu’elle a fut

testée dans un modèle de LME, ChABC a eu pour effet de diminuer les niveaux

d’expression des CSPGs et de stimuler la régénérescence axonale (Bradbury et al., 2002).

De plus, la combinaison de ChABC avec l’anti-Nogo-A s’est révélée encore plus efficace

que le traitement unique avec l’une ou l’autre de ces molécules (Zhao et al., 2013). Par

ailleurs, l’administration d’un anticorps neutralisant dirigé contre Nogo-A, une protéine de

la myéline capable d’inhiber la croissance axonale (Grandpre and Strittmatter, 2001), a eu

pour effet de stimuler une sur-régulation de facteurs de croissance tels que NGF, NT-3 et

NT-4/5 et une augmentation de la plasticité neuronale entraînant la formation de nouvelles

connections neuronales dans la moelle épinière lésée (Zörner and Schwab, 2010).

Les études décrites ci-dessus ont donc un objectif commun qui consiste à stimuler la

réparation tissulaire et diminuer l’apparition des dommages tissulaires secondaires afin

d’améliorer la santé des personnes affligées d’une LME.

55

1.8. Hypothèse et objectifs généraux Les LME entraînent des dommages tissulaires irréversibles réduisant la mobilité et la

qualité de vie des personnes atteintes par ce genre de lésion. Immédiatement après la lésion,

une réponse inflammatoire initiée par les neurones et les cellules gliales est déclenchée,

causant la relâche d’une panoplie de cytokines et de chimiokines dans le tissu nerveux lésé.

Cette cascade inflammatoire orchestre le recrutement de différents types de cellules

immunitaires telles que les neutrophiles et les monocytes sanguins au site de lésion.

Ensemble, ces mécanismes cellulaires et molécules ont pour rôle de stériliser le site

lésionnel et favoriser la réparation tissulaire mais pour « effet secondaire » d’entraîner des

dommages secondaires au tissu lésé.

Au cours des dernières années, plusieurs études ont tenté d’éclaircir la chronologie de

recrutement des cellules immunitaires impliquées ainsi que leur rôle biologique suite à une

LME (Popovich et al., 1999, Stirling and Yong, 2008, Kigerl et al., 2009, Shechter et al.,

2009, Stirling et al., 2009, Lee et al., 2011, Thawer et al., 2013). Précédemment aux

travaux présentés dans cette thèse, une étude effectuée par notre laboratoire a démontré que

les astroyctes sont responsables de l’expression de chimiokines (MCP-1, CXCL1 et

CXCL2) nécessaires au recrutement de neutrophiles et de monocytes pro-inflammatoires

M1 via un mécanisme dépendant de la voie de signalisation de l’IL-1R1/MyD88 (Pineau et

al., 2010). Par contre, les mécanismes initiant cette cascade demeurent inconnus. Nous

avons donc voulu déterminer les molécules et cellules impliquées dans l’initiation de

l’inflammation immédiatement après la LME.

1.8.1. Étude du rôle du récepteur P2X4R Une forte relâche d’ATP dans le milieu extracellulaire survient suite à une LME ou une

LNP activant ainsi des récepteurs purinergiques tels que P2X4R et P2X7R P2X7R (Wang et

al., 2004, Coull et al., 2005). Une augmentation de l’expression de P2X4R par les cellules

microgliales fut rapportée suite à une LME (Schwab et al., 2005) et une LNP (Ulmann et

al., 2008). De plus, Silvermann et al. ont démontré que P2X7R est capable d’activer la

formation de l’inflammasome NLRP1 dans les neurones et les astrocytes traités à l’ATP,

56

suggérant ainsi que ce récepteur puisse favoriser le clivage de l’IL-1β dans les cellules du

SNC. Nous nous sommes donc demandé quel pourrait être le rôle de l’activation de P2X4R

suite à une LME chez la souris.

Lors de la 1ère étude présentée au chapitre 3, nous avons émis comme hypothèse que, suite à

une LME, l’activation de P2X4R stimule la formation d’un inflammasome et le clivage de

l’IL-1β. La relâche de la forme mature de cette cytokine dans le tissu lésé entraîne un

recrutement rapide de cellules immunitaires pouvant infliger des dommages collatéraux aux

neuronaux et un déficit locomoteur. Pour vérifier cette hypothèse, notre plan expérimental

visait à :

1) Vérifier l’expression de P2X4R dans la moelle épinière naïve et lésée à différents

temps post-lésion par Western Blot.

2) Étudier l’expression de la caspase-1 clivée et de l’IL-1β en réponse à une LME par

Western Blot.

3) Vérifier le type cellulaire capable d’exprimer le récepteur dans notre modèle par des

marquages en immunofluorescence.

4) Quantifier le nombre de cellules pro-inflammatoires infiltrantes au site de lésion par

des marquages en immunohistochimie et par cytométrie en flux (FACS) chez des

souris P2x4r-/- versus sauvages.

5) Étudier la récupération des fonctions locomotrices chez des souris P2x4r-/- ayant

subi une LME à l’aide de tests de comportement (BMS et Grip Walk).

1.8.2. Étude des effets de l’IL-1αα et IL-1ββ Une famille de cytokines très importantes qui jouent un rôle dans la neurodégénérescence

suite à une lésion du SNC est la famille de l’IL-1. Les 2 principaux membres, l’IL-1α et

l’IL-1β, exercent leurs actions via un récepteur commun, l’IL-1R1. Il fut démontré que

l’IL-1α est associée à la chromatine dans une cellule normale ou en apoptose mais qu’elle

deviendrait sous une forme libre dans la cellule nécrotique, ce qui résulterait ultimement en

sa relâche dans le milieu extracellulaire et la stimulation de l’inflammation (Luheshi et al.,

57

2009, Cohen et al., 2010). Enfin, l’IL-1α serait requise plus tôt que l’IL-1β au cours de

l’inflammation puisque son rôle serait en lien avec le recrutement des neutrophiles lors

d’une inflammation de type stérile induite par la mort cellulaire (Chen et al., 2007, Kono et

al., 2010).

Lors de la 2e étude présentée dans le chapitre 4, nous avons voulu élucider le rôle de l’IL-

1α et de l’IL-1β dans la chronologie des événements menant à l’initiation de

l’inflammation suite à une LME et, par conséquent, dans la propagation des dommages

tissulaires et la perte des fonctions locomotrices. Nous avons émis comme hypothèse

qu’une LME entraîne la relâche de l’IL-1α et de l’IL-1β ayant pour effet de recruter les

cellules immunitaires innées au site de lésion ce qui pourrait éventuellement entraîner de

possibles dommages au tissu nerveux et causer une atteinte à la capacité locomotrice chez

la souris.

Pour vérifier cette hypothèse, nous nous sommes fixés comme objectifs majeurs de:

1) Déterminer la chronologie d’expression de l’IL-1α et de l’IL-1β et identifier les

cellules responsables de leur production suite à LME.

2) Quantifier le nombre de neutrophiles et de monocytes M1 pro-inflammatoires au

site lésionnel chez des souris Il-1α-/-, Il-1β-/- et Il-1r1-/- et des souris sauvages.

3) Étudier l’effet de l’absence d’IL-1α, d’IL-1β ou de IL-1R1 sur la récupération

locomotrice et la propagation des dommages tissulaires chez la souris lésées en

effectuant 2 tests de comportement (BMS et Grip Walk).

4) Étudier l’effet de l’absence de ces 2 cytokines sur la régulation du transcriptome

murin grâce à des micropuces à ADN et le RT-PCR quantitatif en temps réel.

5) Étudier l’expression du facteur de survie neuronale TOX3 chez les souris Il-1α-/-, Il-

1β-/-, Il-1r1-/- et sauvages à la suite d’une LME et identifier le(s) type(s) cellulaire(s)

responsable(s) de son expression.

59

2. Chapitre 2

Cytokine pathways regulating glial and leukocyte function after spinal cord and peripheral nerve injury

Dominic Bastien1 and Steve Lacroix1

1 Centre de recherche du Centre hospitalier de l'Université Laval and Département de Médecine Moléculaire, Université Laval, Québec, Québec, Canada, G1V 4G2

60

2.1. Résumé Les lésions du système nerveux entraînent la relâche rapide de cytokines par les cellules

gliales et les neurones. Ces cytokines sont responsables de la régulation de différentes

réponses conduisant à la microglioses, le recrutement de cellules immunitaires,

l’astrogliose, la cicatrisation, la dégradation des débris cellulaires, tous des mécanismes

affectant la survie neuronale ainsi que la réparation tissulaire. Cette revue se concentrera

sur les cytokines relâchées suite à une LME et une LNP et les principales voies de

signalisation déclenchées par ces médiateurs inflammatoires. Particulièrement, les familles

de cytokines suivantes seront discutées: IL-1, TNF, IL-6, TGF-β et IL-10. Comment le

contrôle de ces voies de signalisation pourrait mener au développement de nouvelles

thérapies sera aussi discuté. Finalement, cette revue discutera si la manipulation de ces

voies de signalisation pourrait entraîner différents effets dans la moelle épinière lésée

comparativement aux nerfs périphériques lésés.

61

2.2. Abstract Injury to the nervous system causes the almost immediate release of cytokines by glial cells

and neurons. These cytokines orchestrate a complex array of responses leading to

microgliosis, immune cell recruitment, astrogliosis, scarring, and the clearance of cellular

debris, all steps that affect neuronal survival and repair. This review will focus on cytokines

released after spinal cord and peripheral nerve injury and the primary signalling pathways

triggered by these inflammatory mediators. Notably, the following cytokine families will be

covered: IL-1, TNF, IL-6-like, TGF-β, and IL-10. Whether interfering with cytokine

signalling could lead to novel therapies will also be discussed. Finally, the review will

address whether manipulating the above-mentioned cytokine families and signalling

pathways could exert distinct effects in the injured spinal cord versus peripheral nerve.

62

2.3. Introduction Traumatic spinal cord injury (SCI) and peripheral nerve injury (PNI) cause damage to

axons and their myelin sheaths. How axons respond to injury has been extensively studied

for decades in a variety of organisms, ranging from invertebrates to non-human primates

(Bradke et al., 2012). From these studies a main conclusion can be drawn: axonal

regeneration is regulated by a multitude of intracellular and extracellular signals. Among

which are several axon growth inhibitory molecules that have been found in myelin or

associated with the scar (Burda and Sofroniew, 2014; Cregg et al., 2014; Schwab, 2010).

Wallerian degeneration (WD) and clearance of inhibitory myelin debris are delayed in the

injured CNS compared to the injured PNS, which could be one of the main reasons why

CNS regeneration is generally so poor (David and Lacroix, 2005). In addition, immune

cells that phagocytose myelin debris are potentially the source of neurotrophic factors and

anti-inflammatory molecules that may support the regenerative and repair processes. In

support of this are studies that showed that CNS axons can grow in transplanted peripheral

nerve segments (Barrette et al., 2008; David and Aguayo, 1981).

Another direct consequence of SCI is the destruction of neurons and glia at the site of

lesion, which has been referred to as the primary mechanical lesion. Long-standing

evidence suggests that a second wave of cell death follows the primary mechanical insult,

leading to apoptosis of oligodendrocytes (OLs) and neurons (Crowe et al., 1997; Liu et al.,

1997). However, it is important to note that they are many other suspected causes of

secondary damage in the injured spinal cord, including ischemia, vascular damage,

glutamate excitotoxicity, ionic dysregulation, and inflammation (for reviews, see (David

and Lacroix, 2005; Donnelly and Popovich, 2008)). The topic of inflammation has received

the greatest attention because immune cells are the main producers of free radicals,

proteases, eicosanoids and cytokines, all of which are molecules that have been shown to

be both capable of inducing cell death and myelin damage and of being expressed in the

injured spinal cord within minutes to days of mechanical impact (Bao and Liu, 2004; Hains

et al., 2001; Liu et al., 2000; Liu et al., 1998; Noble et al., 2002; Pineau and Lacroix, 2007;

Rice et al., 2007; Wells et al., 2003). This time course fits well with the timing of

secondary damage, suggested to occur between 4 h and 14 d post-SCI (Blight, 1985; Liu et

63

al., 1997). The concept of secondary cell damage is at the center of the preclinical

development of potential neuroprotective therapies, with many studies reporting reduced

lesion size and/or increased spared tissue as a result of treatment (reviewed extensively by

(Kwon et al., 2011)). An outstanding question has been why neurons projecting through

peripheral nerves do not seem to be as sensitive to these potentially cytotoxic molecules.

Indeed, peripheral nerve and spinal cord lesion sites seem to contain the same inflammatory

cells and molecules, but perhaps not at the same timing, duration and expression levels.

This subject will be addressed in the last part of this review.

In the CNS, as in the PNS, glia can be activated by several different types of signals and

modulators, among which cytokines and neurotransmission-related compounds are

considered to play major regulatory roles (Hanisch and Kettenmann, 2007). For example,

microglia respond within minutes to ATP released after laser-induced SCI by extending

their processes in order to rapidly shield the site of injury (Davalos et al., 2005;

Nimmerjahn et al., 2005) (Fig. 2.1). Depending on the repertoire of receptors activated,

microglia can either promote neuronal survival and regeneration or contribute to neuronal

death (Hanisch and Kettenmann, 2007; Ransohoff and Perry, 2009). Although they do not

physically respond as quickly as microglia (Farrar et al., 2012), astrocytes, the main cellular

component of the glial scar, increase their GFAP expression, become hypertrophic,

proliferate and migrate around the lesion site in a process generally referred to as reactive

astrogliosis (Sofroniew, 2009). Several different mediators of reactive astrogliosis exist,

among which are cytokines of the IL-1, TNF, IL-6-like, TGF-β, and IL-10 families

(reviewed by (Sofroniew, 2009)). Importantly, the glial scar has been shown to exert both

beneficial and detrimental effects after SCI (Brambilla et al., 2005; Brambilla et al., 2009;

Faulkner et al., 2004).

64

Figure 2.1 Microglia rapidly shield the site of a spinal cord lesion by first extending their cellular processes and then their cell bodies. To examine the microglial response toward the site of a laser-induced spinal cord lesion, time-lapse two-photon intravital microscopy was used to simultaneously image microglia, axons and blood vessels. Real-time in vivo imaging of microglia (green; CX3CR1-eGFP), axons (cyan; Thy1-CFP), and blood vessels (redwood color; Qtracker® 800 non-targeted quantum dots) was performed in the spinal cord of a Thy1-CFP; CX3CR1-eGFP double transgenic fluorescent mouse. Time zero minutes (min) correspond to the time of the lesion. The lesion site is shown in red. Scale bar: 25 µm.

65

Innate immune cells such as neutrophils and monocytes are rapidly recruited at sites of SCI

(Beck et al., 2010; Fleming et al., 2006; Lee et al., 2011; Mawhinney et al., 2012; Pineau et

al., 2010; Stirling and Yong, 2008; Thawer et al., 2013). Evidence suggests that these cells

could play a key role in both secondary damage and tissue repair after traumatic neural

injury (Barrette et al., 2008; Kigerl et al., 2009; Shechter et al., 2009; Stirling et al., 2009).

The apparent contradictions between these studies may be due to the fact that different

subsets of immune cells have divergent effects, resulting in either neurotoxicity or

regeneration in the injured spinal cord (David and Kroner, 2011). The effects of cytokines

on glia and leukocytes and the contribution of these cells to tissue damage, glial scarring

and regeneration will be explored in more detail in the second part of this review. One

important area of focus will be how cytokines govern immune cell recruitment, activation

and polarization in the context of injury, as this could explain some of the controversies and

paradoxical effects of neuroinflammation in SCI.

This review begins with an overview of the principal families of cytokines for which a role

in the pathophysiology of spinal cord and peripheral nerve injury has been established.

2.4. Cytokines released after neural injury: production, receptor signalling pathways and immune responses

2.4.1. IL-1 family members

The role of interleukin (IL)-1 family cytokines in the initiation and regulation of

inflammation during infection and injury is well established. The family contains 11

members, the best characterized of which are IL-1α, IL-1β, IL-1 receptor antagonist (IL-

1RA), IL-18, and IL-33 (Dinarello, 2009). IL-1α and IL-1β were the first two members of

the family to be described. Despite the fact they share only 25-30% amino acid homology,

they have a similar 3D structure and biological properties (Dinarello, 1991; Graves et al.,

1990). Since they bind to the same receptor, IL-1 receptor type 1 (IL-1R1), with the same

affinity and stimulate expression of similar downstream effectors, IL-1α and IL-1β have

long been thought to trigger identical responses. However, Rothwell and colleagues have

66

shown that the relative potencies of recombinant IL-1α and IL-1β vary depending on the

context and the response being studied, thus suggesting that different mechanisms are likely

to be involved in the various effects of IL-1 cytokines in the CNS (Andre et al., 2005;

Anforth et al., 1998; Tsakiri et al., 2008). For example, the study by Anforth et al. showed

that IL-1β is more effective than IL-1α at inducing fever when the cytokines are injected

intracerebroventricularly (i.c.v.) (Anforth et al., 1998). Moreover, and in contrast to IL-1β,

treatment with IL-1α failed to induce IL-6 production from glia and neurons, despite the

fact that both forms of IL-1 were equally effective at increasing expression levels of

chemokines such as CCL2/MCP-1, CXCL1/KC and IP-10 (Andre et al., 2005; Tsakiri et

al., 2008), More recently, Rider et al. suggested that the precursor of IL-1α and mature IL-

1β recruit different myeloid cells (neutrophils and macrophages, respectively) in response

to hypoxia-induced cell death (Rider et al., 2011). It is therefore plausible that the two IL-1

cytokines signal through distinct signalling complexes and regulate expression of specific

genes. Preliminary results in this direction, in which we compared the transcriptome of the

injured spinal cord of IL-1α-knockout (KO), IL-1ß-KO and wild-type (WT) mice during

the acute phase of SCI using Affymetrix GeneChip microarrays, indicate that a few genes

appear to be specifically regulated by IL-1α (D. Bastien and S. Lacroix, unpublished

observation).

2.4.1.1. Interleukin-1αα (IL-1αα) IL-1α and IL-1β are synthesized as 31-kDa precursor proteins. However, only the IL-1α

precursor (pro-IL-1α) is able to bind to IL-1R1, which suggests that this form is

biologically active (March et al., 1985; Mosley et al., 1987). Proteases such as calpain

(Carruth et al., 1991; Kobayashi et al., 1990), and more recently granzyme B, elastase and

chymase (Afonina et al., 2011), were shown to cleave pro-IL-1α and yield a 17-kDa form.

Initially, that cleavage was thought to have no effect on the biological activities of the

cytokine, but recent studies have shown that the 17-kDa mature form of IL-1α has

enhanced immunological potency compared to the proform (Afonina et al., 2011; Zheng et

al., 2013). Zheng et al. also identified the IL-1 receptor type 2 (IL-1R2) as a regulator of

67

IL-1α cleavage, being able to bind IL-1α and prevent calpain from processing the precursor

cytokine. Despite this, evidence has shown that the proform has the ability to recruit

leukocytes following its release from hypoxic cells (Rider et al., 2011). One unknown is

whether the pro- and mature forms of IL-1α have the same biological functions.

IL-1α, like IL-33, high-mobility group box protein 1 (HMGB1), S100 proteins and heat-

shock proteins (HSPs), belongs to a class of dual-function molecules capable of performing

their functions in the nucleus as well as in the extracellular compartment. These molecules,

also referred to as alarmins or danger-associated molecular pattern molecules (DAMPs)

(see also Kigerl et al., this issue), are constitutively expressed in the nucleus where they act

as regulators of DNA transcription, However, once released into the extracellular space

from necrotic cells upon tissue injury or infection, these molecules become powerful

mediators of inflammation (Chan et al., 2012).

IL-1α has an N-terminal nuclear localization sequence (NLS), allowing it to translocate to

the nucleus of cells, where it regulates transcription of proinflammatory genes (Buryskova

et al., 2004; Werman et al., 2004). During apoptosis, IL-1α remains associated with the

chromatin and is retained in the apoptotic bodies, thus preventing the cytokine from

triggering inflammation. Conversely, following necrosis, IL-1α dissociates from the

chromatin and is released first in the cytoplasm and then in the extracellular milieu where it

can initiate inflammation by binding the IL-1R1 on neighboring cells (Cohen et al., 2010;

Luheshi et al., 2009). Accordingly, mice treated with antibody to IL-1α have reduced

neutrophil recruitment in response to i.p. injection of necrotic cells when compared to mice

treated with control antibody or antibody to IL-1β (Chen et al., 2007). This finding was

confirmed by another in vivo study that showed that IL-1α released by dying cells, believed

to be tissue-resident macrophages, triggers neutrophil recruitment through the CXCL1-

CXCR2 axis in an IL-1R1-dependent manner (Eigenbrod et al., 2008).

In culture, IL-1α has been detected in multiple cell types (Dinarello, 2009). However, in

the CNS, only resident microglia and infiltrating platelets have been confirmed as possible

68

sources of IL-1α during inflammatory conditions, such as cerebral ischemia (Luheshi et al.,

2011; Thornton et al., 2010). In the ischemic brain, microglia express IL-1α mRNA and

protein as early as 4 hours following reperfusion, mainly in regions exhibiting neuronal cell

death (Luheshi et al., 2011). This time point precedes the reported infiltration of blood-

derived immune cells and appearance of apoptotic neurons in this animal model

(Broughton et al., 2009; Iadecola and Anrather, 2011). However, work with KO mice has

revealed that both forms of IL-1, but not IL-1α or IL-1β alone, need to be knocked out to

reduce ischemic infarct size (Boutin et al., 2001). These results highlight the possibility of

compensatory changes in the IL-1 system and reinforce the need to carefully assess the

individual and cumulative effects of cytokines of the IL-1 family.

2.4.1.2. Interleukin-1ββ (IL-1ββ) Because pro-IL-1β is unable to bind to IL-1R1, its enzymatic cleavage by caspase-1 is a

required step in the production of a bioactive 17-kDa mature form of IL-1β. This

proteolytic cleavage of pro-IL-1β depends on the assembly of large multiprotein complexes

termed inflammasomes (Franchi et al., 2009; Lamkanfi and Dixit, 2012; Mariathasan and

Monack, 2007; Martinon et al., 2009). Proteins encoded by the nucleotide-binding

oligomerization domain and leucine-rich repeat (NLR) containing gene family form the

central components of inflammasomes (see also Kigerl et al., this issue). A question that

had remained unanswered until recently is whether spinal cord resident cells express

inflammasomes, and if so which cells influence inflammasome activation after SCI?

de Rivero Vaccari and colleagues were the first to demonstrate the existence of the NLRP1

inflammasome, consisting of NLRP1, caspase-1, caspase-11, XIAP, and ASC, an adaptor

protein essential for caspase-1 recruitment and known to interact with several

inflammasomes (Tschopp et al., 2003), in neurons of the normal rat spinal cord (de Rivero

Vaccari et al., 2008). Neutralization of ASC in SCI mice reduced caspase-1 activation and

IL-1β cleavage, and this was correlated with increased tissue sparing and functional

recovery. More recently, we found that purinergic receptors of the P2X4-subtype are

expressed in spinal cord neurons and regulate inflammasome activation after SCI (de

69

Rivero Vaccari et al., 2012). P2X4-KO mice have decreased levels of activated caspase-1

and mature IL-1β after SCI. Mice lacking the P2X4 receptor also exhibited reduced

recruitment of neutrophils and pro-inflammatory monocytes at sites of SCI and improved

histopathological and functional outcomes compared with WT mice, thus suggesting that

interfering with P2X4R-mediated IL-1β processing in vivo is a potential target to limit

neuroinflammation and neurodegeneration (de Rivero Vaccari et al., 2012). However, an

intriguing observation made by de Rivero Vaccari et al. in the 2008 study is that ASC, but

not NLRP1, is expressed in microglia and OLs, thus suggesting the possibility that other

types of inflammasome sensors may also be implicated in neuroinflammation.

Interestingly, P2X4 receptors are not only expressed in neurons but also in microglia

(Ulmann et al., 2008), and SCI causes increased expression of P2X4 receptors in these two

cell populations (Schwab et al., 2005).

In the CNS, IL-1β can directly affect glial cells, endothelial cells (ECs), and even neurons,

as they all express IL-1R1 (Allan et al., 2005) (see Table 2.1). IL-1β has been shown to

promote astrogliosis (e.g. astrocyte proliferation) and trigger astrocytic release of

glutamate, nitric oxide (NO), potassium, prostaglandins (PGs), cytokines and chemokines

(Basu et al., 2004), all of which were shown to be toxic to neurons at high concentrations

(for review, (David and Lacroix, 2005)). In contrast, astrocyte activation by IL-1β can also

exert neuroprotective effects by stimulating blood-brain barrier repair and decreasing its

permeability. As many as 1,400 genes may be differentially regulated in astrocytes by IL-

1β (John et al., 2005). IL-1β can also stimulate microglia, resulting in the expression and

release of proinflammatory mediators such as prostaglandin E2 (PGE2), cytokines and

chemokines (Basu et al., 2004). Microglia can also release IL-1β, which in turn triggers the

production of ciliary neurotrophic factor (CNTF) by astrocytes in response to brain trauma

in mice (Herx et al., 2000). Oligodendrocytes (OLs) and their precursor cells, OPCs, also

respond to IL-1β. Using the cuprizone model of demyelination, Mason et al. suggested that

IL-1β promotes remyelination and repair (Mason et al., 2001). OPCs of IL-1β-KO mice

exhibited a prominent delay in differentiation into mature OLs, which resulted in

remyelination failure in these animals. Deletion of the IL-1β gene also led to decreased

70

microglial and astrocytic expression of insulin-like growth factor (IGF)-1, a factor known

to stimulate proliferation, differentiation and survival of cells of the OL lineage (Barres et

al., 1993; Mason et al., 2000). The multiple effects mediated by IL-1β in various cell types

raise the interesting question of whether these responses are mediated by different

intracellular signalling pathways.

Other than its effects on glia, IL-1β can also directly bind to IL-1R1 expressed on CNS

endothelium to stimulate production of cytokines, chemokines, cell adhesion molecules

(CAMs), PGs, NO, matrix metalloproteinases (MMPs); molecules that are involved in the

recruitment and infiltration of leukocytes into the CNS parenchyma (Allan et al., 2005).

Finally, although IL-1β does not seem to be directly toxic to healthy neurons, it can induce

production of mediators that are highly neurotoxic through the neurons themselves or

surrounding cells (Allan et al., 2005; Basu et al., 2004). Together, these studies demonstrate

that IL-1β affects a large range of CNS cells and drives the expression of several molecules

previously shown to play a key role in CNS injury and mechanisms of neurodegeneration

and repair.

2.4.1.3. Interleukin-1 receptor type 1 (IL-1R1) IL-1R1, through which both IL-1α and IL-1β signal, possesses an extracellular domain

together with a Toll-like/IL-1R1 (TIR) domain in the cytosolic compartment. It is part of

the IL-1R/Toll-like receptor (TLR) superfamily (O'Neill and Dinarello, 2000). The other

form of IL-1 receptor, IL-1R2, has a shorter intracellular domain believed to be biologically

inert. Intracellular IL-1R2 regulates cell activation by preventing cleavage and activity of

IL-1α (Zheng et al., 2013). IL-1R2 can also be cleaved from the cell membrane and

released in the extracellular milieu, where it can bind IL-1 cytokines and prevent them from

acting on IL-1R1 expressed on adjacent cells (Arend et al., 2008).

Activation of IL-1R1 by IL-1 cytokines leads to the recruitment of a sub-unit called IL-1

receptor accessory protein (IL-1RAcP). The complex composed of IL-1α/β, IL-1R1 and

IL-1RAcP then allows the recruitment of the adaptor protein, myeloid differentiation factor

71

88 (MyD88). MyD88 subsequently recruits the IL-1 receptor-associated kinases (IRAKs)

and tumor necrosis factor (TNF) receptor-associated factor 6 (TRAF6), to activate

transcription factors such as nuclear factor-κB (NF-κB), mitogen-activated protein kinases

(MAPKs) such as c-Jun N-terminal kinase (JNK), extracellular signal-regulated kinases 1

and 2 (ERK-1/2) and p38, and activator protein-1 (AP-1) (O'Neill, 2008) (Fig. 2.2). The

importance of MyD88 has been documented by Adachi et al. who reported a complete loss

of the characteristic immune responses normally mediated by IL-1R1 in MyD88-KO mice,

such as IL-1-mediated cytokine production, acute phase proteins expression and T cell

proliferation (Adachi et al., 1998). More recently, we found that the IL-1R1/MyD88

signalling pathway plays a major role in the recruitment of neutrophils and

proinflammatory M1 monocytes after SCI by promoting the expression of chemokines such

as CXCL1 and CXCL2 by astrocytes (Pineau et al., 2010). It is also important to know that

IL-1RAcPb, a splice isoform of IL-1RAcP with a variant TIR domain and whose

expression is restricted to CNS neurons, has been shown to modulate neuronal responses to

IL-1 (Nguyen et al., 2011; Smith et al., 2009). Although the neuron-specific function of IL-

1RAcPb is largely unknown, the C-terminal extension of AcPb allows it to bind adaptor

proteins and recruit them to the IL-1R1 receptor complex in an IL-1-dependent manner.

Despite the fact that IL-1RAcP is able to associate with IL-1R1 in the presence of IL-1, it

should be pointed out that this association does not lead to the recruitment of MyD88 and

IRAK4, and is therefore unable to mediate canonical IL-1 signalling (Smith et al., 2009).

Nguyen et al. further reported that IL-1α-induced, but not IL-1β-induced, p38

phosphorylation is significantly reduced in primary neuronal cultures from IL-1RAcPb-KO

mice (Nguyen et al., 2011). These results suggest an important role of IL-1RAcPb in

specific neuronal activities, but not all, in response to IL-1α.

Several studies suggested that IL-1R1 plays an important role in glial responses in brain

and spinal cord injury. After penetrating stab injury to the brain, IL-1R1-KO mice exhibit

reduced macrophage/microglia activation and astrogliosis around the lesion site (Basu et

al., 2002b). The study also reported a decrease in IL-6, cyclooxygenase-2 (COX-2), and

VCAM-1 mRNA expression. However, not all astrocytic responses that typically occur

after CNS injury are compromised in mice lacking IL-1R1, as levels of chondroitin

72

sulphate proteoglycans (CSPGs), tenascin, S100β and glutamate transporters (GLAST,

GLT-1) remain unchanged (Lin et al., 2006). Therefore, some astrocyte properties do not

seem to require the IL-1R1 pathway.

2.4.1.4. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1RA) Treatment of many diseases relies on blocking IL-1R1 signalling by way of administering

its receptor antagonist, IL-1RA. Anakinra, the recombinant form of IL-1RA, is widely used

in the clinical treatment of inflammatory diseases such as familial Mediterranean fever,

rheumatoid arthritis, gout and type 2 diabetes (reviewed in (Dinarello, 2011; Dinarello et

al., 2012)). In the CNS after stroke, a single subcutaneous injection of IL-1RA reduced

infarct volume by 33% in rats exposed to middle cerebral artery occlusion (MCAO)

(Greenhalgh et al., 2010). More relevant for the clinical practice, IL-1RA administered at

reperfusion after transient MCAO in a rat model reduced blood-brain barrier disruption,

neutrophil infiltration, microglial activation and cytokine (IL-6) levels in the brain (Pradillo

et al., 2012). Treatment with IL-1RA adsorbed into a gelatin sponge and applied on top of

the contused spinal cord of rats promoted functional recovery for at least 4 weeks (Zong et

al., 2012). Chronic intrathecal delivery of recombinant IL-1RA also reduced apoptosis and

caspase-3 activity in a contusion SCI rat model (Nesic et al., 2001). Together, these results

suggest an important beneficial effect of IL-1RA in the treatment of SCI and

neuropathologies with an inflammatory component.

2.4.1.5. Interleukin-18 (IL-18) Another molecule that possesses a similar structure to cytokines of the IL-1 family is IL-18.

Like IL-1β, IL-18 is synthesized as an inactive 23-kDa protein that can be cleaved by

caspase-1 into a bioactive 18-kDa mature form (Ghayur et al., 1997; Gu et al., 1997).

Because of its role in the production of IFN-γ in T-helper type I (Th1) cells, IL-18 is

perhaps best known for its involvement in T-cell polarization towards a Th1 phenotype

(Nakanishi et al., 2001). This skewing is due to a complex interplay between different

immune cells and involves IL-18, IL-12 and the IL-18 receptor (IL-18R). Somewhat

surprisingly, IL-18 alone can stimulate Th2 responses such as production of the anti-

inflammatory cytokines IL-4 and IL-13 (Nakanishi et al., 2001). Among its other functions,

73

IL-18 also regulates production of CAMs, NO, cytolytic granules and cytokines such as IL-

2, GM-CSF, IL-1β and TNF (Arend et al., 2008; Smith, 2011).

The biological functions of IL-18 are mediated through IL-18R, a receptor of the IL-

1R/TLR superfamily that is remarkably similar to the IL-1R complex (Arend et al., 2008;

Smith, 2011). The IL-18R is composed of a ligand-binding chain, IL-18Rα (also known as

IL-18R1 or IL-1R-related protein), and a signal-transducing chain, IL-18Rβ (also referred

to as IL-18R2 or IL-18R accessory protein). Once formed, this complex recruits different

intracellular molecules such as MyD88, IRAKs and TRAF6, leading to activation of NF-

κB and MAPK signalling pathways (JNK, ERK-1/2 and p38) (Thomassen et al., 1998)

(Fig. 2.2).

Like IL-1β, IL-18 is believed to play a major role in several CNS diseases including

neuropathic pain and SCI. IL-18 is involved in the induction of neuropathic pain that

develops after ligation of the L5 spinal nerve; a model in which microglia from the spinal

cord dorsal horn upregulate their production of IL-18, which in turn signals to astrocytes

through the IL-18R-NF-κB pathway (Miyoshi et al., 2008). In the contusion SCI model,

expression of the mature form of IL-18 is increased as early as 15-30 minutes post-injury

and continues to rise until at least day 3 (de Rivero Vaccari et al., 2008). Expression of the

mature form of IL-18 was further correlated with the assembly of a functional NALP1

inflammasome and caspase-1 activation in spinal cord neurons.

74

Figure 2.2 Cytokine signalling pathways relevant to spinal cord and peripheral nerve injury. Schematic representation of the main cytokines, receptors and signalling pathways regulating neuroinflammation and immune responses after spinal cord and peripheral nerve injury. IL-1R1 and IL-18Rαα are members of the IL-1R/TLR superfamily of receptors and thus share similar signalling pathways. Upon binding of their respective ligands, IL-1α/IL-1β (referred herein as IL-1) and IL-18, they rapidly recruit a second receptor subunit in the cell membrane; IL-1RAcP for IL-1R1 and IL-18Rββ for IL-18Rαα . Formation of the receptor heterodimers then leads to the recruitment of MyD88, IRAKs and TRAF6. The ensuing cellular responses are primarily mediated by NF-κκB- and MAPK-dependent gene expression. The effects of TNF and mTNF are mediated through binding with TNFR1 and TNFR2, respectively, which leads to the formation of complexes involving adaptor proteins of the TRADD, TRAF and FADD families. Depending on the composition of the receptor complexes formed and downstream signalling cascades, such as those mediated by NF-κκB and MAPK, TNF will induce a broad spectrum of effects, including regulation of inflammatory gene expression and cell death and survival. The binding of FasL to FasR induces the recruitment of cytosolic signalling proteins such as FADD and pro-caspase-8, resulting in activation of apoptotic caspase cascade. The three TGF-βs mediate their action through the TGF-βRI—TGF-βRII complex, leading to the phosphorylation of SMAD transcription factors. IL-6 binds to IL-6R, leading to the formation of a receptor complex with gp130. The phosphorylation of gp130 by JAK kinases activates the canonical STAT family of signalling proteins. The effects of IL-10 are mediated via two receptor chains, IL-10R1 and IL-10R2, through activation of the JAK-STAT signalling pathway. All cytokine signalling pathways discussed lead to the transcription of genes involved in immune responses, scarring, cell death and tissue repair. Please refer to the core text of the review for the definition of abbreviations.

75

2.4.2. TNF family members

2.4.2.1. Tumor necrosis factor (TNF) Similar to IL-1, TNF has both neuroprotective and neurodegenerative effects in a number

of CNS diseases and injuries (Sriram and O'Callaghan, 2007). TNF is synthesized as a 26-

kDa membrane-bound precursor (mTNF) and cleaved into a 17-kD mature form by the

TNF-alpha converting enzyme (TACE; also known as ADAM17), which is expressed in

the CNS (Karkkainen et al., 2000). Signalling pathways and biological effects of TNF are

mediated through high affinity transmembrane receptors, namely TNF receptor type 1

(TNFR1) and TNFR2. They are both part of the TNFR superfamily and, like IL-1R1, signal

through transcription factors such as NF-κB, JNK, ERK-1/2 and p38 MAPK, albeit through

a different set of adaptor molecules (Cabal-Hierro and Lazo, 2012). TNFR1 is expressed in

most CNS cell types and is the preferred target of soluble TNF, whereas TNFR2 is mainly

expressed in microglia and endothelial cells and preferentially activated by mTNF.

Following binding of TNF to TNFR1, which possesses a death domain (DD), two different

signalling complexes can be formed: 1) Complex 1 involving TNFR-associated death

domain (TRADD) and controlling expression of anti-apoptotic proteins that prevent cell

death, and 2) Complex II involving both TRADD and FAS-associated death domain

(FADD) and triggering cell death by way of apoptosis or programmed necrosis (also

referred to as necroptosis) (Micheau and Tschopp, 2003). As opposed to TNFR1, TNFR2

lacks a functional DD and binds mTNF with higher affinity than sTNF. Its functions are

mainly proinflammatory and anti-apoptotic, as it induces through TNFR-associated factors

(TRAFs) several proinflammatory mediators downstream of NF-κB and AP-1 activation

(Cabal-Hierro and Lazo, 2012; Santello and Volterra, 2012).

TNF is rapidly expressed (peak at 1 hour) by microglia, astrocytes, OLs and neurons after

SCI in both rats and mice (Pineau and Lacroix, 2007; Yan et al., 2001; Yune et al., 2003),

whereas TNFR1 and TNFR2 are mainly found in astrocytes, OLs and neurons (Yan et al.,

2003). Blockade of TNF during the acute phase of SCI in rats by means of systemic

administration of etanercept (Enbrel), a TNF inhibitor functioning as a decoy receptor that

binds to TNF, was shown to decrease neuronal and oligodendroglial apoptosis, reduce

76

tissue damage and demyelination, and improve recovery of locomotor function (Chen et al.,

2011). In support of the previous study, Genovese et al. have found that deletion of the

TNFR1 gene or TNF blockade using infliximab (Remicade; an antibody directed against

TNF) in SCI mice reduced inflammation, tissue damage and apoptosis, and improved

functional recovery (Genovese et al., 2008). On the contrary, work done using animal

models of stroke and epilepsy has revealed that TNF serves a neuroprotective function, as

microglial activation was suppressed, oxidative stress increased and neuronal damage

exacerbated in mice lacking both TNF receptors (Bruce et al., 1996). This result was

recently confirmed by Lambertsen et al. who showed that cortical infarction and behavioral

deficits are exacerbated in TNF-KO mice after cerebral ischemia (Lambertsen et al., 2009).

This research went further by demonstrating that microglial-derived TNF exerts its

neuroprotective properties through TNFR1. An interesting observation made by Bruce et

al., however, is that injury-induced astrogliosis is apparently unaltered in mice lacking both

TNFR1 and TNFR2. This suggests that TNF signalling is not critical for the astrocytic

response to ischemia and epilepsy. Whether this holds true after SCI remains to be seen,

especially when considering the discrepancies between the results obtained in the three

models discussed above. Along these lines, transgenic TNF overexpression in SCI rats

resulted in more activated astrocytes with longer processes and stronger GFAP staining in

the border of the lesion (Chi et al., 2008). Despite exhibiting more apoptotic cells during

the acute phase of SCI, tissue loss was reduced in TNF-transgenic rats compared to WT

controls. Together, these results suggest a dual role for TNF in the pathophysiology of CNS

injuries such as SCI. The protective or damaging outcome of TNF could depend on more

than one factor, such as for example the duration of NF-κB activation, which we know is

controlled by several regulatory proteins and may be affected by the redistribution of

receptors between lipid rafts and non-raft regions of the plasma membrane (Lotocki et al.,

2004). Hence, investigating these regulatory mechanisms will warrant the use time-specific

and cell lineage-specific knockdown systems.

77

2.4.2.2. Fas ligand (FasL) FasL is a transmembrane protein that closely resembles to other TNF family members. It

can directly act on adjacent cells or be released in a soluble form in the extracellular space

upon cleavage by MMPs. FasL signals through the Fas receptor (FasR, also known as

CD95), one of the most studied members of the TNFR superfamily bearing a DD, also

referred to as “death receptors” (reviewed in (Tibbetts et al., 2003)). The binding of FasL to

FasR induces the recruitment of cytosolic signalling proteins such as FADD and pro-

caspase-8, ultimately resulting in apoptosis (Siegel et al., 2000) (Fig. 2.2). Also of

relevance to this review is the fact that apoptosis triggered by FasL-FasR interactions plays

an important role in the regulation of various types of immune responses (Siegel et al.,

2000).

In the context of SCI, protein expression for FasR has been detected in OLs, astrocytes and

microglia, and expression correlated in time with markers of apoptosis (i.e. TUNEL,

cleaved caspase-8, cleaved caspase-3) (Casha et al., 2001). Accordingly, mice harbouring

deletion of FasR have reduced loss of OL, but not neurons, and significantly improved

axonal sparing, myelin preservation and locomotor recovery compared to WT after SCI

(Casha et al., 2005). FasR deficiency in SCI mice also caused a reduction in levels of

activated caspase-3 and -9, together with the upregulation of anti-apoptotoc proteins such

as BCL-2 and BCL-XL (Yu et al., 2009). Using cell-specific Cre-lox mice, Letellier et al.

have however found that the detrimental function of FasL after SCI is due to its propensity

to increase the migratory ability of neutrophils and macrophages at sites of injury, instead

of by directly inducing apoptosis of FasR-bearing CNS cells (Letellier et al., 2010). Indeed,

deletion of FasL in myeloid cells, but not of FasR in neural cells, led to improved

functional recovery after SCI. Despite these conflicting results on the cellular mechanisms

underlying the detrimental effects of FasL/FasR in SCI, it should be emphasized that

administration of soluble FasR (sFasR) in mice and rats, as a means to neutralize FasL, was

proven to be an effective strategy to improve biological outcome; that is, improvements in

cell survival, tissue sparing and integrity of descending axon tracts and functional recovery

(Ackery et al., 2006; Robins-Steele et al., 2012).

78

2.4.3. Interleukin-6 (IL-6) IL-6 is a proinflammatory cytokine that is rapidly upregulated at the mRNA level during

the acute phase of SCI (Bartholdi and Schwab, 1997; Pineau and Lacroix, 2007). We

recently demonstrated that microglia/macrophages, astrocytes and neurons are the principal

cellular source of IL-6 in the injured mouse spinal cord (Pineau and Lacroix, 2007). IL-6

exerts its biological functions by first binding to the IL-6 receptor (IL-6R). The IL-6/IL-6R

complex then recruits glycoprotein 130 (gp130), allowing it to homodimerize and

autophosphorylate. This, in turn, activates signal transduction through the JAK-STAT

pathway (Murakami et al., 1993) (Fig. 2.2).

Several studies have highlighted the importance of IL-6 in the initiation of inflammation

and recruitment of innate immune cells after CNS injury. In particular, IL-6 can modulate

the recruitment of neutrophils and macrophages by regulating chemokine expression

(Romano et al., 1997). Using a gene therapy approach, we delivered a “hyper-IL-6” fusion

molecule (consisting of IL-6 and the soluble IL-6R) at site of SCI. Hyper-IL-6 is known to

be 100-1000 times more active than the separate molecules. We observed that the number

of infiltrating neutrophils increased by six-fold (Lacroix et al., 2002). This was associated

with a two-fold increase in lesion volume and a reduction in axonal regrowth inside grafts

containing fibroblasts engineered to produce hyper-IL-6. IL-6 is also involved in the

activation of astrocytes and microglia in the injured CNS (Penkowa et al., 1999). This was

confirmed by Okada et al. who showed that treatment with an anti-IL-6R neutralizing

antibody suppressed the development of the astroglial scar, reduced the infiltration of Mac-

1 (CD11b/CD18)-positive myeloid cells and improved functional recovery (Okada et al.,

2004). Another group found that treatment with the same function blocking antibody,

MR16-1, shifted immune responsiveness towards an anti-inflammatory state, characterized

by increased production of anti-inflammatory cytokines and the presence of more than

normal numbers of M2 macrophages (Guerrero et al., 2012). Importantly, myelin was

significantly more preserved and recovery of locomotor function enhanced in mice treated

with the anti-IL-6R antibody. Besides its effects on immune and glial cells, IL-6 is known

to enhance the intrinsic growth capacity of sensory DRG neurons after lesion of their

79

peripheral branch axons (Cafferty et al., 2004; Cao et al., 2006), as well as to affect

neurotransmitter release and neural activity (Spooren et al., 2011).

2.4.4. TGF-β family members The TGF-β superfamily of ligands includes TGF-βs (TGF-β1, TGF-β2 and TGF-β3),

activins, bone morphogenetic proteins (BMPs) and growth and differentiation factors

(GDFs) (Schmierer and Hill, 2007). They regulate a broad range of biological responses

such as cell growth and differentiation, extracellular matrix molecule (ECM) production

and cell survival. Because TGF-βs play an important role in the immune system (Li and

Flavell, 2008), and because they have been the target of intensive research and clinical

trials for a number of diseases in recent years (Akhurst, 2006; Akhurst and Hata, 2012),

they will be the main focus here.

All three TGF-βs modulate their actions through a serine/threonine kinase receptor

complex composed of the type 1 (TGF-βRI) and type 2 (TGF-βRII) receptors. The TGF-β

molecule must first bind to TGF-βRII, which then recruits TGF-βRI to the complex and

activates it by phosphorylation (Heldin et al., 1997). This, in return, results the

phosphorylation of SMAD proteins by TGF-βRI and the propagation of the signal

(Massague, 2000).

TGF-β molecules are known to regulate the expression of genes coding for cell-cycle

regulators, differentiation factors, CAMs, and inflammatory mediators (Massague, 2000).

Accordingly, they exert profound biological functions during development and

neuropathology (Massague, 2000; Wyss-Coray and Mucke, 2002). Following traumatic

SCI in rodents and humans, TGF-β1 and TGF-β2 are upregulated, but with different

patterns of expression. While TGF-β1 was found to be associated with neurons and

immune cells (Buss et al., 2008; Lagord et al., 2002; McTigue et al., 2000), TGF-β2 was

mainly detected in reactive astrocytes forming the glial scar and small round CD68-positive

cells that appeared to be infiltrating immune cells (Buss et al., 2008; Lagord et al., 2002).

At first glance, these results suggest that TGF-β1 modulates neuronal and immune

80

responses, whereas TGF-β2 regulates glial scarring and the production of ECMs such as

collagen, fibronectin and CSPG. However, a number of studies indicate that it may be more

complicated than that. First, the administration of TGF-β1 i.c.v. in rats has been reported to

induce a glial scar (Laping et al., 1994; Logan et al., 1994; Morgan et al., 1995). Second,

the neutralization of endogenous TGF-β1 by means of an i.c.v injection of anti-TGF-β1

antibody attenuated the formation of fibrous scar tissue, as verified using immunostaining

for GFAP, fibronectin and laminin (Logan et al., 1994). Third, chronic inhibition of TGF-

ß1 suppressed glial scar formation and upregulated markers of microglia/macrophage

activation (Iba1, ED1) in the injured rat spinal cord, a finding that was correlated with

improved locomotor recovery (Kohta et al., 2009). Fourth, treatment of cerebral wounds

with an antibody specific to the active form of TGF-β2 also led to an attenuation of CNS

scarring and inflammation (Logan et al., 1999). These results therefore suggest that

substantial functional redundancy must be expected from members of the TGF-β family

after CNS injury. Another explanation for the different outcomes in these studies may be

the dosage, timing, duration and route of administration of the cytokine or antagonist

treatment. Whatever the explanation, these data raise the possibility that anti-TGF-β

therapies could be used as an effective anti-fibrotic therapy, thus limiting tissue scarring in

CNS pathologies where astrocyte activation becomes excessive. This is exactly what the

group of Frank Bradke has recently shown by giving the drug Taxol to SCI rats to dampen

TGF-ß1/SMAD signalling (Hellal et al., 2011). They reported that rats treated with Taxol

had reduced scarring, increased regeneration and/or sprouting of 5-HT fibers, and improved

functional recovery. Notably, Taxol was shown to reduce production of inhibitory

molecules in both astrocytes and meningeal cells at the protein level.

2.4.5. IL-10 family members IL-10 family members include IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26, IL-28A, IL-28B,

and IL-29 (Ouyang et al., 2011; Sabat, 2010). Because most, if not all, of the published

work on the subject of the IL-10 family of cytokines in SCI relates to IL-10, only the latter

cytokine will be covered in this review.

81

2.4.5.1. Interleukin-10 (IL-10) IL-10 was identified by Mosmann and colleagues in 1989 and first given the name of

cytokine synthesis inhibitory factor (CSIF) (Fiorentino et al., 1989). As its name implies,

one of its main function is the negative regulation of proinflammatory cytokine production

(e.g. IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-3, TNF, GM-CSF) in various cell types such as leukocytes and

microglia (Balasingam and Yong, 1996; Basu et al., 2002a; Fiorentino et al., 1989; Fuchs et

al., 1996; Kremlev and Palmer, 2005; Takeda et al., 1999), making it one of the most potent

anti-inflammatory cytokines. The biological effects of IL-10 are mediated via two receptor

chains, IL-10R1 and IL-10R2, and by activating the JAK-STAT signalling pathway (Moore

et al., 2001) (Fig. 2.2). STAT3 is the key transcription factor implicated in IL-10-mediated

responses (Moore et al., 2001; Ouyang et al., 2011).

