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García Amor Enrique
Aislamiento de actinomicetos del suelo y estudio de una cepa de streptomyces sp. productora de
antibiosis
Universidad de Los Andes-Facultad de Ciencias-Postgrado en Biotecnología de Microorganismos.
2000. p. 96
Venezuela
Disponible en:
http://bdigital.ula.ve/RediCiencia/busquedas/DocumentoRedi.jsp?file=33398&type=ArchivoDocumento
&view=pdf&docu=26771&col=5
¿Cómo citar?
Universidad de Los Andes
F acuitad de Ciencias
Departamento de Biología
Postgrado en Biotecnología de Microorganismos
Mérida-Venezuela
Tesis de Maestría realizada por el Licenciado ENRIQUE GARCÍA AMOR
para optar al título de Magíster Scientae en Biotecnología de
Microorganismos
Po' ,,'.l\c í (
"AISLAMIENTO DE ACTINOMICETOS DEL SUELO Y ESTUDIO DE
UNA CEPA DE STREPTOMYCES SP. PRODUCTORA DE
ANTIBIOSIS"
DIGITAL~ZADO http://tesis.ula. ve
El trabajo de investigación fue realizado en el
Laboratorio de Ultraestructura de la Facultad
de Medicina bajo la Tutoría del Profesor José
Antonio Sánchez Crispín"
Mérida- 2000
Aislamiento de Actinomicetos del Suelo y Estudio de una Cepa de Streptomyces sp. Productora de Antibiosis
Se aislaron 329 cepas sugestivas de actinomicetos a partir de 12
muestras de suelo recolectadas en diferentes regiones de Venezuela.
El 36.5% de los aislamientos mostró actividad antimicrobiana contra al
menos un grampositivo, 3.6 % inhibió tanto a grampositivos como a
Escherichia coli, mientras que el 0.9% inhibió exclusivamente a E. coli.
Ninguno mostró actividad contra Pseudomonas aeruginosa. La mayor
proporción de cepas bioactivas provienen de suelos del Edo. Mérida lo
que resalta la importancia de estos suelos como una fuente de
microorganismos autóctonos de interés biotecnológico. Entre todas las
cepas aisladas se selecciona una de ellas, que denominamos T 77,
que mostró actividad contra bacterias grampositivas y contra A. niger,
Gandida albicans y C. utilis. El estudio morfológico, fisiológico y
citoquímico muestra que la cepa T 77 es una especie del género
Streptomyces. La actividad antimicrobiana de la cepa está presente en
los sobrenadantes de crecimiento de los medio de cultivo en los que la
T 77 libera un exopigmento soluble. Este pigmento verde-marrón puede
extraerse de los sobrenadantes de crecimiento con acetato de etilo.
Cuando este extracto se pasa por una columna de silica gel con un
sistema de solvente acetato de etilo/acetona/agua (6:4: 1) se recuperan
cuatro pigmentos, pero uno sólo de ellos, de color amarillo y un
RF=0.80, muestra actividad antibacteriana (contra grampositivos) y
antifúngica.
INDICE DE MATERIA
lndice de materia
Agradecimientos ix
Dedicatoria x
CAPITULO 1. INTRODUCCIÓN 1
1.1. Antecedentes históricos 1
1.2. Streptomyces y sus antibióticos 5
1.3. Características del género Streptomyces 1 O
1.4. Ecología 13
1.5. Taxonomía e identificación 14
CAPITULO 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA, HIPÓTESIS
Y OBJETIVOS 19
2. 1. Planteamiento del problema 19
2.2. Hipótesis 20
2.3. Objetivos generales 20
CAPITULO 3. MATERIALES Y METODOS 21
3.1. Microorganismos de referencia para pruebas antibióticas 21
3.2. Medios de cultivo 21
3.3. Selección de microorganismos productores de antibióticos 21
3.3.1. Origen y recolección de las muestras de suelo 21
3.3.2. Toma de la muestra de suelo 22
3.3.3. Procesamiento de la muestra de suelo 22
3.3.4. Aislamiento de las cepas de actinomicetos 23
3.3.5. Determinación de la actividad antomicrobiana de las
cepas de actinomicetos seleccionadas
3.4. Caracterización morfológica de la cepa T77
3.4.1. Morfología microscópica de la cepa T77
23
24
24
3.4.2. Morfología macroscópica de la cepa T77 24
3.4.2.1.Cultivo en medios sólidos 25
3.4.2.2. Cultivo en medios líquidos 25
3.5. Determinación del isómero del ácido diaminopimélico
(DAP) asociado a la pared celular. 25
3.6. Caracterización de la cepa T77 bajo diferentes condiciones
experimentales 26
3.6.1. Degradación de compuestos 26
3.6.2. Determinación de resistencia a antibióticos 27
3.6.3. Crecimiento a diferentes temperaturas 27
3.6.4. Crecimiento en presencia de agentes químicos 27
3.6.5. Utilización de fuentes de nitrógeno 27
3.6.6. Utilización de fuentes de carbono 28
3.6.7. Determinación de la resistencia a la lisozima 28
3.7. Estudio de la actividad antimicrobiana de la cepa T77 29
3.8. Determinación de la curva de crecimiento de la cepa T77
y cinética de producción de antibiosis
3.8.1. Curva de crecimiento
3.8.2. Cinética de producción
3. 9. Obtención y análisis del extracto crudo y purificación parcial
30
30
30
del pigmento AT77 31
3.9.1. Obtención 31
3.9.2. Evaluación de las fracciones orgánicas (extracto
crudo) y acuosa 32
3.9.3. Cromatografía en capa fina del extracto crudo 32
3.9.4. Bioautografía 32
3.9.5. Purificación parcial de los pigmentos 33
3.1 O. Estudio de la actividad antimicrobiana de los pigmentos 33
11
CAPITULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 35
4.1. Aislamiento y selección de las cepas de actinomicetos 35
4.2. Selección de la cepa T77 37
4.3. Morfología microscópica de la cepa T77 37
4.4. Características macroscópicas de la cepa T77 43
4.5. Determinación del isómero del ácido diaminopimélico 48
4.6. caracterización de la cepa T 77 bajo diferentes condiciones
experimentales 48
4.7. Taxonomía de la cepa T 77 51
4.8. Cinética de crecimiento. 51
4.9. Cinética de producción de antibiosis por la cepa T77 53
4.1 O. Obtención y evaluación de las fracciones orgánica y
acuosa. 55
4.11. Purificación parcial de los pigmentos que constituyen el
extracto crudo. 56
4.12. Actividad antimicrobiana de los pigmentos BA, BR, BM1,
BVy 8M2 58
4.13. Cromatografía y bioautografía de los pigmentos BA, BR,
BM1, BVy 8M2 62
CAPITULO 5. CONCLUSIONES 66
Condu~ones 66
CAPITULO 6. BIBLIOGRAFIA 67
Bibliografía 67
Bibliografía electrónica 73
CAPITULO 7. APENDICE 74
111
INDICE DE TABLAS
Tabla 1 Algunos antibióticos producidos por Streptomyces 6
Tabla 2 Algunos antibióticos de Streptomyces que poseen
otras actividades biológicas de interés 8
Tabla 3 Cantidad de metabolitos secundarios producidos
por diferentes microorganismos 9
Tabla 4 Cantidad de sustancias bioactivas reportadas entre
1993 y 1997 en la revista "Journal of Antibiotics" y
los microorganismos que las producen. 11
Tabla 5 Población de actinomicetos por gramo de suelo de
suelo estudiado. 36
Tabla 6 Cantidad de cepas de actinomicetos aisladas de las
muestras de suelos de diferentes orígenes 38
Tabla 7 Diámetros (mm) de los halos de inhibición producidos
por la cepa T 77 39
Tabla 8 Características de cultivo de la cepa T77 en medios
sólidos 46
Tabla 9 Características de cultivo de la cepa T77 en medios
líquidos 47
Tabla 10 Características fisiológicas y bioquímicas de la cepa
T77 49
IV
· Tabla 11
Tabla 12
Tabla 13
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Utilización de fuentes de nitrógeno y carbono por la
cepa T77. 50
Cinéticas de producción del agente antibiótico de la
cepa T 77 54
Sensibilidad de varias cepas de referencia a los
pigmentos derivados del extracto crudo antibiótico
Producido por la cepa T77. 61
INDICE DE FIGURAS
Pigmento verde exocelular producido por la cepa
T77 40
Hitas y cadenas de esporas de la T77 (microfotografía
al microscopio de luz. X800) 41
Esporas de la cepa T77 (microfotografía por Contraste
Diferencial de Interfase al microscopio de luz) 42
Colonias de la cepa T77 (Morfología macroscópica) 44
Colonias de la cepa T77 (Morfología macroscópica) 45
Cinética de crecimiento de la cepa T77. 52
V
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Cinética de producción de antibiosis por la cepa
T77.
Cromatografía en columna de silica gel del
extracto crudo de la T 77
52
56
Sensibilidad de C. albicans a fracciones derivadas del
extracto bruto antibiótico por la cepa T77. 59
Figura 1 O Sensibilidad de S. lutea a los pigmentos derivados del
extracto crudo producido por la cepa T77 60
Figura 11 Separación por cromatografía en capa fina de silica
gel de los pigmentos obtenidos del extracto crudo
antibiótico producido por la cepa T77. 63
Figura 12 Bioautografía sobre S. lutea del cromatograma
Del pigmento BR 64
Vl
INDICE DEL APÉNDICE
Medios de cultivos del Proyecto Internacional de Streptomyces
ISP N° 2
ISP N° 4
ISP N° 5
ISP N° 7
ISP N° 9
Extracto de levadura -extracto de carne
Almidón- sales inorgánicas
Asparagina- Glicerol
Solución sales trazas P&G
Agar tirosina
Utilización de fuentes de carbono
Medios de cultivos convencionales
Bennett
Nutriente
Middlebrook 7H-9
Almidón-caseina
1 nfusión-cerebro-corazón
Müeller -Hinton
Ensayos fisiológicos y bioquímicos
Descomposición Xantina, hipoxantina y tirosina
Caseina
Almidón
Urea
Reducción Nitrato
Hidrólisis Quitina
Resistencia Lisozima
VIl
75
75
76
76
76
77
78
78
79
79
80
80
80
81
81
82
82
82
83
Crecimiento Fuentes de nitrógeno 83
Soluciones
y patrones Solución salina fisiológica 84
MacFarland 84
viii
AGRADECIMIENTO
Al Profesor José Antonio Sánchez Crispín por su orientación y discusión.
A mi esposa María Alejandra por su infinito apoyo y colaboración.
A mis colegas profesores de la Cátedra de Bacteriología, en especial a la Profesora Nora Pérez y a la Lic. Solange Bracho, por su apoyo incondicional.
A José Antonio Serrano, parte fundamental del equipo.
A Jesús Avella y Samuel Varela del Laboratorio de Ultraestructura de la Facultad de Medicina, por su ayuda técnica.
A Antonio Luis Blanco Sanoja, por las muestras de suelo del Edo. Lara.
A Francisco Díaz, por las muestras de suelo de Lagunillas.
AL profesor Jesús Molinari, por la muestra de suelo de La Cueva
Al profesor Alfredo Carabot, por las muestras de suelo de Isla Babilla y del Edo. Apure.
Al profesor Joshi Narahari y al lng. Honorio Medina, del Laboratorio de Microscopía de Fuerza Atómica de la Facultad de Medicina por el estudio morfológico por Contraste Diferencial de Interfase.
A la profesora María del Carmen Araque, por las cepas de referencia.
A los profesores Alí Bashas, del Laboratorio de Resonancia Magnética Nuclear y, Alfredo Usubillaga, del Instituto de Investigaciones de la Facultad de Farmacia, por sus observaciones y recomendaciones.
IX
W! ~
\
1
1
1
rl :J A mi querida esposa María Alejandra
X
CAPITULO 1
INTRODUCCIÓN
1. 1. ANTECEDENTES HISTÓRICOS
Los trabajos de Louis Pasteur (1822-1895) y Robert Koch (1843-
191 O) demostraron la conexión existente entre las enfermedades
infecciosas y los microorganismos. Esto constituyó uno de los
acontecimientos científicos más importantes del siglo XIX y marca el
inicio de la microbiología médica como disciplina científica. Con la
demostración de la teoría del origen microbiano de la enfermedad se
da inicio a la búsqueda y aplicación de medidas de prevención y
curación de las enfermedades infecciosas. Estas medidas fueron
dirigidas a controlar el desarrollo de los microorganismos mediante la
utilización de sustancias diversas que destruyeran a los agentes
invasores y la aplicación de diferentes formas de vacunas y
tratamientos con sueros. El objetivo era curar la enfermedad con las
mismas sustancias producidas por los animales y humanos, y ensayar
sustancias químicas de diverso origen que destruyeran a los
microorganismos causantes de las enfermedades (Kruif, 1992 a).
