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CÍTRICOS EN LAS AMÉRICAS (RIAC) (IACNET) CITRUS IN THE AMERICAS

CÍTRICOS EN LAS AMÉRICASCITRUS IN THE AMERICAS

Í N D I C EÍNDICE S U M M A R YSUMMARY

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RIACRED INTERAMERICANA DE CÍTRICOS

IACNETINTER-AMERICAN CITRUS NETWORK

Editorial. María del Carmen Pérez, Coordinadora General de la Red Interamericana de Cítricos (RIAC)

Leprosis de los cítricos: una enfermedad multietiológica singular

Pedro Luis Ramos-González, Camila Chabi-Jesus, Gabriela Dias-Arena, Aline D. Tassi, Elliot W. Kitajima, Juliana Freitas-Astúa

Virus de la tristeza de los cítricos en la Región Sudamericana: diversidad genética y evolución

María José Benítez-Galeano

Evolución de la severidad y el daño del huanglongbing en plantaciones de naranjo dulce y sus implicaciones para el manejo de la enfermedad

Renato Beozzo Bassanezi

Enfoques para entender los mecanismos de susceptibilidad a la infección por Candidatus Liberibacter asiaticus en cítricos: manipulación de la respuesta inmune

Fernando Alferez, Jian Wu, Evan Johnson, James H. Graham

4

Editorial. María del Carmen Pérez, General Coordinator of the Interamerican Citrus Network (IACNET).

Citrus leprosis: a unique multietiologic disease

Pedro Luis Ramos-González, Camila Chabi-Jesus, Gabriela Dias-Arena, Aline D. Tassi, Elliot W. Kitajima, Juliana Freitas-Astúa

Citrus tristeza virus at the South American Region: genetic diversity and evolution

María José Benítez-Galeano

Progress of huanglongbing severity and damage in sweet orange orchards and its implications for the disease management

Renato Beozzo Bassanezi.

Approaches to understand susceptibility mechanisms to infection by Candidatus Liberibacter asiaticus in citrus: Manipulation of the immune response

Fernando Alferez, Jian Wu, Evan Johnson, James H. Graham

1


Búsqueda de tolerancia o resistencia a huanglongbing en géneros afines de los cítricos

Chandrika Ramadugu, Manjunath L. Keremane, Ed Stover, David G. Hall, Mikeal L. Roose, Richard F. Lee

Obituarios

Phillip Stansly

Stephen Garnsey

Rolando Riaño

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Finding tolerance and/or resistance to Huanglongbing in citrus relatives

Chandrika Ramadugu, Manjunath L. Keremane, Ed Stover, David G. Hall, Mikeal L. Roose, Richard F. Lee

Obituarios

Phillip Stansly

Stephen Garnsey

Rolando Riaño


La Red Interamericana de Cítricos (RIAC) fue fundada por la FAO en 1991, con el fin de unir en una red de colaboración técnica a distintos países productores de cítricos del continente americano y propiciar la identificación y búsqueda de soluciones a problemas comunes. Durante más de dos décadas ha trabajado en el enfrentamiento a viejas y nuevas enfermedades emergentes de alto impacto económico, mediante una estrategia integral definida por esta organización para el combate de las mismas.

Nuevos retos se han unido en el decursar del tiempo, como es el enfrentamiento al cambio climático, donde los países citrícolas de la región se enfrentan a heladas, prolongadas sequías, inundaciones y huracanes cada vez más intensos y frecuentes, que afectan la calidad y cantidad de sus cosechas así como a las plantaciones, moviendo además las plagas de una localidad a otra. No menos importante, es la crisis económica que ha estado afectando en los últimos años a la región. Todo lo anterior, repercute aún más en los pequeños y medianos productores que en muchos casos han tenido que abandonar el cultivo.

Ante este escenario, la RIAC, apuesta a reforzar su papel en la región, buscando nuevas vías para llegar a los productores con su mensaje y recomendaciones técnicas, para ello desde 2016, ha diseñado un sitio web (www.riacnet.net) que posibilita una interacción más directa con los productores, especialistas e investigadores de todas las regiones del mundo. El sitio, que cuenta con varias secciones en español e inglés, se actualiza constantemente y se ha ido convirtiendo gradualmente en una herramienta de trabajo útil dada su funcionalidad, inmediatez y alcance.

Actualmente la RIAC está formada por 22 miembros activos y cuenta para sus relaciones con una Secretaría de Información y Comunicación que intercambia con los Coordinadores Nacionales y de

EDITORIALThe Inter-American Citrus Network (ICANET) was founded by FAO in 1991, with the aim of uniting different citrus producing countries of the American continent in a network of technical collaboration and promoting the identification and search for solutions to common problems. For more than two decades it has worked in confronting old and new emerging diseases with high economic impact, through an integrated strategy to manage them.

New challenges have come together in the course of time, such as the climate change mitigation, due to the fact that citrus-growing countries of the region face frost, prolonged droughts, floods and hurricanes, increasingly intense and frequent. Those climate events affect the quality and quantity of their crops as well as plantations and contribute of spreading pests from one locality to another. No less important is the economic crisis that has been affecting the region in recent years. All of the above, has an even greater impact on small and medium producers who in many cases have had to abandon the crop.

Given this scenario, IACNET, is committed to strengthening its role in the region, looking for new ways to reach producers with its message and technical recommendations. For this purpose, since 2016, the Network has a new website (www.riacnet.net) that enables a more direct interaction with producers, specialists and researchers from all regions of the world. The website, which has seve-ral sections in Spanish and English, is constantly updated and has gradually become a useful work tool given its functionality, immediacy and scope.

Currently IACNET has 22 active members and its Secretariat of Information and Communication is in charge for the exchanges with the National Coordinators and Working Groups, as well as with the institutions of the member countries. Based

EDITORIAL


Grupos de Trabajo, así como con las instituciones de los países miembros. Partiendo de su carácter incluyente, se han establecido relaciones de trabajo con instituciones y funcionarios del sector privado de los países miembros, que en diferentes ocasiones han colaborado activamente. Asimismo la Red para financiar sus actividades busca proyectos de organismos financieros internacionales con voluntad de coauspiciar acciones a favor de la citricultura continental.

Como parte de sus actividades se han conti- nuado realizando Talleres Técnicos en diferentes países sobre los problemas más acuciantes de las citriculturas de las Américas, organizados directamente o con el coauspicio de la RIAC. Estos talleres han reunido a importantes y prestigiosas personalidades de la citricultura mundial, que de forma desinteresada han brindado su aporte a nuestra organización.

Dentro de los retos enunciados por la RIAC en editoriales anteriores y que aún mantienen su vigencia, se encuentra la búsqueda de soluciones para la supervivencia de los cítricos en la región, mediante el desarrollo de tecnologías, entrenamientos, intercambio de material de propagación certificado y alianzas técnicas entre dos o más países a través de proyectos de cooperación técnica con fondos internacionales, apoyados por los gobiernos y la iniciativa privada de los diferentes países.

Se requiere además, renovar y reforzar los Grupos Técnicos de la RIAC, para lograr una mayor, mejor y oportuna interacción entre los países miembros, en la búsqueda de soluciones a sus problemas técnicos.

Después de más de veinte años, muchos de los fundadores de nuestra Red, se han jubilado, otros ya no están entre nosotros y es responsabilidad de los que aún permanecemos activos, legar en buenas manos el destino de nuestra RIAC.

Por ello, en 2016, la RIAC organizó en Cuba −que ostenta la Coordinación General desde 1994−, una Reunión General de Coordinadores, donde se promovió la elección de una nueva Coordinación General, y de las Coordinaciones de los Grupos Técnicos, que lo requerían. En el caso de la elección de la Coordinación General, al no llegarse a consenso en el momento de la reunión, se decidió

on its inclusive nature, working relationships have been established with institutions and the private sector of the member countries, who have collabo- rated actively on different occasions. Likewise, the Network search for projects from international financial organizations willing to sponsor actions in favor of the continental citriculture.

As part of its activities, technical workshops have been held in different countries on high impact problems for the citricultures of the Americas, organized directly or with the sponsorship of the IACNET. These workshops have brought together important and prestigious personalities of the world citriculture, who have generously given their contribution to our organization.

Within the challenges indicated by IACNET in previous editorials and that still remain valid, is the search for solutions for the survival of citrus crop in the region. It could be achieved through the development of technologies, training, exchange of certified budwood and technical alliances between two or more countries through technical cooperation projects with international funds, supported by governments and the private initiative of the different countries.

It is also necessary to renew and reinforce the Technical Groups of IACNET, in order to achieve a greater, better and timely interaction among the member countries, in the search for solutions to their technical problems.

After more than twenty years, many of the founders of our Network have retired, others are no longer with us and it is the responsibility of those of us who are still active, to leave the fate of our Network in good hands.

For this reason, in 2016, IACNET organized in Cuba −which holds the General Coordination since 1994−, a General Meeting of Coordinators, which promoted the election of a new General Coordination, and the Coordinators of the Technical Groups, which required it. In the case of the election of the General Coordination, when consensus was not reached at the time of the meeting, it was decided to extend the


extender el plazo hasta el 1er. trimestre de 2017. Esto permitiría realizar diferentes consultas y tomar la decisión más adecuada, teniendo en cuenta las sugerencias de los países miembros, lo que no ha sido posible hasta el presente.

Nuevos intentos de reunir a todos los países se realizaron en 2017, durante la celebración del V Simposio Internacional de Fruticultura Tropical y Subtropical, pero no se contó con la asistencia requerida y fue necesario posponer dicha cita. Teniendo en cuenta la necesidad de celebrar dicha reunión proponemos una nueva fecha para 2019.

Para celebrar la Reunión General de Coordina-dores de la RIAC aprovecharemos la cita convocada para el Congreso del Grupo Agrícola de Cuba en La Habana. Esta será una ocasión propicia para reunirnos, donde cumpliremos los siguientes objetivos:

• Realizar elecciones para elegir a la nuevaCoordinación General de RIAC.

• Actualizar la estrategia de cooperación técnicade la RIAC para el periodo 2020-2023 con nuevasy efectivas herramientas para la comunicación.

• Identificar oportunidades de colaboración inter-na cional para la elaboración de Proyectos.

Esperamos contar con el acostumbrado apoyo a nuestra convocatoria y que podamos así lograr mantener viva nuestra Red, ejemplo de voluntad y amor a la citricultura internacional.

¡Los esperamos!

Dra. María del Carmen Pérez HernándezCoordinadora General de la RIAC

deadline until the 1st. quarter of 2017. This would allow different consultations and make the most appropriate decision, taking into account the suggestions of the member countries, which has not been possible until the present.

New attempts to bring all the countries together were made in 2017, during the celebration of the V International Symposium on Tropical and Subtropical Fruit Growing, but the required assistance was not available and it was necessary to postpone it. Taking into account the need to hold such a meeting, we propose a new date for 2019.

To celebrate the General Meeting of Coordinators of the IACNET, we will take advantage of the meeting organized for the Congress of the Agricultural Group of Cuba in Havana. This will be an propitious occasion to meet, where we will fulfill the following objectives:

• Conduct elections to elect the new General Coordination of IACNET.

• Update the technical cooperation strategy for the period 2020-2023 with new and effective tools for communication.

• Identify opportunities for international collaboration for the preparation of Projects.

We hope to have the usual support for our call and that we can thus keep our Network alive, which is an example of will and love for international citriculture.

We wait for you!

Dr. María del Carmen Pérez HernándezGeneral Coordinator of the IACNET


ResumenLa leprosis de los cítricos (LC) es una enfermedad viral transmitida por ácaros y que afecta la citricultura en Latinoamérica. La LC causa una infección no sistémica en la que los virus permanecen restringidos a los tejidos vegetales alrededor del punto de alimentación del vector. Las lesiones cloróticas o necróticas producidas son frecuentes en las hojas, tallos y frutos. La LC reduce el rendimiento del cultivo y puede causar la muerte de los árboles más afectados. Los virus que ocasionan la LC se clasifican en dos géneros: Cilevirus [bipartito ss (+) ARN] y Dichorhavirus [bipartito ss (-) ARN]. La LC prevalente en los huertos desde México hasta Argentina es del tipo citoplasmático (LC-C) causada por el cilevirus citrus leprosis virus C (CiLV-C). La población de CiLV-C está genéticamente subdivida en dos clados que tienen una distribución geográfica contrastante. Mientras que los virus de uno de ellos aparecen confinados en huertos comerciales del Estado de São Paulo, Brasil, los del otro se encuentran dispersos por todo el subcontinente. En Colombia, la LC-C también es causada por otro cilevirus, CiLV-C2, cuyo genoma comparte solo un 55% de identidad nucleotídica con CiLV-C. El tipo nuclear de la leprosis (LC-N) es producida por dichorhavirus. Este tipo de la enfermedad probablemente fue la que afectó la citricultura de la Florida, EE. UU., hace un siglo y en años recientes se describió en huertos comerciales de México y Colombia. La LC-N es causada por variantes de orchid fleck virus que infectan a los cítricos. En Brasil, hasta el momento, la LC-N es

LEpROSIS DE LOS CÍTRICOS: UNA ENfERMEDAD MULTIETIOLógICA SINgULAR Citrus leprosis: a unique multietiologic disease

Pedro Luis Ramos-González1, Camila Chabi-Jesus1,2, Gabriela Dias- -Arena3, Aline D. Tassi4, elliot W. Kitajima4, Juliana Freitas-Astúa1,5

1 Instituto Biológico. Av. Conselheiro Rodrigues Alves 1252, São Paulo 04014-002, Brazil. Tel: (55-11) 5087-1767. email: [email protected]

2 PPG Microbiologia Agrícola ESALQ/USP, Piracicaba/SP, Brazil.3 CCSM /IAC. Cordeirópolis /SP, Brazil.4 NAP/MEPA/ESALQ/USP, Piracicaba/SP, Brazil.5 Embrapa Cassava and Fruits, Cruz das Almas/BA, Brazil.

AbsTRACTCitrus leprosis (CL) is a viral disease currently affecting citrus orchards in Latin America. It causes a non-systemic infection that produces necrotic and chlorotic spots in leaves, stems and fruits, reducing citrus crop yield and leading to the death of younger trees. Viruses causing CL are assigned to two genera: Cilevirus [bipartite ss(+) RNA] and Dichorhavirus [bipartite ss(-)RNA]. Prevalent CL in orchards from Mexico to Argentina is the cytoplasmic type of the disease (CL-C) produced by the cilevirus citrus leprosis virus C (CiLV-C). CiLV-C population is genetically subdivided into two clades, which have a contrasted geographic distribution. While viruses from one clade seem to be confined to commercial areas in the State of São Paulo, Brazil, those from the other occur all over the continent. In Colombia, CL-C is also caused by another cilevirus, CiLV-C2, whose genome shares only 55% nucleotide identity with CiLV-C. Nuclear types of leprosis (CL-N), caused by dichorhaviruses, seem to have severely affected citrus orchards in Florida, USA, a century ago, and have been recently characterized in Brazil, Mexico and Colombia. While in the two latter countries citrus strains of orchid fleck virus (OFV-citrus) occur in commercial orchards, in Brazil, citrus leprosis virus N (CiLV-N) and citrus chlorotic spot virus (CiCSV) are the causal agents for CL-N so far, which are restricted to small non-commercial areas. Both, CiLV-N and

Cítricos en las Américas Vol. 1, No. 1, p. 4-19, 2018 Citrus in the Americas

CÍTRICOS EN LAS AMÉRICAS (RIAC) (IACNET) CITRUS IN THE AMERICAS5

causada por los dichorhavirus citrus leprosis virus N (CiLV-N) y citrus chlorotic spot virus (CiCSV), los que afectan áreas no comerciales. Tanto CiLV-N como CiCSV tienen una relación filogenética relativamente distante entre sí y con OFV (< 65% de identidad nucleotídica). Todos los virus que causan LC son persistentemente transmitidos por ácaros del género Brevipalpus, aunque con particularidades para cilevirus y dichorhavirus. En su conjunto, un amplio espectro de especies e híbridos comerciales de cítricos son propensos a la infección por la LC. Los síntomas visibles de esta enfermedad, al menos en las naranjas dulces infectadas por CiLV-C, parecen ser el resultado de una respuesta de hipersensibilidad. El uso de técnicas ómicas y la epidemiologia molecular han revelado elementos inherentes de la relación virus/ácaro/planta que pueden ayudar a implementar nuevas estrategias más eficaces y seguras para el control de la enfermedad.

La leprosis de los cítricos: reemergencia de una enfermedad centenaria La leprosis de los cítricos (LC) es una enfermedad viral primeramente detectada en el sur de los Estados Unidos a finales del siglo xix (Hume 1901) (Figura 1). En la época se conoció como “rusty nail head” y “scaly bark”, términos en inglés que describían los síntomas preponderantes en los frutos y tallos infectados: lesiones redondeadas que asemejan la cabeza de un clavo oxidado, y la formación de capas de tejidos muertos alrededor de las lesiones, principalmente en las ramas jóvenes (Fawcett, 1911, 1937). Durante el primer tercio del siglo xx, naranjos con lesiones similares se detectaron en huertos citrícolas del sur de la América del Sur, en una región que incluía el norte de Argentina y Paraguay, y la porción sur de Brasil (Spegazzini, 1920; Bitancourt, 1940). La enfermedad, que en aquel momento se nombró localmente lepra explosiva, se estableció en esa región, mientras que en la década del 60 desapareció de los EE.UU., probablemente como consecuencia de sucesivas heladas, y el uso intenso de compuestos derivados del azufre (Childers et al., 2003).

A partir de la década del 90 del siglo xx, la leprosis de los cítricos (LC), que es su denominación actual, ha sido gradualmente detectada en casi todos los países de la América del Sur, donde se considera endémica, en Centroamérica, y en

CiCSV, display a relatively distant phylogenetic relationship with OFV (< 65% nucleotide sequence identity). All viruses causing CL are persistently transmitted by false spider mites of the genus Brevipalpus, but with distinguishing features for cilevirus and dichorhavirus. A large spectrum of citrus commercial species and hybrids are prone to CL infection, and the apparent symptoms, at least in sweet oranges infected by CiLV-C, seem to be the outcome of a hypersensitive-like response. Studies based on molecular epidemiology and omics approaches are providing the necessary insights to generate more effective and safer control strategies of CL.

Citrus leprosis: re-emergence of a centenary disease

Citrus leprosis (CL) is a viral disease firstly reported in the South of the United States at the end of the xix century (Hume, 1901) (Figure 1). Formerly, the disease was known as rusty nail head and scaly bark, terms that described prevailing symptoms in fruits and infected stems: rounded lesions similar to a rusty nail head and the formation of dead tissue layers around the lesions, mainly in young branches (Fawcett, 1911, 1937). During the first quarter of the xx century, orange trees with similar lesions were detected in citrus orchards in South America in regions including the north of Argentina and Paraguay, and the southern part of Brazil (Spegazzini, 1920; Bitancourt, 1940). This disease at that time locally known as “lepra explosiva” was established in that region while in the 60’s it disappeared from the United States, probably as a consequence of consecutive frosts and the intensive use of sulfur-derived compounds (Childers et al., 2003).

From the final decade of the xx century on, citrus leprosis, as it is currently known, has been gradually detected in most countries from South America, where it is considered endemic, in Central America, and in 2006 in Mexico


2006 en México (Figura 1) (Bastianel et al., 2010; Castillo et al., 2011). Un informe reciente indicó la presencia de síntomas de LC en un árbol aislado en Texas, EE. UU. (Lee, 2017). Aunque preliminar, el dato sugiere la re-emergencia de la enfermedad en ese país probablemente como consecuencia de su dispersión natural desde el territorio mexicano.

La leprosis de los cítricos es una enfermedad atípica con notable impacto económicoLos virus que causan la LC son naturalmente transmitidos por ácaros del género Brevipalpus (Acari: Prostigmata: Tenuipalpidae) (Rodrigues and Childers, 2013). La transmisión mecánica y la mediada por injerto son posibles sólo bajo condiciones experimentales (Knorr, 1968; Colariccio et al., 1995). A diferencia de la gran mayoría de los virus vegetales, los que producen la LC no consiguen, al menos bajo condiciones naturales, moverse sistémicamente en sus hospedantes vegetales. Ellos permanecen confinados en los tejidos circundantes a las células vegetales inoculadas por ácaros virulíferos. En las hojas, la infección se propaga de célula a célula por

(Figure 1) (Bastianel et al., 2010; Castillo et al., 2011). A recent report indicated symptoms of the disease on an isolated tree in Texas, USA (Lee, 2017). Though preliminary, it might indicate the re-emergence of the disease in that country probably because of its natural dispersion from Mexico.

Citrus leprosis is an atypical disease with a noticeable economic impact

Viruses causing CL are naturally transmitted by mites of the genus Brevipalpus (Acari: Prostigmata: Tenuipalpidae) (Rodrigues and Childers, 2013). Graft -and mechanic- mediated transmissions are only possible under defined experimental conditions (Knorr, 1968; Colariccio et al., 1995). Unlike most of the plant viruses, those causing CL are unable, at least under natural conditions, to move systemically within their host plants. Rather, they remain confined to tissues surrounding the plant cells inoculated by a viruliferous mite. In leaves, infection is cell-to-cell propagated through

Figura 1. Distribución y fecha de detección de la leprosis de los cítricos.Figure 1. Distribution and date of detection of citrus leprosis disease.


el mesófilo, pero aparentemente no alcanza los tejidos vasculares del vegetal. La infección de puntos distantes dentro de una planta, e incluso dentro de un mismo órgano, por ejemplo, una hoja, puede ser solo mediada por el ácaro vector.

Los síntomas de la LC son generalmente manchas cloróticas que evolucionan a lesiones necróticas y son más frecuentes en los frutos, hojas y ramas jóvenes (Figura 2). En algunas variantes de LC, las manchas cloróticas son predominantes y su tamaño es relativamente mayor a los comúnmente observados (Chabi-Jesus et al., 2018). En general, las lesiones típicas de la enfermedad pueden ser la consecuencia de interacciones incompatibles entre los virus y sus hospedantes en las que media

the mesophyll, but apparently, it does not reach the vascular tissues. Therefore, the infection of distant points within a plant, or even within a single leaf, need to be mediated by mite vectors.

