rna editing in higher plant plastids: oligoribonucleotide sscp analysis allows the proof of base...

4
ORIGINAL PAPER Melanie Fuchs á Rainer M. Maier á Patric Zeltz RNA editing in higher plant plastids: oligoribonucleotide SSCP analysis allows the proof of base conversion directly at the RNA level Received: 12 February 2001 / Accepted: 25 April 2001 / Published online: 14 June 2001 Ó Springer-Verlag 2001 Abstract Plastid RNA editing of a number of tran- scripts at specific sites changes genomically encoded cytidines to nucleosides, which act like uridines in RT- PCR analyses. To study plastid-editing directly at the RNA level, we established a single-strand conforma- tional polymorphism assay for the discrimination of small RNA molecules. The electrophoretic mobility of a oligoribonucleotide resulting from a RNase T1-digested and edited plastid mRNA was shown to be identical with a control RNA molecule containing a uridine at the editing site, whereas the unedited RNA behaved like a RNA molecule containing a cytidine at the respective position. Keywords C-to-U editing á Plastid gene expression á RNA-SSCP analysis Introduction RNA editing changes the nucleotide sequence of a transcript, so that the RNA sequence differs from the genomic template from which it was transcribed. Dis- covered in 1986 Benne et al. 1986), RNA editing has been shown to exist in a variety of genetic systems such as nuclei, mitochondria and chloroplasts for a review see, e.g. Benne 1996; Brennicke et al. 1999; Bock 2000; Gott and Emeson 2000). However, it has yet not been reported for prokaryotes. Formally, RNA editing can be divided in two major classes: Insertional/deletional editing and conversional editing. In the latter case, RNA editing changes the identity of a nucleotide at a specific position but not the number of nucleotides. In plastids and mitochondria of higher plants, RNA editing predominantly takes place by changing genomi- cally encoded cytidines to nucleosides which act like uridines in RT-PCR analyses and chain-termination sequencing reactions. Regarding the mechanism, editing of plant organelle RNA is thought to act by deamina- tion of cytidines at position 4, directly resulting in uridines, which subsequently leads to the incorporation of adenosines at the respective sites during cDNA syn- thesis. To study the editing of plastid transcripts directly at the RNA level, we established a method to detect a single-strand conformation polymorphism rSSCP) in small RNA molecules. This method allows the separa- tion of oligoribonucleotides differing only in one amino group and thus makes it possible to distinguish between edited and unedited molecules directly, without reverse transcription of the RNA. Materials and methods Plasmid constructions and in vitro transcription Maize DNA and cDNA, respectively, were ampli®ed with the primer pair P1 5¢-GCGATTTCAAGTATTGCTCC-3¢, position 116,033±116,052 of the maize plastid chromosome) and P2 5¢- TAGTAGAAGACCAAATCCCCC-3¢, position 113,461±113,481 of the maize plastid chromosome). PCR products were digested with BglII and HindIII and the resulting restriction fragments were separated by agarose gel electrophoresis. DNA fragments with the expected size of 475 bp were eluted with Qiaex Qiagen, Hilden) and subsequently cloned in the pBluescript KSII+ vector to gen- erate pZmc-ndhA/475d and pZmc-ndhA/475c for DNA and cDNA, respectively. The cloned inserts were sequenced to verify editing position IV of maize ndhA. To produce ``unedited'' and ``edited'' ndhA mRNA fragments, the plasmids were linearised with XbaI and transcribed in vitro. The RNA antisense hybridisation probe complementary to the 32-nt oligoribonucleotide obtained by RNAse T1 digestion of ndhA RNA was derived by cloning a 54-bp ApoI/SpeI restriction fragment of ndhA/475d into the EcoRI/SpeI sites of pBluescript KSII+. The resulting plasmid was linearised Curr Genet 2001) 39: 384±387 DOI 10.1007/s002940100221 Communicated by A. Brennicke R.M. Maier &) Botanisches Institut der Ludwig Maximilians UniversitaÈt MuÈnchen, Menzingerstrasse 67, 80638 MuÈnchen, Germany E-mail: [email protected] M. Fuchs á P. Zeltz GeneScan Europe AG, Engesserstrasse 4b, 79108 Freiburg, Germany

Upload: melanie-fuchs

Post on 10-Jul-2016

213 views

Category:

Documents


1 download

TRANSCRIPT

�������� ����

������� ��� � ����� �� ���� � ��� � �����

��� ������ �� ��� � ��� � ������� � ��������� ������ ������� ���� � ��� �� ����� �� ���� ���������� ������ � �� �� ��� ���

��� �� �� ������� ���� �������� �� ����� ���� � �������� !��!� �" #�! ����� $���!%�&'���% ����

���� �� ������� ��� ����!% ( � !�)�� ( ���!&������� �� ����(�� ���� ���!%� %! )������ !� ��������!� � !��� ����* +���� ��� ��, �����!� �! �-&�.� �!�����/ - ����� �������&����!% ������� �� ����� � �* + ��������� � ��!%�&����!� � !( �)�&�� !�� � ��) �����) ����� ( � �� ������)�!��� ! (�)��� ��� ) �����/ -� ���� �� ���� ) ������ ( � ��% ��� !��� ��� ������!% (� ) � ���� -�&��%����!� ���� ������� )��� +�� �� +! � � ��!�����+��� � � !�� � ��� ) ���� � !���!�!% � �����! �� ������!% ���* +���� �� �!���� ��� ��� � ��, ���� ) ���� � !���!�!% � ������! �� �� ������ � ���� !/

����� �� .&� &0 ����!% � ������� %! 1����� ! ����&$$.� �!������

������������

��� ����!% ���!%� �� !��� ��� �2�!� ( ����!������* � ���� �� ��� �2�!� ��((�� (� ) ��%! )�� �)���� (� ) +���� �� +�� ���!������/ 3��&� �� �! �456 78!! � ��/ �4569* ��� ����!% ����! �� +! � 1��� �! � ����� ( %!��� ����)� ������ !����* )�� �� !���� �!� ��� � ������ 7( � � � �+�* /%/ 8!! �446: 8�!!��, � ��/ �444: 8 �, ����:� �� �!� )� ! ����9/ ; + �* �� ��� �� ! � �!�� ��� ( � �� ,��� ��/ � �)����* ��� ����!% ��!� �� ��� �! �+ )�< � ������� �!���� !������� !��

����!% �!� � ! ��� !�� ����!%/ �! �� ����� ���* �������!% ���!%� �� ��!���� ( � !��� ��� �� � ����(��� ���� ! ��� ! � �� !�)�� ( !��� ����/

�! �������� �!� )�� �� !���� ( ��%�� ���!��* �������!% ��� )�!�!��� ��,� ���� �� ���!%�!% %! )�&����� !� �� ������!� � !��� ���� +���� ��� ��,�����!� �! �-&�.� �!����� �!� ����!&��)�!��� !�2�!��!% ����� !�/ �%����!% �� )���!��)* ����!% ( ���!� �%�!�� ��� �� �� �%�� � ��� �� ��)�!�&�� ! ( ������!� �� � ���� ! "* ������� ������!% �!�����!�* +���� ����2�!��� ���� � �� �!� �� ���� ! ( ��! ��!� �� �� ������ ���� ����!% �3�� ��!&�����/

- ����� �� ����!% ( ������� ���!������� ������� ���� ��� � �* + ��������� � )�� � � ���� ���!%�&����!� � !( �)��� ! � ��) �����) 7�$$.�9 �!�)��� ��� ) �����/ -��� )�� � ��� +� �� �����&�� ! ( ��% ��� !��� ���� ��((��!% !�� �! ! �)�! %� �� �!� ���� )�,� �� � ����� � �����!%���� ��+!���� �!� �!���� ) ����� �������* +��� �� � �����!������� ! ( �� ���/

������� � ��� ������

����)�� � !������� !� �!� �! ��� ���!������� !

=��> 3�� �!� �3��* ������ ��* +� �)���?� +��� �����)� ���� �� 7��&�.��---.���-�--�.-..&@�* � ���� !��6*�@@A��6*��� ( �� )��> ������� ��� ) � )9 �!� �� 7��&-��-������..���-.....&@�* � ���� ! ��@*"6�A��@*"5� ( �� )��> ������� ��� ) � )9/ �.� �� ����� +� ��%���+��� ����� �!� ������� �!� �� ������!% �������� ! (��%)!�� +�������� �� �%�� � %� ���� �� ����/ 3�� (��%)!�� +��� ��1���� ��> ( "B� �� +� ���� +��� C��1 7C��%!* ;���!9�!� ����2�!��� �� !� �! �� �8�������� D$��E �� � � %!&��� �F)�&����"B�� �!� �F)�&����"B�� ( � 3�� �!� �3��*������ ��/ -� �� !� �!���� +� �2�!�� � ��(� ����!%� ���� ! �' ( )��> ���/ - �� ��� GG�!����HH �!� GG����HH��� )��� (��%)!��* �� ����)��� +� ��!����� +��� ����!� ���!������ �! ��� / -� ��� �!���!� ����������� ! �� �� )��)!���� � �� @�&!� ��% ��� !��� ��� ����!� ������ -� ��%��� ! ( ��� ��� +�� ��� � �� �� !�!% � �"&�� ���� �� �������� ! (��%)!� ( ����"B�� �!� �� ������� ������ ( �8�������� D$��E/ -� ������!% ����)�� +�� ��!�����

.��� �!� 7����9 @4� @5"A@5B3�� ��/���B�����4"�������

. ))�!����� �� �/ 8�!!��,

�/=/ =��� 7�98 ��!����� �!������ �� ���+�% =�1�)����!�0!� �����I � =�I !��!* =!>�!%�������6B* 5�6@5 =�I !��!* ��)�!�&)���� ���)���J� ��!�,/�� � %�/�!�&)�!��!/�

=/ ����� � �/ F��>�!$��! �� � ��* !%��������� "�*B4��5 ������%* ��)�!�

+��� ��� �!� ���!������ �! ��� �! �� ���!� ( �&@��&0-�/��� �! ��� ���!������� ! ����� !� +� ��( �)� +��� -B ���� ��)��� 78 ���!%�* =�!!��)9 ��� ���!% � �� )�!�(��&����H� ��%%��� !�/

���!� %� +��* ��� � ����� �� ���� !* ��� �������� !�!� �3�� ��!�����

=��> 7��� ���� ���� � / ��� �� �K @5"9 ����!%� +� �����& ��� �! � �� � ��%����� � ���, ����� �� � ��� �* �� �)������� ( �5 �. �!� �B �.* ������ ��/ �!���� ��� � ������ +� �� ����(� ) �� � ( ��&���& �� ���!�� �� ��� �� %����!� �!���(�%��� !�� ������� �� � ��!� ! �!� 8��!�� 7�4559/ .�� � ����� ���+�� 1������ �� ���� %��!���!��) �� ���� ���!����! � 1����&�� ! ��� ���!% � .� )�>�!�,� �!� $����� 7�45B9/ -� ����������� !� +� ����� +��� 3��� �* 1������ +��� ��! ����� � ( �) �!� ���������� +��� �/� ��)� ( ���! � �! �����!� ( �/@ = �����* �; "/5/ � �� ���!������� ! ( ������)� +��� �1�!��� ���� �! �� ���!� ( =�� !� )���!��,)�� ���� ���� ;&(� � �� ���!�������� 7��8.��8��*D�������9 +�� ��( �)� ��� ���!% � �� )�!�(������H� �!&������� !�/

���� -� ��%��� ! �!� � ! 1���!% ��� )�� %����� ( ���

�! ��� ���!������� 7� �%9 +� ��%��� +��� ��� �!��� ( ����-� (� ) � �������� ������ 78 ���!%�* =�!!��)9 ( � � � ��@B �. �! �� ���!� ( �� )= -����;.�* �; B/�* ��� )= ��.��!� � )= 3-�* ( �� +� �� ��! ����� � ( �) 1������ !/������!% ��% ��� !��� ���� L�� !� +� ���������� �� ����!%" ��)� ( " = �;"��* �!������ ! �� ( � �� )�! �!� ��!�!���(�%� ( � �� )�! �� �B*6�� �/ ��� ����� +� ���� � � �!- ��((� 7�� )= -����;.�* �; 5/�* � )= 3-�* �; 5/�9/ - ������ � ����� ��� +�� ��%��� +��� �� �!��� ( ���� -���%����� �� ������� �� �!� ���! �&����������/ ��� �����+� ���� � � �! ��� �� ( � ��((� � � !���!�!% ��� )= ��.�*�� )= = ������;* �; B/�* ��M 7 � 9 ���! � �!� ������ !� C��%!&��� ��� � ��)!� 7C���%!* ;���!9 �� � ���� 2���������+��� � ��((� � !���!�!% ��� )= ��.�* �� )= = ������;*�; B/�* ��M 7 � 9 ���! � �!� �/��M 7 � 9 -��� ! K&���/ . ��)!�+� +���� ��� ��)� +��� ��((� �* ( �� +� �� ��� +����+��� � ��((� � !���!�!% "�� )= ��.�* �� )= = ������;*�; B/�* �!� ��M 7 � 9 ���! �/ ���% ��� !��� ���� L�� !� +����� +��� 5�� )= ��.�* �� )= = ������;* �; B/�* ��M 7 � 9 ���! � �!� 6 = ��� �!� +� ���������� +��� � ��) (�� �� ��! �/