En el año 1902 Paul Ehrlich (1854-1915) comenzó a ensayar el
efecto de los colorantes sobre los tripanosomas. Probó cerca de 500
colorantes sin lograr los resultados esperados hasta que decidió
modificarlos químicamente. Así fue como encontró que uno de estos
colorantes modificados, el rojo tripano, era efectivo contra los
tripanosomas, aunque con el tiempo, estos se volvían resistentes a su
acción. Probó también curar ratones infectados con tripanosomas
inyectándoles diferentes preparaciones con arsénico. Ensayó 606 de
estas preparaciones antes de tener éxito con una que si mostraba ser
inocua para los ratones y lograba matar a los parásitos. Este
compuesto, el 606 o Salvarsán como Ehrlich Jo llamó, consistía en un
compuesto de propil-para-dihidroxi-diaminoarsenobenceno y también
era efectivo contra Treponema pa/lidum. Para 191 O, se habían
inyectado en todo el mundo cerca de 65.000 dosis de Salvarsán para
tratar la sífilis humana. Su éxito fue grandioso pero no total. Después de
la aplicación del Salvarsán algunos pacientes presentaban vómitos,
rigidez en las piernas, convulsiones y muerte (Kruif, 1992 b; The Nobel
Foundation, 1999)
Además del arsénico, el mercurio también fue utilizado para
combatir las infecciones por tripanosomas y espiroquetas (sífilis,
enfermedad del sueño, fiebres recurrentes). La corteza del Quino
(Cinchona sp.), árbol originario de los Andes, constituye la fuente
natural de otro agente quimioterapéutico, la quinina, utilizada desde el
siglo XVII para combatir la malaria. Las sales de antimonio se utilizaron
en el tratamiento de ciertas enfermedades tropicales. Las sales de
bismuto mostraban efectividad contra la sífilis. Todos estos agentes
demostraron ser relativamente eficaces en el tratamiento de algunas
enfermedades ocasionadas por espiroquetas y protozoarios pero
resultaron poco efectivas contra la gran mayoría de las enfermedades
bacterianas (Svartz, 1939)
Las sales de oro fueron utilizadas en los años 20 para combatir
infecciones ocasionadas por estafilococos y se dedicó mucho trabajo a
investigar con estas sustancias a fin de lograr preparaciones efectivas
terapéuticamente y poco tóxicas para los humanos. En uno de los
2
laboratorios dedicados a estas investigaciones, el profesor Gerhard
Domagk (1895-1964) y sus colaboradores encontraron en 1932 que el
pigmento rojo prontosil, era efectivo contra una cepa hemolítica de
estreptococos. Los resultados de estos experimentos no fueron
publicados hasta febrero de 1935 y entonces el prontosil y sus efectos
terapéuticos fueron conocidos en todo el mundo y se llevaron a cabo
experimentos para elucidar su modo de acción. Se llegó a comprobar
que la actividad del compuesto estaba asociada con la molécula de
sulfonamida que constituye parte de la preparación. Aunque el prontosil
no exhibía in vitro ninguna actividad antimicrobiana, una vez dentro del
cuerpo liberaba un compuesto muy activo: el para-aminobenceno
sulfanilamida, sustancia que inhibe competitivamente a la pteridina
sintetasa bacteriana, enzima que interviene en la síntesis del ácido
fólico (Svartz, 1939).
~ Aunque ya Louis Pasteur había observado que los cultivos del
bacilo del carbunco perdían su virulencia cuando se mezclaban con
microorganismos del suelo - lo que le llevó a sugerir que los seres
vivos podían producir sustancias con efectos antimicrobianos y que
este fenómeno revelaba promisorias esperanzas terapéuticas - no fue
sino hasta 1928 que se descubrió el primer antimicrobiano producido ·-..¡
por un microorganismo: la penicilina. Fleming (1881-1955) que en 1928,
se encontraba investigando sobre los estafilococos piógenos, observó
que alrededor del hongo que había contaminado uno de sus cultivos,
podía verse un área clara, libre de bacterias. El hongo, era un
Penicillium notatum y fue cultivado y transferido a un medio de cultivo
líquido en donde crecía superficialmente como una masa verdosa.
Cuando esta masa fue filtrada se encontró que el caldo podía inhibir el
crecimiento de los estafilococos aun cuando se diluía 800 veces, lo que
3
ponía en evidencia la existencia de una sustancia muy activa producida
por el hongo y liberada al caldo de cultivo. Fleming llamó a esta
sustancia Penicilina. Además observó que era efectiva contra diferentes
tipos de bacterias (Liljestrand, 1945).
Si bien el descubrimiento de la penicilina fue en buena parte un
hecho fortuito, el aislamiento de la estreptomicina fue el resultado de un
laborioso proceso de investigación liderado por el Dr. Selman A.
Waksman. El Dr. Waksman (1888-1973) inició en 1939 un extenso
programa de estudio acerca de la naturaleza de diversas sustancias
producidas por los microorganismos del suelo. Ocupó buena parte de
su vida en el aislamiento de actinomicetos del suelo y en la búsqueda y
purificación de los antibióticos que estos microorganismos producen.
[ Waksman fue el que introdujo el término "antibiótico" para referirse a
toda sustancia antibacteriana, producida por un microbio, capaz de
antagonizar con otro microbio. En 1940 Waksman y sus colaboradores
aíslan el primer antibiótico producido por un actinomiceto, la
actinomicina, pero resultó ser muy tóxico para ser utilizado en humanos::J.
En 1942, otro antibiótico, la estreptotricina, fue aislado y estudiado, pero
también resulto ser demasiado tóxico. En 1943, a uno de sus
colaboradores se le encomendó investigar nuevas cepas de
actinomicetos. Después de algunos meses de trabajo fueron aisladas
varias cepas de Streptomyces, y una de ellas mostró tener actividad
antibiótica. A este antibiótico Waksman lo denominó Estreptomicina y
los estudios subsiguientes mostraron que era activo contra diversas
bacterias incluido el bacilo de la tuberculosis y podía ser utilizado en
humanos para tratar esta enfermedad (Wallgren, 1952)
4
El Dr. Waksman y su grupo, aislaron en el transcurso de varios
años unos 22 antibióticos, cuatro de los cuales fueron producidos
comercialmente. Los más conocidos son la estreptomicina, neomicina,
actinomicina y candicidina. El éxito de la estreptomicina en el
tratamiento de la tuberculosis fue contundente y desde entonces, los
actinomicetos han constituido la fuente primaria para la búsqueda de
nuevos antibióticos. El descubrimiento de la estreptomicina
desencadenó en todo el mundo la búsqueda de nuevos antibióticos a
partir de todo tipo de microorganismo. En 1945 se descubrió la
bacitracina, seguida del cloranfenicol y la polimixina en 1947, la
clortetraciclina y la neomicina en 1948, oxitetraciclina en 1950 y la
eritromicina en 1952. Con excepción de la bacitracina y polimixina,
todos estos antibióticos son producidos por actinomicetos y '\'"
principalmente por especies de Streptomyces.) Es importante señalar -que el insigne médico e investigador venezolano, el Dr. Enrique Tejera
(1889-1980), fue el primero en aislar a Streptomyces venezuelae,
actinomiceto productor del antibiótico cloranfenicol. El Dr. Tejera aisló
este microorganismo en 1946 a partir de una muestra de suelo tomada
por él mismo en la Hacienda Bello Campo de Chacao, Caracas
(Serrano y Serrano, 1996lJ En la Tabla 1 mostramos los antibióticos
más importantes, por su uso terapéutico, que son producidos por
Streptomyces.
1.2. STREPTOMYCES Y SUS ANT/8/0T/COS
Para 1955 se conocían cerca de 500 antibióticos producidos por
diversos microorganismos; 20 años más tarde, en 1975, la cifra se
elevaba a casi 5.000 y para 1989 rondaba por los 13.000 (Berdy, 1989).
5
Tabla 1. Algunos antibióticos producidos por Streptomyces.
Especie Antibiótico Estructura química
S. griseus Cicloheximida Cicloalcano
S. griseus Estreptomicina Aminoglucósido
S. clavuligerus Acido clavulánico P-Lactámico
S. rimosus Oxitetraciclina T etracicli na
S. niveus Novobiocina Péptido cíclico
S. aureofaciens Clortetracicli na Tetraciclina
S. kanamyceticus Kanamicina Aminoglucósido
S. venezuelae Cloranfenicol Nitrobenceno
S. cattleya Cephamicina P-Lactámico
S. noursei Nistatina Polieno
S. fradiae Neomicina Aminoglucósido
S. antibioticus Oleandomicina Macrólido
S. mediterraneum Rifamicina Macrocíclico
S. lincolnensis Lincomicina Tioazúcar
S. orientalis Vancomicina Polipéptido
Tomado de Vandamme, 1983.
6
Entre los factores que determinaron esta "explosión" de antibióticos
están: 1) La aplicación de métodos más sensibles y altamente
selectivos para el aislamiento de microorganismos productores así
como para la detección de sus productos, 2) la aparición de cepas de
microorganismos resistentes a los antibióticos conocidos y el
surgimiento de nuevos patógenos emergentes, 3) el descubrimiento de
nuevas aplicaciones, distintas a las de los antibióticos, para los
metabolitos microbianos como agentes antitumorales,
inmunopotenciadores, herbicidas y pesticidas, promotores del
crecimiento vegetal, etc. (Berdy, 1989). En la Tabla 2 se indican
algunas otras actividades que presentan las sustancias producidas por
Streptomyces.
En las décadas de los sesenta y setenta, entre el 75 y el80% de
los antibióticos descubiertos eran producidos por actinomicetos y
principalmente por los del género Streptomyces (Berdy, 1995). Para el
año 1994 se estimaba que de los cerca de 12.000 antibióticos
conocidos, unos 8.000 eran producidos por actinomicetos (Berdy,
1995). En la Tabla 3 se muestran las estimaciones hechas para esa
fecha. En ella queda claro el importante papel de los actinomicetos
como principales productores de antibióticos y otros metabolitos.
En una revisión hecha por nosotros de las sustancias bioactivas
reportadas por la revista de publicación mensual "Journal of Antibiotics"
entre los años 1993 y 1997 ambos inclusive, encontramos que de las
1.182 sustancias bioactivas (antibióticos, antitumorales, herbicidas etc.)
aparecidas en la revista, 612 (51.8 %) son producidas por
Actinomicetos, y las 570 (48.2 %) restantes por otros microorganismos
(bacterias y hongos). Además, esta revisión indica que las especies de
7
Tabla 2. Algunos antibióticos de Streptomyces que poseen otras actividades biológicas de interés.
Actividad Antibiótico Especie productora
lnmunosupresor Alanosina S. alanosinicus Pluramicina S. pluricolorescens
Hipotensivo Aquayamycina S. reticuli Oleandimicina S. antibioticus Spiramycina S. ambofaciens
Diabetogénico Streptozotocin S. achromogenes
Cardiotónico Adriamycina S. peucetius F ungichromina S. cellulosae Endomycina S.endus
Anticoagulante Actinomycina O S. antibioticus Puromycina S. alboniger
Bloqueador neuromuscular Neomycina S. fradiae Streptomycina S.griseus Kanamycina S. kanamyceticus
Antitumoral Actinomycina S. antibioticus Bleomycina S. verticillus Azaserina S. fragilis
Antihelmíntico Avermectina S. avermitilis
Herbicida Herbicidina S. saganonenses
Insecticida Piericidina S. mobaraensis
Acaricida Mylbemycinas Streptomyces sp.
Coccidiostático Monensina S. cinnamonensis Fuente: Vandamme, 1983.
8
ií:t Tabla 3. Cantidad de metabolitos secundarios producidos por diferentes
microorganismos.
Origen Antibióticos Otros metabolitos Metabolitos inactivos'
bioactivos
Bacterias 1.400 (12 %) 240 (9 %) 2.000-5.000
Actinomicetos 7.900 (66 %) 1.220 (40 %) 8.000 - 10.000
Hongos 2.600 (22 %) 1.540 (51 %) 15.000-25.000
Total 11.900 3.000 25.000-40.000
Líquenes 150 200-500 1.000
Algas 700 800-900 1.000 - 2.000
Plantas superiores 5.000 25.000-35.000 500.000-800.000
Animales terrestres 500 10.000-15.000 200.000-300.000
Animales marinos 1.200 1. 500-2.000 2. 000 - 3. 000
Total 7.500 35.000-50.000 >1.000.000
Fuente: Bérdy, 1995.