Citrus leprosis symptoms are generally chlorotic spots that turn into necrotic lesions, which are more frequently seen in fruits, leaves and young branches (Figure 2). In some variants of CL, chlorotic spots are predominant and they are relatively larger than those commonly observed (Chabi-Jesus et al., 2018). Generally, typical lesions of the disease can be the result of incompatible interactions among viruses and their hosts in which occur the production of reactive

Figura 2. Síntomas de la leprosis de los cítricos en hojas, frutos y ramas de naranjo dulce (Citrus sinensis).Figure 2. Citrus leprosis symptoms in leaves, fruits and twigs of infected sweet orange plants (Citrus sinensis). A, C y F: Citrus leprosis virus C (CiLV-C); B y D: citrus leprosis N (CiLV-N); y E: Citrus chlorotic spot virus (CiCSV).Fotos/Pictures: Pedro Luis Ramos-González (A, B, C, D, F), y/and José Evandro Becerra (E).


la producción de especies reactivas del oxígeno, activación de las rutas defensivas mediadas por hormonas y la inducción de la muerte celular, procesos que en su conjunto sugieren una respuesta de hipersensibilidad (Arena et al., 2016; Cruz-Jaramillo et al., 2014). En presencia de altas poblaciones de ácaros virulíferos las lesiones coalescen, estrangulan las ramas finas y pueden provocar la muerte de los árboles, en particular de los arbustos de campos en implantación y desarrollo. Sin embargo, aún en casos menos severos, la LC compromete la productividad citrícola debido a la desvalorización de la fruta fresca, caída prematura de los frutos, defoliación, y la reducción de la vida útil del huerto.

El control de la LC incluye la poda parcial o drástica de las copas infectadas y el uso de acaricidas para controlar las poblaciones de ácaros. En Brasil se recomienda el control químico luego de constatar la presencia de Brevipalpus en un margen que oscila entre el 5 y 10% de los árboles examinados durante una inspección en zig-zag del huerto (Bassanezi, 2017). Se rastrea la presencia de Brevipalpus en cualquiera de sus fases de desarrollo preferentemente en los frutos mayores a 3 cm de diámetro y localizados en el interior de la copa, en los maduros o fuera de época, y en aquellos con deformaciones físicas en su corteza que puedan servir como refugio para los ácaros. La LC es considerada la enfermedad viral de mayor relevancia que afecta la citricultura brasileña. En el estado de São Paulo, la región citrícola por excelencia de ese país, las aplicaciones de acaricidas demandan 54 millones de dólares americanos por año, un valor que representa aproximadamente el 5% del costo del manejo de los huertos en plena producción (Bassanezi et al., 2018).

Leprosis de los cítricos: una enfermedad con varios agentes causales

Dos tipos de LC son descritos de acuerdo a la morfofisiopatología de las células vegetales infectadas y que corresponden con el ciclo replicativo de los virus que las causan (Rodrigues et al., 2003). En la leprosis del tipo nuclear (LC-N) los virus se replican en el núcleo, donde frecuentemente se observan viroplasmas, y las partículas virales se acumulan tanto en el núcleo como en el citoplasma de las células infectadas. En cambio, en la LC del

oxygen species, the activation of hormone-mediated defensive pathways and the induction of cell death (Arena et al., 2016; Cruz-Jaramillo et al., 2014). All these processes suggest a hypersensitivity response (Arena et al., 2016; Cruz-Jaramillo et al., 2014). In the presence of high populations of viruliferous mites, the number of infection loci increases and lesions might coalesce, strangling the thin branches and, sometimes, leading up to the death of trees, in particular, of young developing trees. However, even in less severe cases, CL jeopardizes citrus agroindustry productivity due to the devaluation of fresh fruits, defoliation and the reduction of the orchard’s lifespan.

Citrus leprosis management includes partial or drastic pruning of infected canopies and the use of acaricides to control mite populations. In Brazil, chemical control is recommended upon confirming the presence of Brevipalpus mites from 5 to 10% of the examined trees during a zig-zag inspection of the orchard (Bassanezi, 2017). The presence of the mite at any of its developmental stage is preferably tracked down in fruits above 3 cm of diameter and in those located inside the canopy, the mature or out-of-season fruits, and mainly in those with physical deformations in the peel, which can shelter the mites. CL is currently considered the most important viral disease affecting the Brazilian citrus industry. In the State of São Paulo, the major citrus region in that country, acaricide applications demand US$ 54 million per year, a value that accounts for approximately 5% of the management cost of full bearing orchards (Bassanezi et al., 2018).

Citrus leprosis: a disease with different causal agents

Two types of CL are described according to the morpho-physiopathology of the infected plant cells and that correspond to the type of replication cycle of the viruses causing it (Rodrigues et al., 2003). The viruses causing CL-N replicate in the nucleus, where electron-lucent inclusions are frequently observed. Their viral particles accumulate both in the nucleus and in the cytoplasm of infected cells. In contrast, in the CL-C, all the events of the multiplication cycle and the formation of new


tipo citoplasmático (LC-C) todos los eventos del ciclo de multiplicación y formación de nuevos viriones transcurre en el citoplasma. Al ser transmitidos por ácaros Brevipalpus, los virus que producen la LC-N y -C, son genéricamente llamados como VTB (virus transmitidos por Brevipalpus) -N y -C, respectivamente, una designación que se extiende a otras especies virales con similares características, pero con hospedantes fuera del género Citrus. Los VTB-N y -C son taxonómicamente agrupados en dos géneros virales con características genómicas contrastantes (Figura 3).

Los VTB-N son miembros del género Dichorha-virus, uno de los cuatro géneros de la familia Rhabdoviridae, orden Mononegavirale, que infectan plantas. Como el resto de los rhabdovirus, los dichorhavirus poseen genomas con moléculas de ARN simple cadena y polaridad negativa (-), en el que existen seis marcos abiertos de lectura (ORF). Al microscopio electrónico, los

Figura 3. Organización genómica de Citrus leprosis virus C y Orchid fleck virus, miembros tipo de los géneros Cilevirus y Dichorhavirus, respectivamente. Figure 3. Genomic organization of Citrus leprosis virus C and Orchid fleck virus, type members of the genera Cilevirus and Dichorhavirus, respectively.

virions occur in the cytoplasm. Since transmitted by Brevipalpus mites, all viruses producing CL-N and -C are generically called as BTV (Brevipalpus-transmitted viruses) -N and -C, respectively. This designation is extended to other viral species with similar characteristics, but with hosts outside the genus Citrus. BTV-N and -C are taxonomically grouped into two viral genera, which show contrasting genomic features (Figure 3).

BTV-N are members of the genus Dichorhavirus, one of the four genera of the family Rhabdoviridae, order Mononegavirales that infect plants. As for the rest of the rhabdoviruses, dichorhaviruses have genomes with single-stranded (ss) RNA molecules and negative polarity (-), in which there are six open reading frames (ORF). When observed through the transmission


viriones (aproximadamente 40 × 110 nm) son de prácticamente la mitad de la longitud de los nucleorhabdovirus, lo que probablemente es una consecuencia directa de la división de su genoma en dos segmentos y que representa una de las características distintivas de los dichorhavirus. Las partículas de los dichorhavirus tienen una apariencia de varilla y a pesar de su estrecha asociación con los complejos de membranas de las células infectadas, ellas se presentan generalmente desnudas (Kitajima et al., 1972).

La mayor parte de la información genética contenida en el ARN1 ( ̴ 6,4 kb) de estos virus codifica para las proteínas estructurales. En su dirección 3’-5’, este segmento del genoma contiene los genes N (nucleocapside), P (fosfoproteína), MP (también conocido como P3, codifica la posible proteína de movimiento), M (proteína de la matriz), y G (glicoproteína), los cuales se nombran de acuerdo a su relativamente alto grado de identidad y probable ancestro común con otros rhabdovirus. El ARN2 ( ̴ 6,0 kb) codifica sólo un gen, RdRp, también conocido como gen L, involucrado en el proceso de replicación y transcripción del genoma viral. Como en el resto de los rhabdovirus, cada gen se expresa independientemente a través de ARN sub-genómicos, y las señales de la regulación transcripcional están distribuidas a través de las regiones intergénicas y los extremos de ambas moléculas del RNA genómico (Dietzgen et al., 2018).

Tres dichorhavirus producen la LC-N. En México y Colombia este tipo de la enfermedad es causado por cepas de orchid fleck virus (OFV) que infectan plantas cítricas (OFV-cítrico) (Roy et al., 2015b; Cruz-Jaramillo et al., 2014). Las cepas encontradas en América poseen una elevada identidad nucleotídica y de aminoácidos (> 90%) con la estirpe de OFV que infecta orquídeas y que fue inicialmente descrita en Japón (Kondo et al., 2006). OFV-cítrico infecta un rango amplio de especies del género entre ellas: toronjo (Citrus paradisi Macf.), limonero (Citrus limon (L.) Burm. f.), limero (C. aurantifolia (Christm.) Swing.), naranjo navel (Citrus sinensis (L.) Osb.), mandarino (C. reticulata Blanco) naranjo dulce (C. sinensis (L.) Osb.), limero persa (C. latifolia Tan.), y naranjo agrio (C. aurantium L.) (Roy et al. 2015a; Cruz-Jaramillo et al. 2014; Roy et al. 2015b).

electron microscope, virions of dichorhaviruses (approximately 40 × 110 nm) are roughly the half of the length of nucleorhabdoviruses, which is probably a direct consequence of their split genomes, one of their distinctive features. The particles of dichorhaviruses have a rod-like shape and in spite of their close association with the membranous complexes of the infected cells, they are generally observed as naked particles (Kitajima et al., 1972).

Most of the genetic information contained in RNA1 ( ̴ 6.4 kb) of dichorhaviruses codifies for structural proteins. In the 3’-5’ direction, this genome segment contains the genes N (nucleocapsid), P (phosphoprotein), MP (also known as P3, codifies the possible movement protein), M (protein of the matrix), and G (glycoprotein), which are named according to their relatively high degree of identity and probable common ancestral origin with other rhabdovirus genes. The RNA2 ( ̴ 6.0 kb) only codifies the RdRp gene, also known as the L gene, involved in the replication and transcription processes of the viral genome. As in the rest of the rhabdoviruses, each gene is separately expressed in individual sub-genomic RNA molecules, and the signals for the transcriptional regulation are distributed through the intergenic regions and the ends of both molecules of the genomic RNA (Dietzgen et al., 2018).

Three dichorhaviruses cause CL-N. In Mexico and Colombia this type of the disease is caused by strains of orchid fleck virus that infect citrus plants (OFV-citrus) (Roy et al., 2015b; Cruz-Jaramillo et al., 2014). The American isolates of OFV share high nucleotide and amino acids identities (> 90%) with the strains of OFV that infect orchids and that were initially described in Japan (Kondo et al., 2006). OFV-citrus infects a wide range of species of the genus, among them: grapefruits (Citrus paradisi Macf.), lemons (Citrus limon (L.) Burm. f.), limes (C. aurantifolia (Christm.) Swing.), Navel oranges (Citrus sinensis (L.) Osb.), mandarins (C. reticulata Blanco) sweet oranges (C. sinensis (L.) Osb.), Persian limes (C. latifolia Tan.), and sour oranges (C. aurantium L.) (Roy et al., 2015a; Cruz-Jaramillo et al., 2014; Roy et al., 2015b).


En Brasil, la LC-N está confinada en zonas no comerciales y al menos dos especies tentativas de dichorhavirus han sido completamente caracterizadas. En São Paulo, citrus leprosis virus N (CiLV-N) se encuentra en zonas altas con temperaturas templadas ( ̴ 10-15 °C) (Ramos- -González et al., 2017). En cambio, una segunda especie de dichorhavirus conocido como citrus chlorotic spot virus (CiCSV) se detectó en el nordeste de Brasil, donde las temperaturas medias anuales son cálidas ( ̴ 27 °C) (Chabi-Jesus et al., 2018). Ambas especies infectan naranjos dulces, pero se desconoce con exactitud la gama de hospedantes. Sin embargo, plantas de limero persa y mandarinos presentes en los huertos con naranjos infectados por CiLV-N, permanecían libres de la LC, lo que indirectamente sugiere su inmunidad a este virus.

Los genomas de OFV-cítrico, CiLV-N y CiCSV muestran niveles de identidad nucleotídica entre ellos que no sobrepasan el 65%. Desde el punto filogenético, ellos se distribuyen independientemente en cada uno de los tres sub-clados en los que se subdividen los dichorhavirus (Chabi-Jesus et al., 2018). Una batería de diagnósticos basados en la amplificación por RT-PCR de varias regiones genómicas de los dichorhavirus permite la identificación particular o genérica de ellos a través del uso de cebadores específicos o degenerados. Una revisión actualizada de estas herramientas está disponible (Dietzgen et al., 2018).

Los VTB-C son los agentes causales de la LC-C, que es el tipo de la enfermedad que predomina en los huertos citrícolas desde México hasta Argentina (Bastianel et al., 2010). Ellos pertenecen al género Cilevirus, especialmente creado para agrupar virus con partículas baciliformes de 50–55 × 120–130 nm, envueltas, y cuyo genoma, también bi-segmentado, presenta una organización distintiva y con baja identidad a otros virus previamente identificados y reconocidos por el ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses, https://talk.ictvonline.org). Las dos moléculas de ARN simple cadena y de polaridad positiva de los cilevirus portan información para seis ORF (Locali-Fabris et al., 2006). Además del gen de la RdRp, el ARN1 ( ̴ 9,0 kb), posee un segundo ORF (p29) que codifica para la posible

In Brazil, CL-N is confined to non-commercial citrus areas and at least two tentative species of dichorhaviruses have been completely characterized. In the State of São Paulo, citrus leprosis virus N (CiLV-N) is found in high areas with mode-rate temperatures ( ̴ 10-15 °C) (Ramos-González et al., 2017). However, a second species of dichorhavirus known as citrus chlorotic spot virus (CiCSV) was detected in the Northeast region of the country, where the average annual temperature is warmer ( ̴ 27 °C) (Chabi-Jesus et al., 2018). Members from both viral species infect sweet orange trees, but their host ranges are not fully known. However, Persian lime and mandarin trees present in the orange orchards affected by CiLV-N remained free of CL, indirectly indicating a possible immunity to this virus.

The genomes of OFV-citrus, CiLV-N and CiCSV show nucleotide sequence identity levels that do not exceed 65%. From the phylogenetic point of view, they are distributed separately in each of the three sub-clades in which dichorhaviruses are subdivided (Chabi-Jesus et al., 2018). A battery of diagnosis based on the amplification by RT-PCR of different genomic regions of dichorhaviruses allows for their identification by using specific or degenerated primers. An updated review of these methods is available (Dietzgen et al., 2018).

BTV-C are the causal agents of CL-C, the prevailing type of the disease in citrus orchards from Mexico to Argentina (Bastianel et al., 2010). They belong to the genus Cilevirus that was specially created to group viruses with enveloped bacilliform particles of 50–55 × 120–130 nm, and whose bi-segmented genomes show a distinctive organization and low nucleotide sequence identity with other previously identified viruses recognized by the ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses, https://talk.ictvonline.org). The two ss (+) RNA molecules of cileviruses harbor information for six ORF (Locali-Fabris et al., 2006). In addition to the gene encoding the RdRp, the RNA1 ( ̴ 9,0 kb) has a second ORF (p29) that codes for the possible coat protein of


proteína que conforma la capa proteica. El ARN2 ( ̴ 5,0 kb) alberga los ORF p15, p61 y p24, nombrados de acuerdo al tamaño del polipéptido codificado, mientras que un cuarto ORF se identifica como MP considerando la presencia de motivos típicos de proteínas de movimiento de otros virus. Las proteínas P61 y P24 presentan motivos típicos de proteínas transmembranas y en su conjunto muestran una relativa identidad estructural con proteínas identificadas en virus que infectan vegetales e insectos (higrevirus, blunervirus y negevirus) cuya identificación ha transcurrido en paralelo o después de la descripción de los cilevirus (Freitas-Astúa et al., 2018).

En todas las regiones donde la LC-C ha sido detectada está presente el cilevirus citrus leprosis virus C (CiLV-C), y en Colombia una segunda especie del género, citrus leprosis virus C2 (CiLV-C2), descrita en 2013 (Roy et al., 2013), es prevalente en algunas zonas (Roy et al., 2015a). Los genomas de CiLV-C y CiLV-C2 presentan relativamente baja identidad nucleotídica entre ellos, con valores que no sobrepasan el 55%. Se estima que la población de CiLV-C posee baja variabilidad, tomando como referencia la secuencia del aislado tipo CiLV-C_CRD, otras obtenidas durante los primeros 15 años del siglo xxi, y la de un aislado parcialmente caracterizado y obtenido a partir de un fruto herborizado en 1967 (Hartung et al., 2015). Sin embargo, el aislado CiLV_SJP, cuyo genoma fue caracterizado totalmente en 2016, representa un segundo linaje de CiLV-C (Ramos- -González et al., 2016). Su genoma muestra solo aproximadamente 85% de identidad nucleotídica con los aislados del clado CRD, lo que sugiere un proceso de especiación dentro de la población de CiLV-C. Independientemente de eso, los virus de los clados CRD y SJP comparten casi 100% de identidad nucleotídica a lo largo de un segmento de aprox. 1 kb que comprende la región 5’ del ARN2, lo que indica un probable evento de recombinación entre virus de ambos linajes (Ramos-González et al., 2016). Hasta la fecha, se conoce que los virus del clado SJP están presentes en huertos de la región norte del estado de São Paulo, Brasil. Nuevos estudios en curso buscan definir la filodinámica de las poblaciones de CiLV-C a través del cinturón citrícola brasileño y su interacción con los aislados preponderantes en otras regiones del continente.

the virus. The RNA2 ( ̴ 5,0 kb) hosts the ORF p15, p61 and p24, named according to the size of the codified polypeptide, while a fourth ORF is identified as MP considering the presence in the encoded protein of motifs typically found in movement proteins from other RNA viruses. Proteins P61 and P24 show transmembrane domains and altogether show some structural identity with proteins identified in the insect-infecting viruses of the taxon negevirus and the plant-infecting viruses of the genera Higrevirus and Blunervirus (Freitas-Astúa et al., 2018).

In all regions where CL-C has been detected, the cilevirus citrus leprosis virus C (CiLV-C) is present. In Colombia, a second species of the genus, citrus leprosis virus C2 (CiLV-C2) (Roy et al., 2013), is prevalent (Roy et al., 2015a). Genomes of CiLV-C and CiLV-C2 show a relatively low nucleotide sequence identity among them, with values not exceeding 55%. Taking as reference the nucleotide sequence of the type isolate CiLV-C_CRD, those from other isolates characterized during the first 15 years of the xxi century, and that from a partially characterized isolate rescued from a fruit conserved in an herbarium since 1967 (Hartung et al., 2015), it was revealed that the population of CiLV-C has a low variability. However, the isolate CiLV_SJP, whose genome was totally characterized in 2016, represents a second lineage of CiLV-C (Ramos-González et al., 2016). Its genome only shows ̴ 85% of nucleotide sequence identity with the type-isolate CRD, which might suggest a process of speciation inside the population of CiLV-C. Regardless this, viruses from clades CRD and SJP share nearly 100% of nucleotide identity along with a segment of about 1 kb of the 5’ end of the RNA2, indicating a probably recent recombination event between viruses of the two lineages (Ramos-González et al., 2016). So far, it is known that viruses from clade SJP are only present in orchards of the Northern region of São Paulo State, Brazil. New ongoing studies try to define the phylodynamics of CiLV-C populations through the main Brazilian citrus-producing areas and its interaction with prevailing isolates found in other regions of the continent.


CiLV-C y CiLV-C2 infectan naranjos dulces causando síntomas severos (Bastianel et al., 2010; Roy et al., 2015a). CiLV-C también afecta mandarinos, pero los limoneros, limeros y algunos híbridos entre naranjos dulces y mandarinos son inmunes a la enfermedad (Bastianel et al., 2006, 2018). De forma experimental CiLV-C infecta plantas de más de 28 familias, entre ellas frijol (Phaseolus vulgaris) y Arabidospsis thaliana, plantas comúnmente usadas en los estudios de la biología de este virus (Arena et al., 2017; Garita et al., 2014). Sin embargo, el número de especies vegetales infectadas por CiLV-C y CiLV-C2 que son detectadas en la naturaleza no sobrepasa la decena (Nunes et al., 2012; Roy et al., 2015a).

Ácaros brevipalpus: vectores de los virus que causan la leprosis de los cítricos

En su conjunto, las cerca de 300 especies de ácaros del género Brevipalpus tienen una distribución mundial (Mesa et al., 2009). También conocidos como ácaros planos o arañas falsas, los ácaros Brevipalpus se reproducen por partenogénesis, son haploides, poseen hábitos polífagos, su ciclo de vida incluye cuatro estadios activos, y sus poblaciones están casi exclusivamente formadas por hembras (Alberti and Kitajima, 2014). Esta feminización es consecuencia de la infección por la bacteria endosimbionte Candidatus Cardinium sp. (Weeks et al., 2001). Sin embargo, no todas las especies de Brevipalpus poseen esta bacteria como endosimbionte, ej. Brevipalpus chilense, por lo que podrían mostrar diferentes características biológicas.

Las poblaciones de estos ácaros aumentan en condiciones climáticas de baja humedad relativa, temperaturas cálidas y con baja disponibilidad hídrica en el suelo (Bassanezi, 2018). Como plagas herbívoras su actividad se considera relativamente baja. Sin embargo, solo un pequeño número de las especies descritas de Brevipalpus son reconocidas como vectores de virus vegetales, entre ellas las que causan la LC, lo que las recoloca en la mira del control agrícola.

La taxonomía de los ácaros Brevipalpus ha pasado por diferentes revisiones y los criterios que definen una especie involucran diferentes

CiLV-C and CiLV-C2 infect sweet oranges causing severe symptoms (Bastianel et al., 2010; Roy et al., 2015a). CiLV-C also affects mandarin trees, but lemons, limes and some hybrids of sweet oranges and mandarins are immune to the disease (Bastianel et al., 2018, 2006). Experimentally, CiLV-C infected plants of more than 28 families, among them, beans (Phaseolus vulgaris) and Arabidospsis thaliana, plants commonly used in studies on this virus (Arena et al., 2017; Garita et al., 2014). However, the number of plant species infected by CiLV-C and CiLV-C2 that are detected in nature does not exceed ten (Nunes et al., 2012; Roy et al., 2015a).

Brevipalpus mites: vectors of the viruses causing citrus leprosis

Altogether, the nearly 300 mite species of the genus Brevipalpus are worldwide distributed (Mesa et al., 2009). Also known as flat mites or false spider mites, they reproduce by parthenogenesis, are haploid, and show polyphagous habits. The life cycle of these mites includes four active stages and its populations are almost exclusively composed of females (Alberti and Kitajima, 2014). Being haploid, these populations should be males, but infection by a symbiont, Candidatus Cardinium, results in a feminization process (Weeks et al., 2001). However, not all Brevipalpus species harbour the endosymbiont bacterium i.e. Brevipalpus chilense, which might result in different biological characteristics.