�$$.� � ��������)�� %� ���� �� ���� �!� ����!�!% ( ���

� � �� ������� ! ( ��� ) ����� �!�� ! !&�!�����!% � !&���� !�* �$$.� %�� +��� � ��)!�� ! ( "������/�� �) � !���!�!%��M 7+� 9 � ��������)�� 7�4�� ������)������������)��9 �!��-8 7�� )= -����� ���* �� )= 3-�* �; 5/@9 +� ���/���� �� ��� +� ��! �! ��-8 �� �*���A�*B�� ' �!� � � !&���!� �)������ ( " �. ( � ��A�� � �! � )��� �� � %� ���� &�� ���� ��������� 7����)����* ������%9/ ��� � � �$$.����� �� ����* ��� ��)��� +� ���� � � �! 5�M 7 � 9 ( �&)�)��* � )= 3-�* �/�M 7+� 9 �� ) ��! � ���* �/�M 7+� 91��! ���! �* �!������ ( � � )�! �� 4� �. �!� ��! ������ !��/ 3!�����!% � ��������)�� ��� %�� +� ��! �� ������� ��$�)�� , � ��/ 7�4549/ $�� � ����!�!% ( ������� ��� (��%&)!�� +�� ��( �)� ��� ���!% � �%� � 7�45@9/

8� ���!% ( ��� �!� � ����! ����������� !

���% ��� !��� ���� ������� �� �$$.� ���� �� ���� +����!�(��� !� � ���� �� ����%� !�� ! ))���!� 7;�� !��E* 8 ���!%� =�!!��)9 ���!% � �)���� ���� �� ���

7-��!��� � $3 �)�&��� ���� �� ���� ���!�(� ���* 8� ���*=�I !��!9/ -� ���!�(� +�� ��( �)� ( � �� )�! �� @ )���)�

%�/ �(�� � )���� ! ( �� ���!�(�* ��� +�� ?1� !� ��!�� ! ))���! �� 0'&�� ����!,�!% 7$�������!,� �"��* $�����&%!9/ � ����! ����������� ! +�� ��( �)� �� "@ �.* ��� ���!%� $�)�� , � ��/ 7�4549/

���� �� ��� ����������

-� ��� %! �� ���� ( �� ��� %! ������ �����!% �!�� �)��� ��!%�&� �� 7$$.9 �%� ! ( �� )��> ���������� ) � ) 7=��� � ��/ �44�9/ � � )����� ! ( ��)��> ���&�3�� �2�!� +��� �� ����� )&!� ���2�!�� ��%�!���� � ��� ( �� ����!% ���� 7� � �'9�! �� ��� ���!������* ��� ( +���� ��� � � � !� ( �� !�� � �)�! ����� 7=��� � ��/ �44�9/ -� $$.�%� ! ( �� )��> ������� ��� ) � ) �!����� ������%� %��! ��!&(� �%)!�� 7@�* @�* �!� @" !�9* +����� @� !� �%)!� � !���!�!% ����!% ��� �' ( ���/���% ��� !��� ���� � ���� !��!% � ��� �%)!���� ��� � %!���� �� ��%��� ! +��� ���� -�* +�������� �! ��� ) ���� �� �� @� !� ( %��!���� ����/