9
Streptomyces están relacionadas con la producción del 72.4 % de las
sustancias (Tabla 4).
1.3. CARACTERÍSTICAS DEL GÉNERO STREPTOMYCES
Las bacterias del género Streptomyces producen hitas
vegetativas 0.5 - 2.0 ¡.tm de diámetro, organizadas en un micelio
ramificado que raramente se fragmenta. El micelio aéreo puede
producir cadenas de esporas en cantidades que varían entre tres y
cientos de ellas. Algunas especies pueden producir cadenas cortas de
esporas en el micelio de sustrato. También pueden observarse en otras
especies, estructuras similares a esclerotes, picnidios, esporangios y
sinemas ( Williams y col., 1989).
El ciclo de vida de un estreptomiceto se caracteriza porque en
términos generales exhibe tres estructuras que pueden ser evaluadas
microscópicamente. Estas son: a) Un micelio primario, vegetativo o de
sustrato que crece sobre y dentro del agar (medio sólido), aunque
también se desarrolla en medios de cultivo líquido, b) un micelio aéreo
que porta esporas organizadas en cadenas de longitud variable y e) las
esporas mismas. Las esporas de Streptomyces han sido estudiadas por
diversos autores y entre sus características más importantes podemos
señalar: a) existen algunos reportes de estreptomicetos formadores de
esporas en su micelio de sustrato pero éstas podrían ser producto de
las deformaciones de las hitas en lugar de verdaderas esporas, b) las
esporas aéreas se forman por septación y desarticulación de la hita y
las paredes de la espora se forman en buena parte a partir de las
paredes de la hita parental (desarrollo holotálico}, y e) las esporas
10
Tabla 4. Cantidad de sustancias bioactivas reportadas entre 1993 y 1997 en la revista "Journal of Antibiotics" y los microorganismos que las producen.
Sustancias bioactivas
Producidas por: Streptomyces Actinomadura Micromonospora Amycolatopsis Nocardia Actinoplanes Planobispora Saccharopolyspora Streptosporangium Microbispora Microtetraspora Saccharotrix Streptoverticillium Amycolata Dactylosporangium Nocardiopsis No identificado
Total de sustancias producidas por
* Actinomicetos:
* Otros microorganismos:
1 . 182 ( 1 00 %)
443 37 19 16 15 10 9 7 4 3 3 3 2 1 1 1
38
612 (51.8 %)
570 (48.2 %)
ll
pueden organizarse dentro de una vaina fibrosa (Williams y col., 1989;
Locci y Sharples, 1983).
Las colonias de Streptomyces son liquenoides, cuerosas o
butirosas. Las colonias jóvenes generalmente presentan la superficie
lisa y con el tiempo desarrollan un micelio aéreo hirsuto, granular,
polvoriento o aterciopelado. Producen una amplia variedad de
pigmentos responsables del color del micelio aéreo y vegetativo.
También producen pigmentos difusibles (Williams y col., 1989).
Son microorganismos aerobios, grampositivos y no ácido-alcohol
resistentes. Poseen metabolismo oxidativo. Son catalasa positivos.
Generalmente reducen los nitratos a nitritos y degradan diversos
compuestos, tales como adenina, esculina, caseína, gelatina,
hipoxantina, almidón y L-tirosina. Pueden utilizar un amplio rango de
compuestos orgánicos como únicas fuentes de carbono y energía. La
temperatura óptima de crecimiento oscila entre 25 y 35 °C, aunque
algunas especies crecen a temperaturas en el rango psicrofílico y
termofílico. El rango óptimo de pH para el crecimiento es de 6.5-8.0.
(Williams y col., 1989).
El peptidoglicano incluye ácido L-diaminopimélico. Carecen de
ácidos micólicos. Tienen ácidos grasos saturados, y del tipo iso y
anteiso. Pueden presentar menaquinonas hexa- u octa-hidrogenadas
con nueve unidades de isopreno. El patrón de lípidos polares exhibe
disfosfatidilglicerol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol y manósidos
de fosfatidilinositol. Están ampliamente distribuidas en el suelo. Algunas
especies son patógenas para el hombre y los animales, otras son
12
fitopatógenas. El contenido de G+C del ADN es de 69-78 moles %
(Goodfellowy Cross, 1984).
1.4. ECOLOGIA
Streptomyces está ampliamente distribuido en la naturaleza. Los
principales reservorios para estos microorganismos son el suelo, el
compost, el agua y los sedimentos marinos (Goodfellow y Williams,
1983; García-Quintana y col., 1997; González y col., 1999). La mayoría
son saprófitos y algunos pueden ser parásitos de plantas, animales y el
hombre. Probablemente Streptomyces se encuentra en el suelo en
forma de esporas. Pueden degradar celulosa, lignina y lignocelulosa
(Crawford, 1986), quitina (Williams y Robinson, 1981). Streptomyces
produce compuestos volátiles como la geosmina (1, 1 O -dimetil-trans-9-
decalol) y el metilisoborneol, sustancias que están asociadas con el
olor a tierra mojada.
La escabiosis de la papa es la principal enfermedad vegetal
producida con Streptomyces, siendo S. scabies la especie más
comúnmente asociada con esta enfermedad (Schottel y col., 1992).
Diversas especies de Streptomyces han sido aisladas de casos
clínicos en humanos. S. somaliensis ha sido identificada como uno de
los agentes etiológicos del actinomicetoma en todo el mundo (Serrano
y col., 1998). Otras especies de Streptomyces tales como, S.
violaceoruber, S. coelicolor, S. albus, S. rimosus, han sido asociadas a
infecciones no micetómicas y se han aislado a partir de caries dental,
sangre, amígdalas, piel y esputo (Mcnell y Brown, 1994).
13
1.5. TAXONOMÍA E IDENTIFICACIÓN.
Las primeras descripciones de las especies de Streptomyces se
remontan a comienzos del siglo XX y fueron hechas por los
bacteriólogos del suelo. Los criterios básicos empleados en estas
descripciones tenían que ver con los requerimientos ecológicos, la
pigmentación y la morfología de la cadena de esporas. Para entones
fue utilizado el nombre de Actinomyces hasta que en 1943 Waksman y
Henrici propusieron el nombre de Streptomyces para denominar a los
actinomicetos aeróbios formadores de esporas y evitar así confundirlos
con los organismos patógenos microerofílicos que mantuvieron su
nombre de Actinomyces. Después del descubrimiento de la
actinomicina, producida por S. antibioticus, los investigadores pusieron
mucho interés en los estreptomicetos y se diseñaron diferentes
métodos de aislamiento de estos microorganismos. Como hemos
indicado arriba, los actinomicetos fueron adquiriendo cada vez mayor
atención por ser una fuente importante de sustancias de valor bio
comercial. La gran biodiversidad de estas bacterias y la carencia de
criterios objetivos para su clasificación e identificación condujo a la
descripción de muchísimas "nuevas especies". Es así que entre 1940 y
1957 fueron descritas más de un centenar de especies, mientras que
para 1970 el número había aumentado a unas 3.000 entre las citadas
en las patentes y en diferentes publicaciones (Manfio y col., 1994).
En este sentido el lnternational Streptomyces Proyect (Shirling y
Gottlieb, 1966) constituyó un esfuerzo cooperativo a nivel mundial para
redescribir, siguiendo métodos y criterios estandarizados, cada una de
14
las cepas tipo pertenecientes a varias colecciones disponibles en todo
el mundo. Para ello participaron más de 40 investigadores de 17 países.
Cada cepa fue descrita independientemente por tres especialistas de
diferentes laboratorios participantes. Esta actividad fue auspiciada por
el Subcomité de Actinomicetos del Comité de Taxonomía de la
Sociedad Americana de Microbiología (Subcommittee on Actinomycetes
of the Committee on T axonomy of the American Society of
Microbiology) y el Subcomité sobre Taxonomía de los Actinomicetos
del Comité Internacional sobre Nomenclatura Bacteriológica
(Subcommittee on Taxonomy of Actinomycetes of the lnternational
Committee on Bacteriological Nomenclatura ). Se dan instrucciones
para la preparación de 8 medios de cultivo estándar y se indican los
métodos para cultivar y preparar los inóculos así como las normas para
caracterizar los cultivos en sus aspectos morfológicos y en sus
propiedades fisiológicas (producción de melanina y utilización de
fuentes de carbono).
Una combinación de caracteres morfológicos y citoquímicos son
recomendados para la identificación a nivel de género (Goodfellow y
Cross 1984; Schaal, 1985).
Otra aproximación a la taxonomía de Streptomyces la da la
taxonomía numérica. Las clasificaciones basadas en la taxonomía
numérica proveen de un alto contenido de información que permite la
construcción de esquemas precisos de identificación. Una de las
ventajas de la taxonomía numérica es que puede ser una fuente
importante de información acerca del comportamiento fisiológico y
bioquímico de las cepas asignadas a cada grupo taxonómico. Esta
información se puede expresar como el porcentaje de cepas dentro de
15
cada grupo que son positivas para un determinado carácter. Con esta
información se puede construir una base de datos y matrices de
identificación que preferiblemente contengan el mínimo número de
caracteres requeridos para diferenciar entre los taxa previamente
definidos por la taxonomía numérica. Una vez hechas las matrices,
pueden ser utilizadas en la identificación probabilística de cepas
desconocidas.
Williams y colaboradores (1983a) analizan por taxonomía
numérica a 475 cepas de actinomicetos, entre ellas a 394 especies de
Streptomyces que fueron estudiadas en 139 características que
incluían, morfología y pigmentación, actividad antimicrobiana, actividad
enzimática, degradación de diversos sustratos, resistencia a
antibióticos, crecimiento a diferentes temperaturas y en presencia de
inhibidores químicos y utilización de fuentes de carbono y de nitrógeno.
Los autores encuentran que las 394 especies de Streptomyces pueden
agruparse en tan sólo 77 "cluster" o taxa, definidas a 77.5 % de
similitud cuando se aplica el Coeficiente de Similitud Simple (SsM). La
distribución mostró ser bastante heterogénea: 284 cepas de
estreptomicetos se distribuyeron en 19 cluster mayores (6-71 cepas), 40
cluster menores (2-5 cepas) y 18 cluster de un solo miembro (1 cepa).
Los autores sugieren que algunos de los cluster mayores, en virtud de
su tamaño y homogeneidad, pueden ser considerados como
representativos de especie. Lo mismo se sugiere acerca de los cluster
de un solo miembro y de muchos de los cluster menores, mientras que
la mayoría de los cluster mayores deben aceptarse como lo que ellos
denominan "grupo-especies" que ameritan estudios genéticos y
citoquímicos complementarios para determinar el verdadero estatus de
sus miembros. Este estudio de Williams y sus colaboradores indica
16
también, que los géneros Actinopycnidium, Actinosporangium, Chainia,
Elytrosporangium, Kitasatoa y Microellobosporia debían ser
considerados sinónimos de Streptomyces. Esto en razón de que las
cepas de estos microorganismos que fueron incluidas en el estudio
mostraron valores de similitud con Streptomyces que resultaron en su
inclusión dentro de los cluster ya mencionados y se propone su
inclusión en este género.
Los datos obtenidos en este trabajo de Williams y col. (1983a)
constituyen la base de la clasificación del género Streptomyces de la
novena edición del Bergey · s Manual of Systematic Bacteriology
(Williams y col., 1989) y también sirvieron de base para la construcción
de algünas matrices de identificación probabilística. Estas fueron
creadas para que mediante el uso de la computadora y programas
apropiados se pudieran identificar probabilísticamente cepas nuevas o
desconocidas considerando únicamente la mínima cantidad de
características necesarias para discriminar entre los diferentes cluster
previamente establecidos por Williams y colaboradores. Surge así, la
matriz de Williams y col. (1983b) en la que se evalúan 41
características y 20 cluster de Streptomyces y las matrices de
Langham y col. (1989) con 50 y 39 características para 26 y 28
cluster, respectivamente.
En 1991 Kampfer y colaboradores publican un nuevo estudio de
taxonomía numérica sobre Streptomyces en el que evalúan 821 cepas
de Streptomyces y Streptovertici/lium caracterizadas fisiológicamente a
través de 329 pruebas miniaturizadas (placas de microtitulación). Los
autores quieren mediante este trabajo evaluar las especies y grupo
especies definidos por Williams y col. (1983 a y b), así como incluir en
17
su estudio algunas especies de Streptomyces que no fueron evaluadas
en trabajos anteriores. Estos autores consideran únicamente en su
estudio las características fisiológicas de las cepas ya que como ha
sido reconocido por otros autores, la morfología de la cadena de
esporas puede presentarse en más de una forma en una misma
especie y la pigmentación es difícil de evaluar con precisión. Los
resultados de este amplio trabajo de taxonomía numérica confirman
muchos de los grupos encontrados por Williams y colaboradores, por lo
que los autores apoyan la propuesta de los anteriores en el sentido de
reducir al estatus de especie a muchos de los cluster mayores.