The population of Brevipalpus mites increases under climatic conditions of low relative humidity, warm temperatures and with low water availability in the soil (Bassanezi, 2018). As herbivorous, their activity is considered relatively low. However, only a small number of the described Brevipalpus species are recognized as vectors of plant viruses, among them those that cause CL, which relocates Brevipalpus mites at sight of the agricultural control.

The taxonomy of Brevipalpus mites has undergone several reviews, and criteria defining a species include different morphological aspects and the


aspectos morfológicos y el uso de marcadores moleculares (Beard et al., 2015; Navia et al., 2013). La forma de la espermateca y los análisis filogenéticos basados en las secuencias nucleares (28S y ITS2) y mitocondriales (COI) comienzan a ser sistemáticamente evaluados como criterios taxonómicos para las especies de este género (Tassi, 2018).

Todos los VTB son transmitidos de forma circulativa persistente por sus vectores (Kitajima and Alberti, 2014). A diferencia de los dichorhavirus, que se multiplican y acumulan en los núcleos de las células del ácaro vector, no existen evidencias conclusivas para sugerir la replicación de los cilevirus en los Brevipalpus. CiLV-C y CiLV-C2 son transmitidos por B. yothersi (Figura 4). Todos los estadios de desarrollo de esta especie transmiten CiLV-C, pero la transmisión vertical no ocurre (Tassi et al., 2017). Los ácaros B. yothersi que adquieren CiLV-C permanecen virulíferos por al menos 12 días. Los miembros de las especies B. californicus y B. phoenicis s.s. han sido reconocidos como vectores de los dichorhavirus OFV-citrus y CiLV-N, respectivamente (Ramos-González et al., 2017; García-Escamilla et al., 2018). Los ácaros B. yothersi y B. aff. yothersi, o al menos uno de ellos, transmiten CiCSV (Chabi-Jesus et al., 2018). Tanto CiLV-N como CiCSV han sido transmitidos a la planta modelo Arabidopsis thaliana utilizando brevipalpus virulíferos.

En su interacción con las plantas, los ácaros avirulíferos de la especie B. yothersi estimulan la síntesis de las hormonas ácido salicílico (AS) y ácido jasmónico (AJ) (Arena et al., 2018). A nivel transcripcional, la planta responde con una reprogramación profunda de sus defensas a través de la activación de los genes involucrados en las vías de biosíntesis de AS y AJ, así como los genes que intervienen en la señalización y las respuestas mediadas por estas hormonas, y a la vez reprime los genes responsables del crecimiento del vegetal (Arena et al., 2018). Durante la infección viral, y probablemente a consecuencia de la interferencia entre las rutas de señalización de AS y AJ, las respuestas anti-herbívoros mediadas por AJ son reprimidas, lo que sugiere una manipulación de la respuesta del vegetal por el ácaro para reducir la resistencia a su

use of molecular markers (Beard et al., 2015; Navia et al., 2013). The shape of the spermatheca and phylogenetic analyses based on the nuclear (28S and ITS2) and mitochondrial (COI) sequences now start to be systematically evaluated as taxonomical criteria of the species classification within this genus (Tassi 2018).

All BTV are transmitted in a persistent-circulative mode by their vectors (Kitajima and Alberti, 2014). Unlike dichorhaviruses, that multiply and accumulate on the nucleus of the vector mite cells, there is no conclusive evidence to suggest the replication of cileviruses in Brevipalpus mites. CiLV-C and CiLV-C2 are mainly transmitted by B. yothersi (Figure 4), although B. papayensis is also a reported vector of CiLV-C (Nunes et al., 2018). All developmental stages of B. yothersi transmit CiLV-C, but the vertical transmission through the ovary does not occur (Tassi et al., 2017). Once the mites acquire CiLV-C, they remain viruliferous for at least 12 days. Members of the species B. californicus and B. phoenicis s.s. have been recognized as vectors of the dichorhaviruses OFV-citrus and CiLV-N, respectively (Ramos-González et al., 2017; García-Escamilla et al., 2018). Either B. yothersi, the putative B. aff. yothersi, or both of them are able to transmit CiCSV (Chabi-Jesus et al., 2018). Both CiLV-N and CiCSV have been transmitted to the model plant Arabidopsis thaliana using viruliferous Brevipalpus mites.

Upon the interaction with plants, non-viruliferous B. yothersi mites promote the synthesis of the hormones salicylic acid (SA) and jasmonic acid (JA) (Arena et al., 2018). At the transcriptional level, the plant’s response triggers a deeply reprogramming of defenses including the activation of genes involved in the SA and JA biosynthesis, as well as those that take part in the downstream signalling and response. At the same time, infested plants repress those genes responsible for plant growth (Arena et al., 2018). During virus infection and probably as a consequence of the crosstalk among the SA and JA signalling pathways, the JA-mediated antiherbivory response is repressed, which suggests a manipulation of plants reducing their resistance to the mite colonization. CiLV-C


Figura 4. Características morfológicas de las especies de ácaros Brevipalpus que transmiten los virus que causan la leprosis de los cítricos. A. Vista dorsal de B. yothersi tomada con un microscopio electrónico de barrido (MEB); B. B. yothersi y sus característicos huevos rojos en ambiente in vivo. C-E. Patrón de reticulación de las microplacas de B. yothersi, B. phoenicis y B. aff. yothersi, respectivamente, observadas a través del MEB. F y G. Vista dorsal de B. phoenicis y B. aff. yothersi a través de un microscopio de contraste de fase. En la esquina inferior derecha de los paneles A, F y G se detallan las espermatecas de las tres especies ilustradas.Figure 4. Morphological characteristics of Brevipalpus species recognized as vectors of citrus leprosis causing viruses. A. Scanning electron microscopy (SEM) of B. yothersi dorsal view. B. Specimen of B. yothersi with characteristics red eggs in vivo. C-E. Microplate reticulation patterns of B. yothersi, B. phoenicis and B. aff. yothersi, respectively, as observed by SEM. F and G. Differential interference contrast of B. phoenicis and B. aff. yothersi dorsal views, respectively. Schematical draw of the spermatheca vesicles of the mites are illustrated on the bottom-right corners of panels A, F and G. Barra de escalas / Scale bars: A. 50 μm; B. 100 μm; C, D and E. 1 μm. F and G. 40 μm.


colonización. La infección por CiLV-C potencia la activación de la ruta del AS lo que indirectamente puede contribuir con el establecimiento y proliferación de la colonia de ácaros (Arena et al., 2016).

Nuevos retos y perspectivas del trabajo con la leprosis de los cítricos La confluencia de varios factores, entre ellos: cambio climático (menos lluvia y sequías más extensas), la formación de huertos cítricos con mayor densidad de plantas, el combate a enfermedades altamente destructivas que drenan esfuerzos y recursos (ej. Huanglongbing), etc., en conjunto con el desarrollo de la resistencia contra los acaricidas han contribuido con la potencialización de los daños producidos por la LC (Bassanezi, 2018). Hasta la fecha, la búsqueda del conocimiento de la diversidad de virus y ácaros implicados en esta enfermedad ha revelado especies virales de dos géneros con una biología contrastante, y al menos cuatro especies de brevipalpus. Aunque la lista puede aumentar como resultado de nuevas investigaciones en curso, los datos disponibles demuestran la ocurrencia de la LC en diversos ecosistemas. Así, al menos potencialmente, el conjunto de combinaciones virus-ácaros que producen la LC tiene la capacidad de expansión hacia agroecosistemas adecuados al cultivo de los cítricos.

Los esfuerzos para revelar cuáles son los mecanismos que garantizan la perpetuación de los virus que producen la leprosis, aun en condiciones aparentemente poco ventajosas debido a su peculiar interacción con las plantas hospedantes, y descubrir las bases de la especificidad de la interacción virus-ácaro pueden generar novedosas estrategias de manejo del patosistema. Estos conocimientos, unidos con los estudios de los patrones espaciales de distribución de las poblaciones de ácaros y de árboles afectados por LC (Bassanezi et al., 2018), eficiencia de acaricidas (Della Vechia et al., 2018), parámetros biológicos de poblaciones de ácaros en huertos geográficamente distantes (Amaral et al., 2018), etc., representan oportunidades de desarrollo de métodos de muestreo y alerta más eficientes que pueden contribuir con la reducción de los riesgos y daños asociados a la leprosis de los cítricos.

infection largely favors the activation of the SA route and, indirectly, it might contribute with the fitness of the mites during the plant colonization (Arena et al., 2016).

New challenges and working perspectives with citrus leprosis

The confluence of different factors, such as climate change (less rains and more extended droughts), implementation of citrus orchards with higher tree density, the control of extremely destructive diseases that consumes efforts and inputs (i.e. huanglongbing) etc., along with the development of resistance against acaricides by mites have contributed to increase the burden caused by CL (Bassanezi, 2018). The disentanglement of the CL-involved viral and mite diversities have revealed the existence of species belonging to two viral genera with a contrasting biology and, at least, four Brevipalpus mite species. Though these lists can increase because of new ongoing research, available data show the occurrence of CL in different ecosystems. Thus, at least potentially, the set of virus-mite combinations that causes CL has the capacity to spread toward novel agro-ecosystems not yet affected by the disease.

Efforts to reveal which are the mechanisms allowing the perpetuation of the CL-causing viruses even under apparently disadvantageous conditions due to the peculiar interaction with plants, and to discover the molecular bases behind the virus-mite specific transmission, might generate novel strategies to manage this pathosystem. This knowledge in combination with other studies addressed to reveal the spatial distribution of the mite populations and the CL-affected trees (Bassanezi et al., 2018), biological parameters of mite populations found in geographically distant orchards (Amaral et al., 2018), etc. represent opportunities to develop new sampling methods and more efficient warning systems that would contribute to reduce the risks and damages caused by CL.


AGRADeCimienTosLos autores agradecen a las agencias de fomento CAPES, CNPq and FAPESP por el financiamiento a los becarios y proyectos asociados a este trabajo (CAPES PNPD20132154 - 33141010001P4 - PNPD – IBSP, FAPESP 2012/18771-0, 2014/00366-8, 2008/57909-2 y 2014/08458-9; CNPq 573848/08-4 y 375843/2012-4).

ACKnoWLeDGmenTsThe authors are grateful to CAPES, CNPq and, FAPESP for scholarships and research grants associated to this work (CAPES PNPD20132154 - 33141010001P4 - PNPD – IBSP, FAPESP 2012/18771-0, 2014/00366-8, 2008/57909-2 and 2014/08458-9; CNPq 573848/08-4 and 375843/2012-4).

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VIRUS DE LA TRISTEZA DE LOS CÍTRICOS EN LA REgIóN SUDAMERICANA: DIVERSIDAD gENÉTICA Y EVOLUCIóNThe citrus tristeza virus at the south american region: genetic diversity and evolution

maría José benítez-GaleanoLaboratorio de Virología Molecular, Universidad de la República, Salto, Uruguay / Molecular Biology Lab, University of the Republic, Salto, [email protected]

Citrus are native from South East Asia and the Malayan archipelago. They were grown from seeds for many centuries and were asymptomatic hosts for several isolates of the Citrus Tristeza Virus (CTV) suggesting the co-evolution of this pathogen with its host hundreds of years ago (Roistacher et al., 2010).

The most probable routes of citrus movement date back to the xix century from China to Japan, the Philippines, India, Australia and South Africa. The oldest report of the movement of these fruit trees to South America dates back to 1930, in which the export of trees from South Africa to Argentina esd reported (Wallace et al., 1956). It is good to oustand that at the end of this century, plants movement was made in big containers that allowed to transport plants with soil attached. Probably it caused the silent dissemination, not only of CTV, but also of insect vectors of the virus and species of oomycetes of the Phytophthora genus that would become devastating for the developing citriculture. The latter ones brought about the death of thousands of trees budded on sweet orange (Citrus sinensis Osbeck) (Roistacher et al., 2010), and it led to the adoption of sour orange (C. aurantium L.) as the rootstock par excellence in the Mediterranean region and then in the Americas

Los cítricos son originarios del sudeste asiático y del archipiélago Malayo. Durante muchos siglos, fueron cultivados a partir de semillas y eran huéspedes asintomáticos para muchos aislados del virus de la tristeza de los cítricos (CTV), sugiriendo la co-evolución de este patógeno con su huésped desde hace cientos de años (Roistacher et al., 2010).

Las rutas más probables de movimiento de cítricos se remontan al siglo xix desde China a Japón, Filipinas, India, Australia y Sudáfrica. El reporte más antiguo del transporte de estos frutales a Sudamérica se remonta al año 1930, en el cual se describe la exportación de árboles desde Sudáfrica a Argentina (Wallace et al., 1956). Cabe destacar que a fines de ese siglo, el movimiento de plantas se realizaba en enormes contenedores que permitían transportar la planta completa en tierra. Probablemente esto provocó la diseminación de manera silenciosa no solo de CTV, sino también de insectos vectores del virus y especies de oomycetes del género Phytophthora que serían devastadores para la citricultura en crecimiento. Estos últimos provocaron la muerte de miles de árboles injertados en naranjo dulce (Citrus sinensis Osbeck) (Roistacher et al., 2010), llevando a la adopción del naranjo amargo (C. aurantium L.) como patrón por excelencia en el



Mediterráneo y luego en las Américas, debido a su resistencia a Phytophthora y a sus buenas cualidades agronómicas (Moreno et al., 2008).

Sin embargo, el uso de este portainjerto creó las condiciones para que una nueva enfermedad causara desastres. Esta nueva dolencia, llamada tristeza, fue el resultado directo de la interacción de CTV con nuevos huéspedes sensibles, comercialmente creados, al propagar variedades de naranjo dulce, mandarina (C. reticulata Blanco) o pomelo (C. paradisi Macf.) sobre naranjo amargo. Varias epidemias ocurrieron y las más destructivas fueron en Argentina (1930), Brasil (1937), California (1939), Florida (1951), España (1957), Israel (1970) y Venezuela (1980). A su vez, numerosos brotes importantes fueron reportados en Chipre (1989), Cuba (1992), México (1995), República Dominicana (1996) e Italia (2002) (Revisado por Moreno et al., 2008). Más de 100 millones de árboles fueron devastados, de los cuales, más de 20 millones se encontraban en el sur del continente americano (Moreno et al., 2008). En la actualidad, CTV está distribuido por todas las regiones citrícolas del mundo.

Desde hace varios años, las prácticas de la agricultura moderna han contribuido, en parte, al descubrimiento de nuevos virus emergentes en plantas, siendo los más notables los geminivirus, closterovirus y tospovirus. De manera similar a lo que ocurre con las enfermedades causadas por virus emergentes en animales, varios de los problemas provocados en plantas cultivadas de forma extensiva, se deben a la distorsión humana de la relación estable existente entre el virus, el vector y su huésped natural (Gray & Banerjee, 1999). A diferencia de varios arbovirus que replican dentro del vector, la mayoría de los virus de plantas transmitidos por artrópodos no replican dentro de este (Gray & Banerjee, 1999). Este es el caso de CTV, que una vez instalado en una determinada área citrícola, es dispersado de manera local por áfidos de los géneros Toxoptera y Aphis, siendo la especie más eficiente T. citricida Kirkaldy (Brlansky et al., 2003). Esta especie se encuentra distribuida en varias zonas del mundo, incluida Sudamérica.

Los huéspedes naturales de CTV incluyen especies de los géneros Citrus y Fortunella (familia Rutaceae) (Moreno et al., 2008). El tipo e intensidad de los daños provocados por CTV en

due to its resistance to Phytophthora and its good agronomical qualities (Moreno et al., 2008).

However, the use of this rootstock laid the foundations for a new disease to cause disasters. The new disease, known as Tristeza, was the direct result of the CTV interaction with new sensitive commercial created hosts by propagating sweet orange and mandarin varieties (C. reticulata Blanco) or grapefruit (C. paradisi Macf.) on sour orange. Some epidemies emerged and the most destructive ones were found in Argentina (1930), Brazil (1937), California (1939), Florida (1951), Spain (1957), Israel (1970) and Venezuela (1980). Likewise, several important outbreaks were reported in Chipre (1989), Cuba (1992), Mexico (1995), the Dominican Republic (1996) and Italy (2002) (Revised by Moreno et al., 2008). Over 100 million tres were devasted, out of which, more than 20 million were at the South of the American continent (Moreno et al., 2008). Nowadays, CTV is distributed throughout citrus regions worldwide.

For some years now, cultural practices in modern agriculture have partly contributed to the discovery of new emerging viruses being the most prominent ones the geminiviruses, closteroviruses and tospoviruses. Similarly to what happens with emerging viruses in animals, some of the problems caused to extensively grown plants, are due to the human distortion of the stable relationship between the virus, the vector and its natural host (Gray & Banerjee, 1999). Unlike some arboviruses that replicate themselves within the vector, most of plant viruses transmitted by arthropodes are not replicates within them (Gray & Banerjee, 1999). This is the case of CTV, that once it gets installed at a certain citrus area, it spreads out locally by aphids from the genera Toxoptera and Aphis, being T. citricida Kirkaldy the most efficient one (Brlansky et al., 2003). This specie is distributed in several world areas, including South America.

Natural CTV hosts include species from the genera Citrus and Fortunella (Rutaceae family) (Moreno et al., 2008). The type and intensity of the damages caused by CTV in the field, depend


el campo, depende de las especies infectadas, del patrón sobre el que están injertadas, del aislado de CTV y de las condiciones ambientales (Roistacher & Moreno, 1991). Según la combinación de estas características, el virus puede causar tres síndromes principales conocidos como tristeza o declinamiento, acanaladuras en la madera y amarillamiento de plantín. Desde hace ya dos siglos, la tristeza es una de las enfermedades más destructivas y más estudiada de los cítricos (Roistacher et al., 2010).

Existen diversas estrategias de control de la enfermedad, y en regiones donde el virus es endémico y circulan aislados severos que causan acanaladuras en la madera, la protección cruzada es una de las más utilizadas y efectivas hasta el momento. El fenómeno de protección cruzada ocurre cuando una infección viral pre-existente previene la generación de una infección secundaria por el mismo virus. En 2013, Svetlana Folimonova de la Universidad de Florida, planteó que para establecer una protección cruzada sostenible en el tiempo contra un aislado severo de CTV es necesario el uso exclusivo de un aislado suave del mismo genotipo a controlar. Por lo que para realizar este objetivo primero es necesario identificar al enemigo, es decir, el aislado severo de CTV que necesita ser controlado, y luego obtener un aislado suave del mismo genotipo para ser usado como aislado pre-inmunizador (Folimonova, 2013).

CTV es el virus de plantas más grande descrito hasta el momento. Pertenece al género Closterovirus dentro de la familia Closteroviridae (Dolja et al., 2006). El genoma es una molécula de ARN simple hebra de polaridad positiva de aproximadamente 19,3 kb de longitud que contiene 12 marcos abiertos de lectura y codifica para al menos 19 productos proteicos. La mitad 5’ del genoma incluye los genes involucrados en la replicación del virus, incluyendo la ARN polimerasa ARN dependiente, mientras que la mitad 3’ contiene los genes relacionados con el ensamblaje del virión, el movimiento célula a célula y la supresión del silenciamiento por ARN interferencia (Karasev et al., 1995, Satyanarayana et al., 2000, Ayllon et al., 2001). p25 es una proteína multifuncional que funciona como proteína de cápside, cubriendo el 95% del genoma, y también como supresora del silenciamiento, función compartida con las proteínas p20 y p23 (Lu et al., 2004).

on the infected species, on the rootstock used, on the CTV isolate and environmental conditions (Roistacher & Moreno, 1991). According to the combination of these chracteristics, the virus can cause three main syndromes known as Tristeza or decline, stem pitting and seedling yellowing. Since the last two centuries, Tristeza is one of the most destructive and most studied disease in citrus growing (Roistacher et al., 2010).

There are different control strategies of the disease and in regions where the virus is endemic and severe isolates are present causing stem pitting, cross protection is one of the most common and effective strategy so far. The phenomenon of cross protection occurs when a pre-existing viral infection prevents the generation of a secondary infection by the same virus. In 2013, Svetlana Folimonova from the University of Florida, said that to establish a sustainable cross protection in time against a severe CTV isolate it was necessary the exclusive use of a mild isolate of the same genotype to control. Then, to achieve this goal it is necessary to identify the enemy first, that is, the CTV severe isolate that needs to be controlled and then to get a mild isolate of the same genotype to be used as a pre-immunizing isolate (Folimonova, 2013).

CTV is the major plant virus more described so far. It belong to the Closterovirus genus within the Closteroviridae family (Dolja et al., 2006). The genome is a single-stranded positive polarity RNA molecule of approximately 19.3 kb long containing 12 open reading frames and codifies for at least 19 protein products. Half 5’ of the genome includes genes involved in the replication of the virus including dependent RNA polimerase, while half 3’ contains the genes related to the assembly of the virion, cell to cell movement and the suppression and the silent suppresion by interfering RNA (Karasev et al., 1995, Satyanarayana et al., 2000, Ayllon et al., 2001). p25 is a multifunctional protein that Works as capside protein covering 95% of the genome and also works as suppressor of silencing, a shared function with proteins p20 and p23 (Lu et al., 2004).


As most of the ARN viruses, CTV is present in nature as a mixture of genetic variants that coexist in the same plant showing high levels of genetic and fenotypic diversity (Rubio et al., 2001). This population organization known as viral quasispecies, is the result of not correcting the activity of RNA polymerases, the large sizes of viral populations and its short generation times. In addition to mutation, CTV exploits as evolutionary mechanism, the recombination of genomic fragments, as we will see further ahead. The evolution rate of the virus has been calculated in 6,67 × 10-5 substitutions by site per year (s/s/a) based on an infectious clone of the T36 genotype kept in planta under greenhouse conditions for seven years, so it could be slightly underestimated (Harper, 2013). Likewise, the evolution rate was estimated for individual genes p25 and p20 in an order of magnitude higher than (10-4 s/s/a), calculated on the basis of all circulating genotypes (Silva et al., 2012; Davino et al., 2013).

Due to the great variability of CTV, seven different genotypes are described now. Along history and as new variants of the virus were discovered, their classification changed. In 2013, Scott Harper, from the University of Washington State, proposed a classification based on the phylogeny of complete genomes, in which six clades are clearly observed of the genotypes VT, T3, T36, T30, RB and T68. In this publication it is also suggested the posible existence of a seventh genotype, made up of the isolate HA16-5, but new sequences would be necessary for its confirmation. Thus, in 2015, after the emergence of the complete genome Taiwan-Pum/M/T5, and through the phylogenetic analysis of the genes p25, p20 and p23 from samples collected 20 years ago, we were able to confirm the existence of a seventh genotype that we called NC (also called HA16-5 for its sequence type) (Benítez-Galeano et al., 2015).

