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The red blood cell membrane: structure and functions

Massimiliano Bruno-Franco, Clemente Mazzei

Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale, ASL1 Imperiese, Imperia, Italia

Received: 20 January 2004 - Accepted: 23 February 2004Correspondence:Dott. Massimiliano Bruno-FrancoVia L. Brea 6718100 Imperia, Italia

Introduzione

La membrana eritrocitaria presenta una struttura di basecomune a quella di tutte le cellule eucariote, risulta cioècostituita da un doppio strato fosfolipidico con lacomponente proteica stabilizzata nel foglietto lipidico dalegami idrofobici e legami covalenti1. La compomenteglucidica complessata a formare glicoproteine e glicolipidisi trova unicamente sul versante extracellulare e costituisceil cosiddetto glicocalice. Al di sotto delle membrana cellularetroviamo una struttura poligonale multicomponente, ilmembranoscheletro, che conferisce forma, flessibilità,elasticità e deformabilità durante il passaggio degli eritrocitiattraverso i diversi distretti circolatori e, in particolare.attraverso il microcircolo capillare. Come per tutte le cellule,anche per gli eritrociti troviamo una stretta correlazione trastruttura e funzione biologica. Dal punto di vista puramentedescrittivo, andremo di seguito a definire: il doppio stratolipidico, la componente proteica e glicoproteica ( molte diqueste strutture veicolano determinanti antigeniciappartenenti ai principali sistemi gruppoematici) e, infine, ilmembranoscheletro (Figura 1). La membrana cellularedefinisce fisicamente il limite della cellula, conferisce allacellula struttura, composizione e aspetto, media i rapportidella cellula con l'ambiente circostante, attribuisce capacitàdi adesione, risulta essenziale per tutti i meccanismi diriconoscimento e comunicazione cellulare, modula il rilascioe l'assunzione di sostanze; veicola, inoltre, diversi messaggidal versante extracellulare a quello intracellulare(trasduzione del segnale)2.

Doppio strato lipidico

La struttura di base di tutte le membrane biologichedegli eucarioti si riscontra non solo a livello della membrana

Introduction

The red cell membrane shares the same basic structureas that of all eukaryotic cells in that it is formed of a doublelayer of phospholipids with the protein componentstabilised in the lipid leaflet by hydrophobic bonds andcovalent bonds1. The carbohydrate component, complexedto form glycoproteins and glycolipids, is found exclusivelyon the extracellular side and forms the so-called glycocalyx.Below the cell membrane there is a polygonalmulticomponent structure called the membranecytoskeleton, which confers shape, flexibility, elasticity anddeformability to the red cells as they pass through thevarious parts of the circulatory system, particularly thecapillary microcirculation. There is a strong correlationbetween structure and biological function in red blood cells,as indeed there is in all cells. From a purely descriptivepoint of view, this review is divided into sections on: thelipid bilayer, the protein and glycoprotein components(many of these structures carry particular antigensbelonging to the main blood group systems) and, finally,the membrane skeleton (Figure 1). The cell membranedefines the physical boundary of the cell, confers the cellwith its structure, composition and appearance, mediatesrelations between the cell and its surrounding environment,confers adhesive properties, is essential for all mechanismsof cell recognition and communication, modulates therelease and uptake of substances and, furthermore, carriesvarious messages from the extracellular side to theintracellular one (signal transduction)2.

Review

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plasmatica, ma delimita anche differenti organulicitoplasmatici (membrana mitocondriale, membrananucleare, complesso del Golgi, reticolo endoplasmaticoliscio e rugoso). Il doppio foglietto lipidico è costituitoprincipalmente da fosfolipidi e, in misura minore, dacolesterolo, con le teste polari rivolte verso l'esterno e lecode idrofobiche rivolte verso l'interno, a costituire il coreidrofobico impermeabile alle molecole di acqua e ai solutipolari3,4. I lipidi formano spontaneamente strutturetridimensionali se immerse in un mezzo acquoso; inparticolare, tendono a formare un foglietto a doppio strato,che risulta la struttura termodinamicamente più stabile edenergeticamente meno dispendiosa5. La componentefosfolipidica conferisce fluidità alla membrana. Sono stati,infatti, dimostrati movimenti dei fosfolipidi nell'ambito deldoppio strato lipidico, movimenti di diffusione laterale,rotazionali e di diffusione trasversale (più rari edenergeticamente dispendiosi, mediati da enzimi appositi:"flippasi" ATP dipendenti)6, come illustrato in figura 2.

I lipidi di membrana rappresentano il 50-60 % della massadella membrana eritrocitaria. La componente fosfolipidicarisulta essere così distribuita: fosfatidilcolina (28% deifosfolipidi), fosfatidiletanolamina (27%), sfingomielina(26%), fosfatidilinositolo (13%). In particolare, ilfosfatidilinositolo rappresenta il precursore di importantisecondi messaggeri che modulano il trasporto del Calcio el'interazione tra la membrana e il citoscheletro. Il colesteroloè presente in forma libera non esterificata e controllaprincipalmente la fluidità della membrana (l'anello rigidodel colesterolo abbassa la fluidità della membrana). Lafluidità del doppio strato dipende ancora dalla temperaturacui viene esposta la membrana e dalla lunghezza e dal gradodi saturazione degli acidi grassi costituenti i fosfolipidi (ilgrado di fluidità aumenta col grado di insaturazione)7.

The lipid bilayer

The basic structure of all biological membranes ofeukaryotes is found not only in the plasma membrane, butalso delimiting various cytoplasmic organelles(mitochondrial membrane, nuclear membrane, the Golgiapparatus, smooth and rough endoplasmic reticulum). Thisbasic structure, a double layer of lipids, formed mainly byphospholipids and, to a lesser extent, by cholesterol, haspolar heads facing outwards and hydrophobic tails facinginwards into the cell, thus forming a hydrophobic core thatis impermeable to water molecules and to polar solutes3,4.Lipids spontaneously form three-dimensional structures ifimmersed in an aqueous solution; in particular, they tendto form a double-layered leaflet because this is their mostthermodynamically stable conformation with least energyexpenditure5. The phospholipid component confers fluidityto the membrane. In fact, the phospholipids have beenshown to move in various ways in the lipid bilayer: theycan undergo lateral, rotational and transbilayer movements(this last type of movement being the least common, sinceit requires more energy, and is mediated by appropriateATP-dependent "flippases")6, as illustrated in figure 2.

The lipids constitute about 50-60% of the mass of thered cell membrane. The phospholipid component isdistributed as follows: phosphatidylcholine (28% of thephospholipids), phosphatidylethanolamine (27%),sphingomyelin (26%), and phosphatidylinositol (13%).Phosphatidylinositol, in particular, is an important precursorof secondary messengers that modulate calcium transportand interactions between the membrane and thecytoskeleton. Cholesterol is present in its non-esterified,free form and principally controls the membrane's fluidity(the rigid ring of cholesterol diminishes membrane fluidity).

Figure 1 - Structure of the red blood cell membrane


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M Bruno-Franco, C Mazzei

Componente proteica

Dal punto di vista puramente strutturale, distinguiamoprincipalmente proteine periferiche, che risultanodebolmente associate alla membrana, facilmente estraibilicon blandi reagenti come, ad esempio, i sali e le proteineintegrali inserite nel doppio strato lipidico, estraibili tramitedetergenti. Attualmente le proteine integrali di membrana,dal punto di vista strutturale, possono essere a struttura"monopasso", che attraversano, cioè, una sola volta ildoppio strato lipidico o "multipasso", in quantoattraversano più volte il foglietto fosfolipidico8. La maggiorparte delle proteine integrali formano interazioni di tipo noncovalente con i fosfolipidi di membrana (interazioni di tipoidrofobico), mentre alcune strutture proteiche formanoinvece legami di tipo covalente con la componente lipidica(tipica àncora al glicosilfosfatidilinositolo, o GPI)9, comeillustrato in figura 3. La maggior parte delle proteine integralidi membrana svolgono importanti funzioni biologiche: inparticolare, sono state identificate proteine che fungonoda canali e trasportatori, da recettori per ligandi esogeni edendogeni, da molecole di adesione e da enzimi. Molte diqueste proteine sono poi conosciute in ambitoimmunoematologico, in quanto presentano determinantiantigenici appartenenti ai principali sistemi gruppoematici10.Di seguito, andremo ad analizzare le differenti classi diproteine con particolare attenzione sia alle funzioni sia airisvolti immunoematologici.

Proteine con funzione di trasporto

Si tratta di una classe di proteine e di glicoproteineintegrali di membrana, che svolgono la specifica funzionedi facilitare il passaggio attraverso il doppio strato lipidicodi soluti polari, che, per la presenza di cariche elettrichesuperficiali, non sarebbero in grado di attraversare lamembrana eritrocitaria. Risultano essenziali per ilmetabolismo della cellula ma anche per il mantenimento diun'omeostasi sistemica con particolare riferimentoall'equilibrio acido-base11. Alcune di queste molecolesvolgono poi importanti funzioni strutturali consolidandola forma della membrana e presentando interazioni con ilsottostante membranoscheletro.

Proteina della Banda 3. La proteina della Banda 3 èuna delle proteine integrali più rappresentate a livellomembranario (106 copie/cellula), dal peso molecolare di 90kDa. Strutturalmente, è presente in forma dimerica etetramerica e possiede due differenti domini funzionali. Ildominio citosolico amminoterminale di 43 kDa è in grado di

The fluidity of the lipid bilayer also depends on thetemperature to which the membrane is exposed and thelength and degree of the saturation of the fatty acids in thephospholipids (fluidity increases as the degree ofunsaturation increases)7.

Protein component

From a purely structural point of view, the membraneproteins can be divided into peripheral proteins, which areweakly associated with the membrane, easily extracted bybland reagents such as salts, and the integral proteins fixedin the double lipid layer, which can be extracted bydetergents. From a structural point of view, the integralmembrane proteins can be "single span", which, as theirname suggests, cross the lipid bilayer only once, or"multispan", since they cross the phospholipid leaflet morethan once8. Most of the integral membrane proteins formnon-covalent bonds with the membrane phospholipids(hydrophobic type interactions), although some proteinstructures do actually form covalent bonds with the lipidcomponent (typically anchoring to theglycosylphosphatidylinositol, or GPI)9, as illustrated infigure 3.