-� ��� ����!% ��� �' � !���!�!% "B�&�� �������&����� (��%)!��* ����!� (� ) �.� �� ����� �)���?�(� ) )��> ��� � ����� 3�� �!� �3��* +� �� !��!� � �8�������� �� � 7$�����%!* �)�����)9/��� 3��& �!� �3��&��, ���!������� �� ���� �� �! ��� ���!������� ! ( ����)�� �F)�&����"B�� �!��F)�&����"B��* ������ ��* +� ��%��� +������� -�/ - �! ���%�� �� � ��������� ( � � !( �&)��� !�� � ��) �����) ��+! �� �+ @� !� ��% ��&� !��� ���� � !���!�!% ���� � ������! � � �����! ���� ����!% � ���� !* �� ������!% ��� (��%)!�� +�������� �� �$$.� � ��������)�� %� ���� �� ����/-�� ������������� ��% ��� !��� ����* ����!��!%�� @�* @� �!� @" !� (��%)!�� +� ����� �! � ������ -�&��%��� ��)��� 7��%/ ��* ��!� .* 09/; + �* +���� �� ���� -� %!���� (��%)!�� (@� !� �!� @" !� �!%�� (� ) � �� 3��& �!� �3��&��,���!������� ��!!�!% �� ��!����� � ���� ! 7��%/ ��* �!��&���� �� @� �!� @"9* ��� +�� � ��%!�(���!� ��((�!� �!�� ) ������ ( �� @� !� (��%)!��* +���� � !���! ����� �����! 7��! 0* �!������ �� @�09 � � ������! �� ������!% � ���� ! 7��! .* �!������ �� @�.9/ �! ��!.E0* +�� � �� ( �� ��)��� +� � )��!�* �+ �����!�� ��!�� �� � ���� !� ��!����� � @�0 �!� @�. �� �����* +���� �) !������ ���� �� ��!!�!% ��((�!��� ! � �� � %� � ���% ��((�!�� �! �� ������ ��!�* ��� �!���� � � ��((�!� �! ��������/

- �! ���%�� �� �! � ������ ( �� ���� !���& ��� �� � ���� ! �' ( ��� �! ��� � ������ ������� ���� ��� � �* � �������� �) �!� 7��� �%9 ( ��)��> � ��� ��� � ����� ��� +�� ��%��� +��� ����-�* �� ������� �� ( � �� �! ��� ���!�������/ - !���� ��% ��� !��� ���� L�� !� �!� � � +� ���) �!� ( !����� ����� � � � ��� �! ! ��! ( ���$$.� %��* �� ��%��� ��� +�� (����� !��� �� � !1���!% ��� )�� %�����/ -� (����� ! � !���!�!% ��&% ��� !��� ���� L�� !� �! �!%�� +�� ����2�!���

@5�

� ��� !� � �$$.� %� �!� ��! �! ������� � �� �&����� � !�� � ��)���/ -� ������� ��� ) �����+� ���� �� �������� �� ��� !� � !�� ! ))���!�!� �� ��� ����!% ��� �' � !���!�!% @� !� ��% ��&� !��� ���� +�� ����� �� �� ��!% +��� �! ���� &������ �!���!� ���/ �� �� +! �! ��%/ �8* ��� !�� � ��% ��� !��� ���� 7��!� .* 09 ������� ��������������� ) ������ ��((�!�/ -� � ���� !��!%������� ��% ��� !��� ���� 7��* ��%�� �!� �(� ��!�9%� � ��� !% ��%!�� �� �� ���� ! ��!����� � �� @�0� !�� � ��% ��� !��� ���* ��� %� ! ��%!�� �� ��� ���� ! ( �� @�. ��% ��� !��� ���* +���� �N�������!% �� �� � ���� !��!% � ���� !/ $�!� ��� �� ! ��%!�� ��, ���� �! ��! . �����* ����!% �� ��� ��� �'������ � � �� (?��!�/ �! ������ ! �� �! � �������!�� �� �� �! ��! +��� �� ?!��!% ���� �! ��� ��� ����!% ���!% ������� 1������ ������ �! �����!� ���� ! �� ���!&���� ��� )�� %����� 7-�.: ;�� � �!�$�%���� ����9/

-�.* +���� ��� (�2�!��� �! ��� � ���)�! ��) ��?� !��� ��� ������!% (� ) ����!%* ��� �� ��& �!��% ( !��� ��� ����� ! �� �� ) ! )��� � �/; + �* �! � * � ����� ������!% ( �� !��� �������� � � ���� �� ! � � ����� �!�* ���( �* � �&���� ���������� ! ( !�� �� �! � &���� !��� ������ ��(?���� ���!% -�./ - 1���� ����(���� �� �

�!����(�� ����!%&��, ���� ���* ! ��� � ��! ���� ���&�� � !�� � ����� !� 7��<��,��� �!�=����%�! �44@9 �*����!��� ��* � ����(� �� ����� ��� �� ( � ���%� � 7; �%� � ��/ �44�9/ 3� � ��� ��(?������* ) �� ( �� �! ���%��� !� +� � ! ���!% �! ��� ����!%����)�* �! +���� �� �������� ��� 78��!� � ��/ �44�:=���� � ��/ �44�: O� �!� $������ �44�9 � ! ���!�� ����� !��� ��� � � ���� 7O�!% � ��/ �44�: ;�&� � �!� $�%���� ����9 ��! � ����� �� ������/; + �* �! ��� ����)� ��� �� ���, ����* �!�� ���! !&!������ � !���� !�* !>�)� ��� ���! �� !�����!% �! � )�%�� � ��� !���� ( � �� ����� ��%&!��/ � � 1�)��* �� ��� �! �� +! ���� ����3 7� �&��&����!�� ��� ��! ��! ��)�!��9 �� ��� � ����� )�))����! ����&8 )��� �! ��� 7;���� � ��/�44�9* ���� �%� �3� ������ � � �� !>�) ����!%�! � 7=���� � ��/ �446: O�!% � ��/ �44B9/ -� �$$.��!������ ���!�� ��* �! � !�����* ��)��� �� ����(�� ���������� ! ( �� �! � ������ ( � ���������� ����!%���* ! �! � ���% � � ( ���* ! !&� ) � % �� ���) �����/ �! ������ !* ����� �� ���� ��� ����(�� ����� ������� �� �� ��� � �* ����(���� �� � !>�)���� !��� ��� )��&�!� �� ���� ! ����!% �3����!����� �!� �.� �)���?���� ! �� � ���/

��������������� -� ���� �� +��� � )������ ���� �� (/ ;�!�D I ��� 7����� �! �44�9 !� ���%� ��) � � ��� �! ���%�&�� !�/ P ���!, .�������! $��)��>&��!!+�� �!� �� (/ ��!� ���/ ;��)�!! ( � ���(�� � ))!�� ! ���� )�!�������/ -��� + �,+�� ���� ��� �� �� 3����� � �����!%�%)�!����(�/

����������

8!! � 7�4469 ��� ����!%� � + � )���% �� ���!%�/ .������! �!� 3 � � 6����A��@

8!! �* 8��% # �! �!* 8��,!� Q #�* $� ( �* '�! 8 ) #;*-� )� =. 7�4569 =�< � ���!������ ( �� (��)���(�� �����%! (� ) �����! � ) )�� �� !���� � !���!� ( �� !��� �������� �� ! � !� �� �! �� 3��/ .�� "6�5�4A5�6

8��!� '* ��� �, $* ����� � 7�44�9 ��� ����!% �! +��� )�� &�� !���� �� ��� �� � ��)�!��� ! ����� !/ �8$ ���@B@��6A6�

8 �, � 7����9 $!� (� ) ! !�!�� � + �� %!��� �!( �)��� ! (��� � ������ �� ����� �� ��� ����!%/ 8� ���)� 5���"4A��B

���� � � $�� � ����!�!% ( ���� -� ��%��� ! �� ����� ( ��� �! ��� ���!������� �(�� ! !&�!�����!% ��!%�&����!� � !( �)��� !��� ��) �����) 7�$$.�9 ���� �� ����/ ���%)!�� ������!% (� )���� -�&��%��� ���!������� ( �F).&����"B�� 7���� �9 ��F).&����"B�� 7���� �9 � � �� 7���� ���9 �� �����/ -�� ���� !� �!� �� 1���� �!%�� ( �� ��%��� ! �� ����� ��)��,� �� �� �(�/ � � �!� � � �! � �� @�&!� ��% ��� !���& ���� � !���!�!% � ������! � � �����!* ������ ��* �� �� ����!%��� �' ( ���/ � � ����! �� � ( ���� -� �� ����� �(�� ! !&�!�����!% �$$.� ���� �� ���� ���!% � �� � ����(�� ( � �� @�&!� ��% ��� !��� ���* � !���!�!% ����!% ��� �' ( )��> ���/-� !" ��!� �� + � ��� )��> ��� � ����� ��� ��%��� +������� -�/ . !�� � ��%��� !� ( �! ��� ���!������� ( �F).&����"B�� �!� �F).&����"B�� �� !* � � �� � %��� +� ��!�! ��!� �! ����� �* � �!� ���* ������ ��/ � � �!� � � �! ��� @�&!� ��% ��� !��� ���� � !���!�!% � ������! � � �����!*������ ��* �� �� � ���� ! � ���� !��!% � ����!% ��� �' ()��> ��� �!� �� )��,� �� �� �(�

@56

8�!!��, �* =����(��� �* 8�!�� $ 7�4449 ��� ����!%/ �=$=��� �� � � �@��4BA@�6

.� )�>�!�,� �* $����� � 7�45B9 $�!%�&��� )�� � ( ��� �� &���� ! �� ���� %��!���!��) ��� ���!��A��! �A��� � ( �)1������ !/ �!�� 8� ��) �6����6A��4

� �� #=* )� ! �8 7����9 ��!��� !� �!� )���!��)� ( �������!%/ �!!� � �!� @"�"44A�@�

;�� � -* $�%���� = 7����9 �! � )!� ( � ���&����(�� ���!�&����!% (��� � �!� � � )) ! ���&��!��!% �� ��! �! �� ���&�!% ( ��� � ����� )����� � � �)!� ( � ��� � ����� �! ��� ��� ����!% ����)/ =8� # �����""A����

; �%� �* �� ����!�) �* �� #.* $� �� # 7�44�9 $��&����(������� ! ( �����! (� ) ������! �! �� ��� �� ��! 8 )�������!%/ ������ ����� �� �4���4BA����

;���� $�* ; �%� ��* ������ �% �#* 8��� 8� 7�44�9 3�)�!�&�� ! ( )�))����! %����)�� ���� � ��� �� ��� ������� ��! ��! ��)�!��� ��)�������� � �! � �������!%/ ��� ������A��6�

�%� � �� 7�45@9 � ��� � ����! ( � ����� ! ( !�! %��) �) �!�� ( ���� ( �� +�!% �+ &��)!�� !�� ���� �� ����/ �!��8� ��) �@"��5"A�55

=��� �=* ; �� 8* F��> �* D I ��� ; 7�44�9 �!��!�� ����!% (�� )��> ��� � ����� ��� ���!������ ��� �� � � !� ( � � !&�� � �)�! �����/ ���!� .�� "�6�4A6�6

=��� �=* ��,�)�!! D* �%� � �� D I ��� ; 7�44�9 . )����2�!� ( �� )��> ��� � ����� %! )� %! � !�!�* � �&�� �� ( �� �%!� �!� ?! ��!�!% ( %!��� �!( �)��� ! �����!������ ����!%/ # = � 8� � ����6�"A6�5

=���� -* =��� $* ;�%���� =* D��� P* $���% �; 7�44�9����!% ( �����&�)�! &@&���� 1�&�&)������ 1�> �&"&�� �&� !�� ���� ���� � ��0�&8 ��&)��� �! ��� � ��� ���&����� ��! ��! � �! ��! � ! ��� !/ # 8� � .�)�B��5�66A5�B�

=���� -* =��� $* ;�� �* $��!%� �* $���% �; ;�%���� =7�4469 � )�))����! ��� ����!% !>�)/ ����� @B4�"6�A"6"

��<��,��� 'D* =����%�! �= 7�44@9 ��� ����!% �! ���!� )�&� �� !����� �����&�� ����� �� ����!� ����!% .&� &0 � !& ��� ! �! )����/ ���!� .�� ���5"@A�5��

� ��!� ! .* 8��!�� �D 7�4559 �!� $��+ .; 7�9 ���!� ) �������� � %� A � ��������� ���� ���/ ��� ����* �1( ��* �� 6BAB5

$�)�� , #* ������� �* =�!����� - 7�4549 = ������ �� !�!%� ���� ��� �� )�!���/ . �� $���!% ;��� � ��� ��� ��* . ��$���!% ;��� �* �O

O�!% #;* $,��� �* �1� �* =�!����� - 7�44�9 ����!% ( %����)������ � ����!�� � ��&)��� �! ��� �� ���&����(�� ��)&�!��� ! ( ��! ��!/ ����� @B"�BBA5�

O�!% #;* $,��� �* �1� �* =�!����� - 7�44B9 ����?���� ! �!����������>��� ! ( � ��)�! ��� ��! ��! ��)�!�� ( �%����)�� ���� � 8 ��&)��� ����!%/ �� � ���� ���� $��0$� 4"�"@�"A"@�4

O� P* $������ P 7�44�9 ��!� ( � � ���&����(�� ������! �&�)�!��� ! ����� ! �! � � �! .&� &0 ��� ����!% ( ���!�)�� �� !����/ # 8� � .�) �B���5��BA�5�@@

@5B