What are the circulating genopytes of CTV in south America?

According to most recent articles published in different countries of the región, it is difficult

Como la mayoría de los virus ARN, CTV existe en la naturaleza como una mezcla de variantes genéticas que coexisten en la misma planta mostrando altos niveles de diversidad genética y fenotípica (Rubio et al., 2001). Esta organización poblacional, conocida como cuasiespecies virales, es producto de la falta de actividad correctora de errores de las ARN polimerasas, los grandes tamaños de las poblaciones virales y sus tiempos cortos de generación. Además de la mutación, CTV explota como mecanismo evolutivo la recombinación de fragmentos genómicos, como veremos más adelante. Se ha calculado la tasa de evolución del virus en 6,67 × 10-5 sustituciones por sitio por año (s/s/a) basada en un clon infeccioso del genotipo T36 mantenido in planta en condiciones de invernáculo durante siete años, por lo que la misma podría estar levemente subestimada (Harper, 2013). A su vez, se estimó la tasa de evolución para los genes individuales p25 y p20 en un orden de magnitud mayor (10-4 s/s/a), calculada en base a todos los genotipos circulantes (Silva et al., 2012; Davino et al., 2013).

Dada la gran variabilidad de CTV, se describen al momento siete genotipos diferentes. A lo largo de la historia y a medida que se descubrían nuevas variantes del virus, los sistemas de clasificación del mismo fueron cambiando. En 2013, Scott Harper da la Universidad del Estado de Washington, propone una clasificación basada en la filogenia de genomas completos, en la que se observan claramente seis clados correspondientes a los genotipos VT, T3, T36, T30, RB y T68. En esta publicación también se sugiere la posible existencia de un séptimo genotipo, conformado por el aislado HA16-5, pero nuevas secuencias serían necesarias para su confirmación. Es así que en el 2015, luego de la aparición del genoma completo Taiwan-Pum/M/T5, y mediante el análisis filogenético de los genes p25, p20 y p23 de muestras obtenidas hace 20 años, logramos confirmar la existencia del séptimo genotipo al que nombramos NC (también llamado HA16-5 por su secuencia tipo) (Benítez-Galeano et al., 2015).

¿Cuáles son los genotipos circulantes de CTV en sudamérica?

De acuerdo a un relevamiento de los trabajos más recientes publicados en distintos países de


to establish which are the CTV genotypes circulating in each country since not always comparison is possible. That is, the use of different methodologies or classification systems to characterize CTV isolates makes difficult the comparison of results among research groups. For example, an article published in 2015, base don the approximation of multiple molecular markers, reveals the presence in Chile of reacting isolates type VT, MCA13 and also non-areacting isolates type T30, MCA13 (Besoain et al., 2015). On the other hand, in Colombia, Morales and collaborators (2013) determined the presence of reacting CTV isolates MCA13 in nearly all studied regions, except in one, and analyzed the genetic diversity going through patterns of SSCP of the amplified p25 gene by RT-PCR. Both articles used the categorization of mild and severe isolates for the characterization of CTV without specifying genotypes. On the other hand, since 1979, Peru has a cross protection program in place after importing from Japan buds of Satsuma mandarin infected with severe isolates (Bederski et al., 2005). Recently, the genetic analysis by massive sequencing of isolates from Peru, collected from trees of the program, showed mixtures of the genotypes VT and type RB (Yokomi et al., 2014). In Brazil, there is a cross protection program for “Pera” orange since 1960. Giampani and collaborators (2017) determined the genetic diversity of isolates that infected this cultivar, based on the amplification of the gene p25 and found genotypes T3, VT and NC/HA16-5. Finally, a recent research based on the amplification of gene p33 by massive sequencing allowed to see the presence of more than one genotype in lemon trees of the Tucumán province, in Argentina (Read et al., 2017). This article describes the presence of genotypes RB, T3, NC/HA16-5, VT. When a cross protection program looks forward to be implemented, like the case of our country, it is important to know the composition of circulating populations at the genotype level to avoid using isolates composed of more than one genotype as pre-inmunizing isolate thus avoiding the rupture of resistance as happened in South Africa (Scott et al., 2013).

la región, es difícil de establecer cuáles son los genotipos de CTV circulantes en cada país ya que no siempre la comparación es posible. Es decir, el uso de diferentes metodologías o sistemas de clasificación para la caracterización de aislados de CTV hace difícil la comparación de resultados entre grupos de investigación. Por ejemplo, un trabajo publicado en 2015, basado en la aproximación de marcadores moleculares múltiples, revela la presencia en Chile de aislados tipo VT, MCA13 reactivos así como también aislados tipo T30, no reactivos a MCA13 (Besoain et al., 2015). Por otro lado, en Colombia, Morales y colaboradores (2013) determinaron la presencia de aislados de CTV reactivos a MCA13 en casi todas las regiones estudiadas, excepto en una, y analizaron la diversidad genética analizando patrones de SSCP del gen p25 amplificado por RT-PCR. Ambos trabajos utilizan la categorización en aislados suaves o severos para la caracterización de CTV, sin especificar genotipos. Por otro lado, desde 1979, Perú tiene un programa de protección cruzada, establecido luego de la importación de yemas de mandarina Satsuma infectadas con aislados severos desde Japón (Bederski et al., 2005). Recientemente, el análisis genético mediante secuenciación masiva de aislados de Perú, obtenidos de árboles del programa, mostró mezclas de los genotipos VT y tipo RB (Yokomi et al., 2014). En cuanto a Brasil, este país tiene un programa de protección cruzada para la naranja “Pera” desde 1960. Giampani y colaboradores (2017) determinaron la diversidad genética de aislados que infectaban este cultivar, basados en la amplificación del gen p25 y encontraron los genotipos T3, VT y NC/HA16-5. Por último, un trabajo muy reciente basado en la amplificación del gen p33 mediante secuenciación masiva permitió observar la presencia de más de un genotipo en árboles de limón en la provincia de Tucumán, Argentina (Read et al., 2017). En este trabajo describen la presencia de los genotipos RB, T3, NC/HA16-5, VT. Cuando se intenta establecer un programa de protección cruzada, como en el caso de nuestro país, es importante conocer la composición de las poblaciones circulantes a nivel de genotipo para evitar utilizar aislados compuestos por más de un genotipo como aislado pre-inmunizador, y evitar de esta manera el quiebre de la resistencia como ocurrió en Sudáfrica (Scott et al., 2013).


¿Pero cuál es la situación actualen uruguay?

La presencia de aislados severos de CTV en el país y de su vector más eficiente se habían reportado ya en 1955 (Koch de Brotos, 1955). Sin embargo, no fue hasta 2015 cuando se realizó la primera descripción de los genotipos circulantes en el país (VT, T3, T36 y NC), en base a la clasificación de Harper (2013), y se describió la elevada prevalencia del genotipo NC en muestras de Sudamérica (Benítez-Galeano et al., 2015). Sin embargo, los genotipos descritos fueron el reflejo de la situación del país a fines de los años 90.

Con el objetivo a largo plazo de desarrollar un programa de protección cruzada es que nos planteamos conocer la situación actual de CTV en Uruguay. Entre 2015 y 2017 se colectaron 1175 muestras de campo de todas las regiones citrícolas del país y se analizó la presencia de ocho patógenos virales y viroidales, incluido CTV. En el caso de este último la detección se realizó por RT-PCR en tiempo real y las muestras positivas fueron caracterizadas genéticamente mediante amplificación y análisis filogenético del gen p25. La prevalencia del virus en el país fue de 93%. El análisis filogenético del gen de la cápside reveló la

but, what is the current situation in uruguay?

The presence of severe CTV isolates and its most efficient vector had already been reported in 1955 (Koch de Brotos, 1955). However, it was not until 2015 when the first description of the circulating genotypes in the country was done (VT, T3, T36 y NC), as per Harper’s classification (2013). The high prevalence of the NC genotype in samples from South America was also reported (Benítez-Galeano et al., 2015). Nevertheless, the described genotypes were the expression of the situation in the coutry at the late 1990.

With the long-term objective of developing a cross protection program is that we decided to know the current CTV situation in Uruguay. From 2015 to 2017, 1175 field samples from all citrus regions in the country were collected and the presence of eight viral and viroid pathogens, CTV included, were evaluated. As for the latter one, the detection was made by RT-PCR and the positive samples were genetically characterized through amplification and phylogenetic analysis of the gene p25. The prevalence of the virus in the country was 93%. The phylogenetic analysis of the capside gene showed the presence of the

Figura 1. Árbol filogenético de Máxima Verosimilitud bajo el modelo de sustitución nucleotídica HKY para el gen p25. El soporte de las ramas es mediante el algoritmo aLRT.Figure 1. Maximum Likelihood phylogenetic tree under HKY substitution model for p25 gene. Branch support with aLRT algorithm.


presencia de los genotipos VT, T68, T3, RB y NC, este último encontrado en un 87% de las muestras (Figura 1).

Dada la elevada prevalencia del genotipo NC nos propusimos caracterizarlo en mayor profundidad. En 2017, publicamos la historia evolutiva y dinámica espacio-temporal del genotipo, para el cual estimamos la tasa de evolución para el gen p25 en el orden de 10-3 s/s/a y el ancestro común más reciente del genotipo fue datado en el año 1977 (Benítez-Galeano et al., 2017). Mediante una reconstrucción filogeográfica pudimos establecer el patrón de dispersión del genotipo entre los distintos países del mundo, desde su origen en Estados Unidos hasta los dos ingresos de este genotipo en nuestro país en los años 1991 y 2012 (Figura 2). También pudimos observar mediante un análisis de Skyline, un crecimiento en el tamaño poblacional de NC de un orden de magnitud hacia el año 2012, lo que coincide con la explosión local del genotipo en nuestro país (Figura 3) (Benítez-Galeano et al.,

genotypes VT, T68, T3, RB and NC, this latter found in 87% of the samples (Figure 1).

Because of the high prevalence of genotype NC we decided to go depper into its characterization. In 2017, we published the evolutionary history and temporal-spatial dynamics of the genotype, for which we estimated the evolutionary rate for the gene p25 in the order of 10-3 s/s/a and the most recent common ancestor of the genotype was traced back to 1977 (Benítez-Galeano et al., 2017). By making a phylogeographic reconstruction were could establish the dispersion pattern of the genotype among different countries in the world, since its origin in the United States to the two entries of this genotype in Uruguay in 1991 and 2012 (Figure 2). We also observed through a Skyline analysis, a growth of the population size of NC of an order of magnitude towards 2012, which coincides with the local outbreak of the genotype in our country (Figure 3) (Benítez-Galeano et al.,

Figura 2. Dinámica espacio-temporal de la circulación del genotipo NC en el mundo. Se muestran los patrones de dispersión entre 1977 y 2015 (flechas azules) y el año probable de llegada a cada país. La expansión local ocurrida en Uruguay se muestra con un círculo celeste.Figure 2. Spatiotemporal dynamics of CTV-NC genotype circulating in the world. Dispersal patterns (blue arrows) between 1977 and 2015 and the probable year of arrival to each country are shown. The local expansion occurred in Uruguay is shown as a light blue circle.


2017). Esta dinámica poblacional es característica de organismos que colonizan nuevos espacios (Meyer et al., 2015; Park et al., 2015).

En paralelo, se colectaron aislados de campo, de los cuales se obtuvieron sub-aislados mediante transmisión por un único áfido, con el objetivo de buscar aislados protectivos para protección cruzada. Con el afán de ahondar en la caracterización del genotipo NC se seleccionaron algunos de estos sub-aislados en base a la amplificación por RT-PCR de los genes p25, p20 y p23. Mediante secuenciación masiva de ARN (RNA-seq) y secuenciación de Sanger se obtuvieron los genomas completos de los sub-aislados.

2017). This population dynamics is characteristic of organisms that colonize new spaces (Meyer et al., 2015; Park et al., 2015).

Parallel, field isolates were collected out of which sub-isolates were attained by transmission of only one aphid in order to find protecting isolates for cross protection. In order to deepen on the characterization of the genotype NC, some of these sub-isolates were selected based on amplification by RT-PCR of the genes p25, p20 and p23. By massive sequencing of the RNA (RNA-seq) and Sanger’s sequencing, complete genomes of these sub-isolates were attained.

Figura 3. Dinámica poblacional del genotipo NC. La historia demográfica del genotipo se muestra desde su origen hasta el año de la secuencia más reciente del dataset, 2015. El gráfico de Skyline Bayesiano muestra la evolución del tamaño de la población. Se muestra la mediana (línea oscura) y los límites estimados superior e inferior del 95% HPD (región azul) del tamaño efectivo poblacional (eje y) a lo largo del tiempo (eje x).Figure 3. Population dynamics of the CTV-NC genotype. The demographic history of the genotype is shown since its origin in 1977 until the most recent sequence of the dataset, 2015. The Bayesian Skyline plot shows the evolution in population size. Median (dark line) und upper and lower 95% HPD (blue region) estimates of effective population size (y-axis) through time in years (x-axis) are shown.


Mediante análisis filogenético, utilizando como genomas de referencia los aislados propuestos por Harper (2013) más HA16-5 (GQ454870) y Taiwan-Pum/M/T5 (JX266713) como referencia para el genotipo NC, se estableció que los sub-aislados pertenecen al genotipo RB. En el año 2017, realizamos el primer reporte del genotipo RB en Uruguay mediante la descripción biológica y molecular de regiones parciales de un sub-aislado (Hernández-Rodríguez et al., 2017).

La comparación de los resultados filogenéticos de los sub-aislados con las secuencias de los genes p25, p20 y p23 sugerían la presencia de genomas recombinantes, por lo que análisis de recombinación fueron realizados con los softwares RDP4 y SimPlot, revelando un doble recombinante entre los genotipos T36, RB y NC. En mayo de este año, se publicó la secuencia del sub-aislado DSST-17, para el cual se describieron los sitios de recombinación (Benítez-Galeano et al., 2018).

Debido a que el 90% de los cítricos del Uruguay están injertados en Poncirus trifoliata (L.) Raf. o alguno de sus híbridos, es de vital importancia caracterizar de manera biológica y molecular los aislados recombinantes de RB. A su vez, considerando la prevalencia del genotipo NC en el país, también continuaremos trabajando para su caracterización. Esta información será crucial para establecer si estos aislados presentan algún riesgo para la citricultura del Uruguay.

ConCLusionesCTV presenta una alta diversidad genética y está evolucionando continuamente. La aparición de nuevos genotipos es posible por lo que es de gran importancia mantener una continua vigilancia epidemiológica. La utilización de técnicas modernas para la detección y caracterización de los aislados de CTV, así como la unificación de un sistema de clasificación, facilitará la comparación de resultados entre los distintos grupos de investigación de los distintos países. Esta información es de gran importancia, para la toma de decisiones de las autoridades sanitarias, con el fin de mejorar la sanidad y producción citrícola de los países.

Through a phylogenetic analysis using as reference genomes the isolates proposed by Harper (2013) plus HA16-5 (GQ454870) and Taiwan-Pum/M/T5 (JX266713) as reference for genotype NC, it was established that sub-isolates belonged to genotype RB. In 2017, we made the first report of genotype RB in Uruguay by the biological and molecular descripition of partial regions of a sub-isolate (Hernández-Rodríguez et al., 2017).

The comparison of the phylogenetic results of sub-isolates with the sequences of the genes p25, p20 and p23 suggested the presence of recombinant genomes, so recombination analyses were made using the softwares RDP4 and SimPlot, which revealed a double recombinant among genotypes T36, RB and NC. In May this year, the sequence of the sub-isolate DSST-17 was published, for which recombination sites were described (Benítez-Galeano et al., 2018).

As 90% of citrus in Uruguay are grafted on Poncirus trifoliata (L.) Raf. or some of its hybrids, it is of vital importance to biologically and molecularly characterize the recombinant isolates of RB. Likewise, considering the prevalence of genotype NC in the country, we will continue working for its characterization. This information will be crucial to determine whether these isolates pose some kind of risk for the Uruguayan citriculture.

ConCLusionsCTV shows a high genetic diversity and is in constant evolution. The emergence of new genotypes is possible so it is highly important to implement continuous epidemiological surveillance. The use of modern techniques to detect and characterize CTV isolates as well the unification of a classifying system, will ease the comparison of results among the different research groups of different countr ies. This information is of upmost importance for the sanitary authorities take decisions in order to improve plant protection and citrus production.


eQuiPo De TRAbAJo

Los resultados presentados en la presente publicación son el trabajo de un equipo interdisciplinario e inter institucional que viene trabajando en colaboración desde el 2011. María José Benítez-Galeano, Estefani Bertoni, Matías Castells, Federico Dalmao y Rodney Colina pertenecen al Laboratorio de Virología Molecular, Universidad de la República, Salto, Uruguay. Ana Arruabarrena, Ana Bertalmío, Lester Hernández-Rodríguez, Diego Maeso, Fernando Rivas y Leticia Rubio forman parte del Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria, Uruguay.

WoRKinG TeAm

The results shown in this publication belong to an interdisciplinary and inter institutional team that has been collaborating since 2011. María José Benítez-Galeano, Estefani Bertoni, Matías Castells, Federico Dalmao and Rodney Colina from the Molecular Virology Lab, University of the Republic, Salto, Uruguay. Ana Arruabarrena, Ana Bertalmío, Lester Hernández-Rodríguez, Diego Maeso, Fernando Rivas and Leticia Rubio are part of the National Agriculture and Livestock Research Institute, Uruguay.


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AbsTRACTThe Huanglongbing (HLB) severity progress and its damage to crop yield was evaluated in different bearing sweet orange scion/rootstock combinations considering tree age at symptoms onset for 4 to 6 years in Sao Paulo State, Brazil. All selected citrus blocks were frequently sprayed with insecticides to control the Asian citrus psyllid; the trees had a good nutritional status and yield. This study has focused in getting information to support growers in taking decisions on keeping or removing Huanglongbing (HLB)-affected trees in the orchard. The disease severity progress was well modelled by monomolecular model with the average annual rate of disease severity Rm equal to 0.160. There were no significant differences for Rm among the scion varieties, rootstocks or tree ages. The relationship between disease severity and the relative yield of diseased trees (proportion of diseased trees yield related to the yield of healthy trees) were fitted by the negative exponential model, with the average b parameter equal to 1.922. There was no significant difference for estimated b parameter among different scion varieties or

EVOLUCIóN DE LA SEVERIDAD Y EL DAÑO DE HUANgLONgBINg EN pLANTACIONES DE NARANJO DULCE Y SUS IMpLICACIONES pARA EL MANEJO DE LA ENfERMEDADprogress of huanglongbing severity and damage in sweet orange orchards and its implications for the disease management

Renato beozzo bassaneziDepartamento de Pesquisa e Desenvolvimento, fundo de Defesa da Citricultura (Fundecitrus), 14807-040 Araraquara- SP, Brasil / Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento, fundo de Defesa da Citricultura (Fundecitrus), 14807-040 Araraquara- SP, [email protected]

ResumenLa evolución de la severidad de Huanglongbing (HLB) y sus daños en el rendimiento del cultivo fueron evaluados durante 4 a 6 años en diferentes combinaciones de variedades de naranjo dulce/patrones, considerando la edad del árbol en el momento del comienzo de los síntomas, en el estado de Sao Paulo, Brasil. Todos los bloques de cítricos seleccionados fueron asperjados con insecticidas frecuentemente para el control del psílido asiático de los cítricos y los árboles tuvieron un buen rendimiento y estado nutricional. El objetivo de este estudio fue obtener información para apoyar la toma de decisión de los citricultores sobre la conveniencia de conservar los árboles afectados por Huanglongbing (HLB) en el campo. La evolución de la severidad de la enfermedad fue bien modelada por el modelo monomolecular con una tasa promedio anual de severidad de la enfermedad Rm igual a 0.160. No hubo diferencias significativas para Rm entre las variedades, patrones o edades de los árboles. La relación entre la severidad de la enfermedad y el rendimiento relativo de árboles enfermos (proporción del rendimiento de los árboles enfermos en relación con el rendimiento



de los árboles sanos) fue ajustada al modelo exponencial negativo, con un parámetro b promedio igual a 1.922. No hubo diferencias significativas para el parámetro b estimado entre diferentes variedades y patrones. Sin embargo, los árboles más viejos tuvieron menores valores de b que los árboles más jóvenes. Al contrario de lo que se pensó previamente, la evolución de la severidad de la enfermedad y las pérdidas de rendimiento en árboles adultos de naranjo dulce fueron relativamente más rápidos. En general, la severidad de la enfermedad alcanzó el 50% del área de la copa justo cuatro años después de la manifestación de los síntomas de HLB, con pérdida de rendimiento del 60% en comparación con árboles sanos. Las consecuencias de conservar árboles afectados por HLB en el campo son también discutidas.

inTRoDuCCiÓnHuanglongbing (HLB) ha amenazado la sostenibilidad de la industria cítrica en el mundo debido a su rápida dispersión, los severos daños que causa en la producción y calidad de los frutos y a que es difícil de controlar. Teniendo en cuenta que no existe una cura a gran escala y económicamente factible para los árboles infectados y que no hay variedades comerciales de cítricos tolerantes o resistentes, todas las estrategias de control buscan prevenir nuevas infecciones. Las medidas preventivas para controlar la enfermedad incluyen la eliminación de plantas enfermas y la aplicación de insecticidas contra el vector de la enfermedad, el psílido asiático de los cítricos Diaphorina citri (Bové, 2006; Gottwald et al., 2010). Estas medidas deben ser aplicadas a una escala regional, o sea dentro y fuera de los campos de cítricos comerciales, para que sean efectivas (Bassanezi et al., 2013b).

La eliminación de los árboles cítricos enfermos en campos comerciales es la medida más criticada y menos adoptada por los productores de cítricos. No todos los citricultores tienen el hábito o los recursos disponibles para inspeccionar constantemente los campos. La eliminación de árboles enfermos cuando es adoptada por un solo productor tiene poco o ningún efecto en la reducción de la tasa de progreso de la enfermedad, especialmente si el campo está situado en una región con alta incidencia de la enfermedad o el campo es relativamente pequeño (Bassanezi et al., 2013a,b).

rootstocks. However, older trees had smaller b values than younger trees. Contrary to what was previously thought, the disease severity progress and the yield loss in adult sweet orange trees was relatively faster. In general, the disease severity reached 50% of the canopy area just after four years from HLB-symptoms onset, with 60% yield loss in comparison to healthy trees. The consequences of keeping HLB-affected trees in the orchard is also discussed.

inTRoDuCTionHuanglongbing (HLB) has threaten the sustainability of the citrus industry in the world because its fast spread, the severe damages it causes on fruit production and quality, and its difficult control. As there is no large scale and economically feasible cure for infected trees and no resistant or tolerant commercial citrus varieties, all the control strategies aim at preventing new infections. Preventive measures to control the disease include the elimination of diseased plants and insecticides applications against the disease vector, the Asian citrus psyllid Diaphorina citri (Bové, 2006; Gottwald et al., 2010). For these measures be effective, they must be applied at a regional scale, i.e. inside and outside the commercial citrus orchards, to be effective (Bassanezi et al., 2013b).