Most of the integral membrane proteins have importantbiological functions: in fact, proteins can act as channelsand carriers, receptors for exogenous and endogenousligands, adhesion molecules and enzymes. Most of theseproteins are known to immunohaematologists, since theyhave antigenic determinants belonging to the main blood

Figure 2 - Movements of phospholipids in the membrane

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interagire con differenti enzimi delle via glicolitica, dimodularne l'attività e di stabilire contatti con proteine delmembranoscheletro (anchirina, proteina della Banda 4.1 edella Banda 4.2)12,13. Il dominio carbossi-terminaleextracellulare di circa 50 kDa media lo scambio cloruri/bicarbonati attraverso la membrana eritrocitaria. Questomeccanismo è essenziale nel mantenimento dell'equilibrioacido-base, in quanto consente la rimozione di anidridecarbonica a livello del microcircolo, dove viene prodottaad opera dei processi del metabolismo cellulare, e vienerilasciata a livello polmonare, dove viene eliminata con larespirazione. Si tratta di una proteina integrale di membrana"multipasso", che attraversa 14 volte il doppio stratolipidico14 (Figura 4). Questa proteina viene codificata dalgene DI, di cui sono state caratterizzate 21 varianti alleliche.Molti antigeni del sistema Diego si ritrovano sul terzo anelloextracellulare, implicati particolarmente nei processi diinvecchiamento cellulare, nei meccanismi di interazione conil Plasmodium falciparum e di interazione con numerosirecettori endoteliali (VLA-4, CD36, ICAM-1,Trombospondina)15. È ormai accertato che i globuli rossisenescenti vengono degradati a livello splenico ad operadel sistema reticolo-endoteliale in seguito all'esposizionedi alcuni epitopi della Banda 3; in particolare, sembra che aquesti siti si leghino alcuni autoanticorpi presentifisiologicamente, in grado sia di attivare il complementoche di favorire la fagocitosi16,17.

AQP1-Sistema Colton. È una proteina integrale dimembrana facente parte della superfamiglia delle

group systems10. Here below we analyse the differentclasses of protein, focusing on both their functions andtheir immunohaematological implications.

Proteins with transport functions

The transport proteins are a class of integral membraneproteins and glycoproteins that have the specific functionof helping polar solutes to cross the lipid bilayer. Polarsolutes, because of their surface electrical charge, wouldnot otherwise be able to cross the red cell membrane. Thesetransport proteins are essential for cell metabolism but alsofor the maintenance of systemic homeostasis, particularlyacid-base balance11. Some of these molecules haveimportant structural functions, consolidating the shape ofthe membrane and interacting with the underlyingcytoskeleton.

Band 3 protein. Band 3 protein, with a molecular weightof 90 kDa, is one of the most abundant integral proteins ofthe cell membrane (106 copies/cell). It exists in dimeric andtetrameric forms and has two different functional domains.The 43 kDa amino-terminal cytosolic domain can interactwith various different enzymes of the glycolytic pathway,thus modulating metabolic activity, and can establishcontacts with proteins of the membrane skeleton (ankyrin,band 4.1 protein and band 4.2 protein)12,13. The extracellularcarboxy-terminal domain, with a molecular weight of about50 kDa, mediates chloride/bicarbonate exchange across the

Figure 3 - Structure of the various membrane proteins


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Acquaporine. Si tratta di veri e propri canali ionici chedelimitano un "poro" altamente idrofilo nel doppio stratolipidico altamente selettivo per le molecole di acqua18. L'AQP-1 è stata la prima di queste proteine ad essere identificata: sitratta di una proteina di 28 kDa codificata del gene Colton(CO),situato sul braccio corto del cromosoma 7. Il trasportodelle molecole di acqua è estremamente efficace (3x109

molecole di acqua/cellula). Oltre che sulla membranaeritrocitaria,è localizzata a livello dei vasa recta renali, a livellodella membrana basolaterale e apicale del tubulo renaleprossimale e del tratto discendente dell'ansa di Henle. È unaproteina integrale di membrana organizzata in 6 dominitransmembranari, connessi da anelli idrofilici (A-E). L'ansa Bed E risultano essere essenziali per la permeabilità allemolecole d'acqua. È organizzata come tetramero, di cui unasubunità risulta essere N-glicocosilata in corrispondenzadell'asparagina 42, con un polilattosamminoglicano, cheesibisce specificità del sistema gruppo ematico ABO19. Laselettività per le molecole di acqua deriva dalla conformazionetridimensionale dell'ansa B ed E, che delimitano un canale di3 µm, adatto al passaggio delle molecole d'acqua ma non aquello degli altri soluti. Sebbene il fenotipi Co

null sia stato

associato ad alcuni disordini mieloproliferativi, individuicaratterizzati da questo fenotipo sono apparentemente sanie ciò sembra derivare dal fatto che, in questo caso particolare,la carenza di AQP-1 sia compensata dall'up-regulation dialtre proteine aventi una funzione simile20,21. È, infatti,dimostrato l'intervento dell'AQP3 nel mantenimento degliscambi acquosi tra l'interno e l'esterno del globulo rosso22.

red cell membrane. This function is essential for themaintenance of correct acid-base balance since it allowscarbon dioxide, produced as a by-product of cell metabolicprocesses, to be removed from the microcirculation andreleased into the lungs from where it is then eliminatedduring respiration. Band 3 protein is a "multispan" integralmembrane protein, which crosses the lipid bilayer 14 times14

(Figure 4). This protein is coded for by the DI gene, ofwhich 21 allelic variants have been identified. Many of theantigens of the Diego system are found on the thirdextracellular loop and are particularly involved in processesof cell ageing, interactions with Plasmodium falciparumand interactions with numerous endothelial receptors(VLA-4, CD36, ICAM-1, Thrombospondin)15. It is nowwidely accepted that senescent red blood cells are brokendown in the spleen by the reticulo-endothelial systemfollowing exposure of some epitopes of Band 3 protein; inparticular, it seems that some physiologically presentautoantibodies bind to these sites, thus activating thecomplement cascade and facilitating phagocytosis16,17.

AQP1-Colton system. AQP1 is an integral membraneprotein that is a member of the aquaporin superfamily. Thesystem forms real ion channels that border a stronglyhydrophilic "pore", which is highly selective for watermolecules, in the lipid bilayer18. AQP-1 was the first of theseproteins to be identified: this is a 28 kDa protein coded forby the Colton gene (CO), located on the short arm ofchromosome 7. This protein is extremely efficient at carryingwater molecules (3x109 molecules of water/cell). Besides

Figure 4 - Structure of band 3 protein

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Sistema Kidd/hUT-B1, trasportatore d'urea. La primaidea circa la funzione di trasportatore d'urea da parte delleproteine del sistema Kidd è derivata dall'osservazione cheeritrociti Kidd

null presentavano un'aumentata resistenza alla

lisi quando immersi in una soluzione 2 M di urea23. Studisuccessivi hanno poi evidenziato che eritrociti caratterizzatida questo fenotipo presentavano normale permeabilità aicloruri e all'acqua e ridotta permeabilità selettiva allemolecole d'urea24. Dal punto di vista strutturale la molecolatrasportatrice d'urea è una proteina integrale di membranadi 389 amminoacidi con 10 domini transmembranari e 3potenziali siti di N-glicosilazione. La proteina mostra unelevato grado di omologia tra l'estremità amminoterminalee quella carbossiterminale (Figura 5). È un trasportatorealtamente selettivo nei confronti dell'urea, non essendo ingrado di legare e veicolare altri soluti attraverso la membranaeritrocitaria25 . La sua localizzazione è estremamenteeterogenea: infatti, oltre che a livello eritrocitario, può essereriscontrata anche nel tessuto renale e cardiaco, nel cervello,nel timo, nel piccolo intestino e nei testicoli. La funzione ditrasportatore di urea sembra essere un processo critico perl'organismo, dal momento che sta alla base dell'omeostasiidrica. hUT-B1 sembra essere essenziale durante ilpassaggio degli eritrociti attraverso la "medulla renale"26.In particolare, previene il rigonfiamento degli eritrocitiquando questi abbandonano la regione iperosmotica incorrispondenza dell'apice della medulla renale e limita laperdita di urea all'interno della medulla, incrementando inquesto modo l'efficacia dello scambio controcorrente emantenendo il gradiente di osmolarità cortico-papillare,essenziale per i meccanismi di concentrazione delle urine27.Soggetti Kiddk

null non presentano particolari problemi se

non una certa difficoltà a concentrare le urine; non ci sono

being found in the red cell membrane, the protein is alsopresent in the renal vasa recta and in the basolateral andapical membranes of the proximal renal tubule and of thedescending part of Henle's loop. It is an integral membraneprotein organized in 6 transmembrane domains, connectedto hydrophilic loops (A-E). Loops B and E are essential forpermeability to water molecules. The protein is arranged asa tetramer, of which one subunit is N-glycocosylated atasparagine 42, with a polylactosaminoglycan, which showsspecificity for the ABO blood group system19. Theselectivity for water molecules is a consequence of thethree-dimensional arrangement of the B and E loops, whichborder a 3 µm channel that allows passage of watermolecules, but not of other solutes. Although the Co

null

phenotype has been associated with somemyeloproliferative disorders, individuals with thisphenotype are apparently healthy; this is probably becausein this particular case the lack of AQP-1 is compensated forby up-regulation of other proteins with a similarfunction20,21. In fact, it has been demonstrated that AQP-3is involved in maintaining water exchange between theinside and outside of the red cell22.

The Kidd system/hUT-B1, urea transporter. The firstnotions about the urea-transporting function of the Kiddsystem derived from the observation that Kidd

null red blood

cells were more resistant to lysis when immersed in 2 Msolution of urea23. Subsequent studies then showed thatred cells with this phenotype had normal permeability tochloride ions and water and a selectively reducedpermeability to molecules of urea24. From a structural pointof view the urea-transporting molecule is an integralmembrane protein formed of 389 amino acids with 10transmembrane domains and 3 potential N-glycosylation

Figure 5 - Structure of the Kidd system protein


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assolutamente segni di emolisi durante il passaggio deiglobuli rossi attraverso il parenchima renale, per l'innescarsidi meccanismi di compenso ad opera particolarmentedell'AQP-3. Recenti studi vedono la proteina hUT-B1implicata nei meccanismi di spermatogenesi e diproliferazione cellulare28.

Proteine del sistema Rh e trasporto di ammonio. Gliantigeni del sistema Rh si trovano su proteine integrali dimembrana non glicosilate di 30-32 kDa, strettamenteassociate a glicoproteine di membrana di 45-75 kDa, unavolta chiamate glicoproteine Rh50 e attualmente rinominateRhAG (glicoproteine associate a Rh)29. Il cuore di questocomplesso è un tetramero composto da due unità diproteine Rh e due unità RhAG, cui possono legarsi molecoleaccessorie tramite legami non covalenti. Si tratta di proteineeritroidi specifiche; entrambe presentano 12 dominitransmembranari con entrambe le estremità,amminoterminale e carbossiterminale, presenti a livellocitosolico. Le proteine Rh non sono glicosilate, bensìpalmitate. Al contrario, le proteine RhAG sono glicosilate(sull'asparagina 37) a livello del primo anello extracellulare30

(Figura 6). Rh e RhAG sono intimamente connessi colsottostante citoscheletro, garantendo un'importanteconnessione tra il dominio integrale di membrana e lestrutture periferiche31,32. Studi sull'eritropoiesi in vitrohanno dimostrato l'espressione precoce in particolare delleproteine RhAG a livello delle BFU-E (Burst-forming units-erythroid), mentre gli antigeni Rh sono espressi piùtardivamente, indicando che Rh e RhAG vengonosintetizzati e assemblati indipendentemente l'uno dall'altro.Recentemente, è stato supposto che le proteine Rhsvolgano un ruolo essenziale nel mantenimentodell'asimmetria dei fosfolipidi di membrana, attraverso

sites. There is a strong homology between the amino-terminal and carboxy-terminal parts of this protein (Figure5). The protein is a highly selective transporter of urea andis unable to bind or carry other solutes across the red cellmembrane25. It has an extremely heterogeneous distribution:in fact, besides being present in red cells, it can be found inrenal and cardiac tissues, in the brain, thymus, smallintestines and in the testicles. Urea transport seems to becritical to the body, since it underpins water homeostasis.hUT-B1 appears to be essential during the red blood cell'spassage through the renal medulla26. In particular, theprotein prevents the red cells from swelling when they leavethe hyperosmotic region at the apex of the renal medullaand limit the loss of urea within the medulla, in this wayincreasing the efficacy of the counter-current flow exchangeand maintaining the cortico-papillary osmolarity gradientessential for processes of urine concentration27. Kiddk

null

individuals do not have particular health problems exceptfrom a certain difficulty in concentrating urine; theycertainly show no signs of haemolysis as the red bloodcells cross the renal parenchyma because compensatorymechanisms, particularly those of AQP-3, are triggered.Recent studies suggest that the hUT-B1 protein is alsoinvolved in spermatogenesis and cell proliferation28.