Although IL-10 may play distinct roles in injured tissue, its primary purpose is to suppress

inflammatory cytokine production. This may help limit tissue damage that inflammation

could inflict to bystander cells. Of particular relevance here, IL-10 was found to induce

expression of anti-apoptotic proteins BCL-2 and BCL-XL and support survival of spinal

cord neurons both in vitro and in vivo (Zhou et al., 2009a, b). Notably, the study in which

IL-10 was delivered close to sites of SCI using a gene therapy approach showed that the

increased neuronal survival was accompanied by slight improvements in locomotion over 4

weeks (Zhou et al., 2009a). From a more therapeutic perspective, work from John Bethea’s

laboratory has revealed that a single i.p. injection of IL-10 at 30 min post-SCI in rats was

sufficient to improve recovery of hindlimb function (Bethea et al., 1999). It should be

pointed out, however, that SCI rats that received two doses of the recombinant cytokines at

30 min and 3 days did not perform better than controls on the BBB locomotor test, thus

suggesting once again the importance of timing when inflammation is concerned. Systemic

injection of IL-10 also had neuroprotective effects in rat models of traumatic brain injury

and spinal cord excitotoxicity (intraspinal injection of quisqualic acid) (Brewer et al., 1999;

Knoblach and Faden, 1998; Plunkett et al., 2001). Deletion of the IL-10 gene in SCI mice

increased levels of TNF, IL-1β, iNOS and myeloperoxidase (MPO) in the injured spinal

cord (Genovese et al., 2009). This was correlated with an augmented number of apoptotic

cells and worsening of hindlimb function at 30 days post-SCI. IL-10 may also be important

82

for the beneficial effects of a certain subset of Ly-6C+ CX3CR1+ CCR2+ CD11c+ monocytes

infiltrating the margins of spinal cord lesions and having anti-inflammatory and

neuroprotective properties (Shechter et al., 2009). In particular, Shechter et al. showed that

adoptive transfer of monocytes lacking IL-10 into SCI mice depleted in CD11c-expressing

monocytes failed to reduce the lesion size and improve functional recovery to the extent of

WT monocytes. In a subsequent publication, the same group reported that these infiltrating

IL-10-producing monocyte-derived macrophages accumulate at the lesion border and

apparently degrade inhibitory CSPGs associated with glial scar formation by producing

MMP-13 (Shechter et al., 2011). However, further studies will be needed to clarify the

phenotype of these immune cells and their functions, as well as the role of IL-10 in their

overall impact on the SCI milieu. Whether these monocyte-derived macrophages behave

the same way and can reproduce their beneficial effects in normal pathophysiological

conditions, i.e. without irradiation or prior immune cell depletion, will also need to be

addressed.

83

Table 2.1 Cytokine effects on glia, endothelial cells, leukocytes and neurons in the pathogenesis of spinal cord injury

84

2.5. Cytokine effects on glia, endothelial cells and leukocytes and contribution of these

cells to tissue damage, glial scarring and regeneration

The release of contents of necrotic cells and exposure of DAMPs, also referred to as danger

signals, triggers the rapid response of glia, among which microglia appear to react the

fastest (Fig. 2.1). This allows the activation of a cascade of inflammatory responses, mainly

regulated by cytokines, which cause the activation of the neurovascular unit (NVU) and

influx of innate immune cells at sites of neural injury. The inflammatory response is not

only limited to the recruitment of circulating leukocytes and their activation, but also

includes collateral responses from most if not all other cells present in the injury

environment (Table 2.1). Here, we will focus our discussion on the three main types of glia

(i.e. microglia, astrocytes and OLs), ECs of the NVU, and phagocytic innate immune cells

(i.e. neutrophils and monocytes/macrophages). Special attention will be given to the in vivo

role of these cells and their subsets in secondary tissue damage, glial scarring and

regeneration in the context of neural injury.

2.5.1. Glial cells

Recent advancements in two-photon intravital microscopy (2P-IVM) enable scientists the

opportunity to study dynamic physiological events within living tissues with minimal

impact on cells. Researchers have thus been able to show that microglia are highly

dynamic, constantly monitoring the nervous system in search of molecular evidence of

homeostatic disturbance (Davalos et al., 2005; Nimmerjahn et al., 2005). In general,

microglia residing in the normal adult mouse spinal cord seem to behave like those in the

brain (Soulet et al., 2013), though there is no doubt that the plasticity of these cells is

affected by their molecular environment (which we know varies greatly depending on

regions and conditions). Following tissue injury or disease-induced damage, spinal cord

microglia undergo rapid changes in cell shape, movements and migration ability (Davalos

et al., 2012; Dibaj et al., 2010; Dibaj et al., 2011; Farrar et al., 2012; Fenrich et al., 2012;

Nikic et al., 2011)(Fig. 2.1). It remains to be investigated whether cytokines are involved in

these early changes, but many of the implicated molecules, such as purinergic pathways

85

and NO (Dibaj et al., 2010), exert their effects through them (Pineau and Lacroix, 2009).

The case of IL-1ß is perhaps the best example of this, as cellular nucleotides released

almost immediately after SCI and acting through P2X4 purinoreceptors mediate the release

of mature IL-1ß by CNS resident cells within minutes of the injury, resulting in the

infiltration of innate immune cells from the blood (de Rivero Vaccari et al., 2012). It is also

important to note that the P2X-dependent release of mature IL-1ß could promote cell

motility indirectly by regulating the expression and release of other cytokines and

chemokines (for review, see (Inoue, 2006; Pineau and Lacroix, 2009)). As their name

implies, cytokines regulate cell movements, most often by the intermediary of chemokines,

and are produced by activated microglia in response to SCI (Pineau and Lacroix, 2007).

Cytokines have also been implicated in loss of neuronal and glial cells in both acute and

chronic neurodegenerative disorders (Allan and Rothwell, 2001; Allan et al., 2005), as well

as in regeneration of axons in the injured peripheral nerve (Nadeau et al., 2011).

Fate mapping studies in mice have recently revealed that microglia arise from

erythromyeloid precursors detected in the yolk sac during the embryonic stage of prenatal

development (around day 8.5 to 9.5) rather than from postnatal hematopoietic stem cells

(Ginhoux et al., 2010; Kierdorf et al., 2013; Schulz et al., 2012). Microglia are thus

ontogenetically distinct from monocyte-derived macrophages. Discriminating infiltrating

monocyte-derived macrophages from activated resident microglia in vivo has nevertheless

been an arduous task, due to the fact that both cell types express common antigenic markers

(David and Kroner, 2011; Gordon and Taylor, 2005). Microarray studies have however

revealed that microglia, macrophages and monocytes express identical molecules but at

different levels of expression (Bedard et al., 2007). One of these molecules is the

fractalkine (CX3CL1) receptor, CX3CR1. In both mice and humans, CX3CR1 is highly

expressed on microglia and a subset of patrolling monocytes referred to as M2, which will

be discussed in a subsequent subsection of this review, but weakly expressed in M1

monocytes/macrophages (Geissmann et al., 2003; Harrison et al., 1998; Mildner et al.,

2007). The creation of mice expressing the fluorescent reporter enhanced GFP under the

control of the endogenous Cx3cr1 locus, CX3CR1-eGFP knock-in mice (Jung et al., 2000),

has therefore been a valuable tool for studying microglia function in the healthy and

86

diseased CNS, with one important limitation being that some monocytes and macrophages

are also affected by the mutation. Keeping this limitation in mind, the Popovich laboratory

has reported that deficiency in CX3CR1 promotes functional recovery after SCI (Donnelly

et al., 2011). Lack of CX3CR1 signalling was shown to attenuate the capacity of microglia

and monocyte-derived macrophages to produce proinflammatory cytokines and oxidative

metabolites. This not only supports the idea that proinflammatory cytokines and oxidative

metabolites are toxic to neural cells in the context of injury, but also implies that activation

of CX3CR1 signalling in microglia and macrophages stimulates a proinflammatory

response. Together with earlier work showing that grafting microglial cells into the injured

spinal cord enhances neurite outgrowth (Rabchevsky and Streit, 1997), these data indicate

that microglia might have protective as well as harmful effects after in SCI. It is only

through the development of new approaches and technologies that we will understand all

the intricacies of microglia and grasp the role they play in the normal and injured CNS.

The rapid release of a battery of inflammatory mediators by microglia after injury suggests

that these cells could also influence the functions of other glial cells in their immediate

environment, such as astrocytes and OLs. Astrocytes play a central role in brain and spinal

cord homeostasis, in particular via their neurotransmitter recycling functions and ability to

“seal” the CNS. The latter function of astrocytes, being expressed in the form of the glia

limitans perivascularis, or in the form of the glial scar at its most extreme level of activation

such as in response to tissue damage, prevents the introduction of pathogens into the CNS

and controls attacks by immune cells (Sofroniew, 2009). Astrocytes contribute to

inflammation by rapidly producing IL-1ß, TNF, and IL-6 (Minkiewicz et al., 2013; Pineau

and Lacroix, 2007; Pineau et al., 2010). They also express receptors for many cytokines,

including those recognizing cytokines of the IL-1, TNF, IL-6-like, TGF-ß and IL-10

families (John et al., 2003), giving rise to an autocrine and/or paracrine loop of astroglial

activation. They must thus be considered among the first responders to injury, and NF-κB

and STAT3 seem to be central signalling hubs in this process. In this regard, it is

noteworthy that selective inhibition of astroglial NF-κB in transgenic mice reduces

inflammation and lesion volume and improves locomotor recovery after spinal cord

contusion (Brambilla et al., 2005). However, not all forms of astrocyte responses have a

87

detrimental impact on tissue sparing in the context of injury. STAT3 signalling, for

example, is a critical regulator of astrogliosis and scar formation limiting the spread of

potentially aggressive immune cells (Herrmann et al., 2008; Okada et al., 2006).

Conditional deletion of STAT3 from astrocytes resulted in increased lesion size and

exacerbated demyelination, which correlated with a reduced motor recovery after SCI.

STAT3 is a signal transducer of various cytokines including those of the IL-6-like and IL-

10 families. This suggests that interventions designed to inhibit a specific cytokine or

signalling pathway in astrocytes are most likely to provide effective long-term protection

than blocking all astrocytic functions.

Like microglia and astrocytes, OLs are another important target of cytokines. As reviewed

by McTigue and Tripathi, OLs and OPCs are particularly vulnerable to inflammatory

conditions that can arise from a traumatic injury to the CNS (McTigue and Tripathi, 2008).

Indeed, a 50 percent loss of the OL population has been reported as early as day 1 post-SCI

(Grossman et al., 2001). This could have important consequences on the early loss of motor

function after SCI, as OLs are required for the maintenance of normal axon transport and

an important source of growth factors and neurotrophic cytokines (Nave, 2010).

While OLs in the injured CNS respond to the loss of axonal contact and inflammation by

undergoing apoptosis (Vargas and Barres, 2007), Schwann cells (SCs) in the injured PNS

respond by entering cell cycle (Murinson et al., 2005). Furthermore, and in contrast to the

well-established role of Schwann cells (SC) in breakdown of the myelin sheets and

phagocytosis of its debris in the injured peripheral nerve (Fernandez-Valle et al., 1995;

Hirata and Kawabuchi, 2002; Reichert et al., 1994; Stoll et al., 1989), OLs have little or no

capacity to clear myelin debris after CNS injury. This may contribute to explain why WD is

extremely slow in the injured CNS compared to the PNS in both rodents and humans

(George and Griffin, 1994; Miklossy and Van der Loos, 1991).

2.5.2. Endothelial cells of the neurovascular unit The NVU of the CNS is a complex and dynamic structure composed of ECs, pericytes

embedded in the endothelial basement membrane, perivascular macrophages, and the glia

88

limitans perivascularis, consisting of the parenchymal basement membrane and a

juxtaposed layer of astrocytic processes (“end-feet”). This structure bears the name of

blood-brain barrier (BBB) or blood-spinal cord barrier (BSCB), depending on whether it is

located in the brain or spinal cord. An (almost) equivalent of the BBB/BSCB exists in the

PNS, and is called blood-nerve barrier (BNB). Like the BBB and BSCB, the BNB regulates

the access of soluble mediators and leukocytes circulating in the blood to neural tissue

parenchyma. Unlike its counterparts in the CNS, the BNB is believed to be more permeable

because of the absence of glia limitans perivascularis, but this remains to be demonstrated

experimentally. Since excellent reviews have described in detail the basic structure and

functions of these three barriers (Bartanusz et al., 2011; Kanda, 2013; Muldoon et al., 2013;

Zlokovic, 2008), we will focus here mainly on ECs forming the nonfenestrated

endothelium and their response to neural injury.

Damage to the NVU and breakdown of the BSCB are common consequences of SCI

(Balentine, 1978; Noble and Wrathall, 1988, 1989a, b; Popovich et al., 1996). Of particular

interest are studies that have linked vascular permeability with the evolution of secondary

damage (reviewed by (Tator and Fehlings, 1991), and revisited more recently by

Fassbender et al. (Fassbender et al., 2011)). Permeability of the BSCB has been reported as

early as 5 minutes following spinal cord contusion in rodents and primates (Dohrmann et

al., 1971; Maikos and Shreiber, 2007). This enhanced permeability is clearly too early to be

caused by the transmigration of blood-derived leukocytes, and is thus a direct consequence

of physical disruption of the spinal cord vasculature due to mechanical injury (Maikos and

Shreiber, 2007). However, mounting evidence suggests that activated resident and recruited

immune cells may inflict further damage to the endothelium in the injured peripheral nerve

and spinal cord (Gray et al., 2007; Lee et al., 2011). Although it may be expected that a

certain number of leukocytes will passively enter injured tissue due to disruption of the

microvasculature, active processes regulate the transmigration of immune cells. Leukocyte

entry is a tightly coordinated process requiring cytokines and bind to different subsets of

CAMs that are increased de novo in inflamed tissues (Ley et al., 2007). Interfering with the

mechanisms by which inflammatory mediators contribute to blood vessel dysfunction may

therefore offer a unique opportunity to interfere with secondary events leading to enhanced

89

neurological deficits. This was demonstrated by data showing that pharmacological or

genetic inhibition of MMP activity after SCI prevented BSCB disruption and improved

locomotor fuction (Lee et al., 2012a; Lee et al., 2012b; Noble et al., 2002). Lee et al. also

found that the administration of fluoxetine to SCI mice prevented the expression of

proinflmamatory cytokines (IL-1ß, TNF, IL-6), reduced infiltration of myeloid cells,

attenuated loss of tight junction molecules, and inhibited apototic cell death (Lee et al.,

2012b). It should be emphasized that cytokines such as IL-1 and TNF can directly disrupt

endothelial cell-cell interactions and trigger degradation of barrier function (Royall et al.,

1989; Zhu et al., 2012). An interesting observation in the case of IL-1ß is that its disruptive

effect on endothelial barrier function is mediated through the IL-1R1-MyD88-ARNO-

ARF6 cascade, a pathway independent of NF-κB (Zhu et al., 2012). A better understanding

of the signaling pathways involved in the different functions of cytokines could therefore

help target pathway-specific responses downstream of these receptors. An example would

be the inhibition of vascular leak without interfering with immune-cell adhesion or other

critical NF-κB-dependent responses.

Vessel regression and neovascularization are common features of spinal cord and

peripheral nerve injury (Barrette et al., 2008; Benton et al., 2008; Blight, 1994; Dray et al.,

2009). Such vascular remodelling processes are believed to be involved in the pathogenesis

and recovery of traumatic neural injury. In support of the former are studies suggesting that

OLs and neurons could be particularly sensitive to a constant blood supply due to their

high-energy demand (Attwell et al., 2010). Accordingly, disruption of the endothelium has

been regarded as one of the main causes of secondary damage after SCI (Fassbender et al.,

2011; Mautes et al., 2000; Tator and Fehlings, 1991), although this idea has been

challenged by Casella et al. who reported that neuronal death occurred before EC loss (and

to a greater extent) in the vicinity of a contusion injury (Casella et al., 2006). Despite this

correlative (not causal) evidence, several studies have shown that protecting the vasculature

led to improvements in tissue sparing and functional recovery after SCI (reviewed in

(Fassbender et al., 2011)). One unknown is whether blood vessel regression and

permeability may be necessary steps for neovascularization. This is important considering

90

that neovessels might influence axonal regeneration in the injured PNS and CNS (Barrette

et al., 2008; Dray et al., 2009).

2.5.3. Innate immune cells

Neutrophils and “classically activated” proinflammatory (M1) macrophages (Ly6Chi 7/4+)

are the first innate immune cells to respond, being already abundantly present in spinal cord

parenchymal tissue at 12 h post-SCI (Pineau et al., 2010; Stirling and Yong, 2008). Their

presence at sites of SCI is transient, peaking at 1-2 days before falling to lower levels at 4

days (Stirling and Yong, 2008; Thawer et al., 2013). Importantly, the time course of

recruitment of these two cell populations at sites of peripheral (sciatic) nerve injury is

identical to the one reported in the injured spinal cord in mice (Nadeau et al., 2011). The

presence of these immune cell types during the chronic phase of injury may however differ

between the CNS and PNS, as will be discussed in the last section of this review.

Neutrophils and macrophages are well recognized for their capacity to sterilize lesions by

killing pathogens and their ability to clear cellular debris. Although they have long been

considered as homogeneous cell populations, it is now well established that they show

remarkable heterogeneity in terms of the molecules they express and functional properties.

Monocyte and macrophage heterogeneity has been described first in humans and then more

recently in mice, and implicated in pathologies such as cancer, diabetes, arthritis, obesity,

atherosclerosis, infection, and neural injury (David and Kroner, 2011; Flavell et al., 2010;

Shi and Pamer, 2011; Sica and Mantovani, 2012; Woollard and Geissmann, 2010). M1 and

“alternatively activated” anti-inflammatory (M2) macrophages are commonly identified

based on expression of cell surface markers, such as CD14 and CD16 in humans and Ly6C,

CX3CR1 and CCR2 in mice (Geissmann et al., 2003; Gordon and Taylor, 2005). Monocyte-

derived M1 macrophages are rapidly recruited to injured tissues via CCL2 and primarily

involved in inflammation, proteolysis, and phagocytosis (Nahrendorf et al., 2007). M2

macrophages respond to a different chemokine, CX3CL1, and are implicated in both

immune surveillance and the healing process (Nahrendorf et al., 2007). In the mouse spinal

cord, like in the peripheral nerve, M1 and M2 are successively recruited at sites of injury

91

(Kigerl et al., 2009; Nadeau et al., 2011; Thawer et al., 2013). In line with their reported

effects in injured peripheral tissues, M1 macrophages present in the injured spinal cord

produce proinflammatory mediators and are neurotoxic when co-cultured with primary

neurons, whereas M2 macrophages have axon growth-promoting effects (Kigerl et al.,

2009). An in vivo demonstration that M1 macrophages can kill neurons and contribute to

secondary damage after SCI is however lacking, mainly because there is still no way to

deplete these cells specifically. Likewise for the in vivo role of M2 macrophages, but the

recent demonstration that mice lacking Nr4a (Nur77) developed fewer M2 monocytes and

macrophages may enable such work to be performed in the future (Hanna et al., 2011;

Hanna et al., 2012). Another way to investigate the role of the latter cell subset could be

using the cell depletion method recently developed by Miron et al. (Miron et al., 2013). The

method is based on the concept that phagocytosis of clodronate-containing liposomes will

induce apoptosis and relies on the accuracy of mannosylated clodronate liposomes that

specifically bind the mannose receptor, also called CD206, a receptor whose expression is

strongly upregulated after M2 polarization (Gordon, 2003; Martinez et al., 2006). Using

this depletion strategy, Miron et al. unveiled that M2 macrophages/microglia are important

for OL differentiation and remyelination (Miron et al., 2013). In the meantime, the closest a

study has come to a direct assessment of the role of M1 macrophages in SCI is by depleting

these cells in vivo by injection of liposome-encapsulated clodronate (Lee et al., 2011;

Popovich et al., 1999). The study by Lee et al. demonstrated that preventing the recruitment

of both neutrophils and monocytes, but not neutrophils or monocytes alone, is beneficial for

functional recovery following SCI in mice (Lee et al., 2011). In contrast, in the study by

Popovich et al., macrophage depletion alone was found sufficient to reduce spinal cord

tissue damage and promote partial recovery of hindlimb function in SCI rats (Popovich et

al., 1999). Thus, species differences might exist and could explain the need for dual

depletion in mice. Combined with our earlier results showing that neutrophils and

monocyte-derived M1 macrophages are recruited in the injured mouse spinal cord and

peripheral nerve via a common signalling pathway (i.e. IL-1R1) (Nadeau et al., 2011;

Pineau et al., 2010), these findings suggest a great level of redundant functions between

these two populations of innate immune cells at least in mice.

92

Aside from their role in inflammation, recent SCI studies have attributed to Gr1+

(Ly6G/Ly6C+) neutrophils and macrophages an important function in a variety of

biological processes ranging from angiogenesis to wound healing and scar formation

(Shechter et al., 2009; Shechter et al., 2011; Stirling et al., 2009). It thus appears that the

role of innate immune cells is more complex than previously thought and may also

contribute to recovery. One finding shared by all these studies is the demonstration that the

specialized functions of neutrophils and macrophages are dictated by cytokines present in

the SCI environment. In return, the cytokines produced by activated immune cells can

regulate a variety of subsequent cell responses, including inflammation and immunity,

BBB/BSCB maintenance and integrity, glial scar formation, demyelination and

remyelination, and even neural cell death (see Table 2.1). We believe that this concept of

heterogeneity in phenotype and function in the injured nervous system does not only apply

to monocytes/macrophages, but also to neutrophils which are far more plastic than

previously thought (for review, (Beyrau et al., 2012)). Recent work emerging from the

cancer field has shown that neutrophils can be polarized towards a proinflammatory (N1) or

anti-inflammatory (N2) phenotype, depending on the expression of TGF-ß1 (Fridlender et

al., 2009). The existence of different neutrophil subsets had previously been reported in

various infection models (Tsuda et al., 2004), and has since been confirmed in several

different systemic inflammatory diseases (Denny et al., 2010; Pillay et al., 2012; Pillay et

al., 2010). Whether N1 and N2 neutrophils can be found in the injured spinal cord and

peripheral nerve remains an open question. The future identification of specific markers for

the distinct populations of neutrophils will help answer these questions, and help study their

role in secondary damage, scarring, regeneration and repair.

2.6. Differences between the injured spinal cord and peripheral nerve It is interesting to note that, although the cells that reside in the normal spinal cord are to a

large extent different from those of peripheral nerves, the temporal pattern of cytokine

production and innate immune cell infiltration in these two systems is remarkably similar,

at least during the first week of injury (Boivin et al., 2007; de Rivero Vaccari et al., 2012;

Donnelly et al., 2011; Nadeau et al., 2011; Pineau and Lacroix, 2007; Stirling and Yong,

93

2008; Thawer et al., 2013). Assuming that excessive inflammation is one of the leading

causes of secondary damage after neural injury, it may come as a surprise that inhibition of

key proinflammatory cytokine pathways or depletion of innate immune CD11b+ cells has

been repeatedly demonstrated to reduce repair and recovery after peripheral nerve injury

(Barrette et al., 2008; Boivin et al., 2007; Nadeau et al., 2011). We are therefore led to ask

why an apparently similar inflammatory response would be detrimental in the injured

spinal cord, but beneficial in the injured peripheral nerve.

Following injury, severed proximal segments of axons that remain connected to their cell

bodies retract over hundreds of micrometers (~300 µm on average) in a process referred to

as “axonal dieback” or acute axonal degeneration (AAD) (Kerschensteiner et al., 2005).

Axonal dieback is commonly observed in both the injured CNS and PNS and mediated by

two distinct mechanisms. The initial phase of dieback occurs within 30 minutes of the

axonal injury (Kerschensteiner et al., 2005; Knoferle et al., 2010), a rapid time-course that

precedes the infiltration of circulating neutrophils and proinflammatory M1 monocytes and

which thus suggests it is regulated by intrinsic neuronal mechanisms. This was confirmed

by the demonstration that blocking calcium (Ca2+) release from intra-axonal Ca2+ stores or

inhibiting calcium-dependant proteases such as calpain prevents AAD in the injured spinal

cord and optic nerve (Kerschensteiner et al., 2005; Knoferle et al., 2010; Stirling et al.,

2014). The initial phase of AAD is followed by a delayed slow phase of axonal dieback

mediated by macrophages infiltrating sites of injury and occurring between days 2-4 and 28

post-lesion (Busch et al., 2009; Horn et al., 2008), thus supporting once again the concept

that macrophages are playing an active role in various forms of secondary damage.

Whether microglia contribute to SCI-induced axonal dieback is currently being debated,

with recent IVM studies in favour and against this idea (Evans et al., 2014; Stirling et al.,

2013). Stimulation of microglia with the TLR2-specific agonist Pam2CSK4, but not

zymosan, induced a protective mixed M1/M2 phenotype in microglia, which was

associated with a reduction in secondary bystander damage to axons that were originally

spared by the initial laser-induced SCI (Stirling et al., 2013). Accordingly, TLR2-KO mice

exhibited greater axonal dieback than control mice after laser-induced SCI and mildly

reduced functional recovery after contusion SCI (Kigerl et al., 2007; Stirling et al., 2013).

94

This is in contrast to the situation occurring in the injured peripheral nerve where

deficiency in TLR2 signalling was found to delay myelin debris clearance, axonal

regeneration and recovery of locomotor function (Boivin et al., 2007). The differences in

cell types present in each of these tissues could explain these different outcomes, taking

into account that microglia and Schwann cells, for example, express high levels of TLRs

such TLR2 (Babcock et al., 2006; Karanth et al., 2006; Lee et al., 2006).

Neutrophils and M1 macrophages are considered to be toxic for neurons (Allen et al., 2012;

Geremia et al., 2012; Kigerl et al., 2009; Lee et al., 2011). We find it particularly

interesting that the initial phase of axon retraction precedes the infiltration of neutrophils

and monocyte-derived M1 macrophages (CD45+ CD11b+ 7/4+ Ly-6Chi Ly-6G- cells), a

process that begins at around 6-12 hours post-injury (Nadeau et al., 2011; Pineau et al.,

2010; Stirling and Yong, 2008). It is also intriguing that these two cell types have almost

completely disappeared from the injured spinal cord and peripheral nerve at 3-4 days

(Nadeau et al., 2011; Pineau et al., 2010; Stirling and Yong, 2008). Three to 4 days post-

injury is the time at which macrophages found at sites of neurodegeneration start to express

genes and markers associated with pro-regenerative, anti-inflammatory M2-phenotype such

as arginase-1 and CD206 (Kigerl et al., 2009; Nadeau et al., 2011). It is also the time at

which peripheral nerve axons begin their attempt to regenerate across the injury site (Fu

and Gordon, 1997). However, for an unexplained reason, the expression of M2 genes and

protein markers is only transient after SCI and rapidly returns to preinjury levels by 7 days.

In contrast, the expression of M1-related genes (e.g., CD16, CD32, CD86) is maintained, as

such that after 28 days only M1 macrophages persist at sites of SCI (Kigerl et al., 2009). It

has been proposed that the predominance of M1 macrophages and almost complete absence

of M2 macrophages at sites of SCI could cause chronic inflammation, thus leading to

secondary damage. This scenario is in contrast to what is thought to occur in the injured

PNS, where it has been assumed that the expression of proinflammatory markers is rapidly

decreased and stay decreased chronically. However, a formal demonstration of this is still

lacking. This supposition, if true, could be explained by the increased expression of

immunosuppressive cytokines such as TGF-ß1 and IL-10, which were both found to be

upregulated in the peripheral nerve but not in the spinal cord after injury (Be'eri et al.,

95

1998; Perrin et al., 2005). Other than cytokines, and as suggested by observations made in

vitro and in vivo in the multiple sclerosis brain, the phagocytosis of myelin debris could be

the factor conferring anti-inflammatory function (Boven et al., 2006). This would mean that

the persistent expression of anti-inflammatory cytokines in the injured PNS is a direct

consequence of the latter response, not the cause. This brings another question to mind:

whether the long-lasting presence of M2 macrophages throughout the peripheral nerve

distal stump is the main reason why regeneration is more efficient in the PNS than CNS?

The inhibitory influences of myelin debris persist for prolonged periods in the CNS and

prevent axon regeneration. As explained above, this difference in the time required for

myelin clearance in the CNS compared to the PNS may be due to differences in the

immune response. The Rotshenker laboratory has established a strong correlation between

the magnitude and timing of cytokine production and the initiation and progression of WD,

and found that mice with abnormally slow WD express reduced levels of IL-1ß and TNF

(Be'eri et al., 1998; Shamash et al., 2002). Together with a previous study that showed that

microglia/macrophage activation is compromised in mice carrying a mutation that causes

delayed WD (Fujiki et al., 1996), these findings highlight the crucial role that cytokines

may play in immune cell activation/recruitment, WD, and myelin clearance. This idea is

further supported by our data showing that recruitment of innate immune cells and

functional recovery after sciatic nerve lesion are impaired in the absence of IL-1ß and TNF

(Nadeau et al., 2011). The entry of blood-derived immune cells into restricted areas of the

injured spinal cord, mostly limited to the core of the lesion, further suggests the possibility

that production and/or release of proinflammatory cytokine expression may be defective in

degenerating white matter tracts after SCI. Interestingly, injecting recombinant IL-1ß or

CCL2 and MIP-1α into the injured mouse dorsal column triggered macrophage/microglial

activation and myelin clearance. Neutralizing the same three cytokines/chemokines in the

lesioned sciatic nerve via the administration of function-blocking antibodies suppressed the

clearance of inhibitory myelin debris (Perrin et al., 2005). Taken together, these studies

suggest that changes in the immune responses, which are dictated by the nature of the

cytokines produced in the inflamed tissue, may explain the different responses to injury

between the CNS and PNS.

96

2.7. Conclusion In the recent years, we have learned a great deal about the complexity and heterogeneity of

the immune cell response. We now know that immune cells are remarkably plastic and can

be polarized towards different functional phenotypes depending on the cytokines and other

signals (e.g. DAMPs, PAMPs) present in their immediate environment. This has been

interpreted as indicating of the existence of different subsets of immune cells, playing a role

in immune regulation, host defence and wound healing. We have also learnt that microglia

are ontogenetically distinct from monocyte-derived macrophages, and that they are highly

dynamic (rather than quiescent) and plastic. This new knowledge has enabled us to address

key gaps in neuroimmunology, and to explain some of the discrepancies in results in the

SCI field that had remained unexplained until recently. As knowledge and technology is

evolving rapidly, it can be expected in years to come that the identification of the

endogenous signals regulating immune cell phenotype and function will allow the creation

of novel approaches to either trace/image, selectively deplete or manipulate/target immune

cells more specifically. It is expected that these advancements will eventually lead to the

development of therapeutics aimed at regulating the entry of potentially harmful immune

cells into the CNS or the activation these cell types to promote neuroprotective and

regenerative effects. In this regard, anti-cytokines therapies seem particularly promising to

achieve this goal.

2.8. Acknowledments The work leading to this review was supported by grants from the Canadian Institutes of

Health Research (Grant number MOP-84558), International Foundation for Research in

Paraplegia (Project number P97), and Wings for Life Spinal Cord Research Foundation

(Project number 48, Contract number WFL-CA-006/11) to S.L. Both D.B. and S.L. are

supported by the Fonds de la recherche en santé du Québec. We thank Nicolas Vallières,

Nadia Fortin and Martine Lessard for their invaluable technical assistance. The authors

would also like to thank Dr. Manu Rangachari for his critical review of this manuscript.

97

2.9. References Ackery, A., Robins, S., Fehlings, M.G., 2006. Inhibition of Fas-mediated apoptosis through

administration of soluble Fas receptor improves functional outcome and reduces

posttraumatic axonal degeneration after acute spinal cord injury. J Neurotrauma 23, 604-

616.

Adachi, O., Kawai, T., Takeda, K., Matsumoto, M., Tsutsui, H., Sakagami, M., Nakanishi,

K., Akira, S., 1998. Targeted disruption of the MyD88 gene results in loss of IL-1- and

IL-18-mediated function. Immunity 9, 143-150.

Afonina, I.S., Tynan, G.A., Logue, S.E., Cullen, S.P., Bots, M., Luthi, A.U., Reeves, E.P.,

McElvaney, N.G., Medema, J.P., Lavelle, E.C., Martin, S.J., 2011. Granzyme B-

dependent proteolysis acts as a switch to enhance the proinflammatory activity of IL-

1alpha. Mol Cell 44, 265-278.

Akhurst, R.J., 2006. Large- and small-molecule inhibitors of transforming growth factor-

beta signaling. Curr Opin Investig Drugs 7, 513-521.

Akhurst, R.J., Hata, A., 2012. Targeting the TGFbeta signalling pathway in disease. Nat

Rev Drug Discov 11, 790-811.

Allan, S.M., Rothwell, N.J., 2001. Cytokines and acute neurodegeneration. Nat Rev

Neurosci 2, 734-744.

Allan, S.M., Tyrrell, P.J., Rothwell, N.J., 2005. Interleukin-1 and neuronal injury. Nat Rev

Immunol 5, 629-640.

Allen, C., Thornton, P., Denes, A., McColl, B.W., Pierozynski, A., Monestier, M.,

Pinteaux, E., Rothwell, N.J., Allan, S.M., 2012. Neutrophil cerebrovascular

98

transmigration triggers rapid neurotoxicity through release of proteases associated with

decondensed DNA. J Immunol 189, 381-392.

Andre, R., Pinteaux, E., Kimber, I., Rothwell, N.J., 2005. Differential actions of IL-1 alpha

and IL-1 beta in glial cells share common IL-1 signalling pathways. Neuroreport 16,

153-157.

Anforth, H.R., Bluthe, R.M., Bristow, A., Hopkins, S., Lenczowski, M.J., Luheshi, G.,

Lundkvist, J., Michaud, B., Mistry, Y., Van Dam, A.M., Zhen, C., Dantzer, R., Poole,

S., Rothwell, N.J., Tilders, F.J., Wollman, E.E., 1998. Biological activity and brain

actions of recombinant rat interleukin-1alpha and interleukin-1beta. Eur Cytokine Netw

9, 279-288.

Arend, W.P., Palmer, G., Gabay, C., 2008. IL-1, IL-18, and IL-33 families of cytokines.

Immunol Rev 223, 20-38.

Attwell, D., Buchan, A.M., Charpak, S., Lauritzen, M., Macvicar, B.A., Newman, E.A.,

2010. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature 468, 232-243.

Babcock, A.A., Wirenfeldt, M., Holm, T., Nielsen, H.H., Dissing-Olesen, L., Toft-Hansen,

H., Millward, J.M., Landmann, R., Rivest, S., Finsen, B., Owens, T., 2006. Toll-like

receptor 2 signaling in response to brain injury: an innate bridge to neuroinflammation. J

Neurosci 26, 12826-12837.

Balasingam, V., Yong, V.W., 1996. Attenuation of astroglial reactivity by interleukin-10. J

Neurosci 16, 2945-2955.

Balentine, J.D., 1978. Pathology of experimental spinal cord trauma. I. The necrotic lesion

as a function of vascular injury. Lab Invest 39, 236-253.

99

Bao, F., Liu, D., 2004. Hydroxyl radicals generated in the rat spinal cord at the level

produced by impact injury induce cell death by necrosis and apoptosis: protection by a

metalloporphyrin. Neuroscience 126, 285-295.

Barres, B.A., Schmid, R., Sendnter, M., Raff, M.C., 1993. Multiple extracellular signals are

required for long-term oligodendrocyte survival. Development 118, 283-295.

Barrette, B., Hebert, M.A., Filali, M., Lafortune, K., Vallieres, N., Gowing, G., Julien, J.P.,

Lacroix, S., 2008. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J Neurosci 28,

9363-9376.

Bartanusz, V., Jezova, D., Alajajian, B., Digicaylioglu, M., 2011. The blood-spinal cord

barrier: morphology and clinical implications. Ann Neurol 70, 194-206.

Bartholdi, D., Schwab, M.E., 1997. Expression of pro-inflammatory cytokine and

chemokine mRNA upon experimental spinal cord injury in mouse: an in situ

hybridization study. Eur J Neurosci 9, 1422-1438.

Basu, A., Krady, J.K., Enterline, J.R., Levison, S.W., 2002a. Transforming growth factor

beta1 prevents IL-1beta-induced microglial activation, whereas TNFalpha- and IL-6-

stimulated activation are not antagonized. Glia 40, 109-120.

Basu, A., Krady, J.K., Levison, S.W., 2004. Interleukin-1: a master regulator of

neuroinflammation. J Neurosci Res 78, 151-156.

Basu, A., Krady, J.K., O'Malley, M., Styren, S.D., DeKosky, S.T., Levison, S.W., 2002b.

The type 1 interleukin-1 receptor is essential for the efficient activation of microglia and

the induction of multiple proinflammatory mediators in response to brain injury. J

Neurosci 22, 6071-6082.

100

Be'eri, H., Reichert, F., Saada, A., Rotshenker, S., 1998. The cytokine network of wallerian

degeneration: IL-10 and GM-CSF. Eur J Neurosci 10, 2707-2713.

Beck, K.D., Nguyen, H.X., Galvan, M.D., Salazar, D.L., Woodruff, T.M., Anderson, A.J.,

2010. Quantitative analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury:

evidence for a multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment.

Brain 133, 433-447.

Bedard, A., Tremblay, P., Chernomoretz, A., Vallieres, L., 2007. Identification of genes

preferentially expressed by microglia and upregulated during cuprizone-induced

inflammation. Glia 55, 777-789.

Benton, R.L., Maddie, M.A., Minnillo, D.R., Hagg, T., Whittemore, S.R., 2008. Griffonia

simplicifolia isolectin B4 identifies a specific subpopulation of angiogenic blood vessels

following contusive spinal cord injury in the adult mouse. J Comp Neurol 507, 1031-

1052.

Bethea, J.R., Nagashima, H., Acosta, M.C., Briceno, C., Gomez, F., Marcillo, A.E., Loor,

K., Green, J., Dietrich, W.D., 1999. Systemically administered interleukin-10 reduces

tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery

following traumatic spinal cord injury in rats. J Neurotrauma 16, 851-863.

Beyrau, M., Bodkin, J.V., Nourshargh, S., 2012. Neutrophil heterogeneity in health and

disease: a revitalized avenue in inflammation and immunity. Open Biol 2, 120134.

Blight, A.R., 1985. Delayed demyelination and macrophage invasion: a candidate for

secondary cell damage in spinal cord injury. Cent Nerv Syst Trauma 2, 299-315.

Blight, A.R., 1994. Effects of silica on the outcome from experimental spinal cord injury:

implication of macrophages in secondary tissue damage. Neuroscience 60, 263-273.

101

Boivin, A., Pineau, I., Barrette, B., Filali, M., Vallieres, N., Rivest, S., Lacroix, S., 2007.

Toll-like receptor signaling is critical for Wallerian degeneration and functional

recovery after peripheral nerve injury. J Neurosci 27, 12565-12576.

Boutin, H., LeFeuvre, R.A., Horai, R., Asano, M., Iwakura, Y., Rothwell, N.J., 2001. Role

of IL-1alpha and IL-1beta in ischemic brain damage. J Neurosci 21, 5528-5534.

Boven, L.A., Van Meurs, M., Van Zwam, M., Wierenga-Wolf, A., Hintzen, R.Q., Boot,

R.G., Aerts, J.M., Amor, S., Nieuwenhuis, E.E., Laman, J.D., 2006. Myelin-laden

macrophages are anti-inflammatory, consistent with foam cells in multiple sclerosis.

Brain 129, 517-526.

Bradke, F., Fawcett, J.W., Spira, M.E., 2012. Assembly of a new growth cone after

axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat Rev Neurosci 13, 183-193.

Brambilla, R., Bracchi-Ricard, V., Hu, W.H., Frydel, B., Bramwell, A., Karmally, S.,

Green, E.J., Bethea, J.R., 2005. Inhibition of astroglial nuclear factor kappaB reduces

inflammation and improves functional recovery after spinal cord injury. J Exp Med 202,

145-156.

Brambilla, R., Hurtado, A., Persaud, T., Esham, K., Pearse, D.D., Oudega, M., Bethea, J.R.,

2009. Transgenic inhibition of astroglial NF-kappaB leads to increased axonal sparing

and sprouting following spinal cord injury. J Neurochem 110, 765-778.

Brewer, K.L., Bethea, J.R., Yezierski, R.P., 1999. Neuroprotective effects of interleukin-10

following excitotoxic spinal cord injury. Exp Neurol 159, 484-493.

Broughton, B.R., Reutens, D.C., Sobey, C.G., 2009. Apoptotic mechanisms after cerebral

ischemia. Stroke 40, e331-339.

102

Bruce, A.J., Boling, W., Kindy, M.S., Peschon, J., Kraemer, P.J., Carpenter, M.K.,

Holtsberg, F.W., Mattson, M.P., 1996. Altered neuronal and microglial responses to

excitotoxic and ischemic brain injury in mice lacking TNF receptors. Nat Med 2, 788-

794.

Burda, J.E., Sofroniew, M.V., 2014. Reactive gliosis and the multicellular response to CNS

damage and disease. Neuron 81, 229-248.

Buryskova, M., Pospisek, M., Grothey, A., Simmet, T., Burysek, L., 2004. Intracellular

interleukin-1alpha functionally interacts with histone acetyltransferase complexes. J Biol

Chem 279, 4017-4026.

Busch, S.A., Horn, K.P., Silver, D.J., Silver, J., 2009. Overcoming macrophage-mediated

axonal dieback following CNS injury. J Neurosci 29, 9967-9976.

Buss, A., Pech, K., Kakulas, B.A., Martin, D., Schoenen, J., Noth, J., Brook, G.A., 2008.

TGF-beta1 and TGF-beta2 expression after traumatic human spinal cord injury. Spinal

Cord 46, 364-371.

Cabal-Hierro, L., Lazo, P.S., 2012. Signal transduction by tumor necrosis factor receptors.

Cell Signal 24, 1297-1305.

Cafferty, W.B., Gardiner, N.J., Das, P., Qiu, J., McMahon, S.B., Thompson, S.W., 2004.

Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out

mice. J Neurosci 24, 4432-4443.

Cao, Z., Gao, Y., Bryson, J.B., Hou, J., Chaudhry, N., Siddiq, M., Martinez, J., Spencer, T.,

Carmel, J., Hart, R.B., Filbin, M.T., 2006. The cytokine interleukin-6 is sufficient but

not necessary to mimic the peripheral conditioning lesion effect on axonal growth. J

Neurosci 26, 5565-5573.

103

Carruth, L.M., Demczuk, S., Mizel, S.B., 1991. Involvement of a calpain-like protease in

the processing of the murine interleukin 1 alpha precursor. J Biol Chem 266, 12162-

12167.

Casella, G.T., Bunge, M.B., Wood, P.M., 2006. Endothelial cell loss is not a major cause of

neuronal and glial cell death following contusion injury of the spinal cord. Exp Neurol

202, 8-20.

Casha, S., Yu, W.R., Fehlings, M.G., 2001. Oligodendroglial apoptosis occurs along

degenerating axons and is associated with FAS and p75 expression following spinal cord

injury in the rat. Neuroscience 103, 203-218.

Casha, S., Yu, W.R., Fehlings, M.G., 2005. FAS deficiency reduces apoptosis, spares axons

and improves function after spinal cord injury. Exp Neurol 196, 390-400.

Chan, J.K., Roth, J., Oppenheim, J.J., Tracey, K.J., Vogl, T., Feldmann, M., Horwood, N.,

Nanchahal, J., 2012. Alarmins: awaiting a clinical response. J Clin Invest 122, 2711-

2719.

Chen, C.J., Kono, H., Golenbock, D., Reed, G., Akira, S., Rock, K.L., 2007. Identification

of a key pathway required for the sterile inflammatory response triggered by dying cells.

Nat Med 13, 851-856.

Chen, K.B., Uchida, K., Nakajima, H., Yayama, T., Hirai, T., Watanabe, S., Guerrero,

A.R., Kobayashi, S., Ma, W.Y., Liu, S.Y., Baba, H., 2011. Tumor necrosis factor-alpha

antagonist reduces apoptosis of neurons and oligodendroglia in rat spinal cord injury.

Spine (Phila Pa 1976) 36, 1350-1358.

104

Chi, L.Y., Yu, J., Zhu, H., Li, X.G., Zhu, S.G., Kindy, M.S., 2008. The dual role of tumor

necrosis factor-alpha in the pathophysiology of spinal cord injury. Neurosci Lett 438,

174-179.

Cohen, I., Rider, P., Carmi, Y., Braiman, A., Dotan, S., White, M.R., Voronov, E., Martin,

M.U., Dinarello, C.A., Apte, R.N., 2010. Differential release of chromatin-bound IL-

1alpha discriminates between necrotic and apoptotic cell death by the ability to induce

sterile inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 2574-2579.

Cregg, J.M., Depaul, M.A., Filous, A.R., Lang, B.T., Tran, A., Silver, J., 2014. Functional

regeneration beyond the glial scar. Exp Neurol 253C, 197-207.

Crowe, M.J., Bresnahan, J.C., Shuman, S.L., Masters, J.N., Beattie, M.S., 1997. Apoptosis

and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys. Nat Med 3, 73-

76.

Davalos, D., Grutzendler, J., Yang, G., Kim, J.V., Zuo, Y., Jung, S., Littman, D.R., Dustin,

M.L., Gan, W.B., 2005. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in

vivo. Nat Neurosci 8, 752-758.

Davalos, D., Ryu, J.K., Merlini, M., Baeten, K.M., Le Moan, N., Petersen, M.A., Deerinck,

T.J., Smirnoff, D.S., Bedard, C., Hakozaki, H., Gonias Murray, S., Ling, J.B., Lassmann,

H., Degen, J.L., Ellisman, M.H., Akassoglou, K., 2012. Fibrinogen-induced perivascular

microglial clustering is required for the development of axonal damage in

neuroinflammation. Nat Commun 3, 1227.

David, S., Aguayo, A.J., 1981. Axonal elongation into peripheral nervous system "bridges"

after central nervous system injury in adult rats. Science 214, 931-933.

105

David, S., Kroner, A., 2011. Repertoire of microglial and macrophage responses after

spinal cord injury. Nat Rev Neurosci 12, 388-399.

David, S., Lacroix, S., 2005. Role of the Immune Response in Tissue Damage and Repair

in the Injured Spinal Cord, in: Antel, J., Birnbaum, G., Hartung, H.P., Vincent, A.

(Eds.), Clinical Neuroimmunology, Second edition ed. Oxford University press, New

York, pp. 53-63.

de Rivero Vaccari, J.P., Bastien, D., Yurcisin, G., Pineau, I., Dietrich, W.D., De Koninck,

Y., Keane, R.W., Lacroix, S., 2012. P2X4 receptors influence inflammasome activation

following spinal cord injury. J Neurosci 32, 3058-3066.

de Rivero Vaccari, J.P., Lotocki, G., Marcillo, A.E., Dietrich, W.D., Keane, R.W., 2008. A

molecular platform in neurons regulates inflammation after spinal cord injury. J

Neurosci 28, 3404-3414.

Denny, M.F., Yalavarthi, S., Zhao, W., Thacker, S.G., Anderson, M., Sandy, A.R.,

McCune, W.J., Kaplan, M.J., 2010. A distinct subset of proinflammatory neutrophils

isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and

synthesizes type I IFNs. J Immunol 184, 3284-3297.

Dibaj, P., Nadrigny, F., Steffens, H., Scheller, A., Hirrlinger, J., Schomburg, E.D., Neusch,

C., Kirchhoff, F., 2010. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury

under ATP control in vivo. Glia 58, 1133-1144.

Dibaj, P., Steffens, H., Zschuntzsch, J., Nadrigny, F., Schomburg, E.D., Kirchhoff, F.,

Neusch, C., 2011. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS

microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PLoS One 6, e17910.

Dinarello, C.A., 1991. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. Blood 77, 1627-1652.

106

Dinarello, C.A., 2009. Immunological and inflammatory functions of the interleukin-1

family. Annu Rev Immunol 27, 519-550.

Dinarello, C.A., 2011. Interleukin-1 in the pathogenesis and treatment of inflammatory

diseases. Blood 117, 3720-3732.

Dinarello, C.A., Simon, A., van der Meer, J.W., 2012. Treating inflammation by blocking

interleukin-1 in a broad spectrum of diseases. Nat Rev Drug Discov 11, 633-652.

Dohrmann, G.J., Wagner, F.C., Jr., Bucy, P.C., 1971. The microvasculature in transitory

traumatic paraplegia. An electron microscopic study in the monkey. J Neurosurg 35,

263-271.

Donnelly, D.J., Longbrake, E.E., Shawler, T.M., Kigerl, K.A., Lai, W., Tovar, C.A.,

Ransohoff, R.M., Popovich, P.G., 2011. Deficient CX3CR1 signaling promotes recovery

after mouse spinal cord injury by limiting the recruitment and activation of

Ly6Clo/iNOS+ macrophages. J Neurosci 31, 9910-9922.

Donnelly, D.J., Popovich, P.G., 2008. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal

regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol 209, 378-388.

Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F., 2009. Quantitative analysis by in vivo imaging of

the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord. Proc Natl

Acad Sci U S A 106, 9459-9464.