The elimination of diseased trees in commercial citrus orchards is the most criticized and the less adopted measure by citrus growers. Not all citrus growers can afford frequent orchard inspections. The removal of diseased trees, when adopted alone by the grower, has little or no effect on the reduction of disease progress rate, especially if the orchard is located in a region with high disease incidence or the orchard is relatively small (Bassanezi et al., 2013a,b). In cases of high disease incidence in the orchard, eradicating


En el caso de alta incidencia de la enfermedad en el campo, la erradicación de árboles afectados resultaría en la inmediata salida del productor del negocio de los cítricos. Cuando un árbol sintomático que todavía tiene algunos frutos es eliminado, hay pérdidas inmediata y futura de la producción debido a que la enfermedad no causa la muerte del árbol de inmediato, cuando estos se mantienen en el campo.

Consecuentemente, las investigaciones que permitan a los productores de cítricos evaluar la factibilidad de la adopción o no de determinada práctica de manejo, son esenciales. Las preguntas más comúnmente hechas por los citricultores son: ¿cuánto tiempo tomará que los síntomas de HLB afecten toda la copa del árbol y reduzcan su producción por debajo del umbral económico? y ¿cuánto tiempo toma que un campo de cítricos con árboles enfermos pierda su productividad económicamente?

Para simular y responder estas cuestiones, como fue propuesto por Bassanezi y Bassanezi (2008), es necesario conocer en diferentes escenarios de cítricos y manejo de la enfermedad como es la producción esperada de campos sanos durante los años, la evolución de la incidencia de la enfermedad, la evolución de la severidad de la enfermedad en árboles afectados y la relación severidad de la enfermedad - rendimiento del árbol.

El rendimiento esperado de campos sanos es bien conocido mediante la experiencia de los productores y depende de las condiciones locales del suelo y el clima, combinaciones variedad/ /patrón, prácticas culturales como densidad de plantación, nutrición, irrigación y control de plagas. La evolución de la incidencia de HLB está bien documentada y depende fundamentalmente del rigor del control del vector dentro y fuera del campo (Gottwald et al., 2007; Gottwald, 2010; Gottwald et al., 2010; Gatineau et al., 2010; Bassanezi et al., 2013a,b). Se puede predecir modelando los datos anuales históricos de la incidencia de HLB del campo. Acerca de la evolución de la severidad HLB, los datos de la literatura indican que los síntomas severos de HLB son observados después de 5 a 8 años de plantados los árboles (Aubert et al., 1984; Regmi y Lama, 1987; Aubert et al., 1990; Aubert et al., 1996; Roistacher, 1996) o de 1 a 5 años después de la aparición de los

affected trees might take growers out of the business. When a symptomatic, tree that still has some fruits is eliminated, there is an immediate and future production loss because the disease does not kill the tree at once.

Therefore, studies allowing citrus growers evaluate the feasibility of adopting a definitive management, are essential. The most common questions made by citrus growers are how long will it take for the symptoms of HLB affect the entire tree canopy and reduce its production bellow an affordable economic threshold and how long will it take for a citrus orchard with diseased trees lose its economical productivity?

To simulate and answer these questions as proposed by Bassanezi & Bassanezi (2008) it is necessary to know under different citrus growing sites and disease management how is the expected production of a healthy grove over the years, the disease incidence progress, the disease severity progress in affected trees and the disease severity/tree yield relationship.

The expected yield of a healthy orchard is well known by grower’s experience and depends on the local conditions of soil and weather, scion/ /rootstock combination, cultural practices such as planting density, nutrition, irrigation, and pest control. The progress of HLB incidence is well documented and depends mostly on how intensive vector control inside and outside the orchard might be (Gottwald et al., 2007; Gottwald, 2010; Gottwald et al., 2010; Gatineau et al., 2010; Bassanezi et al., 2013a,b). It can be predicted by modelling the historical annual HLB-incidence data from the orchard. Relative to the progress of HLB severity, data from the literature indicates that the severe symptoms of HLB are observed from 5 to 8 years after planting (Aubert et al., 1984; Regmi & Lama, 1987; Aubert et al., 1990; Aubert et al., 1996; Roistacher, 1996) or from 1 to 5 years after the first HLB-symptoms appearance (Lin, 1963; Schwarz et al., 1973; Aubert, 1992). However,


primeros síntomas de HLB (Lin, 1963; Schwarz et al., 1973; Aubert, 1992). Sin embargo, estos datos son genéricos y no dan detalles acerca de la edad de los árboles al inicio de los síntomas, ni cuantifican la severidad de la enfermedad en árboles individuales en el tiempo, lo que permite modelar el progreso de la severidad de la enfermedad en diferentes condiciones como edad del árbol, combinaciones variedad/patrón y estado nutricional. Otra brecha en el conocimiento es la relación entre la severidad de la enfermedad y el rendimiento que solo está disponible para árboles jóvenes al comienzo de la producción (Bassanezi et al., 2011). Por consiguiente, no hay suficientes datos acerca de la evolución de la severidad de la enfermedad y la pérdida de rendimiento, que permitan simular la pérdida futura de rendimiento de campos afectados por HLB, especialmente para árboles cítricos adultos en los que la eliminación es más debatida por los productores.

Así, este trabajo tiene como objetivo evaluar y comparar la evolución de la severidad de HLB y sus daños para las principales variedades de naranjo dulce y patrones usados en el estado de Sao Paulo, Brasil, con diferentes edades en el momento de la manifestación de síntomas de la enfermedad, para apoyar la toma de decisiones de los citricultores.

mATeRiALes Y mÉToDosPara este trabajo, fueron seleccionados bloques de naranjo dulce en tres campos comerciales en el estado de Sao Paulo, Brasil, en los cuales no se lleva a cabo la erradicación de árboles sintomáticos de HLB pero el control del vector se mantiene intensivo, con al menos aplicaciones quincenales de insecticida. Todos los campos estaban con buen estado nutricional y con altos rendimientos. Las variedades de naranjo dulce [Citrus sinensis (L.) Osbeck] fueron ‘Hamlin’ (temprana), ‘Pera Rio’ (media estación), ‘Valencia’ y ‘Natal’ (tardía). Los patrones fueron lima Rangpur (C. limonia Osbeck), mandarino Sunki [C. sunki (Hayata) hort. ex Tanaka] y Cleopatra (C. reshini hort. ex Tanaka), limón Volkameriana (C. volkameriana V. Ten. y Pasq.) y citrumelo Swingle [C. paradisi Macfad. x Poncirus trifoliolata (L.) Raf.]. La edad de los árboles seleccionados se extendió desde 4 hasta 12 años de edad (Tabla).

these data are generic and do not provide details on tree age at the symptoms onset, nor quantify the disease severity in individual trees over time which would allow modelling the disease severity progress under different conditions such as tree age, scion/rootstock combinations, and nutritional status. Another gap is the knowledge about disease severity and yield relationship, that is only available for young trees at the beginning of production (Bassanezi et al., 2011). Therefore, there are not enough data on the progress of disease severity and yield loss, especially for adult citrus trees whose eradication is more contested by growers, all of which would allow simulating the future yield loss of HLB-affected orchards.

Thus, this work aims at evaluating and comparing the progress of HLB-severity and its damages for the main sweet orange varieties and rootstocks used in Sao Paulo State, Brazil, at different ages of disease symptoms appearance to support the decision-making process of citrus growers.

mATeRiAL AnD meTHoDsSweet orange blocks were selected in three different commercial orchards of Sao Paulo State, Brazil, where the removal of HLB-symptomatic trees is not accomplished but the psyllid control is still intensive, with at least one insecticide application every two weeks. All orchards showed good nutritional status and high yields. The sweet orange varieties [Citrus sinensis (L.) Osbeck] were ‘Hamlin’ (early), ‘Pera Rio’ (mid-season), ‘Valencia’ and ‘Natal’ (late). The rootstocks were Rangpur lime (C. limonia Osbeck), Sunki [C. sunki (Hayata) hort. ex Tanaka] and Cleopatra (C. reshini hort. ex Tanaka) mandarins, Volkamer lemon (C. volkameriana V. Ten. & Pasq.) and Swingle citrumelo [C. paradisi Macfad. x Poncirus trifoliolata (L.) Raf.]. The age of selected trees ranged from 4 to 12 years old (Table).


Tabla. Municipios del estado de Sao Paulo, Brasil, variedades de naranjo dulce, patrones y edad de los árboles seleccionados, al comienzo de las evaluacionesTable. Municipality in Sao Paulo State, Brazil, sweet orange variety, rootstock and age of trees selected at the beginning of evaluations

municipios /municipality

Variedad de naranjo dulce/ sweet orange

varietyPatrón/Rootstock edad/Age

Pirajuí Natal lima Rangpur 12

Pirajuí Valencia lima Rangpur 12

Pirajuí Pera Rio mandarino Sunki 5

Pirajuí Hamlin citrumelo Swingle 10

Pirajuí Valencia citrumelo Swingle 9


Pirajuí Pera Rio citrumelo Swingle 5


São Manoel Hamlin lima Rangpur 8

São Manoel Hamlin mandarino Cleopatra 9

São Manoel Hamlin citrumelo Swingle 8

São Manoel Pera Rio mandarino Sunki 8

São Manoel Pera Rio lima Rangpur 8

São Manoel Valencia citrumelo Swingle 8

São Manoel Valencia limón Volkameriana 8

São Manoel Valencia mandarino Cleopatra 8

Analândia Valencia lima Rangpur 9



Analândia Natal lima Rangpur 9










En cada bloque de cítricos, fueron seleccionados 30 árboles con menos del 5% de la copa ocupada por los síntomas de la enfermedad y mensualmente fue evaluada la severidad de la enfermedad según la metodología descrita por Gottwald et al. (1989). En la temporada de cosecha, las frutas de cada árbol enfermo seleccionado fueron recogidas y pesadas individualmente. Adicionalmente, 20 árboles sanos fueron también cosechados en cada bloque. Las evaluaciones fueron hechas durante periodos de 4 a 6 años.

Para cada combinación de variedad/patrón/ /edad, los datos de la evolución de la severidad de la enfermedad en el tiempo fueron ajustados a modelos epidemiológicos, como monomolecular [x=1-(1-x0)exp(-Rt)], logistic [x=1/(1+b1exp(-Rt))], Gompertz [x=exp(-b1exp(-Rt))] y linear [x=x0+Rt], donde x es la severidad de la enfermedad en el tiempo t, x0 es la severidad inicial, b1 es una constante relacionada con la severidad inicial, y R es la tasa anual de evolución de la severidad (Campbell y Madden, 1990). El parámetro R del modelo de mejor ajuste a la curva de evolución de la severidad fue comparado entre variedades, patrones y edad, mediante el test de Kruskall-Wallis de análisis de varianza por rangos.

El rendimiento relativo de árboles enfermos (en relación al rendimiento medio de árboles sanos del mismo bloque), en el tiempo fue ajustado al modelo exponencial negativo [PR= exp(-b.x)], donde PR es el rendimiento relativo, b es una constante relacionada con la inclinación de la curva y x es la severidad de enfermedad (Bassanezi et al., 2011). El parámetro b de la relación severidad de la enfermedad-rendimiento relativo fue comparado entre variedades, patrones y edad mediante el test de Kruskall-Wallis de análisis de varianza por rangos.

ResuLTADos

Evolución de la severidad de HLB

La severidad de la enfermedad en cada árbol selec-cionado se incrementó con el paso del tiempo en todos los árboles enfermos seleccionados indepen-dientemente de la condición nutricional del campo, el control del vector, la combinación de variedad /patrón y la edad de los árboles al inicio de los sínto-mas de HLB.

In each citrus block, 30 trees with less than 5% of the canopy affected by the disease symptoms, were selected. They were monthly evaluated as to disease severity according to the methodology described by Gottwald et al. (1989). At the harvest time, fruits of each diseased tree were individually picked and weighted. Additionally, 20 healthy trees were also harvested in each block. Evaluations were done for 4 to 6 years.

For each scion/rootstock/age combination, data of disease severity progress over time were fitted to epidemiological models, such as monomolecular [x=1-(1-x0)exp(-Rt)], logistic [x=1/(1+b1exp(-Rt))], Gompertz [x=exp(-b1exp(-Rt))] and linear [x=x0+Rt], where x is the disease severity at the time t, x0 is the initial severity, b1 is a constant related to initial severity, and R is the annual severity progress rate (Campbell & Madden, 1990). The parameter R of the best-fitted model for the disease severity progress curve was compared among scion varieties, rootstocks and age by Kruskall-Wallis by ranks variance analyses test.

The relative yield of diseases trees (yield of diseased trees in relation to the average yield of healthy trees from the same block) over time was fitted to the negative exponential model [PR=exp(-b.x)], where PR is the relative yield, b is a constant related to the slope of the curve and x is the disease severity (Bassanezi et al., 2011). The parameter b of the disease severity-relative yield relationship was compared among scion varieties, rootstocks and age using the Kruskall-Wallis by ranks variance analysis test.

ResuLTs

HLB severity progress

The disease severity in each selected tree increased over time in all diseased trees regardless orchard nutritional condition, vector control, scion/ /rootstock combination and age of trees at the beginning of HLB symptoms.


Variedad de naranjo dulce Patrón

Edad de los árboles al comienzo de los síntomas de HLB (año)

Figura 1. Diagrama de cajas por grupo de variedades de naranjo dulce (A), patrones (B) y edad de los árboles al comienzo de los síntomas de HLB (C) para la tasa de evolución de la severidad de HLB (Rm) estimada mediante el ajuste del modelo monomolecular a la severidad de la enfermedad en función del tiempo.Figure 1. Boxplot by group of sweet orange varieties (A), rootstocks (B) and tree age at HLB-symptoms onset (C) for the HLB-severity progress rate (Rm) estimated by the adjustment of monomolecular model to the disease severity as function of time.


Los datos de la evolución de la severidad de la enfermedad se ajustaron bien a todos los modelos evaluados (R2> 0,60). Sin embargo, el modelo monomolecular tuvo el mejor ajuste en 20 de 27 bloques.

No hubo diferencias significativas para los valores de la tasa anual de evolución de la severidad estimados por el modelo monomolecular (Rm) entre las diferentes variedades de naranjo dulce (p= 0,3553), patrones (p= 0,0938) y edad (p= 0,1643) (Figura 1) Los valores de Rm variaron de 0,066 a 0.245, con un promedio de 0.160 (Figura 2).

Disease severity progress data fitted well in all tested models (R2> 0.60). However, the monomolecular model showed the best adjustment in 20 out of 27 blocks.

There were no significant differences for the annual rate of severity progress estimated by monomolecular model (Rm) among different sweet oranges scion varieties (p= 0.3553), rootstocks (p= 0.0938) and ages (p= 0.1643) (Figure 1). The Rm values varied from 0.066 to 0.245, with an average of 0.160 (Figure 2).

Figura 2. Curvas de evolución de la severidad de HLB para árboles adultos de naranjo dulce considerando la tasa de evolución de la severidad de la enfermedad mínima, promedio y máxima por el modelo monomolecular obtenido en la evaluación de 27 combinaciones de variedades de naranjo dulce/patrones/edad al comienzo de los síntomas.Figure 2. HLB severity progress curves for adult sweet orange trees considering the minimum, average and maximum disease severity progress rates for the monomolecular model obtained in the evaluation of 27 combinations of sweet orange varieties/rootstocks/ages at the symptoms onset.


Relación entre la severidad de HLB y el rendimiento relativo

El rendimiento relativo de cada árbol enfermo seleccionado disminuyó con el paso del tiempo en todos los bloques independientemente de la condición nutricional del campo, el control del vector, la combinación de variedad/patrón y la edad de los árboles al inicio de los síntomas de HLB.

A pesar de la significación del parámetro b del modelo exponencial negativo para todas las relaciones entre la severidad y el rendimiento relativo de los árboles enfermos, los valores del coeficiente de determinación fueron bajos o intermedios con un valor máximo de 0,74, indicando una elevada variabilidad de la colección de datos. Los valores estimados de b estuvieron entre 0,649 y 3,731, con un promedio de 1,922 (Figura 3).

HLB severity-relative yield relationship

The relative yield of each selected diseased tree decreased over time in all blocks regardless orchard nutritional status, vector control, scion/ /rootstock combination and age of trees at the beginning of HLB symptoms.

Despite the significance of parameter b of the negative exponential model for all relationships between disease severity and relative yield of diseased trees, the values of determination coefficient were low or intermediate with a maximum value of 0.74, indicating a high variability of the data set. The estimated b-values were between 0.649 and 3.731, with an average of 1.922 (Figure 3).

Figura 3. Rendimiento relativo de árboles adultos de naranjo dulce enfermos considerando el parámetro b mínimo, promedio y máximo por el modelo exponencial negativo obtenido en la evaluación de 27 combinaciones de variedades de naranjo dulce/patrones/edad al comienzo de los síntomas.Figure 3. Relative yield of diseased adult sweet orange trees considering the minimum, average and maximum parameter b for the negative exponential model obtained in the evaluation of 27 combinations of sweet orange varieties/rootstocks/ages at the symptoms onset.


No hubo diferencias significativas para el parámetro b del modelo exponencial negativo entre variedades de naranjo dulce (p= 0,0843) y patrones (p= 0,0574). Sin embargo, el valor de b disminuyó significativamente para árboles de mayor edad (p= 0,0090), indicando que el rendimiento relativo de árboles enfermos más jóvenes disminuye más rápidamente que en árboles enfermos mayores (Figura 4).

There was no significant difference for parameter b of negative exponential model among sweet orange varieties (p= 0.0843) and rootstocks (p= 0.0574). However, the b-value decreased significantly for older trees (p= 0.0090), indicating that the relative yield of younger diseased trees decreases faster than older diseased trees (Figure 4).

Variedad de naranjo dulcePatrón

Edad de los árboles al comienzo de los síntomas de HLB (año)

Figura 4. Diagrama de cajas por grupo de variedades de naranjo dulce (A), patrones (B) y edad de los árboles al comienzo de los síntomas de HLB (C) para el parámetro b, estimado mediante el ajuste del modelo exponencial negativo a los datos del rendimiento relativo en función de la severidad de la enfermedad.Figure 4. Boxplot by group of sweet orange varieties (A), rootstocks (B) and tree age at HLB-symptoms onset (C) for the b parameter estimated by the the adjustment of negative exponential model to the relative yield data as function of disease severity.


DisCusiÓnLa evolución de HLB en árboles de naranjo dulce adultos fue cuantificado y modelado por primera vez. No hubo diferencias en la tasa de evolución de la severidad entre diferentes variedades y entre diferentes patrones, indicando que no existen diferencias en la resistencia entre los materiales evaluados, como fue reportado en otros trabajos publicados sobre la multiplicación de Candidatus Liberibacter asiaticus en los mismos cultivares de naranjo dulce y especies de patrones evaluados (Folimonova et al., 2009; Lopes et al., 2009, 2014).

Se esperaba que la tasa de evolución de la severidad de la enfermedad fuese inversamente proporcional a la edad del árbol en el momento del comienzo de los síntomas. Sin embargo, esto no fue observado en este estudio, probablemente porque la evolución de la severidad de la enfermedad fue evaluada en árboles mayores de cuatro años, en los cuales el crecimiento de la copa no varió demasiado.

Una vez que el primer síntoma de HLB apareció, la severidad anual de la enfermedad se incrementó siempre, aunque pudo aumentar y disminuir durante el año debido a los nuevos brotes vegetativos que camuflaron los síntomas hasta que se volvieron maduros. La evolución de la severidad para árboles adultos de naranjo dulce con síntomas iniciales ocupando el 10% de la copa del árbol, podría ser relativamente rápida, alcanzando más del 50% de severidad de la enfermedad solamente cuatro años después del comienzo de los síntomas.

Con la evolución de los síntomas de HLB en la copa, aumenta la diferencia entre el rendimiento de árboles afectados en relación a árboles sanos. La relación severidad - rendimiento relativo, fue similar entre los cultivares de naranjo dulce evaluados, corroborando observaciones previas en campos de 4 a 6 años de edad injertados sobre lima Rangpur (Bassanezi et al., 2011). Tampoco fue observada ninguna diferencia significativa entre patrones en cuanto a la relación de la severidad de la enfermedad y el rendimiento relativo. Sin embargo, la disminución en el rendimiento relativo fue superior para árboles más jóvenes.

En general, los árboles adultos de naranjo dulce con 50% de la copa con síntomas producen

DisCussionThe HLB progress in adult sweet orange trees was quantified and modelled for the first time. There were no differences in the severity progress rates among different scion varieties and among different rootstocks, indicating no resistance differences as to resistance among the evaluated materials as reported in other articles regarding the multiplication of Candidatus Liberibacter asiaticus in the same tested sweet orange cultivars and rootstocks species (Folimonova et al., 2009; Lopes et al., 2009, 2014).

The disease severity progress rate was expected to be inversely proportional to the age of trees at symptoms onset. However, it was not observed in this study, probably because the disease severity progress was evaluated in trees older than four years, whose canopy growth did not vary too much.

Once the first HLB-symptoms appeared, the annual disease severity always increased, though it could go up and down during the year because of the new vegetative flushes that masked the symptoms until they became mature. Progress of disease severity for adult sweet orange trees with initial symptoms covering 10% of the tree canopy could be relatively fast, showing more than 50% severity just after four years of symptom onset.

With the progress of HLB symptoms in the canopy, the difference between the yield of affected trees in relation to healthy trees increased. The disease severity- relative yield relationship was similar among tested sweet orange cultivars, which confirms the previous observation for orchards from 4 to 6 years old grafted on Rangpur lime (Bassanezi et al., 2011). No significant differences in the disease severity / relative yield relationships was observed among the tested rootstocks as well. However, relative yield decrease was higher for younger trees.

In general, adult sweet orange trees with 50% canopy with symptoms produced 60% less than


menos del 60% de lo que producen los árboles sanos de la misma combinación variedad/patrón, en las mismas condiciones de campo y prácticas culturales.