The Rh system proteins and ammonium transport.Antigens of the Rh system are found on non-glycosylated30-32 kDa integral membrane proteins, strongly associatedwith membrane glycoproteins having a molecular weightof 45-75 kDa, once called Rh50 glycoproteins and nowrenamed RhAG (Rh associated glycoprotein)29. The coreof this complex is a tetramer formed of two units of Rhproteins and two RhAG units which can bind accessorymolecules by non-covalent bonds. These are red cell-

Figure 6 - Structure of Rh and RhAG

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un'attività simil-traslocasi ATP-dipendente. Inoltre, ilcomplesso RhAG si è dimostrato inequivocabilmente untrasportatore selettivo per gli ioni ammonio. L'eritrocitarimuove tale ione a livello tissutale e, in particolare, a livellocerebrale e lo rilascia a livello epatico e renale, doveavvengono i processi metabolici di detossificazione edeliminazione33. Strutture proteiche omologhe a RhAG, comeper esempio RhBG e RhCG, sono state riscontrate in altritessuti, soprattutto in quello renale, dove svolgono sempreun importante ruolo nell'escrezione urinaria dell'ammonio enel mantenimento dell'equilibrio acido-base34.

Proteine con funzioni recettoriali

I recettori sono delle proteine integrali di membranache consentono l'internalizzazione di molecole presentinell'ambiente extracellulare o, per lo meno, consentono amolecole biologicamente attive di trasmettere un segnalebiochimico all'interno della cellula. In ambito strettamenteimmunoematologico, molte proteine facenti parte deiprincipali sistemi gruppoematici fungono da recettori pervirus, batteri, parassiti, svolgendo un ruolo preminentenella patogenesi di alcune malattie infettive. Moltimicrorganismi riconoscono residui di carboidrati presentisui glicolipidi e sulle glicoproteine, in particolare residui diacido sialico. Il Parvovirus B19, ad esempio, utilizza il gruppoglicolipidico dell'antigene P per infettare i progenitorieritroidi35. Tra i batteri che riconoscono recettori presentisu antigeni del sistema Lewis, l'Helicobacter pylori èsicuramente l'agente patogeno clinicamente più importante.Per colonizzare le mucose l'Helicobacter pylori usa le suemolecole di adesione (Bab A) che si legano aiglicoconiugati degli antigeni Leb presenti sull'epitelio dellamucosa gastrica36. Il lipopolisaccaride dell'Helicobacteresprime inoltre antigeni del sistema Lewis, costituendo unasorta di meccanismo mimetico per il sistema immunitariodell'ospite. Molteplici molecole gruppo antigeniche presentisulla membrana eritrocitaria fungono da recettori per iplasmodi della malaria37. I merozoiti del Plasmodiumfalciparum sono in grado di parassitare i globuli rossi conmeccanismi acido sialico-dipendenti e acido sialico-indipendenti. La glicoforina A è implicata in meccanismi diinfezione cellulare acido sialico-dipendente, cui il plasmodiosi lega tramite il suo recettore EBA di 175 kDa. Recentistudi hanno individuato un altro recettore malaricoimplicato nell'infezione eritrocitaria (BAEBL), che è in gradodi interagire con la glicoforina C38. I globuli rossi infettatisviluppano una particolare citoaderenza per l'endotelio del

specific proteins; both have 12 transmembrane domainsand both their ends, the amino-terminus and carboxy-terminus, are found in the cytosol. The Rh proteins are notglycosylated, but rather fatty acid acylated with palmitate.In contrast, the RhAG proteins are glycosylated (atasparagine 37) in the first extracellular loop30 (Figure 6). Rhand RhAG are intimately connected with the underlyingcytoskeleton, ensuring an important link between theintegral membrane domain and peripheral structures31,32. Invitro studies on erythropoiesis have demonstrated earlyexpression of RhAG proteins in burst-forming units-erythroid (BFU-E) cells, whereas the Rh antigens areexpressed later, indicating that Rh and RhAG aresynthesised and assembled independently from each other.It has recently been hypothesised that the Rh proteinsplay an essential role in maintaining membrane phospholipidasymmetry, through an ATP-dependent, translocase-likeactivity. Furthermore, the RhAG complex has beenunequivocally demonstrated to be a selective transporterof ammonium ions. Red blood cells remove this ion fromtissues, particularly the brain, and release it in the liver andkidney where the metabolic processes for its detoxificationand elimination take place33. Proteins that are structurallyhomologous to RhAG, for example RhBG and RhCG, havebeen found in other tissues, particularly in the kidney, wherethey play an important role in urinary excretion of ammoniumand maintenance of the acid-base balance34.

Proteins with receptor functions

Receptors are integral membrane proteins which allowextracellular molecules to enter the cell or allow biologicallyactive molecules to transmit their biochemical signals tothe interior of the cell. In a strictly immunohaematologicalcontext, many proteins belonging to the main blood groupsystems act as receptors for viruses, bacteria and parasites,playing a prominent role in the pathogenesis of someinfectious diseases. Numerous micro-organisms recognizethe carbohydrate residues present on glycolipids andglycoproteins, in particular the sialic acid residues. Forexample, Parvovirus B19 uses the glycolipid group of the Pantigen to infect erythroid progenitor cells35. Among thebacteria which recognize receptors on the antigens of theLewis system, Helicobacter pylori is undoubtedly theclinically most important pathogen. In order to colonisemucosa, Helicobacter pylori uses its adhesion molecules(Bab A), which bind to the glycoconjugates of the Leb

antigens present on the epithelium of gastric mucosa36.


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microcircolo cerebrale, rendendosi responsabile di gravi dannial sistema nervoso centrale. I globuli rossi infettati presentano,inoltre, uno spiccato tropismo per gli eritrociti ancora sani,favorendo così lo svilupparsi del processo infettivo.

Sistema DARC(Duffy Antigen Receptor forChemokines). Strutturalmente, si tratta di una glicoproteinaintegrale di membrana di 336 residui amminoacidici costituitada 7 domini transmembranari. L'estremità N-terminaleesocellulare (proteasi sensibile ma non degradabile dallatripsina) presenta due siti di N-glicosilazione, il polimorfismoFya/Fyb, il determinante antigenico Fy6 e i siti di legame perle particelle virali HIV-1 e per il Plasmodium vivax. Ildeterminante antigenico Fy3 (proteasi resistente) richiedel'integrità dell'anello di connessione 4 tra il dominiotransmembranario 6 e 7 (Figura 7). I ponti disolfuro tra C51e C176 e tra C129 e C195 sono cruciali per il legame con lechemochine39. Il complesso DARC si riscontra a livelloeritrocitario, a livello delle cellule endoteliati delle venulepost-capillari, a livello delle cellule del Purkinje delcervelletto e delle cellule epiteliali renali. Le chemochinedella classe CC e CXC si legano a questo complesso conelevata affinità. È ormai accertato che i recettori per lechemochine CXCR4 e CCR5 siano dei cofattori essenzialiper l'infezione da HIV-1, corroborando l'ipotesi che glieritrociti rappresentino un reservoir per le particelle virali40.Il complesso DARC sembra inoltre rivestire un ruoloimportante di scavenger sulla membrana dei globuli rossi ,consentendo l'eliminazione dell'eccesso di chemiochineprodotte in alcune situazioni patologiche come, ad esempio,nel corso di alcune malattie autoimmuni41. In vivo ilcomplesso DARC è un importante regolatore del traffico

Furthermore, lipopolysaccharide of Helicobacter expressesantigens of the Lewis system, creating a sort of camouflagefor the host's immune system. Many molecules of theantigen groups present on the red cell membrane act asreceptors for malarial plasmodia37. The merozoites ofPlasmodium falciparum can infect red cells using bothsialic acid-dependent and independent mechanisms.Glycophorin A is involved in the sialic acid-dependentmechanisms since the plasmodium binds to its 175 kDaEBA receptor. Recent studies have identified anothermalarial receptor (BAEBL) involved in red cell infection;this receptor is able to interact with glycophorin C38. Theinfected red cells develop a particular capacity to adhere tothe endothelium of the cerebral microcirculation, thus beingresponsible for severe central nervous system damage.Furthermore, the infected red cells have marked tropism forstill healthy erythrocytes, thus enhancing propagation ofthe infection.

Duffy Antigen Receptor for Chemokines (DARC)system. Structurally speaking, this is an integral membraneglycoprotein formed of 336 amino acid residues in 7transmembrane domains. The extracellular amino-terminus(protease-sensitive but not susceptible to trypsindegradation) has two N-glycosylation sites, the Fya/Fyb

polymorphism, the Fy6 antigenic determinant and bindingsites for HIV-1 viral particles and for Plasmodium vivax.The Fy3 antigenic determinant (protease-resistant) requiresintegrity of ring 4 connecting the transmembrane domains6 and 7 (Figure 7). The disulphide bridges between C51and C176 and between C129 and C195 are crucial for bindingwith chemokines39. The DARC complex is found in red blood

Figure 7 - Structure of the DARC complex

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leucocitario, modulando i processi di diapedesi etranscitosi42. Una up-regulation del sistema DARC siriscontra tipicamente in alcune condizioni di malattia come,per esempio, nell'infezione conclamata da HIV-1(particolarmente espresso a livello dei capillari glomerulari)e nella sindrome emolitico-uremica.