Eigenbrod, T., Park, J.H., Harder, J., Iwakura, Y., Nunez, G., 2008. Cutting edge: critical

role for mesothelial cells in necrosis-induced inflammation through the recognition of

IL-1 alpha released from dying cells. J Immunol 181, 8194-8198.

Evans, T.A., Barkauskas, D.S., Myers, J., Hare, E.G., You, J., Ransohoff, R.M., Huang,

A.Y., Silver, J., 2014. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived

107

macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic

spinal cord injury. Exp Neurol.

Farrar, M.J., Bernstein, I.M., Schlafer, D.H., Cleland, T.A., Fetcho, J.R., Schaffer, C.B.,

2012. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.

Nat Methods.

Fassbender, J.M., Whittemore, S.R., Hagg, T., 2011. Targeting microvasculature for

neuroprotection after SCI. Neurotherapeutics 8, 240-251.

Faulkner, J.R., Herrmann, J.E., Woo, M.J., Tansey, K.E., Doan, N.B., Sofroniew, M.V.,

2004. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. J

Neurosci 24, 2143-2155.

Fenrich, K.K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F., 2012. Long-

term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular

resolution using implanted glass windows. J Physiol 590, 3665-3675.

Fernandez-Valle, C., Bunge, R.P., Bunge, M.B., 1995. Schwann cells degrade myelin and

proliferate in the absence of macrophages: evidence from in vitro studies of Wallerian

degeneration. J Neurocytol 24, 667-679.

Fiorentino, D.F., Bond, M.W., Mosmann, T.R., 1989. Two types of mouse T helper cell.

IV. Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Th1 clones. J Exp

Med 170, 2081-2095.

Flavell, R.A., Sanjabi, S., Wrzesinski, S.H., Licona-Limon, P., 2010. The polarization of

immune cells in the tumour environment by TGFbeta. Nat Rev Immunol 10, 554-567.

108

Fleming, J.C., Norenberg, M.D., Ramsay, D.A., Dekaban, G.A., Marcillo, A.E., Saenz,

A.D., Pasquale-Styles, M., Dietrich, W.D., Weaver, L.C., 2006. The cellular

inflammatory response in human spinal cords after injury. Brain 129, 3249-3269.

Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G., 2009. The inflammasome: a

caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis.

Nat Immunol 10, 241-247.

Fridlender, Z.G., Sun, J., Kim, S., Kapoor, V., Cheng, G., Ling, L., Worthen, G.S., Albelda,

S.M., 2009. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: "N1"

versus "N2" TAN. Cancer Cell 16, 183-194.

Fu, S.Y., Gordon, T., 1997. The cellular and molecular basis of peripheral nerve

regeneration. Mol Neurobiol 14, 67-116.

Fuchs, A.C., Granowitz, E.V., Shapiro, L., Vannier, E., Lonnemann, G., Angel, J.B.,

Kennedy, J.S., Rabson, A.R., Radwanski, E., Affrime, M.B., Cutler, D.L., Grint, P.C.,

Dinarello, C.A., 1996. Clinical, hematologic, and immunologic effects of interleukin-10

in humans. J Clin Immunol 16, 291-303.

Fujiki, M., Zhang, Z., Guth, L., Steward, O., 1996. Genetic influences on cellular reactions

to spinal cord injury: activation of macrophages/microglia and astrocytes is delayed in

mice carrying a mutation (WldS) that causes delayed Wallerian degeneration. J Comp

Neurol 371, 469-484.

Geissmann, F., Jung, S., Littman, D.R., 2003. Blood monocytes consist of two principal

subsets with distinct migratory properties. Immunity 19, 71-82.

Genovese, T., Esposito, E., Mazzon, E., Di Paola, R., Caminiti, R., Bramanti, P.,

Cappelani, A., Cuzzocrea, S., 2009. Absence of endogenous interleukin-10 enhances

109

secondary inflammatory process after spinal cord compression injury in mice. J

Neurochem 108, 1360-1372.

Genovese, T., Mazzon, E., Crisafulli, C., Di Paola, R., Muia, C., Esposito, E., Bramanti, P.,

Cuzzocrea, S., 2008. TNF-alpha blockage in a mouse model of SCI: evidence for

improved outcome. Shock 29, 32-41.

George, R., Griffin, J.W., 1994. Delayed macrophage responses and myelin clearance

during Wallerian degeneration in the central nervous system: the dorsal radiculotomy

model. Exp Neurol 129, 225-236.

Geremia, N.M., Bao, F., Rosenzweig, T.E., Hryciw, T., Weaver, L., Dekaban, G.A.,

Brown, A., 2012. CD11d Antibody Treatment Improves Recovery in Spinal Cord-

Injured Mice. J Neurotrauma 29, 539-550.

Ghayur, T., Banerjee, S., Hugunin, M., Butler, D., Herzog, L., Carter, A., Quintal, L.,

Sekut, L., Talanian, R., Paskind, M., Wong, W., Kamen, R., Tracey, D., Allen, H., 1997.

Caspase-1 processes IFN-gamma-inducing factor and regulates LPS-induced IFN-

gamma production. Nature 386, 619-623.

Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M.F.,

Conway, S.J., Ng, L.G., Stanley, E.R., Samokhvalov, I.M., Merad, M., 2010. Fate

mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.

Science 330, 841-845.

Gordon, S., 2003. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol 3, 23-35.

Gordon, S., Taylor, P.R., 2005. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev

Immunol 5, 953-964.

110

Graves, B.J., Hatada, M.H., Hendrickson, W.A., Miller, J.K., Madison, V.S., Satow, Y.,

1990. Structure of interleukin 1 alpha at 2.7-A resolution. Biochemistry 29, 2679-2684.

Gray, M., Palispis, W., Popovich, P.G., van Rooijen, N., Gupta, R., 2007. Macrophage

depletion alters the blood-nerve barrier without affecting Schwann cell function after

neural injury. J Neurosci Res 85, 766-777.

Greenhalgh, A.D., Galea, J., Denes, A., Tyrrell, P.J., Rothwell, N.J., 2010. Rapid brain

penetration of interleukin-1 receptor antagonist in rat cerebral ischaemia:

pharmacokinetics, distribution, protection. Br J Pharmacol 160, 153-159.

Grossman, S.D., Rosenberg, L.J., Wrathall, J.R., 2001. Temporal-spatial pattern of acute

neuronal and glial loss after spinal cord contusion. Exp Neurol 168, 273-282.

Gu, Y., Kuida, K., Tsutsui, H., Ku, G., Hsiao, K., Fleming, M.A., Hayashi, N., Higashino,

K., Okamura, H., Nakanishi, K., Kurimoto, M., Tanimoto, T., Flavell, R.A., Sato, V.,

Harding, M.W., Livingston, D.J., Su, M.S., 1997. Activation of interferon-gamma

inducing factor mediated by interleukin-1beta converting enzyme. Science 275, 206-

209.

Guerrero, A.R., Uchida, K., Nakajima, H., Watanabe, S., Nakamura, M., Johnson, W.E.,

Baba, H., 2012. Blockade of interleukin-6 signaling inhibits the classic pathway and

promotes an alternative pathway of macrophage activation after spinal cord injury in

mice. J Neuroinflammation 9, 40.

Hains, B.C., Yucra, J.A., Hulsebosch, C.E., 2001. Reduction of pathological and behavioral

deficits following spinal cord contusion injury with the selective cyclooxygenase-2

inhibitor NS-398. J Neurotrauma 18, 409-423.

111

Hanisch, U.K., Kettenmann, H., 2007. Microglia: active sensor and versatile effector cells

in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci 10, 1387-1394.

Hanna, R.N., Carlin, L.M., Hubbeling, H.G., Nackiewicz, D., Green, A.M., Punt, J.A.,

Geissmann, F., Hedrick, C.C., 2011. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls

bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol 12,

778-785.

Hanna, R.N., Shaked, I., Hubbeling, H.G., Punt, J.A., Wu, R., Herrley, E., Zaugg, C., Pei,

H., Geissmann, F., Ley, K., Hedrick, C.C., 2012. NR4A1 (Nur77) deletion polarizes

macrophages toward an inflammatory phenotype and increases atherosclerosis. Circ Res

110, 416-427.

Harrison, J.K., Jiang, Y., Chen, S., Xia, Y., Maciejewski, D., McNamara, R.K., Streit, W.J.,

Salafranca, M.N., Adhikari, S., Thompson, D.A., Botti, P., Bacon, K.B., Feng, L., 1998.

Role for neuronally derived fractalkine in mediating interactions between neurons and

CX3CR1-expressing microglia. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 10896-10901.

Heldin, C.H., Miyazono, K., ten Dijke, P., 1997. TGF-beta signalling from cell membrane

to nucleus through SMAD proteins. Nature 390, 465-471.

Hellal, F., Hurtado, A., Ruschel, J., Flynn, K.C., Laskowski, C.J., Umlauf, M., Kapitein,

L.C., Strikis, D., Lemmon, V., Bixby, J., Hoogenraad, C.C., Bradke, F., 2011.

Microtubule stabilization reduces scarring and causes axon regeneration after spinal cord

injury. Science 331, 928-931.

Herrmann, J.E., Imura, T., Song, B., Qi, J., Ao, Y., Nguyen, T.K., Korsak, R.A., Takeda,

K., Akira, S., Sofroniew, M.V., 2008. STAT3 is a critical regulator of astrogliosis and

scar formation after spinal cord injury. J Neurosci 28, 7231-7243.

112

Herx, L.M., Rivest, S., Yong, V.W., 2000. Central nervous system-initiated inflammation

and neurotrophism in trauma: IL-1 beta is required for the production of ciliary

neurotrophic factor. J Immunol 165, 2232-2239.

Hirata, K., Kawabuchi, M., 2002. Myelin phagocytosis by macrophages and

nonmacrophages during Wallerian degeneration. Microsc Res Tech 57, 541-547.

Horn, K.P., Busch, S.A., Hawthorne, A.L., van Rooijen, N., Silver, J., 2008. Another

barrier to regeneration in the CNS: activated macrophages induce extensive retraction of

dystrophic axons through direct physical interactions. J Neurosci 28, 9330-9341.

Iadecola, C., Anrather, J., 2011. The immunology of stroke: from mechanisms to

translation. Nat Med 17, 796-808.

Inoue, K., 2006. The function of microglia through purinergic receptors: neuropathic pain

and cytokine release. Pharmacol Ther 109, 210-226.

John, G.R., Lee, S.C., Brosnan, C.F., 2003. Cytokines: powerful regulators of glial cell

activation. Neuroscientist 9, 10-22.

John, G.R., Lee, S.C., Song, X., Rivieccio, M., Brosnan, C.F., 2005. IL-1-regulated

responses in astrocytes: relevance to injury and recovery. Glia 49, 161-176.

Jung, S., Aliberti, J., Graemmel, P., Sunshine, M.J., Kreutzberg, G.W., Sher, A., Littman,

D.R., 2000. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and

green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol 20, 4106-4114.

Kanda, T., 2013. Biology of the blood-nerve barrier and its alteration in immune mediated

neuropathies. J Neurol Neurosurg Psychiatry 84, 208-212.

113

Karanth, S., Yang, G., Yeh, J., Richardson, P.M., 2006. Nature of signals that initiate the

immune response during Wallerian degeneration of peripheral nerves. Exp Neurol 202,

161-166.

Karkkainen, I., Rybnikova, E., Pelto-Huikko, M., Huovila, A.P., 2000. Metalloprotease-

disintegrin (ADAM) genes are widely and differentially expressed in the adult CNS.

Mol Cell Neurosci 15, 547-560.

Kerschensteiner, M., Schwab, M.E., Lichtman, J.W., Misgeld, T., 2005. In vivo imaging of

axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med 11, 572-577.

Kierdorf, K., Erny, D., Goldmann, T., Sander, V., Schulz, C., Perdiguero, E.G., Wieghofer,

P., Heinrich, A., Riemke, P., Holscher, C., Muller, D.N., Luckow, B., Brocker, T.,

Debowski, K., Fritz, G., Opdenakker, G., Diefenbach, A., Biber, K., Heikenwalder, M.,

Geissmann, F., Rosenbauer, F., Prinz, M., 2013. Microglia emerge from erythromyeloid

precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat Neurosci 16, 273-280.

Kigerl, K.A., Gensel, J.C., Ankeny, D.P., Alexander, J.K., Donnelly, D.J., Popovich, P.G.,

2009. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing

either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. J Neurosci 29,

13435-13444.

Kigerl, K.A., Lai, W., Rivest, S., Hart, R.P., Satoska, A.R., Popovich, P.G., 2007. Toll-like

receptor (TLR)-2 and TLR-4 regulate inflammation, gliosis, and myelin sparing after

spinal cord injury. J Neurochem 102, 37-50.

Knoblach, S.M., Faden, A.I., 1998. Interleukin-10 improves outcome and alters

proinflammatory cytokine expression after experimental traumatic brain injury. Exp

Neurol 153, 143-151.

114

Knoferle, J., Koch, J.C., Ostendorf, T., Michel, U., Planchamp, V., Vutova, P., Tonges, L.,

Stadelmann, C., Bruck, W., Bahr, M., Lingor, P., 2010. Mechanisms of acute axonal

degeneration in the optic nerve in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 6064-6069.

Kobayashi, Y., Yamamoto, K., Saido, T., Kawasaki, H., Oppenheim, J.J., Matsushima, K.,

1990. Identification of calcium-activated neutral protease as a processing enzyme of

human interleukin 1 alpha. Proc Natl Acad Sci U S A 87, 5548-5552.

Kohta, M., Kohmura, E., Yamashita, T., 2009. Inhibition of TGF-beta1 promotes functional

recovery after spinal cord injury. Neurosci Res 65, 393-401.

Kremlev, S.G., Palmer, C., 2005. Interleukin-10 inhibits endotoxin-induced pro-

inflammatory cytokines in microglial cell cultures. J Neuroimmunol 162, 71-80.

Kwon, B.K., Okon, E., Hillyer, J., Mann, C., Baptiste, D., Weaver, L.C., Fehlings, M.G.,

Tetzlaff, W., 2011. A systematic review of non-invasive pharmacologic neuroprotective

treatments for acute spinal cord injury. J Neurotrauma 28, 1545-1588.

Lacroix, S., Chang, L., Rose-John, S., Tuszynski, M.H., 2002. Delivery of Hyper-IL-6 to

the injured spinal cord increases neutrophil and macrophage infiltration and inhibits

axonal growth. J. Comp. Neurol. 454, 213-228.

Lagord, C., Berry, M., Logan, A., 2002. Expression of TGFbeta2 but not TGFbeta1

correlates with the deposition of scar tissue in the lesioned spinal cord. Mol Cell

Neurosci 20, 69-92.

Lambertsen, K.L., Clausen, B.H., Babcock, A.A., Gregersen, R., Fenger, C., Nielsen, H.H.,

Haugaard, L.S., Wirenfeldt, M., Nielsen, M., Dagnaes-Hansen, F., Bluethmann, H.,

Faergeman, N.J., Meldgaard, M., Deierborg, T., Finsen, B., 2009. Microglia protect

115

neurons against ischemia by synthesis of tumor necrosis factor. J Neurosci 29, 1319-

1330.

Lamkanfi, M., Dixit, V.M., 2012. Inflammasomes and their roles in health and disease.

Annu Rev Cell Dev Biol 28, 137-161.

Laping, N.J., Morgan, T.E., Nichols, N.R., Rozovsky, I., Young-Chan, C.S., Zarow, C.,

Finch, C.E., 1994. Transforming growth factor-beta 1 induces neuronal and astrocyte

genes: tubulin alpha 1, glial fibrillary acidic protein and clusterin. Neuroscience 58, 563-

572.

Lee, H., Jo, E.K., Choi, S.Y., Oh, S.B., Park, K., Kim, J.S., Lee, S.J., 2006. Necrotic

neuronal cells induce inflammatory Schwann cell activation via TLR2 and TLR3:

implication in Wallerian degeneration. Biochem Biophys Res Commun 350, 742-747.

Lee, J.Y., Kim, H.S., Choi, H.Y., Oh, T.H., Ju, B.G., Yune, T.Y., 2012a. Valproic acid

attenuates blood-spinal cord barrier disruption by inhibiting matrix metalloprotease-9

activity and improves functional recovery after spinal cord injury. J Neurochem 121,

818-829.

Lee, J.Y., Kim, H.S., Choi, H.Y., Oh, T.H., Yune, T.Y., 2012b. Fluoxetine inhibits matrix

metalloprotease activation and prevents disruption of blood-spinal cord barrier after

spinal cord injury. Brain 135, 2375-2389.

Lee, S.M., Rosen, S., Weinstein, P., van Rooijen, N., Noble-Haeusslein, L.J., 2011.

Prevention of both neutrophil and monocyte recruitment promotes recovery after spinal

cord injury. J Neurotrauma 28, 1893-1907.

Letellier, E., Kumar, S., Sancho-Martinez, I., Krauth, S., Funke-Kaiser, A., Laudenklos, S.,

Konecki, K., Klussmann, S., Corsini, N.S., Kleber, S., Drost, N., Neumann, A., Levi-

116

Strauss, M., Brors, B., Gretz, N., Edler, L., Fischer, C., Hill, O., Thiemann, M., Biglari,

B., Karray, S., Martin-Villalba, A., 2010. CD95-ligand on peripheral myeloid cells

activates Syk kinase to trigger their recruitment to the inflammatory site. Immunity 32,

240-252.

Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M.I., Nourshargh, S., 2007. Getting to the site of

inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol 7, 678-689.

Li, M.O., Flavell, R.A., 2008. TGF-beta: a master of all T cell trades. Cell 134, 392-404.

Lin, H.W., Basu, A., Druckman, C., Cicchese, M., Krady, J.K., Levison, S.W., 2006.

Astrogliosis is delayed in type 1 interleukin-1 receptor-null mice following a penetrating

brain injury. J Neuroinflammation 3, 15.

Liu, D., Ling, X., Wen, J., Liu, J., 2000. The role of reactive nitrogen species in secondary

spinal cord injury: formation of nitric oxide, peroxynitrite, and nitrated protein. J

Neurochem 75, 2144-2154.

Liu, D., Sybert, T.E., Qian, H., Liu, J., 1998. Superoxide production after spinal injury

detected by microperfusion of cytochrome c. Free Radic Biol Med 25, 298-304.

Liu, X.Z., Xu, X.M., Hu, R., Du, C., Zhang, S.X., McDonald, J.W., Dong, H.X., Wu, Y.J.,

Fan, G.S., Jacquin, M.F., Hsu, C.Y., Choi, D.W., 1997. Neuronal and glial apoptosis

after traumatic spinal cord injury. J Neurosci 17, 5395-5406.

Logan, A., Berry, M., Gonzalez, A.M., Frautschy, S.A., Sporn, M.B., Baird, A., 1994.

Effects of transforming growth factor beta 1 on scar production in the injured central

nervous system of the rat. Eur J Neurosci 6, 355-363.

117

Logan, A., Green, J., Hunter, A., Jackson, R., Berry, M., 1999. Inhibition of glial scarring

in the injured rat brain by a recombinant human monoclonal antibody to transforming

growth factor-beta2. Eur J Neurosci 11, 2367-2374.

Lotocki, G., Alonso, O.F., Dietrich, W.D., Keane, R.W., 2004. Tumor necrosis factor

receptor 1 and its signaling intermediates are recruited to lipid rafts in the traumatized

brain. J Neurosci 24, 11010-11016.

Luheshi, N.M., Kovacs, K.J., Lopez-Castejon, G., Brough, D., Denes, A., 2011.

Interleukin-1alpha expression precedes IL-1beta after ischemic brain injury and is

localised to areas of focal neuronal loss and penumbral tissues. J Neuroinflammation 8,

186.

Luheshi, N.M., Rothwell, N.J., Brough, D., 2009. Dual functionality of interleukin-1 family

cytokines: implications for anti-interleukin-1 therapy. Br J Pharmacol 157, 1318-1329.

Maikos, J.T., Shreiber, D.I., 2007. Immediate damage to the blood-spinal cord barrier due

to mechanical trauma. J Neurotrauma 24, 492-507.

March, C.J., Mosley, B., Larsen, A., Cerretti, D.P., Braedt, G., Price, V., Gillis, S., Henney,

C.S., Kronheim, S.R., Grabstein, K., et al., 1985. Cloning, sequence and expression of

two distinct human interleukin-1 complementary DNAs. Nature 315, 641-647.

Mariathasan, S., Monack, D.M., 2007. Inflammasome adaptors and sensors: intracellular

regulators of infection and inflammation. Nat Rev Immunol 7, 31-40.

Martinez, F.O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A., 2006. Transcriptional profiling of

the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: new molecules and

patterns of gene expression. J Immunol 177, 7303-7311.

118

Martinon, F., Mayor, A., Tschopp, J., 2009. The inflammasomes: guardians of the body.

Annu Rev Immunol 27, 229-265.

Mason, J.L., Suzuki, K., Chaplin, D.D., Matsushima, G.K., 2001. Interleukin-1beta

promotes repair of the CNS. J Neurosci 21, 7046-7052.

Mason, J.L., Ye, P., Suzuki, K., D'Ercole, A.J., Matsushima, G.K., 2000. Insulin-like

growth factor-1 inhibits mature oligodendrocyte apoptosis during primary

demyelination. J Neurosci 20, 5703-5708.

Massague, J., 2000. How cells read TGF-beta signals. Nat Rev Mol Cell Biol 1, 169-178.

Mautes, A.E., Weinzierl, M.R., Donovan, F., Noble, L.J., 2000. Vascular events after spinal

cord injury: contribution to secondary pathogenesis. Phys Ther 80, 673-687.

Mawhinney, L.A., Thawer, S.G., Lu, W.Y., Rooijen, N., Weaver, L.C., Brown, A.,

Dekaban, G.A., 2012. Differential detection and distribution of microglial and

hematogenous macrophage populations in the injured spinal cord of lys-EGFP-ki

transgenic mice. J Neuropathol Exp Neurol 71, 180-197.

McTigue, D.M., Popovich, P.G., Morgan, T.E., Stokes, B.T., 2000. Localization of

transforming growth factor-beta1 and receptor mRNA after experimental spinal cord

injury. Exp Neurol 163, 220-230.

McTigue, D.M., Tripathi, R.B., 2008. The life, death, and replacement of oligodendrocytes

in the adult CNS. J Neurochem 107, 1-19.

Micheau, O., Tschopp, J., 2003. Induction of TNF receptor I-mediated apoptosis via two

sequential signaling complexes. Cell 114, 181-190.

119

Miklossy, J., Van der Loos, H., 1991. The long-distance effects of brain lesions:

visualization of myelinated pathways in the human brain using polarizing and

fluorescence microscopy. J Neuropathol Exp Neurol 50, 1-15.

Mildner, A., Schmidt, H., Nitsche, M., Merkler, D., Hanisch, U.K., Mack, M.,

Heikenwalder, M., Bruck, W., Priller, J., Prinz, M., 2007. Microglia in the adult brain

arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat Neurosci

10, 1544-1553.

Minkiewicz, J., de Rivero Vaccari, J.P., Keane, R.W., 2013. Human astrocytes express a

novel NLRP2 inflammasome. Glia 61, 1113-1121.

Miron, V.E., Boyd, A., Zhao, J.W., Yuen, T.J., Ruckh, J.M., Shadrach, J.L., van

Wijngaarden, P., Wagers, A.J., Williams, A., Franklin, R.J., ffrench-Constant, C., 2013.

M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS

remyelination. Nat Neurosci 16, 1211-1218.

Miyoshi, K., Obata, K., Kondo, T., Okamura, H., Noguchi, K., 2008. Interleukin-18-

mediated microglia/astrocyte interaction in the spinal cord enhances neuropathic pain

processing after nerve injury. J Neurosci 28, 12775-12787.

Moore, K.W., de Waal Malefyt, R., Coffman, R.L., O'Garra, A., 2001. Interleukin-10 and

the interleukin-10 receptor. Annu Rev Immunol 19, 683-765.

Morgan, T.E., Laping, N.J., Rozovsky, I., Oda, T., Hogan, T.H., Finch, C.E., Pasinetti,

G.M., 1995. Clusterin expression by astrocytes is influenced by transforming growth

factor beta 1 and heterotypic cell interactions. J Neuroimmunol 58, 101-110.

120

Mosley, B., Urdal, D.L., Prickett, K.S., Larsen, A., Cosman, D., Conlon, P.J., Gillis, S.,

Dower, S.K., 1987. The interleukin-1 receptor binds the human interleukin-1 alpha

precursor but not the interleukin-1 beta precursor. J Biol Chem 262, 2941-2944.

Muldoon, L.L., Alvarez, J.I., Begley, D.J., Boado, R.J., Del Zoppo, G.J., Doolittle, N.D.,

Engelhardt, B., Hallenbeck, J.M., Lonser, R.R., Ohlfest, J.R., Prat, A., Scarpa, M.,

Smeyne, R.J., Drewes, L.R., Neuwelt, E.A., 2013. Immunologic privilege in the central

nervous system and the blood-brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab 33, 13-21.

Murakami, M., Hibi, M., Nakagawa, N., Nakagawa, T., Yasukawa, K., Yamanishi, K.,

Taga, T., Kishimoto, T., 1993. IL-6-induced homodimerization of gp130 and associated

activation of a tyrosine kinase. Science 260, 1808-1810.

Murinson, B.B., Archer, D.R., Li, Y., Griffin, J.W., 2005. Degeneration of myelinated

efferent fibers prompts mitosis in Remak Schwann cells of uninjured C-fiber afferents. J

Neurosci 25, 1179-1187.

Nadeau, S., Filali, M., Zhang, J., Kerr, B.J., Rivest, S., Soulet, D., Iwakura, Y., de Rivero

Vaccari, J.P., Keane, R.W., Lacroix, S., 2011. Functional Recovery after Peripheral

Nerve Injury is Dependent on the Pro-Inflammatory Cytokines IL-1{beta} and TNF:

Implications for Neuropathic Pain. J Neurosci 31, 12533-12542.

Nahrendorf, M., Swirski, F.K., Aikawa, E., Stangenberg, L., Wurdinger, T., Figueiredo,

J.L., Libby, P., Weissleder, R., Pittet, M.J., 2007. The healing myocardium sequentially

mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. J Exp

Med 204, 3037-3047.

Nakamura, M., Okada, S., Toyama, Y., Okano, H., 2005. Role of IL-6 in spinal cord injury

in a mouse model. Clinical reviews in allergy & immunology 28, 197-204.

121

Nakanishi, K., Yoshimoto, T., Tsutsui, H., Okamura, H., 2001. Interleukin-18 regulates

both Th1 and Th2 responses. Annu Rev Immunol 19, 423-474.

Nave, K.A., 2010. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci 11,

275-283.

Nesic, O., Xu, G.Y., McAdoo, D., High, K.W., Hulsebosch, C., Perez-Pol, R., 2001. IL-1

receptor antagonist prevents apoptosis and caspase-3 activation after spinal cord injury. J

Neurotrauma 18, 947-956.

Nguyen, L., Rothwell, N.J., Pinteaux, E., Boutin, H., 2011. Contribution of interleukin-1

receptor accessory protein B to interleukin-1 actions in neuronal cells. Neurosignals 19,

222-230.

Nikic, I., Merkler, D., Sorbara, C., Brinkoetter, M., Kreutzfeldt, M., Bareyre, F.M., Bruck,

W., Bishop, D., Misgeld, T., Kerschensteiner, M., 2011. A reversible form of axon

damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med

17, 495-499.

Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F., 2005. Resting microglial cells are highly

dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science 308, 1314-1318.

Noble, L.J., Donovan, F., Igarashi, T., Goussev, S., Werb, Z., 2002. Matrix

metalloproteinases limit functional recovery after spinal cord injury by modulation of

early vascular events. J Neurosci 22, 7526-7535.

Noble, L.J., Wrathall, J.R., 1988. Blood-spinal cord barrier disruption proximal to a spinal

cord transection in the rat: time course and pathways associated with protein leakage.

Exp Neurol 99, 567-578.

122

Noble, L.J., Wrathall, J.R., 1989a. Correlative analyses of lesion development and

functional status after graded spinal cord contusive injuries in the rat. Exp Neurol 103,

34-40.

Noble, L.J., Wrathall, J.R., 1989b. Distribution and time course of protein extravasation in

the rat spinal cord after contusive injury. Brain Res 482, 57-66.

O'Neill, L.A., 2008. The interleukin-1 receptor/Toll-like receptor superfamily: 10 years of

progress. Immunol Rev 226, 10-18.

O'Neill, L.A., Dinarello, C.A., 2000. The IL-1 receptor/toll-like receptor superfamily:

crucial receptors for inflammation and host defense. Immunol Today 21, 206-209.

Okada, S., Nakamura, M., Katoh, H., Miyao, T., Shimazaki, T., Ishii, K., Yamane, J.,

Yoshimura, A., Iwamoto, Y., Toyama, Y., Okano, H., 2006. Conditional ablation of

Stat3 or Socs3 discloses a dual role for reactive astrocytes after spinal cord injury. Nat

Med 12, 829-834.

Okada, S., Nakamura, M., Mikami, Y., Shimazaki, T., Mihara, M., Ohsugi, Y., Iwamoto,

Y., Yoshizaki, K., Kishimoto, T., Toyama, Y., Okano, H., 2004. Blockade of

interleukin-6 receptor suppresses reactive astrogliosis and ameliorates functional

recovery in experimental spinal cord injury. J Neurosci Res 76, 265-276.

Ouyang, W., Rutz, S., Crellin, N.K., Valdez, P.A., Hymowitz, S.G., 2011. Regulation and

functions of the IL-10 family of cytokines in inflammation and disease. Annu Rev

Immunol 29, 71-109.

Penkowa, M., Moos, T., Carrasco, J., Hadberg, H., Molinero, A., Bluethmann, H., Hidalgo,

J., 1999. Strongly compromised inflammatory response to brain injury in interleukin-6-

deficient mice. Glia 25, 343-357.

123

Perrin, F.E., Lacroix, S., Aviles-Trigueros, M., David, S., 2005. Involvement of monocyte

chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-

1beta in Wallerian degeneration. Brain 128, 854-866.

Pillay, J., Kamp, V.M., van Hoffen, E., Visser, T., Tak, T., Lammers, J.W., Ulfman, L.H.,

Leenen, L.P., Pickkers, P., Koenderman, L., 2012. A subset of neutrophils in human

systemic inflammation inhibits T cell responses through Mac-1. J Clin Invest 122, 327-

336.

Pillay, J., Ramakers, B.P., Kamp, V.M., Loi, A.L., Lam, S.W., Hietbrink, F., Leenen, L.P.,

Tool, A.T., Pickkers, P., Koenderman, L., 2010. Functional heterogeneity and

differential priming of circulating neutrophils in human experimental endotoxemia. J

Leukoc Biol 88, 211-220.

Pineau, I., Lacroix, S., 2007. Proinflammatory cytokine synthesis in the injured mouse

spinal cord: Multiphasic expression pattern and identification of the cell types involved.

J Comp Neurol 500, 267-285.

Pineau, I., Lacroix, S., 2009. Endogenous signals initiating inflammation in the injured

nervous system. Glia 57, 351-361.

Pineau, I., Libo, S., Bastien, D., Lacroix, S., 2010. Astrocytes initiate inflammation in the

injured mouse spinal cord by promoting the entry of neutrophils and inflammatory

monocytes in an IL-1 receptor/MyD88-dependent fashion. Brain Behav Immun 24, 540-

553.

Plunkett, J.A., Yu, C.G., Easton, J.M., Bethea, J.R., Yezierski, R.P., 2001. Effects of

interleukin-10 (IL-10) on pain behavior and gene expression following excitotoxic

spinal cord injury in the rat. Exp Neurol 168, 144-154.

124

Popovich, P.G., Guan, Z., Wei, P., Huitinga, I., van Rooijen, N., Stokes, B.T., 1999.

Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and

neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol 158, 351-365.

Popovich, P.G., Horner, P.J., Mullin, B.B., Stokes, B.T., 1996. A quantitative spatial

analysis of the blood-spinal cord barrier. I. Permeability changes after experimental

spinal contusion injury. Exp Neurol 142, 258-275.

Pradillo, J.M., Denes, A., Greenhalgh, A.D., Boutin, H., Drake, C., McColl, B.W., Barton,

E., Proctor, S.D., Russell, J.C., Rothwell, N.J., Allan, S.M., 2012. Delayed

administration of interleukin-1 receptor antagonist reduces ischemic brain damage and

inflammation in comorbid rats. J Cereb Blood Flow Metab 32, 1810-1819.

Rabchevsky, A.G., Streit, W.J., 1997. Grafting of cultured microglial cells into the lesioned

spinal cord of adult rats enhances neurite outgrowth. J Neurosci Res 47, 34-48.

Ransohoff, R.M., Perry, V.H., 2009. Microglial physiology: unique stimuli, specialized

responses. Annu Rev Immunol 27, 119-145.

Reichert, F., Saada, A., Rotshenker, S., 1994. Peripheral nerve injury induces Schwann

cells to express two macrophage phenotypes: phagocytosis and the galactose-specific

lectin MAC-2. J Neurosci 14, 3231-3245.

Rice, T., Larsen, J., Rivest, S., Yong, V.W., 2007. Characterization of the early

neuroinflammation after spinal cord injury in mice. J Neuropathol Exp Neurol 66, 184-

195.

Rider, P., Carmi, Y., Guttman, O., Braiman, A., Cohen, I., Voronov, E., White, M.R.,

Dinarello, C.A., Apte, R.N., 2011. IL-1{alpha} and IL-1{beta} Recruit Different

Myeloid Cells and Promote Different Stages of Sterile Inflammation. J Immunol.

125

Robins-Steele, S., Nguyen, D.H., Fehlings, M.G., 2012. The delayed post-injury

administration of soluble fas receptor attenuates post-traumatic neural degeneration and

enhances functional recovery after traumatic cervical spinal cord injury. J Neurotrauma

29, 1586-1599.

Romano, M., Sironi, M., Toniatti, C., Polentarutti, N., Fruscella, P., Ghezzi, P., Faggioni,

R., Luini, W., van Hinsbergh, V., Sozzani, S., Bussolino, F., Poli, V., Ciliberto, G.,

Mantovani, A., 1997. Role of IL-6 and its soluble receptor in induction of chemokines

and leukocyte recruitment. Immunity 6, 315-325.

Royall, J.A., Berkow, R.L., Beckman, J.S., Cunningham, M.K., Matalon, S., Freeman,

B.A., 1989. Tumor necrosis factor and interleukin 1 alpha increase vascular endothelial

permeability. Am J Physiol 257, L399-410.

Sabat, R., 2010. IL-10 family of cytokines. Cytokine Growth Factor Rev 21, 315-324.

Santello, M., Volterra, A., 2012. TNFalpha in synaptic function: switching gears. Trends

Neurosci 35, 638-647.

Sato, A., Ohtaki, H., Tsumuraya, T., Song, D., Ohara, K., Asano, M., Iwakura, Y., Atsumi,

T., Shioda, S., 2012. Interleukin-1 participates in the classical and alternative activation

of microglia/macrophages after spinal cord injury. J Neuroinflammation 9, 65.

Schmierer, B., Hill, C.S., 2007. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity

and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 970-982.

Schulz, C., Gomez Perdiguero, E., Chorro, L., Szabo-Rogers, H., Cagnard, N., Kierdorf,

K., Prinz, M., Wu, B., Jacobsen, S.E., Pollard, J.W., Frampton, J., Liu, K.J., Geissmann,

F., 2012. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.

Science 336, 86-90.

126

Schwab, J.M., Guo, L., Schluesener, H.J., 2005. Spinal cord injury induces early and

persistent lesional P2X4 receptor expression. J Neuroimmunol 163, 185-189.

Schwab, M.E., 2010. Functions of Nogo proteins and their receptors in the nervous system.

Nat Rev Neurosci 11, 799-811.

Shamash, S., Reichert, F., Rotshenker, S., 2002. The cytokine network of Wallerian

degeneration: tumor necrosis factor- alpha, interleukin-1alpha, and interleukin-1beta. J

Neurosci 22, 3052-3060.

Shechter, R., London, A., Varol, C., Raposo, C., Cusimano, M., Yovel, G., Rolls, A.,

Mack, M., Pluchino, S., Martino, G., Jung, S., Schwartz, M., 2009. Infiltrating blood-

derived macrophages are vital cells playing an anti-inflammatory role in recovery from

spinal cord injury in mice. PLoS Med 6, e1000113.

Shechter, R., Raposo, C., London, A., Sagi, I., Schwartz, M., 2011. The glial scar-

monocyte interplay: a pivotal resolution phase in spinal cord repair. PLoS One 6,

e27969.

Shi, C., Pamer, E.G., 2011. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat

Rev Immunol 11, 762-774.

Sica, A., Mantovani, A., 2012. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J

Clin Invest 122, 787-795.

Siegel, R.M., Chan, F.K., Chun, H.J., Lenardo, M.J., 2000. The multifaceted role of Fas

signaling in immune cell homeostasis and autoimmunity. Nat Immunol 1, 469-474.

Smith, D.E., 2011. The biological paths of IL-1 family members IL-18 and IL-33. J Leukoc

Biol 89, 383-392.

127

Smith, D.E., Lipsky, B.P., Russell, C., Ketchem, R.R., Kirchner, J., Hensley, K., Huang,

Y., Friedman, W.J., Boissonneault, V., Plante, M.M., Rivest, S., Sims, J.E., 2009. A

central nervous system-restricted isoform of the interleukin-1 receptor accessory protein

modulates neuronal responses to interleukin-1. Immunity 30, 817-831.

Sofroniew, M.V., 2009. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar

formation. Trends Neurosci 32, 638-647.

Soulet, D., Pare, A., Coste, J., Lacroix, S., 2013. Automated Filtering of Intrinsic

Movement Artifacts during Two-Photon Intravital Microscopy. PLoS One 8, e53942.

Spooren, A., Kolmus, K., Laureys, G., Clinckers, R., De Keyser, J., Haegeman, G., Gerlo,

S., 2011. Interleukin-6, a mental cytokine. Brain Res Rev 67, 157-183.

Sriram, K., O'Callaghan, J.P., 2007. Divergent roles for tumor necrosis factor-alpha in the

brain. J Neuroimmune Pharmacol 2, 140-153.

Stirling, D.P., Cummins, K., Chen, S.R., Stys, P., 2014. Axoplasmic reticulum Ca release

causes secondary degeneration of spinal axons. Ann Neurol.

Stirling, D.P., Cummins, K., Mishra, M., Teo, W., Yong, V.W., Stys, P., 2013. Toll-like

receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord

injury. Brain.

Stirling, D.P., Liu, S., Kubes, P., Yong, V.W., 2009. Depletion of Ly6G/Gr-1 leukocytes

after spinal cord injury in mice alters wound healing and worsens neurological outcome.

J Neurosci 29, 753-764.

Stirling, D.P., Yong, V.W., 2008. Dynamics of the inflammatory response after murine

spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res 86, 1944-1958.

128

Stoll, G., Griffin, J.W., Li, C.Y., Trapp, B.D., 1989. Wallerian degeneration in the

peripheral nervous system: participation of both Schwann cells and macrophages in

myelin degradation. J Neurocytol 18, 671-683.

Takeda, K., Clausen, B.E., Kaisho, T., Tsujimura, T., Terada, N., Forster, I., Akira, S.,

1999. Enhanced Th1 activity and development of chronic enterocolitis in mice devoid of

Stat3 in macrophages and neutrophils. Immunity 10, 39-49.

Tator, C.H., Fehlings, M.G., 1991. Review of the secondary injury theory of acute spinal

cord trauma with emphasis on vascular mechanisms. J Neurosurg 75, 15-26.

Thawer, S.G., Mawhinney, L., Chadwick, K., de Chickera, S.N., Weaver, L.C., Brown, A.,

Dekaban, G.A., 2013. Temporal changes in monocyte and macrophage subsets and

microglial macrophages following spinal cord injury in the lys-egfp-ki mouse model. J

Neuroimmunol.

Thomassen, E., Bird, T.A., Renshaw, B.R., Kennedy, M.K., Sims, J.E., 1998. Binding of

interleukin-18 to the interleukin-1 receptor homologous receptor IL-1Rrp1 leads to

activation of signaling pathways similar to those used by interleukin-1. J Interferon

Cytokine Res 18, 1077-1088.

Thompson, C.D., Zurko, J.C., Hanna, B.F., Hellenbrand, D.J., Hanna, A., 2013. The

therapeutic role of interleukin-10 after spinal cord injury. J Neurotrauma 30, 1311-1324.

Thornton, P., McColl, B.W., Greenhalgh, A., Denes, A., Allan, S.M., Rothwell, N.J., 2010.

Platelet interleukin-1alpha drives cerebrovascular inflammation. Blood 115, 3632-3639.

Tibbetts, M.D., Zheng, L., Lenardo, M.J., 2003. The death effector domain protein family:

regulators of cellular homeostasis. Nat Immunol 4, 404-409.

129

Tsakiri, N., Kimber, I., Rothwell, N.J., Pinteaux, E., 2008. Differential effects of

interleukin-1 alpha and beta on interleukin-6 and chemokine synthesis in neurones. Mol

Cell Neurosci 38, 259-265.

Tschopp, J., Martinon, F., Burns, K., 2003. NALPs: a novel protein family involved in

inflammation. Nat Rev Mol Cell Biol 4, 95-104.

Tsuda, Y., Takahashi, H., Kobayashi, M., Hanafusa, T., Herndon, D.N., Suzuki, F., 2004.

Three different neutrophil subsets exhibited in mice with different susceptibilities to

infection by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Immunity 21, 215-226.

Ulmann, L., Hatcher, J.P., Hughes, J.P., Chaumont, S., Green, P.J., Conquet, F., Buell,

G.N., Reeve, A.J., Chessell, I.P., Rassendren, F., 2008. Up-regulation of P2X4 receptors

in spinal microglia after peripheral nerve injury mediates BDNF release and neuropathic

pain. J Neurosci 28, 11263-11268.

Vargas, M.E., Barres, B.A., 2007. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow?

Annu Rev Neurosci 30, 153-179.

Wells, J.E., Rice, T.K., Nuttall, R.K., Edwards, D.R., Zekki, H., Rivest, S., Yong, V.W.,

2003. An adverse role for matrix metalloproteinase 12 after spinal cord injury in mice. J

Neurosci 23, 10107-10115.

Werman, A., Werman-Venkert, R., White, R., Lee, J.K., Werman, B., Krelin, Y., Voronov,

E., Dinarello, C.A., Apte, R.N., 2004. The precursor form of IL-1alpha is an intracrine

proinflammatory activator of transcription. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 2434-2439.

Woollard, K.J., Geissmann, F., 2010. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions.

Nat Rev Cardiol 7, 77-86.

130

Wyss-Coray, T., Mucke, L., 2002. Inflammation in neurodegenerative disease-a double-

edged sword. Neuron 35, 419.

Yan, P., Li, Q., Kim, G.M., Xu, J., Hsu, C.Y., Xu, X.M., 2001. Cellular localization of

tumor necrosis factor-alpha following acute spinal cord injury in adult rats. J

Neurotrauma 18, 563-568.

Yan, P., Liu, N., Kim, G.M., Xu, J., Li, Q., Hsu, C.Y., Xu, X.M., 2003. Expression of the

type 1 and type 2 receptors for tumor necrosis factor after traumatic spinal cord injury in

adult rats. Exp Neurol 183, 286-297.

Ye, L., Huang, Y., Zhao, L., Li, Y., Sun, L., Zhou, Y., Qian, G., Zheng, J.C., 2013. IL-

1beta and TNF-alpha induce neurotoxicity through glutamate production: a potential

role for neuronal glutaminase. J Neurochem 125, 897-908.

Yu, W.R., Liu, T., Fehlings, T.K., Fehlings, M.G., 2009. Involvement of mitochondrial

signaling pathways in the mechanism of Fas-mediated apoptosis after spinal cord injury.

Eur J Neurosci 29, 114-131.

Yune, T.Y., Chang, M.J., Kim, S.J., Lee, Y.B., Shin, S.W., Rhim, H., Kim, Y.C., Shin,

M.L., Oh, Y.J., Han, C.T., Markelonis, G.J., Oh, T.H., 2003. Increased production of

tumor necrosis factor-alpha induces apoptosis after traumatic spinal cord injury in rats. J

Neurotrauma 20, 207-219.

Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J.J., Bennett, M.R., Clarke, M.C., 2013. Intracellular

interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1alpha,

controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity 38, 285-295.

Zhou, Z., Peng, X., Insolera, R., Fink, D.J., Mata, M., 2009a. IL-10 promotes neuronal

survival following spinal cord injury. Exp Neurol 220, 183-190.

131

Zhou, Z., Peng, X., Insolera, R., Fink, D.J., Mata, M., 2009b. Interleukin-10 provides direct

trophic support to neurons. J Neurochem 110, 1617-1627.

Zhu, W., London, N.R., Gibson, C.C., Davis, C.T., Tong, Z., Sorensen, L.K., Shi, D.S.,

Guo, J., Smith, M.C., Grossmann, A.H., Thomas, K.R., Li, D.Y., 2012. Interleukin

receptor activates a MYD88-ARNO-ARF6 cascade to disrupt vascular stability. Nature

492, 252-255.

Zlokovic, B.V., 2008. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative

disorders. Neuron 57, 178-201.

Zong, S., Zeng, G., Wei, B., Xiong, C., Zhao, Y., 2012. Beneficial effect of interleukin-1

receptor antagonist protein on spinal cord injury recovery in the rat. Inflammation 35,

520-526.

133

3. Chapitre 3

P2X4 Receptors Influence Inflammasome Activation Following Spinal Cord Injury

Juan Pablo de Rivero Vaccari1,†, Dominic Bastien4,†, Geoffrey Yurcisin2, Isabelle Pineau4, W. Dalton Dietrich1, Yves De Koninck3, Robert W. Keane1,2, et Steve Lacroix4,*

The Miami Project to Cure Paralysis, 2 Department of Physiological & Biophysics, University of Miami Miller School of Medicine, Miami, 33136, FL; 3 Institut universitaire de santé mentale de Québec, Québec, Canada, G1J 2G3; 4 Centre de recherche du Centre hospitalier de l'Université Laval and Département de Médecine Moléculaire, Université

Laval, Québec, Québec, Canada, G1V 4G2

N.B. Juan Pablo de Rivero Vaccari et Dominic Bastien ont contribué également à la réalisation de ce manuscrit

134

3.1. Résumé Les récepteurs P2X4 et P2X7 sont les récepteurs purinergiques principaux exprimés chez les

cellules immunitaires et les cellules du SNC. Ces récepteurs sont capables de former des

interactions entre eux pour réguler des voies de signalisation dépendante de l’ATP. Nos

plus récentes études ont démontré que le récepteur P2X7 chez les neurones et les astrocytes

active l’inflammasome NLRP1. Si P2X4R régule l’activation d’un ou plusieurs

inflammasomes demeure encore inconnu. Dans cette étude, nous démontrons que P2X4R

est exprimé chez les neurones de la moelle épinière. De plus, nous fournissons des

évidences que les LME induisent une réponse inflammatoire entraînant une augmentation

du clivage de la caspase-1 ainsi que de la production de l’IL-1β, mais pas de l’IL-18. Les

souris déficientes en P2X4R ont présenté des niveaux plus faibles de caspase-1 clivée et

d’IL-1β corrélant avec une diminution de l’infiltration de neutrophiles et de macrophages

M1 dérivés des monocytes ainsi qu’avec une réduction de la perte de tissu nerveux et une

amélioration des fonctions locomotrices. Ces résultats suggèrent que P2X4R influence

l’activation et la formation de l’inflammasome conduisant à l’activation de la caspase-1 et

au clivage de l’IL-1β chez les neurones suite à une LME. Ce récepteur pourrait représenter

une cible thérapeutique intéressante pour limiter la réponse inflammatoire initiée après une

lésion du SNC.

135

3.2. Abstract P2X4 and P2X7 are the predominant P2X receptor subtypes expressed on immune and

neural cells. These receptor subtypes traffic between intracellular compartments and the

plasma membrane and form protein interactions with each other to regulate ATP-dependent

signaling. Our recent studies have shown that P2X7 receptors in neurons and astrocytes

activate NLRP1 inflammasomes, but whether P2X4 receptors regulate inflammasome

signaling is largely unknown. Here, we demonstrate that P2X4 receptors are expressed in

neurons of the spinal cord. We provide direct evidence that SCI induces an innate

inflammatory response that leads to increased caspase-l cleavage and production of IL-1β,

but not IL-18. Consistent with these findings, P2X4-knockout mice showed impaired

inflammasome signaling in the cord resulting in decreased levels of IL-1β and reduced

infiltration of neutrophils and monocyte-derived M1 macrophages, resulting in significant

tissue sparing and improvement in functional outcomes. These results indicate that P2X4

receptors influence inflammasome signaling involving caspase-1 activation and IL-1β

processing in neurons after SCI. P2X4 might thus represent a potential therapeutic target to

limit inflammatory responses associated with SCI and neurodegenerative disorders.

136

3.3. Introduction The innate immune response is classically known as the first line of defense against

endogenous and exogenous insults. However, innate immunity actually serves as a

sophisticated system for sensing “danger signals” such as host-derived signals of cellular

stress and tissue destruction. One of the most studied endogenous insults that activates the

innate immune response is adenosine 5’ triphosphate (ATP). Extracellular ATP is elevated

in neuroinflammation in spinal cord injury (SCI) and neuropathic pain and acts on

purinergic receptors such as P2X7 or P2X4 (Tsuda et al., 2003; Wang et al., 2004; Coull et

al., 2005). P2X4 is the most abundant P2X receptor subtype present in the central nervous

system (CNS) (Buell et al., 1996; Soto et al., 1996). It is expressed in neurons of different

brain regions and in microglia (Burnstock, 2007; Ulmann et al., 2008).