Considerando el largo tiempo de vida económica esperado para campos de naranjo dulce (usualmente más de 20 años), la evolución de la severidad HLB y la pérdida de rendimiento en árboles adultos no es tan lenta como se pensó previamente y puede ser considerado rápida. Una vez que la severidad de la enfermedad progresa no puede ser disminuida después del comienzo de los síntomas, la única forma de reducir la tasa de pérdida de la cosecha de un campo afectado es reducir la tasa de infección de nuevos árboles. Esto se lleva a cabo mediante el control frecuente del vector dentro y fuera del campo y remoción de la fuente de inóculo fuera del campo.

Aunque la decisión de eliminar árboles enfermos es de los productores, debería ser bien pensada. La permanencia de árboles afectados con HLB en los campos aumentará la incidencia de la enfermedad dentro de estos, ya que las plantas enfermas no son reemplazadas por sanas y la infección de nuevos árboles no puede ser evitada completamente. En breve tiempo la severidad de la enfermedad aumentará en todo el campo con la consiguiente reducción de la producción y calidad de los frutos (Bassanezi et al., 2009). Con menos rendimiento, el tiempo de vida económica del campo afectado se acortará creando la necesidad de su renovación temprana. Por lo tanto, la preservación de árboles sintomáticos en los campos, requiere el aumento de la frecuencia de aspersiones de insecticidas, para evitar nuevas autoinfecciones y la infección de nuevos campos cerca de los viejos infectados. La alta dependencia de insecticidas traerá toda clase de efectos secundarios como el incremento de los costes de producción, los riesgos de contaminación del medio ambiente, el riesgo de residuos en la fruta y el resurgimiento de plagas secundarias.

Además de esto, la conservación de árboles enfermos puede comprometer todos los árboles cítricos alrededor del campo en ausencia de un fuerte programa de control del vector, haciéndose más difícil la plantación de nuevos campos.

healthy trees of same scion/rootstock combination under the same field conditions and cultural practices.

Considering the long expected economic lifespan for sweet orange orchards (usually more than 20 years), the HLB severity progress and yield loss in adult trees is not as slow as previously thought and can be considered fast. Once the disease severity progress cannot be reduced after the symptoms onset, he only way to reduce the rate of crop loss of an affected orchard is by reducing the infection rate of new trees, which is done by frequent psyllid control inside the orchard and an intensive vector control and inoculum removal outside the orchard.

Although the eradication of diseased trees depends on the grower’s decision, it should be well thought out. Keeping HLB-affected trees in the orchards will increase the incidence of the disease, since the diseased trees are not replaced by healthy ones and the infection of new trees cannot be completely avoided. In a short time, the disease severity in the entire orchard will increase with consequent crop and quality reduction (Bassanezi et al., 2009). With less yield, the economic lifespan of the affected orchard will be reduced, thus creating the need for early renewal of the orchard. However, keeping symptomatic trees in the orchards, would mean increasing insecticide sprays to avoid new self-infections and infecting new orchards around. The high dependence of insecticides will bring about side-effects such as increased production costs, environmental contamination risks, residues in fruits, and emergence of secondary pests.

Besides that, the living with diseased trees could compromise all the citrus trees around the orchard in the absence of an appropriate vector control program, making more difficult the planting of new orchards.



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ENfOqUES pARA ENTENDER LOS MECANISMOS DE SUSCEpTIBILIDAD A LA INfECCIóN pOR CANDIDATUS LIBERIBACTER ASIATICUS EN CITRUS: MANIpULACIóN DE LA RESpUESTA INMUNEApproaches to understand susceptibility mechanisms to infection by Candidatus Liberibacter asiaticus in citrus: Manipulation of the immune response

Fernando Alferez1, Jian Wu2, evan Johnson2 y James H. Graham2

1 South West Florida Research and Education Center, University of Florida, IFAS, Immokalee, FL, USA.2 Citrus Research and Education Center, University of Florida, IFAS, Lake Alfred, FL, USA. [email protected]

ResumenEn este trabajo se ha estudiado el papel de la respuesta inmune mediada por ácido salicílico (SA) en respuesta a Huanglongbing (HLB) en cítricos. Para ello se evaluaron dos patrones con diferente susceptibilidad a la enfermedad: mandarino Cleopatra (más susceptible) y citrumelo Swingle (más tolerante). Se estudió la expresión de genes que pudieran estar implicados en la respuesta diferencial de ambos patrones a la infección causada por la bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus. Los genes asociados con la biosíntesis de SA se activaron tras la infección de las plantas del patrón más susceptible, Cleopatra, pero no así los genes siguientes en esta ruta (que codifican proteínas de tipo PR). Esto pudiera deberse a que los genes implicados en la síntesis y percepción de ácido abscísico (ABA) estaban activados, así como que los niveles de esta hormona, un antagonista del SA, eran altos. En contraste, la expresión del gen PR1, implicado en la resistencia inmune, estaba muy inducida en el patrón citrumelo Swingle a pesar de que la síntesis de SA no estaba tan activada, lo que sugiere que existe una ruta alternativa, independiente de SA, para inducir las proteínas PR y desatar la cascada de resistencia al patógeno que estaría operando en

AbsTRACTThis research has studied the role played by the mediated immune response by salicylic acid(SA) to Huanglongbing (HLB) presence in citrus. Two rootstocks with different susceptibility to the disease were tested: Cleopatra mandarin (more susceptible) and Swingle citrumelo (more tolerant). The expression of genes that could be involved in the differential response of both rootstocks to the infection caused by the bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus, was also studied. Genes associated to the biosynthesis of SA were activated after the infection of the plants on the most susceptible rootstock, Cleopatra, but not so for the following genes in this route (that codify PR type proteins), probably because the genes involved in the synthesis and perception of abscisic acid (ABA) were activated, as well as the levels of this hormone, an antagonist of the SA, were high. In contrast, the expression of the gene PR1, involved in the immune resistance, was very much induced in the Swingle citrumelo rootstock despite the synthesis of SA was not so much activated, which indicates the existence of an independent alternative route of SA to induce PR proteins and trigger off a cascade of resistance to



the pathogen that would be operating in this more tolerant rootstock. These results provide us with a knowledge pool of molecular type to manipulate an immune response in citrus, and at the same time, suggest management strategies for the crop in an environment of high infection pressure by HLB. These strategies should be based on the prevention of stressing conditions during the normal crop management, provision of good irrigation and good nutritional status for the trees.

inTRoDuCTionHuanglongbing (HLB), caused by the bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), is a devastating disease affecting citrus in more than 40 countries. In Florida, it has sharply reduced production in the last decade. There is still no cure for the disease in the nearby horizon, and one of the strategies that promises to render the better results is the quest for tolerant or resistant varieties. A rational way to deal with this issue is through the understanding of the molecular and physiological basis determining this tolerance or resistance.

The tolerance to infection by CLas and the severity of symptoms vary among different citrus species, both in studies under greenhouse conditions and in open-field environments. In general, some studies have shown that varieties grafted on trifoliate roostocks and its hybrids are more tolerant to the infection (Folimonova et al., 2009; Albrecht and Bowman, 2012b; Boava et al., 2015). Likewise, there are hints showing the bacterium has more capacity to colonize sweet orange varieties than trifoliate rootstocks. Moreover, previous studies have shown that trifoliate rootstocks perform better in the presence of the infection than Cleopatra mandarin (Folimonova et al., 2009; Boava et al., 2015).

This article focus on the comments from a study that compared the molecular and hormonal response of Cleopatra mandarin roots and Swingle citrumelo to the infection by CLas. Likewise, the meanings such responses could have to develop management strategies for citrus under the presence of HLB infection, are be considered.

este patrón más tolerante. Estos resultados nos proporcionan una base de conocimientos de tipo molecular para manipular la respuesta inmune en cítricos y al mismo tiempo sugieren estrategias de manejo para el cultivo en un entorno de alta presión de infección por HLB. Estas estrategias deben basarse en evitar condiciones de estrés durante el manejo normal del cultivo, conseguir una buena irrigación y un buen estado nutricional de los árboles.

inTRoDuCCiÓnEl Huanglongbing (HLB), causado por la bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), es una enfermedad devastadora que afecta al cultivo de los cítricos en más de 40 países. En Florida, ha reducido de forma drástica la producción en la última década. Todavía no existe una cura para la enfermedad en el horizonte cercano y una de las estrategias que promete rendir mejores resultados es la búsqueda de variedades tolerantes o resistentes. Una forma racional de abordar este objetivo se basa en la comprensión de las bases moleculares y fisiológicas que determinan esta tolerancia o resistencia.

La tolerancia frente a la infección por CLas y la severidad de los síntomas varían entre diferentes especies de cítricos, tanto en estudios en invernadero como en campo abierto. En general, varios estudios han mostrado que las variedades injertadas sobre patrones trifoliados y sus híbridos son más tolerantes a la infección (Folimonova et al., 2009; Albrecht y Bowman, 2012b; Boava et al., 2015). Del mismo modo, existen indicaciones de que la bacteria tiene más capacidad de colonizar variedades de naranjo dulce que patrones trifoliados. Asimismo, trabajos previos han mostrado que los patrones trifoliados se comportan mejor frente a la infección que el mandarino Cleopatra (Folimonova et al., 2009; Boava et al., 2015).

En este artículo nos centraremos en el comentario de los resultados obtenidos durante un estudio comparando la respuesta molecular y hormonal de raíces de mandarino Cleopatra y citrumelo Swingle a la infección por CLas. Además, analizaremos el significado que pueden tener estas respuestas de cara al desarrollo de estrategias de manejo del cultivo en presencia de HLB.


RuTAs De ResPuesTA A LA inFeCCiÓn en PLAnTAs

En general, se puede considerar que la respuesta de la planta a la infección por un patógeno es el resultado de la interacción entre ambos organismos a nivel molecular, celular y fisiológico. Las hormonas vegetales están implicadas en la regulación de numerosos procesos del desarrollo y también de la respuesta de la planta a la infección. Clásicamente existen dos rutas principales de respuesta a patógenos en plantas. La primera esta mediada por el ácido salicílico (SA) en respuesta a patógenos bio- y hemibiotróficos. SA es un elemento central en la inducción de la resistencia sistémica adquirida en plantas (SAR). La cascada de respuesta incluye la regulación del gen NPR1 (acrónimo del inglés: “nonexpressor of PR genes”) y la activación de genes que codifican proteínas relacionadas con la respuesta a patogénesis (PR1, PR2 y PR5). La segunda ruta de respuesta está regulada por las hormonas etileno (ET) y ácido jasmónico (JA) actuando conjuntamente y funciona frente a organismos necrotrofos. Otras moléculas como la hormona ácido abscísico (ABA) y las enzimas de la familia fosfolipasa D (PLD) también están implicadas en la transducción y amplificación de esta ruta de respuesta.

Ambas rutas pueden actuar de forma antagonista, aunque la forma en que se regula la respuesta de ambas y su interconexión es algo que no se conoce en detalle en cítricos. Sin embargo, en otras plantas se ha demostrado que el tratamiento con ABA exógeno reduce la respuesta de los genes regulados por SA, lo que redunda en una mayor susceptibilidad al patógeno (Mohr y Cahill, 2007). El antagonismo ABA/SA puede deberse al efecto directo del ABA sobre el ET, e indirecto sobre JA (Adie et al., 2007). Además, diferentes enzimas del grupo de las fosfolipasas también están implicadas, por una parte en la señalización por etileno en respuesta a patógenos, y por otra, en el control de la respuesta mediada por SA. Este hecho convierte a este grupo de enzimas en un importante elemento de control que modula la respuesta de la planta a la infección. De esta forma, el ajuste fino de la respuesta a patógenos no depende de una hormona en particular, sino más bien de una acción concertada entre las diferentes rutas de respuesta en función de cada patógeno y del estado de

ResPonse RouTes To inFeCTion in PLAnTs

In general, the response of the plants to infection by a pathogen can be considered as the result of the interaction between both organisms at molecular, cell and physiological levels. Plant hormones are involved in the regulation of several development processes and also in the response of the plant to infection. Classically, plants show two main response routes to pathogens. The first one is mediated by salicylic acid (SA) in response to bio and hemibiotrophic pathogens. SA is a chief element in the induction of acquired systemic resistance in plants (SAR). The response cascade includes the regulation of the gene NPR1 (acronym of “nonexpressor of PR genes”) and the activation of genes that codify proteins related to the response to pathogenesis (PR1, PR2 and PR5). The second response route is regulated by the hormones ethylene (ET) and jasmonic acid (JA) acting together. It works with necrotrophic organisms. Other molecules like the hormone abscisic acid (ABA) and the enzymes of the phospholipase D family (PLD) are also involved in the transduction and amplification of this response route.

Both routes can act as antagonists, though the way the response of both of them is regulated and their interconection is something unknown in details for citrus. However, it has been demonstrated in other plants that exogenous ABA treatment reduces the response of the genes regulated by SA, which results in a higher susceptibility to the pathogen (Mohr and Cahill, 2007). The ABA/SA antagonism can be due to the direct effect of ABA on ET, and indirect on JA (Adie et al., 2007). Moreover, different enzymes from the phospholipase group are also involved, on the one hand, in the signalling of ethylene in reponse to pathogens, and on the other hand, in the control of the mediated response by SA. This fact turns this group of enzymes into an important control element that modulates plants response to infection. Thus, the fine adjustment of the response to pathogens does not depend on a hormone in particular, but rather on a coordinated action among different response routes in function of each pathogen and the status of the plant. Indeed, comparative studies of the response at


la planta. Efectivamente, estudios comparando la respuesta a nivel transcripcional frente a la infección por CLas en mandarino Cleopatra (más susceptible) y patrones trifoliados híbridos (más tolerantes) ya mostraban una regulación diferencial de algunos genes candidatos a conferir dicha tolerancia (Albrecht y Bowman, 2012).

mATeRiALes Y mÉToDosEn este trabajo hemos querido profundizar más en estos aspectos y para ello hemos comparado la respuesta de mandarino Cleopatra y citrumelo Swingle a la infección por CLas. Raíces fibrosas de ambos patrones infectados se podaron tras 6 meses de infectadas y posteriormente se aislaron y se extrajo el ADN mediante procedimientos convencionales en tres tiempos diferentes: 3, 5 y 11 semanas posinfección.

Se estudió la expresión de genes de las dos rutas descritas de biosíntesis de SA (corismato sintasa como gen clave de la ruta directa vía corismato, y corismato mutasa (CM) y PAL de la ruta indirecta vía fenilalanina ammonioliasa) y genes de la cascada de respuesta posterior que incluyeron NPR1, PR1, PR2 y PR5. Además, se estudió la expresión de genes de la biosíntesis de etileno: ACS1, ACS2 y ACO, de la biosíntesis de ABA (NCED) y de la señalización por ABA: ABI, AHG, HAB y SnRK2. Finalmente se evaluó también la expresión de genes de la familia de fosfolipasas, incluyendo PLA2α, PLA2β y las cinco isoformas de PLD descritas en cítricos (α,β,γ,δ,ε).

ResuLTADos Y DisCusiÓnLo primero que fuimos capaces de observar es que la infección por CLas indujo la expresión de los genes de la síntesis de SA en raíces de mandarino Cleopatra al principio de la infección, pero después de 11 semanas se perdió este efecto. Se trataría por tanto de una respuesta de activación temprana. En citrumelo Swingle por el contrario la síntesis de SA se activó mucho más tarde, concretamente a las 11 semanas, gracias a la inducción del gen CM. En general, la síntesis de SA, ET y ABA, así como los genes de su ruta de señalización, se activaron cinco semanas después de la infección en mandarino Cleopatra. Sin embargo, los genes

transcriptional level by CLas in Cleopatra mandarin (more susceptible) and trifoliate orange hybrids (more tolerant) showed a differential regulation of some candidate genes to provide such tolerance (Albrecht and Bowman, 2012).

mATeRiALs AnD meTHoDsThis research has gone deeper into these aspects, so the response of Cleopatra mandarin and Swingle citrumelo to CLas infection has been compared. Fibrous roots from both infected rootstocks were pruned after 6 months of infection. Afterwards they were isolated and DNA was extracted by conventional procedures at three different times: 3, 5 and 11 weeks postinfection.

Gene expression of both described routes of SA biosynthesis were studied (chorismate synthase as key gene of the direct route via chorismate, and chorismate mutase (CM) and PAL of the indirect route via phenylalanine ammonia lyase) and genes of the subsequent response cascade that included NPR1, PR1, PR2 and PR5. Moreover, gene expression was studied for the ethylene biosynthesis: ACS1, ACS2 y ACO, of the ABA biosynthesis (NCED) and the signalling by ABA (ABI, AHG, HAB and SnRK2). Finally, gene expression of the phospholipase family was also evaluated including PLA2α, PLA2β and the five isoforms of PLD described in citrus (α,β,γ,δ,ε).

ResuLTs AnD DisCussionWhat we were able to observe first was that infection by CLas induced the expression of genes of the SA synthesis in roots of Cleopatra mandarin at the beginning of the infection, but after 11 weeks this effect was lost. So, it would be an early activation response. On the contrary, in Swingle citrumelo, SA synthesis was activated much later, specifically 11 weeks after, thanks to the induction of the CM gene. In general, SA, ET and ABA synthesis as well as the genes of its signalling route, were activated five weeks after the infection in Cleopatra mandarin. However, genes of the signalling cascade NPR1 and PR1 did not get activated. This suggests that


de la cascada de señalización NPR1 y PR1 no se activaron. Esto sugiere que los altos niveles de ABA y ET podrían inhibir la respuesta inmune mediada por SA. En contraste, en citrumelo Swingle la expresión de los genes relacionados con ABA se reprimió por la infección y la expresión de los genes PR se incrementó de forma dramática en el mismo periodo de tiempo. En cuanto a la expresión de los genes que codifican fosfolipasas también encontramos diferencias muy interesantes, puesto que se activaron en mandarino Cleopatra mientras que se reprimieron en citrumelo Swingle de forma coordinada con la represión de la biosíntesis de ABA y ET (Figura).

En conjunto, nuestros resultados muestran que la respuesta de defensa frente a la infección fue menos eficiente en mandarino Cleopatra que en citrumelo Swingle, ya que ABA, JA y ET pueden actuar como antagonistas de la ruta de síntesis y señalización de SA en el primero. La inducción de PR1 y la represión de la síntesis de hormonas en citrumelo Swingle indicaron que este patrón tiene la capacidad de responder a la infección por CLas

the high levels of ABA and ET could inhibit the immune response mediated by SA. In contrast, in Swingle citrumelo the expression of genes related to ABA was repressed by the infection and the expression of PR genes sharply increased in the same period of time. As to the expression of genes that codify phospholipases, very interesting differences were found since they got activated in Cleopatra mandarin while depressed in Swingle citrumelo coordinately with the repression of ABA and ET biosynthesis (Figure).

Altogether, our results show that the defense response to infection was less efficient in Cleopatra mandarin than in Swingle citrumelo, since ABA, JA and ET can act as antagonists of SA synthesis and signalling routein the first one. PR1 induction and the repression of the hormone synthesis in Swingle citrumelo indicated this rootstock has the capability of responding to CLas infection both depending or not depending from SA pathway, which could be

Figura. Representación esquemática de las rutas activadas y reprimidas en mandarino Cleopatra y citrumelo Swingle en respuesta a la infección por CLas.Figure. Schematic representation of the activated and repressed routes in Cleopatra mandarin and Swingle citrumelo in their response to infection by CLas.


de forma dependiente o independiente de SA, lo cual podría constituir un sistema más efectivo para conferir tolerancia frente al patógeno. Este tipo de respuesta permitiría al patrón citrumelo Swingle una adaptación más rápida a la presión de CLas, con lo cual podría utilizar los recursos de forma más eficiente y adoptar un mejor balance entre resistencia a la infección y desarrollo. Esta noción se ve apoyada por nuestro descubrimiento de que el metabolismo de azúcares es más eficiente en citrumelo Swingle que en mandarino Cleopatra (Wu et al., 2018). La Figura representa un esquema de los circuitos activados y reprimidos en ambos patrones en respuesta a la infección por CLas.

ConCLusiones Y ReComenDACionesEstos resultados tienen implicaciones importantes para el manejo de plantas en un entorno de alta presión de infección por HLB. A pesar de que los experimentos se hicieron con plantas en condiciones de invernadero y que siempre es difícil extrapolar ciertos resultados a árboles adultos en condiciones abiertas en el campo, nuestras observaciones sugieren que:

• Un adecuado estado nutricional de los árboles puede ser importante para que los recursos fotoasimilados sean utilizados de manera más eficiente, obteniendo un mejor balance entre la resistencia a la enfermedad y el desarrollo de la planta.

• Cualquier estrés que implique activación del circuito ABA/ET/JA puede ser perjudicial para la capacidad del árbol de responder a la infección vía SA. Nuestros resultados sugieren que la deshidratación, el estrés por inundación, o las heridas en la planta (condiciones estas dos últimas muy comunes durante y después del paso de tormentas tropicales o huracanes, por ejemplo) pueden hacer susceptibles a los árboles a responder de forma menos eficaz frente a las infecciones posteriores de tipo oportunista (como cancrosis o Phytophthora), ya que dicho circuito puede antagonizar la respuesta inmune mediada por SA.

a more effective system to provide tolerance to the pathogen. This type of response would allow Swingle citrumelo to adapt faster to CLas pressure and use resources more efficiently and so adopt a better balance between resistance to the infection and development. This idea is supported by our discovery related to the metabolism of sugars that is more efficient in Swingle citrumelo than in Cleopatra mandarin (Wu et al., 2018). The figure represents the activated and repressed circuits of both roostocks in response to CLas infection.

ConCLusions AnD ReCommenDATionsThese results have important implications to manage plants in an environment with a high pressure of infection by HLB. Despite trials were made with plants under greenhouse conditions, which makes difficult to extrapolate certain results to adult trees under open-field conditions, our observations suggest that:

• An adequate nutritional status of the trees can be important for the photoassimilated resources be more efficiently used, thus achieving a better balance between resistance to the disease and plant development.

• Any stress leading to the activation of the circuit ABA/ET/JA can be harmful to the capability of the tree to respond to infection via SA. Our results suggest that dehydration, stress by flooding, plant wounds (the two latter ones are very common during and after tropical storms and hurricanes, for example) can make trees susceptible to less effectively respond to later opportunist-type infections (like citrus canker or Phytophthora), since that circuit can antagonize the immune response mediated by SA.


• De todo lo anterior se desprende que es imperativo evitar condiciones de estrés durante el manejo normal del cultivo. Es fundamental conseguir una buena irrigación y un buen estado nutricional de los árboles.

• From all the above, it is evident that is imperative to avoid stressing conditions during the normal crop management. It is essential to provide good irrigation and to achieve a good nutritional status of the trees.

bibLioGRAFíA / ReFeRenCesAdie BA, Perez-Perez J, Perez-Perez MM,

Godoy M, Sánchez-Serrano JJ, Schmelz EA, Solano R. 2007. ABA is an essential signal for plant resistance to pathogens affecting JA biosynthesis and the activation of defenses in Arabidopsis. The Plant Cell 19: 1665-81.