Proteine con funzioni di adesione

Si tratta di un gruppo eterogeneo di molecole integrali dimembrana che mediano i meccanismi di adesioneintercellulare e l'interazione con strutture della matriceextracellulare. Molte svolgono ruoli importanti nei processidi embriogenesi, di crescita cellulare, di differenziazione eriparazione cellulare. Ci interesseremo particolarmente diquelle molecole che presentano correlazioni con i sistemigruppoematici. La presenza delle molecole di adesione e illoro grado di espressione sulla membrana eritrocitaria varianodurante le differenti fasi maturative della linea eritroide.Alcune vengono rapidamente ipoespresse e altre, inclusequelle gruppospecifiche, possono essere presenti anche sullecellule mature. La maggior parte di queste proteine presentauna struttura di base simile alla superfamiglia delleimmunoglobuline43. Molecole di adesione gruppo-correlatesono essenziali nei normali processi fisiologici del globulorosso: differenziazione, maturazione, enucleazione, rilasciomidollare, apoptosi e invecchiamento cellulare44. Molte diqueste proteine sono coinvolte, inoltre, anche in processipatologici, come, ad esempio, in tutta una serie di sindromitrombotiche, nella malaria e nell'anemia a cellule falciformi.Nella drepanocitosi è ormai dimostrata un'esaltata presenzamembranaria del recettore per la fibronectina, del CD36, delCD239 e CD242. L'utilizzo dell'idrossiurea in quest'ultimacircostanza sembra diminuire drasticamente l'espressionesuperficiale delle molecole di adesione riducendodecisamente il rischio trombotico45.

CD44. Si tratta di una famiglia di molecole di adesionealtamente glicosilate, codificate da un gene presente sulcromosoma 11. Differenti siti di splicing consentono lasintesi di differenti isoforme, che svolgono differentifunzioni biologiche e sono presenti in differenti tipicellulari46. Dal punto di vista strettamenteimmunoematologico, il CD44 veicola antigeni del sistemaIndian e AnWj. Si ritrova sia su cellule eritroidi che non, edè in grado di formare legami ad alta affinità con acidoialuronico, collagene di tipo I, di tipo VI e con la fibronectina,principali costituenti della matrice extracellulare47. Il CD44è implicato nei fenomeni di homing delle cellule

cells, in endothelial cells of post-capillary venules, inPurkinje cells of the cerebellum and in renal epithelial cells.The class CC and CXC chemokines bind with a very strongaffinity to this complex. It is now generally accepted thatreceptors for the CXCR4 and CCR5 chemokines areessential co-factors for HIV-1 infection, in corroborationof the hypothesis that red blood cells form a reservoir ofviral particles40. The DARC complex also seems to play animportant role as a scavenger on the red cell membrane,allowing excess chemokines produced in some pathologicalsituations, such as various autoimmune diseases, to beeliminated41. In vivo the DARC complex is an importantregulator of leucocyte trafficking, modulating processesof diapedesis and transmigration42. Up-regulation of theDARC system typically occurs in some diseases, such asfull-blown HIV-1 infection (particularly expression in theglomerular capillaries) and in haemolytic-uraemic syndrome.

Proteins with adhesion functions

This is a heterogeneous group of integral membraneproteins which mediate the mechanisms of intracellularadhesion and interactions with extracellular matrixstructures. Many have important functions inembryogenesis, cell growth, differentiation and repair. Wewill concentrate on those molecules which are associatedwith blood group systems. The presence of adhesionmolecules and their degree of expression on the red cellmembrane vary during the different stages of maturationof the erythroid lineage. Some rapidly become only weaklyexpressed or lost, while others, including the blood groupspecific ones, can also be present on mature red cells. Mostof these proteins have a basic structure resembling that ofthe superfamily of immunoglobulins43. Blood group-relatedadhesion molecules are essential for normal physiologicalprocesses of red blood cells: differentiation, maturation,enucleation, release from the bone marrow, apoptosis andcellular ageing44. Furthermore, many of these proteins arealso involved in pathological processes such as a wholeseries of thrombotic syndromes, malaria and sickle cellanaemia. It has been demonstrated that there is increasedexpression of the membrane receptor for fibronectin, CD36,CD239 and CD242 in sickle cell disease. Treating thiscondition with hydroxyurea seems to decrease the surfaceexpression of adhesion molecules drastically, thusconsiderably decreasing the risk of thrombosis45.

CD44. This is a family of highly glycosylated adhesionmolecules coded for by a gene on chromosome 11. Different


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emopoietiche (consentendo ad esse di raggiungere e diaderire alla propria "nicchia" biologica), nella regolazionedi molteplici attività immunitarie, nell'embriogenesi, nellamaturazione dei progenitori midollari e nella progressionedelle metastasi tumorali48,49. L'isoforma eritrocitaria (CD44H) ha un peso molecolare di 80 kDa. Durante la maturazioneeritroide viene regolata negativamente sulla membranaeritrocitaria, anche se è ancora evidenziabile sui globulirossi maturi. È ipotizzabile che questa down-regulationconsenta di ridurre le interazioni tra la cellula eritroidemidollare e la sua matrice extracellulare, consentendo ilrilascio a livello periferico della cellula ormai matura. Dalpunto di vista patologico, è stata trovata un'associazionesignificativa tra una rara forma di anemia diseritropoieticacongenita, caratterizzata dalla persistenza di emoglobinafetale, e la completa assenza di CD44 solo a livelloeritrocitario. Dal punto di vista strutturale il CD 44 è unaproteina integrale di membrana, di cui si riconoscono 4domini principali: distale extracellulare, membrano-prossimale, transmembranario e intracellulare. Il dominiointracellulare svolge un'importante funzione strutturale,presentando molteplici interazioni con il citoscheletrosottostante e contribuendo all'ancoraggio delle struttureperiferiche al dominio integrale di membrana (Figura 8).

Sistema Lutheran/Antigene B-CAM (CD239).L'antigene gruppo ematico Lutheran e B-CAM (Basal CellAdhesion Molecular Antigen, marcatore del carcinomaovarico epiteliale) si trovano su una glicoproteina espressain due diverse isoforme di 85 e 78 kDa. Questo complessomolecolare non è limitato alla cellula eritroide, bensì èdimostrabile anche a livello della membrana basale epitelialee a livello endoteliale50. Molto spesso, gli antigeni Lu/B-CAM vengono iperespressi in alcuni tumori di origine

splicing sites give rise to the synthesis of a variety ofisoforms which have different biological functions and arepresent on different types of cells46. From a strictlyimmunohaematological point of view, CD44 carries antigensof the Indian system and AnWj. It is found on erythroidcells and other cell types, and can form high affinity bondswith hyaluronic acid, type I and type VI collagen and withfibronectin, the main constituents of the extracellularmatrix47. CD44 is implicated in the mechanisms ofhaematopoietic cell homing (allowing these cells to reachand adhere to their own biological "niche"), in the regulationof many immune functions, embryogenesis, maturation ofbone marrow progenitor cells and in the progression ofneoplastic metastases48,49. The red cell isoform (CD44 H)has a molecular weight of 80 kDa. It is down-regulated onthe red cell membrane during erythroid maturation, althoughit is still detectable on mature red blood cells. It can behypothesised that this down-regulation reduces theinteractions between the bone marrow erythroid cell andits extracellular matrix, allowing the then mature cell to bereleased into the peripheral circulation. From a pathologicalpoint of view, the complete absence of CD44 only from thered cells is associated with a rare form of congenitaldyserythropoietic anaemia, characterized by the persistenceof foetal haemoglobin. Structurally, CD44 is an integralmembrane protein, in which 4 main domains have beenrecognized: distal extracellular, membrane-proximal,transmembrane and intracellular. The intracellular domainplays an important structural role, having numerousinteractions with the underlying cytoskeleton andcontributing to anchoring peripheral structures to theintegral membrane domain (Figure 8).

Lutheran system/B-CAM antigen (CD239). The

Figure 8 - Structure of CD44

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epiteliale. Questa proteina presenta una notevole omologiain residui amminoacidici con il CD146 e CD166 , molecoleubiquitarie in grado di interagire ad alta affinità con lalaminina51. Nonostante si conosca la funzione biologica dellaproteina Lutheran, soggetti Lutheran-null non presentanoalcuna alterazione fenotipica. Questa proteina viene espressatardivamente durante il processo eritropoietico, a partire dallostadio di proeritroblasto, immediatamente primadell'enucleazione, suggerendo anche per questa classe diproteine un importante ruolo nel rilascio dell'eritrocita maturonel sangue periferico. Soggetti affetti da drepanocitosipresentano una iperespressione di questo antigene, connotevole incremento dei fenomeni microtrombotici e veno-occlusivi52. Studi recenti hanno dimostrato un ruolo di questaproteina nella stabilizzazione della membrana tramite sueinterazioni col citoscheletro eritrocitario.

LW/ICAM-4 (CD242). L'antigene LW si trova su unaglicoproteina della membrana eritrocitaria di 42 kDa,codificata da un gene che si trova sul cromosoma 19. Gliantigeni LW ed Rh sono associati a livello fenotipico, dalmomento che l'espressione di LW è maggiore in soggettiRh positivi che in Rh negativi. La glicoproteina carrierdell'antigene LW è stata recentemente rinominata ICAM-4(InterCellular Adhesion Molecule-4). È in grado di formarelegami ad alta affinità e specificità con b

2 integrina53-55.

Durante le fasi maturative della linea eritroide, l'interazionedi ICAM-4 con le integrine è implicata nella formazionedegli isolotti eritroblastici, oltre che nei processi diinvecchiamento cellulare ed eritrocateresi tramite affinitàper le integrine dei macrofagi splenici.

CD47. Glicoproteina di membrana chiamata anche IAP(Integrin Associated Protein) di 47-52 kDa, costituita dapiù domini transmembranari; presenta un'estremità amminoterminale extracellulare ad elevata omologia con il dominiovariabile delle immunoglobuline56. È in grado di interagirecon numerose integrine presenti a livello dei leucociti, dellepiastrine, delle cellule placentari e delle fibrocellulemuscolari57.58; il legame CD47-integrina attiva una proteinaG di membrana, che, a sua volta, trasmette un messaggioall'interno della cellula con modulazione di molteplici attivitàbiologiche, come, per esempio, l'attivazione piastrinica,l'adesione leucocitaria, la migrazione e la fagocitosi59,60. Altriligandi del CD47 sono rappresentati dal CD18 e dal CD31 lecui interazioni modulano la migrazione leucocitariatransendoteliale e transepiteliale e l'attivazionelinfocitaria61,62. Nessun determinante antigenicogruppoematico è stato sino ad ora evidenziato sul CD47.

CD147. È una glicoproteina transmembranaria,strutturalmente simile alla citoadesina CD22, che veicola

Lutheran blood group antigen and basal cell adhesionmolecule (B-CAM) antigen, a marker of epithelial ovariancarcinoma, are found on a glycoprotein expressed in twodifferent isoforms, one 85 kDa, the other 78 kDa. Thismolecular complex is not limited to the erythrocyte lineage,but is also found on epithelial basement membrane andendothelial cells50. The Lu/B-CAM antigens are very oftenoverexpressed in some tumours of epithelial origin. Theamino acid residues of this protein show strong homologywith those of CD146 and CD166, ubiquitous molecules thathave high affinity interactions with laminin51. Althoughthe biological function of the Lutheran protein is known,Lutheran-null individuals do not have any phenotypicchanges. This protein is expressed late in erythropoiesis,starting from the proerythroblastic stage, immediatelybefore enucleation, suggesting that this is another proteinimportant in releasing the mature red blood cell into theperipheral circulation. Subjects with sickle cell disease showoverexpression of this antigen, with marked increases inmicrothrombotic and veno-occlusive phenomena52. Recentstudies have shown that this protein is involved inmembrane stabilisation through its interactions with theerythrocyte cytoskeleton.