Además, Kampfer y colaboradores ( 1991) obtienen altos valores de
similitud entre Streptoverticillium y Streptomyces por lo que proponen
que las cepas de Streptoverticillium sean transferidas (reclasificadas) en
el género Streptomyces.
Los resultados del estudio numérico de Kampfer y col. (1991),
fueron utilizados en la construcción de una matriz de probabilidad para
la identificación de los estreptomicetos, mediante ensayos fisiológicos
miniaturizados (Kampfer y Kroppenstedt, 1991 ). La matriz consta de 50
pruebas versus 52 grupos taxonómicos e incluye cepas de Jos cluster
mayores y menores de la clasificación de Kampfer y col. ( 1991 ). Los 50
ensayos contemplan 45 pruebas de utilización de fuentes de carbono y
5 ensayos enzimáticos cualitativos para la utilización de sustratos
cromogénicos.
18
CAPITULO 2
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA,
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS.
2.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La utilización de antibióticos para el tratamiento de enfermedades
infecciosas en humanos y animales es un hecho cotidiano que en vez
de disminuir se incrementa con el tiempo. Esto se debe, entre otras
razones, al aumento mismo de la población humana que sigue su
ascenso exponencial con el hasta ahora inevitable aumento de la
pobreza. Como consecuencia se crean condiciones de vida insalubres,
desnutrición y otros males para una buena parte de la población
mundial que, son el "caldo de cultivo" para variadas enfermedades
infecciosas. Además, el surgimiento de cepas de microorganismos
patógenos resistentes a muchos de los antibióticos conocidos
constituye un problema adicional quer hay que resolver para un efectivo
control y erradicación de esas enfermedades infecciosas.
Por otra parte, aun cuando muchos de los antibióticos son
obtenidos por procesos fermentativos y los microorganismos
productores pueden encontrarse en el suelo, pocos han sido los
esfuerzos que se han hecho en nuestro país a fin de producir algún
antibiótico a escala industrial.
Estos dos problemas, la necesidad de encontrar nuevas cepas
productoras de antibióticos y la posibilidad de producir algún antibiótico
en nuestro país, nos ha conducido a plantearnos las siguientes
hipótesis y objetivos:
19
2.2. H/POTESIS
1 o Es posible aislar y seleccionar actinomicetos del suelo que
produzcan antibiosis contra cepas seleccionadas de organismos
sensibles.
2° Aplicando métodos de extracción con solventes orgánicos y
de análisis cromatográfico es posible caracterizar la sustancia
responsable de la actividad antibiótica.
2.3. OBJETIVOS
1) Recoger y colectar muestras de suelo de diferentes regiones del país.
2) Aislar actinomicetos de esas muestras.
3) Evaluar su capacidad para producir antibiosis.
4) Seleccionar una cepa de entre las aisladas.
5) Caracterizar esta cepa a fin de identificarla a nivel de género y, si es
posible, de especie.
6) Estudiar los aspectos relacionados con el crecimiento del
microorganismo y la producción de antibiosis.
7) Estudiar la actividad antibiótica de los extractos brutos y aislar y
purificar parcialmente el principio activo.
20
CAPITULO 3
MATERIALES Y MÉTODOS
3. 1 MICROORGANISMOS DE REFERENCIA PARA PRUEBAS
ANTIBIÓTICAS
Los microorganismos contra los que se ensayó la actividad
antimicrobiana de la cepa Streptomyces sp. T 77 fueron: Escherichia
coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 60519,
Sarcina lutea ULA 15, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Nocardia
asteroides ATCC 19247, Rhodococcus rhodochrous ATCC 13808,
Gandida utilis ATCC 5239, Gandida albicans ATCC y Aspergillus niger
ATCC 29212.
3.2 MEDIOS DE CULTIVO
Ver capítulo 7. Apéndice.
3.3 SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE
ANTIBIÓTICOS.
3.3.1. ORIGEN y RECOLECCIÓN DE LAS MUESTRAS DE
SUELO.
Se recolectaron 12 muestras de suelo de los siguientes lugares:
1) Frailejón: rizosfera de frailejón (Espeletia sp.), Parque Nacional La
Culata, Edo. Mérida; 2) Cultivo de papa, Parque Nacional La Culata; 3)
21
Cueva del Valle, una mezcla de tierra y guano de murciélago, El Valle,
Edo. Mérida 4) El Arado: bosquecillo de galería vía Monterrey, El Valle,
Edo. Mérida; 5) Lagunillas (cafetal): siembra de cafeto en Lagunillas,
Edo. Mérida; 6) Lagunillas (cactáceas): zona de cactáceas en
Lagunillas, Edo. Mérida 7) Tintorero: vía Tintorero, Edo. Lara; 8) San
Pablo; vía San Pablo; E do. Lara; 9) Quíbor: vía Quíbor, E do. Lara; 1 O)
Pueblo Nuevo: Zona de cactáceas, Pueblo Nuevo, Edo. Falcón; 11)
Hato El Frío: Hato del mismo nombre en el Edo. Apure; 12) Isla Babilla:
isla del mismo nombre en el río Orinoco, cerca de Pto. Ayacucho, Edo.
Amazonas.
3.3.2. TOMA DE LA MUESTRA DE SUELO.
Se escarbó el suelo hasta unos 1 O cm de profundidad, se colocó
la tierra en una placa de Petri estéril y se transportó hasta el Laboratorio
donde se procesó como se describe a continuación.
3.3.3. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA DE SUELO
Con la finalidad de separar la tierra de piedras, restos orgánicos,
etc., se cernió la muestra con un colador. Luego se resuspendió 1.0 gr
de la tierra cernida en 10.0 mi de solución salina estéril, se agitó
mecánicamente por 3 minutos y se dejó reposar por unos 1 O minutos. A
continuación se hicieron diluciones seriadas de esta suspensión y se
sembraron alícuotas de 0.1 mi de la suspensión original y de las
diluciones 1 o-1 1 o-2 y 10-3. La siembra se hizo en superficie, con un
rastrillo de vidrio, sobre los siguientes medios de cultivo: 1 ) agar
Middlebrook 7H-9 (Difco) suplementado con glicerol (0.2 % v/v) y
anfotericina 8 (2.5 mg/L), 2) el mismo medio y suplementos y además
22
tetraciclina (25 ~g/ml), 3) Agar almidón/caseina suplementado con
anfotericina 8 (2.5 mg/L). Las placas se incubaron a 30 oc por 21 días.
3.3.4. AISLAMIENTO DE LAS CEPAS DE ACTINOMICETOS.
Se seleccionaron las colonias que presentaban características
compatibles con las de los actinomicetos, i.e., colonias secas, de
aspecto polvoriento o terroso y pigmentadas. Las cepas seleccionadas
fueron repicadas a placas de agar nutriente para confirmar su pureza y
se mantuvieron en dos medios de conservación: 1) glicerol al 20 % (a -
20°C) y 2) agar inclinado (cuñas) Bennett (a temp. ambiente).
3.3.5 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
DE LAS CEPAS DE ACTINOMICETOS SELECCIONADAS.
Se uitilizó el método del taco que consiste en lo siguiente: Las
cepas seleccionadas fueron crecidas en agar Bennett durante 5 días
de incubación a 30 °C. Al cabo de este tiempo se tomaron tacos de
agar de las áreas que mostraban crecimiento de las cepas. Estos tacos
se obtuvieron introduciendo en el agar, pitillos de plástico (sorbedores)
estériles -que hicieron las veces de sacabocados desechables- y que al
sacarlos traían consigo un trozo de agar cilíndrico y de unos 5.0 mm de
diámetro por 7.0 mm de largo. Luego se colocaron estos tacos sobre
placas de agar Mueller-Hinton recién sembradas con cada uno de los
microorganismos de referencia y se incubaron a 37 oc por 18 horas. La
actividad antimicrobiana se manifestó por un halo de inhibición del
crecimiento alrededor de la cepa (taco) de ensayo. El diámetro de este
halo fue medido con una regla. Los microorganismos de referencia
contra los que se ensayó la actividad antimicrobiana fueron: Escherichia
23
co/i ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 60519,
Sarcina lutea ULA 15, Enterococcus faecalis ATCC 29212 y E faecalis
ATCC 19438.
3.4. CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE LA CEPA T77
Como consecuencia del método de selección que fue utilizado,
se seleccionó una de las cepas (ver Resultados y Discusión) que
identificamos como cepa T 77. Los ensayos realizados en lo sucesivo
se refieren a esta cepa.
3.4.1. MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA DE LA CEPA T77.
Para el estudio morfológico se sembró la cepa por agotamiento
en el medio de agar extracto de malta extracto de levadura (ISP2) e
inmediatamente se insertaron dentro del agar varias laminillas
cubreobjetos estériles (22 mm x 22 mm) en un ángulo aproximado de
45°. Después de 7 días de incubación a 32 °C, las laminillas
cubreobjetos fueron cuidadosamente retiradas de la placa de agar,
sumergidas en metano! por 1 O minutos y luego coloreadas con una
solución de cristal violeta al 1 % por 1 minuto. A continuación, se
dejaron en solución lugol por dos minutos, se enjuagaron con agua y se
permitió secar a la temperatura ambiente. Una vez secas se pegaron
con Martex sobre láminas portaobjetos y se observaron al microscopio
óptico.
3.4.2. MORFOLÓGÍA MACROSCÓPICA DE LA CEPA T77.
24
3.4.2.1. CULTIVOS EN MEDIOS SÓLIDOS.
La cepa se sembró en medios de cultivo de diferente
composición y se incubó a 30 oc por 14 días. Al término de este tiempo
se evaluó la cantidad de crecimiento, el color del micelio aereo, la
producción del exopigmento y el color del micelio de sustrato. Para esto
último se siguió el procedimiento de Shirling y Gottlieb (1966): se tomó
un pedazo de agar con el crecimiento de la cepa y con una hojilla se
cortó el agar justo debajo del crecimiento microbiano a fin de poder
evaluar sin interferencia del agar, el color del micelio de sustrato.
3.4.2.2. CULTIVOS EN MEDIOS LÍQUIDOS.
La cepa fue crecida en los medios ISP2, ISP4, Bennett y Caldo
Nutriente a 30 oc y 200 r.p.m. de agitación orbital. A los 7 días se
evaluó a simple vista la cantidad de crecimiento y la producción de
exopigmento.
3.5. DETERMINACIÓN DEL ISÓMERO DEL ÁCIDO DIAMINOPIMÉ
LICO (DAP) ASOCIADO A LA PARED.
Tres mg de biomasa seca de la cepa T 77 fue hidrolizada con 1.0
mi de HCI 6 N por 18 horas a 100 °C. Al cabo de este tiempo el
hidrolizado se centrifugó en una microcentrifuga Eppendorf y el
sobrenadante fue recuperado y mezclado con 1.0 mi de agua destilada.
La mezcla se dejó secar en el homo a 1 00 oc y el residuo obtenido fue
resuspendido en 1.0 mi de agua destilada y secado una vez más. Una
25
vez seco, se resuspendió en 0.1 mi de HCI 0.08 N. Tres J.1 1 de este
extracto fue aplicado sobre una placa de celulosa (Merck ) para
cromatografía en capa fina de alta resolución (HPTLC). Además se
aplicaron extractos preparados de hidrolizados de cepas de referencia
así como del patrón de ácido mesodiaminopimélico (Sigma). El sistema
de solventes (fase móvil) en la corrida fue la mezcla de metanol-agua
HCI-piridina (80:26:4: 1 O v/v). Para obtener una buena separación se
dejó correr 1 O cm el frente del sistema de solventes, se dejó secar la
placa y se reveló asperjándole ninhidrina al 0.2 % en butanol saturado
con agua y calentándola por 5 minutos a 100 °C.
3. 6. CARACTERIZACION DE LA CEPA T77 BAJO DIFERENTES
CONDICIONES EXPERIMENTALES
3.6.1. DEGRADACIÓN DE COMPUESTOS.
La degradación de xantina (0.4 % p/v), hipoxantina, tirosina (0.5
% p/v) y almidón (1 % p/v) fue detectada en agar nutriente
suplementado con estos compuestos. Para la lectura de los tres
primeros, se consideró un resultado positivo cuando ocurría el
aclaramiento del medio alrededor y/o por debajo del crecimiento del
microorganismo. En la prueba de degradación del almidón el resultado
era positivo cuando al agregar unas gotas de solución de Lugol se
observó una zona clara alrededor de las colonias en crecimiento.