Increased expression of P2X4 is observed in injured tissue following SCI (Schwab et al.,

2005), traumatic brain injury (Zhang et al., 2006), and cerebral ischemia (Cavaliere et al.,

2003). Moreover, P2X4 receptors are elevated in spinal cord microglia after peripheral

nerve injury (Tsuda et al., 2003; Ulmann et al., 2008). Neutralizing P2X4 activity using an

antisense oligonucleotide or a transgenic approach prevents tactile allodynia (Tsuda et al.,

2003; Ulmann et al., 2008), suggesting that P2X4 receptors are involved in neuropathic

pain. P2X4 receptors are also expressed within the immune system (Wang et al., 2004).

However, the involvement of P2X4 in neuroinflammatory processes remains unresolved.

The inflammasome is a multiprotein complex that promotes the maturation of inflammatory

cytokines such as IL-1β and IL-18, and is therefore likely to control many aspects of

neuroinflammatory processes. Our previous work demonstrated that P2X7 receptors

activate the NLRP1 inflammasome in neurons and astrocytes via a mechanism mediated by

pannexin-1 (Silverman et al., 2009). Heteromeric interactions between P2X4 and P2X7

receptors have been reported in human embryonic kidney 293 cells and in primary cultures

of bone marrow-derived macrophages (Guo et al., 2007; Casas-Pruneda et al., 2009).

Moreover, genetic knockdown studies in mouse epithelial cells indicate that interactions

between P2X4 and P2X7 regulate overall P2X receptor levels (Weinhold et al., 2010). In

this study we used P2X4-knockout (ko) mice to examine the role of P2X4 receptors in

137

inflammasome activation and neuroinflammation following SCI. We show that P2X4-KO

mice have significant decreases in inflammasome activation, pro-inflammatory cytokine

production, inflammatory cell infiltration and improved histopathological and functional

outcomes compared with wild types following SCI. Thus, P2X4 receptors may play a

critical role in neurons mediating innate neuroinflammatory events following SCI.

3.4. Materials and Methods

3.4.1. Animals

A total of 190 adult mice were used in this study. P2X4-KO mice in the C57BL/6

background were generated, reproduced, and genotyped as previously described by the

Rassendren laboratory (Ulmann et al., 2008). C57BL/6 mice from Charles River

Laboratories (St-Constant, QC, Canada) were used as controls. Bone marrow chimeric

mice were produced using our previously published protocol (Pineau and Lacroix, 2007).

All mice had free access to food and water.

3.4.2. Spinal cord injury C57BL/6 (n = 99) and P2X4-KO (n = 91) mice were anesthetized with isoflurane and

underwent a laminectomy at vertebral level T9-10, which corresponds to spinal segment

T10-11. Briefly, the vertebral column was stabilized and a contusion of 70 kdyn was

performed using the Infinite Horizon (IH) SCI device (Precision Systems &

Instrumentation, Lexington, KY). Animals used for behavioral testing received a 50-kdyn

injury. Overlying muscular layers were then sutured and cutaneous layers stapled. Post-

operatively, animals received manual bladder evacuation twice daily to prevent urinary

tract infections. Depending on the experiment performed, SCI mice were sacrificed at 30

minutes, 6 and 12 hours, and 3, 4, 7, 14 and 38 days post-contusion. All surgical procedures

were approved by the Laval University Animal Care Committee and followed Canadian

Council on Animal Care guidelines.

138

3.4.3. Immunoblotting For detection of protein levels, a 4-mm spinal cord segment centered over the lesion was

harvested at different time points after injury with extraction buffer (20 mM Tris–HCl, pH:

7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100; 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 1 mM

ethylene glycol tetraacetic acid, 2.5 mM pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate)

containing protease and phosphatase inhibitor cocktails (Sigma). Immunoblot analysis was

carried with the Criterion system (Bio-Rad), as described before (de Rivero Vaccari et al.,

2008), using antibodies to caspase-1 (Imgenex, 1:1000), IL-1β (National Cancer Insitute,

1:10,000), IL-18 (Abcam, 1:1000), P2X4 (Abcam, 1:1000), and P2X7 (Alomone, 1:1000).

Actin (Sigma, 1:10,000) was used as a protein loading control and internal standard.

3.4.4. Flow cytometry Cells freshly isolated from the spinal cord of injured mice were analyzed using flow

cytometry following our previously published method (Pineau et al., 2010). Briefly,

animals were transcardially perfused with cold Hanks' balanced salt solution (HBSS) to

remove immune cells from the vasculature, their spinal cords dissected out, and a 1-cm

segment centered at the site of the lesion isolated and mechanically homogenized with a

small tissue grinder. Cells were filtered through a 40-µm nylon mesh cell strainer (BD

Bioscience, Mississauga, ON, Canada), centrifuged at 200g for 10 min, washed once with

HBSS, and resuspended with HBSS containing 20% fetal bovine serum (FBS; Sigma-

Aldrich Canada Ltd., Oakville, ON, Canada). For multicolor immunofluorescent labeling,

cells were incubated with Mouse Fc Block (i.e., purified anti-mouse CD16/CD32; BD

Bioscience) for 5 min in order to prevent nonspecific binding, followed by labeling for 30

min at room temperature with the following fluorescently conjugated primary antibodies:

PerCP-conjugated anti-CD45 (1:33, BD Biosciences), BD HorizonTM V450-conjugated

anti-CD11b (1:66, BD Biosciences), FITC-conjugated anti-Ly-6C (1:100, BD Biosciences),

PE-Cy7-conjugated anti-Ly-6G (1:100, BD Biosciences), and PE-conjugated anti-7/4 (1:20,

AbD Serotec) (for a full description of these primary antibodies, please refer to our

published work (Nadeau et al., 2011)). Cells were analyzed using FlowJo software (v. 9.2;

Tree Star Inc.) on a FACS LSRII flow cytometer (BD Biosciences). Myeloid cells were

139

identified based on their expression of CD45, CD11b, Ly-6C, and Ly-6G, as follows:

neutrophils, CD45hi CD11b+ Ly-6C+ Ly-6G+; monocyte-derived M1 macrophages, CD45hi

CD11b+ Ly-6Chi Ly-6G-; monocyte-derived M2 macrophages, CD45hi CD11b+ Ly-6C- Ly-

6G-; microglia, CD45dim CD11b+ Ly-6C- Ly-6G- (Babcock et al., 2003; Gordon and Taylor,

2005; Auffray et al., 2007; Nahrendorf et al., 2007). As well, the phenotype of these

myeloid cells was analyzed by flow cytometry using antibodies directed against the

following antigens: APC-conjugated anti-CD11c (1:50, BD Biosciences), Alexa-Fluor 700-

conjugated anti-MHCII (1:100, eBiosciences), PE-conjugated anti-iNOS (1:20, Santa Cruz

Biotechnology), and PE-conjugated anti-COX2 (1:20, Santa Cruz Biotechnology). For the

intracellular detection of iNOS and COX-2, cells were permeabilized in a solution

containing 1% PFA, 0.1% saponin (Sigma-Aldrich Canada Ltd.) and 10 mM HEPES for 30

min at room temperature. Cells were then washed with PBS and stained with either one of

the fluorescently conjugated primary antibodies for an additional 30 min on ice. For all

multi-color experiments, fluorescence-minus-one (FMO) staining was used to define the

cutoff for positivity.

3.4.5. Tissue processing and histology

Spinal cords were collected and prepared as previously described (Pineau and Lacroix,

2007). Briefly, mice were overdosed with a mixture of ketamine-xylazine and

transcardially perfused with 4% paraformaldehyde (PFA), pH 7.4, in PBS. Spinal cords

were dissected out and placed overnight in a PBS/20% sucrose solution. For each animal, a

spinal cord segment of 12 mm centered over the lesion site was cut in several series of 14-

µm-thick coronal sections using a cryostat. For immunohistochemistry against 7/4, mice

were perfused with 0.9% saline solution followed by 4% PFA, pH 9.5, in borax buffer.

Spinal cords were dissected out, post-fixed for 2 days, and placed overnight in a 4% PFA-

borax/10% sucrose solution until processing using a cryostat set at 30 µm thickness. All

sections were collected directly onto slides having a permanent positive charged surface

(Surgipath Canada Inc., Winnipeg, MB, Canada) and stored at -20 °C until use. To identify

the lesion epicenter and quantify lesion volume, one series of adjacent sections was stained

with hematoxylin-eosin (H&E) and luxol fast blue (LFB).

140

3.4.6. Immunohistochemistry and quantification of immunolabeling

Cells expressing P2X4 in the normal and injured spinal cord were identified by confocal

immunofluorescence labeling of the reporter protein beta-galactosidase (β-Gal; dilution

1:20,000, MP Biomedicals), HuC/HuD (to visualize neurons; 1:80, Invitrogen Canada),

NeuN (neurons; 1:250, Millipore), GFAP (astrocytes; 1:100, Invitrogen Canada), and

CD11b (microglia/macrophages; 1:500, AbD Serotec). Alexa Fluor® secondary antibody

conjugates (1:200, Invitrogen Canada) were used as secondary antibodies, whereas 4', 6-

diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI; Invitrogen Canada) was used for nuclear

counterstaining. Immunofluorescence labeling was performed according to our previously

published methods (Barrette et al., 2008). Sections were observed and imaged on a

Fluoview FV1000 confocal microscope system equipped with Ar 488, HeNe1 543, and

HeNe2 633 lasers (Olympus Canada Inc.).

Immunoperoxidase labeling using the anti-7/4 antibody was performed to detect both

neutrophils and proinflammatory M1 macrophages in the spinal cord of injured mice.

Immunoperoxidase labeling was performed on spinal cord tissue sections directly mounted

onto slides using CoverWell incubation chambers (Invitrogen Canada) and our previously

published protocol (Pineau and Lacroix, 2007), with the only difference that sections were

pre-treated for 15 min with proteinase K to improve immunolabeling efficiency. The anti-

7/4 antibody was purchased from AbD Serotec (Raleigh, NC) and used at a dilution of

1:800. Following immunoperoxidase labeling, tissue sections were counterstained with

LFB to visualize damaged areas.

For the quantification of neutrophils and M1 macrophages, the outline of the coronal

section was traced at 20X magnification and a grid of 50 µm x 50 µm positioned over the

spinal cord using the Bioquant Nova Prime software (Bioquant Image Analysis

Corporation, Nashville, TN). All 7/4+ cells were then counted at 20X magnification.

Results were expressed as an average number of positive cells per coronal section.

Macrophage and microglial activity in the injured mouse spinal cord was examined using

the anti-galectin-3 (Gal-3, also referred to as Mac-2) antibody (1:500, ATCC), as described

141

in previous studies (Reichert and Rotshenker, 1999; Kriz et al., 2003; Lalancette-Hebert et

al., 2007). For the quantification, the proportional area of tissue occupied by Gal-3

immunoperoxidase labeling was measured in coronal sections taken at specific distances

from the lesion epicenter. In brief, digital images were collected with a high resolution

Retiga QICAM fast color 1394 camera (1392 x 1040 pixels; QImaging, Burnaby, BC,

Canada) installed on a Nikon Eclipse 80i microscope. Digitized images were then

thresholded using the Bioquant Nova Prime software, such that only immunoperoxidase

labeled product resulted in measurable pixels, and the area occupied by the signal measured

and divided by the total area of the cross-section. All quantifications were done blind with

respect to the identity of the animals and the epineurial layer excluded from analyses.

3.4.7. Behavioral analyses

Recovery of locomotor function after SCI was quantified in an open field using the Basso

Mouse Scale, according to the method developed by Basso et al. (Basso et al., 2006).

Recovery of hindlimb function was also assessed using the grip walk (GW) test, a modified

version of the grid walk or "foot fault" test, following the method recently described by

Pajoohesh-Ganji et al. (Pajoohesh-Ganji et al., 2010). All behavioral analyses were done

blind with respect to the identity of the animals.

3.4.8. Statistical analysis

Statistical evaluations were performed with one- or two-way ANOVA or repeated-

measures ANOVA. Post-ANOVA comparisons were made using the Bonferroni correction.

All statistical analyses were performed using the GraphPad Prism software (GraphPad

Software Inc., San Diego, CA). A p value < 0.05 was considered as statistically significant.

142

3.5. Results

3.5.1. Caspase-1 and IL-1ββ responses are decreased in P2X4-KO mice following SCI

P2X4 and P2X7 receptor expression in the spinal cord was analyzed by immunoblotting in

WT and P2X4-KO mice at 30 min, 6 h and 3 days after SCI (Fig. 3.1). Three days after

SCI, P2X4 expression was significantly elevated in WT animals, whereas P2X4 was not

detected in P2X4-KO mice, thus corroborating that the knockout phenotype was

maintained in this colony of animals. However, although SCI significantly increased levels

of P2X7 by 6 hr after SCI, no significant differences in P2X7 expression were observed

between WT and P2X4-KO mice (Fig. 3.1).

Figure 3.1 P2X4 and P2X7 expression in the normal and injured mouse spinal cord. A, Representative immunoblots of P2X4 and P2X7 receptor expression after SCI. B, Densitometric analysis indicates that P2X4 protein expression is increased after SCI. The P2X4 protein was not detected in P2X4-KO mice. C, P2X7 expression is not altered in P2X4-KO animals when compared to wild type (WT) animals. Moreover, the levels of P2X7 increased at 6 h after SCI (N=5 per group). Data are presented as mean + s.e.m. * p < 0.05 compared to P2X4-KO animals. † P < 0.05 compared to sham animals.

143

As shown in Figure 3.2, active caspase-1 and IL-1β were elevated after SCI in both WT

and ko mice after SCI, but the levels of these proteins were significantly higher in WT

animals when compared to P2X4-KO mice. In contrast, levels of active IL-18 were not

significantly altered following SCI in either WT or P2X4-KO mice. These results indicate

that P2X4 is involved in inflammasome activation after SCI.

Figure 3.2 Increased expression of bioactive caspase-1 and IL-1ß is reduced in the injured spinal cord of P2X4-knockout mice. A, Representative immunoblots of caspase-1, IL-1ββ and IL-18 after SCI. B-D, Densitometric analysis indicates that both caspase-1 (B) and IL-1ββ (C) are decreased in the P2X4-KO when compared to WT animals. Levels of IL-18 (D) are not altered in P2X4-KO animals when compared to WT animals (N=5 per group). Data are presented as mean + s.e.m. * p < 0.05 compared to P2X4-KO animals. † P < 0.05 compared to sham animals.

144

3.5.2. P2X4 is expressed in neurons of the dorsal horn and medial grey

To investigate which cell type(s) express P2X4 in the normal and injured mouse spinal

cord, we took advantage of the fact that the reporter gene ß-Gal was inserted in place of the

first exon of P2X4 in P2X4-KO animals. ß-Gal expression in the mouse spinal cord was

examined using multiple immunofluorescence confocal microscopy. As demonstrated in

Figure 3.3, no ß-Gal signal was detected in the spinal cord of C57BL/6 (negative control)

mice. In contrast, ß-Gal immunostaining was clearly detected in the spinal cord of P2X4-

KO mice, with expression mainly located in the dorsal horn and medial gray areas.

Combination of ß-Gal immunostaining with immunofluorescence markers of neurons

(HuC/HuD), astrocytes (GFAP), and microglia (CD11b) revealed that mostly all ß-Gal+

cells also expressed the neuronal marker HuC/HuD (Fig. 3.3C-E). Importantly, neurons

were found to be the main, if not the only, cell type expressing ß-Gal in both the normal

and injured mouse spinal cord (Fig. 3.3F-H). This expression pattern was observed until at

least day 3 post-SCI, the latest time point examined in colocalization experiments. These

findings were confirmed using a second antibody specific for neurons, NeuN (data not

shown).

145

Figure 3.3 ß-galactosidase staining is localized in neurons in the normal and injured spinal cord of P2X4-KO mice. A-B, Representative confocal photomicrographs showing ß-Gal immunostaining (green) in the spinal cord of naive C57BL/6 (negative control) and P2X4-KO mice. Note that in P2X4-KO mice the ß-Gal reporter gene was inserted in place of the first exon of P2X4, meaning that the P2X4 promoter drives expression of ß-Gal in these animals. C-E, ß-Gal immunoreactivity (ir) colocalized with the neuronal marker HuC/HuD (red, C), but not with GFAP-ir astrocytes (red, D) and CD11b-ir microglia (red, E), in the spinal cord dorsal horn of naive P2X4-KO mice. F-H, ß-Gal expression colocalized with neurons, but not astrocytes and microglia, at 24 hours after SCI. Scale bars = (in B) A-B, 200 µm; (in H) C-H, 20 µm.

146

3.5.3. P2X4 deficiency in neural cells reduces inflammation at sites of SCI

To establish whether the anti-7/4 antibody may be appropriate for analysis of infiltration of

neutrophils and monocyte-derived M1 macrophages using immunohistochemistry, we first

confirmed that the 7/4 antigen (also referred to as Ly-6B (Rosas et al., 2010)) was

expressed in these two subsets of infiltrating myeloid cells, but that it was not present in

activated resident microglia. To accomplish this aim, we used flow cytometry, which

allows simultaneous analysis of several different markers in individual cells in a

quantitative manner. Additionally this approach took advantage of the fact that infiltrating

blood-derived leukocytes and microglia express different levels (high vs. dim) of the

leukocyte common antigen CD45 (Sedgwick et al., 1991; Babcock et al., 2003). As shown

in Figure 3.4A, CD45hi CD11b+ Ly-6C+ Ly-6G+ neutrophils and CD45hi CD11b+ Ly-6Chi

Ly-6G- monocyte-derived M1 macrophages expressed 7/4 at high intensity, whereas the 7/4

antigen was absent in CD45dim CD11b+ Ly-6C- Ly-6G- microglia.

147

Figure 3.4 P2X4 deficiency in neural cells reduces neutrophil and M1 monocyte infiltration at sites of SCI. A, Evaluation of 7/4 as a specific marker for blood-derived neutrophils and M1 macrophages. Expression of 7/4 in neutrophils (green; CD45hi CD11b+ Ly-6C+ Ly-6G+), M1 macrophages (blue; CD45hi CD11b+ Ly-6Chi Ly-6G-), and microglia (red; CD45dim CD11b+ Ly-6C- Ly-6G-) isolated by flow cytometry from the spinal cord of a C57BL/6 mouse at 12 hours post-SCI (data are representative of N=6 mice). The fluorescence-minus-one (FMO) negative control for 7/4 (i.e. all antibodies minus the PE-conjugated anti-7/4 antibody; CD45+CD11b+ gated cells) is shown in the far right panel. B, Quantification of the number of neutrophils and proinflammatory M1 macrophages, as visualized by immunostaining of the 7/4 antigen, at various rostral (R) and caudal (C) distances from the lesion epicenter at 12 hours post-SCI (N=9-11 per group). C-D, Representative bright-field photomicrographs showing 7/4 immunolabeling in the spinal cord of WT (C) and P2X4-KO (D) mice at 12 hours after SCI. The central canal (cc) in panels C-D is identified by dashed lines. E, Representative bright-field photomicrograph showing the absence of 7/4+ cells in the spinal cord of a non-injured WT —> WT chimeric mouse at 12 h post-laminectomy. F, Photomicrograph showing several 7/4+ cells closely associated with spinal cord blood vessels in a WT —> WT chimeric mouse at 6 h post-SCI. Dashed boxes delimit blood vessels. G, Quantification of 7/4+ neutrophils

148

and M1 macrophages in the spinal cord of WT —> WT, WT —> P2X4-KO, and P2X4-KO —> WT bone marrow chimeras at 12 hours post-SCI (N=4 per group). ***p < 0.001, **p < 0.01, and *p < 0.05, significant difference between WT and P2X4-ko mice (B). ***p < 0.001, **p < 0.01, and *p < 0.05, significant difference between WT —> WT and WT —> P2X4-KO chimeric mice (G). †††p < 0.001, ††p < 0.01, and †p < 0.05, significant difference between P2X4-KO —> WT and WT —> P2X4-KO chimeric mice (G). Scale bars: (in D) C-D, 50 µm; (in F) E-F, 50 µm.

To determine whether deficiency in P2X4 affects the immune cell infiltration at the injury

site, we next quantified the number of neutrophils and proinflammatory M1 macrophages

identified by 7/4 immunolabeling in tissue sections from P2X4-KO and WT mice (Fig.

3.4B-D). At 12 hours after SCI, approximately 1123 ± 72 cells expressing the 7/4 marker

were counted at the lesion epicenter in WT mice. This number was reduced by

approximately 25% in P2X4-KO mice, with an average of 855 ± 77 7/4+ cells at the lesion

epicenter. This effect was transient and the numbers of 7/4+ cells at the lesion epicenter

were not significantly different (ANOVA) between the two groups at 4 days post-SCI (data

not shown).

To confirm that P2X4 channels expressed in neural cells (as opposed to in bone marrow-

derived leukocytes) were involved in the initiation of neuroinflammation after SCI, we

investigated immune cell recruitment in irradiation bone marrow chimeras. First, we

confirmed that irradiation did not lead to the infiltration of 7/4+ cells in the spinal cord of

non-injured, laminectomized chimeric mice (Fig. 3.4E). However, the pattern of expression

was dramatically different after SCI in which 7/4+ cells were observed within the

perivascular spaces of spinal cord blood vessels as early as 6 h (Fig. 3.4F). At 12 h post-

SCI, WT mice that were reconstituted with either WT (WT –> WT) or P2X4-deficient

(P2X4-KO –> WT) bone marrow did not show a significant reduction in recruitment of

7/4+ neutrophils and monocyte-derived M1 macrophages (Fig. 3.4G). In contrast, P2X4-KO

mice reconstituted with WT bone marrow (WT –> P2X4-KO) had markedly reduced

immune cell infiltration at the injury site. These results confirm that P2X4 plays an

important role in neural cells, but not in bone marrow-derived cells, in the regulation of

innate immune cell infiltration at sites of SCI. Importantly, this conclusion would not have

been affected even if irradiation would have promoted the infiltration of bone marrow-

149

derived leukocytes in the spinal cord, as was suggested by others (Shechter et al., 2009;

Donnelly et al., 2011).

Using immunohistochemistry against Gal-3, we next examined microglial/macrophage

activation and found that it was reduced by approximately 50% in the spinal cord of P2X4-

KO mice compared with WT mice at 4 days post-SCI (Fig. 3.5A-C). By contrast, these

differences were not observed at 38 days (data not shown). To further explore the role of

P2X4 in the response of microglia and infiltrating macrophages, referred hereinafter as

monocyte-derived macrophages (Kigerl et al., 2009; Shechter et al., 2009), cells were

isolated from the injured spinal cord at 7 and 14 days and then characterized and quantified

by flow cytometry based on expression of the following markers: CD45, CD11b, Ly-6C,

MHCII, CD11c, iNOS, COX-2.

Figure 3.5 P2X4 deficiency attenuates microglial/macrophage activation after SCI. A, Quantification of microglial/macrophage activation, as visualized by galectin-3 immunolabeling, in the spinal cord of P2X4-KO and WT mice at 4 days post-SCI (N=5 per group). B-C, Representative bright-field photomicrographs showing galectin (Gal)-3 immunolabeling in the spinal cord of WT (B) and P2X4-KO (C) mice at a distance of 1176 µm rostral to the lesion at 4 days after SCI. D, Representative flow cytometry profiles showing the presence of monocyte-derived M1 macrophages (M1;

150

CD45hi CD11b+ Ly-6Chi), monocyte-derived M2 macrophages (M2; CD45hi CD11b+ Ly-6C-), neutrophils (N; CD45hi CD11b+ Ly-6C+), and microglia (CD45dim CD11b+ Ly-6C-) in the spinal cord of a C57BL/6 mouse at 7 days post-SCI (representative of N=6 mice per group per time point). CD45 levels (high vs. intermediate) were used to distinguish infiltrating blood-derived CD11b+ myeloid cells (CD45hi CD11b+; boxed region G1) from CD11b+ resident microglia (CD45dim CD11b+; boxed region G2). E, Quantification of proportions of M1 macrophages, M2 macrophages and microglia, relative to total CD45+ CD11b+ myeloid cells, in P2X4-KO and WT mice at 7 and 14 days post-SCI. Also shown in (E) are quantitative analyses of CD11c, MHCII, iNOS and COX-2 expression. ***p < 0.001, **p < 0.01, and *p < 0.05, significant difference between WT and P2X4-KO mice (A, E). Scale bar: (in C) B-C, 250 µm.

As shown in Fig. 3.5D-E, no significant changes in numbers of monocyte-derived M1

macrophages (CD45hi CD11b+ Ly-6Chi), monocyte-derived M2 macrophages (CD45hi

CD11b+ Ly-6C-), and microglia (CD45dim CD11b+ Ly-6C-) were detected between both

groups at 7-14 days post-SCI. With the exception of a modest, but significant, decrease in

the number of iNOS+ cells in the P2X4 group at 7 days, no obvious differences were

observed either in the phenotype of microglia and macrophage subsets between both mouse

strains. In agreement with Donnelly et al. (Donnelly et al., 2011), iNOS was mainly

detected in the CD11b+/Ly-6C- population. All together, these results suggest that the

immune response is attenuated and delayed in SCI P2X4-KO mice, thus supporting a role

of the inflammasome as an initiator of neuroinflammation after SCI.

3.5.4. P2X4-KO mice show improved histopathological outcomes when compared to

wild type mice

To determine if lack of P2X4 expression resulted in decreased tissue damage after SCI in

vivo, various groups of animals were subjected to SCI, sacrificed 4 days after injury and

lesion volume was measured. Spinal cord sections from P2X4-KO mice showed a

significant reduction in lesion volume after SCI when compared to injured WT mice (Fig.

3.6A), as determined by decreased immune cell infiltration, diminished white matter

degeneration and preservation of motor neuron morphology. These results are consistent

151

with the lower levels of inflammasome activation and decrease in IL-1β cytokine

production observed in P2X4-KO mice.

Figure 3.6 Spinal cord lesion volume and recovery of locomotor function are improved in P2X4-KO mice. A P2X4-KO mice had significantly reduced spinal cord tissue damage at 4 days after injury (N=5 per group). B-C, Locomotor function was assessed using the Basso Mouse Scale (BMS) (B) and BMS subscore (C) over a 35-day period after SCI (N=10 mice/group). D, The modified grip walk (GW) test was also used to assess hind-paw function, and the number of hind-paw grips on the grid walk counted at 8, 15, 22, 29 and 36 days post-injury (N=10 mice/group). The GW test was performed using three different patterns: easy, medium, and hard. The total number of grips for the three different patterns is presented in D. E, Impact force (kdyn) and spinal cord tissue displacement (µm) at the time of the contusion injury for all animals included in behavioral analyses. *** p < 0.001, ** p < 0.01, and * p < 0.05 compared

152

with SCI WT (C57BL/6) mice; 2-way repeated-measures ANOVA, Bonferroni post-test.

3.5.5. Functional recovery after SCI is improved in P2X4-KO mice when compared to

wild type mice

We next examined whether deletion of the P2X4 gene affects locomotor recovery after

SCI. Evaluation was performed in an open-field using the 9-point BMS scale and the 11-

point BMS subscores. Uninjured P2X4-KO and WT (C57BL/6) mice performed flawlessly

in these tests and received perfect scores on the BMS and BMS subscore scales. However,

after a moderate (50 kdyn) traumatic SCI (Fig. 3.6B) P2X4-KO mice performed

significantly better than WT mice at 1 and 3 days post-SCI. At 3 days post-SCI, more than

80% of P2X4-KO mice regained occasional plantar stepping (score ≥ 4 on the BMS)

compared with only 30% in control mice. Importantly, significant improvements in specific

aspects of locomotion such as coordination, paw position and trunk stability were observed

between P2X4-KO mice (average subscore of 6.8 ± 0.5 at 35 days post-SCI) and WT mice

(5.0 ± 0.4) at the conclusion of behavioral testing (Fig. 3.6C). Early recovery of forelimb-

hindlimb coordination after SCI was confirmed in P2X4-KO mice compared with WT mice

using the grip walk test (Fig. 3.6D). The severity of SCI was almost identical between both

groups, with an average force applied of 51.9 ± 0.8 kdyn for WT mice vs. 51.9 ± 0.7 kdyn

for P2X4-KO mice (Fig. 3.6E). Moreover, the average spinal cord tissue displacement did

not differ significantly (ANOVA) between groups with 357.6 ± 12.6 µm for WT mice

compared to 392.5 ± 17.4 µm for P2X4-KO mice. Thus, lack of expression of P2X4 results

in improved behavioral outcomes after SCI.

3.6. Discussion In this study, we show that deletion of P2X4 in mice results in decreased innate immune

responses following SCI compared to wild type animals. These decreased inflammatory

responses involve a significant reduction in inflammasome activation in neurons as

determined by decreased cleavage of caspase-1 and production of IL-1β, and decreased

infiltration of innate immune cells into the injury site acutely after SCI. The reduction in

153

inflammatory processes was transient in nature, but resulted in significant improvements in

histopathological and functional outcomes. Our findings suggest that blocking neuronal

P2X4 acutely after SCI may be an effective means to prevent the detrimental effects of

inflammation and loss of neurological function after trauma.

To investigate which CNS cell type(s) express P2X4 in the normal and injured mouse

spinal cord, we took advantage of the finding that the P2X4 promoter drives ß-Gal

expression in P2X4-KO animals. This approach also served to get around the difficult

problem that all commercially available anti-P2X4 antibodies tested produced positive

immunostaining in spinal cord tissue from P2X4-KO mice (de Rivero Vaccari et al.,

personal observation). Therefore, commercial antibodies were not reliable for detection of

P2X4 immunoreactivity in the mouse CNS, but rather ß-Gal immunodetection proved to

better measure of P2X4 cell type expression. Our results demonstrate that the co-

localization of ß-Gal immunostaining was almost exclusively observed within neurons and

not astrocytes or microglia. Thus, in both the normal and injured spinal cord, P2X4 is

mainly expressed in neurons. However, our results do not rule out the possibility that cells

that would normally express P2X4 fail to infiltrate in the spinal cord, either in the control

state or after SCI, due to lack of the receptor. In this case, such cells would not be seen in

ko animals, in spite of their possible relevance to outcome.

We have previously shown that the NOD-like receptor complex NLRP1 inflammasome is

expressed in neurons of the spinal cord. The NLRP1 inflammasome activates caspase-1,

resulting in production of IL-1β and IL-18 (de Rivero Vaccari et al., 2008). In this study,

animals lacking P2X4 showed lower levels of inflammasome activation as determined by

decreased levels of active caspase-1 and IL-1β. However, the levels of IL-18 did not

significantly differ between wild type animals and knockouts. This finding suggests that IL-

1β and IL-18 are regulated by different signaling mechanisms after SCI. In support of this

idea are reports demonstrating that in addition to regulation by the inflammasome, IL-18

levels are influenced by exogenous hormones (Park et al., 2005a; Park et al., 2005b; Park et

al., 2007).

154

P2X4 forms heteromeric interactions with another purinergic receptor, P2X7 (Guo et al.,

2007). In the present study, the protein expression levels of P2X7 were not affected in the

P2X4-KO mice after SCI, suggesting that P2X4 is not necessary for the regulation of P2X7

in the spinal cord. However, P2X7 is an ATP activated receptor involved in the

inflammatory response after SCI (Wang et al., 2004; Peng et al., 2009). Moreover, P2X7

interacts with pannexin-1 and the inflammasome in CNS cells (Silverman et al., 2009).

Therefore, more detailed studies involving protein associations of P2X4 and P2X7 with

inflammasomes are needed to establish more precise regulation of inflammasome responses

after SCI.

Deletion of P2X4 also significantly diminished the number of neutrophils and monocyte-

derived M1 macrophages that infiltrated the injury site after SCI. P2X4-KO animals

showed a 25% decrease in the amount of infiltrated neutrophils and M1 macrophages in the

spinal cord at 12 h post-injury and a 50% decrease in the amount of microglial/macrophage

activation at 4 days. Importantly, studies using irradiation bone marrow chimeras revealed

that the P2X4 was required on radioresistant (i.e. non-bone marrow-derived), but not

radiosensitive (i.e. bone marrow-derived) host cells for modulating innate immune cell

entry into the damaged spinal cord. Taken together with our previous work that showed that

the IL-1R1/MyD88 signaling pathway triggers innate immune cell infiltration after SCI

(Pineau et al., 2010), these results suggest that one of the cellular sources of IL-1β in the

injured spinal cord are neurons and that activation of P2X4 is critical for inflammatory cell

infiltration. The relationship between inflammation and the pathogenesis of SCI remains

controversial in that mounting evidence shows that some subsets of immune cells may

support regeneration whereas others may cause neurotoxicity (Gensel et al., 2009; Kigerl et

al., 2009; Stirling et al., 2009). A recent cell depletion study has demonstrated quite

convincingly that preventing the recruitment of both neutrophils and monocytes that

differentiate into proinflammatory M1 macrophages is beneficial for functional recovery

after injury (Lee et al., 2011).

Previous reports have mainly discussed the effects of ATP stimulation of P2X4 that results

in increased intracellular calcium concentrations, activation of mitogen-activated protein

155

kinases and release of proinflammatory cytokines (Ferrari et al., 1997; Schwiebert et al.,

2002). P2X4 receptor activation has been suggested to mediate synaptic transmission

(North, 2002), and P2X4 signaling may play a critical role in the inflammatory responses in

the pathology of brain tumors, neuropathic pain and multiple sclerosis (Guo et al., 2004;

Guo and Schluesener, 2005; Guo et al., 2006; Ulmann et al., 2008). Our study shows that

P2X4-KO animals have lower levels of caspase-1 activation and IL-1β cleavage, resulting

in significant improvement in tissue sparing and functional recovery. The improvements in

functional outcomes were predominantly observed during the first week post-injury,

suggesting that the deleterious inflammatory processes mediated by P2X4 activation occur

during the acute phase after SCI. Interestingly, only neurons were found to express P2X4 in

the spinal cord during the acute phase after SCI. However, other groups have reported that

activated microglia in the spinal cord upregulate P2X4 expression after peripheral (sciatic)

nerve injury, although the increased expression peaked during the second week post-lesion

in this particular model (Cavaliere et al., 2003; Tsuda et al., 2003; Schwab et al., 2005;

Ulmann et al., 2008). In the chronic phase after SCI, P2X4 does not seem to play a

significant role, yet the improved functional recovery observed in P2X4-KO compared with

wild type mice was maintained up to at least day 35. We propose that blocking neuronal

P2X4 early after SCI may be an effective means for preventing the detrimental effects of

inflammation and loss of neurological function in a variety of CNS injuries including

traumatic brain injury, ischemia and SCI.

3.7. References

Auffray C, Fogg D, Garfa M, Elain G, Join-Lambert O, Kayal S, Sarnacki S, Cumano A,

Lauvau G, Geissmann F (2007) Monitoring of blood vessels and tissues by a

population of monocytes with patrolling behavior. Science 317:666-670.

Babcock AA, Kuziel WA, Rivest S, Owens T (2003) Chemokine expression by glial cells

directs leukocytes to sites of axonal injury in the CNS. J Neurosci 23:7922-7930.

Barrette B, Hebert MA, Filali M, Lafortune K, Vallieres N, Gowing G, Julien JP, Lacroix S

(2008) Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J Neurosci 28:9363-

9376.

156

Basso DM, Fisher LC, Anderson AJ, Jakeman LB, McTigue DM, Popovich PG (2006)

Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord

injury in five common mouse strains. J Neurotrauma 23:635-659.

Buell G, Lewis C, Collo G, North RA, Surprenant A (1996) An antagonist-insensitive P2X

receptor expressed in epithelia and brain. EMBO J 15:55-62.

Burnstock G (2007) Physiology and pathophysiology of purinergic neurotransmission.

Physiol Rev 87:659-797.

Casas-Pruneda G, Reyes JP, Perez-Flores G, Perez-Cornejo P, Arreola J (2009) Functional

interactions between P2X4 and P2X7 receptors from mouse salivary epithelia. J

Physiol 587:2887-2901.

Cavaliere F, Florenzano F, Amadio S, Fusco FR, Viscomi MT, D'Ambrosi N, Vacca F,

Sancesario G, Bernardi G, Molinari M, Volonte C (2003) Up-regulation of P2X2,

P2X4 receptor and ischemic cell death: prevention by P2 antagonists. Neuroscience

120:85-98.

Coull JA, Beggs S, Boudreau D, Boivin D, Tsuda M, Inoue K, Gravel C, Salter MW, De

Koninck Y (2005) BDNF from microglia causes the shift in neuronal anion gradient

underlying neuropathic pain. Nature 438:1017-1021.

de Rivero Vaccari JP, Lotocki G, Marcillo AE, Dietrich WD, Keane RW (2008) A

molecular platform in neurons regulates inflammation after spinal cord injury. J

Neurosci 28:3404-3414.

Donnelly DJ, Longbrake EE, Shawler TM, Kigerl KA, Lai W, Tovar CA, Ransohoff RM,

Popovich PG (2011) Deficient CX3CR1 signaling promotes recovery after mouse

spinal cord injury by limiting the recruitment and activation of Ly6Clo/iNOS+

macrophages. J Neurosci 31:9910-9922.

Ferrari D, Chiozzi P, Falzoni S, Dal Susino M, Melchiorri L, Baricordi OR, Di Virgilio F

(1997) Extracellular ATP triggers IL-1 beta release by activating the purinergic P2Z

receptor of human macrophages. J Immunol 159:1451-1458.

Gensel JC, Nakamura S, Guan Z, van Rooijen N, Ankeny DP, Popovich PG (2009)

Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci

29:3956-3968.

157

Gordon S, Taylor PR (2005) Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol

5:953-964.

Guo C, Masin M, Qureshi OS, Murrell-Lagnado RD (2007) Evidence for functional

P2X4/P2X7 heteromeric receptors. Mol Pharmacol 72:1447-1456.

Guo LH, Schluesener HJ (2005) Lesional accumulation of P2X(4) receptor(+) macrophages

in rat CNS during experimental autoimmune encephalomyelitis. Neuroscience

134:199-205.

Guo LH, Trautmann K, Schluesener HJ (2004) Expression of P2X4 receptor in rat C6

glioma by tumor-associated macrophages and activated microglia. J Neuroimmunol

152:67-72.

Guo LH, Guo KT, Wendel HP, Schluesener HJ (2006) Combinations of TLR and NOD2

ligands stimulate rat microglial P2X4R expression. Biochem Biophys Res Commun

349:1156-1162.

Kigerl KA, Gensel JC, Ankeny DP, Alexander JK, Donnelly DJ, Popovich PG (2009)

Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing

either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. J Neurosci

29:13435-13444.

Kriz J, Gowing G, Julien JP (2003) Efficient three-drug cocktail for disease induced by

mutant superoxide dismutase. Ann Neurol 53:429-436.

Lalancette-Hebert M, Gowing G, Simard A, Weng YC, Kriz J (2007) Selective ablation of

proliferating microglial cells exacerbates ischemic injury in the brain. J Neurosci

27:2596-2605.

Lee SM, Rosen S, Weinstein P, van Rooijen N, Noble-Haeusslein LJ (2011) Prevention of

both neutrophil and monocyte recruitment promotes recovery after spinal cord

injury. J Neurotrauma 28:1893-1907.

Nadeau S, Filali M, Zhang J, Kerr BJ, Rivest S, Soulet D, Iwakura Y, de Rivero Vaccari JP,

Keane RW, Lacroix S (2011) Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury is

Dependent on the Pro-Inflammatory Cytokines IL-1{beta} and TNF: Implications

for Neuropathic Pain. J Neurosci 31:12533-12542.

Nahrendorf M, Swirski FK, Aikawa E, Stangenberg L, Wurdinger T, Figueiredo JL, Libby

P, Weissleder R, Pittet MJ (2007) The healing myocardium sequentially mobilizes

158

two monocyte subsets with divergent and complementary functions. J Exp Med

204:3037-3047.

North RA (2002) Molecular physiology of P2X receptors. Physiol Rev 82:1013-1067.

Pajoohesh-Ganji A, Byrnes KR, Fatemi G, Faden AI (2010) A combined scoring method to

assess behavioral recovery after mouse spinal cord injury. Neurosci Res 67:117-

125.

Park HJ, Kim HJ, Lee JY, Cho BK, Gallo RL, Cho DH (2007) Adrenocorticotropin

hormone stimulates interleukin-18 expression in human HaCaT keratinocytes. J

Invest Dermatol 127:1210-1216.

Park HJ, Kim HJ, Lee JH, Lee JY, Cho BK, Kang JS, Kang H, Yang Y, Cho DH (2005a)

Corticotropin-releasing hormone (CRH) downregulates interleukin-18 expression in

human HaCaT keratinocytes by activation of p38 mitogen-activated protein kinase

(MAPK) pathway. J Invest Dermatol 124:751-755.

Park HS, Kim Y, Lee C (2005b) Single nucleotide variants in the beta2-adrenergic and

beta3-adrenergic receptor genes explained 18.3% of adolescent obesity variation. J

Hum Genet 50:365-369.

Peng W, Cotrina ML, Han X, Yu H, Bekar L, Blum L, Takano T, Tian GF, Goldman SA,

Nedergaard M (2009) Systemic administration of an antagonist of the ATP-

sensitive receptor P2X7 improves recovery after spinal cord injury. Proc Natl Acad

Sci U S A 106:12489-12493.

Pineau I, Lacroix S (2007) Proinflammatory cytokine synthesis in the injured mouse spinal

cord: Multiphasic expression pattern and identification of the cell types involved. J

Comp Neurol 500:267-285.

Pineau I, Sun L, Bastien D, Lacroix S (2010) Astrocytes initiate inflammation in the injured

mouse spinal cord by promoting the entry of neutrophils and inflammatory

monocytes in an IL-1 receptor/MyD88-dependent fashion. Brain Behav Immun

24:540-553.

Reichert F, Rotshenker S (1999) Galectin-3/MAC-2 in experimental allergic

encephalomyelitis. Exp Neurol 160:508-514.

159

Rosas M, Thomas B, Stacey M, Gordon S, Taylor PR (2010) The myeloid 7/4-antigen

defines recently generated inflammatory macrophages and is synonymous with Ly-

6B. J Leukoc Biol 88:169-180.

Schwab JM, Guo L, Schluesener HJ (2005) Spinal cord injury induces early and persistent

lesional P2X4 receptor expression. J Neuroimmunol 163:185-189.

Schwiebert LM, Rice WC, Kudlow BA, Taylor AL, Schwiebert EM (2002) Extracellular

ATP signaling and P2X nucleotide receptors in monolayers of primary human

vascular endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol 282:C289-301.

Sedgwick JD, Schwender S, Imrich H, Dorries R, Butcher GW, ter Meulen V (1991)

Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and

inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A 88:7438-7442.

Shechter R, London A, Varol C, Raposo C, Cusimano M, Yovel G, Rolls A, Mack M,

Pluchino S, Martino G, Jung S, Schwartz M (2009) Infiltrating blood-derived

macrophages are vital cells playing an anti-inflammatory role in recovery from

spinal cord injury in mice. PLoS Med 6:e1000113.

Silverman WR, de Rivero Vaccari JP, Locovei S, Qiu F, Carlsson SK, Scemes E, Keane

RW, Dahl G (2009) The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons

and astrocytes. J Biol Chem 284:18143-18151.

Soto F, Garcia-Guzman M, Gomez-Hernandez JM, Hollmann M, Karschin C, Stuhmer W

(1996) P2X4: an ATP-activated ionotropic receptor cloned from rat brain. Proc Natl

Acad Sci U S A 93:3684-3688.

Stirling DP, Liu S, Kubes P, Yong VW (2009) Depletion of Ly6G/Gr-1 leukocytes after

spinal cord injury in mice alters wound healing and worsens neurological outcome.

J Neurosci 29:753-764.

Tsuda M, Shigemoto-Mogami Y, Koizumi S, Mizokoshi A, Kohsaka S, Salter MW, Inoue

K (2003) P2X4 receptors induced in spinal microglia gate tactile allodynia after

nerve injury. Nature 424:778-783.

Ulmann L, Hatcher JP, Hughes JP, Chaumont S, Green PJ, Conquet F, Buell GN, Reeve

AJ, Chessell IP, Rassendren F (2008) Up-regulation of P2X4 receptors in spinal

microglia after peripheral nerve injury mediates BDNF release and neuropathic

pain. J Neurosci 28:11263-11268.

160

Wang X, Arcuino G, Takano T, Lin J, Peng WG, Wan P, Li P, Xu Q, Liu QS, Goldman

SA, Nedergaard M (2004) P2X7 receptor inhibition improves recovery after spinal

cord injury. Nat Med 10:821-827.

Weinhold K, Krause-Buchholz U, Rodel G, Kasper M, Barth K (2010) Interaction and

interrelation of P2X7 and P2X4 receptor complexes in mouse lung epithelial cells.

Cell Mol Life Sci 67:2631-2642.

Zhang Z, Artelt M, Burnet M, Trautmann K, Schluesener HJ (2006) Lesional accumulation

of P2X4 receptor+ monocytes following experimental traumatic brain injury. Exp

Neurol 197:252-257.

161

4. Chapitre 4

IL-1α gene deletion protects oligodendrocytes after spinal cord injury through upregulation of survival factor Tox3

Dominic Bastien1, Victor Bellver Landete1, Martine Lessard1, Nicolas Vallières1, Akira Takashima2, Yannick Doyon1, and Steve Lacroix1

1Centre de recherche du Centre hospitalier de l'Université Laval and Département de Médecine Moléculaire, Université Laval, Québec, Québec, Canada; 2Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Toledo College of Medicine, Toledo, OH, USA

162

4.1. Résumé Les lésions de la moelle épinière (LME) entraînent la relâche de signaux de danger par les

cellules nécrotiques, un processus qui mène à la neuroinflammation. Des études suggèrent

que l’inflammation joue un role dans les dommages mais aussi dans la réparation du tissu

nerveux. Dans notre étude, nous avons étudié la synthèse, la relâche et les fonctions de

l’IL-1α et l’IL-1β dans la neuroinflammation, les dommages tissulaires et la récupération

locomotrice suite à une LME. Nous avons démontré que les microglies situées au site de

lésion expriment rapidement l’IL-1α, tandis que les neutrophiles (Ly6G+ 7/4+) et les

macrophages dérivés des monocytes infiltrants (Ly6Chi 7/4+) produisent l’IL-1β. Bien que

l’infiltration de ces 2 types cellulaires fut également réduite chez les souris Il-1α-/- et Il-1β-

/- comparée aux souris sauvages, les souris Il-1α-/- présentaient une plus grande

amélioration locomotrice dès le jour 1 post-LME. Cette récupération a persisté à travers le

temps et corrélé avec un volume de lésion plus petit. L’analyse du transcriptome des

cellules du tissus nerveux à 1 jour post-LME a permis d’identifier 18 transcrits qui furent

différentiellement régulés chez les souris Il-1α-/- comparativement aux souris Il-1β-/- et

sauvages, parmi lesquels se retrouve le facteur de survie cellulaire TOX3. En absence d’IL-

1a, les souris ont présenté des niveaux plus élevés de TOX3 dans leurs oligodendrocytes et

ce dès le jour 10 post-natal, un effet qui a persisté jusqu’à l’âge adulte. L’analyse de la

moelle épinière en développement de souris sauvages a révélé que les niveaux d’ARNm de

l’IL-1α mais pas de l’IL-1β augmentent drastiquement entre les jours P5 et P10, coïncidant

avec une période critique de l’activation microgliale et de l’initiation de la myélinisation.

Chez les souris Il-1α-/- adultes, la survie des oligodendrocytes fut significativement plus

élevée comparativement aux sourisIl-1β-/- et sauvages au jour 1 post-LME. Nous avons

donc démontré pour la première fois que l’absence de l’IL-1α chez la souris réduit

l’expression du facteur de survie TOX3 chez les oligodendrocytes, suggérant que

l’inhibition de cette cytokine pourrait réduire la dégénérescence suite à un traumatisme du

SNC ou certaines maladies neurodégénératives.

163

4.2. Abstract Spinal cord injury (SCI) causes the release of danger signals by stressed and dying cells, a

process that leads to neuroinflammation. Evidence suggests that inflammation plays a role

in both damage and repair of injured neural tissue. Here, we have studied the synthesis,

release mechanisms and function of IL-1α and IL-1β in neuroinflammation, tissue damage

and recovery after SCI. We found that microglia at sites of injury rapidly express IL-1α,

and that infiltrating Ly6G+ 7/4+ neutrophils and Ly6Chi 7/4+ monocyte-derived M1

macrophages subsequently produce IL-1β. While infiltration of these two cell types was

equally reduced in IL-1α-/- and IL-1β-/- mice compared to wild-type (WT), IL-1α-/- mice

exhibited better locomotor recovery as early as day 1 post-SCI. This early recovery seen in

IL-1α-/- mice persisted over time and correlated with reduced lesion volume. Transcriptome

analysis of SCI tissue at day 1 identified 18 transcripts differentially regulated in IL-1α-/-

mice compared with IL-1β-/- and WT, among which is the survival factor TOX3. IL-1α-/-

mice have markedly increased levels of TOX3 in their oligodendrocytes, beginning at

postnatal day (P) 10 and persisting through adulthood. An examination of the developing

spinal cord of WT mice revealed that mRNA levels for IL-1α, but not IL-1β, are

dramatically increased between P5 and P10, coinciding with a critical period of microglial

activation and the beginning of myelination. In adult spinal cord of IL-1α-/- mice,

oligodendrocyte survival was significantly increased compared to IL-1β-/- and WT at day 1

post-SCI. Thus, we show for the first time that IL-1α represses expression of the survival

factor TOX3 in oligodendrocytes, suggesting that inhibiting IL-1α may help reduce

neurodegeneration during CNS insult and neurodegenerative disease.