LW/ICAM-4 (CD242). The LW antigen is found on a42 kDa red cell membrane glycoprotein, coded for by agene located on chromosome 19. The LW and Rh antigensare phenotypically associated, since expression of LW isgreater in Rh positive subjects than in Rh negative ones.The glycoprotein carrying the LW antigen has recentlybeen renamed intercellular adhesion molecule-4 (ICAM-4).This molecule can form high affinity and strongly specificbonds with b

2 integrin53-55. The interaction between ICAM-

4 and integrins is involved in the formation of erythroblasticislets during erythroid maturation, as well as in processesof cell ageing and red cell destruction through affinity forthe integrins of splenic macrophages.

CD47. This 47-52 kDa membrane glycoprotein alsoknown as integrin-associated protein (IAP), is formed ofseveral transmembrane domains; its extracellular amino-terminus has strong homology with the variable domain ofimmunoglobulins56. This protein can interact with numerousintegrins in leucocytes, platelets, placental cells and musclefibre cells57,58; the CD47-integrin bond activates a membraneprotein G which, in its turn, transmits a message within thecell thus modulating many biological activities, such asplatelet activation, leucocyte adhesion, migration andphagocytosis59,60. Other CD47 ligands are CD18 and CD31whose interactions influence transendothelial andtransepithelial leucocyte migration and lymphocyte


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l'antigene Ok(a+)63. Risulta implicata in processi di adesionecellulare, funge da recettore per molteplici fattori di crescita64

ed è altamente espressa su cellule emopoietiche, celluleendoteliali e cellule epiteliali, favorendo la formazione dibarriere tessutali. Sembra essere essenziale anche neiprocessi di eritrocateresi e studi su modelli animali vedonoil CD147 coinvolto nei meccanismi di embriogenesi espermatogenesi65.

CD108. Appartiene alla famiglia delle semaforine, ungruppo di proteine multifunzionali espresse a livello delsistema nervoso centrale e a livello delle differenti celluledel sistema immunitario. Modulano i meccanismi dimigrazione cellulare, di citoadesione, di attivazionelinfocitaria e di sviluppo embrionale. A livello eritrocitario,ilCD108 è associato ad un complesso enzimatico di membranadotato di attività tirosinchinasica principalmente implicatonei processi di trasduzione del messaggio cellulare. Veicolal'antigene gruppo ematico JMH (John Milton Hagen) ed èconnesso ai lipidi di membrana tramite àncora GPI. Ilcorrispettivo ligando e la specifica funzione biologica sonoper ora ancora parzialmente sconosciuti66.

Proteine con funzione enzimatica

Gicosiltrasferasi. Sono prodotti codificati dai geni ABO,H, SE ed LE e appartengono alle glicosiltrasferasi67. Questienzimi si riscontrano sia a livello membranario (complessodel Golgi) che in forma solubile in molti liquidi biologici, inparticolare a livello plasmatico. Attualmente si conosceancora molto poco circa la funzione biologica di questisistemi gruppoematici.

Sistema Kell. Si tratta di una glicoproteina di membranacon un singolo dominio transmembranario di 93 kDa. Inumerosi residui di acido glutammico all'estremità N-terminale (versante citosolico) interagiscono con l'enzimagliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi. Il dominioextracellulare è formato da 665 residui amminoacidici con 5siti di N-glicosilazione. La proteina Kell presenta 16 residuidi cisteina; 15 a livello del dominio extracellulare, 1 a livellodel dominio transmembranario e nessuno a livello deldominio intracellulare68. La cisteina 72 del dominioextracellulare è legata alla cisteina 347 della proteina XKtramite un ponte disolfuro, gli altri residui di cisteinasembrano stabilizzare le interazioni tra la proteina Kell e laproteina XK69. La proteina XK è una proteina integrale dicirca 51 kDa, caratterizzata da 10 domini transmembranaricon entrambe le estremità N e C terminali presenti a livellocitosolico. Dal momento che queste due proteine risultano

activation61,62. No blood group antigenic determinant hasso far been shown on CD47.

CD147. This is a transmembrane glycoprotein,structurally similar to the CD22 cytoadhesin, which carriesthe Ok(a+) antigen63. It is involved in cell adhesionprocesses, acts as receptor for numerous growth factors64

and is strongly expressed on haematopoietic, endothelialand epithelial cells, facilitating the formation of tissuebarriers. It also seems to be essential in processes of redcell destruction and animal studies indicate that CD147 isinvolved in embryogenesis and spermatogenesis65.

CD108. This molecule belongs to the family ofsemaphorins, a group of multifunctional proteins expressedin the central nervous system and various immune systemcells. It modulates mechanisms of cell migration, celladhesion, lymphocyte activation and embryonicdevelopment. In red blood cells, CD108 is associated witha membrane enzyme complex with tyrosine kinase activityinvolved in processes of cell message transduction. Itcarries the JMH (John Milton Hagen) blood group antigenand is connected to membrane lipids through the GPIanchor. Its corresponding ligand and specific biologicalfunction are still poorly understood66.

Proteins that act as enzymes

Glycosyltransferases. These are products coded for bythe ABO, H, SE and LE genes67. These enzymes are foundin both membranes (Golgi complex) and in a soluble form inmany biological fluids, in particular in the plasma. Verylittle is currently known about the biological function ofthese blood group systems.

Kell system. This is a membrane glycoprotein with asingle 93 kDa transmembrane domain. The numerousresidues of glutamic acid at the amino-terminus (intracellularface) interact with the glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase enzyme. The extracellular domain is formedof 665 amino acid residues with 5 N-glycosylation sites.The Kell protein has 16 cysteine residues; 15 are in theextracellular domain and 1 is in the transmembrane domain;there are none in the intracellular domain68. Cysteine 72 ofthe extracellular domain is bound to cysteine 347 of the XKprotein through a disulphide bridge; the other cysteineresidues seem to stabilise the interactions between the Kellprotein and the XK protein69. The XK protein is an integralprotein of about 51 kDa. It has 10 transmembrane domainswith both the amino- and carboxy-termini in the cytosol.Since these two proteins are strongly associated in the red

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strettamente associate a livello della membrana eritrocitariavengono solitamente considerate come un'unica entità. Laproteina fa parte della famiglia delle zinco endopeptidasiM13. Si tratta di un gruppo di enzimi presenti in molte specie,dai batteri agli esseri uomani, caratterizzati da una sequenzacatalitica in grado di legare ioni zinco70. Recenti studi hannodimostrato che il principale substrato della proteina Kell-Metalloproteasi è rappresentata dell'endotelina 3. Leendoteline presentano tre principali isoforme (ET-1, ET-2,ET-3)71. In particolare, la proteina Kell distacca alcuni residuiamminoacidici da precursori dell'endotelina 3, portando allaforma biologicamente attiva della molecola. L'endotelina 3è principalmente coinvolta nella regolazione del tonovascolare, essendo in grado di controllare sia la contrattilitàche la proliferazione della muscolatura liscia vasale. Sembra,inoltre, in grado di interagire anche col tessuto del sistemanervoso centrale, col sistema para e ortosimpatico e colsistema renina-angiotensina. In sintesi, le endotelinesvolgono direttamente e attraverso l'interazione con altrestrutture un potente effetto vasocostrittore. Gli antigenidel sistema Kell sono espressi precocemente durantel'eritropoiesi, facendo ipotizzare un possibile ruolo neiprocessi di maturazione e di differenziazione cellulare,correlato principalmente alla sua attività enzimatica72.

Proteine strutturali

Le principali proteine essenziali per l'integrità strutturaledella membrana eritrocitaria sono sostanzialmente quelledel sistema Rh e le proteina della Banda 3. La Glicoforina A,nonostante sia presente sul globulo rosso con una densitàsimile a quella della Banda 3, non risulta, come quest'ultima,critica per la struttura di membrana73,74. Infatti, eritrocitideficitari della Glicoforina A presentano una normalesopravvivenza. Dal punto di vista strettamenteimmunoematologico, la Glicoforina A veicola gli antigeniMN e la Glicoforina B gli antigeni Ss. Per il loro elevatocontenuto in acido sialico, contribuiscono in manierasignificativa al conferimento della carica elettrica negativadella superficie della membrana eritrocitaria. La caricaelettrica negativa degli eritrociti è importante per ridurrel'aggregazione tra i globuli durante la circolazione e perridurre fenomeni trombotici vasocclusivi. La glicoforina Ce D sono decisamente implicate nel mantenimento dellastabilità di membrana, in quanto interagiscono con ilmembranoscheletro sottostante; in particolare, formano uncomplesso ternario con la proteina p55 e la proteina dellabanda 4.175.

cell membrane they are usually considered as a single entity.The protein is part of the family of M13 zincendopeptidases. This is a group of enzymes present inmany species, from bacteria to humans, with a catalyticsequence capable of binding zinc ions70. Recent studieshave demonstrated that the main substrate of the Kell-metalloprotease protein is endothelin 3. The are three mainisoforms of endothelin (ET-1, ET-2, ET-3)71. The Kell proteindetaches some amino acid residues from precursors ofendothelin 3, converting the molecule into its biologicallyactive form. Endothelin 3 is predominantly involved inregulating vascular tone, being able to control both thecontractility and proliferation of the vasal smooth muscle.Furthermore, it also seems to interact with central nervoussystem tissue, with the parasympathetic and sympatheticnervous systems, and with the renin-angiotensin system.In summary, endothelins produce a potent vasoconstrictiveeffect, both directly and through interactions with otherstructures. The Kell system antigens are expressed earlyduring erythropoiesis, suggesting that their enzymaticactivity might play a role in cell maturation anddifferentiation 72.

Structural proteins

The essential proteins for the structural integrity of thered cell membrane are basically those of the Rh system andthe Band 3 protein. Glycophorin A, unlike Band 3 protein,does not seem to be critical for membrane structure73,74. Infact, although these two proteins normally have a similardensity of expression, red cells lacking glycophorin A havea normal survival. From a strictly immunohaematologicalpoint of view, glycophorin A carries the MN antigens andglycophorin B carries the Ss antigens. Because of theirhigh content of sialic acid, they contribute significantly tothe negative electrical charge of the red cell membrane.The negative electrical charge of red cells is important forpreventing aggregation among circulating red cells and inreducing vaso-occlusive phenomena. Glycophorins C andD are definitely involved in membrane stability since theyinteract with the underlying cytoskeleton; in detail, theyform a tertiary complex with the p55 protein and Band 4.1protein75.

