RING TEST FOR A WHOLE-SEDIMENT TOXICITY ASSAY WITH THE RING TEST FOR A WHOLE-SEDIMENT TOXICITY ASSAY WITH THE

BENTHIC MARINE DIATOM BENTHIC MARINE DIATOM Cylindrotheca closteriumCylindrotheca closterium

Instituto de Ciencias Instituto de Ciencias

Marinas de Andalucía Marinas de Andalucía

(ICMAN)(ICMAN)

Cristiano V.M. AraújoCristiano V.M. Araújo

Julián BlascoJulián Blasco

Ignacio Moreno-GarridoIgnacio Moreno-Garrido

EXERCICIO INTERLABORATORIO DUN ENSAIO DE TOXICIDADE CON EXERCICIO INTERLABORATORIO DUN ENSAIO DE TOXICIDADE CON

SEDIMENTO USANDO A DIATOMEA SEDIMENTO USANDO A DIATOMEA Cylindrotheca closteriumCylindrotheca closterium

destino final de contaminantes: impacto urbano e industrialdestino final de contaminantes: impacto urbano e industrial

sumidero / fuente de contaminantes y nutrientessumidero / fuente de contaminantes y nutrientes

biodiversidad biodiversidad funcionamientofuncionamiento

Sedimentos estuarinosSedimentos estuarinos

elutriatos y agua intersticialelutriatos y agua intersticial

sedimentosedimento

Calidad ambiental del sedimentoCalidad ambiental del sedimento

Representante del Representante del

microfitobentosmicrofitobentos

Relevancia elevada: productor Relevancia elevada: productor

primarioprimario

Importante en el ciclo de materia Importante en el ciclo de materia

y energía, producción de oxígeno, y energía, producción de oxígeno,

estabilización del sedimentoestabilización del sedimento

Alta sensibilidadAlta sensibilidad

Cylindrotheca closterium (diatomea)

ORGANISMO DE ENSAYOORGANISMO DE ENSAYO

Microalgas - organismos de ensayoMicroalgas - organismos de ensayo

Selenastrum Selenastrum capricornutumcapricornutum

Phaeodactylum Phaeodactylum tricornutum tricornutum

Sedimento - organismos bentónicos

OBJETIVOS

Evaluar y optimizar el ensayo de toxicidad en sedimento usando

Cylindrotheca closterium para aplicación en programas de calidad

ambiental de sedimentos marinos y costeros.

Evaluar la viabilidad y variabilidad (intra e interlaboratorial) del

método.

La draga es hundida en el sedimento

Sedimento superficial aislado por la tapa

Ría de HuelvaRía de Huelva

Muestras de sedimentoMuestras de sedimento

Cepa de microalgaCepa de microalgaSoluciones: cultivo y ensayoSoluciones: cultivo y ensayo

Cepa de microalgas Medio de cultivo

Añadir agua Milli-Q, NaCl,

NaSO4, solución stock 01 y

02, medio f/2 y silicato

Aclimatarlas a

temperatura

ambiente

Renovar el cultivo después de la

1ª (cultivo 02) y 2ª (cultivo 03)

semanas.

Cultivo 01: IncubarVerte el contenido de las pipetas

Medio del ensayo Frascos del ensayo

Añadir agua Milli-Q, NaCl, NaSO4,

solución stock 01 y 02, solución

nutritiva y silicato

Añadir 2 g de peso seco

sedimento y 48 mL de

medio

El día siguienteEl día siguiente

Cultivo 03(crecimiento exponencial)

Centrifugar y lavar

el cultivo con el

medio de ensayo

Inóculo concentrado

Añadir las algas

Incubar - al final de 72 h, hacer

el recuento celular

Frascos del ensayo

Ensayo de toxicidad

RESULTADOSRESULTADOS

Densidad celular final de poblaciones de Cylindrotheca closterium tras 72h de exposición a

cuatro muestras de sedimento. Los ensayos representan diferentes laboratorios.

Ds: nº de células en el control al final del ensayo

Dc: nº de células en la muestra test

Di: nº de células inicial (1x104 cels mL-1)

Den

sid

ad c

elu

lar

tras

72

h (

cel

s m

L-1)

x 10

4

Ensayos

RESULTADOSRESULTADOS

Sample A

Assays

1 2 3 4 5 6 7

Gro

wth

inhi

bitio

n (%

)

-50

-25

0

25

50

75

100

125

Intervalo entre el 2º y Intervalo entre el 2º y

3º cuartiles3º cuartiles

Inhibición de crecimiento (%) de células de Cylindrotheca

closterium expuestas al sedimento A.