164

4.3. Introduction Spinal cord injury (SCI) can lead to loss of motor and sensory function in the lower and/or

upper limbs. At the site of injury, the pathology is divided into two major chronological

events: the primary and secondary lesions. The second wave of tissue destruction that

follows the primary mechanical insult is believed to be caused by a complex series of

events leading to apoptosis, including ischemia, vascular damage, glutamate excitotoxicity,

ionic dysregulation, inflammation, free radical generation, and cytokine and protease

production (David and Lacroix, 2005). Damage to the CNS is associated with an almost

immediate response of microglia (Davalos et al., 2005). Astrocytes, the main cellular

component of the glial scar, also react quickly by exhibiting changes in gene expression,

hypertrophy, and process extension (Sofroniew, 2009). The glial scar has been shown to

have both protective and detrimental functions in the context of SCI (Faulkner et al., 2004,

Brambilla et al., 2005, Brambilla et al., 2009).

Innate immune cells such as neutrophils and monocytes are rapidly recruited at sites of SCI

(Fleming et al., 2006, Stirling and Yong, 2008, Pineau et al., 2010, Lee et al., 2011, Thawer

et al., 2013). Evidence suggests that these cells could play a key role in both damage and

repair of neural tissue after an injury or ischemia (Barrette et al., 2008, Kigerl et al., 2009,

Shechter et al., 2009, Stirling et al., 2009, Allen et al., 2012). The apparent contradictions

between these studies may be due to the fact that different subsets of immune cells have

divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured spinal cord

(David and Kroner, 2011, Bastien and Lacroix, 2014). A better understanding of the roles

of the various subsets of immune cells and the identification of the endogenous factors

stimulating their recruitment is key for the development of efficient immunotherapies.

One important family of cytokines playing a key role in neurodegeneration is the

interleukin (IL)-1 family (Allan and Rothwell, 2001, Allan et al., 2005). Two of the

members of this large family, IL-1α and IL-1β, are believed to exert similar

proinflammatory actions by binding to the IL-1 type I receptor (IL-1R1). Work done by the

Rock group has shown that IL-1α rather than IL-1β is required for neutrophil recruitment

during cell death-induced sterile inflammation (Chen et al., 2007). However, a more recent

165

study by the same group now suggests that both IL-1α and IL-1β produced by tissue

resident macrophages are important for this response (Kono et al., 2010).

IL-1β has been proven to be important in the development and progression of a number of

autoinflammatory and CNS diseases (Allan et al., 2005, Dinarello, 2011). Apart from its

role in the initiation of gliosis and inflammation (Basu et al., 2002), studies have linked IL-

1β to the production of growth factors by CNS resident cells in various disease/injury

models (Herx et al., 2000, Albrecht et al., 2002, Albrecht et al., 2003, Amankulor et al.,

2009). Other evidence indicates that IL-1β likely plays an important role in CNS

remyelination by regulating multiple stages of oligodendrocyte development (Mason et al.,

2001).

In this study, we have analyzed the source, synthesis and release mechanisms, and

roles of IL-1α and IL-1β in the context of traumatic SCI. Furthermore, we have identified

some of the genes and proteins that are regulated by these two cytokines after SCI. Finally,

we have evaluated the effects of blocking IL-1α and IL-1β on neuroinflammation, tissue

damage and functional recovery. Importantly, we uncovered a dual role for IL-1α not only

in promoting neuroinflammation after SCI, but also in repressing a key survival factor in

oligodendrocytes. Blocking this cytokine may therefore be a promising therapeutical

avenue to prevent loss of CNS cells following SCI and other neurodegenerative conditions.

4.4. Materials and methods

4.4.1. Animal A total of 249 adult mice were used in this study. C57BL/6 mice, used as controls, were

purchased from Charles River Laboratories (St-Constant, QC, Canada). IL-1α-, IL-1β-, and

IL-1α/β-knockout (KO) were obtained from Dr. Yoichiro Iwakura (Institute of Medical

Science, University of Tokyo, Japan) and have been previously described (Horai et al.,

1998). Breeders for the pIL1β-DsRed transgenic mouse line were obtained from Dr. Akira

Takashima (University of Toledo College of Medicine, Toledo, OH) and bred in-house at

166

the Animal Research Facility of the CHUL Research Center and genotyped according to

the method published by Matsushima et al. (Matsushima et al., 2010). Finally, CX3CR1-

eGFP transgenic mice were purchased from The Jackson Laboratory. All mice had free

access to food and water.

4.4.2. Spinal cord injury C57BL/6 (n = 65), IL-1α-KO (n = 67), IL-1β-KO (n = 65), IL-1α/β-KO (n = 26), pIL1β-

DsRed (n = 8) and CX3CR1-eGFP (n = 18) mice were anesthetized with isoflurane and

underwent a laminectomy at vertebral level T9-10, which corresponds to spinal segment

T10-11. Briefly, the vertebral column was stabilized and a contusion of 50 kdyn was

performed using the Infinite Horizon (IH) SCI device (Precision Systems &

Instrumentation, Lexington, KY). Animals used for quantification of immune cells, either

by IF or by flow cytometry, received a 70-kdyn injury. Overlying muscular layers were

then sutured and cutaneous layers stapled. Post-operatively, animals received manual

bladder evacuation twice daily to prevent urinary tract infections. Depending on the

experiment performed, SCI mice were sacrificed by perfusion at 1, 3, 4, 6, 12 and 24 hours,

and 3, 4 and 36 days post-contusion. All surgical procedures were approved by the Laval

University Animal Care Committee and followed Canadian Council on Animal Care

guidelines.

4.4.3. Flow cytometry Cells freshly isolated from the spinal cord of injured mice were analyzed using flow

cytometry following our previously published method (De Rivero Vaccari et al., 2012).

Briefly, animals were transcardially perfused with cold Hanks’ balanced salt solution

(HBSS) to remove immune cells from the vasculature, their spinal cords dissected out, and

a 1-cm segment centered at the site of the lesion isolated and mechanically homogenized

with a small tissue grinder. Cells were filtered through a 40-µm nylon mesh cell strainer

(BD Bioscience, Mississauga, ON, Canada), centrifuged at 200g for 10 min, washed once

with HBSS, and resuspended with HBSS containing 20% fetal bovine serum (FBS; Sigma-

Aldrich Canada Ltd.). For multicolor immunofluorescent labeling, cells were incubated

167

with Mouse Fc Block (i.e., purified anti-mouse CD16/CD32; BD Bioscience) for 5 min in

order to prevent nonspecific binding, followed by labeling for 30 min at room temperature

with the following fluorescently conjugated primary antibodies: PerCP-conjugated anti-

CD45 (1:33, BD Biosciences), BD HorizonTM V450-conjugated anti-CD11b (1:66, BD

Biosciences), FITC-conjugated anti-Ly-6C (1:100, BD Biosciences), PE-Cy7-conjugated

anti-Ly-6G (1:100, BD Biosciences), and PE-conjugated anti-7/4 (1:20, AbD Serotec) (for

a full description of these primary antibodies, please refer to our published work (Nadeau et

al., 2011)). Cells were analyzed using FlowJo software (v. 9.2; Tree Star Inc.) on a FACS

LSRII flow cytometer (BD Biosciences). Myeloid cells were identified based on their

expression of CD45, CD11b, Ly-6C, and Ly-6G, as follows: neutrophils, CD45hi CD11b+

Ly-6C+ Ly-6G+; monocyte-derived M1 macrophages, CD45hi CD11b+ Ly-6Chi Ly-6G-;

microglia, CD45dim CD11b+ Ly-6C- Ly-6G- (De Rivero Vaccari et al., 2012).

4.4.4. Tissue processing and histology Spinal cords were collected and prepared as previously described (Pineau and Lacroix,

2007). Briefly, mice were overdosed with a mixture of ketamine-xylazine and

transcardially perfused with 4% paraformaldehyde (PFA), pH 7.4, in PBS. Spinal cords

were dissected out and placed overnight in a PBS/30% sucrose solution. For each animal, a

spinal cord segment of 12 mm centered over the lesion site was cut in 7 series of 14-µm-

thick coronal sections using a cryostat. For immunohistochemistry against 7/4 (also

referred to as Ly-6B, see (Rosas et al., 2010)) and Ly-6G and experiments involving in situ

hybridization (ISH), mice were perfused with 0.9% saline solution followed by 4% PFA,

pH 9.5, in borax buffer. Spinal cords were dissected out, post-fixed for 2 days, and placed

overnight in a 4% PFA-borax/10% sucrose solution until processing using a cryostat set at

30 µm thickness. All sections were collected directly onto Surgipath X-tra microslides

having a permanent positive charged surface (Leica Microsystems Canada, Concord, ON,

Canada) and stored at -20 °C until use. To identify the lesion epicenter and quantify lesion

volume, one series of adjacent sections was immunostained using a rabbit anti-GFAP

(mouse) antibody (1:750 dilution, Dako Canada Inc., Burlington, ON, Canada) and then

counterstained with 4', 6-diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI; 1 µg/ml, Life

168

Technologies Inc., Burlington, ON, Canada) and FluoroMyelinTM red fluorescent myelin

stain (1:300 dilution, Life Technologies Inc.).

4.4.5. Immunohistochemistry and quantification

Cells expressing IL-1α were identified by confocal IF labeling using a goat anti-mouse IL-

1α polyclonal antibody (1:100 dilution, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN), and co-

localized with markers of microglia such as ionized calcium-binding adaptor molecule 1

(Iba1; 1:750 dilution, Wako Chemicals USA, Richmond, VA) and the GFP reporter

expressed under the control of the CX3CR1 promoter (CX3CR1-eGFP transgenic mice).

The astroglial scar was visualized using the anti-GFAP antibody described above. Alexa

Fluor® secondary antibody conjugates (1:250, Life Technologies Inc.) were used as

secondary antibodies, whereas DAPI was used for nuclear counterstaining.

Immunofluorescence labeling was performed according to our previously published

methods (De Rivero Vaccari et al., 2012). Sections were observed and imaged on an

Olympus IX81 Fluoview FV1000 confocal microscope system equipped with 488 nm, 543

nm, and 633 nm lasers (Olympus Canada Inc.). Quantification of double-labeled cells was

performed manually at 40x using the Olympus confocal microscope. Results were

presented as the percent of IL-1α-positive (+) cells that expressed each of the two

microglial markers (Iba1, GFP).

TOX3 protein expression was visualized by confocal IF microscopy using a rabbit

polyclonal anti-TOX3 antibody (1:100 dilution, Novus Biologicals Canada ULC, Oakville,

ON, Canada). Colocalization of TOX3 in neurons, oligodendrocytes and endothelial cells

was performed using the neuron-specific markers NeuN (1:250 dilution, EMD Millipore,

Billerica, MA) and HuC/HuD (1:80 dilution, Life Technologies Inc.), the oligodendrocyte

marker CC-1 (also referred to as anti-APC; 1/500 dilution, Abcam) and the endothelial cell

marker CD31 (also referred to as PECAM-1; 1:750 dilution, BD Biosciences), respectively.

For the quantification of NeuN+ neurons and CC1+ oligodendrocytes expressing or not

TOX3, the number of labeled cells was estimated by the optical fractionator method using

the Bioquant Nova Prime software (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN)

169

on video images transmitted by a high-resolution Retiga QICAM fast color 1394 camera

(1392 x 1040 pixels, QImaging, Burnaby, BC, Canada) installed on a Nikon Eclipse 80i

microscope. For this, the outline of the coronal section (for the quantification of neurons) or

spinal white matter (for the quantification of oligodendrocytes) was traced at 10X and then

sampled at 40X magnification. The counting parameters were as follows: sampling grid

size, 150 x 150 µm; counting frame size, 50 x 50 µm, and; dissector height, 14 µm. Cells

were counted only if their nuclei laid within the dissector area, did not intersect forbidden

lines, and came into the focus as the optical plane moved through the height of the

dissector. Quantification was performed on a total of 9 equally spaced sections (294 µm

apart) spanning 3 mm centered at the lesion epicenter, as we noted in our previous work

that the lesion normally extends over approximately 3 mm in mice that received a 50-kdyn

SCI contusion. For each section, the total number of positively-stained cells was calculated

by multiplying the total volume of the coronal section or spinal cord white matter, as

measured using the Bioquant Nova Prime software, by the average number of cells per

mm3. A relative number of cells that survived the trauma was then estimated by adding the

total number of positively-stained cells counted in each of the 9 sections encompassing the

lesion.

Immunoperoxidase labeling using the anti-7/4 antibody was performed to detect both

neutrophils and proinflammatory M1 macrophages in the spinal cord of injured mice, as

this antibody was recently shown to be specific for detecting these two cell types in SCI

tissue (De Rivero Vaccari et al., 2012). Immunoperoxidase labeling was performed on

spinal cord tissue sections directly mounted onto slides using CoverWell incubation

chambers (Life Technologies Inc.) and our previously published protocol (Pineau and

Lacroix, 2007), with the only difference that sections were pre-treated for 15 min with

proteinase K to improve immunolabeling efficiency. The anti-7/4 antibody was purchased

from AbD Serotec (Raleigh, NC) and used at a dilution of 1:800. Following

immunoperoxidase labeling, tissue sections were counterstained with Luxol Fast blue

(LFB) to visualize damaged areas. For the quantification of neutrophils and M1

macrophages, the outline of the coronal section was traced at 10X magnification, as

described above, and a grid of 50 µm x 50 µm positioned over the spinal cord using the

170

Bioquant Nova Prime software. All 7/4+ cells were then counted at 20X magnification.

Results were expressed as an average number of positive cells per coronal section.

All quantifications were done blind with respect to the identity of the animals and the

epineurial layer excluded from analyses.

4.4.6. In situ hybridization (ISH) ISH was carried out to detect mRNAs coding for IL-1α and IL-1ß, following our

previously published method (Pineau and Lacroix, 2007).

4.4.7. Lesion volume analysis The calculation of areas of tissue damage and lesion volume after SCI was performed on 1

series of adjacent sections within a predetermined spinal cord segment, including the lesion

epicenter and sections located up to approximately 1 mm distal to the center of the lesion in

both directions (i.e., rostral and caudal). Fourteen-µm-thick coronal sections were first

immunostained for GFAP and then counterstained with DAPI and FluoroMyelinTM to

visualize the glial scar and identify gray and white matter sparing, respectively. The

analysis was performed using the BioQuant Nova Prime computerized image analysis

system (Bioquant Topographer XP plug-in; Nashville, TN). In each section, the total area

of the coronal section was first determined by manually tracing the contour at low

magnification. Next, the outline of necrotic and damaged tissue was traced at higher

magnifications. Areas where normal spinal cord architecture was absent and areas

containing cellular and myelin debris surrounded by the astroglial scar were considered as

areas of tissue damage. The Topographer (Atlas Shop and Atlas Modeler) offered with the

Bioquant program was then used to reconstruct the injured spinal cord and measure lesion

volume.

171

4.4.8. Microarray analysis Spinal cord segments of 6 mm-long centered over the lesion were rapidly dissected, frozen

in liquid nitrogen, and stored at -80°C until RNA extraction. Total RNA was isolated by

TRI Reagent and purified with the GenElute mammalian total RNA miniprep kit (Sigma-

Aldrich Canada Ltd.). Ten µg of total RNA was converted to complementary DNA (cDNA)

using SuperScriptTM Reverse Transcriptase (Life Technologies Inc.), and T7-oligo-d(T)24

(Geneset, La Jolla, CA) as a primer. Second-strand synthesis was performed using T4 DNA

polymerase and E. coli DNA ligase and then blunt-ended by T4 polynucleotide kinase.

cDNA was purified by phenol-chloroform extraction using Phase Lock Gel (Brinkmann

Instruments Inc., Westbury, NY), then in vitro transcribed for 16 h at 37°C using the IVT

Labeling Kit (Affymetrix, Santa Clara, CA) to produce biotinylated cRNA. Biotin-labeled

cRNA was purified using the RNeasy Mini Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA) and

fragmented to a size range of 30-200 nt using fragmentation buffer. The quality of total

RNA, cDNA synthesis, cRNA amplification, and cRNA fragmentation was monitored by

microcapillary electrophoresis (Bioanalyzer 2100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA).

Fifteen µg of fragmented cRNA was hybridized for 16 h at 45°C with constant rotation on a

GeneChip® Mouse Gene 1.0 ST Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). After hybridization,

microarrays (n = 12) were processed using the Affymetrix GeneChip Fluidic Station 450

(protocol EukGE-WS2v5_450). In brief, staining was made with streptavidin-conjugated

phycoerythrin (SAPE; Life Technologies Inc.), followed by amplification with a

biotinylated anti-streptavidin antibody (Life Technologies Inc.), and by a second round of

SAPE staining. Microarrays were scanned using a GeneChip Scanner 3000 G7

(Affymetrix) enabled for high-resolution scanning. Images were extracted with the

GeneChip Operating Software (Affymetrix GCOS v1.4). Quality control of microarrays

was performed using the AffyQCReport software (Gautier et al., 2004).

Background subtraction and normalization of probe set intensities was performed using the

method of Robust Multiarray Analysis (RMA) described by Irizarry et al. (Irizarry et al.,

2003). To identify differentially expressed genes, gene expression intensity was compared

using an ANOVA test with a significance threshold < 0.001 and fold change of ≥ 1.5, and a

Bayes smoothing approach developed for a low number of replicates (Smyth, 2004). False

172

discovery rate (FDR) < 0.2 was used to adjust for multiple testing. This analysis was

performed using the AffylmGUI Graphical User Interface for the LIMMA microarray

package (Wettenhall et al., 2006), and Partek Genomics Suite (Partek Incorporated, St-

Louis, MO). All microarray data compliant with the MIAME guidelines

(http://www.mged.org/) were deposited in the Gene Expression Omnibus (GEO) database

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), Accession Number GSE22291.

4.4.9. Real time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) Quantitative RT-PCR was used to validate microarray data for selected candidate genes

found to be preferentially upregulated in the injured spinal cord of IL-1α-KO compared

with IL-1β-KO and C57BL/6 mice. Total RNA was isolated from spinal cords

(exsanguinated by intracardiac perfusion with saline) using the TRIzol method following

the manufacturer’s protocol (Life Technologies Inc.). RNA quantity and quality were

assessed using the RNA 6000 Nano LabChip and Agilent Bioanalyzer 2100. First-strand

cDNA synthesis was accomplished using 5 µg of isolated RNA in a reaction containing 200

U of SuperScriptTM III RNase H-Reverse Transcriptase (Life Technologies Inc.), 300 ng of

oligo-dT18, 50 ng of random hexamers, 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 75 mM KCl, 3 mM

MgCl2, 500 uM deoxynucleotides triphosphate, 5 mM dithiothreitol, and 40 U of Protector

RNase inhibitor (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) in a final volume of 50 µl. The

reaction was incubated at 25°C for 10 min and then at 50°C for 1 h, and a PCR purification

kit (Qiagen, Hilden, Germany) was used to purify cDNA (Life Technologies Inc.). Equal

amounts of cDNA were amplified in duplicate in a final volume of 10 µl containing 5 µL of

2X LightCycler 480 SYBRGreen I Master (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), 0.5 µM

of forward and reverse primers and 2 µL of cDNA (10 ng/µl). The primer pairs were:

TOX3, 5’-cctttcagactctcagcgatcc-3’ and 5’-ctggcggtactgtgacacttgt-3’; and GAPDH, 5’-

acgggaagctcactggcatgg-3’ and 5’-atgcctgcttcaccaccttcttg-3’. The sequences chosen were

selected to match only the intended gene using the GeneTools software (BioTools Inc.),

and verified by BLAST analysis in GenBank. Amplification was performed using the

LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) and the following conditions:

2 min at 50°C, 4 min at 95°C, followed by 45 cycles of 10 sec at 95°C (denaturation), 10

173

sec at 60°C (annealing), 12 sec at 72°C (elongation), and 5 sec at 74°C (reading).

Amplification efficiencies were validated and normalized to GAPDH and amounts of

TOX3 mRNA levels calculated according to a standard curve.

4.4.10. Behavioral analysis Recovery of locomotor function after SCI was quantified in an open field using the Basso

Mouse Scale, according to the method developed by Basso et al. (Basso et al., 2006).

Recovery of hindlimb function was also assessed using the grip walk (GW) test, a modified

version of the grid walk or "foot fault" test, following the method recently described by

Pajoohesh-Ganji et al. (Pajoohesh-Ganji et al., 2010). All behavioral analyses were done

blind with respect to the identity of the animals.

4.4.11. Statistical analysis Statistical evaluations were performed with one- or two-way ANOVA or repeated-

measures ANOVA. Post-ANOVA comparisons were made using the Bonferroni correction.

All statistical analyses were performed using the GraphPad Prism software (GraphPad

Software Inc., San Diego, CA). A p value < 0.05 was considered as statistically significant.

4.5. Results

4.5.1. Il-1αα protein expression in the injured spinal cord precedes IL-1ββ and is localized in microglia at the site of injury

Previous work has suggested that IL-1α released by cells undergoing necrosis could induce

sterile inflammation (Chen et al., 2007, Cohen et al., 2010, Rider et al., 2011). We thus

investigated whether IL-1α protein expression could be detected early in the injured mouse

spinal cord by confocal IF microscopy. Immunostaining was performed using a polyclonal

anti-IL-1α antibody directed against the N-terminal (6-166) part of murine IL-1α, thus

recognizing both the mature and precursor forms of the cytokine. No IL-1α expression was

observed in the spinal cord of adult naïve (uninjured) mice (Fig. 4.1A), either suggesting

that constitutive IL-1α is undetectable by IF because the protein is closely associated with

174

chromatin or that its expression is regulated by injury. As shown in Fig. 4.1A-B, IL-1α

immunostaining became detectable in the cells of the spinal cord as early as 4 hours post-

SCI, with the presence of 38 ± 6 cells at the lesion epicenter. This number had decreased to

15 ± 1 cells by 24 hours. No IL-1α-positive (+) cells were seen at 1 hour or 3 days after

injury (data not shown). At 4 hours post-SCI, IL-1α+ cells were mainly found at the lesion

epicenter and surrounding damaged areas. On very rare occasions, a few IL-1α+ cells were

found proximal or distal to the lesion site, while at 24 hours all IL-1α+ cells were physically

contained within the contusion site. It should be noted that most of them had a ramified

morphology reminiscent of microglia (Fig. 4.1C-E). Taking advantage of transgenic mice

in which the GFP reporter is expressed in microglia under the control of the CX3CR1

promoter, CX3CR1-eGFP+/- mice, we confirmed that the vast majority of IL-1α+ cells

colocalized with GFP-expressing cells following SCI, with an average colocalization

percentage of 88 ± 3% at 24 hours. IL-1α+ cells also colocalized with the myeloid cell

marker CD11b and the microglial/macrophage marker Iba1 (Fig. 4.1C-E). At 4 hours post-

SCI, a time that precedes the entry of blood-derived macrophages, colocalization of the IL-

1α protein with the Iba1 marker was estimated to be 96 ± 1%. Confocal microscopy

analysis revealed that the IL-1α protein was localized in the cell nucleus or cytoplasm (Fig.

4.1C-E). No IF signal was detected in the injured spinal cord of IL-1α-KO mice at any of

the times analyzed (Fig. 4.1A), confirming the specificity of the antibody used.

175

Figure 4.1 IL-1α protein expression in the injured spinal cord precedes IL-1β and is localized in microglia at the site of injury. A: Representative confocal photomicrographs showing IL-1α immunostaining (red) in the spinal cord of naïve and injured C57BL/6 mice at 4 and 24 hours (h) post-SCI (n=6-9 mice/time). Note that no IL-1α signal was detected in the injured spinal cord of IL-1α-KO mice, thus

IL-1 7/4

3528

2744

1960

1176

392

392C

1176C

1960C

2744C

3528C

0

200

400

600

800

1000

IL-1

IL-1

IL-1

IL-1

IL-1

IL-1

3528

2940

2352

1764

1176

588

0

588C

1176C

1764C

2352C

2940C

3528C

0

10

20

30

40

50

60

IL-1

IL-1

H

E

C

BA

176

confirming antibody specificity. B: Quantification of IL-1α+ cells in spinal cord sections taken both rostral (R) and caudal (C) to the lesion epicenter at 4 and 24 h post-SCI. C-E: Confocal photomicrographs showing co-localization of the IL-1α protein (red) with the myeloid cell marker CD11b (purple) and the microglial/macrophage markers Iba1 (purple) and CX3CR1-eGFP (eGFP, green). The nuclear staining DAPI is shown in blue. F: Imaging of IL-1β-producing cells (red cells) in the injured spinal cord of pIL-1β-DsRed transgenic mice at 4 and 24 hours post-SCI. In these transgenic mice, the DsRed fluorescent reporter is expressed under the control of the IL-1β gene promoter. G: Confocal photomicrographs showing the co-localization of IL-1β-DsRed+ cells (red) with 7/4-expressing cells (green). H: Quantification of IL-1β-DsRed+ cells in spinal cord sections taken both rostral (R) and caudal (C) to the lesion epicenter at 4 and 24 h post-SCI (n=3 mice/time). Scale bars: A, 100 µm; C-E (in E), 10 µm; F, 100 µm; G, 20 µm.

Using ISH, we detected two waves of IL-1β mRNA expression during the early acute phase

of SCI: the first one at 45 min to 3 h throughout the entire 12-mm (spinal cord) segment

analyzed, including the lesion and surrounding areas, and the second one restricted to the

lesion site at 6 h to 24 h (with a peak at 12 h) (data not shown; see also (Pineau and

Lacroix, 2007)). To determine whether mRNA expression resulted in production of IL-1β

protein, we took advantage of pIL-1β-DsRed transgenic mice in which the DsRed

fluorescent protein gene is expressed under the control of the IL-1β promoter. Such as for

IL-1β mRNA signal, no DsRed expression was detected in the spinal cord of uninjured

mice (data not shown). Time-course experiments showed that DsRed marker expression

was almost completely absent at 4 hours, but increased thereafter to reach a peak at 24

hours post-SCI (Fig. 4.1F, H). As for IL-1α+ cells, IL-1β-DsRed+ cells were found almost

exclusively within the lesion site, thus suggesting that only the second wave of IL-1β

mRNA expression is translated into protein production. However, the morphological

characteristics of these cells differed drastically, as IL-1α+ cells were typically ramified and

arborized, whereas IL-1β-DsRed+ cells were round. As seen in Fig. 4.1G, DsRed+ cells

colocalized with 7/4-expressing cells (i.e. neutrophils and monocyte-derived M1

macrophages), but only in rare occasions with Iba1-expressing microglia. Taken together,

these results indicate that microglia located as sites of SCI rapidly (< 4 hours) respond to

injury by expressing IL-1α, and that neutrophils and M1 monocytes that infiltrate the lesion

site starting at 6 hours further contribute to amplify the IL-1 response by producing IL-1β.

177

4.5.2. Infiltration of neutrophils and proinflammatory “M1” macrophages is equally reduced in the injured spinal cord of IL-1αα- and IL-1ββ-KO mice

To determine to what extent these cytokines are responsible for the early recruitment of

innate immune cells at sites of injury, we first quantified the number of neutrophils and

monocyte-derived M1 macrophages expressing the 7/4 antigen. Importantly, we recently

demonstrated that the 7/4 antigen is specifically expressed at the surface of both of these

cell populations, but not in resident microglia, thus justifying our immunohistochemical

approach (De Rivero Vaccari et al., 2012).

At 12 h after SCI, 1123 ± 72 cells immunopositive for 7/4 were counted at the lesion

epicenter in WT mice (Fig. 4.2A). This number was reduced by 69%, 58% and 79% in IL-

1α-, IL-1β- and IL-1α/β-KO mice, respectively, with an average of 347 ± 79, 470 ± 45 and

237 ± 114 cells at the lesion epicenter. Similarly, the number of Ly-6G+ neutrophils was

reduced by ~65%, 48% and 78% in IL-1α-, IL-1β- and IL-1α/β-KO mice, respectively,

compared with WT animals (Fig. 4.2B). To validate immunohistochemical data, cells were

isolated from the spinal cord of contused mice at 12 h and then characterized and quantified

by flow cytometry based on expression of the following cell-surface markers: CD45,

CD11b, Ly-6C, Ly-6G, and F4/80. As shown in Fig. 4.2C-E, flow cytometry data

confirmed the significantly reduced presence of neutrophils (CD45hi CD11b+ Ly-6C+ Ly-

6G+ F4/80-) and monocyte-derived M1 macrophages (CD45hi CD11b+ Ly-6Chi Ly-6G-

F4/80+) in SCI mice lacking IL-1α and/or IL-1β. The number of microglia (CD45dim

CD11b+ Ly-6C- Ly-6G- F4/80+) did not significantly differ between groups (data not

shown).

Altogether, these results suggest that cytokines of the IL-1 family are important regulators

of the infiltration of innate immune cells of the granulomonocytic lineage after SCI.

178

Figure 4.2 IL-1deficiency reduces neutrophil and M1 monocyte infiltration in the injured spinal cord. A-B: Quantification of the number of neutrophils and proinflammatory M1 macrophages, as visualized by 7/4 (A) and Ly-6G (B) immunostaining, at various rostral (R) and caudal (C) distances from the lesion epicenter at 12 h after SCI (n=4-12 mice/group). C-D: Quantification of the proportions of M1 macrophages (C) and neutrophils (D) relative to total CD45+ cells in KO and WT (C57BL/6) mice at 12 h after SCI. E: Representative flow cytometry profiles showing the presence of neutrophils (green; CD45hi CD11b+ Ly6C+ Ly6G+) and monocyte-derived M1 macrophages (red; CD45hi CD11b+ Ly6Chi Ly6G-) in the spinal cord of a C57BL/6 and IL-1αα/ββ-KO mouse at 12 h after SCI (date are

-way repeated-measures ANOVA with Bonferroni’s post hoc test.

BAM

ea

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0 103

104

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0

103

104

105

0 103

104

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0

103

104

105

C57BL/6

CD

45

0 102

103

104

105

0

103

104

105

0 102

103

104

105

0

103

104

105

Ly-6

C

0 103

104

105

0

103

104

105

0 103

104

105

0

103

104

105

Ly-6

C

CD11b Ly-6G F4/80

M1 Monocytes

Neutrophils

Others

0.30

0.20

0.10

0.00

WT

IL-1 KO

IL-1 KO

IL-1 KO

***

†††

###

***

†††

###

***

†††

###

***

†††

###

179

4.5.3. Mice harboring deletion of the IL-1αα gene exhibit improved functional recovery and histopathological outcome compared to IL-1ββ-KO and WR mice after SCI

Neuroinflammation is considered as one of the leading causes of secondary damage in the

injured spinal cord. Therefore, we next investigated whether the absence of the IL-1α or IL-

1β gene affects neuropathology in SCI. Evaluation was performed in an open field using

the 9-point BMS scale and the 11-point BMS subscore. Naïve IL-1α-KO, IL-1β-KO and

WT mice all performed flawlessly and received perfect scores on the BMS and BMS

subscore scales. The situation was however different after a moderate (50 kdyn) traumatic

SCI. As shown in Fig. 4.3A, IL-1α- and IL-1β-KO mice recovered significantly better than

WT mice at 1 and 3 days post-SCI. Unlike IL-1β-KO mice, IL-1α-KO performed

significantly better than WT mice at 7 and 14 days as well. At day 14, more than 90% of

IL-1α-KO were mostly coordinated and had parallel paw position at initial contact (score ≥

7 on the BMS), compared to 0% and 10% in WT and IL-1β-KO mice, respectively. The

average BMS subscore of IL-1α-KO mice was 8.3 ± 0.4 compared with 5.4 ± 0.3 for WT

and 4.7 ± 0.6 for IL-1β-KO mice at 14 days post-SCI (Fig. 4.3B). The extent and

reproducibility of the early locomotor recovery seen at day 1 in SCI IL-1α-KO mice

compared with the other two groups is best demonstrated by a dot plot showing individual

BMS scores of mice included in all experiments performed (n=27 mice per group) (Fig.

4.3C). We also analysed lesion volume by GFAP immunostaining delimiting the lesion

frontier and found that tissue damage was reduced in IL-1α-KO mice compared to IL-1β-

KO and WT mice at day 35 post-SCI (Fig. 4.3D). Together, these results suggest that

deletion of the IL-1α gene contributes to better functional recovery by reducing lesion

volume after SCI.

180

Figure 4.3 Recovery of locomotor function and spinal cord lesion volume are improved in IL-1-KO mice. A-B: Locomotor function was assessed using the Basso mouse scale (BMS) (A) and BMS subscore (B) over a 35-day period after SCI (n= 8-10 mice per group). *, † p < 0.05; **, †† p < 0.01; and ***, ††† p < 0.001, significant difference between KO and WT (C57BL/6) mice; two-way repeated-measures ANOVA with Bonferroni’s post hoc test. C: Dot plot showing BMS scores assigned to individual mice of each mouse line at day 1 post-SCI across all experiments performed (n = 27 mice per group). Males are shown in black filled circles and females in empty white circles. D: IL-1αα-KO mice had significantly reduced spinal cord tissue damage at 35 d after injury (n= 8-10 per group). For C-D, Data are expressed as mean ± SEM. ***p < 0.001, **p < 0.01; one-way ANOVA with Bonferroni’s post hoc tests.

4.5.4. IL-1ββ-KO mice have reduced IL-1αα levels in their spinal cord compared to WT mice whereas IL-1αα-KO mice express IL-1ββ normally

Horai et al. have previously suggested that IL-1β exerts greater control on IL-1α

production than does IL-1α on IL-1β production, at least in the brain (diencephalon).

0.05

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

C57BL/6 IL-1 KO IL-1 KO

Le

sio

n v

olu

me

(m

m3)

D

BM

S score

± S

EM

Female

0123456789

Male

C57BL/6 IL-1 KO IL-1 KO

*****

C

01234567891011

0 7 14 21 28 35Days after injury

BM

S s

ubscore

± S

EM ***

**

***†

B

IL-1 ko

IL-1 ko

0 7 14 21 28 35Days after injury

0123456789

BM

S s

core

± S

EM

***

***

*

†

***†††

C57BL/6

A

181

Specifically, they reported a 1.5-fold decrease in IL-1β mRNA expression in the brain of

IL-1α-KO mice compared to WT, and a 30-fold decrease in IL-1α mRNA levels in IL-1β-

KO mice (Horai et al., 1998). To extend these data to the adult spinal cord, we have

examined by various means the expression of IL-1α and IL-1β in IL-1β-KO and IL-1α-KO

mice, respectively. Using qRT-PCR, we determined that IL-1α mRNA is weakly expressed

in the spinal cord of WT (C57BL/6) naïve mice and virtually absent in IL-1β-KO under

baseline conditions (Fig. 4.4A). After SCI, IL-1α mRNA levels increased by more than 10-

fold in the spinal cord of WT mice. Importantly, this increase was 2.5-fold higher than that

found in SCI IL-1β-KO mice. On the contrary, IL-1β mRNA expression was undetectable

in the normal spinal cord of IL-1α-KO and WT mice. IL-1β mRNA expression increased

markedly at 24 hours after SCI in both IL-1β-KO and WT mice, with no difference

observed between the two groups, thus corroborating the microarray data (Fig. 4.4B). To

further study the importance of IL-1β in production of IL-1α protein, we next performed

immunofluorescence staining for IL-1α and quantified the number of IL-1α+ cells in SCI

tissue from both IL-1β-KO and WT mice at 4 hours post-SCI, which corresponds to the

maximum expression of the IL-1α protein. We counted a total of 101 ± 13 positive cells in

IL-1β-KO mice compared to 280 cells ± 25 in WT mice, corresponding to a nearly 3-fold

decrease in the number of IL-1α+ cells at sites of SCI in mice lacking IL-1β (Fig. 4.4C).

Together, these results indicate that deficiency in IL-1β attenuates production of IL-1α (but

not the opposite) in the normal and injured spinal cord. This raises the possibility that the

early locomotor recovery seen in IL-1β-KO mice compared to WT might be due to a

reduction in IL-1α production.

182

Figure 4.4 IL-1α and IL-1b mRNA expression levels in the spinal cord of naive and injured mice at 1 day post-SCI. A-B: Quantitative real time RT-PCR (qRT-PCR) analysis shows decreased expression of IL-1αα mRNA in Il-1ββ-/- mice while no changes in IL-1ββ levels were detected in Il-1ββ-/- mice after injury. Data are means ± SEM of the ratio between each IL-1 gene and 18S mRNA levels. ***p < 0.001, *p < 0.05, one-way ANOVA, Bonferroni’s post hoc.

4.5.5. Increase expression of TOX3 in the injured spinal cord of IL-1αα-KO mice To investigate the mechanism by which IL-1α mediates its detrimental effect after

traumatic SCI, we analyzed the transcriptome of the injured spinal cord of IL-1α-KO, IL-

1β-KO and WT mice at 24 hours after injury using GeneChip microarrays. Our results

showed that only 18 transcripts were significantly up- or down- regulated in IL-1α-KO

compared with IL-1β-KO and WT mice (Table 4.1). Surprisingly, none of these genes have

IL-1

mR

NA

/18S

IL-1

mR

NA

/18S

C57BL/6

IL-1

-KO

C57BL/6

-SCI

IL-1

-KO-S

CI

0.0

0.5

1.0

1.5

C57BL/6

IL-1

-KO

C57BL/6

-SCI

IL-1

-KO-S

CI

0.0

0.5

1.0

1.5

A

B

***

*

***

183

been previously shown to play a role in neuroinflammation. This is in drastic contrast with

the list of 23 transcripts found to be differentially regulated in both IL-1 KO mouse lines

compared to WT after SCI (Table 4.2), as many of the genes listed in Table 4.2 are

involved in neuroinflammation. Together, these data reinforce the idea that the absence of

IL-1α could mediate protection of spinal cord cells by a mechanism distinct from its known

inflammatory activities, most likely through its ability to regulate transcription and

chromatin, as recently suggested by others but without a direct link to specific genes

(Buryskova et al., 2004, Lamacchia et al., 2013).

Table 4.1 Transcripts found to be differentially regulated exclusively in IL-1α ko mice after SCI. Table listing the transcripts found to be significantly regulated in IL-1α-KO mice exclusively after SCI, as determined using Affymetrix GeneChip® microarrays. The abbreviation “F.C.” means fold change compared to the C57BL/6 control group. All mice in this analysis received a SCI.

184

Table 4.2 Transcripts found to be differentially regulated simultaneously in IL-1α and IL-1β-KO mice after SCI. Table listing the transcripts found to be significantly regulated in IL-1α-KO and IL-1ββ-KO mice after SCI, as determined using Affymetrix GeneChip® microarrays. The abbreviation “F.C.” means fold change compared to the C57BL/6 control group. All mice in this analysis received a SCI.

Among the 18 genes found to be differentially regulated in IL-1α-KO mice compared to

the other two mouse strains, one has particularly attracted our attention because of its

known biological function, namely, the neuronal survival factor TOX high mobility group

box family member 3 (TOX3) (Fernandes-Alnemri et al., 2009, Dittmer et al., 2011). Using

qRT-PCR, we confirmed that TOX3 is significantly upregulated in IL-1α-KO mice

compared to the other two groups at 24 hours post-SCI, consistent with microarray data

(Fig. 4.5A-B).

185

Figure 4.5 Expression of the survival factor TOX3 is increased in the injured spinal cord of IL-1α-KO mice. B: Microarray analysis of gene expression shows that TOX3 is differentially expressed (i.e. upregulated) in the spinal cord of IL-1α-KO mice compared with IL-1β-KO and C57BL/6 mice at day 1 post-SCI. Data are expressed as an average microarray hybridization signal (n = 4 mice per group). Normalization of probe set intensities was performed using the method of Robust Multiarray Analysis (RMA). C: Quantitative real time RT-PCR (qRT-PCR) analysis confirms increased expression of TOX3 in the injured spinal cord of IL-1α-KO at day 1 post-SCI. Data are expressed as a ratio to GAPDH mRNA levels. All data are expressed as mean ± SEM. ***p < 0.001.

4.5.6. Oligodendrocytes from mice lacking IL-1αα upregulate the survival factor TOX3 and are protected from SCI-induced death

TOX3 is a nuclear protein that was recently found to protect neurons from apoptotic cell

death when overexpressed (Dittmer et al., 2011). Building on our transcriptome data

showing higher levels of TOX3 transcript in IL-1α-KO mice than WT after SCI, we next

examined whether these changes translated into differences at the protein level. Using

immunofluorescence confocal microscopy and co-staining with various makers of CNS

cells, we found that the TOX3 protein was weakly expressed in the spinal cord of WT mice

under normal conditions. The TOX3 signal was mainly localized in the nucleus of NeuN+

neurons and CC1+ oligodendrocytes (Fig. 4.6A), as well as being associated with CD31+

endothelial cells (data not shown). Quantification of TOX3 immunostaining revealed that

protein levels of the survival factor were markedly increased in the spinal cord of naïve IL-

1α-KO mice compared with IL-1β-KO and WT mice. The overexpression concerned

mainly neurons and oligodendrocytes, with an approximate 130% and 200% increase in

TOX3

GeneChip microarrays

Aver

age

hybr

idiz

atio

n si

gnal

(Nor

mal

ized

dat

a)

A******

C57BL/6IL-1 KOIL-1 KO

qRT-PCRB

mR

NA

leve

ls(R

elat

ive

to G

AP

DH

)

******

TOX3

186

signal intensity in these two cell types, respectively (data not shown). This also translated

into higher numbers of neurons and oligodendrocytes expressing TOX3 in the adult spinal

cord of naïve IL-1α-KO mice. On average, we counted 206 ± 18 NeuN+ TOX3+ cells per

mm2 in the grey matter of IL-1α-KO mice compared to 80 ± 9 and 101 ± 17 in IL-1β-KO

and WT mice, respectively. The same also applied to oligodendrocytes of the white matter,

where we counted 278 ± 11 CC1+ TOX3+ cells per mm2 in naïve IL-1α-KO mice compared

to 127 ± 12 and 113 ± 10 in IL-1β-KO and WT mice, respectively. Importantly for data

interpretation, the total numbers of NeuN+ neurons and mature CC1+ oligodendrocytes

were similar between the three mouse strains under normal, uninjured conditions.

Intriguingly, overexpression of TOX3 in IL-1α-KO mice was maintained in

oligodendrocytes but completely lost in neurons at 24 h after SCI (Fig. 4.6B, D), thus

suggesting that the former cell type is more likely to be protected from injury.

To investigate whether more neurons and oligodendrocytes were protected from SCI in IL-

1α-KO mice, and whether TOX3-expressing neurons/oligodendrocytes were more likely to

be protected from injury-induced death, we counted these cells in spinal cord sections

spanning the entire rostro-caudal extent of the lesion (i.e., ~3 mm centered at the lesion

epicenter). As expected from the work of the Wrathall lab (Grossman et al., 2001, Lytle and

Wrathall, 2007), fewer NeuN+ neurons and CC1+ oligodendrocytes were detected in the

injured compared with uninjured spinal cord, independently of the mouse line (data not

shown). On average, the neuronal and oligodendroglial cell loss in IL-1β-KO and WT

(C57BL/6) mice was estimated to be around 50% at 24 hours post-SCI. Importantly, the

total numbers of CC1+ oligodendrocytes, but not NeuN+ neurons, were significantly higher

(by more than 20%) in the injured spinal cord of IL-1α-KO mice at this time (Fig. 4.6C). In

IL-1α-KO mice, a total of 2656 ± 210 neurons and 3283 ± 209 oligodendrocytes survived

the injury compared to 2746 ± 186 and 2680 ± 135 in IL-1β-KO mice and 2759 ± 167 and

2707 ± 133 in WT mice. Another important observation is that 75% of the CC1+

oligodendrocytes that survived the injury in IL-1α-KO mice express TOX3 (Fig. 4.6D),

while CC1+ TOX3+ oligodendrocytes accounted for only 35% of the total number of CC1+

oligodendrocytes in the uninjured spinal cord of these mice (data not shown). This once

187

again suggests that TOX3 overexpression is protective in SCI and that CC1+ TOX3+

oligodendrocytes have a greater capacity to survive the hypoxic, ischemic and

inflammatory conditions of the lesion.

188

Figure 4.6 IL-1α deficiency upregulates expression of the survival factor TOX3 in oligodendrocytes and protects these cells from death after SCI. A: Confocal photomicrographs showing TOX3 immunostaining (red) in the spinal cord of a naïve C57BL/6 mouse. Note that the TOX3 protein is weakly expressed and localized specifically in the nucleus of oligodendrocytes (CC1+, green cells in the upper right

Tota

l ce

ll n

um

be

r

0

1000

2000

3000

4000

5000

Oligodendrocytes Neurons

**

C57BL/6

IL-1 ko

IL-1 ko

Oligodendrocytes Neurons

TO

X3

inte

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0

20

40

60

80

********TOX3 Dapi

TOX3 Dapi Merge + NeuN

Merge + CC1

Olig

od

en

dro

cyte

sN

eu

ron

s

A B

C

C57BL/6

IL-1 KO

IL-1 KO

CC1 TOX3 Merge + Dapi

D

189

panel) and neurons (NeuN+, green cells in the lower right panel), as well as being associated with CD31+ endothelial cells (not shown). The nuclear staining DAPI is shown in blue. The right-most panels are an overlay of the three colors. B: Quantification of TOX3 immunostaining intensity in spinal cord oligodendrocytes and neurons of the three mouse strains at day 1 post-SCI. C: Quantification of the total number of CC1+ oligodendrocytes and NeuN+ neurons in spinal cord sections spanning the entire rostro-caudal extent of the lesion, i.e. ~3 mm centered at the lesion epicenter. Data in B-C are expressed as mean ± SEM. ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05, one-way ANOVA, Bonferroni’s post hoc. D: Representative confocal photomicrographs showing CC1 (green) and TOX3 (red) immunostainings in the injured spinal cord of C57BL/6 mice as well as IL-1α- and IL-1β-KO mice. Scale bars: A, 10 µm; D, 50 µm.

4.5.7. Tox3 overexpression in oligodendrocytes of IL-1αα -/- mice occurs at early at an early stage of the myelination process and persists through adulthood.

To determine whether TOX3 overexpression occurs during a specific period of CNS

development or later during adulthood, we performed immunostaining for TOX3 and

measured protein levels in the developing and adult spinal cord of naïve IL-1α-KO, IL-1β-

KO and WT mice. As shown in Fig. 6, TOX3 protein levels were increased in the spinal

cord of IL-1α-KO mice compared with IL-1β-KO and WT mice during the postnatal

period. Importantly, this overexpression translated into much higher numbers of CC1+

oligodendrocytes expressing TOX3 in the spinal cord of naïve IL-1α-KO mice than the

other two groups of mice from P10 up to P30 (Fig. 4.7A), and as described above, this

difference was maintained up to adulthood. At P10, we counted as many as 924 ± 266

CC1+ TOX3+ oligodendrocytes per cross-section in the spinal cord white matter of IL-1α-

KO mice compared to only 34 ± 34 and 55 ± 37 in IL-1β-KO and WT mice, respectively.

This represents an almost 30-fold increase in cell numbers. With the exception of P10,

numbers of CC1+ mature oligodendrocytes were similar between mouse strains at all times

(Fig. 4.7B). Together, these results suggest that IL-1α represses TOX3 in spinal cord

oligodendrocytes during early postnatal development, at around P10, right before the

beginning of the myelination process.

190

To assess whether IL-1α is produced during this developmental phase, we next measured

mRNA levels for IL-1α and IL-1β in the spinal cord of C57BL/6 mice at various times

postnatally (between P1 and P30). Using real-time qRT-PCR, we found that mRNA levels

for IL-1α, but not IL-1β, are dramatically increased between P5 and P10 (Fig. 4.7C).

Therefore, our results indicate that spinal cord microglia become activated and produce IL-

1α just before the beginning of the myelination process, suggesting that interactions

between microglia and oligodendrocytes appear to regulate the survival of mature

oligodendrocytes through TOX3.

Figure 4.7 Increased mRNA expression levels of IL-1α, but not IL-1β, between postnatal day 5 and 10, coinciding with a critical period of microglial activation and the beginning of myelination A-B: Quantification of the total numbers of TOX3+CC1+ (A) and CC1+ (B) oligodendrocytes in the spinal cord of Il-1a-/-, Il-1b-/- and wild-type (WT) mice at postnatal day 3, 10, 18 and 30. C: Quantitative real time RT-PCR (qRT-PCR) analysis confirms increased expression of IL-1a mRNA in the spinal cord of WT mice during the postnatal development period. Data are means ±

P1 P3 P7 P10 P14 P18 P300.000

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005 IL-1 mRNAIL-1 mRNA

mR

NA

/ G

APD

H

Postnatal day

0

2000

4000

6000

8000

P3 P10 P18 P30

Postnatal day

Tota

l # o

f CC

1+ cel

l

***

C57BL/6

IL-1 koIL-1 ko

P3 P10 P18 P300

500

1000

1500

2000

Postnatal day

Tota

l # o

f CC

1+ /TO

X3+ c

ell

***

***

***

###

****

****

***

A B

C

* **

191

SEM of the ratio between each IL-1 gene and GAPDH mRNA levels. **** p < 0.0001, ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05, ###p < 0.001 compared to postnatal day 1, one-way ANOVA, Bonferroni’s post hoc.