The membrane skeleton

This is a complex submembrane polygonal structure; it


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Il membranoscheletro

Si tratta di una complessa struttura poligonalesubmembranaria; conferisce forma, resistenza e flessibilitàall'eritrocita prevenendo la frammentazione cellulare, inparticolar modo a livello capillare, dove il flusso sanguignoè tipicamente turbolento76. I costituenti fondamentali sonotetrameri di spectrina, connessi tra loro da oligomeri di actinae stabilizzati dalla proteina 4.1 (Figura 9). Dal punto di vistastrettamente biochimico, il membranoscheletro è l'insiemedelle proteine eritrocitarie che residuano dopo estrazionecon il detergente non ionico Triton X100. Andiamo ora adanalizzare i singoli costituenti77.

Spectrina. È la molecola quantitativamente piùrappresentata nel membranoscheletro, di cui costituisce il75% della massa ed è presente nell'eritrocita in circa 200.000copie per cellula. È costituita da due catene polipeptidiche,la catena a di circa 240 kDa e la catena b di circa 220 kDa78.Le due catene sono appaiate in senso antiparallelo acostituire un eterodimero a forma di bastoncino, dallalunghezza di circa 100 nm; si indica come regione di testadel dimero quella formata dall'estremità amminoterminaledella catena a e dall'estremità carbossiterminale dellacatena b. Due eterodimeri si associano spontaneamentetesta-testa a formare un tetrametro, che rappresenta la formaprevalente di organizzazione della spectrina nelmembranoscheletro79 (Figura 10). Lo studio della strutturaprimaria dell'a-spectrina ha evidenziato sequenze di 106amminoacidi separate da corti segmenti di connessione.Tali sequenze assumono una struttura secondaria ad a-elica, che si ripiega ulteriormente a formare domini triplaelica. Il dimero di spectrina è composto da circa 38 domini atripla elica. Oltre ad essere in grado di interagire con un

confers shape, resistance and flexibility to the red cellpreventing cell fragmentation, especially in the capillarieswhere the blood flow is usually turbulent76. Its fundamentalconstituents are spectrin tetramers interconnected by actinoligomers and stabilised by protein 4.1.

From a strictly biological point of view, the membraneskeleton is the set of red blood cell proteins which remainafter extraction with a non-ionic detergent, Triton X100. Itssingle components are described below77.

Spectrin. This is the most abundant molecule in themembrane skeleton, constituting 75% of its mass; there areabout 200,000 copies per red cell. The molecule is formedof two polypeptide chains, an a chain of about 240 kDaand a b chain of about 220 kDa78. The two chains are pairedin an antiparallel configuration and form a rod-shapedheterodimer about 100 nm long; the head of the dimer is theregion formed by the amino-terminus of the a chain andthe carboxy-terminus of the b chain.

Two heterodimers spontaneously combine head-headto form a tetramer, which is the predominant organizationalform of spectrin in the membrane cytoskeleton79 (Figure10). Analysis of the primary structure of a-spectrin hasidentified sequences of 106 amino acids separated by shortconnecting segments. These sequences take on asecondary a-helix structure, which further folds to formtriple helix domains. The dimer of spectrin is composed ofabout 38 triple helix domains. Besides being able to interacthead-to-head with another dimer to form a tetramer, spectrinhas specific binding sites for actin, protein 4.1 and ankyrin.More precisely, the tails of the molecule bind actin andprotein 4.1 thus uniting various tetramers of spectrin, whilethe b chain interacts with ankyrin, a protein which connectsthe membrane skeleton with the integral membrane domain.

Figure 9 - Structure of the red blood cell membrane cytoskeleton

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altro eterodimero di spectrina testa-testa a formare untetramero, la spectrina possiede specifici siti di legame perl'actina, la proteina 4.1 e l'anchirina. Precisamente, le codedella molecola legano l'actina e la proteina 4.1 portandoall'unione dei diversi tetrameri di spectrina, mentre la catenab interagisce con l'anchirina, una proteina che connette ilmembranoscheletro con il dominio integrale di membrana. Illegame tra spectrina e actina a bassa affinità è stabilizzato erinforzato dalla proteina 4.1, che fa aumentare la forza di legamedi circa un milione di volte. Il sistema ternario che ne risulta,spectrina-actina-proteina 4.1, è stabile e insolubile80.

Actina. È presente a livello eritrocitario sotto forma dicorti oligomeri, protofilamenti, costituiti da 20-30 monomeri.Si stima che per ogni filamento siano presenti dai 25.000 ai35.000 protofilamenti. L'actina risulta essenziale per il legametra loro dei diversi tetrameri di spectrina81.

Proteina4.1. È presente in circa 200.000 copie per cellula.Dal punto di vista biochimico se ne riconoscono dueisoforme differenti all'estremità carbossiterminale, la 4.1 a ela 4.1 b. Entrambe sono glicosilate da N-acetilglucosamminache si lega a residui di serina o treonina in una regione dellaporzione carbossiterminle. La proteina 4.1 gioca un ruolochiave nell'assemblaggio del membranoscheletro e nelmantenimento degli ancoraggi dello stessomembranoscheletro al dominio integrale di membrana82.

Proteina 4.9. La sua funzione non è ancora ben nota,ma è ormai stato dimostrato in vitro che concorre allaformazione degli oligomeri di actina.

Tropomiosina eritrocitaria. È composta da duepolipeptidi di 29 e 27 kDa e si differenzia da tutte le altreforme non muscolari poiché si lega bene all'actina aconcentrazioni fisiologiche di Mg++ (2-3nM), mentre le altresi legano solo debolmente all'actina o non si legano affatto.La forma eritrocitaria della tropomiosina differisce da quellamuscolare per l'incapacità di autoassemblarsi testa-coda eper l'impossibilità di formare polimeri. Una funzione della

The low affinity bond between spectrin and actin isstabilised and reinforced by protein 4.1, which strengthensthe bond about one million-fold. The resulting spectrin-actin-protein 4.1 tertiary structure is stable and insoluble80.

Actin. This is present in red cells as short oligomers, orprotofilaments, formed of 20-30 monomers. It has beenestimated that there are about 25,000 to 35,000protofilaments in each filament. Actin is essential forbinding tetramers of spectrin together81.

Protein 4.1. There are about 200,000 copies of thisprotein in each cell. From a biochemical point of view thereare two isoforms that differ at the carboxy-terminal end,4.1a and 4.1b. Both are glycosylated by N-acetylglucosamine, which binds to serine or threonineresidues in a region of the carboxy-terminus. Protein 4.1plays a key role in assembling the membrane skeleton andin maintaining the membrane skeleton anchored to theintegral membrane domain82.

Protein 4.9. The function of this protein is still poorlyunderstood, but it has been demonstrated in vitro to beinvolved in the formation of actin oligomers.

Red cell tropomyosin. This is composed of two 29 and27 kDa polypeptides and differs from all the other non-muscle forms because it binds well to actin at physiologicalconcentrations of Mg++ (2-3nM), while the others bind onlyweakly or not at all to actin. Red cell tropomyosin differsfrom muscle tropomyosin by the former's inability to self-assemble in head-to-tail configurations and inability to formpolymers. One function of tropomyosin could be tostabilise actin and enhance biogenesis of its protofilamentsduring differentiation of the erythroid lineage. Since theintracellular concentration of Mg++ increases when the redcell is de-oxygenated, tropomyosin could be a mechanismthrough which membrane skeleton stability is influencedby the oxygenation status of the red cell83.

Adducin. This is a protein associated with the membrane

Figure 10 - Structure of a spectrin heterodimer


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cytoskeleton. There are about 30,000 copies per cell. It is adimer formed of a 103 kDa a chain and a 97 kDa b chain. Itcan interact with calmodulin in the presence of Ca++ ions. Itis predominantly associated with spectrin-actin complexesin a stoichiometric spectrin-adducin ratio of 2:1, suggestingthat adducin has the function of recruiting two moleculesof spectrin on one filament of actin84.

Red cell myosin. This is similar to skeletal musclemyosin. Electron microscopy reveals a rod-like structureabout 150 nm long with two globular heads at one extremity.Its ATP-dependent contractile activity (actin-myosinmechanism of action) allows the red cell to change shapeand adapt to various different mechanical stimuli.

Contacts between the membrane skeletonand the integral membrane domain

The contacts between the cytoskeleton and the integralmembrane domain are based on spectrin, which interactswith the cytoplasmic domain of Band 3 through ankyrin,and on protein 4.1, which has been found to have the sitesresponsible for the interaction with glycophorin C. Ankyrinis a 215 kDa globular protein, phosphorylated in varioussites86. A subsite of ankyrin binds b spectrin in a regionclose to that responsible for the interaction between thedimers and another binds with the cytoplasmic domain ofband 3 protein. In brief, ankyrin has 3 functional domainswhich, starting from the amino-terminal end, are: (i) an 89kDa domain which binds to the Band 3 protein (it onlyinteracts with the tetrameric form of Band 3 protein), (ii) acentral, 62 kDa domain that binds b spectrin and (iii) a 55 kDacarboxy-terminal domain which has regulatory functions87.

Regulation of the supramolecular structureof the membrane skeleton

With the exception of actin, all the main proteins of themembrane skeleton are phosphorylated by one or moreendogenous protein kinases and in vitro binding studieshave demonstrated that the state of phosphorylationprofoundly affects the properties of these proteins and, inparticular, their interactions with each other and with theintegral membrane domain. The protein 4.1-spectrin bondis sensitive to the state of phosphorylation of protein 4.1(by the action of protein kinases A and C): in fact,phosphorylation significantly reduces the formation of thetertiary complexes (spectrin-actin-protein 4.1). The

tropomiosina può essere quella di stabilizzare l'actinae di favorire la biogenesi di suoi protofilamenti durantela differenziazione della linea eritroide. Poiché laconcentrazione intracellulare di Mg++ aumenta quandoil globulo rosso è deossigenato, la tropomiosinapotrebbe fornire un meccanismo per cui la stabilitàdel membranoscheletro è influenzata dallo stato diossigenazione dell'eritrocita83.

Adducina. È una proteina associata almembranoscheletro presente in circa 30.000 copie percellula, presenta una struttura dimerica essendo costituitada una catena a di 103 kDa e da una b di 97 kDa. È in gradodi interagire con la calmodulina in presenza di ioni Ca++ . Siassocia prevalentemente ai complessi spectrina-actina conrapporto stechiometrico spectrina-adducina 2:1,suggerendo che l'adducina abbia la funzione di reclutaredue molecole di spectrina su un filamento di actina84.

Miosina eritrocitaria. È simile alla miosina del muscoloscheletrico. Al microscopio elettronico presenta unastruttura bastoncellare lunga circa 150 nm con due testeglobulari ad un'estremità. La sua attività contrattile ATPdipendente (meccanismo di interazione actina-miosina)consente all'eritrocita di cambiare forma e di adattarsi allediverse sollecitazioni meccaniche.