Albrecht U, Bowman KD. 2012. Tolerance of trifoliate citrus rootstock hybrids to ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’. Scientia Horticulturae 147: 71-80.

Boava LP, Sagawa CH, Cristofani-Yaly M, Machado MA. 2015. Incidence of ‘Candidatus Liberibacter asiat icus’-Infected Plants Among Citrandarins as Rootstock and Scion Under Field Conditions. Phytopatology 105:518-524.

Folimonova SY, Robertson CJ, Garnsey SM, Gowda S, Dawson WO. 2009. Examination of the responses of different genotypes of citrus to huanglongbing (citrus greening) under different conditions. Phytopathology 99: 1346–54.

Mohr PG, Cahill DM. 2007. Suppression by ABA of salicylic acid and lignin accumulation and the expression of multiple genes, in Arabidopsis infected with Pseudomonas syringae pv. tomato. Functional and Integrative Genomics 7:181-91.

Wu J, Alferez F, Johnson E, Graham, JH. 2018. Up-regulation of PR1 and less disruption of hormone and sucrose metabolism in roots is associated with lower susceptibility to ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’. Plant Pathology, Doi: 10.1111/ppa.12838.


BúSqUEDA DE TOLERANCIA O RESISTENCIA A HUANgLONgBINg EN gÉNEROS AfINES A LOS CÍTRICOSfinding tolerance and/or resistance to huanglongbing in citrus relativesChandrika Ramadugu1, manjunath L. Keremane2, ed stover3, David G. Hall3, mikeal L. Roose1, and Richard F. Lee2*

1 Universidad de California, Riverside, CA. / University of California, Riverside, CA.2 USDA ARS Repositorio Nacional de Clones para Dátiles y Cítricos, Riverside, CA. / USDA ARS

National Clonal Germplasm Repository for Citrus and Dates, Riverside, CA.3 USDA ARS Laboratorio de Investigaciones Hortícolas, Fort Pierce, FL. / USDA ARS Horticultural

Research Laboratory, Fort Pierce, FL.* Jubilado. / Retired

AbsTRACT Huanglongbing (HLB, previously called citrus greening disease) has been a limiting factor of production in many citrus areas. HLB was found in Florida in 2005, following the introduction of the Asian citrus psyllid in 1998. HLB has had a major negative impact on Florida citrus production. There is no known resistance in Citrus, and no easy solution for the disease has been found. In 2008 we began a long term field research project to determine if we could find sources of resistance or tolerance to HLB. Seed was collected from the Citrus Variety Collection, University of California, Riverside in 2008 and forwarded to USDA ARS, Ft. Pierce, FL where seedlings were grown. In 2009 a replicated plot having 98 accessions (65 Citrus accessions and 33 accessions belonging to 20 closely related genera) was planted into the field and exposed to natural challenge of HLB. The seedlings were observed and evaluated for presence of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by qPCR, presence of symptoms, and growth. After six years, some accessions were identified as immune (no detection of CLas and no symptoms), resistant (no symptoms even though CLas could occasionally be detected temporarily), tolerant (CLas replicates at a reduced level but severe symptoms are not present), or susceptible (CLas establishes and replicates, severe symptoms and/or death occur). Two accessions, Clausena

ResumenHuanglongbing (HLB, anteriormente llamada greening de los cítricos) ha sido un factor limitante de la producción en muchas áreas citrícolas. HLB apareció en Florida en el año 2005, tras la introducción del psílido asiático de los cítricos en 1998. La enfermedad ha tenido un impacto negativo importante en la producción citrícola de este estado. No se conoce resistencia alguna en los cítricos y no se ha encontrado ninguna solución fácil para la enfermedad. En el 2008 comenzamos un proyecto de investigación a largo plazo para determiner si podíamos encontrar fuentes de resistencia o tolerancia a HLB. Se colectaron semillas de la Colección de Variedades de Cítricos de la Universidad de California, Riverside en el 2008 y se enviaron al Servicio de Investigación Agrícola del Departamento de Agricultura de EE.UU. en Ft. Pierce, FL donde se cultivaron las plántulas. En el año 2009 se plantó una parcela replicada con 98 accesiones (65 de Citrus y 33 de 20 géneros estrechamente relacionados) y se expuso al desafío natural del HLB. Estas plantas se observaron y se evaluaron para determinar la presencia de Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) por PCR, presencia de síntomas y crecimiento. Después de seis años, algunas accesiones se identificaron como inmunes (no hubo detección de CLas ni tampoco síntomas), resistentes (sin síntomas, aunque pudo detectarse CLas ocasionalmente

Cítricos en las Américas Vol. 1, No. 1, p. 52-63 2018 Citrus in the Americas


de forma temporal), tolerantes (CLas se replicó a bajo nivel, pero no hubo síntomas severos), o susceptibles (CLas se estableció y replicó, hubo síntomas severos o muerte de los árboles). Dos accesiones, Clausena excavata y Glycosmis pentaphylla, se consideraron immunes. Seis accesiones se consideraron resistentes y este grupo incluyó Eremocitrus glauca. Hubo muchas accesiones que se consideraron tolerantes: Microcitrus australasica y otras limas de Australia resultaron tolerantes, pero mostraron distintos grados de síntomas entre las diferentes plántulas. Algunas accesiones mostraron tolerancia a HLB en la medida que se recuperaron de la infección, tal fue el caso de Balsamocitrus daweii o, ‘Uganda powder flask’. Poncirus trifoliata var Little Leaf fue considerada tolerante debido a una tasa de infección más lenta. Todo lo demás se consideró susceptible, e incluyó a todas las accesiones del género Citrus. Investigaciones posteriores se han centrado en Eremocitrus y Microcitrus, que fueron compatibles desde el punto de vista sexual y de injerto con el género Citrus, y se intenta utilizar la hibridación para trasladar la tolerancia / /resistencia ante HLB al género Citrus.

inTRoDuCCiÓnEl psílido asiático de los cítricos (PAC) apareció por primera vez en la costa Sureste de Florida en 1998, y en los años siguientes su área geográfica se expandió hasta que el insecto se diseminó por todo el Estado. Entre 1998-2002 se hicieron inspecciones por parte de la División de la Industria de Plantas de Florida y científicos individuales, utilizando elprotocolo de PCR utilizado en aquel momento para la detección de la bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) asociada a huanglongbing (HLB). La enfermedadno se detectó en ningún campo antes del 2005. El cáncer de los cítricos era la principal enfermedad cuarentenada presente en Florida por entonces y debido a regulaciones cuarentenarias se hicieron inspecciones limitadas en la citricultura del sur de Florida a inicios del decenio del 2000. Durante esas inspecciones, se encontró HLB en Miami durante el año 2005. Inspecciones posteriores realizadas a inicios del 2005 revelaron que HLB ya estaba diseminada en el sur del Estado y también estaba presente a lo largo de la costa sureste, en la zona de Indian River y en la región citrícola del suroeste de Florida. Años después, HLB estaba presente en todas las áreas citrícolas del Estado. Dicha

excavata and Glycosmis pentaphylla, were considered immune. Six accessions were considered resistant, this group included Eremocitrus glauca. Several accessions were considered tolerant: Microcitrus australasica and other Australian limes were tolerant but showed varying degrees of symptoms among different seedlings. Some accessions showed tolerance to HLB as recovery from infection, such as Balsamocitrus daweii or, ‘Uganda powder flask’. Poncirus trifoliata var Little Leaf was considered tolerant due to a delayed rate of infection. Everything else was considered to be susceptible, this included all accessions in the genus Citrus. Subsequent research has focused on Eremocitrus and Microcitrus, which are sexually and graft compatible with Citrus, and we are attempting to use hybridization to move HLB tolerance/resistance into citrus.

inTRoDuCTionThe Asian citrus psyllid (ACP) was first found on the Southeast Florida coast in 1998, and over the next few years its geographical area expanded until the insect was spread throughout Florida. Surveys were conducted from 1998-2002 by Florida Division of Plant Industry and individual scientists using the then current PCR protocol for detection of the bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) associated with huanglongbing (HLB). HLB was not detected in any of the field trees prior to 2005. Citrus canker was a major quarantined disease that was present in Florida at that time and because of quarantine regulations limited citrus surveys were conducted in South Florida in the early 2000s. During these surveys HLB was discovered in the Miami Florida area in 2005. Subsequent delimiting surveys in early 2005 revealed that HLB was already widespread in Southern Florida and was present along the Southeast coast of Florida to the Indian River area and in the Southwest Florida citrus production area. In the next few years, HLB became widespread throughout the citrus production area of Florida. HLB has had a devastating impact on Florida citrus production.


enfermedad ha tenido un impacto devastador en la producción citrícola de Florida, cuya producción total en el 2017-2018 fue de 78,130,000 cajas, la cifra más baja desde 1946 (Figura 1).

El daño causado al cultivo por el huracán Irma, combinado con las pérdidas por HLB fueron los responsables de esta baja producción. Sin embargo, la producción de 2016-2017 fue la más baja desde 1965, y esta reducida producción de 1965 refleja la pérdida de árboles causada por una gran helada el año anterior. Al utilizar la temporada 2000-2001 como año tipo, la cantidad de acres en producción en el 2017 se había reducido a la mitad, fundamentalmente por el efecto de HLB (Figura 2A). Adicionalmente, el promedio de cítricos producido por acre en Florida también se

The total citrus production in Florida in the 2017- -2018 season was 78.130.000 boxes which is the lowest production since 1946 (Figure 1).

Crop damage by hurricane Irma combined with losses due to HLB resulted in this low production. However, the production for the 2016-2017 season was the lowest since 1965, and the low production in 1965 reflects tree losses from a major freeze event the previous year. Using 2000-2001 as a benchmark year, the number of bearing acres of citrus at the current time (2017) has been cut in half, largely due to HLB (Figure 2A). Additionally, the average citrus produced per acre in Florida has been cut in half (Figure 2B). The costs for caring of an acre of citrus has increased from an average of

Figura 1. Resumen de la producción total de cítricos (cajas -x 1000- de 90 lb para naranjas, de 85 lb para toronjas, y de 95 lb para mandarinas) en Florida desde la temporada 1917-1918 hasta la 2017- -2018. Datos de Estadísticas Citrícolas de Florida, Dpto. de Agricultura, Servicio Nacional de Estadísticas Agrícolas.Figure 1. Summary of the total citrus production (field boxes -x 1000- 90 lb for Orange, 85 lb for grapefruit, and 95 lb for mandarins) in Florida from the 1917-1918 season through the 2017-2018 season. Data from the Florida Citrus Statistics, USDA, National Agricultural Statistics Service.


había reducido a la mitad (Figura 2B). Los costos de atención de un acre aumentaron desde un promedio de $769 en la temporada 2000-2001 a $2376 en la de 2016-20017 (Figura 2C).

Las investigaciones orientadas al control de la enfermedad mediante la aplicación de bactericidas, terapia con calor en los árboles infectados y la

$769 in the 2000-2001 season to $2376 per acre for the 2016-20017 season (Figure 2C).

Research to control the disease by application of bactericides, heat therapy of infected trees, and modifying the fertilization regime have not

Figura 2. Influencia de HLB principalmente (confirmado por vez primera en Florida en el 2005) en la cantidad de acres de cítricos (A), cantidad promedio de cajas de 90 libras de cítricos producidos por acre (B), y el costo de atención por acre (C) desde 2001 hasta 2018. Los datos para (A) y (B) provienen de Estadísticas Citrícolas de Florida, del Dpto. de Agricultura, del Servicio Nacional de Estadísticas Agrícolas, y los datos de (C) son de las publicaciones del Servicio de Extensión IFAS de la Universidad de Florida sobre los costos de producción de naranjas procesadas cultivadas en el suroeste de Florida en las temporadas respectivas.Figure 2. Influence largely of huanglong-bing (first confirmed in Florida in 2005) on number of bearing acres of citrus (A), the average number of 90 pound boxes of citrus produced per acre (B), and the cost of care per acre (C) from 2001-2018. Data for (A) and (B) are from the Florida Citrus Statistics, USDA, National Agricultural Statistics Service, and the data for (C) is from University of Florida IFAS Extension publications on the Cost of production for processed oranges grown in Southwest Florida for the respective seasons.


modificación del régimen de fertilización, no han sido eficaces para mantener la producción. Todas las especies del género Citrus son susceptibles a HLB.

mATeRiALes Y mÉToDosEn el Repositorio Nacional de Clones para Dátiles y Cítricos del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, en Riverside, California, tenemos acceso a germoplasma mantenido en la Colección de Variedades por la Universidad de California, Riverside. Esta colección contiene más 1,100 selecciones de Citrus y sus parientes. Decidimos evaluar unas 100 selecciones de germoplasma diferentes del género Citrus y sus parientes para ver si podíamos identificar fuentes de resistencia o tolerancia a HLB en condiciones naturales de campo. Para obtener germoplasma para los ensayos, comenzamos con la “Core Collection” de 65 diferentes cultivares cítricos que se habían caracterizado con anterioridad a través de marcadores de repetición de secuencia simple (SSR) o microsatélites. Esta Colección Principal representa casi el 85 % de la diversidad genética que se había identificado a partir de los 370 híbridos en la Colección de Variedades de Cítricos usando 23 marcadores SSR (Barkley, 2003). También incluimos semillas de selecciones de cítricos que se habían extraído con fines de distribución y muchos parientes de los cítricos y genotipos como Poncirus trifoliata, pummelo, etc. En total, se enviaron semillas de más de 100 selecciones al Laboratorio de Horticultura del Departamento de Agricultura de EE. UU. en Ft. Pierce, Florida, donde germinaron en un invernadero. En el 2009, se plantaron 98 selecciones en una parcela de campo replicada siguiendo un orden aleatorio en la finca Picos, próxima a Ft. Pierce, FL, con ocho réplicas de cada selección. Las plántulas se fertilizaron y se regaron, pero recibieron un manejo de plagas mínimo.

Las evaluaciones se realizaron dos veces al año, generalmente en marzo y octubre en los primeros tres años y después anualmente, en octubre, durante cuatro años hasta llegar a seis. Se recogieron muestras de hojas adultas en cada planta, seleccionando hojas sintomáticas de HLB, si estaban presentes. Las extracciones de ADN de las muestras se analizaron por qPCR para varias

been effective in maintaining citrus production. All Citrus species are susceptible to HLB.

mATeRiALs AnD meTHoDsAt the USDA ARS National Clonal Germplasm Repository for Citrus and Dates, Riverside, CA, we have access to the germplasm resources maintained at the Citrus Variety Collection (CVC) by University of California Riverside. This collection contains over 1,100 selections of Citrus and citrus relatives. We decided to evaluate about 100 different diverse germplasm selections of Citrus and citrus relatives to see if we could identify sources of resistance and/or tolerance to HLB under natural field challenge conditions. To gather diverse germplasm for testing, we started with the “Core Collection” of 65 different citrus cultivars which were previously characterized using Simple Sequence Repeat (SSR) markers. This Core Collection represents about 85 per cent of the genetic diversity that had been identified from 370 citrus hybrids in the CVC using 23 SSR markers (Barkley, 2003). We also included the seed of citrus selections which had already been collected for distribution purposes. Additionally, we included several citrus relatives and the type citrus genotypes such as Poncirus trifoliata, pummelo, etc. In total, seed of over 100 selections was sent to the USDA ARS Horticultural Research Lab, Ft. Pierce, Florida where they were germinated in a greenhouse. In 2009, 98 selections were planted in a randomized, replicated field plot at the USDA ARS Picos Farm near Ft. Pierce, FL, with eight replications of each selection. The seedlings were fertilized, watered, but received minimal pest management care.

Evaluations were made twice a year, usually in March and October, for the first three years, then annually in October for years four through six. Mature leaf samples were collected from each plant, selecting HLB symptomatic leaves if they were present. The DNA extractions from the samples were tested by qPCR for multiple regions of the HLB genome. The COX gene (mitochondrial


regiones del genoma de HLB. El gen COX (gen citocromo c oxidasa mitocondrial) de las plantas hospedantes se utilizó como control interno para determinar la calidad de las extracciones de ADN. Los valores del ciclo de corte (Ct) de la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) inferiores a 40 muestran la detección del gen buscado. Los valores Ct de 40 se consideraron negativos al patógeno asociado a HLB. Al finalizar el experimento de seis años, los datos se analizaron cuidadosamente para determinar la reacción de las accesiones al desafíocon HLB. En lugar de clasificar las plantas como susceptibles o resistentes, pudimos ubicarlas en ocho categorías diferentes. En la sección que sigue, los números en paréntesis que siguen al nombre científico del cultivar corresponden al número de la accesión. Al buscar el nombre del cultivar, aparecerá la información específica sobre esa accesión en la página web de la Colección de Variedades de Cítricos (www.citrusvariety.ucr.edu).

ResuLTADosLas categorías identificadas en este experimento de desafío con HLB son:

Categoría 1: Inmune, nunca se detectó el patógeno. Ejemplos: Glycosmis pentaphylla ‘Orange Berry’ (3285), Clausena excavata ‘Pink wampee’ (3166).

Categoría 2: Resistente, replicación transitoria, ausencia de síntomas de HLB, generalmente negativa a la prueba de qPCR. Un ejemplo es el híbrido de Eremocitrus glauca, Australian desert lime (4105). Los valores Ct usuales para las accesiones de esta categoría se muestran en la Figura 3a. Otros ejemplos son Murraya paniculata ‘orange jasmine’ (1637), Zanthoxylum ailanthoides y Murraya koenigii ‘Curry leaf’ (3165).

Categoría 3: Altamente tolerante, bajos niveles de CLas detectados por qPCR, alguna variación en las plántulas. Ejemplo: Microcitrus australasica, ‘Australian finger lime’ (1484). Ver ejemplo en la Figura 3b. Otros ejemplos son Citrus halimii ‘Mountain’ citron (3780) híbrido de Microcitrus (Microcitrus australis x Calamondin) (1466), y Microcitrus inodora ‘Large-leaf Australian wild lime’ (3785).

Categoría 4: Tolerante, son afectados por HLB, pero se recuperan y resultan negativos a las

cytochrome c oxidase gene) from plant hosts was used as an internal control to determine the quality of the DNA extractions. Quantitative real-time PCR (qPCR) cycle threshold values (Ct) less than 40 show that the target gene was detected. Ct values of 40 are considered negative for the HLB pathogen. At the end of the six-year trial, the data were carefully analyzed to determine the reaction of the accessions to HLB challenge. Instead of classifying the plants as susceptible or resistant, we were able to assign the plants into eight different categories. In the section that follows, the numbers in parenthesis following the scientific name or cultivar name is the accession number. Searching for the cultivar name will bring up the specific information on that accession in the CVC web page (www.citrusvariety.ucr.edu).

ResuLTsThe categories identified in this HLB challenge experiment are:

Category 1: Immune, no pathogen ever detected. Examples are: Glycosmis pentaphylla ‘Orange Berry’ (3285), Clausena excavata ‘Pink wampee’ (3166).

Category 2: Resistant, transient replication, absence of HLB symptoms, usually test negative by qPCR. An example is Eremocitrus glauca hybrid, Australian desert lime (4105). Typical Ct values for accessions of this category are shown in Figure 3a. Other examples are Murraya paniculata ‘orange jasmine’ (1637), Zanthoxylum ailanthoides, and Murraya koenigii ‘Curry leaf’ (3165).

Category 3: Highly tolerant, low levels of CLas detected by qPCR, some seedling variation. An example is Microcitrus australasica, ‘Australian finger lime’ (1484). See example in Figure 3b. Other examples are Citrus halimii ‘Mountain’ citron (3780), Microcitrus hybrid (Microcitrus australis x Calamondin) (1466), and Microcitrus inodora ‘Large-leaf Australian wild lime’ (3785).

Category 4: Tolerant, become HLB affected but recover and test negative for CLas. An example


pruebas de CLas. Ejemplo: Murraya paniculata ‘Hawaiian mock orange’ var. ‘Ovatifoliolata’ (3171). Ver ejemplo en la Figura 3c. Otros ejemplos son Balsamocitrus daweii ‘Uganda powder flask’ (3514), Aegle marmelos ‘Indian bael’ fruit, Aeglopsis chevalieri ‘Chevalier’s Aeglopsis’ (2878), Microcitrus australis ‘lima redonda australiana’ (3673), y Citrus latipes ‘Khasi’ papeda (3052).

Categoría 5: Tolerante, infección tardía por CLas. Ejemplo: Poncirus trifoliata var. ‘Little-leaf’ (accesión 4007). Ver ejemplo en la Figura 3d. El otro ejemplo es XCitroncirus (mandarino Cleopatra x P. trifoliata) ‘X639’ híbrido de trifoliado (3957).

Categoría 6: Susceptible, síntomas fuertes de HLB la enfermedad siempre es detectada, pero hay retención de hojas durante seis años. Ejemplos: Citrus medica cidra ‘Diamante’ (3523), C. amblycarpa mandarino ‘Nasnaran’ (2485), C. aurantifolia ‘India’ lime (2450), C. aurantium naranjo agrio ‘Olivelands’ (2717) y otras 34 accesioness de Citrus.

Categoría 7: Susceptible, muerte por HLB después de cuatro años. Ejemplos: Citrus sinensis ‘Pineapple’ sweet orange (3858), C. aurantifolia lima ‘Mexicana’ (3822), C. aurantium naranjo agrio ‘Goutoucheng’ (3929), y otras 22 accesiones de Citrus.

Categoría 8: Susceptible, muerte por HLB después de dos años. Hubo cinco accesiones: Citrus reticulata mandarino Unnamed (3812), C. aurantium naranjo agrio var. salicifolia (3289), C. nobilis mandarino ‘King’ (3845), C. reticulata mandarino ‘Parson’s Special’ (300), e híbridos de C. reticulata (Clementine x Orlando) mandarino ‘Lee’ (3851).

Dentro del género Citrus, cinco accesiones pertenecían a la categoría 8; 25 a la 7; 32 a la 6; una [Citrus latipes ‘Khasi’ papeda (3052)] a la 4; y una [Citrus halimii ‘Mountain citron’ (3780)] a la 3. Es de destacar que todos los tipos de cítricos comerciales están en las categorías susceptibles. Información más detallada aparece en Ramadugu et al. (2016).

En el cruzamiento de variedades comerciales de cítricos en busca de resistencia / tolerancia a HLB, las limas australianas son de especial interés porque son sexualmente compatibles con Citrus y

is Murraya paniculata ‘Hawaiian mock orange’ var. ‘Ovatifoliolata’ (3171). See example in Figure 3c. Other examples are Balsamocitrus daweii ‘Uganda powder flask’ (3514), Aegle marmelos ‘Indian bael’ fruit, Aeglopsis chevalieri ‘Chevalier’s Aeglopsis’ (2878), Microcitrus australis ‘Australian round lime’ (3673), and Citrus latipes ‘Khasi’ papeda (3052).