La degradación de la urea se determinó inoculando una asada de
esporas en tubos de ensayo con caldo urea (Difco ). El viraje del
indicador (rojo fenal) de rosado a fucsia fue considerado como positivo.
26
La descomposición de la caseína fue determinada sobre placas
de agar Skim Milk . La prueba positiva presenta aclaramiento del medio
alrededor y por debajo del crecimiento.
3.6.2. DETERMINACIÓN DE LA RESISTENCIA A ANTIBIÓTI
COS.
Se sembró una asada de esporas de la cepa T77 en placas de
agar Bennett suplementadas cada una por separado con estreptomicina
(100 ¡.tg/ml), tetraciclina (50 ¡.tg/ml), rifampicina (50 ¡.tg/ml) y penicilina G
(1 O u.i./ml). Se incubó a 30 oc junto con un control sin antibiótico. Las
placas se leyeron después de 7 días de incubación.
3. 6.3. CRECIMIENTO A DIFERENTES TEMPERATURAS.
Sobre agar Bennett se determinó crecimiento a 4 oc después de
30 días de incubación, así como a 37° y 42 °C después de 7 días
de incubación.
3. 6.4. CRECIMIENTO EN PRESENCIA DE AGENTES
QUIMICOS.
Esto fue determinado en agar de Bennett suplementado con
fenal al 0.1 % (p/v) y NaCI al10 y 13% (p/v).
3.6.5. UTILIZACIÓN DE FUENTES DE NITRÓGENO.
27
Se determinó la capacidad de la cepa para crecer en un medio
basal suplementado con los siguientes compuestos al O, 1% (p/v) de
concentración como única fuente de nitrógeno: ácido-a-amino-n
butírico, L-arginina, L-cisteina, nitrato de potasio y L-asparagina. Los
resultados fueron determinados después de 15 días comparando el
crecimiento de la cepa en cada fuente de N y en una placa de medio
base sin suplementar (control negativo) así como en otra con L
asparagina como control positivo. La fórmula del medio basal se indica
en la sección Apéndice.
3.6.6. UTILIZACIÓN DE FUENTES DE CARBONO.
Se determinó la capacidad de la cepa para crecer en placas de
agar Medio ISP 9 (Shirling y Gottlieb 1966) suplementado con los
siguientes compuestos al 1 % de concentración final como única fuente
de carbono: O-glucosa, celulosa, sacarosa, rafinosa, L-arabinosa, 0-
xilosa, manitol, L-ramnosa, 0-fructosa y O-galactosa. Las placas de
agar fueron incubadas a 32 °C y los resultados se determinaron
después de 7, 14 y 21 días comparando el crecimiento con el de una
placa sin suplementar (control negativo) y un control positivo con O
glucosa. En la sección Apéndice se indica la fórmula y modo de
preparación del Medio ISP9.
3. 6. 7. DETERMINACIÓN DE LA RESISTENCIA A LA LISOZIMA.
Para esta prueba se sembró la cepa en tubos de ensayo con
caldo glicerol con lisozima (0.1 % p/v) y sin ella (tubo control). La
prueba se consideró positiva si había crecimiento en los dos tubos y
negativa si no lo había o era escaso en el medio con lisozima y
28
abundante en el tubo control. En el Apéndice se indica la formulación y
preparación del caldo.
3. 7. ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LA CEPA
T77.
Tres fueron los métodos utilizados: 1) el método del taco, ya
descrito en esta sección, 2) el del pozo y 3) el del disco de papel. En el
método del pozo, se utilizaron sobrenadantes de crecimiento de la cepa
T77 para estudiar la actividad antimicrobiana de la cepa cuando era
crecida en medios de cultivo líquido. En estos casos se procedió de la
siguiente manera. Las cepas de referencia se sembraron en superficie
sobre placas de Agar Mueller-Hinton. A continuación se hicieron pozos
en estas placas introduciendo dentro del agar un pitillo plástico estéril
que al sacarlo traía consigo un trozo de agar haciendo de esta manera
un agujero o "pozo" en el medio de cultivo. Dado que el fondo de estos
pozos es el piso de la placa de Petri, se vació en cada uno de ellos, 25
!J.I de agar fundido para sellar el pozo por debajo e impedir de esta
manera que el sobrenadante que agregáramos después difundiera por
el fondo de la placa. Luego se agregó a cada pozo 25 !J.I de
sobrenadante de crecimiento de la cepa T77 y se incubó a 37 oc por 18
o más horas, hasta la aparición de los halos de inhibición. En el método
del disco, se impregnaron pequeños discos de papel (5 mm de
diámetro) con suficiente cantidad del sobrenadante de crecimiento.
Luego se secaron con una corriente de aire antes de colocarlos sobre
la superficie de una placa de agar Mueller-Hinton previamente
inoculada con la cepa de referencia.
29
3.8 CARACTER{STICAS DE LAS CINÉTICAS DE CRECIMIENTO Y DE
PRODUCCIÓN DE ANTI810SIS DE LA CEPA T 77
3.8.1. CINÉTICA DE CRECIMIENTO.
Se determinó la variación en el peso seco de la cepa cuando era
crecida en caldo extracto de malta-extracto de levadura durante 96
horas. La curva se inició inoculando 0.1 mi del sobrenadante de
crecimiento de un cultivo de 72 horas de la cepa T 77 en cada una de
las 21 fiolas de 250 mi de aforo conteniendo 50 mi de caldo. Las fiolas
se incubaron en un agitador orbital marca New Brunswick regulado a
32 °C y 200 r.p.m. de agitación. A partir de este momento y hasta 96
horas después, se tomaron un total de 7 muestras de tres fiolas cada
una El contenido de cada una de las tres fiolas se centrifugó a 5000
r.p.m. durante 10 minutos, se guardó el sobrenadante a 4 oc para
determinar posteriormenté su actividad inhibitoria y la masa celular se
lavó con agua destilada estéril y se centrifugó nuevamente. Esta vez se
descartó el sobrenadante cuidadosamente y la masa celular se colocó
en pequeñas placas de Petri de 5 cm de diámetro, de peso conocido, y
se mantuvieron en una estufa a 1 00 oc durante 18 horas. Al cabo de
este tiempo se sacaron las placas del horno y se pesaron nuevamente.
en una balanza analítica (Mettler). El peso seco se determinó
calculando la diferencia entre los dos valores. Dado que para cada
punto de la curva el muestreo se hizo por triplicado, el valor del peso
seco se calculó promediando los tres valores obtenidos.
3.8.2. CINÉTICA DE PRODUCCIÓN DE ANT/810SIS.
Con la finalidad de determinar si la actividad inhibitoria está
siempre presente en los sobrenadantes de crecimiento o si aparece
30
después de cierto tiempo de crecimiento de la cepa, se ensayaron los
sobrenadantes de crecimiento de la cepa crecida en caldo extracto de
levadura-extracto de malta. Las muestras consisten en los
sobrenadantes que se guardaron a 4 oc durante la determinación de la
curva de crecimiento por lo que corresponden a los mismos tiempos
que se consideraron durante la misma, es decir, a O, 19, 27, 43, 67, 91
y 115 horas de edad del cultivo. La actividad inhibitoria sobre las cepas
de referencia se evaluó mediante el método de difusión en pozo (ver
aparte 3.7)
3.9. OBTENCIÓN, ANÁLISIS DEL EXTRACTO CRUDO Y
PURIFICACIÓN PARCIAL DE LOS PIGMENTOS.
3. 9. 1. OBTENCIÓN
Nueve fiolas de 1000 mi de aforo que contenían 200 mi de caldo
ISP2 se inocularon con 20 mi de un precultivo de Streptomyces sp. T77.
Las fiolas se mantuvieron en agitación (200 r.p.m.) a 30 °C. A los 5
días, se filtró el contenido de las fiolas y el sobrenadante (1.5 L) fue
extraído dos veces con acetato de etilo. Para ello se mezclaron en un
embudo de decantación 50 mi de sobrenadante con igual volumen de
acetato de etilo, se agitó vigorosamente y se permitió la separación de
las dos fases resultantes. La fase superior (fase orgánica) se recuperó
y constituyó el primer extracto. La fase inferior (fase acuosa) se
recolectó y se extrajo nuevamente con otros 50 mi de acetato de etilo.
La fase superior de esta segunda extracción se reunió con la primera.
Se procedió de esta manera hasta extraer la totalidad del volumen (1.5
L) del sobrenadante de crecimiento. El extracto se concentró en una
corriente de aire hasta que se secó completamente, lo que rindió un
31
residuo de color marrón que de ahora en adelante denominaremos
"extracto crudo". Se guardó en el refrigerador hasta su utilización. Una
parte de la fracción acuosa se concentró en corriente de aire y se
guardó para experimentos posteriores.
3.9.2. EVALUACIÓN DE LAS FRACCIONES ORGÁNICA
(EXTRACTO CRUDO) Y ACUOSA.
Se impregnaron discos de papel de 5 mm de diámetro con la
fracción acuosa, con una suspensión del extracto crudo en acetato de
etilo y con acetato de etilo puro (control). Los discos se secaron con
corriente de aire y se aplicaron en placas de agar Mueller-Hinton
sembradas con las cepas de referencia.
3.9.3. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DEL EXTRACTO
CRUDO.
En una placa de aluminio de silica gel (Merck N° 5444) se
aplicaron unos 5 J..ll de una suspensión del residuo orgánico en acetato
de etilo. La corrida se realizó con el sistema acetato de etilo/ acetona
/agua (6:4: 1 ).
3.9.4. BIOAUTOGRAF/AS.
Los cromatogramas en silica gel, en donde se corrieron las
suspensiones del extracto crudo se cortaron en tiras de unos 5 mm de
ancho por 4 cm de largo y se colocaron sobre placas de agar, con la
silica en contacto con la superficie. Estas placas fueron previamente
32
inoculadas con las cepas de referencia. Las placas se guardaron una
hora a 4 oc y luego se incubaron a 36°C durante 18 horas.
3.9.5. PURIFICACIÓN PARCIAL DE LOS PIGMENTOS.
Se adaptó el sistema de filtración Millipore mostrado en la página
57 para que hiciera las veces de una columna de cromatografía al
vacío. Para tal fin se colocó lana de vidrio en el fondo del cilindro de 15
mi que se usa con este conocido sistema de filtración y se rellenó el
cilindro (columna) con suficiente cantidad de silica gel. Luego se
conecto la fiola de 125 mi de aforo a una bomba de vacío y se agregó
el solvente (acetato de etilo: acetona: agua 6:4:1 ). Una vez empacada
la columna, se colocaron dos mi de muestra (residuo orgánico
resuspendido en acetato de etilo) y se permitió que, por presión
negativa, pasaran a través de la columna. Para recoger las fracciones
se detuvo la bomba de vacío y se recolectó y guardó el contenido. La
fiola se lavaba con acetato de etilo a fin de evitar que los restos de una
fracción contaminaran a la siguiente y se continuó con la operación
hasta recuperar todas las fracciones. Estas se trasvasaron a cápsulas
de Petri y se secaron con una corriente de aire. Una vez secas lo que
quedaba en cada una de las placas de Petri era un residuo (amarillo,
rosado, verde o morado, según el caso).
3. 10. ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS
PIGMENTOS.
A excepción del pigmento M2 que fue resuspendido en 1.0 mi de
metano!, los demás residuos se resuspendieron en 1.0 mi de acetato de
etilo y con ellos se impregnaron discos de papel que se dejaron secar
33
bajo una corriente de aire. Una vez secos los discos, se aplicaron sobre
placas de agar sembradas con B. subtilis, S. tutea, E. coli, A. niger y C.
albicans. También se aplicaron discos que habían sido impregnados
con metanol y acetato de etilo (controles). Los microorganismos se
incubaron 18 horas a 36 °C. Al final de este tiempo se midieron los
halos de inhibición.
34
CAPÍTULO 4
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE LAS CEPAS DE
ACTINOMICETOS.
Se aislaron 329 colonias probables de actinomicetos, a partir de
las 12 muestras de suelo recolectadas de diferentes regiones de
Venezuela. Los datos presentados en la Tabla 5 indican que las
muestras de suelo con mayor población de actinomicetos son las del
cultivo de papa y las de rizosfera de frailejón, seguidas por las
provenientes del Edo. Lara (Tintorero, San Pablo y Quíbor).