Contatti tra membranoscheletro e dominiointegrale di membrana

I contatti tra membranoscheletro e dominio integrale dimembrana si stabiliscono a livello della spectrina cheinteragisce col dominio citoplasmatico della Banda 3attraverso l'anchirina e a livello della proteina 4.1, sulla cuimolecola sono stati identificati i siti responsabilidell'interazione con la glicoforina C. L'anchirina è una proteinaglobulare di 215 kDa, fosforilata in più siti86. Un subsitodell'anchirina lega la b spectrina in una regione vicina a quellaresponsabile dell'interazione tra i dimeri e un altro si associacon il dominio citoplasmatico della proteina della Banda 3. Insintesi, l'anchirina presenta 3 domini funzionali, che, a partiredall'estremo amminoterminale, sono: un dominio di 89 kDache si lega alla proteina della Banda 3 ( interagisce solo conla forma tetramerica della Banda 3), un dominio centrale di 62kDa che lega la b spectrina ed un dominio carbossiterminaledi 55 kDa che ha funzioni di regolazione87.

Regolazione della struttura sopramolecolaredel membranoscheletro

Ad eccezione dell'actina, tutte le principali proteine del

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membranoscheletro sono fosforilate da una o piùproteine chinasi endogene e studi di legami in vitrohanno dimostrato che lo stato di fosforilazionemodifica profondamente le proprietà di questeproteine e, in particolare, le interazione reciproche ecol dominio integrale di membrana. Il legame dellaproteina 4.1-spectrina è sensibile allo stato difosforilazione della 4.1 (ad opera delle proteinchinasiA e C): infatti, la fosforilazione riducesignificativamente la formazione di complessi ternari(spectrina-actina-4.1). La fosforilazione dell'anchirina riducesia la sua affinità per la spectrina che per il dominiocitoplasmatico della Banda 3. La fosforilazione della 4.9 adopera della proteinchinasi A sopprime la sua capacità dipromuovere la formazione in vitro di piccoli fasci di actina.Da tutto ciò risulta che la fosforilazione di uno o piùcomponenti del membranoscheletro abbia come effettoquello di allentare alcune interazioni, rendendo ilmembranoscheletro meno rigido e più flessibile88.

Espressione e assemblaggiodel membranoscheletro durante l'eritropoiesi

Durante il programma differenziativo dei progenitori deglieritrociti avviene la ristrutturazione della membrana plasmaticae la biogenesi del membranoscheletro. Un'importantecaratteristica del membranoscheleletro consiste nel fatto chenella cellula matura questa struttura si assemblaesclusivamente sul versante citoplasmatico della membrana;perciò, in vivo, la formazione di questo complessosovramolecolare deve essere controllata nello spazio durantela differenziazione ertroide, affinché la sua formazioneavvenga solo in prossimità della membrana plasmatica e non,ad esempio, in modo anomalo a livello citoplasmatico. Finoallo stadio di eritroblasto policromatofilo, alcune proteinedel membranoscheletro vengono sintetizzate e si assemblanoa livello citoplasmatico, ma vanno incontro ad un rapidoturnover. Dallo stadio di policromatofilo in poi, incomincia avenire sintetizzata, in concomitanza con la globina, anche laproteina Banda 3, l'interazione di tale proteina con l'anchirinafornisce sul versante citoplasmatico della membrana il sitoper il legame con la spectrina e ciò stabilizza i componenti delmembranoscheletro e li preserva dal catabolismo89. Sembra,comunque, che la proteina Banda 3 debba subire variazioniconformazionali, dopo il suo inserimento nella membrana,prima di essere in grado di stabilire legami efficienti con icomponenti periferici del membranoscheletro. Appareparticolarmente interessante valutare come si arrivi alla

phosphorylation of ankyrin reduces its affinity for bothspectrin and the cytoplasmic domain of Band 3. Thephosphorylation of protein 4.9, by protein kinase A,suppresses the protein's capacity to promote formation ofsmall bundles of actin in vitro. The end result of all this isthat phosphorylation of one or more components of themembrane skeleton has the effect of loosening someinteractions, making the membrane skeleton less rigid andmore flexible88.

Expression and assembly of the membraneskeleton during erythropoiesis

Reorganization of the plasma membrane and biogenesisof the membrane skeleton take place during thedifferentiation of red cell progenitors. An important featureof the membrane skeleton is that, in the mature cell, thisstructure is assembled exclusively on the cytoplasmic faceof the membrane; thus, in vivo, the formation of thissupramolecular complex must be spatially controlled duringerythroid differentiation, so that it develops only inproximity to the plasma membrane and not, for example,anomalously in the cytoplasm. Up to the stage of thepolychromatophilic erythroblast some proteins of themembrane skeleton are synthesised and assembled in thecytoplasm, but undergo rapid turnover. From thepolychromatophilic stage onwards, Band 3 protein startsto be synthesised concomitantly with globin; the interactionof Band 3 protein and ankyrin creates the site for spectrinbinding on the cytoplasmic face of the membrane, thusstabilising the components of the membrane skeleton andprotecting them from catabolism89. It does seem, however,that Band 3 protein must undergo conformational changesafter its insertion into the membrane before it can establishefficient bonds with the peripheral components of themembrane skeleton. It seems particularly interesting toevaluate how the correct stoichiometry between thecomponents of the mature membrane skeleton is achieved.As far as concerns the spectrin-actin interaction, the amountwhich is assembled in the membrane skeleton is not simplydictated by the speed of expression and by the subsequentinteraction between proteins, but seems to be under aprecise post-transduction control90. The three polypeptidechains are synthesised in excess of the quantities thataggregate; one fraction is assembled rapidly after itssynthesis while the other is quickly broken down. As theassembly of the membrane skeleton proceeds, there is aprogressive decrease in the lateral diffusion of the


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References

1) Finean JB, Coleman R, Mitchell RH. Membranes and TheirCellular Functions, 3th ed, Oxford, Blackwell ScientificPublications; 1984.

2) Jain MK. Introduction to Biological Membrane,2th ed, NewYork, John Wile & Sons Inc; 1988.

3) Bretscher MS. The molecules of the cell membrane. SciAm1985; 253: 100-9.

4) Stein WD. Transport and Diffusion Across Cell Membranes,New York, Academic Press Inc; 1986.

5) Tanford C. The Hydrophobic Effect: Formation of Micellesand Biological Membranes,2th ed, New York, John Wile &Sons Inc; 1980.

6) Rothman JE, Lenard J. Membrane asymmetry. Science 1977;195: 743-53.

7) Singer SJ, Nicolson GL. The fluid mosaic model of thestructure of cell membranes. Science 1972; 175: 720-31.

8) Unwin N, Henderson R. Traduzione italiana de La Strutturadelle Proteine delle Membrane Biologiche (The Structure ofBiological Membrane Proteins), Milano, Le Scienze; 1984.

9) McIlhinney RAJ. The fats of life: the importance and functionof protein acylation. Trends Biochem Sci 1990; 15: 387-91.

10) Cartron JP, Coli Y. Structural and functional diversity ofblood group antigens. Transfus Clin Bio 2001; 8: 163-99.

11) Jennings ML. Structure and function of the red cell aniontransport protein. Annu Rev Biophys Chem 1989; 18: 397-430.

12) Fujinaga J, Tanga XB, Casey J. Topology of the membranedomain of the human erythrocyte anion exchange AE1. JBiol Chem 1999; 274: 6626-33.

13) Peters LL, Shivdasani RA, Liu SC, et al. Anion exchanger 1(Band 3) is required to prevent erythrocyte membrane surfaceloss but not to form the membrane skeleton. Cell 1996; 86:917-27.

14) Tanner MJA. The structure and function of Band 3 (AE1):recent developments. Mol Membr Biol 1997; 14: 155-65.

15) Zelinski T. Erythrocyte Band 3 antigens and Diego bloodgroup system. Transfus Med Rev 1998; 12: 36-45.

16) Kay MMB, Marchalonis JJ, Schluter SF, Bosman G. Humanerythrocyte aging: cellular and molecular biology, TransfusMed Rev 1991; 5: 173-95.

17) Horning R, Lutz HU. Band 3 protein clustering on humanerythrocytes promotes binding of naturally occurring anti-Band3 and anti-spectrin antibodies. Exp Gerontol 2000; 35: 1025-44.

18) Verkman AS. Structure and function of aquaporin waterchannels. Am J Renal Physiol 2000; 278: 213-8.

19) Walz T, Hirai T, Murata K, et al. Three-dimensional structureof aquaporin-1. Nature 1997; 387: 624-6.

20) Pasquali F, Bernasconi P, Casalone R, et al. Pathogeneticsignificance of pure monosomy 7 in myeloproliferativedisorders , analysis of 14 cases. Hum Genet 1982; 62: 40-51.

21) Mathai JC, Mori S Smith BL, et al. Functional analysis ofaquaporin-1 deficient red cells. The Colton-null phenotype.J Biol Chem 1996; 271: 1309-13.

22) Roudier N, Bailly P, Gane P, et al. Erythroid expression andoligomeric state of the AQP-3 protein. J Biol Chem 2002;277: 7664-9.

23) Heaton DC, McLoughlin K. Jk (a-b-) red blood cells resisturea lysis. Transfusion 1982; 22: 70-1.

24) Macey RI, Gargus JJ, Gunn RB, et al. Urea transportdeficiency in Jk (a-b-) erythrocytes . Am J Physiol 1991;260: 778-83.

25) Lucien JP, Rodier N, Cartron JP, et al. Antigenic and functionalproperties of the human red blood urea transporter hUT-B1. J Biol Chem 2002; 277: 34101-8.

26) Gillin AG, Sands JM. Urea transport in the kidney. SeminNephrol 1993; 13: 146-54.

membrane proteins. This observation indicates that themembrane skeleton not only plays a role in controlling thedeformability and shape of red blood cells, but also in thediffusion and topography of the integral membraneproteins.

corretta stechiometria tra i componenti delmembranoscheletro maturo. Per quanto riguarda l'interazionespectrina-actina, la quantità che si assembla a livellodel membranoscheletro non è dettata semplicementedalla velocità di espressione e dalla successivainterazione tra le proteine, ma sembra che ci sia unpreciso controllo post-traduzionale90. Le tre catenepolipeptidiche vengono sintetizzate in eccesso rispettoalla quantità che si aggrega, con una frazione che siassembla rapidamente dopo la sintesi e un'altra cheviene rapidamente degradata. Con il processo diassemblaggio del membranoscheletro si assiste ad unaprogressiva riduzione della diffusione laterale delle proteinedella membrana. Da questa osservazione emerge un ulterioreruolo del membranoscheletro nel controllare, oltre ladeformabilità e la forma dell'eritrocita, anche la diffusione ela topografia delle proteine integrali di membrana.

Blood Transf 2004; 2: 160-80

179

27) Macey RI, Youself LW. Osmotic stability of red cell in renalcirculation requires rapid urea transport. Am J Physiol 1988;254: 669-74.

28) Heideger MA, Smith CP, You G, et al. Structure, regulationand physiological roles of urea transporters. Kidney Int 1996;49: 1615-23.

29) Avent ND, Reid ME. The Rh blood system: a review. Blood2000; 95: 375-87.

30) Cartron JP, Agre P. Rh blood group antigens: protein andgene structure. Seminars in Hematology 1993; 30: 193-208.