4.6. Discussion In this study, we show that deletion of the IL-1α gene in mice results in decreased lesion

volume and improved functional outcome after SCI, an effect that we ascribe to an increase

in survival of oligodendrocytes in damaged areas. Our immunohistochemical data indicate

that IL-α is rapidly produced by microglia after SCI, in line with a recent report from

Luheshi et al. using an ischemic brain injury model in mice (Luheshi et al., 2011).

Specifically, we found that IL-1α is produced and/or released at sites of trauma, and that

IL-1α production by microglia precedes both the infiltration of blood-derived innate

immune cells, which we found are the main cellular source of IL-1β, and secondary

damage to oligodendrocytes. Importantly, the infiltration of neutrophils and monocyte-

derived M1 macrophages is severely compromised in the injured spinal cord of Il-1α-/-

mice. Our results thus support the growing body of evidence that IL-1α is a damage-

associated molecular pattern (DAMP) molecule released by dying cells, thus enabling the

recruitment of innate immune cells (Chen et al., 2007, Eigenbrod et al., 2008). A key new

finding of this study is the discovery that the survival factor TOX3 is overexpressed in

oligodendrocytes as a result of deletion of the IL-1α gene, and that this overexpression

occurs during the early postnatal period and lasts for the lifetime of the Il-1α-/- mouse.

Furthermore, oligodendrocytes overexpressing TOX3 in the spinal cord of Il-1α-/- mice

survived better than those not expressing TOX3 (in these same animals), as well as those of

Il-1β-/- and WT mice after SCI in vivo.

Cohen et al. have recently reported that IL-1α is associated with the chromatin and released

with the cytoplasmic content as a result of necrotic cell death, but not apoptotic cell death,

following which it stimulates myeloid cell recruitment (Cohen et al., 2010). Although our

results indicate that IL-1α is released by microglia and initiates inflammation after SCI, we

do not know whether this inflammatory response mediates secondary (bystander) damage.

192

Interestingly, the Allan group has recently shown that neutrophils acquire potentially

neurotoxic properties upon transmigration across IL-1-stimulated blood-brain barrier

(BBB) (Allen et al., 2012). This particular study suggested that neurotoxicity could be

mediated by the action of neutrophil-derived proteases that are released in association with

decondensed DNA, commonly referred to as neutrophil extracellular traps (NETs). In

addition, monocyte-derived M1 macrophages identified by their production of

proinflammatory mediators are present in the injured spinal cord and neurotoxic when co-

cultured with primary neurons (Kigerl et al., 2009). A recent cell depletion study in SCI

mice has further revealed that preventing the recruitment of both neutrophils and

monocytes is beneficial for functional recovery (Lee et al., 2011). Future studies will

therefore be required to determine whether innate immune cells that rapidly infiltrate sites

of SCI in response to IL-1α are those that contribute to secondary tissue damage.

Pro-IL-1α and pro-IL-1β are expressed as 31-kDa polypeptides. Despite long-standing

evidence that the precursor form of IL-1α is biologically active, in contrast to pro-IL-1β,

recent studies have challenged this view by showing that pro-IL-1α has minimal activity,

but its cleavage into a 17-kDa fragment by proteases such as calpain or granzyme B

enhanced biological activity by up to 10-50 fold in vitro and in vivo (Afonina et al., 2011,

Zheng et al., 2013). The processing and secretion of IL-1β is regulated by inflammasomes

(Lamkanfi and Dixit, 2012), and we now know that this is also partially the case for IL-1α,

at least in the context of exposition to microbial pathogen-associated molecular pattern

(PAMP) molecules (Gross, 2012). Here, we show that IL-1α is rapidly (within 4 h)

produced by resident microglia after SCI, and that innate immune cells that are

subsequently, but still rapidly (within 6-12 h), recruited from the blood into sites of injury

further amplify the inflammatory response by producing IL-1β. Interestingly, Iyer et al.

have demonstrated that necrotic cell extracts, when injected into the peritoneal cavity of

mice deficient in key molecules involved in IL-1β processing and secretion, such as

caspase-1, the inflammasome adaptor molecule apoptosis-associated speck-like protein

(ASC) and the NLR protein Nlrp3 (also referred to as Nalp3, CIAS1 or cryopyrin), failed to

induce neutrophil influx as they would normally do in WT recipient mice (Iyer et al.,

2009). Using LPS-primed macrophages as a model, they further showed that necrotic cells

193

induce IL-1β maturation through Nlrp3, a finding confirmed by Li et al. using necrosis-

inducing drugs (Li et al., 2009). This suggests that some of the inflammatory effects of IL-

1α may also result from the induction of IL-1β production and maturation, which may

explain why neutrophil and M1 monocyte infiltration is equally reduced in the injured

spinal cord of IL-1α-/- and IL-1β-/- mice compared to WT mice.

The inflammasomes and other signals regulating IL-1α and IL-1β activity and

inflammation in the injured CNS remain largely unknown and may be different from those

identified in peripheral tissues. Recently, we showed that deletion of the purinergic P2X4

receptor, a receptor known to bind extracellular nucleotides, is associated with reduced

inflammasome activation and decreased production of cleaved IL-1β after SCI (De Rivero

Vaccari et al., 2012). This finding was correlated with reduced spinal cord tissue damage

and improved locomotor recovery as early as day 1, reminiscent of the early recovery

observed here in IL-1α-/- mice. One unknown, however, is whether levels of the pro- and

mature forms of IL-1α are impaired in P2X4-/- mice under normal and injured conditions.

Perhaps the most important conclusion that can be drawn from the comparison of Il-1α-/-

and Il-1β-/- mice is that despite showing a similarly reduced inflammatory response after

SCI, Il-1α-/- mice exhibited better recovery of locomotor abilities and had reduced lesion

volume. This, combined with the early functional recovery seen at day 1 in Il-1α-/- mice,

suggests that these mutant animals are protected from SCI-induced neurodegeneration

rather than benefiting from improved regenerative abilities. It also suggests that the

improved recovery of function in injured Il-1α-/- mice is unlikely to be mediated by innate

immune cells recruited from the blood. Still, we cannot completely rule out the possibility

that the absence of IL-1α or IL-1β could have differentially affected the expression of

specific proinflammatory and cytotoxic effectors by the remaining immune cells recruited

at the lesion site. However, it must be pointed out that our microarray study failed to detect

significant changes in expression levels of inflammatory genes between the two IL-1

mouse strains at day 1 post-SCI.

194

In contrast to the function of IL-1α, which remains uncertain, the role of IL-1β has been

relatively well studied in the context of CNS injury (Allan and Rothwell, 2001, Allan et al.,

2005). It has been assumed that IL-1 proteins have identical biological functions given that

both cytokines bind and activate the same cell surface receptor, IL-1R1, although a role for

IL-1R2 in the regulation of IL-1α activity post-necrosis has recently been highlighted

(Zheng et al., 2013). Despite the fact that intracellular IL-1R2 can regulate cell activation

by preventing cleavage of IL-1α by calpain and act extracellularly as a decoy receptor for

free IL-1, IL-1R2 lacks an intracellular Toll-like/IL-1R1 (TIR) domain and therefore is not

a direct mediator of cytokine signalling. Thus, it may come as a surprise that Il-1β-/- mice

did not recover locomotor function to the extent of Il-1α-/- mice after SCI. This could

suggest that IL-1α mediates CNS cell loss independently of IL-1R1, through a yet

unidentified receptor. Interestingly, a novel isoform of the IL-1R1 accessory protein, IL-

1RAcPb, containing a variant TIR domain and whose expression is restricted to CNS

neurons has recently been implicated in neuroprotection in animal models of

neuroinflammation (Smith et al., 2009). Nguyen et al. later reported that IL-1α-induced, but

not IL-1β-induced, p38 phosphorylation is significantly reduced in primary neuronal

cultures from IL-1RAcPb-KO mice (Nguyen et al., 2011). This is convincing evidence that

supports the idea that IL-1α has specific effects within the CNS. Here, we have extended

this work by identifying 18 genes that are regulated by IL-1α, but not by IL-1β, and through

the demonstration that IL-1α regulates oligodendrocyte survival after SCI. It is important to

note that the study by Smith et al. assessed IL-1RAcPb mRNA expression in purified

neurons, microglia and astrocytes, but not in oligodendrocytes. It is therefore possible that

IL-1α may exert its effects on oligodendrocytes through a receptor other than IL-1R1, such

as IL-1RAcPb.

Our genome-wide transcriptome analysis identified 18 genes as significantly up- or down-

regulated in IL-1α-/- mice compared with IL-1β-/- and WT mice, among which is the

transcript coding for the TOX high mobility group box (HMGB) family member 3, also

known as TOX3. TOX3 was recently shown to regulate Ca2+-dependent transcription in

neurons through interaction with the cAMP-response-element-binding protein (CREB)

(Yuan et al., 2009). Dittmer et al. have since established that TOX3 is predominantly

195

expressed in the CNS where it acts as a neuronal survival factor (Dittmer et al., 2011). It

was demonstrated that TOX3 overexpression protects neurons from cell death via the

upregulation of anti-apoptotic genes and downregulation of pro-apoptotic genes. Here, our

data show the presence of almost 3 times more neurons and oligodendrocytes expressing

TOX3 in the spinal cord of naïve IL-1α-/- mice compared to IL-1β-/- and WT mice, but this

difference did not translate into an increased neuronal survival in IL-1α-/- mice at day 1

post-SCI. Instead, deletion of the IL-1α gene distinctively induced the survival of mature

oligodendrocytes after SCI. Recently, Miron et al. unveiled that M2 anti-inflammatory

microglia/macrophages are important for oligodendrocyte differentiation and CNS

remyelination (Miron et al., 2013). It will be of interest in future work to determine whether

the absence of IL-1α could induce a phenotypic switch in polarization of microglia during

the early developmental period, thus leading to gene expression changes in

oligodendrocytes.

In summary, we have established that deletion of the IL-1α gene provides protection of

oligodendrocytes from SCI via a mechanism that involves overexpression of the survival

factor TOX3. Therefore, we propose that inhibition of IL-1α or overexpression of TOX3

during the early acute phase of a CNS insult may be an effective means for preventing loss

of neurological function in a variety of injuries such as ischemia and traumatic brain and

spinal cord injury.

4.7. References

Afonina IS, Tynan GA, Logue SE, Cullen SP, Bots M, Lüthi AU, Reeves EP, McElvaney

NG, Medema JP, Lavelle EC, Martin SJ (2011) Granzyme B-dependent proteolysis acts

as a switch to enhance the proinflammatory activity of IL-1α. Molecular Cell, vol. 44, pp

265-278.

Albrecht P, Dahl J, Stoltzfus O, Levenson R, Levison S (2002) Ciliary Neurotrophic Factor

Activates Spinal Cord Astrocytes, Stimulating Their Production and Release of

196

Fibroblast Growth Factor-2, to Increase Motor Neuron Survival. Experimental

neurology, vol. 173, pp 46-62.

Albrecht P, Murtie J, Ness J, Redwine J, Enterline J, Armstrong R, Levison S (2003)

Astrocytes produce CNTF during the remyelination phase of viral-induced spinal cord

demyelination to stimulate FGF-2 production. In: Neurobiology of Disease, vol. 13, pp

89-101.

Allan S, Rothwell N (2001) Cytokines and acute neurodegeneration. Nature reviews

Neuroscience, vol. 2, pp 734-744.

Allan S, Tyrrell P, Rothwell N (2005) Interleukin-1 and neuronal injury. Nature reviews

Immunology, vol. 5, pp 629-640.

Allen C, Thornton P, Denes A, McColl BW, Pierozynski A, Monestier M, Pinteaux E,

Rothwell NJ, Allan SM (2012) Neutrophil cerebrovascular transmigration triggers rapid

neurotoxicity through release of proteases associated with decondensed DNA. J

Immunol, vol. 189, pp 381-392.

Amankulor N, Hambardzumyan D, Pyonteck S, Becher O, Joyce J, Holland E (2009) Sonic

Hedgehog Pathway Activation Is Induced by Acute Brain Injury and Regulated by

Injury-Related Inflammation. Journal of Neuroscience, vol. 29, pp 10299-10308.

Barrette B, Hébert M-A, Filali M, Lafortune K, Vallières N, Gowing G, Julien J-P, Lacroix

S (2008) Requirement of myeloid cells for axon regeneration. In: The Journal of

neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, vol. 28, pp 9363-

9376.

Basso D, Fisher L, Anderson A, Jakeman L, McTigue D, Popovich P (2006) Basso Mouse

Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five

common mouse strains. Journal of neurotrauma, vol. 23, pp 635-659.

197

Bastien D, Lacroix S (2014) Cytokine pathways regulating glial and leukocyte function

after spinal cord and peripheral nerve injury. Experimental neurology, vol. 258C, pp 62-

77.

Basu A, Krady J, O&apos;Malley M, Styren S, DeKosky S, Levison S (2002) The type 1

interleukin-1 receptor is essential for the efficient activation of microglia and the

induction of multiple proinflammatory mediators in response to brain injury. The

Journal of neuroscience, vol. 22, pp 6071-6082.

Brambilla R, Bracchi-Ricard V, Hu W-H, Frydel B, Bramwell A, Karmally S, Green EJ,

Bethea JR (2005) Inhibition of astroglial nuclear factor kappaB reduces inflammation

and improves functional recovery after spinal cord injury. J Exp Med, vol. 202, pp 145-

156.

Brambilla R, Hurtado A, Persaud T, Esham K, Pearse D, Oudega M, Bethea J (2009)

Transgenic inhibition of astroglial NF-κB leads to increased axonal sparing and

sprouting following spinal cord injury. Journal of Neurochemistry, vol. 110, pp 765-778.

Buryskova M, Pospisek M, Grothey A, Simmet T, Burysek L (2004) Intracellular

interleukin-1alpha functionally interacts with histone acetyltransferase complexes. The

Journal of biological chemistry, vol. 279, pp 4017-4026.

Chen C-J, Kono H, Golenbock D, Reed G, Akira S, Rock KL (2007) Identification of a key

pathway required for the sterile inflammatory response triggered by dying cells. Nature

medicine, vol. 13, pp 851-856.

Cohen I, Rider P, Carmi Y, Braiman A, Dotan S, White M, Voronov E, Martin M,

Dinarello C, Apte R (2010) Differential release of chromatin-bound IL-1alpha

discriminates between necrotic and apoptotic cell death by the ability to induce sterile

198

inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America, vol. 107, pp 2574-2579.

Davalos D, Grutzendler J, Yang G, Kim J, Zuo Y, Jung S, Littman D, Dustin M, Gan W-B

(2005) ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature

neuroscience, vol. 8, pp 752-758.

David S, Kroner A (2011) Repertoire of microglial and macrophage responses after spinal

cord injury. Nature reviews Neuroscience, vol. 12, pp 388-399.

David S, Lacroix S (2005) Role of the immune response in tissue damage and repair in the

injured spinal cord. Clinical Neuroimmunology 2e edition.

De Rivero Vaccari J, Bastien D, Yurcisin G, Pineau I, Dietrich W, De Koninck Y, Keane

R, Lacroix S (2012) P2X4 Receptors Influence Inflammasome Activation after Spinal

Cord Injury. The Journal of neuroscience, vol. 32, pp 3058-3066.

Dinarello CA (2011) Interleukin-1 in the pathogenesis and treatment of inflammatory

diseases. Blood, vol. 117, pp 3720-3732.

Dittmer S, Kovacs Z, Yuan SH, Siszler G, Kögl M, Summer H, Geerts A, Golz S, Shioda

T, Methner A (2011) TOX3 is a neuronal survival factor that induces transcription

depending on the presence of CITED1 or phosphorylated CREB in the transcriptionally

active complex. In: Journal of Cell Science, vol. 124, pp 252-260.

Eigenbrod T, Park J-H, Harder J, Iwakura Y, Núñez G (2008) Cutting edge: critical role for

mesothelial cells in necrosis-induced inflammation through the recognition of IL-1 alpha

released from dying cells. In: The Journal of Immunology, vol. 181, pp 8194-8198.

Faulkner JR, Herrmann JE, Woo MJ, Tansey KE, Doan NB, Sofroniew MV (2004)

Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. In: J

Neurosci, vol. 24, pp 2143-2155.

199

Fernandes-Alnemri T, Yu J-W, Datta P, Wu J, Alnemri E (2009) AIM2 activates the

inflammasome and cell death in response to cytoplasmic DNA. In: Nature, vol. 458, pp

509-513.

Fleming J, Norenberg M, Ramsay D, Dekaban G, Marcillo A, Saenz A, Pasquale-Styles M,

Dietrich W, Weaver L (2006) The cellular inflammatory response in human spinal cords

after injury. In: Brain, vol. 129, pp 3249-3269.

Gautier L, Cope L, Bolstad BM, Irizarry RA (2004) affy--analysis of Affymetrix GeneChip

data at the probe level. In: Bioinformatics, vol. 20, pp 307-315.

Gross O (2012) Measuring the inflammasome. In: Methods in molecular biology (Clifton,

NJ), vol. 844, pp 199-222.

Grossman SD, Rosenberg LJ, Wrathall JR (2001) Temporal-spatial pattern of acute

neuronal and glial loss after spinal cord contusion. In: Experimental neurology, vol. 168,

pp 273-282.

Herx L, Rivest S, Yong V (2000) Central nervous system-initiated inflammation and

neurotrophism in trauma: IL-1 beta is required for the production of ciliary neurotrophic

factor. In: Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 165, pp 2232-2239.

Horai R, Asano M, Sudo K, Kanuka H, Suzuki M, Nishihara M, Takahashi M, Iwakura Y

(1998) Production of mice deficient in genes for interleukin (IL)-1alpha, IL-1beta, IL-

1alpha/beta, and IL-1 receptor antagonist shows that IL-1beta is crucial in turpentine-

induced fever development and glucocorticoid secretion. In: The Journal of

Experimental Medicine, vol. 187, pp 1463-1475.

Irizarry RA, Hobbs B, Collin F, Beazer-Barclay YD, Antonellis KJ, Scherf U, Speed TP

(2003) Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array

probe level data. In: Biostatistics, vol. 4, pp 249-264.

200

Iyer S, Pulskens W, Sadler J, Butter L, Teske G, Ulland T, Eisenbarth S, Florquin S, Flavell

R, Leemans J, Sutterwala F (2009) Necrotic cells trigger a sterile inflammatory response

through the Nlrp3 inflammasome (Supporting information). In: Proceedings of the

National Academy of Sciences, vol. 106, pp 20388-20393.

Kigerl KA, Gensel JC, Ankeny DP, Alexander JK, Donnelly DJ, Popovich PG (2009)

Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either

neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. In: The Journal of

neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, vol. 29, pp 13435-

13444.

Kono H, Karmarkar D, Iwakura Y, Rock K (2010) Identification of the Cellular Sensor

That Stimulates the Inflammatory Response to Sterile Cell Death. In: The Journal of

Immunology, vol. 184, pp 4470-4478.

Lamacchia C, Rodriguez E, Palmer G, Gabay C (2013) Endogenous IL-1α is a chromatin-

associated protein in mouse macrophages. In: Cytokine.

Lamkanfi M, Dixit VM (2012) Inflammasomes and their roles in health and disease. In:

Annu Rev Cell Dev Biol, vol. 28, pp 137-161.

Lee SM, Rosen S, Weinstein P, Van Rooijen N, Noble-Haeusslein LJ (2011) Prevention of

both neutrophil and monocyte recruitment promotes recovery after spinal cord injury. In:

Journal of Neurotrauma, vol. 28, pp 1893-1907.

Li H, Ambade A, Re F (2009) Cutting edge: Necrosis activates the NLRP3 inflammasome.

In: Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 183, pp 1528-1532.

Luheshi NM, Kovács KJ, Lopez-Castejon G, Brough D, Denes A (2011) Interleukin-1α

expression precedes IL-1β after ischemic brain injury and is localised to areas of focal

neuronal loss and penumbral tissues. In: Journal of neuroinflammation, vol. 8, p 186.

201

Lytle JM, Wrathall JR (2007) Glial cell loss, proliferation and replacement in the contused

murine spinal cord. In: Eur J Neurosci, vol. 25, pp 1711-1724.

Mason J, Suzuki K, Chaplin D, Matsushima G (2001) Interleukin-1beta promotes repair of

the CNS. In: The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for

Neuroscience, vol. 21, pp 7046-7052.

Matsushima H, Ogawa Y, Miyazaki T, Tanaka H, Nishibu A, Takashima A (2010)

Intravital imaging of IL-1beta production in skin. In: Journal of Investigative

Dermatology, vol. 130, pp 1571-1580.

Miron VE, Boyd A, Zhao J-W, Yuen TJ, Ruckh JM, Shadrach JL, van Wijngaarden P,

Wagers AJ, Williams A, Franklin RJM, Ffrench-Constant C (2013) M2 microglia and

macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. In:

Nature Neuroscience, vol. 16, pp 1211-1218.

Nadeau S, Filali M, Zhang J, Kerr BJ, Rivest S, Soulet D, Iwakura Y, de Rivero Vaccari JP,

Keane RW, Lacroix S (2011) Functional recovery after peripheral nerve injury is

dependent on the pro-inflammatory cytokines IL-1β and TNF: implications for

neuropathic pain. In: The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for

Neuroscience, vol. 31, pp 12533-12542.

Nguyen L, Rothwell NJ, Pinteaux E, Boutin H (2011) Contribution of interleukin-1

receptor accessory protein B to interleukin-1 actions in neuronal cells. In: Neurosignals,

vol. 19, pp 222-230.

Pajoohesh-Ganji A, Byrnes K, Fatemi G, Faden A (2010) A combined scoring method to

assess behavioral recovery after mouse spinal cord injury. In: Neuroscience Research, pp

1-9.

202

Pineau I, Lacroix S (2007) Proinflammatory cytokine synthesis in the injured mouse spinal

cord: Multiphasic expression pattern and identification of the cell types involved. In:

The Journal of Comparative Neurology, vol. 500, pp 267-285.

Pineau I, Sun L, Bastien D, Lacroix S (2010) Astrocytes initiate inflammation in the injured

mouse spinal cord by promoting the entry of neutrophils and inflammatory monocytes in

an IL-1 receptor/MyD88-dependent fashion. In: Brain Behav Immun, vol. 24, pp 540-

553.

Rider P, Carmi Y, Guttman O, Braiman A, Cohen I, Voronov E, White MR, Dinarello CA,

Apte RN (2011) IL-1α and IL-1β recruit different myeloid cells and promote different

stages of sterile inflammation. In: Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950), vol.

187, pp 4835-4843.

Rosas M, Thomas B, Stacey M, Gordon S, Taylor P (2010) The myeloid 7/4-antigen

defines recently generated inflammatory macrophages and is synonymous with Ly-6B.

In: Journal of Leukocyte Biology, vol. 88, pp 169-180.

Shechter R, London A, Varol C, Raposo C, Cusimano M, Yovel G, Rolls A, Mack M,

Pluchino S, Martino G, Jung S, Schwartz M (2009) Infiltrating Blood-Derived

Macrophages Are Vital Cells Playing an Anti-inflammatory Role in Recovery from

Spinal Cord Injury in Mice. In: PLoS Medicine, vol. 6, p e1000113.

Smith D, Lipsky B, Russell C, Ketchem R, Kirchner J, Hensley K, Huang Y, Friedman W,

Boissonneault V, Plante M-M, Rivest S, Sims J (2009) A Central Nervous System-

Restricted Isoform of the Interleukin-1 Receptor Accessory Protein Modulates Neuronal

Responses to Interleukin-1. In: Immunity, vol. 30, pp 817-831.

Smyth GK (2004) Linear models and empirical bayes methods for assessing differential

expression in microarray experiments. In: Stat Appl Genet Mol Biol, vol. 3, p Article3.

203

Sofroniew M (2009) Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.

In: Trends in neurosciences, vol. 32, pp 638-647.

Stirling DP, Liu S, Kubes P, Yong VW (2009) Depletion of Ly6G/Gr-1 leukocytes after

spinal cord injury in mice alters wound healing and worsens neurological outcome. In:

The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, vol.

29, pp 753-764.

Stirling DP, Yong VW (2008) Dynamics of the inflammatory response after murine spinal

cord injury revealed by flow cytometry. In: J Neurosci Res, vol. 86, pp 1944-1958.

Thawer SG, Mawhinney L, Chadwick K, de Chickera SN, Weaver LC, Brown A, Dekaban

GA (2013) Temporal changes in monocyte and macrophage subsets and microglial

macrophages following spinal cord injury in the lys-egfp-ki mouse model. In: Journal of

Neuroimmunology.

Wettenhall JM, Simpson KM, Satterley K, Smyth GK (2006) affylmGUI: a graphical user

interface for linear modeling of single channel microarray data. In: Bioinformatics, vol.

22, pp 897-899.

Yuan S, Qiu Z, Ghosh A (2009) TOX3 regulates calcium-dependent transcription in

neurons. In: Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 106, pp 2909-2914.

Zheng Y, Humphry M, Maguire JJ, Bennett MR, Clarke MCH (2013) Intracellular

Interleukin-1 Receptor 2 Binding Prevents Cleavage and Activity of Interleukin-1α,

Controlling Necrosis-Induced Sterile Inflammation. In: Immunity.

205

5. Chapitre 5 : Discussion & Conclusion

Les LME sont causées par un impact direct sur le tissu résultant en la destruction des

neurones, des axones, de la myéline et des cellules gliales. Les LME occasionnent aussi

l’apparition de dommages secondaires caractérisés par la mort par apoptose de neurones et

d’OLs. Ces dommages secondaires peuvent être causés par différents mécanismes

cellulaires et moléculaires tels que l’activation des cellules gliales, l’hémorragie et la

relâche de cytokines pro-inflammatoires et de glutamate. L’inflammation est aussi une

conséquence inévitable des LME. Les cellules immunitaires innées telles que les

neutrophiles et les monocytes sont recrutées rapidement au site de lésion (Fleming et al.,

2006, Stirling et Yong, 2008, Beck et al., 2010, Pineau et al., 2010). Il est connu que ces

cellules peuvent jouer un rôle important dans la propagation des dommages secondaires de

par leur implication dans la production de molécules oxydantes, d’enzymes protéolitiques

et de cytokines. Cependant, ces cellules joueraient également un rôle essentiel dans la

réparation tissulaire. L’existence de plusieurs sous-types de cellules immunitaires exerçant

un effet soit neurotoxique soit réparateur pourrait expliquer cette divergence dans les

différentes études effectuées sur ce sujet (Popovich et al., 1999) (Stirling et Yong, 2008)

(Shechter et al., 2009)(Lee et al., 2011). Une meilleure compréhension des mécanismes

régulant la migration, l’activation et les différentes fonctions de ces cellules immunitaires

nous permettrait donc d’identifier des cibles potentielles pour traiter le SNC lésé de façon à

diminuer la perte de tissu nerveux et promouvoir la réparation tissulaire.

Les travaux ayant mené à la rédaction de cette thèse avaient pour but d’identifier les

mécanismes impliqués dans l’initiation de l’inflammation et le recrutement des cellules

immunitaires innées ainsi que les mécanismes sous-jacents aux dommages tissulaires

occasionnant un déficit moteur chez la souris ayant subi une LME. Tout d’abord, nous nous

sommes intéressés aux mécanismes d’activation et de relâche de l’IL-1β impliquant le

récepteur purinergique P2X4R et les inflammasomes. Ensuite, nous nous sommes attardés

206

aux effets de la délétion des gènes codant pour les cytokines IL-1α et IL-1β sur

l’inflammation et la perte des fonctions locomotrices suite à une LME.

5.1. Étude du rôle de P2X4R Les résultats présentés dans le chapitre 3 nous ont permis d’identifier le P2X4R comme un

activateur important du clivage de l’IL-1β très tôt suite à une LME. Ce mécanisme semble

être dépendant de l’activation et de la formation d’un complexe protéique appelé

inflammasome étant donné que nous avons noté une augmentation de l’expression de la

caspase-1 clivée, la protéine effectrice nécessaire au clivage de l’IL-1β. Les souris P2x4r-/-

présentent une diminution d’expression des formes clivées de la caspase-1 et de l’IL-1β

ainsi qu’une récupération locomotrice plus rapide dès le premier jour post-LME

comparativement aux souris contrôles C57BL/6.

Dans cette étude, nous avons utilisé une méthode indirecte pour détecter la localisation

cellulaire de P2X4R, c’est-à-dire la détection de l’expression de la β-galactosidase dont le

gène fut inséré à la place du premier exon de P2X4R chez les souris P2x4r-/-. Nous avons

observé une forte colocalisation de P2X4R avec les marqueurs neuronaux NeuN et HuC/D

dans nos préparations de moelles épinières intactes et lésées (temps 24 heures post-LME).

Par contre, nous n’avons pas réussi à détecter le récepteur chez la microglie malgré le fait

qu’il fut rapporté à plusieurs reprises que la microglie exprime une variété de récepteurs

purinergiques (Färber and Kettenmann, 2006, Fields and Burnstock, 2006), dont P2X4R

(Schwab et al., 2005, Ulmann et al., 2008, Ulmann et al., 2013, Vázquez-Villoldo et al.,

2013). P2X4R fut aussi démontré comme étant important dans le contrôle des fonctions

inflammatoires et phagocytaires des microglies dans diverses maladies du SNC (Tozaki-

Saitoh et al., 2011). Récemment, P2X4R fut observé chez les cellules microgliales

CX3CR1+ 48 heures après une crise épileptique de longue durée (Ulmann et al., 2013).

Cependant, son niveau d’expression semblait varier selon l’état d’activation de la

microglie. Au cours de l’étude présentée dans le chapitre 4, nous avons démontré que la

microglie est responsable de la synthèse de l’IL-1α très tôt suite à une LME (c.-à-d. au

temps 4 heures post-lésion). Ensemble, ces résultats suggèrent qu’il serait intéressant de

207

déterminer l’expression de P2X4R à des temps plus tôt post-LME. Il demeure donc possible

que l’ATP relâchée en grande quantité immédiatement suivant la lésion puisse avoir

stimulé l’expression de P2X4R chez les microglies.

La présence de P2X4R dans les neurones semble être impliquée dans plusieurs fonctions

neuronales telles que la neurotransmission et la potentialisation synaptique (Fields and

Burnstock, 2006, Burnstock, 2007, Henshall et al., 2013). L’activation de P2X4R chez les

neurones entraîne une mort cellulaire rapide de même que l’activation des microglies. Il

demeure donc possible que la diminution de l’activation des microglies, déterminée en

fonction de la baisse de l’intensité du marquage galectine-3 observé chez les souris P2x4r-/-,

puisse être causée par l’absence du récepteur chez les neurones, résultant ainsi à un déficit

de stimulation de la microglie par des facteurs normalement relâchés par les neurones en

détresse. Il serait donc intéressant d’étudier les effets de ce récepteur chez la microglie et

les neurones séparément pour élucider le rôle de P2X4R dans l’activation et la prolifération

de la microglie. Pour ce faire, nous pourrions prendre avantage des modèles de souris

transgéniques en utilisant le système Cre-lox dans le but de déléter de façon cellule

spécifique un gène d’intérêt. In vitro, nous pourrions co-cultiver des cellules microgliales et

neurones préalablement traités avec le système CRISPR-Cas9 afin d’induire une mutation

non-fonctionnelle spécifique dans un gène d’intérêt comme P2x4r (Hsu et al., 2014).

Le mécanisme exact de l’activation de P2X4R et du clivage et de la relâche de l’IL-1β

demeure inconnu. L’ATP relâchée par les cellules endommagées et nécrotiques pourrait

l’être par l’entremise d’hémicanaux membranaires tels que les pannexines et les connexines

(Barbe et al., 2006). Les pannexines contribueraient à la propagation des dommages

neuronaux en permettant le transport des ions Ca2+ du milieu extracellulaire jusqu’à

l’intérieur de la cellule. Bien que les pannexines semblent rester dans une position ouverte,

il a été démontré que l’activation de la pannexine-1 (Panx1) facilite le passage de Ca2+ à

travers la membrane cellulaire (Vanden Abeele et al., 2006) (Locovei et al., 2006). Une

autre conséquence de l’activation de Panx1 est la sortie d’ATP de la cellule (Bao et al.,

2004). Les pannexines possèdent d’ailleurs une plus grande perméabilité à l’ATP

comparativement aux connexines (Iglesias et al., 2009, Iglesias and Spray, 2012). Plusieurs

208

interactions de Panx1 avec des récepteurs membranaires tels que le NMDA (N-methyl-D-

aspastate), le TRPV4 (transient receptor potential cation channel subfamily V member 4),

les récepteurs couplés aux protéines G et les récepteurs purinergiques ont été décrites

(Shestopalov and Slepak, 2014). Pelegrin et al. ont démontré que Panx1 est requise pour la

clivage de l’IL-1β par la caspase-1 de même que pour la relâche de cette cytokine en

réponse à l’activation de P2X7R par l’ATP dans des macrophages en culture (Pelegrin et

Surprenant, 2006) (Pelegrin et al., 2008). En effet, le traitement de macrophages en culture

avec un peptide inhibant Panx1, 10panx1, a pour effet de bloquer l’activation de la caspase-

1 en réponse à l’ATP, diminuant ainsi la relâche de l’IL-1α, l’IL-1β et l’IL-18. De plus

amples expériences seraient donc nécessaires pour vérifier l’importance de Panx1 suite à

l’activation de P2X4R et, par conséquent, dans les dommages neuronaux qui surviennent

suite à une LME. Toutefois, Silverman et al. ont démontré par co-immunoprécipitation que

Panx1 est capable de s’associer à P2X7R et la caspase-1 dans des cellules neuronales en

culture (Silverman et al., 2009). Cette étude a d’ailleurs démontré que l’activation de

l’inflammasome NLRP1 par les ions K+ peut être inhibée par l’ajout de probenecide, un

inhibiteur de Panx1. Ce mécanisme suggère donc la possibilité que Panx1 joue un rôle

important dans le clivage et la relâche de l’IL-1β par les neurones.

L’activation des récepteurs P2X suggère une augmentation des concentrations

intracellulaires en Ca2+, l’activation de protéases telles que les caspases et la calpaïne et

l’assemblage d’un inflammasome responsable du clivage de l’IL-1β. Plusieurs

inflammasomes candidats pourraient se former suite à l’activation par l’ATP, comme par

exemple NLRP1 (Silverman et al., 2009, Fan et al., 2014), NLRP2 (Minkiewicz et al.,

2013) et NLRP3 (Kanneganti et al., 2007, Gombault et al., 2012). L’inflammasome NLRP1

a déjà été identifié dans les neurones de la moelle épinière (de Rivero Vaccari et al., 2008)

ou du cerveau (de Rivero Vaccari et al., 2009) ainsi que dans les astrocytes, les

macrophages/microglies (Abulafia et al., 2009) et les OLs (Kummer et al., 2007). NLRP2

est aussi exprimé dans les astrocytes humains, du moins en culture (Minkiewicz et al.,

2013). Quant à NLRP3, il semble peu ou pas exprimé dans le cerveau normal (Kummer et

al., 2007, de Rivero Vaccari et al., 2008). Par contre, la situation est tout autre dans un

contexte pathologique. Dans la maladie d’Alzheimer, par exemple, il fut rapporté que

209

l’inflammasome NLRP3 est activé dans les cellules microgliales du cerveau en réponse à

l’augmentation des plaques β-amyloïdes (Tan et al., 2013). Des études in vitro et in vivo par

immunoprécipitation et par immunofluorescence pourraient contribuer dans le futur à

identifier les inflammasomes impliqués suite à l’activation de P2X4R.

Les P2XRs sont capables de former des homodimères mais peuvent aussi s’assembler en

hétérodimères avec d’autres P2XRs (North, 2002). Les récepteurs P2X4 et P2X7 ont la

possibilité d’influencer l’expression de l’un et l’autre, de sorte que l’expression de P2X4R

serait sur-régulée lorsque l’expression de P2X7R est sous-régulée (Weinhold et al., 2010).

Par contre, nous n’avons pas observé ce mécanisme de régulation suite à une LME, en

accord avec les résultats de d’autres études réalisées in vivo (Brône et al., 2007, Ulmann et

al., 2008, Barberà-Cremades et al., 2012). L’activation prolongée des P2XRs peut induire

la perméabilité de ces récepteurs à de plus grosses molécules telles que des colorants

fluorescents de plus de 900 Da de diamètre (Pelegrín, 2011). Les pores ainsi formés

seraient vraisemblablement associés à la mort cellulaire par apoptose (Virginio et al., 1999,

Mackenzie et al., 2005) et pourraient aussi impliquer la perméabilité de la membrane

mitochondriale (Bonora et al., 2014). Casas-Pruneda et al. ont mis à profit cette

caractéristique unique de P2X7R pour étudier l’interaction entre P2X4R et P2X7R (Casas-

Pruneda et al., 2009). Plus spécifiquement, ce groupe a étudié l’entrée du bromure

d’éthidium (BrEt) suite à une stimulation avec le Bz-ATP, un agoniste de P2X7R, dans des

cellules HEK-293 transfectées avec P2X4R, P2X7R ou les 2 récepteurs. Ils ont observé que

les cellules exprimant les 2 récepteurs présentent une entrée 4 fois plus faible en EtBr et

moins rapide comparativement aux cellules n’exprimant que P2X7R. De plus, l’amplitude

du courant Na+, mesurée par électrophysiologie, est fortement diminuée chez les cellules

exprimant les 2 récepteurs en comparaison avec celles n’exprimant que P2X7R. Par contre,

la coexpression de ces récepteurs a amélioré de façon siginificative la régulation du

courrant électrique cellulaire généré par l’activation de P2X7R. Ces résultats suggèrent

donc que la formation de larges pores dans la membrane, un signe avant-coureur de mort

cellulaire, et les autres effets biologiques de P2X7R pourraient être fortement régulés par la

présence de P2X4R. Il faudrait donc s’assurer que l’absence de P2X4R chez les souris

P2x4r-/- n’a pas entrainé d’effet sur l’activité biologique de P2X7R et que les effets

210

observés chez ces souris furent uniquement causés par l’absence de P2X4R. Supportant

cette possibilité sont les travaux de Hung et al. ayant démontré que ces 2 récepteurs

forment une certaine synergie. En effet, des études de co-immunoprécipitation effectuées

grâce à un anticorps liant le P2X4R ont démontré que P2X7R et Panx1 forment un

hétérotrimère avec P2X4R dans les cellules endothéliales des gencives suite à une

stimulation à l’ATP (Hung et al., 2013). Il semble que ce complexe favoriserait la

production de cytokines pro-inflammatoires telle que l’IL-1β en présence de P. gingivalis,

comme le suggère le fait que la sécrétion d’IL-1β par les cellules endothéliales soit bloquée

suite à une stimulation à l’ATP et un traitement avec des antagonistes de P2X7R (ex. :

PPADS, oxATP), un inhibiteur de Panx1 (probenecide) ou un inhibiteur de P2X4R (5-

BDBD). L’existence d’une association entre ces deux récepteurs P2X suppose une certaine

complexité de la voie de signalisation des récepteurs purinergiques. La création de modèles

transgéniques murins possédant des déficiences dans l’un ou l’autre de ces récepteurs ou

dans les deux de façon cellule spécifique serait très intéressante pour établir la dépendance

fonctionnelle in vivo de ces 2 récepteurs dans les mécanismes d’activation de

l’inflammation dans notre modèle de lésion.

Finalement, nous avons démontré que l’absence de P2X4R entraîne une amélioration des

fonctions locomotrices très tôt suite à une LME. Nous avions alors suggéré que le blocage

de ce récepteur dans la phase aigüe suivant la lésion serait un moyen efficace de prévenir

les effets néfastes de l’inflammation sur la perte des fonctions neurologiques dans plusieurs

modèles de lésion du SNC. Par conséquent, il serait intéressant de vérifier l’effet des

antagonistes de P2X4R sur l’activation de l’inflammasome et la propagation des dommages

neuronaux. Plusieurs drogues peuvent être utilisées pour bloquer ce récepteur. Parmi celles-

ci, nous retrouvons l’ivermectine, un inhibiteur allostérique de P2X4R, le TNP-ATP et le 5-

BDBD, deux antagonistes, ainsi que la paroxetine, un antidépresseur capable d’inhiber le

récepteur (Vázquez-Villoldo et al., 2013).

211

5.2. Étude des effets des cytokines de la famille de l’IL-1 : l’IL-1αα et l’IL-1ββ Les résultats présentés dans le chapitre 4 nous ont permis de démontrer que l’IL-1α est

impliquée dans la régulation des mécanismes de survie des OLs, et que son absence

entraîne une augmentation de la récupération des fonctions locomotrices suite à une LME.

L’effet protecteur de cette cytokine semble dépendant de la surexpression du facteur de

survie TOX3 chez les OLs. Nous avons tout d’abord analysé l’expression temporelle de

l’IL-1α et de l’IL-1β suite à une LME. L’IL-1α est très rapidement exprimée par la

microglie et ce dès le temps 4 heures post- LME, tandis que les neutrophiles et monocytes

pro-inflammatoires recrutés au site de lésion semblent être responsables de l’expression de

l’IL-1β entre 6 et 24 heures post-lésion. Étant donné que la pro-forme de l’IL-1α est

biologiquement active, contrairement à la pro-forme de l’IL-1β, il n’est pas étonnant que

l’expression et les effets de l’IL-1α suite à la lésion soient observés plus rapidement chez la

souris. Néanmoins, la pro-IL-1α pourrait avoir été rapidement clivée par des protéases

telles que la calpaïne (Carruth et al., 1991) (Zheng et al., 2013) ou la granzyme B (Afonina

et al., 2011). La calpaïne fut d’ailleurs associée à la propagation des dommages tissulaires

dans le SNC suite à une LME (Ray et al., 2003a, Vosler et al., 2008, Yang et al., 2013). Au

contraire, l’inhibition de la calpaïne avec E-64d chez le rat suite à une LME a eu pour effet

d’entraîner une diminution de la fragmentation de l’ADN génomique dans le tissu lésé. De

plus, cet inhibiteur a contribué à l’élévation du niveau de transcription du gène de la

protéine basique de la myéline (MBP), une composante importante de la structure de la

myéline, suggérant qu’un tel traitement pourrait améliorer le recouvrement des fonctions

locomotrices suite à une LME (Ray et al., 2003b). Amini et al. ont récemment produit une

souris déficiente en calpaïne spécifiquement dans le SNC (souris Nestin-cre; capns1flox/flox)

(Amini et al., 2013). Ils ont observé dans ce modèle une modification de la morphologie

des neurones pyramidaux CA1 chez les souris calpaïne-KO. En effet, l’absence de la

calpaïne a diminué la densité des épines dendritiques chez ces neurones ainsi que le nombre

totale d’épines chez l’animal. Une réduction des niveaux d’expression de certaines sous-

unités des récepteurs NMDA et AMPA a aussi été constatée, altérant ainsi la mémoire et

l’apprentissage. De plus, une déficience en calpaïne chez la souris a pour effet de diminuer

la sensitivité des neurones à une toxine spécifique du complexe 1 de la mitochondrie, le

212

MPP+, un métabolite actif du MPTP utilisé comme modèle animal de la maladie de

Parkinson. Dans cette étude, la survie neuronale fut favorisée via un mécanisme inhibant le

clivage de la sous-unité p35 de la kinase dépendante de la cycline (Cdk5). Étant donné le

rôle de la calpaïne dans le clivage de l’IL-1α et dans les dommages neuronaux, il serait

intéressant de caractériser les effets de cette protéase sur les OLs et la remyélinisation dans

notre modèle de LME.

Bien qu’il n’est pas surprenant que la microglie soit rapidement activée suite à une LME, il

s’agit de la toute première démonstration que cette cellule serait potentiellement impliquée

dans un mécanisme de régulation de la protéine de survie TOX3 chez les OLs. La microglie

fournit un environnement favorable à la croissance des OLs en produisant plusieurs

facteurs de croissance et médiateurs pro-inflammatoires nécessaires à la réparation

tissulaire et la remyélinisation (Lambertsen et al., 2009, Graeber et al., 2011, Peferoen et

al., 2014). Différentes études ont démontré que l’inhibition de la microgliose présente des

effets néfastes à la réparation tissulaire et la remyélinisation, suggérant ainsi une certaine

interaction physique et/ou moléculaire entre les microglies et les OLs. Il a été démontré que

les microglies s’accumulent dans le cerveau de souris traitées au cuprizone, une drogue

servant à induire la mort des OLs et une démyélinisation aiguë chez le rongeur, et

demeurent activées plusieurs jours suivant l’arrêt de la diète. Fait intéressant, l’inhibition de

l’activité de ces cellules grâce à un traitement à la minocycline permet de réduire la perte

d’OLs matures (CC1+) et de rétablir, du moins en partie, les niveaux d’expression de la

protéine basique de la myéline (MBP). Il fut également rapporté que la minocycline a pour

effet de diminuer la surexpression de l’ARNm du CNTF par les microglies situées dans les

zones de démyélinisation-remyélinisation. Ces résultats suggèrent que le CNTF relâché par

ces cellules une fois activées serait important pour la remyélinisation des axones (Tanaka et

al., 2013). Une seconde étude a aussi suggéré que la microglie favoriserait la

remyélinisation en stimulant la réponse des OPCs chez le rat dans un modèle de

démyélinisation avec le BrEt (Li et al., 2005). L’injection de la minocycline dans ce modèle

animal a eu pour effet de diminuer l’expression de deux marqueurs d’OPCs, soient le

PDGF-αR et Olig-1, 5 jours après le traitement au BrEt, moment auquel la prolifération des

OPCs est à son maximum suite à une démyélinisation. Il est à noter qu’Olig-1 et Olig-2

213

sont reconnus comme étant des facteurs de transcription nécessaires à la remyélinisation

dans le modèle de la cuprizone chez la souris. Ces protéines sont exprimées dans le noyau

des OLs et de leurs précurseurs et ce dès le jour 1 post-naissance (Arnett et al., 2004),

suggérant ainsi leur importance dans le développement du SNC.

D’un autre côté, la microglie peut aussi produire de nombreux médiateurs inflammatoires

pouvant infliger des dommages aux cellules du SNC tels que le glutamate, les MMPs, les

ROS et NOS ainsi que certaines cytokines (van Rossum and Hanisch, 2004, Graeber et al.,

2011, Peferoen et al., 2014). En lien avec cette affirmation, de nombreuses études ont

démontré que l’inhibition de l’activation et de la prolifération des microglies engendre des

effets neuroprotecteurs suite à des dommages neurologiques (Tikka et al., 2001, Stirling et

al., 2004, Yune et al., 2007, Howell et al., 2010, Schmitz et al., 2014). L’inhibition de

l’activité microgliale par la minocycline a permis de diminuer la production de métabolites

d’oxyde d’azote (NO) en réponse à des excitoxines (ex.: glutamate ou kainate) dans des

cultures mixtes provenant de moelles épinières via un mécanisme impliquant l’inhibition de

la phosphorylation de la MAPK p38 (Tikka et al., 2001). Yune et al. ont par la suite

approfondi l’étude de cette voie de signalisation en démontrant que l’inhibition de MAPK

p38 a pour effet de réduire la production de pro-NGF par les microglies dans la moelle

épinière lésée, définissant ainsi, un nouveau mécanisme par lequel les OLs pourraient

mourir suite à une LME chez le rat (Yune et al., 2007). L’équipe de Stirling et al. ont

rapporté que l’amélioration des fonctions locomotrices suite à l’inhibition de la microglie

par la minocycline serait plutôt due à une diminution de la dégénérescence rétrograde aiguë

dans les faisceaux corticospinaux (CST) (Stirling et al., 2004). Il est important de noter que

ces effets pourraient être occasionnés par d’autres types cellulaires étant donné que la

minocycline n’est pas spécifique aux microglies. Bien que l’IL-1β fut auparavant identifiée

comme étant nécessaire à la maturation des OPCs et la remyélinisation dans le modèle de la

cuprizone chez la souris (Mason et al., 2001), d’autres ont démontré qu’une diminution en

IL-1β résultant de l’inactivation des microglies permet d’augmenter l’intégrité de la matière

blanche chez des rats néonataux après 24 h d’exposition à une forte concentration (80% O2)

d’oxygène (Schmitz, 2014). Tous ces résultats suggèrent qu’il existe différentes fonctions

et états d’activation chez les cellules microgliales. Il serait donc intéressant d’étudier plus

214

en détail l’activation de la microglie et ses interactions physiques et moléculaires avec les

OLs dans notre modèle murin de LME dans le but de mieux contrôler les effets de la

microglie sur les OLs. L’observation de coupes histologiques par microscopie électronique

pourrait éventuellement nous fournir des évidences de l’intéraction physique entre ces 2

types cellulaires in vivo. De plus, nous pourrions prendre avantage de l’utilisation de co-

cultures de microglies et d’OLs ou de souris traitées avec un inhibiteur de la microglie pour

vérifier l’effet de cette cellule sur la prolifération et la différenciation des OL.