Category 5: Tolerant, delayed infection by CLas. An example is Poncirus trifoliata var. ‘Little-leaf’ (accession 4007). See example in Figure 3d. The other example is XCitroncirus (Cleopatra mandarin x P. trifoliata) ‘X639’ trifoliate hybrid (3957).

Category 6: Susceptible, strong HLB symptoms, CLas always detected, but retained leaves for six years. Examples are: Citrus medica ‘Diamante’ citron (3523), C. amblycarpa ‘Nasnaran’ mandarin (2485), C. aurantifolia ‘India’ lime (2450), C. aurantium ‘Olivelands’ sour orange (2717) and 34 other accessions of Citrus.

Category 7: Susceptible, died of HLB after four years. Examples are Citrus sinensis ‘Pineapple’ sweet orange (3858), C aurantifolia ‘Mexican’ lime (3822), C. aurantium ‘Goutoucheng’ sour orange (3929), and 22 other Citrus accessions.

Category 8: Susceptible, died of HLB within two years. There were five accessions: Citrus ret iculata Unnamed mandarin (3812), C. aurantium sour orange var. salicifolia (3289), C. nobilis ‘King’ mandarin (3845), C. reticulata ‘Parson’s Special’ mandarin (300), and C. reticulata hybrid (Clementine x Orlando) ‘Lee’ mandarin (3851).

Within the Citrus genus, five accessions belonged to Category 8; 25 accessions were Category 7; 32 accessions were Category 6; one accession [Citrus latipes ‘Khasi’ papeda (3052)] belonged to category 4; and one accession [Citrus halimii ‘Mountain citron’ (3780)] belonged to category 3. Note that all commercial citrus types are in the susceptible categories. More detailed information may be found in Ramadugu et al. (2016).

For breeding commercial citrus for resistance and/or tolerance to HLB, the Australian limes are of special interest because they are graft- and sexually compatible with Citrus (Figure 4).


Figura 3. Ejemplos de datos de qPCR. Esta tabla muestra los valores COX Ct de los años 2010, 2011, y 2012, y los ensayos de qPCR para CLas para esos mismos años. Los valores Ct de 40 son negativos mientras que los valores inferiores a 40 indican la presencia del gen objetivo. Una Ct de 40 para el gen citrícola endógeno COX indica un fallo en la extracción/PCR de esa muestra, pero si se detecta COX y CLas no está presente, ello indica la ausencia del patógeno asociado a HLB y es una prueba qPCR válida.A: Datos de qPCR de una accesión ubicada en la categoría 2, resistente a HLB. Este ejemplo es de un híbrido de Eremocitrus glauca. Los datos muestran la replicación transitoria de la bacteria asociada con HLB, pero generalmente resulta negativo a la prueba qPCR. B: Ejemplo de qPCR para una accesión designada como categoría 3, altamente tolerante con bajos niveles de CLas, de acuerdo a los resultados por qPCR, pero con alguna variación en las plántulas. El ejemplo utilizado aquí es de Microcitrus australasica ‘Australian finger lime’. Algunos árboles fueron susceptibles probablemente porque fueron plántulas polinizadas abiertamente y probablemente eran híbridos de Microcitrus y Citrus. Se observó que las plantas originales fuentes de semillas de Microcitrus australasica eran resistentes a HLB (datos no mostrados aquí). C: Ejemplo de datos de qPCR de una accesión ubicada en la categoría 4, tolerante, que se infectó, pero se recuperó y dio negativa a la prueba. El ejemplo utilizado aquí es de Murraya paniculata ‘Hawaiian mock orange’. de CLas. El ejemplo usado aquí es de Poncirus trifoliata ‘Little leaf’’.D: Ejemplo de datos de qPCR para una accessión ubicada en la categoría 5, tolerante, con infección tardía.

Figure 3. Examples of qPCR data. This table shows the COX Ct values for the years of 2010, 2011, and 2012, and the qPCR tests for CLas for the same years. Ct values of 40 are negative while values less than 40 indicate the presence of target gene. A Ct of 40 for the citrus endogenous gene COX indicates a failure of extraction/PCR for that sample, but if COX is detected and CLas is not, this indicates absence of the HLB pathogen and is a valid qPCR test.

A b

C D


A: The qPCR data for an accession designated as Category 2, resistant to HLB. This example is from an Eremocitrus glauca hybrid. Data show transient replication of the bacterium associated with huanglongbing (HLB), but usually tests negative by qPCR.B: Example of qPCR data for an accession designated as Category 3, highly tolerant with low levels of CLas as tested by qPCR, but with some seedling variation. The example used here is from Microcitrus australasica ‘Australian finger lime’. Certain trees were susceptible probably because they were open pollinated seedlings and presumably were hybrids of Microcitrus and Citrus. The original seed source plants of Microcitrus australasica were observed to be HLB resistant (data not shown here).C: Example of qPCR data for an accession designated as Category 4, tolerant, become CLas infected but recover and then test negative for CLas. The example used here is from Murraya paniculata ‘Hawaiian mock orange’.D: Example of qPCR data for an accession designated as Category 5, tolerant, with delayed infection by CLas. The example used here is from Poncirus trifoliata ‘Little leaf’’.

también por injerto (Figura 4). En la Universidad de California, se han obtenido numerosos híbridos a partir de cruces exitosos utilizando ‘Australian finger lime’, mandarinos y Poncirus trifoliata como progenitor de semillas y utilizando polen de P. trifoliata, Eremolemon, pummelo, ‘Australian desert limes’ y ‘Australian finger limes’. Los híbridos obtenidos se evaluaron para conocer su resistencia a HLB mediante experimentos en invernaderodonde los vectores se alimentaron activamente de plantas infectadas y después fueron confinados y forzados a alimentarse de hojas de las plantas bajo investigación. Vea el ejemplo en la Figura 5. Estos experimentos han demostrado que la resistencia a HLB es heredable. Para verificar que la planta realmente es un híbrido, en ocasiones se necesita secuenciar una parte del genoma del híbrido.

Esta parcela de campo también se inspeccionó para detectar la colonización del psílido (Westbrook et al., 2011). Casimiroa edulis, comúnmente conocida como ‘White sapote’ (Mamey blanco), fue el único genotipo evadido totalmente por el psílido. En Poncirus trifoliata ‘Little-leaf’, se encontraron niveles muy bajos del psílido, lo cual pudo haber contribuido a que este genotipo fuera ubicado en la categoría 5. Sin embargo, P. trifoliata fácilmente forma híbridos con Citrus, y esta característica puede ser útil en el desarrollo de híbridos que no sean hospedantes preferidos por el vector.

At UCR, several hybrids have been obtained from successful crosses using Australian finger lime, mandarins, and Poncirus trifoliata as the seed parent and using pollen from P. trifoliata, Eremolemon, pummelo, Australian desert limes, and Australian finger limes. The hybrids obtained have been screened for resistance to HLB by greenhouse experiments where ACPs actively feeding on CLas infected plants are caged and forced to feed on the leaves of the test plants. See the example in Figure 5. These experiments have shown the resistance to HLB is heritable. Sequencing a part of the hybrid genome is often needed to verify the plant is, in fact, a hybrid.

This field plot was also surveyed for colonization by the ACP (Westbrook et al., 2011). Casimiroa edulis, commonly known as ‘White sapote’, was the only genotype completely avoided by the ACP. Very low levels of the ACP were found on Poncirus trifoliata ‘Little-leaf’. The low level of ACP on this genotype may have contributed to this genotype being placed in Category 5. However, P. trifoliata readily forms hybrids with Citrus, and this trait may be useful in development of hybrids which are not preferred hosts of ACP.


Figura 4. Ejemplos de los limeros australianos resistentes y tolerantes a HLB seleccionados para transferir la resistencia a HLB hacia los cítricos, mediante cruzamientos.Figure 4. Examples of the HLB resistant and tolerant Australian limes selected for breeding HLB resistance into Citrus.

Resumen Y DisCusiÓnNuestra estrategia de desarrollar una fuerte resistencia a HLB en cítricos comerciales es única ya que tratamos de transferir la resistencia a partir de parientes lejanos de los cítricos nativos de Australia. Estas fuentes de géneros afines de los cítricos resistentes a HLB han sido filogenéticamente distintas de Citrus durante casi 3,5 millones de años (Schwartz et al., 2012). Los experimentos realizados han demostrado que esa resistencia a HLB es heredable y se segrega en la progenie híbrida.

La genotipificación de poblaciones resistentes y susceptibles a HLB puede ser útil para identificar marcadores asociados con la resistencia a HLB, lo cual facilita y acelera la selección de híbridos potencialmente útiles con resistencia a la enfermedad. Actualmente, cada híbrido ha de desafiarse con el patógeno asociado a HLB para determinar si es susceptible o resistente. Los marcadores desarrollados a través de la

summARY AnD DisCussionOur approach to developing strong resistance to HLB in commercial citrus is unique as we are trying to transfer the resistance from distant citrus relatives native to Australia. These sources of HLB resistant citrus relative genera have been phylogenetically distinct from Citrus for about 3.5 million years (Schwartz et al., 2012). Experiments have shown that this resistance to HLB is heritable and segregates in the hybrid progeny.

Genotyping of HLB resistant and susceptible hybrid populations may be useful in identifying markers associated with HLB resistance, thus making selection of potentially useful hybrids having HLB resistance easier and quicker. Currently, each hybrid plant must be challenged with the HLB pathogen to determine if it is susceptible or resistant. The markers developed through genotyping would help in the identification


Figura 5. Ejemplo que muestra que la resistencia a HLB de los géneros afines de los cítricos es heredable. En este ejemplo, se muestra que el ‘Eremolemon’, híbrido natural de Eremocitrus glauca cruzado con limonero ‘Meyer’, es resistente a HLB, lo que se demostró al forzar psílidos a alimentarse de sus hojas después de haberse alimentado de plantas infectadas. La prueba qPCR se realizó unos nueve meses después del desafío con los psílidos. Nótese que la forma de la hoja del híbrido ‘Eremolemon’ es intermedia entre E. glauca y el limonero ‘Meyer’.Figure 5. An example showing that the HLB resistance in citrus relatives is heritable. In this example, ‘Eremolemon’, a natural hybrid of Eremocitrus glauca crossed with a ‘Meyer lemon’, is shown to be HLB resistant as proven by forcing psyllids to feed on the plants’ leaves after the psyllids had been fed on CLas infected citrus hosts. Testing by qPCR was performed about nine months after the psyllid challenge. Note that the leaf shape of the hybrid ‘Eremolemon’ is intermediate between E. glauca and the ‘Meyer lemon’.

genotipificación ayudarían a la identificación de genes implicados en la resistencia a la enfermedad. Si se conocen los genes que causan la resistencia, entonces sería posible complementar el cruzamiento tradicional con métodos de ingeniería genética para transferir los caracteres de resistencia aHLB a cítricos comerciales.

La transferencia de resistencia a HLB a partir de géneros afines a los cítricos por métodos de cruzamiento convencionales es un proceso largo. Sin embargo, hay limitaciones con el uso de la

of the gene(s) involved in imparting resistance to HLB. If the gene(s) which cause resistance are known, it would then be possible to complement the traditional breeding with genetic engineering approaches to transfer the HLB-resistant traits to commercial citrus.

Transferring HLB resistance from citrus relatives to commercial citrus by conventional breeding methods is a long term process. However, there are also limitations when using genetic


ingeniería genética. Como la transformación de cítricos adultos no es eficaz, se suele usar tejido joven de las plántulas para generar cítricos transgénicos. Se desconoce exactamente qué gen insertar en las plantas modificadas genéticamente para lograr resistencia, y la planta transformada resultante aún requiere de una evaluación horticultural lo cual lleva varios años. Los requerimientos regulatorios para la aprobación de frutas cítricas transgénicas requieren mucho tiempo. Existe también una predisposición del consumidor ante el consumo de frutos transgénicos. Teniendo en cuenta estos factores, la vía de utilizar métodos de cruzamiento convencionales para obtener cítricos resistentes a HLB puede no ser más prolongada que utilizar métodos de ingeniería genética, y la preocupación del consumidor sobre los frutos transgénicos no sería un problema.

El desarrollo de cítricos resistentes a HLB, sea por métodos tradicionales o por ingeniería genética, permitiría una producción sostenible de cítricos donde HLB sea endémica y reduciría grandemente el empleo de plaguicidas. Los beneficios ambientales incluirían la protección de insectos beneficiosos como las abejas y otros utilizados como controles biológicos de plagas comunes. Como se destaca en la Figura 2C, los costos de producción de cítricos se han incrementado casi tres veces con los intentos de “vivir con el HLB”. Los cítricos resistentes a esta enfermedad darían como resultado menores costos de manejo, niveles de producción más altos y una industria citrícola sostenible.

engineering approaches. Since mature citrus transformation is not effective, juvenile seedling tissue is typically used for generating transgenic citrus. Exactly what gene to insert into genetic engineered plants to achieve resistance is unknown, and the resultant transformed plants still need to be evaluated horticulturally which takes several years. The regulatory requirements for approval of transgenic citrus fruit are time consuming. There is also a consumer bias against consumption of transgenic fruit. Considering these factors, the approach of using traditional breeding methods to obtain HLB resistant citrus may not be any longer than using the genetic engineering approach, and the consumer concern about transgenic fruit would not be a problem.

The development of HLB resistant Citrus, either by traditional breeding or genetic engineering, would permit sustainable citrus production where HLB is endemic and greatly reduces pesticide usage. Environmental benefits would include the protection of beneficial insects such as honey bees and insects used for biological control of common citrus pests. As noted in Figure 2C, the production costs for citrus have increased about three fold with the attempts to “live with” HLB. Citrus with HLB resistance would result in reduced management costs, higher levels of production, and a sustainable citrus industry.


Barkley, N. A. 2003. Genetic diversity in a citrus germplasm collection characterized with simple sequence repeat markers. Ph.D. Thesis. University of California, Riverside, CA. 197 pgs.

Ramadugu, C., M. L. Keremane, S. E. Halbert, Y. P. Duan, M. L. Roose, E. Stover, and R. F. Lee. 2016. Long-term field evaluation reveals huanglongbing resistance in citrus relatives. Plant Disease 100:1858-1869.

Schwartz, T., S. Nylinder, C. Ramadugu, A. Antonelli, and B. E. Pfeil. 2015. The origin of oranges: a multi-locus phylogeny of Rutaceae subfamily Aurantioideae. Syst. Bot. 40:1053-1062.

Westbrook, C.J., D.G. Hall, E.W. Stover, Y. Duan, and R.F. Lee. 2011. Colonization of Citrus and Citrus-related germplasm by Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae). HortScience 46(7):997-1005.


OBITUARIOS Obituaries

La Coordinación General de la Red Interamericana de Cítricos (RIAC), desde las páginas de este número de Cítricos en las Américas, desea expresar sus condolencias por el fallecimiento de tres especialistas que dedicaron su vida a la citricultura mundial. La RIAC desea además reconocer su contribución en la formación de citricultores y especialistasy su apoyo desinteresado a las actividades de la Red.

Philip A Stansly, Doctor, 74 años de edad, falleció el 12 de septiembre de 2018 en Fort Myers.

Nació el 5 de mayo de 1944, hijo de Philip G y Marguerite (Anzolut) Stansly.

Sus estudios incluyeron: Licenciatura en zoología de la Universidad Estatal de Wayne, 1968; maestría en zoología de la Universidad de Oklahoma, 1978; Doctorado en Entomología por la Universidad Texas A&M, 1984.

Vivió y trabajó durante un año o más en Francia, Níger, México, Venezuela, Ecuador y España, y hablaba español y francés. Stansly conoció a su esposa mientras hacía su investigación de doctorado en México. Tuvo dos hijos y dos hijas.

Trabajó como Entomólogo en la Universidad de la Florida por más de 30 años.

Recibió varios premios: A Davis Productivity Award de la UF; dos Premios de Logros para la Entomología de Extensión de la Sociedad de Entomología de la Florida (de los cuales se desempeñó como presidente en 2015–2016); elogios de la Asociación de Productores

The General Coordination of the Inter-American Citrus Network (IACNET) from the pages of this issue of Citrus in the Americas, wishes to express its condolences for the death of three specialists who dedicated their lives to the global citrus industry. IACNET also wishes to acknowledge its contribution in the training of citrus farmers and specialists and its support for the activities of the Network.

Philip A Stansly, Ph.D. age 74, passed away September 12, 2018 in Fort Myers.

He was born May 5, 1944, to Philip G and Marguerite (Anzolut) Stansly.

His studies included: Bachelor’s degree in zoology from Wayne State University, 1968; master’s degree in zoology from University of Oklahoma, 1978; doctorate in entomology from Texas A&M University, 1984

He lived and worked for a year or more in France, Niger, Mexico, Venezuela, Ecuador and Spain, and spoke Spanish and French. Stansly met his wife Silvia Linares while doing doctorate research in Mexico. He had two sons and two daugthers.

He was an Entomologist for the University of Florida for over 30 years.

He received several awards: A Davis Productivity Award from UF; two Achievement Awards for Extension Entomology from the Florida Entomological Society (which he served as president in 2015–2016); commendations from Gulf Citrus Growers Association



de Cítricos del Golfo y la Junta de Comisionados del Condado de Collier por su servicio a la industria de los cítricos.

Dr. Stansly deja a su querida familia, pero deja también su legado a esa gran familia de citricultores y científicos que siempre lo recordarán por su entrega, entusiasmo y sabiduría.

Stephen Garnsey nació en Oceanside en 1937, y se crió en DeLuz. Falleció el 22 de mayo de 2018.

Comenzó su educación en la escuela de una sola aula en DeLuz (actualmente Centro Ecológico de DeLuz), cursó estudios secundarios en Fallbrook, y después obtuvo el grado de Licenciado en Botánica en la Universidad de California, Riverside en 1958, y más adelante, se doctoró en Fitopatología en dicha Universidad, en 1964.

Steve tuvo una larga e ilustre carrera como virólogo de cítricos. Realizó trabajos innovadores sobre identificación, epidemiología y control de enfermedades devastadoras de los cítricos.

Resultó miembro electo de la Sociedad Americana de Fitopatología (APS) y de la Organización Internacional de Virólogos de Cítricos (IOCV); publicó cientos de artículos en medios científicos y fue autor y coautor de numerosos capítulos de libros sobre varios aspectos de la citricultura.

Steve contrajo nupcias con su esposa Rosalee en 1958. Su primera hija, Lisa, nació en California, y cuando a Steve le ofrecieron un empleo en la Estación Experimental de Cítricos de Orlando, toda la familia se radicó en Florida.

and Collier County Board of Commissioners for service to the citrus industry.

Dr. Stansly leaves behind his loving family, but leaves also his legacy to the large citrus family made up of growers and scientists who will always remember him for his devotion, enthusiasm and wisdom.

Stephen Garnsey was born in Oceanside in 1937, and was raised in DeLuz. He passed away on May 22, 2018.

Steve started his education at the DeLuz one-room Schoolhouse (now the DeLuz Ecology Center), attended Fallbrook High School, then went on to earn a BS in Botany at University of California Riverside in 1958 and then a PhD in Plant Pathology at the same university in 1964.

Steve had a long and illustrious career as a citrus virologist. He did groundbreaking work on the identification, epidemiology and control of devastating citrus diseases.

He was an elected fellow of both the American Phytopathological Society (APS) and the International Organization of Citrus Virologists (IOCV), published several hundred research articles in scientific journals, and was the author/co-author of a number of book chapters on various aspects of citrus disease.

Steve married his wife Rosalee in 1958. Their first child, Lisa, was born in California, and when Steve was offered a job at the Citrus Experiment Station in Orlando, the whole family headed off to Florida.


Después de 36 años de trabajo con el Departamento de Agricultura de Estados Unidos, fue nombrado Profesor Adjunto de la Universidad de Florida.

Rolando Riaño González, nació un 27 de julio de 1957 en Pedro Betancourt, Matanzas, Cuba. Falleció el 25 de septiembre de 2017.

Desde joven se destacó por su inteligencia y tenacidad, comenzó su vida laboral en 1976 en la entonces Empresa de Cítricos “Victoria de Girón”, escenario donde desarrollaría su futura vida laboral y profesional, con muestras de un extraordinario sentido de pertenencia.

Riaño creció como los grandes, desde la base, nunca perdió el sentido de la sencillez y la austeridad. Si alguien pensó y actuó como citricultor, ese fue Riaño. Nunca fue un hombre de silencio, escribió su historia, creó una familia, formó a sus hijos, sembró árboles y entregó talento y sabiduría a la citricultura jagüeyense y cubana hasta sus últimas horas.

Con solo 31 años desplegó un intenso trabajo que en 1991 lo convirtió en Director de la Granja 4. Posteriormente, en 1997, se incorporó a la Junta Directiva de la Empresa.

Como parte del proceso de perfeccionamiento empresarial, Riaño se desempeñó como Director Adjunto de la Unidad de Servicios Técnicos y en el año 2002, fue promovido a Director de Desarrollo de la Empresa.

A pesar de su enfermedad, se mantuvo activo hasta horas antes de su fallecimiento. Su desaparición física no impidió que nos legara su sencillez y sensibilidad, su pensamiento y palabra valiente, su altruismo y modestia.

After 36 years working with the USDA, he was appointed as an Adjunct Professor at the University of Florida.

Rolando Riaño González, was born on July 27th, 1957 in Pedro Betancourt, Matanzas, Cuba. He passed away on September 25, 2017.

Since he was young he stood out by his intelligence and tenacity. His working life began in 1976 at the then Citrus Enterprise “Victoria de Girón”, the place where he developed his future labor and professional life with an extraordinary sense of ownership.

Riaño grew up like the greats, from the grassroot, he never lost his naturalness and austerity. If someone thought and worked like a citrus grower, that was Riaño. He was never a silent man, he wrote his history, he created a family, he educated his children, he planted trees and gave out talent and wisdom to Jagüey Grande and Cuba’s citriculture till his last hours.

With barely 31 years, he worked intensively and in 1991 he became Manager of Farm No. 4. Later on, in 1997, he joined the Board of Directors of the Enterprise.

As part of the managerial improvement process, Riaño became Assistant Director of the Technical Service Unit and in 2002, he was promoted to Development Manager of the enterprise.

In spite of his disease, he remained active till hours before passing away on September 25th, 2017. His physical disapperance did not prevent us from keeping his naturalness and sensitivity, his thoughts and corageous speech, his altruism and modesty.

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