31) Cartron JP, Peters L, Colin Y, et al. Evidence that red cellskeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complexmember CD47. Blood 2002; 101: 338-44.

32) Nicolas V, Gane P, Colin Y, et al. Rh-RhAG/ankyrin-R, anew interaction site between the membrane bilayer and thered cell skeleton, is impaired by Rh null-associated mutation.J Biol Chem 2003; 278: 25526-33.

33) Hemker MB, Roos D, Cheroutre G, et al. The Rh complexexports ammonium from human red blood cells. Br JHaematol. 2003; 122: 333-40.

34) Quentin F, Eladari D, Cartron JP, et al. RhBG and RhCG, theputative ammonia transporters, are expressed in the samecells in the distal nephron. J Am Soc Nephrol 2003; 14: 545-54.

35) Garratty G. Blood group antigens as tumor markers, parasitic,bacterial and viral receptors, and their association withimmunologically important proteins. Immunol Invest 1995;24: 213-22.

36) Applemek BJ, Monteiro MA, Martin SL, et al. WhyHelicobacter pylori has Lewis antigens. Trends Miocrobiol2000; 8: 565-70.

37) Pasvol G, Chasis JA, Anstee DJ, et al. Inhibition of malarialparasite invasion by monoclonal antibodies againstglycophorin A correlates with reduction in red cell membranedeformability. Blood 1989; 74: 1836-43.

38) Lisowska E. Antigenic properties of human glycophorins,an update. Adv Exp Med Biol 2001; 491: 155-69.

39) Cartron JP, Filipe A, Gane P, et al. Structure-function analysisof the extracellular domains of the Duffy antigen/receptorfor chemokines: characterization of antibody and chemokinebinding sites. Br J Haematol 2003; 122: 1014-23.

40) Lachgar A, Jaureguiberry G, Le Buenac H, et al. Binding ofHIV-1 to RBC’s involves the Duffy Antigen Receptors forChemokines. Biomed Pharmacother 1998; 52: 436-9.

41) Fukuma N, Akimitsu N, Hamamoto H, et al. A role of theDuffy antigen for the maintenance of plasma chemokineconcentrations. Biochem Biophys Res Commun 2003; 303:137-9.

42) Lee JS, Peiper SC, Wong VA, et al. Duffy antigen facilitatesmovement of chemokine across the endothelium in vitro andpromotes neutrophil transmigration in vitro and in vivo. JImmunol. 2003; 170: 5244-51.

43) Freemont AJ, Hoyland JA. Cell adhesion molecules. J ClinPathol Mol Pathol. 1996; 49: 321-30.

44) Spring FA, Parsons SF. Erythroid cell adhesion molecules.Transfus Med Rev 2000; 14: 351-63.

45) Styles LA, Lubin B, Vichinsky F, et al. Decrease of very lateactivation antigen-4 and CD36 on reticulocytes in sickle cellpatients treated with hydroxyurea. Blood 1997; 89: 2554-9.

46) Bajorath J. Molecular organization, structural features andligand binding characteristics of CD44, a highly variable cellsurface glycoprotein with multiple functions. Proteins 2000;39: 103-11.

47) Isacke CM, Yarwood H. The hyaluronan receptor, CD44.Int J Biochem Cell Biol 2002; 34: 718-21.

48) Voermans C, Rood PM, Hordijk PL, et al. Adhesion moleculesinvolved in transendothelial migration of human hematopoieticprogenitor cells. Stem Cells 2000; 18: 435-43.

49) Deguci T, Komada Y. Homing associated cell adhesionmolecule (CD44) on human CD34+ hematopoieticprogenitor cells. Leuk Lymphoma 2000; 40: 25-37.

50) Crew VK, Green C, Daniels G. Molecular bases of the antigensof the Lutheran blood group system. Transfusion 2003; 43:1729-37.

51) Parson SF. Erythroid cell adhesion molecules Lutheran andLW in health and disease. Best Pract Res Clin Haemat 1999;12: 729-45.

52) Udani M, Zen Q, Cottman M, et al. Basal cell adhesionmolecule Lutheran protein: the receptor critical for sickle celladhesion to laminin. J Clin Invest. 1998; 101: 2550-8.

53) Hayflick JS, Kilgannon P, Gallatin WM. The intercellularadhesion molecule ICAM family proteins. New membersand novel functions. Immuno Res 1998; 17: 313-27.

54) Spring FA, Parsons SF, Ortlepp S, et al. Intercellular adhesionmolecule-4 binds alpha(4) beta (1) and alfa (V)- familyintegrins through novel integrin-binding mechanisms. Blood2001; 98: 458-66.

55) Hermanol P, Gone P, Huet M, et al. Red cell ICAM-4 is anovel ligand for platelet-activated alfa II beta-3 integrin. JBiol Chem 2003; 278: 4892-8.

56) Brown EJ, Frazier WA. Integrin-associated protein (CD47)and its ligands. Trends Cell Biol 2001; 11: 130-5.

57) Lamy L, Ticchioni M, Bernard A, et al. CD47 and the 19kDa interacting protein-3 (BNIP3) in T cell apoptosis. JBiol Chem 2003; 278: 23915-21.

58) Chung J, Wang XQ, Lindberg FP, Frazier WA.Thrombospondin-1 acts via IAP/CD47 to synergize withcollagen in alpha2beta1-mediated platelet activation. Blood1999; 94: 642-8.

59) Brown E. Integrin associated protein (CD47): an unusualactivator of G protein signalling. J Clin Invest 2001; 107:1499-500.

60) Yoshida H, Yokota T, Matsuzawa Y, et al. Integrin associatedprotein CD47 regulates motile activity in human B-cell linesthrough CDC 42. Blood 2000; 96: 234-41.

61) Pettersen RD, Hestdal K, Olafsen MK, et al. CD47 signalsT cell death. J Immunol 1999; 162: 7031-40.


Blood Transf 2004; 2: 160-80

180

62) Motegi S, Okazawa H, Matozaki T, et al. Role of the CD47-SHPS-1 system in regulation of cell migration. EMBO J2003; 22: 2634-44.

63) Staffler G, Stockinger H. CD147. J Biol Regul HomeostAgents 2000; 14: 327-30.

64) Murumatsu T, Miyauchi T. Basigin (CD147): amultifunctional transmembrane protein involved inreproduction, neural function, inflammation and tumorinvasion. Histol Histopathol 2003; 18: 981-7.

65) Staffler G, Moonsom S, Kasinrerk W, et al. Engagement ofCD147 molecule-induced cell aggregation through theactivation of protein kinases and reorganization of thecytoskeleton. Immunobiology 2001; 203: 659-69.

66) Mudad R, Rao N, Angelisova P, et al. Evidence that CDw108membrane protein bears the JMH blood group antigen.Transfusion 1995; 35: 566-70.

67) Lowe JB. The blood group specific human glycosyltransferases.Baillieres Clin Haematol 1993; 6: 465-92.

68) Lee S, Russo D, Redman C. Functional and structural aspectsof the Kell blood group system. Trans Med Rev 2000; 14:93-103.

69) Lee S, Russo D, Redman C. Association of XK and Kellblood group proteins. J Biol Chem 1998; 273: 13950-6.

70) Turner J, Tanzawa K. Mammalian membranemetallopeptidases: NEP, ECE, KELL and PEX. FASEB J1997; 11: 355-64.

71) Turner AJ, Murphy LJ. Molecular pharmacology ofendothelin converting enzymes. Biochem Pharmacol 1996;51: 91-102.

72) Southcott MG, Tanner MA, Anstee DJ. The expression ofhuman blood group antigens during erythropoiesis in a cellculture system. Blood 1999; 93: 4425-35.

73) Lisowska E. Antigenic properties of human glycophorins,an update. Adv Exp Med Biol 2001; 491: 141-53.

74) Valverde JR, Rasia RJ, Stoltz JF, et al. Quantification ofglycophorin A and glycophorin B on normal human RBCsby flow cytometry. Transfusion 2003; 43: 1145-52.

75) Chang SH, Low PS. Regulation of the glycophorin C-protein4.1 membrane to skeleton bridge an evaluation of itscontribution to erythrocyte membrane stability. J Biol Chem2001; 276: 22.223-30.

76) Nash GB, Gratzer WB. Structural determinants of the rigidityof the red cell membrane. Biorheology 1993; 30: 397-407.

77) Navarro MJ, Seguin I, Boivin P, et al. Study of humanerythrocyte membrane protein interactions by selectivesolubilization of Triton-skeletons. Biol Cell 1995; 83: 33-8.

78) Beck KA, Nelson WJ. The spectrin based membrane skeletonas a membrane protein sorting machine. Am J Physiol 1996;270: 1263-70.

79) Hansen J, Skalak R, Chien S, et al. Spectrin properties andthe elasticity of the red blood cell membrane skeleton.Biorheology 1997; 34: 327-48.

80) An X, Guo X, Sum H, et al. Phosphatidylserine binding sitesin erythroid spectrin: location and implications for membranestability. Biochemistry 2004; 43: 310-5.

81) Picart C, Dalhaimer P, Discher DE. Actin protofilamentorientation in deformation of the erythrocyte membraneskeleton. Biophys J 2000; 79: 2987-3000.

82) An X, Takakuwa Y, Manno S, et al. Structural and functionalcharacterization of protein 4.1-phosphatidylserineinteraction: potential role in 4.1 sorting within cells. J BiolChem 2001; 276: 3577-85.

83) Sung LA, Gao KM, Yee LJ, et al. Tropomyosin isoform 5bis expressed in human erythrocytes: implications oftropomodulin-TM5 or tropomodulin-TM5b complexes inthe protofilament and hexagonal organization of membraneskeletons. Blood 2000; 95: 1473-80.

84) Joshi R, Bennett V. Mapping the domain structure of humanerythrocyte adducin. J Biol Chem 1990; 265: 13130-6.

85) Cibert C, Pruliere G, Lacombe C, et al. Calculation of a Gaprestoration in the membrane skeleton of the red blood cell:possible role for myosin II in local repair. Biophys J 1999;76: 1153-65.

86) Anstee DJ, Hemming NJ, Tanner MJ. Functional factors in thered cell membrane: interactions between the membrane and itsunderlying skeleton. Immunol Invest 1995; 24: 187-98.

87) Discher DE. New insights into erythrocyte membraneorganization and microelasticity. Curr Opin Hematol 2000;7: 117-22.

88) Manno S, Takakuwa Y, Nagao K, et al. Modulation oferythrocyte membrane mechanical function by beta-spectrinphosphorylation and dephosphorylation. J Biol Chem, 1995;270: 5659-65.

89) Hanspal M, Golan DE, Yi SJ, et al. Temporal synthesisof band 3 oligomers during terminal maturation of mouseerythroblasts. Dimers and tetramers exist in themembrane as preformed stable species. Blood 1998;92: 329-38.

90) Hanspal M, Palck J. Biogenesis of erythrocyte membraneskeleton in health and disease. Stem Cells 1993; 11: 8-12.

Blood Transf 2004; 2: 160-80


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