Nous avons aussi démontré que l’IL-1α joue un rôle dans les mécanismes cellulaires

impliqués dans la mort des OLs matures. En effet, l’absence de cette cytokine a pour effet

d’entrainer une amélioration de la récupération des fonctions locomotrices suite à une

LME. Tel que mentionné auparavant, l’IL-1α semble inhiber l’expression du facteur de

survie TOX3 chez les OLs. En effet, nous avons démontré que l’absence d’IL-1α chez la

souris augmente l’expression de TOX3 chez les OLs. Le mécanisme de régulation de

TOX3 dans les OLs par l’IL-1α demeure cependant inconnu. Des expériences futures

devront être réalisées pour établir si l’IL-1α possède un rôle direct ou indirect dans la

survie des OLs. L’utilisation de cultures d’OLs semble être une alternative très intéressante

puisque plusieurs modèles in vitro de mort cellulaire existent. L’équipe de Dittmer et al. a

démontré que la surexpression de TOX3 chez des cellules neuronales Neuro2a transfectées

avec un vecteur d’expression Myc-TOX3 protège celles-ci contre la mort cellulaire en

diminuant l’expression de gènes pro-apoptotiques tels que les caspases-3 et -9, Bax, Bid et

Bad et via la sur-régulation de gènes anti-apoptotiques tels que Bcl-XL et Bcl-2 (Dittmer et

al., 2011). Cette étude a aussi démontré que TOX3 est capable d’interagir avec CITED1 ou

CREB phosphorylé afin de former un complexe permettant la transcription de différents

promoteurs tel que les promoteurs C3 répondant à l’estrogène ou Bcl-2. Les modèles de

mort cellulaire utilisés dans cette étude comprenaient le traitement à la tunicamycine, une

drogue qui inhibe la synthèse des N-glycoprotéines et crée un stress mortel via le réticulum

endoplasmique, et la sur-expression de Bax qui elle mène à la relâche du cytochrome c par

les mitochondries et l’activation des caspases impliquées dans l’apoptose. Un autre modèle

in vitro très intéressant consiste en l’utilisation de conditions hypoxiques (O2 <0,3%, 5%

CO2, 95% N2) dans le but causer la nécrose et/ou l’apoptose. Ce modèle d’environnement

215

hypoxique fut entre autre utilisé par Cohen et al. lorsqu’ils ont rapporté la relâche de la

forme précurseure de l’IL-1α par des kératinocytes (BD7) nécrotiques après 24 heures de

culture (Cohen, 2010). De plus, cette relâche d’IL-1α fut corrélée à une augmentation du

recrutement de neutrophiles et de monocytes chez des souris injectées avec un surnageant

contenant des cellules nécrotiques. Enfin, l’ajout d’un anticorps dirigé contre l’IL-1α mais

pas contre l’IL-1β dans les lysats cellulaires a permis de diminuer le recrutement de cellules

pro-inflammatoires au site d’injection, fournissant ainsi des évidences du rôle spécifique de

l’IL-1α dans l’inflammation qui s’installe dans des conditions nécrotiques (Chen et al.,

2007). Donc, sachant que l’augmentation de TOX3 chez les OLs semble avoir un rôle

bénéfique sur la récupération locomotrice chez la souris, il pourrait être pertinent d’étudier

l’effet des conditions hypoxiques in vitro, par exemple, sur la mort des OLs et l’expression

de TOX3. Par la suite, nous pourrions vérifier l’effet de la sur-expression de TOX3 chez

des OLs transfectés avec un vecteur exprimant TOX3 et observer si la mort cellulaire est

effectivement diminuée chez ces OLs dans ces mêmes conditions.

Nous avons également observé un niveau d’expression basal plus élevé pour TOX3 chez

les souris Il-1α-/- naïves comparativement aux souris contrôles. La plus forte expression de

TOX3 chez les souris Il-1α-/- naïve suggère que cette protéine pourrait être fortement

régulée au cours du développement de l’animal. En effet, nous avons sacrifié des souris à

différents temps post-naissance (P3, P7, P10, P14, P18, P30) et observé que le nombre

d’OLs CC1+ TOX3+ est fortement augmenté chez les souris Il-1α-/- dès le dixième jour

suivant la naissance comparativement aux souris contrôles et Il-1β-/-. Ce temps correspond

au moment où la quantité de myéline tend à augmenter dans le cerveau de rongeurs en

développement, bien que des axones myélinisés soient déjà observés à P7 (Downes et

Mullins, 2013). Dans le cerveau de rats, les 10 premiers jours suivant la naissance

correspondent à des temps où la population microgliale se retrouve plutôt sous une forme

améboïde tandis que les microglies changent leur morphologie pour une forme ramifiée

vers la 14e journée post-naissance (Shigemoto-Mogami et al., 2014). Il fut aussi démontré

que les microglies peuvent stimuler l’oligodendrogénèse en favorisant la relâche de facteurs

trophiques e.g., IGF-1 (Butovski, 2006) et cytokines (e.g., IL-1β, IL-6 et TNF-α) ainsi que

la prolifération des cellules progénitrices O4+ (Shigemoto-Mogami et al., 2014). Pendant le

216

développement embryonnaire chez le rongeur, les OPCs semblent provenir de la région

ventrale de la moelle épinière avant de migrer vers les autres régions du SNC incluant le

cerveau (de Castro et al., 2005) (Crawford et al., 2014). Les OPCs se différencient en OLs

matures dans le SNC mais sont aussi capables de proliférer pour maintenir le nombre de

leur population. Il semblerait que ces cellules progénitrices auraient également le pouvoir

de générer des cellules de Schwann et, dans de plus rares occasions, des astrocytes

(Crawford et al., 2014). En plus des fonctions physiologiques dans le SNC sain ou en

développement, les OPCs jouent un rôle très important suite à une lésion tissulaire. En

effet, ces cellules migrent vers les zones de démyélinisation, prolifèrent et se différencient

en OLs matures dans le but de remyéliniser le tissu atteint (Zawadzka et al., 2010). Pour

bien déterminer le mécanisme de régulation de l’expression de TOX3 au cours du

développement, il serait intéressant d’étudier la migration des OPCs et leur différenciation

en OLs matures. Nous avons aussi planifié d’étudier par RT-PCR l’expression de l’ARNm

de l’IL-1α et de l’IL-1β à différents temps post-naissance (P1, P3, P7, P10, P14, P18, P30)

et vérifier si l’expression de l’IL-1α chez la microglie corrèle avec la présence de TOX3

dans les OLs.

Le développement des OLs est contrôlé par la présence de différents facteurs de croissance.

La présence de Sonic hedgehog (Shh) est nécessaire à l’apparition et à la différenciation des

OPCs dans un cerveau en développement et adulte (Orentas et al., 1999, Sussman et al.,

2002, Ortega et al., 2013). De plus, Shh semble jouer un rôle dans la remyélinisation

d’axones puisque son expression est augmentée chez les OLs Olig2+ dans un cerveau ayant

subi une démyélinisation via le traitement avec la lysophosphatidylcholine (LPC),

suggérant du même coup que ces cellules sont une source majeure de Shh (Ferrent et al.,

2013). Cette étude a aussi démontré que l’injection d’un vecteur sur-exprimant Shh chez la

souris favorise la différenciation des OPCs en OLs MBP+ au site de démyélinisation-

remyélinisation. Plus récemment, Jia et al. ont démontré qu’il est possible d’améliorer les

fonctions locomotrices chez le rat ayant subi une LME par une simple injection intrathécale

dans la moelle épinière de cellules souches mésenchymales (BMSCs) transfectées avec un

vecteur d’expression contenant Shh. Dans cette même étude, la surexpression de Shh a

également entraîné une sur-expression des facteurs de croissance bFGF et VEGF ainsi que

217

le neurofilament NF200 (Jia et al., 2014). Les résultats de cette étude corrèlent avec ceux de

2 études antérieures au cours desquelles il fut démontré que Shh possède des effets

bénéfiques dans un modèle d’ischémie cérébrale et de LME (Bambakidis et al., 2010,

Bambakidis et al., 2012). Ces résultats suggèrent donc que le ciblage de l’expression de

Shh serait d’une valeur thérapeutique prometteuse pour le traitement de plusieurs maladies

neurodégénératives chez l’humain. Il est important de noter que plusieurs cytokines telles

que l’IL-1β, TNF-α et IFN-γ sont capables d’induire l’expression de l’ARNm de Shh dans

des cultures primaires d’astrocytes (Falsig et al., 2006). Il fut aussi démontré que Shh est

exprimé par des astrocytes réactifs et que ces derniers stimuleraient la prolifération des

précurseurs Olig2+ suite à une lésion du cerveau (Amankulor et al., 2009). Cela suggère

que la voie de signalisation de Shh pourrait être en partie responsable du processus de

remyélinisation après l’apparition de dommages tissulaires du SNC. De plus, le facteur de

transcription NF-κB pouvant être induit par l’IL-β peut se lier au promoteur de Shh dans le

but d’activer la transcription de celui-ci (Kasperczyk et al., 2009). Ce mécanisme fut

démontré comme étant capable de stimuler la résistance des cellules à l’apoptose et la

croissance des cellules pancréatiques tumorales in vivo. Étant donné que la surexpression

de TOX3 semble réguler la survie des OLs et peut-être aussi celle des neurones via

l’expression de gènes pro- et anti-apoptotiques, il serait intéressant de vérifier si TOX3 peut

aussi réguler l’expression de Shh chez les OLs, favorisant ainsi la réparation tissulaire suite

à une LME.

5.3. Conclusion Les travaux présentés dans cette thèse ont permis d’identifier plusieurs médiateurs de

l’initiation de l’inflammation suite à une LME. Nous suggérons que le récepteur

purinergique P2X4R est activé très rapidement suite à une lésion, activant à son tour un

inflammasome encore non identifié (possiblement NLRP1b ou AIM2) qui serait nécessaire

au clivage de l’IL-1β impliqué dans la propagation de l’inflammation et des dommages

neuronaux dont la résultante serait une perte précoce des fonctions locomotrices chez la

souris.

218

Nous avons aussi démontré que la microglie exprime rapidement l’IL-1α tandis que

l’expression de l’IL-1β se fait un peu plus tardivement par les cellules immunitaires pro-

inflammatoires recrutées au site de lésion telles que les neutrophiles et les monocytes M1.

L’inhibition de l’IL-1α a permis d’accélérer la récupération locomotrice. Nous suggérons

donc que la microglie est primordiale à l’initiation de l’inflammation suite à la lésion. La

microglie contribuerait donc à la propagation des dommages tissulaires dans notre modèle.

Nous avons aussi prouvé que l’inhibition de l’IL-1α chez les souris Il-1α-/- a pour effet

d’augmenter l’expression de TOX3 dans les OLs. TOX3 est reconnu comme étant un

facteur de survie notamment pour les neurones. La sur-expression de TOX3 pourrait

possiblement contribuer à la diminution de la perte cellulaire suite à la lésion, mais cette

affirmation reste à être confirmée.

Cette thèse aura permis d’élucider de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires

déclenchés suite à une LME et qui pourraient représenter des cibles thérapeutiques

intéressantes pour l’amélioration des fonctions neurologiques chez les individus affligés par

ce type de lésion.

219

Chapitre 6 : Bibliographie de l’introduction et la discussion Abbate A, Salloum F, Vecile E, Das A, Hoke N, Straino S, Biondi-Zoccai G, Houser J-E,

Qureshi I, Ownby E, Gustini E, Biasucci L, Severino A, Capogrossi M, Vetrovec G,

Crea F, Baldi A, Kukreja R, Dobrina A (2008) Anakinra, a Recombinant Human

Interleukin-1 Receptor Antagonist, Inhibits Apoptosis in Experimental Acute

Myocardial Infarction. In: Circulation, vol. 117, pp 2670-2683.

Abbott NJ, Rönnbäck L, Hansson E (2006) Astrocyte-endothelial interactions at the blood-

brain barrier. In: Nature reviews Neuroscience, vol. 7, pp 41-53.

Abbracchio MP, Burnstock G, Boeynaems J-M, Barnard EA, Boyer JL, Kennedy C, Knight

GE, Fumagalli M, Gachet C, Jacobson KA, Weisman GA (2006) International

Union of Pharmacology LVIII: update on the P2Y G protein-coupled nucleotide

receptors: from molecular mechanisms and pathophysiology to therapy. In:

Pharmacol Rev, vol. 58, pp 281-341.

Abulafia D, De Rivero Vaccari J, Lozano J, Lotocki G, Keane R, Dietrich W (2009)

Inhibition of the inflammasome complex reduces the inflammatory response after

thromboembolic stroke in mice. In: Journal of Cerebral Blood Flow; Metabolism,

vol. 29, pp 534-544.

Adachi O, Kawai T, Takeda K, Matsumoto M, Tsutsui H, Sakagami M, Nakanishi K, Akira

S (1998) Targeted disruption of the MyD88 gene results in loss of IL-1- and IL-18-

mediated function. In: Immunity, vol. 9, pp 143-150.

220

Adamczak SE, de Rivero Vaccari JP, Dale G, Brand Iii FJ, Nonner D, Bullock M, Dahl GP,

Dietrich W, Keane RW (2014) Pyroptotic neuronal cell death mediated by the

AIM2 inflammasome. In: J Cereb Blood Flow Metab.

Afonina IS, Tynan GA, Logue SE, Cullen SP, Bots M, Lüthi AU, Reeves EP, McElvaney

NG, Medema JP, Lavelle EC, Martin SJ (2011) Granzyme B-dependent proteolysis

acts as a switch to enhance the proinflammatory activity of IL-1α. In: Molecular

Cell, vol. 44, pp 265-278.

Agostini L, Martinon F, Burns K, McDermott M, Hawkins P, Tschopp J (2004) NALP3

forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-

Wells autoinflammatory disorder. In: Immunity, vol. 20, pp 319-325.

Ajami B, Bennett JL, Krieger C, Tetzlaff W, Rossi FMV (2007) Local self-renewal can

sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. In: Nature

Neuroscience, vol. 10, pp 1538-1543.

Akira S, Uematsu S, Takeuchi O (2006) Pathogen recognition and innate immunity. In:

Cell, vol. 124, pp 783-801.

Ali S, Mohs A, Thomas M, Klare J, Ross R, Schmitz ML, Martin MU (2011) The dual

function cytokine IL-33 interacts with the transcription factor NF-κB to dampen

NF-κB-stimulated gene transcription. In: Journal of immunology (Baltimore, Md :

1950), vol. 187, pp 1609-1616.

Allan S, Tyrrell P, Rothwell N (2005) Interleukin-1 and neuronal injury. In: Nature reviews

Immunology, vol. 5, pp 629-640.

Amankulor N, Hambardzumyan D, Pyonteck S, Becher O, Joyce J, Holland E (2009) Sonic

Hedgehog Pathway Activation Is Induced by Acute Brain Injury and Regulated by

Injury-Related Inflammation. In: Journal of Neuroscience, vol. 29, pp 10299-10308.

221

Amini M, Ma C-l, Farazifard R, Zhu G, Zhang Y, Vanderluit J, Zoltewicz JS, Hage F,

Savitt JM, Lagace DC, Slack RS, Beique J-C, Baudry M, Greer PA, Bergeron R,

Park DS (2013) Conditional disruption of calpain in the CNS alters dendrite

morphology, impairs LTP, and promotes neuronal survival following injury. In: J

Neurosci, vol. 33, pp 5773-5784.

Anderson CM, Nedergaard M (2006) Emerging challenges of assigning P2X7 receptor

function and immunoreactivity in neurons. In: Trends in neurosciences, vol. 29, pp

257-262.

Arend W, Palmer G, Gabay C (2008) IL-1, IL-18, and IL-33 families of cytokines. In:

Immunological reviews, vol. 223, pp 20-38.

Arnett HA, Fancy SPJ, Alberta JA, Zhao C, Plant SR, Kaing S, Raine CS, Rowitch DH,

Franklin RJM, Stiles CD (2004) bHLH transcription factor Olig1 is required to

repair demyelinated lesions in the CNS. In: Science (New York, NY), vol. 306, pp

2111-2115.

Auffray C, Fogg D, Garfa M, Elain G, Join-Lambert O, Kayal S, Sarnacki S, Cumano A,

Lauvau G, Geissmann F (2007) Monitoring of Blood Vessels and Tissues by a

Population of Monocytes with Patrolling Behavior. In: Science (New York, NY),

vol. 317, pp 666-670.

Auffray C, Sieweke M, Geissmann F (2009) Blood Monocytes: Development,

Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. In: Annual Review of

Immunology, vol. 27, pp 669-692.

Bambakidis NC, Petrullis M, Kui X, Rothstein B, Karampelas I, Kuang Y, Selman WR,

LaManna JC, Miller RH (2012) Improvement of neurological recovery and

222

stimulation of neural progenitor cell proliferation by intrathecal administration of

Sonic hedgehog. In: J Neurosurg, vol. 116, pp 1114-1120.

Bambakidis NC, Wang X, Lukas RJ, Spetzler RF, Sonntag VKH, Preul MC (2010)

Intravenous hedgehog agonist induces proliferation of neural and oligodendrocyte

precursors in rodent spinal cord injury. In: Neurosurgery, vol. 67, pp 1709-1715;

discussion 1715.

Bao F, Dekaban GA, Weaver LC (2005) Anti-CD11d antibody treatment reduces free

radical formation and cell death in the injured spinal cord of rats. In: Journal of

Neurochemistry, vol. 94, pp 1361-1373.

Bao L, Locovei S, Dahl G (2004) Pannexin membrane channels are mechanosensitive

conduits for ATP. In: FEBS Lett, vol. 572, pp 65-68.

Barbe MT, Monyer H, Bruzzone R (2006) Cell-cell communication beyond connexins: the

pannexin channels. In: Physiology (Bethesda), vol. 21, pp 103-114.

Barberà-Cremades M, Baroja-Mazo A, Gomez A, Machado F, Di Virgilio F, Pelegrín P

(2012) P2X7 receptor-stimulation causes fever via PGE2 and IL-1β release. In:

FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for

Experimental Biology.

Basu A, Krady J, O&apos;Malley M, Styren S, DeKosky S, Levison S (2002) The type 1

interleukin-1 receptor is essential for the efficient activation of microglia and the

induction of multiple proinflammatory mediators in response to brain injury. In:

The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience,

vol. 22, pp 6071-6082.

Bauernfeind F, Horvath G, Stutz A, Alnemri E, Macdonald K, Speert D, Fernandes-

Alnemri T, Wu J, Monks B, Fitzgerald K, Hornung V, Latz E (2009) Cutting Edge:

223

NF- B Activating Pattern Recognition and Cytokine Receptors License NLRP3

Inflammasome Activation by Regulating NLRP3 Expression. In: The Journal of

Immunology, vol. 183, pp 787-791.

Beck K, Nguyen H, Galvan M, Salazar D, Woodruff T, Anderson A (2010) Quantitative

analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury: evidence for a

multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment. In: Brain,

vol. 133, pp 433-447.

Beggs S, Trang T, Salter M (2012) P2X4R(+) microglia drive neuropathic pain. In: Nature

neuroscience, vol. 15, pp 1068-1073.

Bell MT, Puskas F, Agoston VA, Cleveland JC, Freeman KA, Gamboni F, Herson PS,

Meng X, Smith PD, Weyant MJ, Fullerton DA, Reece TB (2013) Toll-like receptor

4-dependent microglial activation mediates spinal cord ischemia-reperfusion injury.

In: Circulation, vol. 128, pp S152-156.

Bermudez LE, Petrofsky M, Stevens P (1998) Treatment with recombinant granulocyte

colony-stimulating factor (Filgrastin) stimulates neutrophils and tissue macrophages

and induces an effective non-specific response against Mycobacterium avium in

mice. In: Immunology, vol. 94, pp 297-303.

Bianco F, Ceruti S, Colombo A, Fumagalli M, Ferrari D, Pizzirani C, Matteoli M, Di

Virgilio F, Abbracchio M, Verderio C (2006) A role for P2X 7in microglial

proliferation. In: Journal of Neurochemistry, vol. 99, pp 745-758.

Boehme SA, Lio FM, Maciejewski-Lenoir D, Bacon KB, Conlon PJ (2000) The chemokine

fractalkine inhibits Fas-mediated cell death of brain microglia. In: Journal of

immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 165, pp 397-403.

224

Bonora M, Wieckowski MR, Chinopoulos C, Kepp O, Kroemer G, Galluzzi L, Pinton P

(2014) Molecular mechanisms of cell death: central implication of ATP synthase in

mitochondrial permeability transition. In: Oncogene, vol. 0.

Borregaard N (2010) Neutrophils, from marrow to microbes. In: Immunity, vol. 33, pp 657-

670.

Boutin H, LeFeuvre R, Horai R, Asano M, Iwakura Y, Rothwell N (2001) Role of IL-

1alpha and IL-1beta in ischemic brain damage. In: The Journal of neuroscience : the

official journal of the Society for Neuroscience, vol. 21, pp 5528-5534.

Bracchi-Ricard V, Lambertsen KL, Ricard J, Nathanson L, Karmally S, Johnstone J,

Ellman DG, Frydel B, Mctigue DM, Bethea JR (2013) Inhibition of astroglial NF-

kappaB enhances oligodendrogenesis following spinal cord injury. In: J

Neuroinflammation, vol. 10, p 92.

Bradbury EJ, Moon LDF, Popat RJ, King VR, Bennett GS, Patel PN, Fawcett JW,

McMahon SB (2002) Chondroitinase ABC promotes functional recovery after

spinal cord injury. In: Nature, vol. 416, pp 636-640.

Brambilla R, Bracchi-Ricard V, Hu W-H, Frydel B, Bramwell A, Karmally S, Green EJ,

Bethea JR (2005) Inhibition of astroglial nuclear factor kappaB reduces

inflammation and improves functional recovery after spinal cord injury. In: J Exp

Med, vol. 202, pp 145-156.

Brambilla R, Hurtado A, Persaud T, Esham K, Pearse D, Oudega M, Bethea J (2009)

Transgenic inhibition of astroglial NF-κB leads to increased axonal sparing and

sprouting following spinal cord injury. In: Journal of Neurochemistry, vol. 110, pp

765-778.

225

Brône B, Moechars D, Marrannes R, Mercken M, Meert T (2007) P2X currents in

peritoneal macrophages of wild type and P2X4 -/- mice. In: Immunol Lett, vol. 113,

pp 83-89.

Bruce AJ, Boling W, Kindy MS, Peschon J, Kraemer PJ, Carpenter MK, Holtsberg FW,

Mattson MP (1996) Altered neuronal and microglial responses to excitotoxic and

ischemic brain injury in mice lacking TNF receptors. In: Nat Med, vol. 2, pp 788-

794.

Bruey J-M, Bruey-Sedano N, Luciano F, Zhai D, Balpai R, Xu C, Kress C, Bailly-Maitre

B, Li X, Osterman A, Matsuzawa S-i, Terskikh A, Faustin B, Reed J (2007) Bcl-2

and Bcl-XL regulate proinflammatory caspase-1 activation by interaction with

NALP1. In: Cell, vol. 129, pp 45-56.

Bsibsi M, Ravid R, Gveric D, van Noort JM (2002) Broad expression of Toll-like receptors

in the human central nervous system. In: J Neuropathol Exp Neurol, vol. 61, pp

1013-1021.

Burnstock G (2007) Physiology and pathophysiology of purinergic neurotransmission. In:

Physiol Rev, vol. 87, pp 659-797.

Burnstock G, Arnett TR, Orriss IR (2013) Purinergic signalling in the musculoskeletal

system. In: Purinergic Signalling.

Buryskova M, Pospisek M, Grothey A, Simmet T, Burysek L (2004) Intracellular

interleukin-1alpha functionally interacts with histone acetyltransferase complexes.

In: The Journal of biological chemistry, vol. 279, pp 4017-4026.

Bush TG, Puvanachandra N, Horner CH, Polito A, Ostenfeld T, Svendsen CN, Mucke L,

Johnson MH, Sofroniew MV (1999) Leukocyte infiltration, neuronal degeneration,

226

and neurite outgrowth after ablation of scar-forming, reactive astrocytes in adult

transgenic mice. In: Neuron, vol. 23, pp 297-308.

Cardona A, Pioro E, Sasse M, Kostenko V, Cardona S, Dijkstra I, Huang D, Kidd G,

Dombrowski S, Dutta R, Lee J-C, Cook D, Jung S, Lira S, Littman D, Ransohoff R

(2006) Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. In: Nature

neuroscience, vol. 9, pp 917-924.

Carriere V, Roussel L, Ortega N, Lacorre D-A, Americh L, Aguilar L, Bouche G, Girard J-

P (2007) IL-33, the IL-1-like cytokine ligand for ST2 receptor, is a chromatin-

associated nuclear factor in vivo. In: Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America, vol. 104, pp 282-287.

Carruth LM, Demczuk S, Mizel SB (1991) Involvement of a calpain-like protease in the

processing of the murine interleukin 1 alpha precursor. In: J Biol Chem, vol. 266,

pp 12162-12167.

Casanova J-L, Abel L, Quintana-Murci L (2011) Human TLRs and IL-1Rs in Host

Defense: Natural Insights from Evolutionary, Epidemiological, and Clinical

Genetics. In: Annual Review of Immunology, vol. 29, pp 447-491.

Casas-Pruneda G, Reyes JP, Pérez-Flores G, Pérez-Cornejo P, Arreola J (2009) Functional

interactions between P2X4 and P2X7 receptors from mouse salivary epithelia. In:

The Journal of physiology, vol. 587, pp 2887-2901.

Casha S, Yu WR, Fehlings MG (2001) Oligodendroglial apoptosis occurs along

degenerating axons and is associated with FAS and p75 expression following spinal

cord injury in the rat. In: Neuroscience, vol. 103, pp 203-218.

227

Cayrol C, Girard J-P (2009) The IL-1-like cytokine IL-33 is inactivated after maturation by

caspase-1. In: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

States of America, vol. 106, pp 9021-9026.

Charo IF, Ransohoff RM (2006) The many roles of chemokines and chemokine receptors

in inflammation. In: The New England journal of medicine, vol. 354, pp 610-621.

Chen C-J (2006) MyD88-dependent IL-1 receptor signaling is essential for gouty

inflammation stimulated by monosodium urate crystals. In: The Journal of clinical

investigation, vol. 116, pp 2262-2271.

Chen C-J, Kono H, Golenbock D, Reed G, Akira S, Rock KL (2007) Identification of a key

pathway required for the sterile inflammatory response triggered by dying cells. In:

Nature medicine, vol. 13, pp 851-856.

Chen K-B, Uchida K, Nakajima H, Yayama T, Hirai T, Watanabe S, Guerrero AR,

Kobayashi S, Ma W-Y, Liu S-Y, Baba H (2011) Tumor necrosis factor-α antagonist

reduces apoptosis of neurons and oligodendroglia in rat spinal cord injury. In:

Spine, vol. 36, pp 1350-1358.

Chen L, Brosnan CF (2006) Exacerbation of experimental autoimmune encephalomyelitis

in P2X7R-/- mice: evidence for loss of apoptotic activity in lymphocytes. In:

Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 176, pp 3115-3126.

Chen W-F, Jean Y-H, Sung C-S, Wu G-J, Huang S-Y, Ho J-T, Su T-M, Wen Z-H (2008)

Intrathecally injected granulocyte colony-stimulating factor produced

neuroprotective effects in spinal cord ischemia via the mitogen-activated protein

kinase and Akt pathways. In: Neuroscience, vol. 153, pp 31-43.

Chen Y, Swanson RA (2003) Astrocytes and brain injury. In: J Cereb Blood Flow Metab,

vol. 23, pp 137-149.

228

Chi L-Y, Yu J, Zhu H, Li X-G, Zhu S-G, Kindy MS (2008) The dual role of tumor necrosis

factor-alpha in the pathophysiology of spinal cord injury. In: Neuroscience letters,

vol. 438, pp 174-179.

Christophi GP, Gruber RC, Panos M, Christophi RL, Jubelt B, Massa PT (2012)

Interleukin-33 upregulation in peripheral leukocytes and CNS of multiple sclerosis

patients. In: Clin Immunol, vol. 142, pp 308-319.

Cohen I, Rider P, Carmi Y, Braiman A, Dotan S, White M, Voronov E, Martin M,

Dinarello C, Apte R (2010) Differential release of chromatin-bound IL-1alpha

discriminates between necrotic and apoptotic cell death by the ability to induce

sterile inflammation. In: Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, vol. 107, pp 2574-2579.

Corbaz A, ten Hove T, Herren S, Graber P, Schwartsburd B, Belzer I, Harrison J, Plitz T,

Kosco-Vilbois MH, Kim S-H, Dinarello CA, Novick D, van Deventer S, Chvatchko

Y (2002) IL-18-binding protein expression by endothelial cells and macrophages is

up-regulated during active Crohn's disease. In: Journal of immunology (Baltimore,

Md : 1950), vol. 168, pp 3608-3616.

Coull JAM, Beggs S, Boudreau D, Boivin D, Tsuda M, Inoue K, Gravel C, Salter MW, De

Koninck Y (2005) BDNF from microglia causes the shift in neuronal anion gradient

underlying neuropathic pain. In: Nature, vol. 438, pp 1017-1021.

Craigie E, Birch RE, Unwin RJ, Wildman SS (2013) The relationship between P2X4 and

P2X7: a physiologically important interaction? In: Front Physiol, vol. 4, p 216.

Crawford AH, Stockley JH, Tripathi RB, Richardson WD, Franklin RJM (2014)

Oligodendrocyte progenitors: Adult stem cells of the central nervous system? In:

Exp Neurol.

229

Cregg JM, Depaul MA, Filous AR, Lang BT, Tran A, Silver J (2014) Functional

regeneration beyond the glial scar. In: Experimental neurology, vol. 253C, pp 197-

207.

Crespo D, Asher RA, Lin R, Rhodes KE, Fawcett JW (2007) How does chondroitinase

promote functional recovery in the damaged CNS? In: Experimental neurology, vol.

206, pp 159-171.

Davalos D, Grutzendler J, Yang G, Kim J, Zuo Y, Jung S, Littman D, Dustin M, Gan W-B

(2005) ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. In:

Nature neuroscience, vol. 8, pp 752-758.

David S, Lacroix S (2003) Molecular approaches to spinal cord repair. In: Annual Review

of Neuroscience, vol. 26, pp 411-440.

de Castro F, Bribián A (2005) The molecular orchestra of the migration of oligodendrocyte

precursors during development. In: Brain Res Brain Res Rev, vol. 49, pp 227-241.

de Rivero Vaccari JP, Lotocki G, Alonso OF, Bramlett HM, Dietrich WD, Keane RW

(2009) Therapeutic neutralization of the NLRP1 inflammasome reduces the innate

immune response and improves histopathology after traumatic brain injury. In: J

Cereb Blood Flow Metab, vol. 29, pp 1251-1261.

de Rivero Vaccari JP, Lotocki G, Marcillo AE, Dietrich WD, Keane RW (2008) A

molecular platform in neurons regulates inflammation after spinal cord injury. In:

The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience,

vol. 28, pp 3404-3414.

Del Puerto A, Wandosell F, Garrido JJ (2013) Neuronal and glial purinergic receptors

functions in neuron development and brain disease. In: Front Cell Neurosci, vol. 7,

p 197.

230

Dénes A, Ferenczi S, Halász J, Környei Z, Kovács KJ (2008) Role of CX3CR1 (fractalkine

receptor) in brain damage and inflammation induced by focal cerebral ischemia in

mouse. In: J Cereb Blood Flow Metab, vol. 28, pp 1707-1721.

Di Virgilio F, Ceruti S, Bramanti P, Abbracchio M (2009) Purinergic signalling in

inflammation of the central nervous system. In: Trends in neurosciences, vol. 32, pp

79-87.

Diaz-Hernandez JI, Gomez-Villafuertes R, León-Otegui M, Hontecillas-Prieto L, Del

Puerto A, Trejo JL, Lucas JJ, Garrido JJ, Gualix J, Miras-Portugal MT, Diaz-

Hernandez M (2012) In vivo P2X7 inhibition reduces amyloid plaques in

Alzheimer's disease through GSK3β and secretases. In: Neurobiol Aging, vol. 33,

pp 1816-1828.

Dinarello C (2007) Interleukin-18 and the pathogenesis of inflammatory diseases. In:

Seminars in nephrology, vol. 27, pp 98-114.

Dinarello CA (1991) Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. In: Blood, vol. 77, pp

1627-1652.

Dinarello CA (1994) The interleukin-1 family: 10 years of discovery. In: FASEB journal :

official publication of the Federation of American Societies for Experimental

Biology, vol. 8, pp 1314-1325.

Dinarello CA (1999) IL-18: A TH1-inducing, proinflammatory cytokine and new member

of the IL-1 family. In: The Journal of allergy and clinical immunology, vol. 103, pp

11-24.

Dinarello CA (2009) Immunological and inflammatory functions of the interleukin-1

family. In: Annual Review of Immunology, vol. 27, pp 519-550.

231

Dinarello CA, Simon A, Van Der Meer JWM (2012) Treating inflammation by blocking

interleukin-1 in a broad spectrum of diseases. In: Nat Rev Drug Discov, vol. 11, pp

633-652.

Dittmer S, Kovacs Z, Yuan SH, Siszler G, Kögl M, Summer H, Geerts A, Golz S, Shioda

T, Methner A (2011) TOX3 is a neuronal survival factor that induces transcription

depending on the presence of CITED1 or phosphorylated CREB in the

transcriptionally active complex. In: Journal of Cell Science, vol. 124, pp 252-260.

Domeniconi M, Cao Z, Spencer T, Sivasankaran R, Wang K, Nikulina E, Kimura N, Cai H,

Deng K, Gao Y, He Z, Filbin M (2002) Myelin-associated glycoprotein interacts

with the Nogo66 receptor to inhibit neurite outgrowth. In: Neuron, vol. 35, pp 283-

290.

Donnelly D, Longbrake E, Shawler T, Kigerl K, Lai W, Tovar C, Ransohoff R, Popovich P

(2011) Deficient CX3CR1 signaling promotes recovery after mouse spinal cord

injury by limiting the recruitment and activation of Ly6Clo/iNOS+ macrophages.

In: The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for

Neuroscience, vol. 31, pp 9910-9922.

Dostert C, Ludigs K, Guarda G (2013) Innate and adaptive effects of inflammasomes on T

cell responses. In: Curr Opin Immunol.

Dostert C, Pétrilli V, Van Bruggen R, Steele C, Mossman BT, Tschopp J (2008) Innate

immune activation through Nalp3 inflammasome sensing of asbestos and silica. In:

Science (New York, NY), vol. 320, pp 674-677.

Downes N, Mullins P (2013) The Development of Myelin in the Brain of the Juvenile Rat.

In: Toxicol Pathol.

232

Dreyfus CF, Dai X, Lercher LD, Racey BR, Friedman WJ, Black IB (1999) Expression of

neurotrophins in the adult spinal cord in vivo. In: J Neurosci Res, vol. 56, pp 1-7.

Eash KJ, Means JM, White DW, Link DC (2009) CXCR4 is a key regulator of neutrophil

release from the bone marrow under basal and stress granulopoiesis conditions. In:

Blood, vol. 113, pp 4711-4719.

Eddleston M, Mucke L (1993) Molecular profile of reactive astrocytes--implications for

their role in neurologic disease. In: Neuroscience, vol. 54, pp 15-36.

Eigenbrod T, Park J-H, Harder J, Iwakura Y, Núñez G (2008) Cutting edge: critical role for

mesothelial cells in necrosis-induced inflammation through the recognition of IL-1

alpha released from dying cells. In: The Journal of Immunology, vol. 181, pp 8194-

8198.

Elmore MRP, Najafi AR, Koike MA, Dagher NN, Spangenberg EE, Rice RA, Kitazawa M,

Matusow B, Nguyen H, West BL, Green KN (2014) Colony-stimulating factor 1

receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia

progenitor cell in the adult brain. In: Neuron, vol. 82, pp 380-397.

Eng LF, Ghirnikar RS, Lee YL (2000) Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one

years (1969-2000). In: Neurochem Res, vol. 25, pp 1439-1451.

Falsig J, Pörzgen P, Lund S, Schrattenholz A, Leist M (2006) The inflammatory

transcriptome of reactive murine astrocytes and implications for their innate

immune function. In: J Neurochem, vol. 96, pp 893-907.

Fan C, Zhao X, Guo X, Cao X, Cai J (2014) P2X4 promotes interleukin‑1β production in

osteoarthritis via NLRP1. In: Mol Med Rep, vol. 9, pp 340-344.

233

Färber K, Kettenmann H (2006) Purinergic signaling and microglia. In: Pflügers Archiv -

European Journal of Physiology, vol. 452, pp 615-621.

Faulkner JR, Herrmann JE, Woo MJ, Tansey KE, Doan NB, Sofroniew MV (2004)

Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. In:

J Neurosci, vol. 24, pp 2143-2155.

Faustin B, Chen Y, Zhai D, Le Negrate G, Lartigue L, Satterthwait A, Reed J (2009)

Mechanism of Bcl-2 and Bcl-X(L) inhibition of NLRP1 inflammasome: loop

domain-dependent suppression of ATP binding and oligomerization. In:

Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 106, pp 3935-3940.

Faustin B, Lartigue L, Bruey J-M, Luciano F, Sergienko E, Bailly-Maitre B, Volkmann N,

Hanein D, Rouiller I, Reed JC (2007) Reconstituted NALP1 inflammasome reveals

two-step mechanism of caspase-1 activation. In: Molecular Cell, vol. 25, pp 713-

724.

Fernandes-Alnemri T, Yu J-W, Juliana C, Solorzano L, Kang S, Wu J, Datta P, McCormick

M, Huang L, McDermott E, Eisenlohr L, Landel CP, Alnemri ES (2010) The AIM2

inflammasome is critical for innate immunity to Francisella tularensis. In: Nature

Immunology, vol. 11, pp 385-393.

Ferrari D, Chiozzi P, Falzoni S, Dal Susino M, Melchiorri L, Baricordi OR, Di Virgilio F

(1997) Extracellular ATP triggers IL-1 beta release by activating the purinergic P2Z

receptor of human macrophages. In: Journal of immunology (Baltimore, Md :

1950), vol. 159, pp 1451-1458.

Ferrari D, Pizzirani C, Adinolfi E, Lemoli R, Curti A, Idzko M, Panther E, Di Virgilio F

(2006) The P2X7 receptor: a key player in IL-1 processing and release. In: Journal

of immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 176, pp 3877-3883.

234

Fields R, Burnstock G (2006) Purinergic signalling in neuron–glia interactions. In: Nature

reviews Neuroscience, vol. 7, pp 423-436.

Figley SA, Khosravi R, Legasto JM, Tseng Y-F, Fehlings M (2013) Characterization of

Vascular Disruption and Blood-Spinal Cord Barrier Permeability Following

Traumatic Spinal Cord Injury. In: Journal of Neurotrauma, p 131117084218009.

Fleming J, Norenberg M, Ramsay D, Dekaban G, Marcillo A, Saenz A, Pasquale-Styles M,

Dietrich W, Weaver L (2006) The cellular inflammatory response in human spinal

cords after injury. In: Brain, vol. 129, pp 3249-3269.

Franchi L, Eigenbrod T, Muñoz-Planillo R, Nuñez G (2009) The inflammasome: a caspase-

1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. In:

Nat Immunol, vol. 10, pp 241-247.

Freund P, Schmidlin E, Wannier T, Bloch J, Mir A, Schwab ME, Rouiller EM (2009) Anti-

Nogo-A antibody treatment promotes recovery of manual dexterity after unilateral

cervical lesion in adult primates--re-examination and extension of behavioral data.

In: The European journal of neuroscience, vol. 29, pp 983-996.

Gaudet A, Popovich P, Ramer M (2011) Wallerian degeneration: Gaining perspective on

inflammatory events after peripheral nerve injury. In: Journal of neuroinflammation,

vol. 8, p 110.

Geissmann F, Jung S, Littman D (2003) Blood monocytes consist of two principal subsets

with distinct migratory properties. In: Immunity, vol. 19, pp 71-82.

Geissmann F, Manz M, Jung S, Sieweke M, Merad M, Ley K (2010) Development of

Monocytes, Macrophages, and Dendritic Cells. In: Science (New York, NY), vol.

327, pp 656-661.

235

Genovese T, Mazzon E, Crisafulli C, Di Paola R, Muià C, Esposito E, Bramanti P,

Cuzzocrea S (2008) TNF-alpha blockage in a mouse model of SCI: evidence for

improved outcome. In: Shock, vol. 29, pp 32-41.

Gerondakis S, Grumont RJ, Banerjee A (2007) Regulating B-cell activation and survival in

response to TLR signals. In: Immunol Cell Biol, vol. 85, pp 471-475.

Ghayur T, Banerjee S, Hugunin M, Butler D, Herzog L, Carter A, Quintal L, Sekut L,

Talanian R, Paskind M, Wong W, Kamen R, Tracey D, Allen H (1997) Caspase-1

processes IFN-gamma-inducing factor and regulates LPS-induced IFN-gamma

production. In: Nature, vol. 386, pp 619-623.

Ginhoux F, Greter M, Leboeuf M, Nandi S, See P, Gokhan S, Mehler MF, Conway SJ, Ng

LG, Stanley ER, Samokhvalov IM, Merad M (2010) Fate mapping analysis reveals

that adult microglia derive from primitive macrophages. In: Science (New York,

NY), vol. 330, pp 841-845.

Gombault A, Baron L, Couillin I (2012) ATP release and purinergic signaling in NLRP3

inflammasome activation. In: Front Immunol, vol. 3, p 414.

Gordon S (2002) Pattern recognition receptors: doubling up for the innate immune

response. In: Cell, vol. 111, pp 927-930.

Gordon S, Taylor P (2005) Monocyte and macrophage heterogeneity. In: Nature reviews

Immunology, vol. 5, pp 953-964.

Gorio A, Gokmen N, Erbayraktar S, Yilmaz O, Madaschi L, Cichetti C, Di Giulio AM,

Vardar E, Cerami A, Brines M (2002) Recombinant human erythropoietin

counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from

experimental spinal cord trauma. In: Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America, vol. 99, pp 9450-9455.

236

Graeber M, Li W, Rodriguez M (2011) Role of microglia in CNS inflammation. In: FEBS

letters, vol. 585, pp 3798-3805.

Grandpre T, Strittmatter S (2001) Nogo: A Molecular Determinant of Axonal Growth and

Regeneration. In: The Neuroscientist, vol. 7, pp 377-386.

Graves BJ, Hatada MH, Hendrickson WA, Miller JK, Madison VS, Satow Y (1990)

Structure of interleukin 1 alpha at 2.7-A resolution. In: Biochemistry, vol. 29, pp

2679-2684.

Greenhalgh A, Galea J, Dénes A, Tyrrell P, Rothwell N (2010) Rapid brain penetration of

interleukin-1 receptor antagonist in rat cerebral ischaemia: pharmacokinetics,

distribution, protection. In: British Journal of Pharmacology, vol. 160, pp 153-159.

Gris D (2004) Transient Blockade of the CD11d/CD18 Integrin Reduces Secondary

Damage after Spinal Cord Injury, Improving Sensory, Autonomic, and Motor

Function. In: Journal of Neuroscience, vol. 24, pp 4043-4051.

Gris D, Ye Z, Iocca H, Wen H, Craven R, Gris P, Huang M, Schneider M, Miller S, Ting J

(2010) NLRP3 Plays a Critical Role in the Development of Experimental

Autoimmune Encephalomyelitis by Mediating Th1 and Th17 Responses. In: The

Journal of Immunology, vol. 185, pp 974-981.

Gross O, Thomas C, Guarda G, Tschopp J (2011) The inflammasome: an integrated view.

In: Immunological reviews, vol. 243, pp 136-151.

Gu BJ, Sluyter R, Skarratt KK, Shemon AN, Dao-Ung L-P, Fuller SJ, Barden JA, Clarke

AL, Petrou S, Wiley JS (2004) An Arg307 to Gln polymorphism within the ATP-

binding site causes loss of function of the human P2X7 receptor. In: The Journal of

biological chemistry, vol. 279, pp 31287-31295.

237

Gu Y, Kuida K, Tsutsui H, Ku G, Hsiao K, Fleming MA, Hayashi N, Higashino K,

Okamura H, Nakanishi K, Kurimoto M, Tanimoto T, Flavell RA, Sato V, Harding

MW, Livingston DJ, Su MS (1997) Activation of interferon-gamma inducing factor

mediated by interleukin-1beta converting enzyme. In: Science (New York, NY),

vol. 275, pp 206-209.

Guarda G, Zenger M, Yazdi A, Schroder K, Ferrero I, Menu P, Tardivel A, Mattmann C,

Tschopp J (2011) Differential Expression of NLRP3 among Hematopoietic Cells.

In: The Journal of Immunology, vol. 186, pp 2529-2534.

Gutcher I, Urich E, Wolter K, Prinz M, Becher B (2006) Interleukin 18-independent

engagement of interleukin 18 receptor-alpha is required for autoimmune

inflammation. In: Nature Immunology, vol. 7, pp 946-953.

Hamada Y, Ikata T, Katoh S, Nakauchi K, Niwa M, Kawai Y, Fukuzawa K (1996)

Involvement of an intercellular adhesion molecule 1-dependent pathway in the

pathogenesis of secondary changes after spinal cord injury in rats. In: Journal of

Neurochemistry, vol. 66, pp 1525-1531.

Han P, Mi W-L, Wang Y-Q (2011) Research progress on interleukin-33 and its roles in the

central nervous system. In: Neurosci Bull, vol. 27, pp 351-357.

Hayakawa H, Hayakawa M, Kume A, Tominaga S-i (2007) Soluble ST2 blocks

interleukin-33 signaling in allergic airway inflammation. In: J Biol Chem, vol. 282,

pp 26369-26380.

Hayakawa M, Hayakawa H, Matsuyama Y, Tamemoto H, Okazaki H, Tominaga S-i (2009)

Mature interleukin-33 is produced by calpain-mediated cleavage in vivo. In:

Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 387, pp 218-222.

238

Henshall DC, Diaz-Hernandez M, Miras-Portugal MT, Engel T (2013) P2X receptors as

targets for the treatment of status epilepticus. In: Front Cell Neurosci, vol. 7, p 237.

Herx L, Rivest S, Yong V (2000) Central nervous system-initiated inflammation and

neurotrophism in trauma: IL-1 beta is required for the production of ciliary

neurotrophic factor. In: Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 165, pp

2232-2239.

Hirasawa T, Ohsawa K, Imai Y, Ondo Y, Akazawa C, Uchino S, Kohsaka S (2005)

Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. In: J

Neurosci Res, vol. 81, pp 357-362.

Hirsiger S, Simmen H-P, Werner C, Wanner G, Rittirsch D (2012) Danger signals

activating the immune response after trauma. In: Mediators of inflammation, vol.

2012, p 315941.

Hoffman HM, Mueller JL, Broide DH, Wanderer AA, Kolodner RD (2001) Mutation of a

new gene encoding a putative pyrin-like protein causes familial cold

autoinflammatory syndrome and Muckle-Wells syndrome. In: Nat Genet, vol. 29,

pp 301-305.

Hornung V, Latz E (2010) Intracellular DNA recognition. In: Nature reviews Immunology,

vol. 10, pp 123-130.

Howell O, Rundle J, Garg A, Komada M, Brophy P, Reynolds R (2010) Activated

microglia mediate axoglial disruption that contributes to axonal injury in multiple

sclerosis. In: Journal of neuropathology and experimental neurology, vol. 69, pp

1017-1033.

Hsu L-C, Ali S, McGillivray S, Tseng P-H, Mariathasan S, Humke E, Eckmann L, Powell

J, Nizet V, Dixit V, Karin M (2008) A NOD2-NALP1 complex mediates caspase-1-

239

dependent IL-1beta secretion in response to Bacillus anthracis infection and

muramyl dipeptide. In: Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, vol. 105, pp 7803-7808.

Hsu PD, Lander ES, Zhang F (2014) Development and Applications of CRISPR-Cas9 for

Genome Engineering. In: Cell, vol. 157, pp 1262-1278.

Huang H-Y, Lin S-Z, Kuo J-S, Chen W-F, Wang M-J (2007) G-CSF protects dopaminergic

neurons from 6-OHDA-induced toxicity via the ERK pathway. In: Neurobiol

Aging, vol. 28, pp 1258-1269.

Hughes EG, Kang SH, Fukaya M, Bergles DE (2013) Oligodendrocyte progenitors balance

growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain. In: Nature

Neuroscience, vol. 16, pp 668-676.

Hung S-C, Choi CH, Said-Sadier N, Johnson L, Atanasova KR, Sellami H, Yilmaz Ö,

Ojcius DM (2013) P2X4 assembles with P2X7 and pannexin-1 in gingival epithelial

cells and modulates ATP-induced reactive oxygen species production and

inflammasome activation. In: PLoS ONE, vol. 8, p e70210.

Iglesias R, Dahl G, Qiu F, Spray DC, Scemes E (2009) Pannexin 1: the molecular substrate

of astrocyte "hemichannels". In: The Journal of neuroscience : the official journal of

the Society for Neuroscience, vol. 29, pp 7092-7097.

Iglesias RM, Spray DC (2012) Pannexin1-mediated ATP release provides signal

transmission between Neuro2A cells. In: Neurochem Res, vol. 37, pp 1355-1363.

Ignácio AR, Müller YMR, Carvalho MSL, Nazari EM (2005) Distribution of microglial

cells in the cerebral hemispheres of embryonic and neonatal chicks. In: Braz J Med

Biol Res, vol. 38, pp 1615-1621.

240

Jander S, Stoll G (1998) Differential induction of interleukin-12, interleukin-18, and

interleukin-1beta converting enzyme mRNA in experimental autoimmune

encephalomyelitis of the Lewis rat. In: J Neuroimmunol, vol. 91, pp 93-99.

Jha S, Srivastava SY, Brickey WJ, Iocca H, Toews A, Morrison JP, Chen VS, Gris D,

Matsushima GK, Ting JP-Y (2010) The inflammasome sensor, NLRP3, regulates

CNS inflammation and demyelination via caspase-1 and interleukin-18. In: The

Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, vol.

30, pp 15811-15820.

Jia Y, Wu D, Zhang R, Shuang W, Sun J, Hao H, An Q, Liu Q (2014) Bone marrow-

derived mesenchymal stem cells expressing the Shh transgene promotes functional

recovery after spinal cord injury in rats. In: Neuroscience letters, vol. 573C, pp 46-

51.

John GR, Lee SC, Song X, Rivieccio M, Brosnan CF (2005) IL-1-regulated responses in

astrocytes: relevance to injury and recovery. In: Glia, vol. 49, pp 161-176.