MedianaMediana

SD de los 3 valores SD de los 3 valores

centralescentrales

RESULTADOSRESULTADOS

Sample B

Assays

1 2 3 4 5 6 7

Gro

wth

inhi

bitio

n (%

)

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

125

Intervalo entre el 2º y Intervalo entre el 2º y

3º cuartiles3º cuartiles

Inhibición de crecimiento (%) de células de Cylindrotheca

closterium expuestas al sedimento B.

MedianaMediana

SD de los 3 valores SD de los 3 valores

centralescentrales

RESULTADOSRESULTADOS

Sample C

Assays

1 2 3 4 5 6 7

Gro

wth

inhi

bitio

n (%

)

50

60

70

80

90

100

110

Intervalo entre el 2º y Intervalo entre el 2º y

3º cuartiles3º cuartiles

Inhibición de crecimiento (%) de células de Cylindrotheca

closterium expuestas al sedimento C.

MedianaMediana

SD de los 3 valores SD de los 3 valores

centralescentrales

RESULTADOSRESULTADOS

Replicabilidad y reproducibilidad (en %) del porcentaje de inhibición de crecimiento

obtenido para cada laboratorio y muestra.

Muestras

Ensayo Ra R’b

1 2 3 4 5 67

(CV en %)

A -c 4.28 >100 5.47 0.67 16.71 7.29 63 19

B 5.41 35.03 67.53 16.68 0.46 6.98 >100 73 31

C 20.15 0.64 27.22 5.99 0.87 0.85 3.70 17 17

a: R representa la reproducibilidad calculada con todos los datos.a: R representa la reproducibilidad calculada con todos los datos.

b: R’ representa la reproducibilidad calculada sin el datos del ensayo #3.b: R’ representa la reproducibilidad calculada sin el datos del ensayo #3.

c: No hubo crecimiento celular en ninguna de las réplicas.c: No hubo crecimiento celular en ninguna de las réplicas.

RESULTADOSRESULTADOS

Xlab: resultado de un laboratorio.

X: mediana de los resultados de todos los laboratorios (excepto ensayo #3).

IQR(n): rango intercuartil (diferencia entre los cuartiles superiores (75%) e inferiores (25%)

normalizado (multiplicado por 0.7413 - factor sacado a partir de la distribución normal de los datos).

Z ≤ 2: satisfactorioZ ≤ 2: satisfactorio

2 < Z 2 < Z ≤≤ 3 aceptable (cuestionable) 3 aceptable (cuestionable)

Z > 3 insatisfactorioZ > 3 insatisfactorio

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

El ensayo propuesto ha sido valorado positivamente por todos los El ensayo propuesto ha sido valorado positivamente por todos los

laboratorios pese la falta de experiencia con el organismo usado;laboratorios pese la falta de experiencia con el organismo usado;

Alrededor del 80% de los ensayos (17 de 21) presentaron resultados Alrededor del 80% de los ensayos (17 de 21) presentaron resultados

considerados satisfactorios (Z score ≤ 2);considerados satisfactorios (Z score ≤ 2);

La practicidad y relevancia del ensayo, y la buena reproducibilidad La practicidad y relevancia del ensayo, y la buena reproducibilidad

(pequeña variabilidad) de los resultados favorece a la implementación (pequeña variabilidad) de los resultados favorece a la implementación

del ensayo con del ensayo con Cylindrotheca closterium Cylindrotheca closterium expuesta a todo el expuesta a todo el

sedimento como método estándar para evaluar la calidad del sedimento como método estándar para evaluar la calidad del

sedimento estuarino. sedimento estuarino.

A G R A D E C I M I E N T A G R A D E C I M I E N T O SO S

PROYECTOPROYECTO

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Marinas de Andalucía Marinas de Andalucía

(ICMAN)(ICMAN)

Cristiano V.M. AraújoCristiano V.M. Araújo

Julián BlascoJulián Blasco

Ignacio Moreno-GarridoIgnacio Moreno-Garrido

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BENTHIC MARINE DIATOM BENTHIC MARINE DIATOM Cylindrotheca closteriumCylindrotheca closterium

EXERCICIO INTERLABORATORIO DUN ENSAIO DE TOXICIDADE CON EXERCICIO INTERLABORATORIO DUN ENSAIO DE TOXICIDADE CON

SEDIMENTO USANDO A DIATOMEA SEDIMENTO USANDO A DIATOMEA Cylindrotheca closteriumCylindrotheca closterium