De las 329 cepas aisladas, 135 (41 %) mostraron antibiosis
contra al menos, uno de los microorganismos de referencia. Ciento
veinte (36.5 %) de los aislados mostraron actividad antimicrobiana
contra al menos un grampositivo, 12 (3.6 %) inhibieron tanto a
grampositivos como a E. coli (gramnegativo), mientras que tan solo 3
(0.9%) inhibió exclusivamente a E. coli. Ninguno de los aislados inhibió
a P. aeruginosa. Este patrón de antibiosis, donde observamos un alto
porcentaje de aislados que inhiben a grampositivos y con muy pocas
cepas activas contra gramnegativos, también ha sido reportado por
otros investigadores. Estos autores mencionan una alta frecuencia de
actividad antimicrobiana contra microorganismos grampositivos
encontrada entre actinomicetos aislados del suelo (Selim, 1971;
Abussaud, 1996; García -Quintana, 1997; Díaz y col, 1997).
35
Tabla 5. Población de actinomicetos por gramo de suelo estudiado.
Frailejón
Cultivo de papa
Cueva
El Arado
Lugar
Lagunillas (cafetal)
Lagunillas (cactáceas)
Tintorero
San Pablo
Quibor
Pueblo Nuevo
Hato "El Frío"
Isla Babilla
Condiciones experimentales:
UFC 1 gr de suelo
60.000
100.000
200
9.150
5.000
2.700
13.600
21.600
22.000
NO
5.000
500
Medio de aislamiento: Middlebrook 7H-9 y almidón- caseina como se indica en
la Tabla 6; Temperatura. 30 °C; Tiempo 2 a 3 semanas; Técnica para
determinar la población microbiana: dilución en placa.
36
Como pone de manifiesto la Tabla 6, el mayor porcentaje de
cepas bioactivas fue obtenido en la muestra proveniente de un cafetal
en Lagunillas (Edo. Mérida) seguido muy de cerca por la de rizosfera de
frailejón. De estos resultados se deduce que los suelos del estado
Mérida pueden ser considerados un importante reservorio de
actinomicetos con actividad antimicrobiana.
4.2. SELECCIÓN DE LA CEPA T77.
De entre las 329 cepas aisladas se seleccionó la N° T 77,
proveniente de una muestra de suelo tomada en Lagunillas
(cactáceas), Edo. Mérida (Tabla 6). Los criterios de selección fueron:
a) Mostrar halos de antibiosis mayores de 7 mm (Tabla 7) b) producir
un pigmento de color verde en determinados medios de cultivo
(Figura 1) y e) presentar antibiosis contra diversos microorganismos
grampositivos y hongos (Tabla 7). Tanto la producción de color verde
como la actividad antibiótica fueron estables y se mantuvieron
después de muchos subcultivos.
4.3. MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA DE LA CEPA T77.
Al microscopio óptico se observaron hifas finas y ramificadas
algunas de las cuales incluyen cadenas de esporas en cantidad variable
pero que, en general, oscilan entre 10 y 20 esporas por cadena (Figura
2). La coloración al Gram resultó positiva. No se observó fragmentación
del micelio ni ninguna otra estructura en particular. La Figura 3 muestra
37
Tabla 6. Cantidad de cepas de actinomicetos aisladas de las muestras de suelo.
Lugar Medios de Cepas Cepas bioactivas aislamiento aisladas
Cantidad %
Frailejón MI 18 13 72,2
Cultivo de papa MI 9 5 55,5
Cueva MI 4 1 25
El Arado MI- Tet 71 12 16,9
Lagunillas MI-Tet 67 31 46,3 (Cafetal)
Lagunillas MI- Tet 23 17 73,9 (Cactáceas)
Tintorero A/C 25 5 20
San Pablo A/C 31 6 "19,3
Quibor A/C 34 16 47
Pueblo Nuevo A/C 29 19 65,5
Hato El Frío A/C 9 6 66,6
Isla Babilla A/C 9 4 44,4
Total 329 135 (41 %)
Leyenda:
MI: Middlebrook 7H-9; MI-Tet: Middlebrook 7H-9 suplementado con
tetraciclina; A/C: almidón-caseina. Cepas bioactivas: aquellas que
inhibieron al menos uno de los microorganismos. Se considera que hubo
inhibición cuando el diámetro de los halos era igual o menor a 7 mm.
Condiciones experimentales:
Medios de aislamiento: Middlebrook 7H-9 y almidón-caseina según se
indique; Temperatura: 30 °C; Tiempo: 2 a 3 semanas.
38
Tabla 7. Diámetro (mm) de los halos de inhibición producidos por la cepa T77.
Método MICROORGANISMO Taco Disco
(valores en mm) BACTERIAS GRAMNEGATIVAS
P. aeruginosa ATCC 27853 o o E. coli ATCC 25922 o o
BACTERIAS GRAMPOSITIVAS
S. aureus ATCC 25923 15 o B. subtilis ATCC 60519 20 12
S. Jutea ULA 15 15 10
E. faecalis ATCC 19433 12 10
N. asteroides ATCC 14759 9 ND
N. otitidiscaviarum GAM 5 15 9
R. rhodochroccus ATCC 13808 14 o Cepa T77 15 6
Streptomyces sp. T1 02 20 ND
HONGOS Y LEVADURAS
A. níger ATCC 5239 15 10
C. albicans ULA 20 9
C. utilis ATCC 5239 12 9
Condiciones experimentales:
Medio de producción del agente antibiótico: agar y caldo ISP N° 2;
Temperatura: 30 °C; tiempo: 7 días; Agitación: 220 rpm; Medio de ensayo de
antibiosis: Müller-Hinton e ISP2; lnóculo de las cepas de referencia:
108UFC/ml aproximadamente; Temperatura de incubación: una hora a 4 oc para la difusión y 24 a 48 horas a 37 °C para el crecimiento de las cepas de
referencia; El diámetro de los halos de inhibición se expresan en mm.
NO: no determinado.
39
Figura l. Pigmento verde exocelular producido por la
cepa T 77.
Fotografía tomada a las 72 horas de crecimiento a 30 oc y 200 r.p.m. de agitación orbital. Medio de cultivo:
Caldo ISP 2 (extracto de malta-extracto de levadura).
40
Figura 2. Rifas y cadenas de esporas de la cepa T 77 (Microfotografía al microscopio de luz. X800).
'!·,
Microcultivo en lámina sobre agar ISP2 a los 7 días de incubación a 30 oc.
4 1
Figura 3. Esporas de la cepa T 77 (Microfotografía por Contraste Diferencial de Interfase al microscopio de luz)
42
una microfotografía de la cepa en donde se pueden observar las
esporas cilíndricas y lisas.
4.4. CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE LA CEPA T 77.
La cepa crece sobre placas de agar como colonias secas, de
unos 3-4 mm de diámetro después de 5 días de incubación, de aspecto
terroso y pigmentación variable dependiendo de la composición del
medio de cultivo. En agar extracto de levadura-extracto de malta
produce colonias que a los 5 días pueden observarse como colonias
verdes (Figura 4). A medida que envejecen, las colonias se van
oscureciendo y desarrollando un micelio aéreo blanquecino que las
envuelve total o parcialmente (Figuras 4 y 5). En la Tabla 8 se resumen
las características de crecimiento y pigmentación de la cepa evaluada
después de 14 días de crecimiento en diferentes medios sólidos de
cultivo. Esta tabla muestra las diversas características de pigmentación
que pueden presentar los micelios de la cepa según se cultive en uno u
otro medio. Pero lo más importante es que cuando ensayamos la
actividad antimicrobiana (a partir del crecimiento de la cepa en todos
estos medios) encontramos que se detectó únicamente cuando se
cultivó en medios donde se producía el exopigmento, es decir, en agar
ISP N° 2, ISP N° 5, Bennett y almidón-caseina.
En medios de cultivo líquido la cepa T ??puede crecer formando
esférulas de 1-2 mm de diámetro. En caldo ISP2 produce un
exopigmento verde después de 48-72 horas de crecimiento a 30 oc y
200 r.p.m. de agitación orbital (Figura 1 ). Después de 72 horas el medio
de cultivo se va tornando paulatinamente de color marrón. En la Tabla 9
se resumen las características del crecimiento de la cepa en diferentes
medios de cultivo líquidos.
43
Figura 4. Colonias de la cepa T77 (Morfología macroscópica).
Colonias de la cepa T 77 después de 5 días de crecimiento a 30 oc en agar ISP2 .
44
Figura 5. Colonias de la cepa T 77 (morfología macroscópica).
Colonias de la cepa T 77 después de 7 días de crecimiento a 30 °C en agar ISP2.
45
Tabla 8. Características de cultivo de la cepa T77 en medios sólidos.
Medio Crecimiento
Agar extracto de Abundante malta y levadura
(ISP N° 2)
Agar almidón Moderado sales inorgánicas
(ISP N° 4)
Agar asparagina Bueno glicerol
(ISP N° 5)
Agar tirosina Bueno (ISP N° 7)
Agar nutriente Moderado
Agar Bennett Abundante
Agar almidón- Abundante Caseina
Agar celulosa Moderado
Condiciones experimentales:
Micelio aéreo Gris
verdoso
Blanco amarillo
Blanco verdoso
Verde claro
Blanco
Gris verdoso
Verde claro
Beige
Pigmento Micelio de soluble sustrato Marrón Marrón oscuro oscuro
Ausente Incoloro
Marrón Marrón claro verdoso
Marrón Verde claro oscuro
Ausente Beige
Marrón Marrón verdoso
Marrón Verde claro
Ausente Beige
Temperatura: 30 °C; Tiempo: 14 días; pH inicial de los cultivos: 6.8- 7.2.
46
Tabla 9. Características de cultivo de la cepa T77 en medios líquidos.
Medio
Caldo ISP N° 2
Caldo ISP N° 4
Caldo Bennett
Caldo nutriente
Condiciones experimentales:
Crecimiento Exopigmento
Abundante Verde - marrón
Moderado Verde claro
Abundante Verde - marrón
Moderado Marrón claro
Temperatura: 30 °C; Agitación: 200 rpm; Tiempo: 14 días; pH inicial de los
medios: 6.8- 7.2.
47
4.5. DETERMINACIÓN DEL ISÓMERO DEL ÁCIDO
DIAMINOPIMÉLICO.
La cromatografía de alta resolución en capa fina de celulosa
indica que la cepa T 77 posee el isómero LL del ácido diaminopimélico
(DAP). El DAP es un aminoácido no proteico presente en el
peptidoglicano de las paredes celulares de las bacterias gramnegativas
(isómero meso) y de algunas grampositivas. Es considerado un
marcador quimiotaxonómico de mucho peso para la identificación de los
actinomicetos a nivel de género. En las bacterias del orden
Actinomycetales, podemos encontrar LL-diaminopimélico en los
géneros Streptomyces, Streptoverticillium, Arachnia, lntrasporangium,
Kineosporia, Nocardioides y Sporichthya. Sin embargo, estos géneros
difieren de manera importante entre sí y con respecto a Streptomyces
en sus características morfológicas y fisiológicas (Williams y col.,
1989).
4.6 CARACTERIZACIÓN DE LA CEPA T 77 BAJO
DIFERENTES CONDICIONES EXPERIMENTALES.
En las Tablas 10 y 11 se muestran Jos resultados del
comportamiento de la cepa T 77 bajo diferentes condiciones. La cepa
muestra, en general, capacidad para descomponer la mayoría de los
sustratos ensayados. Además, entre algunas de las características
resaltantes, destacan su resistencia a la penicilina y a la tetraciclina, su
capacidad para crecer a 45 oc así como en presencia de NaCI al 7%
48
Tabla 10. Características fisiológicas y bioquímicas de la cepa T77.
ENSAYO RESULTADO
Reducción del nitrato:
Descomposición de:
Resistencia a:
Quitina
Esculina
Caseina
Xantina
Hipoxantina
Tirosina
Almidón
Urea
Estreptomicina (100 f.lg/ml)
Tetraciclina (50 f.lg/ml)
Rifampicina (50 f.lg/ml)
Penicilina G (10 u.i.)
Lisozima ( 0.1 f.lg/ml)
Crecimiento a:
4°C
30°C
45 oc
Crecimiento con:
NaCI 4 y 7 % (p/v)
10 y 13% (p/v)
Fenol 0.1% (p/v)
Condiciones experimentales:
negativo
negativo
positivo
positivo
positivo
negativo
positivo
positivo
positivo
negativo
positivo
negativo
positivo
negativo
negativo
positivo
positivo
positivo
negativo
positivo
Temperatura: 30°C; Tiempo: 15 días; pH de los medios: 7.0- 7.2.
49
Tabla 11. Utilización de fuentes de nitrógeno y carbono por la cepa T
77.
FUENTE RESULTADO
Acido-a-amino-n-butírico positivo
L-Arginina positivo
L-Cisteina positivo
L-Nitrato de potasio positivo
L-Asparagina positivo
Manito! positivo
O-Glucosa positivo
0-Xilosa positivo
L-Arabinosa positivo
0-Fructosa positivo
O-Galactosa positivo
Sacarosa negativo
Rafinosa negativo
lnositol negativo
Control negativo negativo
Condiciones experimentales:
Temperatura: 30 °C; Tiempo: 14 días; pH del medio base: 7.0; Concentración
de las fuentes de carbono y nitrógeno: 1.0 y 0.1 % (p/v) respectivamente;
Controles positivos: medio base con glucosa y L-asparagina respectivamente;
Control negativo: medio base sin las fuentes respectivas.