Juknis N, Cooper JM, Volshteyn O (2012) The changing landscape of spinal cord injury.

In: Spinal Cord Injury, vol. 109, pp 149-166.

Kadota R, Koda M, Kawabe J, Hashimoto M, Nishio Y, Mannoji C, Miyashita T, Furuya T,

Okawa A, Takahashi K, Yamazaki M (2012) Granulocyte colony-stimulating factor

(G-CSF) protects oligpdendrocyte and promotes hindlimb functional recovery after

spinal cord injury in rats. In: PLoS ONE, vol. 7, p e50391.

Kahlenberg J, Dubyak G (2004) Mechanisms of caspase-1 activation by P2X7 receptor-

mediated K+ release. In: American journal of physiology Cell physiology, vol. 286,

pp C1100-1108.

241

Kaisho T, Akira S (2006) Toll-like receptor function and signaling. In: J Allergy Clin

Immunol, vol. 117, pp 979-987; quiz 988.

Kanneganti T-D, Lamkanfi M, Kim Y-G, Chen G, Park J-H, Franchi L, Vandenabeele P,

Núñez G (2007) Pannexin-1-mediated recognition of bacterial molecules activates

the cryopyrin inflammasome independent of Toll-like receptor signaling. In:

Immunity, vol. 26, pp 433-443.

Kärkkäinen I, Rybnikova E, Pelto-Huikko M, Huovila AP (2000) Metalloprotease-

disintegrin (ADAM) genes are widely and differentially expressed in the adult CNS.

In: Mol Cell Neurosci, vol. 15, pp 547-560.

Kasperczyk H, Baumann B, Debatin K-M, Fulda S (2009) Characterization of sonic

hedgehog as a novel NF-kappaB target gene that promotes NF-kappaB-mediated

apoptosis resistance and tumor growth in vivo. In: FASEB journal : official

publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, vol.

23, pp 21-33.

Kerschensteiner M, Schwab M, Lichtman J, Misgeld T (2005) In vivo imaging of axonal

degeneration and regeneration in the injured spinal cord. In: Nature medicine, vol.

11, pp 572-577.

Kielian T, Barry B, Hickey W (2001) CXC chemokine receptor-2 ligands are required for

neutrophil-mediated host defense in experimental brain abscesses. In: Journal of

immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 166, pp 4634-4643.

Kierdorf K, Erny D, Goldmann T, Sander V, Schulz C, Perdiguero EG, Wieghofer P,

Heinrich A, Riemke P, Hölscher C, Müller DN, Luckow B, Brocker T, Debowski

K, Fritz G, Opdenakker G, Diefenbach A, Biber K, Heikenwalder M, Geissmann F,

Rosenbauer F, Prinz M (2013) Microglia emerge from erythromyeloid precursors

242

via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. In: Nature Neuroscience, vol. 16, pp 273-

280.

Kigerl K, Lai W, Rivest S, Hart R, Satoskar A, Popovich P (2007) Toll-like receptor

(TLR)-2 and TLR-4 regulate inflammation, gliosis, and myelin sparing after spinal

cord injury. In: Journal of Neurochemistry, vol. 102, pp 37-50.

Kigerl KA, Gensel JC, Ankeny DP, Alexander JK, Donnelly DJ, Popovich PG (2009)

Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing

either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. In: The

Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, vol.

29, pp 13435-13444.

Kim J-E, Kim D-S, Jin Ryu H, Il Kim W, Kim M-J, Won Kim D, Young Choi S, Kang T-C

(2013) The effect of P2X7 receptor activation on nuclear factor-κB phosphorylation

induced by status epilepticus in the rat hippocampus. In: Hippocampus, vol. 23, pp

500-514.

Kim SH, Eisenstein M, Reznikov L, Fantuzzi G, Novick D, Rubinstein M, Dinarello CA

(2000) Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18

binding protein to inhibit IL-18. In: Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America, vol. 97, pp 1190-1195.

Kobayashi Y, Yamamoto K, Saido T, Kawasaki H, Oppenheim JJ, Matsushima K (1990)

Identification of calcium-activated neutral protease as a processing enzyme of

human interleukin 1 alpha. In: Proceedings of the National Academy of Sciences of

the United States of America, vol. 87, pp 5548-5552.

Köles L, Leichsenring A, Rubini P, Illes P (2011) P2 receptor signaling in neurons and glial

cells of the central nervous system. In: Adv Pharmacol, vol. 61, pp 441-493.

243

Kono H, Karmarkar D, Iwakura Y, Rock K (2010) Identification of the Cellular Sensor

That Stimulates the Inflammatory Response to Sterile Cell Death. In: The Journal of

Immunology, vol. 184, pp 4470-4478.

Kreutzberg GW (1996) Microglia: a sensor for pathological events in the CNS. In: Trends

Neurosci, vol. 19, pp 312-318.

Kummer J, Broekhuizen R, Everett H, Agostini L, Kuijk L, Martinon F, Van Bruggen R,

Tschopp J (2007) Inflammasome Components NALP 1 and 3 Show Distinct but

Separate Expression Profiles in Human Tissues Suggesting a Site-specific Role in

the Inflammatory Response. In: Journal of Histochemistry and Cytochemistry, vol.

55, pp 443-452.

Kwon B, Okon E, Hillyer J, Mann C, Baptiste D, Weaver L, Fehlings M, Tetzlaff W (2011)

A systematic review of non-invasive pharmacologic neuroprotective treatments for

acute spinal cord injury. In: Journal of neurotrauma, vol. 28, pp 1545-1588.

Laflamme N, Soucy G, Rivest S (2001) Circulating cell wall components derived from

gram-negative, not gram-positive, bacteria cause a profound induction of the gene-

encoding Toll-like receptor 2 in the CNS. In: Journal of Neurochemistry, vol. 79, pp

648-657.

Lambertsen KL, Clausen BH, Babcock AA, Gregersen R, Fenger C, Nielsen HH, Haugaard

LS, Wirenfeldt M, Nielsen M, Dagnaes-Hansen F, Bluethmann H, Faergeman NJ,

Meldgaard M, Deierborg T, Finsen B (2009) Microglia protect neurons against

ischemia by synthesis of tumor necrosis factor. In: J Neurosci, vol. 29, pp 1319-

1330.

Lamkanfi M, Dixit V (2009) Inflammasomes: guardians of cytosolic sanctity. In:

Immunological reviews, vol. 227, pp 95-105.

244

Lamkanfi M, Dixit VM (2012) Inflammasomes and their roles in health and disease. In:

Annu Rev Cell Dev Biol, vol. 28, pp 137-161.

Lapidot T, Kollet O (2002) The essential roles of the chemokine SDF-1 and its receptor

CXCR4 in human stem cell homing and repopulation of transplanted immune-

deficient NOD/SCID and NOD/SCID/B2m(null) mice. In: Leukemia, vol. 16, pp

1992-2003.

Larsen PH, Holm TH, Owens T (2007) Toll-like receptors in brain development and

homeostasis. In: Sci STKE, vol. 2007, p pe47.

Latz E (2010) The inflammasomes: mechanisms of activation and function. In: Current

Opinion in Immunology, vol. 22, pp 28-33.

Lee CYD, Landreth GE (2010) The role of microglia in amyloid clearance from the AD

brain. In: J Neural Transm, vol. 117, pp 949-960.

Lee H, Lee S, Cho I-H, Lee SJ (2013) Toll-like receptors: sensor molecules for detecting

damage to the nervous system. In: Curr Protein Pept Sci, vol. 14, pp 33-42.

Lee J-M, Yan P, Xiao Q, Chen S, Lee K-Y, Hsu CY, Xu J (2008) Methylprednisolone

protects oligodendrocytes but not neurons after spinal cord injury. In: The Journal

of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, vol. 28, pp

3141-3149.

Lee JK, Zheng B (2012) Role of myelin-associated inhibitors in axonal repair after spinal

cord injury. In: Experimental neurology, vol. 235, pp 33-42.

Lee SM, Rosen S, Weinstein P, Van Rooijen N, Noble-Haeusslein LJ (2011) Prevention of

both neutrophil and monocyte recruitment promotes recovery after spinal cord

injury. In: Journal of Neurotrauma, vol. 28, pp 1893-1907.

245

Lehnardt S (2010) Innate immunity and neuroinflammation in the CNS: the role of

microglia in Toll-like receptor-mediated neuronal injury. In: Glia, vol. 58, pp 253-

263.

Lehnardt S, Henneke P, Lien E, Kasper DL, Volpe JJ, Bechmann I, Nitsch R, Weber JR,

Golenbock DT, Vartanian T (2006) A mechanism for neurodegeneration induced by

group B streptococci through activation of the TLR2/MyD88 pathway in microglia.

In: Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 177, pp 583-592.

Lehnardt S, Lachance C, Patrizi S, Lefebvre S, Follett PL, Jensen FE, Rosenberg PA,

Volpe JJ, Vartanian T (2002) The toll-like receptor TLR4 is necessary for

lipopolysaccharide-induced oligodendrocyte injury in the CNS. In: The Journal of

neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, vol. 22, pp 2478-

2486.

Lehnardt S, Massillon L, Follett P, Jensen FE, Ratan R, Rosenberg PA, Volpe JJ, Vartanian

T (2003) Activation of innate immunity in the CNS triggers neurodegeneration

through a Toll-like receptor 4-dependent pathway. In: Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America, vol. 100, pp 8514-8519.

Li GL, Farooque M, Holtz A, Olsson Y (1999) Apoptosis of oligodendrocytes occurs for

long distances away from the primary injury after compression trauma to rat spinal

cord. In: Acta neuropathologica, vol. 98, pp 473-480.

Li W-W, Setzu A, Zhao C, Franklin RJM (2005) Minocycline-mediated inhibition of

microglia activation impairs oligodendrocyte progenitor cell responses and

remyelination in a non-immune model of demyelination. In: Journal of

Neuroimmunology, vol. 158, pp 58-66.

246

Li X-Q, Wang J, Fang B, Tan W-F, Ma H (2014) Intrathecal antagonism of microglial

TLR4 reduces inflammatory damage to blood-spinal cord barrier following

ischemia/reperfusion injury in rats. In: Mol Brain, vol. 7, p 28.

Lin H-W, Basu A, Druckman C, Cicchese M, Krady J, Levison S (2006) Astrogliosis is

delayed in type 1 interleukin-1 receptor-null mice following a penetrating brain

injury. In: Journal of neuroinflammation, vol. 3, p 15.

Locovei S, Wang J, Dahl G (2006) Activation of pannexin 1 channels by ATP through P2Y

receptors and by cytoplasmic calcium. In: FEBS Lett, vol. 580, pp 239-244.

Lu QR, Sun T, Zhu Z, Ma N, Garcia M, Stiles CD, Rowitch DH (2002) Common

developmental requirement for Olig function indicates a motor

neuron/oligodendrocyte connection. In: Cell, vol. 109, pp 75-86.

Lu QR, Yuk D, Alberta JA, Zhu Z, Pawlitzky I, Chan J, McMahon AP, Stiles CD, Rowitch

DH (2000) Sonic hedgehog--regulated oligodendrocyte lineage genes encoding

bHLH proteins in the mammalian central nervous system. In: Neuron, vol. 25, pp

317-329.

Luheshi NM, Kovács KJ, Lopez-Castejon G, Brough D, Denes A (2011) Interleukin-1α

expression precedes IL-1β after ischemic brain injury and is localised to areas of

focal neuronal loss and penumbral tissues. In: Journal of neuroinflammation, vol. 8,

p 186.

Luheshi NM, McColl BW, Brough D (2009) Nuclear retention of IL-1 alpha by necrotic

cells: a mechanism to dampen sterile inflammation. In: European journal of

immunology, vol. 39, pp 2973-2980.

Lytle JM, Wrathall JR (2007) Glial cell loss, proliferation and replacement in the contused

murine spinal cord. In: Eur J Neurosci, vol. 25, pp 1711-1724.

247

Mackenzie AB, Young MT, Adinolfi E, Surprenant A (2005) Pseudoapoptosis induced by

brief activation of ATP-gated P2X7 receptors. In: The Journal of biological

chemistry, vol. 280, pp 33968-33976.

Maezawa I, Maeda N, Montine TJ, Montine KS (2006) Apolipoprotein E-specific innate

immune response in astrocytes from targeted replacement mice. In: Journal of

neuroinflammation, vol. 3, p 10.

March CJ, Mosley B, Larsen A, Cerretti DP, Braedt G, Price V, Gillis S, Henney CS,

Kronheim SR, Grabstein K (1985) Cloning, sequence and expression of two distinct

human interleukin-1 complementary DNAs. In: Nature, vol. 315, pp 641-647.

Mariathasan S, Monack D (2007) Inflammasome adaptors and sensors: intracellular

regulators of infection and inflammation. In: Nature reviews Immunology, vol. 7,

pp 31-40.

Mariathasan S, Newton K, Monack D, Vucic D, French D, Lee W, Roose-Girma M,

Erickson S, Dixit V (2004) Differential activation of the inflammasome by caspase-

1 adaptors ASC and Ipaf. In: Nature, vol. 430, pp 213-218.

Mariathasan S, Weiss D, Newton K, Mcbride J, O&apos;rourke K, Roose-Girma M, Lee

W, Weinrauch Y, Monack D, Dixit V (2006) Cryopyrin activates the inflammasome

in response to toxins and ATP. In: Nature, vol. 440, pp 228-232.

Martinon F, Burns K, Tschopp J (2002) The inflammasome: a molecular platform

triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. In:

Molecular Cell, vol. 10, pp 417-426.

Martinon F, Pétrilli V, Mayor A, Tardivel A, Tschopp J (2006) Gout-associated uric acid

crystals activate the NALP3 inflammasome. In: Nature, vol. 440, pp 237-241.

248

Mason J, Suzuki K, Chaplin D, Matsushima G (2001) Interleukin-1beta promotes repair of

the CNS. In: The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for

Neuroscience, vol. 21, pp 7046-7052.

Masumoto J, Taniguchi S, Ayukawa K, Sarvotham H, Kishino T, Niikawa N, Hidaka E,

Katsuyama T, Higuchi T, Sagara J (1999) ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates

during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. In: J Biol Chem,

vol. 274, pp 33835-33838.

Matute C, Torre I, Pérez-Cerdá F, Pérez-Samartín A, Alberdi E, Etxebarria E, Arranz AM,

Ravid R, Rodríguez-Antigüedad A, Sánchez-Gómez M, Domercq M (2007) P2X(7)

receptor blockade prevents ATP excitotoxicity in oligodendrocytes and ameliorates

experimental autoimmune encephalomyelitis. In: The Journal of neuroscience : the

official journal of the Society for Neuroscience, vol. 27, pp 9525-9533.

Mautes A, Weinzierl M, Donovan F, Noble L (2000) Vascular events after spinal cord

injury: contribution to secondary pathogenesis. In: Physical therapy, vol. 80, pp

673-687.

Mctigue DM, Tripathi RB (2008) The life, death, and replacement of oligodendrocytes in

the adult CNS. In: Journal of Neurochemistry, vol. 107, pp 1-19.

Mekki-Dauriac S, Agius E, Kan P, Cochard P (2002) Bone morphogenetic proteins

negatively control oligodendrocyte precursor specification in the chick spinal cord.

In: Development, vol. 129, pp 5117-5130.

Meucci O, Fatatis A, Simen AA, Miller RJ (2000) Expression of CX3CR1 chemokine

receptors on neurons and their role in neuronal survival. In: Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 97, pp 8075-

8080.

249

Mildner A, Schmidt H, Nitsche M, Merkler D, Hanisch U-K, Mack M, Heikenwalder M,

Brück W, Priller J, Prinz M (2007) Microglia in the adult brain arise from Ly-

6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. In: Nature

neuroscience, vol. 10, pp 1544-1553.

Miller RH (2002) Regulation of oligodendrocyte development in the vertebrate CNS. In:

Progress in neurobiology, vol. 67, pp 451-467.

Minkiewicz J, de Rivero Vaccari JP, Keane RW (2013) Human astrocytes express a novel

NLRP2 inflammasome. In: Glia.

Mitew S, Hay CM, Peckham H, Xiao J, Koenning M, Emery B (2013) Mechanisms

Regulating the Development of Oligodendrocytes and Central Nervous System

Myelin. In: Neuroscience.

Miyoshi K, Obata K, Kondo T, Okamura H, Noguchi K (2008) Interleukin-18-Mediated

Microglia/Astrocyte Interaction in the Spinal Cord Enhances Neuropathic Pain

Processing after Nerve Injury. In: Journal of Neuroscience, vol. 28, pp 12775-

12787.

Mizuno T, Kawanokuchi J, Numata K, Suzumura A (2003) Production and neuroprotective

functions of fractalkine in the central nervous system. In: Brain Res, vol. 979, pp

65-70.

Moritz DR, Rodewald HR, Gheyselinck J, Klemenz R (1998) The IL-1 receptor-related T1

antigen is expressed on immature and mature mast cells and on fetal blood mast cell

progenitors. In: Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 161, pp 4866-

4874.

250

Mosley B, Urdal DL, Prickett KS, Larsen A, Cosman D, Conlon PJ, Gillis S, Dower SK

(1987) The interleukin-1 receptor binds the human interleukin-1 alpha precursor but

not the interleukin-1 beta precursor. In: J Biol Chem, vol. 262, pp 2941-2944.

Myer DJ, Gurkoff GG, Lee SM, Hovda DA, Sofroniew MV (2006) Essential protective

roles of reactive astrocytes in traumatic brain injury. In: Brain, vol. 129, pp 2761-

2772.

Nahrendorf M, Swirski F, Aikawa E, Stangenberg L, Wurdinger T, Figueiredo J-L, Libby

P, Weissleder R, Pittet M (2007) The healing myocardium sequentially mobilizes

two monocyte subsets with divergent and complementary functions. In: Journal of

Experimental Medicine, vol. 204, pp 3037-3047.

Nakanishi K, Yoshimoto T, Tsutsui H, Okamura H (2001) Interleukin-18 is a unique

cytokine that stimulates both Th1 and Th2 responses depending on its cytokine

milieu. In: Cytokine Growth Factor Rev, vol. 12, pp 53-72.

Narcisse L, Scemes E, Zhao Y, Lee SC, Brosnan CF (2005) The cytokine IL-1beta

transiently enhances P2X7 receptor expression and function in human astrocytes.

In: Glia, vol. 49, pp 245-258.

Nesic O, Xu G, McAdoo D, High K, Hulsebosch C, Perez-Pol R (2001) IL-1 receptor

antagonist prevents apoptosis and caspase-3 activation after spinal cord injury. In:

Journal of neurotrauma, vol. 18, pp 947-956.

Nguyen L, Rothwell NJ, Pinteaux E, Boutin H (2011) Contribution of interleukin-1

receptor accessory protein B to interleukin-1 actions in neuronal cells. In:

Neurosignals, vol. 19, pp 222-230.

Nicolay DJ, Doucette JR, Nazarali AJ (2007) Transcriptional control of

oligodendrogenesis. In: Glia, vol. 55, pp 1287-1299.

251

Nimmerjahn A, Kirchhoff F, Helmchen F (2005) Resting microglial cells are highly

dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. In: Science (New York, NY),

vol. 308, pp 1314-1318.

Norenberg MD (1994) Astrocyte responses to CNS injury. In: J Neuropathol Exp Neurol,

vol. 53, pp 213-220.

North RA (2002) Molecular physiology of P2X receptors. In: Physiol Rev, vol. 82, pp

1013-1067.

O'Connor W, Harton JA, Zhu X, Linhoff MW, Ting JP-Y (2003) Cutting edge:

CIAS1/cryopyrin/PYPAF1/NALP3/CATERPILLER 1.1 is an inducible

inflammatory mediator with NF-kappa B suppressive properties. In: Journal of

immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 171, pp 6329-6333.

O'Neill LA, Dinarello CA (2000) The IL-1 receptor/toll-like receptor superfamily: crucial

receptors for inflammation and host defense. In: Immunology today, vol. 21, pp

206-209.

Okun E, Griffioen KJ, Mattson MP (2011) Toll-like receptor signaling in neural plasticity

and disease. In: Trends Neurosci, vol. 34, pp 269-281.

Orentas DM, Hayes JE, Dyer KL, Miller RH (1999) Sonic hedgehog signaling is required

during the appearance of spinal cord oligodendrocyte precursors. In: Development,

vol. 126, pp 2419-2429.

Ortega JA, Radonjić NV, Zecevic N (2013) Sonic hedgehog promotes generation and

maintenance of human forebrain Olig2 progenitors. In: Front Cell Neurosci, vol. 7,

p 254.

252

Park HH, Lo Y-C, Lin S-C, Wang L, Yang JK, Wu H (2007) The Death Domain

Superfamily in Intracellular Signaling of Apoptosis and Inflammation. In: Annual

Review of Immunology, vol. 25, pp 561-586.

Paulukat J, Bosmann M, Nold M, Garkisch S, Kämpfer H, Frank S, Raedle J, Zeuzem S,

Pfeilschifter J, Mühl H (2001) Expression and release of IL-18 binding protein in

response to IFN-gamma. In: Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950), vol.

167, pp 7038-7043.

Peferoen L, Kipp M, van der Valk P, van Noort JM, Amor S (2014) Oligodendrocyte-

microglia cross-talk in the central nervous system. In: Immunology, vol. 141, pp

302-313.

Pelegrín P (2011) Many ways to dilate the P2X7 receptor pore. In: British Journal of

Pharmacology, vol. 163, pp 908-911.

Pelegrin P, Barroso-Gutierrez C, Surprenant A (2008) P2X7 receptor differentially couples

to distinct release pathways for IL-1beta in mouse macrophage. In: Journal of

immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 180, pp 7147-7157.

Pelegrin P, Surprenant A (2006) Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-

1beta release by the ATP-gated P2X7 receptor. In: The EMBO Journal, vol. 25, pp

5071-5082.

Peng W, Cotrina M, Han X, Yu H, Bekar L, Blum L, Takano T, Tian G-F, Goldman S,

Nedergaard M (2009) Systemic administration of an antagonist of the ATP-

sensitive receptor P2X7 improves recovery after spinal cord injury. In: Proceedings

of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 106, pp

12489-12493.

253

Pernet V, Schwab ME (2012) The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair.

In: Cell Tissue Res, vol. 349, pp 97-104.

Perrin FE, Lacroix S, Avilés-Trigueros M, David S (2005) Involvement of monocyte

chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and

interleukin-1beta in Wallerian degeneration. In: Brain, vol. 128, pp 854-866.

Perry V, Nicoll J, Holmes C (2010) Microglia in neurodegenerative disease. In: Nature

Publishing Group, pp 1-9.

Pétrilli V, Papin S, Dostert C, Mayor A, Martinon F, Tschopp J (2007) Activation of the

NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration. In:

Cell Death and Differentiation, vol. 14, pp 1583-1589.

Pillay J, Den Braber I, Vrisekoop N, Kwast L, De Boer R, Borghans J, Tesselaar K,

Koenderman L (2010) In vivo labeling with 2H2O reveals a human neutrophil

lifespan of 5.4 days. In: Blood, vol. 116, pp 625-627.

Pineau I, Lacroix S (2006) Proinflammatory cytokine synthesis in the injured mouse spinal

cord: Multiphasic expression pattern and identification of the cell types involved.

In: The Journal of Comparative Neurology, vol. 500, pp 267-285.

Pineau I, Sun L, Bastien D, Lacroix S (2010) Astrocytes initiate inflammation in the injured

mouse spinal cord by promoting the entry of neutrophils and inflammatory

monocytes in an IL-1 receptor/MyD88-dependent fashion. In: Brain Behav Immun,

vol. 24, pp 540-553.

Pittman K, Kubes P (2013) Damage-associated molecular patterns control neutrophil

recruitment. In: J Innate Immun, vol. 5, pp 315-323.

Popovich P, Guan Z, Wei P, Huitinga I, Van Rooijen N, Stokes B (1999) Depletion of

hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and

254

neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. In: Experimental

neurology, vol. 158, pp 351-365.

Popovich PG, Guan Z, McGaughy V, Fisher L, Hickey WF, Basso DM (2002) The

neuropathological and behavioral consequences of intraspinal

microglial/macrophage activation. In: J Neuropathol Exp Neurol, vol. 61, pp 623-

633.

Popovich PG, Wei P, Stokes BT (1997) Cellular inflammatory response after spinal cord

injury in Sprague-Dawley and Lewis rats. In: J Comp Neurol, vol. 377, pp 443-464.

Pradillo JM, Denes A, Greenhalgh AD, Boutin H, Drake C, McColl BW, Barton E, Proctor

SD, Russell JC, Rothwell NJ, Allan SM (2012) Delayed administration of

interleukin-1 receptor antagonist reduces ischemic brain damage and inflammation

in comorbid rats. In: J Cereb Blood Flow Metab, vol. 32, pp 1810-1819.

Priestley JV, Michael-Titus AT, Tetzlaff W (2012) Limiting spinal cord injury by

pharmacological intervention. In: Spinal Cord Injury, vol. 109, pp 463-484.

Rathinam VAK, Jiang Z, Waggoner SN, Sharma S, Cole LE, Waggoner L, Vanaja SK,

Monks BG, Ganesan S, Latz E, Hornung V, Vogel SN, Szomolanyi-Tsuda E,

Fitzgerald KA (2010) The AIM2 inflammasome is essential for host defense against

cytosolic bacteria and DNA viruses. In: Nature Immunology, vol. 11, pp 395-402.

Ray S, Hogan E, Banik N (2003a) Calpain in the pathophysiology of spinal cord injury:

neuroprotection with calpain inhibitors. In: Brain research Brain research reviews,

vol. 42, pp 169-185.

Ray S, Matzelle D, Sribnick E, Guyton M, Wingrave J, Banik N (2003b) Calpain inhibitor

prevented apoptosis and maintained transcription of proteolipid protein and myelin

255

basic protein genes in rat spinal cord injury. In: Journal of chemical neuroanatomy,

vol. 26, pp 119-124.

Rider P, Carmi Y, Guttman O, Braiman A, Cohen I, Voronov E, White MR, Dinarello CA,

Apte RN (2011) IL-1α and IL-1β recruit different myeloid cells and promote

different stages of sterile inflammation. In: Journal of immunology (Baltimore, Md :

1950), vol. 187, pp 4835-4843.

Roberts AW (2005) G-CSF: a key regulator of neutrophil production, but that's not all! In:

Growth Factors, vol. 23, pp 33-41.

Roth W, Kumar V, Beer H-D, Richter M, Wohlenberg C, Reuter U, Thiering S,

Staratschek-Jox A, Hofmann A, Kreusch F, Schultze JL, Vogl T, Roth J, Reichelt J,

Hausser I, Magin TM (2012) Keratin 1 maintains skin integrity and participates in

an inflammatory network in skin through interleukin-18. In: Journal of Cell Science,

vol. 125, pp 5269-5279.

Rotshenker S (2011) Wallerian degeneration: the innate-immune response to traumatic

nerve injury. In: Journal of neuroinflammation, vol. 8, p 109.

Roussel L, Erard M, Cayrol C, Girard J-P (2008) Molecular mimicry between IL-33 and

KSHV for attachment to chromatin through the H2A-H2B acidic pocket. In: EMBO

Rep, vol. 9, pp 1006-1012.

Russell SE, Walsh PT (2012) Sterile inflammation - do innate lymphoid cell subsets play a

role? In: Front Immunol, vol. 3, p 246.

Sabroe I, Whyte MKB (2007) Toll-like receptor (TLR)-based networks regulate

neutrophilic inflammation in respiratory disease. In: Biochem Soc Trans, vol. 35, pp

1492-1495.

256

Sagulenko V, Thygesen SJ, Sester DP, Idris A, Cridland JA, Vajjhala PR, Roberts TL,

Schroder K, Vince JE, Hill JM, Silke J, Stacey KJ (2013) AIM2 and NLRP3

inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. In:

Cell Death Differ.

Sakaki H, Fujiwaki T, Tsukimoto M, Kawano A, Harada H, Kojima S (2013) P2X4

receptor regulates P2X7 receptor-dependent IL-1β and IL-18 release in mouse bone

marrow-derived dendritic cells. In: Biochem Biophys Res Commun, vol. 432, pp

406-411.

Sanz JM, Di Virgilio F (2000) Kinetics and mechanism of ATP-dependent IL-1 beta

release from microglial cells. In: Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950),

vol. 164, pp 4893-4898.

Sareneva T, Julkunen I, Matikainen S (2000) IFN-alpha and IL-12 induce IL-18 receptor

gene expression in human NK and T cells. In: Journal of immunology (Baltimore,

Md : 1950), vol. 165, pp 1933-1938.

Sato A, Ohtaki H, Tsumuraya T, Song D, Ohara K, Asano M, Iwakura Y, Atsumi T, Shioda

S (2012) Interleukin-1 participates in the classical and alternative activation of

microglia/macrophages after spinal cord injury. In: Journal of neuroinflammation,

vol. 9, p 65.

Sayer FT, Kronvall E, Nilsson OG (2006) Methylprednisolone treatment in acute spinal

cord injury: the myth challenged through a structured analysis of published

literature. In: Spine J, vol. 6, pp 335-343.

Schäbitz W-R, Kollmar R, Schwaninger M, Juettler E, Bardutzky J, Schölzke MN, Sommer

C, Schwab S (2003) Neuroprotective effect of granulocyte colony-stimulating factor

257

after focal cerebral ischemia. In: Stroke; a journal of cerebral circulation, vol. 34, pp

745-751.

Schmitz J, Owyang A, Oldham E, Song Y, Murphy E, McClanahan TK, Zurawski G,

Moshrefi M, Qin J, Li X, Gorman DM, Bazan JF, Kastelein RA (2005) IL-33, an

interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1 receptor-related protein ST2 and

induces T helper type 2-associated cytokines. In: Immunity, vol. 23, pp 479-490.

Schmitz T, Krabbe G, Weikert G, Scheuer T, Matheus F, Wang Y, Mueller S, Kettenmann

H, Matyash V, Bührer C, Endesfelder S (2014) Minocycline protects the immature

white matter against hyperoxia. In: Experimental neurology, vol. 254, pp 153-165.

Schnell L, Fearn S, Klassen H, Schwab ME, Perry VH (1999) Acute inflammatory

responses to mechanical lesions in the CNS: differences between brain and spinal

cord. In: Eur J Neurosci, vol. 11, pp 3648-3658.

Schroder K, Tschopp J (2010) The Inflammasomes. In: Cell, vol. 140, pp 821-832.

Schulz C, Perdiguero EG, Chorro L, Szabo-Rogers H, Cagnard N, Kierdorf K, Prinz M,

Wu B, Jacobsen SEW, Pollard JW, Frampton J, Liu KJ, Geissmann F (2012) A

Lineage of Myeloid Cells Independent of Myb and Hematopoietic Stem Cells. In:

Science, vol. 336, pp 86-90.

Schwab J, Guo L, Schluesener H (2005) Spinal cord injury induces early and persistent

lesional P2X4 receptor expression. In: Journal of neuroimmunology, vol. 163, pp

185-189.

Schwab ME, Strittmatter SM (2014) Nogo limits neural plasticity and recovery from injury.

In: Curr Opin Neurobiol, vol. 27C, pp 53-60.

258

Semerad C, Liu F, Gregory A, Stumpf K, Link D (2002) G-CSF is an essential regulator of

neutrophil trafficking from the bone marrow to the blood. In: Immunity, vol. 17, pp

413-423.

Sharma K, Selzer ME, Li S (2012) Scar-mediated inhibition and CSPG receptors in the

CNS. In: Experimental neurology, vol. 237, pp 370-378.

Sharp A, Polak P, Simonini V, Lin S, Richardson J, Bongarzone E, Feinstein D (2008)

P2x7 deficiency suppresses development of experimental autoimmune

encephalomyelitis. In: Journal of neuroinflammation, vol. 5, p 33.

Shechter R, London A, Varol C, Raposo C, Cusimano M, Yovel G, Rolls A, Mack M,

Pluchino S, Martino G, Jung S, Schwartz M (2009) Infiltrating Blood-Derived

Macrophages Are Vital Cells Playing an Anti-inflammatory Role in Recovery from

Spinal Cord Injury in Mice. In: PLoS Medicine, vol. 6, p e1000113.

Shestopalov VI, Slepak VZ (2014) Molecular pathways of pannexin1-mediated

neurotoxicity. In: Front Physiol, vol. 5, pp 1-8.

Shigemoto-Mogami Y, Hoshikawa K, Goldman JE, Sekino Y, Sato K (2014) Microglia

enhance neurogenesis and oligodendrogenesis in the early postnatal subventricular

zone. In: The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for

Neuroscience, vol. 34, pp 2231-2243.

Silver J, Miller JH (2004) Regeneration beyond the glial scar. In: Nature reviews

Neuroscience, vol. 5, pp 146-156.

Silverman W, De Rivero Vaccari J, Locovei S, Qiu F, Carlsson S, Scemes E, Keane R,

Dahl G (2009) The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and

astrocytes. In: The Journal of biological chemistry, vol. 284, pp 18143-18151.

259

Sims JE, Smith DE (2010) The IL-1 family: regulators of immunity. In: Nature reviews

Immunology, vol. 10, pp 89-102.

Smith D, Lipsky B, Russell C, Ketchem R, Kirchner J, Hensley K, Huang Y, Friedman W,

Boissonneault V, Plante M-M, Rivest S, Sims J (2009) A Central Nervous System-

Restricted Isoform of the Interleukin-1 Receptor Accessory Protein Modulates

Neuronal Responses to Interleukin-1. In: Immunity, vol. 30, pp 817-831.

Sofroniew M (2005) Reactive Astrocytes in Neural Repair and Protection. In: The

Neuroscientist, vol. 11, pp 400-407.

Sriram K, O'Callaghan JP (2007) Divergent roles for tumor necrosis factor-alpha in the

brain. In: J Neuroimmune Pharmacol, vol. 2, pp 140-153.

Stirling DP, Cummins K, Mishra M, Teo W, Yong VW, Stys P (2013) Toll-like receptor 2-

mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury. In:

Brain.

Stirling DP, Khodarahmi K, Liu J, McPhail LT, McBride CB, Steeves JD, Ramer MS,

Tetzlaff W (2004) Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death,

attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord

injury. In: J Neurosci, vol. 24, pp 2182-2190.

Stirling DP, Liu S, Kubes P, Yong VW (2009) Depletion of Ly6G/Gr-1 leukocytes after

spinal cord injury in mice alters wound healing and worsens neurological outcome.

In: The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for

Neuroscience, vol. 29, pp 753-764.

Stirling DP, Yong VW (2008) Dynamics of the inflammatory response after murine spinal

cord injury revealed by flow cytometry. In: J Neurosci Res, vol. 86, pp 1944-1958.

260

Sussman CR, Davies JE, Miller RH (2002) Extracellular and intracellular regulation of

oligodendrocyte development: roles of Sonic hedgehog and expression of E

proteins. In: Glia, vol. 40, pp 55-64.

Sutmuller R, Garritsen A, Adema GJ (2007) Regulatory T cells and toll-like receptors:

regulating the regulators. In: Ann Rheum Dis, vol. 66 Suppl 3, pp iii91-95.

Takebayashi H, Nabeshima Y, Yoshida S, Chisaka O, Ikenaka K, Nabeshima Y-i (2002)

The basic helix-loop-helix factor olig2 is essential for the development of

motoneuron and oligodendrocyte lineages. In: Curr Biol, vol. 12, pp 1157-1163.

Takeda K, Akira S (2005) Toll-like receptors in innate immunity. In: International

immunology, vol. 17, pp 1-14.

Takeda K, Tsutsui H, Yoshimoto T, Adachi O, Yoshida N, Kishimoto T, Okamura H,

Nakanishi K, Akira S (1998) Defective NK cell activity and Th1 response in IL-18-

deficient mice. In: Immunity, vol. 8, pp 383-390.

Takeuchi O, Akira S (2010) Pattern Recognition Receptors and Inflammation. In: Cell, vol.

140, pp 805-820.

Talabot-Ayer D, Lamacchia C, Gabay C, Palmer G (2009) Interleukin-33 is biologically

active independently of caspase-1 cleavage. In: J Biol Chem, vol. 284, pp 19420-

19426.

Tan M-S, Yu J-T, Jiang T, Zhu X-C, Tan L (2013) The NLRP3 Inflammasome in

Alzheimer’s Disease. In: Mol Neurobiol, vol. 48, pp 875-882.

Tanaka T, Murakami K, Bando Y, Yoshida S (2013) Minocycline reduces remyelination by

suppressing ciliary neurotrophic factor expression after cuprizone-induced

demyelination. In: J Neurochem, vol. 127, pp 259-270.

261

Taoka Y, Okajima K, Uchiba M, Murakami K, Kushimoto S, Johno M, Naruo M, Okabe H,

Takatsuki K (1997) Role of neutrophils in spinal cord injury in the rat. In:

Neuroscience, vol. 79, pp 1177-1182.

Tator C, Koyanagi I (1997) Vascular mechanisms in the pathophysiology of human spinal

cord injury. In: Journal of neurosurgery, vol. 86, pp 483-492.

Tator CH (1995) Update on the pathophysiology and pathology of acute spinal cord injury.

In: Brain Pathol, vol. 5, pp 407-413.

Thawer SG, Mawhinney L, Chadwick K, de Chickera SN, Weaver LC, Brown A, Dekaban

GA (2013) Temporal changes in monocyte and macrophage subsets and microglial

macrophages following spinal cord injury in the lys-egfp-ki mouse model. In:

Journal of Neuroimmunology.

Thomassen E, Bird TA, Renshaw BR, Kennedy MK, Sims JE (1998) Binding of

interleukin-18 to the interleukin-1 receptor homologous receptor IL-1Rrp1 leads to

activation of signaling pathways similar to those used by interleukin-1. In: J

Interferon Cytokine Res, vol. 18, pp 1077-1088.

Thornton P, Mccoll B, Greenhalgh A, Denes A, Allan S, Rothwell N (2010) Platelet

interleukin-1 drives cerebrovascular inflammation. In: Blood, vol. 115, pp 3632-

3639.

Tikka T, Fiebich BL, Goldsteins G, Keinanen R, Koistinaho J (2001) Minocycline, a

tetracycline derivative, is neuroprotective against excitotoxicity by inhibiting

activation and proliferation of microglia. In: The Journal of neuroscience : the

official journal of the Society for Neuroscience, vol. 21, pp 2580-2588.

Tozaki-Saitoh H, Tsuda M, Inoue K (2011) Role of purinergic receptors in CNS function

and neuroprotection. In: Adv Pharmacol, vol. 61, pp 495-528.

262

Trajkovic V, Sweet MJ, Xu D (2004) T1/ST2--an IL-1 receptor-like modulator of immune

responses. In: Cytokine Growth Factor Rev, vol. 15, pp 87-95.

Trang T, Beggs S, Wan X, Salter MW (2009) P2X4-receptor-mediated synthesis and

release of brain-derived neurotrophic factor in microglia is dependent on calcium

and p38-mitogen-activated protein kinase activation. In: The Journal of

neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, vol. 29, pp 3518-

3528.

Tremblay M-È, Lowery RL, Majewska AK (2010) Microglial interactions with synapses

are modulated by visual experience. In: PLoS Biol, vol. 8, p e1000527.

Tsuda M, Shigemoto-Mogami Y, Koizumi S, Mizokoshi A, Kohsaka S, Salter MW, Inoue

K (2003) P2X4 receptors induced in spinal microglia gate tactile allodynia after

nerve injury. In: Nature, vol. 424, pp 778-783.

Tsutsui H, Kayagaki N, Kuida K, Nakano H, Hayashi N, Takeda K, Matsui K,

Kashiwamura S, Hada T, Akira S, Yagita H, Okamura H, Nakanishi K (1999)

Caspase-1-independent, Fas/Fas ligand-mediated IL-18 secretion from macrophages

causes acute liver injury in mice. In: Immunity, vol. 11, pp 359-367.

Ulmann L, Hatcher JP, Hughes JP, Chaumont S, Green PJ, Conquet F, Buell GN, Reeve

AJ, Chessell IP, Rassendren F (2008) Up-regulation of P2X4 receptors in spinal

microglia after peripheral nerve injury mediates BDNF release and neuropathic

pain. In: The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for

Neuroscience, vol. 28, pp 11263-11268.

Ulmann L, Levavasseur F, Avignone E, Peyroutou R, Hirbec H, Audinat E, Rassendren F

(2013) Involvement of P2X4 receptors in hippocampal microglial activation after

status epilepticus. In: Glia.

263

Van Loo G, De Lorenzi R, Schmidt H, Huth M, Mildner A, Schmidt-Supprian M,

Lassmann H, Prinz M, Pasparakis M (2006) Inhibition of transcription factor NF-κB

in the central nervous system ameliorates autoimmune encephalomyelitis in mice.

In: Nature Immunology, vol. 7, pp 954-961.

van Rossum D, Hanisch U-K (2004) Microglia. In: Metabolic brain disease, vol. 19, pp

393-411.

Vanden Abeele F, Bidaux G, Gordienko D, Beck B, Panchin YV, Baranova AV, Ivanov

DV, Skryma R, Prevarskaya N (2006) Functional implications of calcium

permeability of the channel formed by pannexin 1. In: J Cell Biol, vol. 174, pp 535-

546.

Vargas M, Barres B (2007) Why Is Wallerian Degeneration in the CNS So Slow? In:

Annual Review of Neuroscience, vol. 30, pp 153-179.

Vázquez-Villoldo N, Domercq M, Martín A, Llop J, Gómez-Vallejo V, Matute C (2013)

P2X4 receptors control the fate and survival of activated microglia. In: Glia.

Virginio C, MacKenzie A, North RA, Surprenant A (1999) Kinetics of cell lysis, dye

uptake and permeability changes in cells expressing the rat P2X7 receptor. In: J

Physiol (Lond), vol. 519 Pt 2, pp 335-346.

Voskuhl R, Peterson R, Song B, Ao Y, Morales L, Tiwari-Woodruff S, Sofroniew M

(2009) Reactive Astrocytes Form Scar-Like Perivascular Barriers to Leukocytes

during Adaptive Immune Inflammation of the CNS. In: Journal of Neuroscience,

vol. 29, pp 11511-11522.

Vosler PS, Brennan CS, Chen J (2008) Calpain-mediated signaling mechanisms in neuronal

injury and neurodegeneration. In: Molecular neurobiology, vol. 38, pp 78-100.

264

Wang X, Arcuino G, Takano T, Lin J, Peng WG, Wan P, Li P, Xu Q, Liu QS, Goldman

SA, Nedergaard M (2004) P2X7 receptor inhibition improves recovery after spinal

cord injury. In: Nature medicine, vol. 10, pp 821-827.

Weinhold K, Krause-Buchholz U, Rödel G, Kasper M, Barth K (2010) Interaction and

interrelation of P2X7 and P2X4 receptor complexes in mouse lung epithelial cells.

In: Cell Mol Life Sci, vol. 67, pp 2631-2642.

Werman A, Werman-Venkert R, White R, Lee J-K, Werman B, Krelin Y, Voronov E,

Dinarello C, Apte R (2004) The precursor form of IL-1alpha is an intracrine

proinflammatory activator of transcription. In: Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America, vol. 101, pp 2434-2439.

Wildbaum G, Youssef S, Grabie N, Karin N (1998) Neutralizing antibodies to IFN-gamma-

inducing factor prevent experimental autoimmune encephalomyelitis. In: Journal of

immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 161, pp 6368-6374.

Wilson JR, Forgione N, Fehlings MG (2013) Emerging therapies for acute traumatic spinal

cord injury. In: CMAJ : Canadian Medical Association Journal, vol. 185, p 485.

Wright H, Moots R, Bucknall R, Edwards S (2010) Neutrophil function in inflammation

and inflammatory diseases. In: Rheumatology, vol. 49, pp 1618-1631.

Yan P, Li Q, Kim GM, Xu J, Hsu CY, Xu XM (2001) Cellular localization of tumor

necrosis factor-alpha following acute spinal cord injury in adult rats. In: Journal of

neurotrauma, vol. 18, pp 563-568.

Yan P, Liu N, Kim G-M, Xu J, Xu J, Li Q, Hsu CY, Xu X-M (2003) Expression of the type

1 and type 2 receptors for tumor necrosis factor after traumatic spinal cord injury in

adult rats. In: Experimental neurology, vol. 183, pp 286-297.

265

Yang J, Weimer RM, Kallop D, Olsen O, Wu Z, Renier N, Uryu K, Tessier-Lavigne M

(2013) Regulation of Axon Degeneration after Injury and in Development by the

Endogenous Calpain Inhibitor Calpastatin. In: Neuron.

Yasuoka S, Kawanokuchi J, Parajuli B, Jin S, Doi Y, Noda M, Sonobe Y, Takeuchi H,

Mizuno T, Suzumura A (2011) Production and functions of IL-33 in the central

nervous system. In: Brain Res, vol. 1385, pp 8-17.

Yiu G, He Z (2006) Glial inhibition of CNS axon regeneration. In: Nature reviews

Neuroscience, vol. 7, pp 617-627.

Yoshimoto T, Mizutani H, Tsutsui H, Noben-Trauth N, Yamanaka K, Tanaka M, Izumi S,

Okamura H, Paul WE, Nakanishi K (2000) IL-18 induction of IgE: dependence on

CD4+ T cells, IL-4 and STAT6. In: Nature Immunology, vol. 1, pp 132-137.

Yoshimoto T, Takeda K, Tanaka T, Ohkusu K, Kashiwamura S, Okamura H, Akira S,

Nakanishi K (1998) IL-12 up-regulates IL-18 receptor expression on T cells, Th1

cells, and B cells: synergism with IL-18 for IFN-gamma production. In: Journal of

immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 161, pp 3400-3407.

Yune TY, Chang MJ, Kim SJ, Lee YB, Shin SW, Rhim H, Kim YC, Shin ML, Oh YJ, Han

CT, Markelonis GJ, Oh TH (2003) Increased production of tumor necrosis factor-

alpha induces apoptosis after traumatic spinal cord injury in rats. In: Journal of

neurotrauma, vol. 20, pp 207-219.

Yune TY, Lee JY, Jung GY, Kim SJ, Jiang MH, Kim YC, Oh YJ, Markelonis GJ, Oh TH

(2007) Minocycline alleviates death of oligodendrocytes by inhibiting pro-nerve

growth factor production in microglia after spinal cord injury. In: J Neurosci, vol.

27, pp 7751-7761.

266

Zawadzka M, Rivers LE, Fancy SPJ, Zhao C, Tripathi R, Jamen F, Young K, Goncharevich

A, Pohl H, Rizzi M, Rowitch DH, Kessaris N, Suter U, Richardson WD, Franklin

RJM (2010) CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well

as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. In: Cell Stem Cell, vol. 6,

pp 578-590.

Zhang Y-K, Liu J-T, Peng Z-W, Fan H, Yao A-H, Cheng P, Liu L, Ju G, Kuang F (2013)

Different TLR4 expression and microglia/macrophage activation induced by

hemorrhage in the rat spinal cord after compressive injury. In: Journal of

neuroinflammation, vol. 10, p 112.

Zhao R-R, Andrews MR, Wang D, Warren P, Gullo M, Schnell L, Schwab ME, Fawcett

JW (2013) Combination treatment with anti-Nogo-A and chondroitinase ABC is

more effective than single treatments at enhancing functional recovery after spinal

cord injury. In: The European journal of neuroscience, vol. 38, pp 2946-2961.

Zheng Y, Humphry M, Maguire JJ, Bennett MR, Clarke MCH (2013) Intracellular

Interleukin-1 Receptor 2 Binding Prevents Cleavage and Activity of Interleukin-1α,

Controlling Necrosis-Induced Sterile Inflammation. In: Immunity.

Zhou Q, Anderson DJ (2002) The bHLH transcription factors OLIG2 and OLIG1 couple

neuronal and glial subtype specification. In: Cell, vol. 109, pp 61-73.

Zhou Q, Wang S, Anderson DJ (2000) Identification of a novel family of oligodendrocyte

lineage-specific basic helix-loop-helix transcription factors. In: Neuron, vol. 25, pp

331-343.

Zhu W, London NR, Gibson CC, Davis CT, Tong Z, Sorensen LK, Shi DS, Guo J, Smith

MCP, Grossmann AH, Thomas KR, Li DY (2012) Interleukin receptor activates a

267

MYD88-ARNO-ARF6 cascade to disrupt vascular stability. In: Nature, vol. 492, pp

252-255.

Ziegler-Heitbrock L, Ancuta P, Crowe S, Dalod M, Grau V, Hart D, Leenen P, Liu Y-J,

Macpherson G, Randolph G, Scherberich J, Schmitz J, Shortman K, Sozzani S,

Strobl H, Zembala M, Austyn J, Lutz M (2010) Nomenclature of monocytes and

dendritic cells in blood. In: Blood, vol. 116, pp e74-e80.

Zong S, Zeng G, Wei B, Xiong C, Zhao Y (2012) Beneficial effect of interleukin-1 receptor

antagonist protein on spinal cord injury recovery in the rat. In: Inflammation, vol.

35, pp 520-526.

Zörner B, Schwab ME (2010) Anti-Nogo on the go: from animal models to a clinical trial.

In: Ann N Y Acad Sci, vol. 1198 Suppl 1, pp E22-34.

Zozulya A, Clarkson B, Ortler S, Fabry Z, Wiendl H (2010) The role of dendritic cells in

CNS autoimmunity. In: Journal of Molecular Medicine, vol. 88, pp 535-544.

Zujovic V, Benavides J, Vigé X, Carter C, Taupin V (2000) Fractalkine modulates TNF-

alpha secretion and neurotoxicity induced by microglial activation. In: Glia, vol. 29,

pp 305-315.