50
(p/v) y la habilidad para utilizar diversas fuentes de nitrógeno y carbono
para su crecimiento.
4. 7. TAXONOMÍA DE LA CEPA T 77.
Los resultados de los estudios morfológico, citoquímico y fisiológico
de la cepa T 77 sugieren que pertenece al género Streptomyces. Esto
se apoya fundamentalmente en lo siguiente: presenta colonias
discretas, pigmentadas, con un micelio vegetativo que no fragmenta y
un micelio reproductivo portador de cadenas de esporas, que dan a la
colonia un aspecto polvoriento. Las cadenas de esporas están
dispuestas en forma flexuosa (rectiflexibles) y circular (retinaculiaperti)
aunque algunas espirales (spiral) pueden ser observadas. En algunos
medios de cultivo produce un exopigmento. En medios de cultivo líquido
crece formando pequeñas esférulas visibles a simple vista. Posee el
isómero LL del ácido diaminopimélico. Es capaz de hidrolizar diversos
sustratos y crecer a 45°C. Produce antibiosis contra bacterias
grampositivas y contra hongos (C. albicans y A. niger )
4.8. CINETICA DE CRECIMIENTO.
La Figura 6 muestra la variación del peso seco (mg) a medida
que transcurre el tiempo. La fase estacionaria se alcanza
aproximadamente a las 70 horas después de iniciado el cultivo. A partir
de este momento se observa un leve descenso del crecimiento seguido
de un repunte a partir de las 90 horas de edad del cultivo. Este
fenómeno, similar a una diauxia, podría obedecer al hecho de que el
51
Figura 6: Cinética de crecimiento de la cepa T77
200 --------·-·-------·--------------·-----------·----------··¡
_160 - ~~ 1
~ / 11,
-120 +-----------------~~~----------------------------~ o / ¡ ~ 80 ~ 1
~ 40 / !
o~ o 20 40 60 80 100
1 -~ Peso seco] Tiempo (horas)
Figura 7: Cinética de producción de antibiosis por la cepa T77.
120
30 -------·-------------·--··-··---·- ··--··----·---···-··---·---------···-----·-··-·--·-----,
1
en
-~10 ~----------~--~~----------------------------------~ ;e "E <( 5
0 ~------~~~--~--------~------~--------~------~
o 20 40 60
1 -+- C. utifis -11-- S. aureus 1
Condiciones experimentales:
80 100 Tiempo (horas)
120
Medio de cultivo: ISP N° 2; pH inicial del medio: 7; pH final del cultivo: 8;
Agitación: 200 rpm; Temperatura: 30 °C; Técnica de detección de la
antibiosis: pozo; lnóculo de la cepa de referencia (C. utilis y S. aureus): 108
UFC/ml; Medio de ensayo: Müeller-Hinton; Volumen de muestra: 25 J.!l.
Cada punto de la figura 6 es el promedio de tres determinaciones. Ver
Materiales y Métodos
52
medio ISP N° 2 contiene dos fuentes de carbono: la glucosa y la malta
(extracto).
4.9. CINÉTICA DE PRODUCCIÓN DE ANTIBIOSIS POR LA
CEPA T77.
Se pudo detectar antibiosis a partir de sobrenadantes que tenían
43 ó más horas de cultivo en caldo ISP N° 2 (ver Tabla 12). A las 27
horas de cultivo no se detectó actividad contra ninguno de los
organismos ensayados. Después de 67 horas de incubación la actividad
antimicrobiana -medida como diámetros de los halos de inhibición- fue
máxima para casi todos los microorganismos ensayados. Tomando en
cuenta estos hechos y considerando que según la cinética de
crecimiento (Figura 6) la fase estacionaria comienza a las 70 horas, se
puede afirmar que la(s) sustancia(s) bioactiva (s) responsable(s) de la
antibiosis se estarían produciendo en la fase exponencial de
crecimiento (entre las 27 y las 43 horas). En la Figura 7 se puede
observar que la actividad antimicrobiana se detecta por primera vez a
las 43 horas y alcanza su máximo a las 67 horas.
Si bien tradicionalmente los antibióticos son considerados
metabolitos secundarios en virtud de que la mayoría de ellos son
producidos durante la fase estacionaria de crecimiento, existen reportes
de sustancias con actividad antimicrobiana que son producidos durante
la fase exponencial de crecimiento. Tal es el caso de la
undecilprodigiosina, un pigmento rojo con actividad antimicrobiana
sintetizado por Streptomyces coelicolor, el cual se acumula durante la
fase exponencial de crecimiento (Hobbs y col., 1990). La nisamicina es
53
Tabla 12. Cinéticas de producción del agente antibiótico por la cepa T77.
Tiempo (horas)
Microorganismos 19 27 43 67 91 115
de referencia BACTERIAS
B. subtilis o o 14 18.5 18.5 18.5
S. aureus o o 16 20 20 21
R. rhodochrous o o 10 20 20 20
E. faecalis o o 15.5 20 20 20
N. asteroides o o 22 25 25 25
M.lutea o o 20 20 20 20
HONGOS
Y LEVADURAS
C. utilis o o 15 25 25 25
A. níger o o 11.5 23 24.5 24
Condiciones experimentales:
Medio de producción: Caldo ISP N° 2; Temperatura: 30 °C; Tiempo: 115 horas;
Agitación: 200 rpm; pH inicial del medio: 7.0; pH final del cultivo: 8; Medio de
ensayo de antibiosis: Müeller-Hinton e ISP2; Método de detección de la
antibiosis: pozo; Volumen de muestra: 25 f.d; Tiempo y temperatura de
incubación: una hora a 4 °C para la difusión del agente antibiótico.
Posteriormente, 24 horas a 37 °C para el crecimiento de las bacterias y 48
horas a 37 oc para el crecimiento de los hongos y levaduras. Los valores
indican milímetros y son el promedio de dos experimentos diferentes.
·- ~- ~~-- ~~-~---~~ ---- ------------~~~---
54
un antibiótico producido por Streptomyces sp. K 1 06, tiene actividad
contra bacterias grampositivas y hongos filamentosos y es producido a
partir de las 21 horas de crecimiento alcanzando su máximo a las 48
horas de incubación, cuando aún la cepa se encuentra en fase
exponencial de crecimiento (Hayashi y col., 1994). En el caso de la
sustancia bioactiva producida cepa T 77 estaríamos también en
presencia de un metabolito sintetizado y excretado durante el
crecimiento exponencial.
4.10.0BTENCIÓN Y EVALUACIÓN DE LAS FRACCIONES
ORGÁNICA Y ACUOSA.
Se obtuvieron 260 mg de un residuo marrón (extraído con 3 litros
de acetato de etilo) que provienen de 1.5 litros de sobrenadante de
cultivo de la cepa T 77 en caldo ISP 2. Este extracto crudo conforma la
fracción orgánica de se separó de la fase acuosa. Mientras esta última
fase no mostró actividad contra los microorganismos ensayados, el
extracto crudo resuspendido en acetato de etilo inhibió a varias
bacterias grampositivas además de los hongos, C. albicans y A.
niger.
La cromatografía, en capa fina de silica gel, del extracto crudo
mostró a simple vista y con luz visible, cuatro bandas bien definidas y
de colores diferentes: amarilla (A), rosada (R), verdeazulada (V) y
morada (M). Las bioautografías realizadas a partir de estas
cromatografías del extracto crudo indicaron que tanto la actividad
antimicrobiana como la antifúngica están asociadas con la banda
amarilla (A).
55
En vista de esto se procedió a purificar las 4 bandas por
cromatografía en columna de silica gel. Esto con la finalidad de
confirmar y estudiar con más detalle lo relacionado con la actividad
antimicrobiana de las bandas.
4.11. PURIFICACIÓN PARCIAL DE LOS PIGMENTOS QUE
CONSTITUYEN EL EXTRACTO CRUDO.
En la figura 8 se mu~stra el sistema Millipore adaptado para la
cromatografía en columna de silica gel. La suspensión del extracto
crudo en acetato de etilo, que se colocó en el tope de la columna de
silica, es de color marrón. En la medida en que, por efecto del vacío
aplicado al sistema, la muestra se desplaza por la columna, aparecieron
las bandas. La fotografía de la figura 8 recoge el instante en que ya la
muestra de extracto crudo se ha separado en todos los pigmentos que
la constituyen. Primero aparece la amarilla . que también fue la más
abundante. Luego la rosada. La primera banda morada que
denominamos BM1 no siempre se observaba (como tampoco se
observó en la cromatografía en capa fina que mencionamos en el
aparte 4.1 0). La verdeazulada en algunas ocasiones es verde y,en
otras, azul. La segunda banda morada (8M2) siempre quedó de última
y mostró muy poca movilidad por lo que tardó el doble de tiempo que
las otras en salir de la columna. En término medio, las cuatro primeras
bandas eluyeron en 15-20 minutos, con un volumen de 50-75 mi del
sistema de solvente (acetato de etilo 1 acetona 1 agua 6:4:1 v/v).
56
Figura 8. Cromatografía en columna de silica gel del extracto crudo de la cepa T 77.
~ Banda Morada (BM2)
~Banda Verdeazulada (B V)
~Banda Morada (BMl)
~Banda Rosada (BR)
~Banda Amarilla (BA)
Fase móvil: Acetato de etilo/acetona/agua (6:4: 1). Fase estacionaria: Silica gel
57
4.12. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS PIGMENTOS
BA, BR, BM1, BV Y 8M2.
Los pigmentos mostrados en la figura 8 se recogieron en
pequeñas cápsulas de Petri y se concentraron por evaporación en
corriente de aire y se ensayaron para evaluar su actividad
antimicrobiana. En las figuras 9 y 1 O se muestran fotografías de dos
de los ensayos realizados contra la levadura C. atbicans y el
grampositivo S. tutea, con discos impregnados con los pigmentos y
algunas fracciones derivados del extracto bruto antibiótico producido
por la cepa T 77. En la figura 10 se observa que S. tutea , a diferencia
de los otros microorganismos evaluados (resultados no mostrados), es
más sensible a 8R que a cualquier otro de los pigmentos. Además, se
observan en la Figura 1 O, pequeños halos de inhibición alrededor de los
discos impregnados con metano! y acetato de etilo (controles). Esto no
se observó en los antibiogramas de los otros microorganismos y se
puede explicar por la presencia de trazas de estos solventes en los
discos que aplicamos sobre S. lutea. Por otra parte, los resultados de
sensibilidad mostrados en la figura 1 O, nos permiten concluir que S.
lutea no es sensible a 8M2.
Los demás resultados (no mostrados) indican que ninguno de los
pigmentos inhibió a E. coti mientras que S. tutea, B. subtilis, C.
albicans (Figura 9) y A. niger mostraron sensibilidad aunque de manera
diferente. En la Tabla 13 se resumen los resultados para estas últimas
4 cepas cuyos aspectos más resaltantes son: Los pigmentos 8A, 8R y
8V muestran antibiosis contra los 4 microorganismos, mientras que
8M1 y 8M2, varían en esta característica. Estos resultados contrastan
con los discutidos en la sección 4.1 O en cuanto a que las
bioautografías del cromatograma en capa fina de silica gel del extracto
crudo mostraron que la antibiosis estaba asociada únicamente al
58
Figura 9. Sensibilidad de C. albicans a
fracciones derivadas del extracto bruto
antibiótico producido por la cepa T 77 .
l. Sobrenadante de crecimiento 2. Extracto crudo 3. Fracción acuosa 4. Banda amarilla (BA) 5. Banda morada (BM2) 6. Acetato de etilo (control) 7. Metanol (control) 8. Medio ISP2 (control) 9 . Extracto de ISP2 en acetato de etilo (control) Cada disco fue impregnado con 1 O ¡..tl de cada una de las diferentes fracciones.
59
Figura 10. Sensibilidad de S. lutea a los pigmentos
derivados del extracto crudo producido por la cepa T 77 .
BA. Banda amarilla BV. Banda verdeazul BR. Banda rosada BM2. Banda morada 2 C l. Metanol (control) C2. Acetato de etilo (control) Cada disco fue impregnado con 1 O ul de cada una de las diferentes fracciones.
60
Tabla 13. Sensibilidad de varias cepas de referencia a los
pigmentos derivados del extracto crudo antibiótico producido por la
cepa T 77.
BANDAS DEL EXTRACTO CRUDO
Amarilla Rosada Morada 1 Verde Morada 2
Cepas de (BA) (BR) (BM1) (BV) (8M2)
referencia
Bacterias
S. tutea S . s S S R
B. subtilis S S S S R
Hongos
y levaduras
C. albicans S S R S R
A. niger S S R S R
Condiciones experimentales:
Muestra: bandas derivadas del extracto crudo del sobrenadante de
crecimiento de la cepa T77 en caldo ISP N° 2; Medio de ensayo de
la antibiosis: Müeller-Hinton e ISP2; lnóculo de las cepas de
referencia: 108 UFC/ml ; Método de detección de la antibiosis: Disco
impregnado con un volumen de muestra de 1 O ¡.1l; Tiempos y
temperatura de incubación: 1 hora a 4 oc para la difusión del agente
antibiótico, 24 horas a 37 oc para el crecimiento de las bacterias y
48 horas para el de levaduras y hongos.
Leyenda:
S: sensible; R: resistente.
61
pigmento amarillo (A) . Para resolver esta contradicción, realizamos
cromatografías y bioautografías de cada uno de los pigmentos.
4.13. CROMATOGRAFÍA Y BIOAUTOGRAFÍA DE LOS PIGMENTOS
BA, BR, BM1,BV Y 8M2.
La cromatografía en capa fina de silica gel de los pigmentos con
el sistema de solventes acetato de etilo : acetona : agua ( 6: 4: 1 v/v)
reveló que, cada pigmento está constituido por más de una sustancia.
La figura 11 es un dibujo de la cromatografía con el que representamos
las diferentes bandas detectadas. El pigmento BA mostró dos bandas.
Una con un RF de 0.80, bastante gruesa y de color amarillo. La otra,
de color rosado y RF de 0.42. El pigmento BR, muestra también estas
dos bandas, aunque la amarilla en menor cuantía e intensidad. BM1
presenta una pequeña banda amarilla con el mismo RF que la
encontrada en los pigmentos anteriores, además de una morada (RF =
0.57) y otra marrón (RF 0.37). El pigmento verdeazul (BV) se separó en
los componentes amarillo (RF =0.80) y azul (RF = 0.50). El pigmento
M2 sólo presentó una banda de color morado (RF = 0.37).
Estos resultados indican que los pigmentos BA, BR, BM1 y BV,
no están puros, y que en realidad conforman una mezcla de los
compuestos anteriormente mencionados. En virtud de ·que los
pigmentos bioactivos BA, BR, BM1 y BV (Tabla 13) tienen todos en
común el componente amarillo de RF = 0.80 (Figura 11) se puede
entonces inferir que la acción inhibidora se debería a esta banda.
Con la finalidad de comprobar si nuestra inferencia es correcta,
se realizó una bioautografía con las bandas aisladas en la
cromatografía de la figura 11 . La figura 12 muestra una bioautografía
62
Figura 11. Separación por cromatografía en capa
fina de silica gel de los pigmentos obtenidos del
extracto crudo antibiótico producido por la cepa T 77.
-
BA BR BMI
..
BV BM2
(---Frente del solvente (--- RF= 0.80
(--- RF= 0.57 (--- RF= 0.50
(-Punto de aplicación
Muestras de 5 ul. Solvente de corrida Acetato de etilo :acetona : agua ( 6:4:1). Tiempo de corrida : 10 minutos. En este dibujo se incluyen, juntos, los resultados que obtuvimos por separado para cada pigmento.
63
Figura 12. Bioautografía sobre S. lutea del
cromatograma del pigmento BR.
il.Ri.:-+ -- .. . . ..
FS. Frente del solvente
BR2. Banda de RF= 0.80
BRl. Banda de RF= 0.42
PA. Punto de aplicación.
64
del cromatograma del pigmento BR. En ella se observa que el halo de
inhibición está alrededor de la banda BR2, de color amarillo y RF =0.80.
En las demás bioautografías (resultados no mostrados) se observaron
halos de inhibición sobre B. subtilis, C. albicans y A. niger producidos
solamente por la banda amarilla de RF =0.80 pero no hubo inhibición
por las otras bandas con RF de 0.37, 0.42, 0.50, y 0.57 (figura 11 ).
Este resultado nos permite concluir que el pigmento amarillo de RF = 0.80, presente en los pigmentos BA, BR, BM1 y BV, es el responsable
por la actividad antibiótica observada.
El estudio bioquímico y fisiológico de este antibiótico debe
continuar en cuanto a la purificación y caracterización estructural de la
molécula productora del efecto inhibitorio sobre las cepas probadas. No
obstante, antes de emprender este estudio, que es costoso y requiere
de tiempo, deben realizarse algunas pruebas generales sobre animales
de laboratorio para establecer si merece la pena continuar con
purificaciones adicionales. En todo caso, esto que indicamos está más
allá de los limites establecidos por este trabajo de investigación en
cuanto a ser una Tesis de Maestría.
65
CONCLUSIONES
1. Los suelos de Venezuela son una fuente importante de actinomicetos
productores de antibiosis .
. 2. Entre los suelos estudiados, los del estado Mérida parecen ser los
más ricos en actinomicetos totales (UFC/gr de suelo) así como en los
más bioactivos.
3. La cepa T 77 aislada y seleccionada para este trabajo la hemos
caracterizado con criterios bioquímicos, fisiológicos y estructurales
como una especie del género Streptomyces que crece bien en
diferentes medios de cultivo entre 30 y 45 °C, pH 6-8 y con agitación
orbital de 200 r.p.m.
4. La cepa T 77 produce un antibiótico recuperado en extractos brutos
derivados por extracción con acetato de etilo de los sobrenadantes de
cultivos en medio ISP2. Este extracto bruto es activo contra bacterias
grampositivas y contra levaduras y hongos filamentosos.
5. Una purificación parcial del agente antibiótico existente en el extracto
bruto muestra que se trata de un pigmento amarillo/con un RF de 0.8 en
cromatografía en capa fina de silica gel con un sistema de solventes
acetato de etilo/acetona/agua (6:4: 1)
66
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74
CAPITULO 7.
APENDICE
+ ISP N °2: MEDIO EXTRACTO DE LEVADURA ·EXTRACTO DE
MALTA (Pridham y col., 1956/57).
Extracto de levadura
Extracto de malta
Dextrosa
Agua destilada
Ajustar pH a 7.3
Agar
4.0 g
10.0 g
4.0 g
1.0 L
20.0 g
+ISP N° 4: MEDIO ALMIDON-SALES INORGANICAS (Küster, 1959).
A. Almidón soluble 10.0 g
Hacer una pasta de almidón con una pequeña porción de
agua destilada y completar hasta un volumen de 500 mi.
B. Solución de sales
K2HP04
MgS04.7H20
NaCI
(NH4)S04
CaC03
Agua destilada
Solución sales traza P&G
Ajustar pH entre 7. O -7.4
1.0 g
1.0 g
1.0 g
2.0 g
2.0 g
500ml
1.0 mi
75
Mezclar la suspensión de almidón y la solución de
sales S. Esterilizar 15 minutos a 121 oc.
+ ISP N° 5: MEDIO GLICEROL- ASPARAGINA (Pridham y Lyons,
1961 ).
L -asparagina
Glicerol
K2HP04
Agua destilada
Solución Sales Traza P&G
Ajustar pH entre 7.0-7.4
Agar
1.0 g
10.0 g
1.0 g
1.0 L
1.0 mi
20.0 g
+ SOLUCIÓN SALES TRAZA P & G (Shirling y Gottlieb, 1966)
FeS04.7H20
MnCI2.4H20
ZnS04.7H20
Agua destilada
0.1 g
0.1 g
0.1 g
100.0 mi
+ISP N° 7:AGAR TIROS/NA ( Shinobu, 1958).
Glicerol 10.0 g
L. tirosina 0.5 g
L -asparagina 1.0 g
K2HP04 (base anhidro) 0.5 g
MgS04. 7H20 0.5 g
NaCI 0.5 g
FeS04. 7H20 0.01 g
76
Agua destilada
Solución sales trazas P&G
Ajustar a pH 7.2-7.4
Agar
1.0 l
1.0 mi
20.0g
+ ISP N° 9: MEDIO UTILIZACIÓN DE FUENTES DE CARBONO
(Pridham y Gottlieb, 1948; Shirling y Gottileo, 1966).
A) Fuentes de carbono estériles:
Esterilizar por filtración una solución 2' 1 O % de cada Jna de las
fuentes de carbono. El i-inositol y la cei~ osa deben ester,izarse con
éter o con óxido de etileno ( Shirling y GJttlieb, 1966). Las fuentes de
carbono estériles son agregadas al medio Jase para una co1centración
final del1 %.
8) Solución Sales Traza de P & G (Pr,Jham y Gottlieb, • 948)
Sólo 1.0 mi de esta solución será usada pera 1.0 l de medie
CuS04.SH20 0.64g
FeS04.7H20 0.11 g
MnChAH20 0.79g
ZnS04.7H20 0.15 g
Agua destilada 100.0 r
Guardar a 3-5 oc hasta su uso. L·evar a temperatu·a ambiente
antes de usar. Preparar solución fresca ceda mes. Hacer ceso omiso a
cualquier precipitado que se forme duran: e el almacenamie-1to (debido
posiblemente a las sales de hierro).
C) Agar base sales minerales:
77
(NH4)S04 2.64 g
KH2P04 2.38 g
K2HP04.3H20 5.65 g
MgS04.7H20 1.0 g
Sales traza P & G 1.0 mi
Agua destilada 1.0 L
Ajustar, si es necesario, el pH a 6.8-7.0 con 1 N de
NaOH o 1 N de HCL
Agar 15.0 g
O) Medio completo:
Esterilizar el agar base sales minerales ( O ), dejarlo enfriar hasta
60 oc y añadirle asépticamente las fuentes de carbono estériles ( A )
para una concentración final de 1 %. Agitar la mezcla y servir en
placas de Petri. Cada organismo requiere 2 placas de Petri sin fuentes
de carbono (control negativo) además de dos placas para cada fuente
de carbono a ensayar.
+ MEDIO BENNETT (McCiung, 1948)
Extracto de levadura
Extracto de carne
Caseína digerida
Glucosa
Agua destilada
pH 7.3
1.0 g
1.0 g
2.0 g
10.0 g
1.0 L
Agar 15.0 g
+ AGAR NUTRIENTE (Gordon, 1966).
78
Peptona
Extracto de carne
Agar
Agua destilada
Ajustar a pH 7. O
+MEDIO MIDDLEBROOK 7H-9 (DIFCO)
Composición:
Sulfato de amonio
5.0 g
3.0 g
15.0 g
1.0 L
0.5 g
Acido-glutámico (sales de sodio) 0.5 g
Citrato de sodio 0.1 g
Piridoxina 0.001 g
Biotina 0.0005 g
Fosfato disódico 2.5 g
Fosfato monopotásico 1.0 g
Citrato férrico de amonio 0.04g
Sulfato de magnesio 0.005 g
Cloruro de calcio 0.0005 g
Sulfato de zinc 0.001 g
Sulfato de cobre 0.001 g
pH 7.0
Esterilizar a 121 oc durante 15 minutos.
+MEDIO ALMIDON- CASE/NA (Küster y Williams, 1964).
Almidón
Caseína (libre de vitamina)
KN03
NaCI
10.0 g
0.3 g
2.0 g
2.0 g
79
K2HP04 2.0 g
MgS04. 7Hz0 0.05g
CaC03 0.02g
FeS04. 7H20 0.01 g
Agar 15.0 9
Agua destilada 1.0 L
Ajustar pH a 7 .2.
+ MEDIO INFUSIÓN CEREBRO CORAZON (BHI, OXOID)
Fórmula (g/L):
Infusión de ternera 12.5 g
Infusión de corazón bovino 5.0 g
Proteasa peptona 10.0 g
Glucosa 2.0 g
Cloruro sódico 5.0 g
Fosfato disódico 2.5 g
pH 7.4 ± 0.2
+ MEDIO MUELLER- HINTON (MERCK)
Fórmula (g/L):
Infusión de carne 5.0 g
Hidrolizado de caseína 17.5 g
Almidón 1.5 g
Agar 12,5 g
pH 7.4 ± 0.2
+ MEDIO PARA DETERMINAR LA DESCOMPOSICIÓN DE
XANTINA, HIPOXANTINA, TIROS/NA (Gordon, 1966).
80
A 5 mi de agua destilada se le agrega la siguiente cantidad de
cada uno de los compuestos:
Xantina
Hipoxantina
Tirosina
0.4 g
0.4 g
0.5 g
Las suspensiones se esterilizan por 15 minutos a 121 oc y cada una
de ellas se mezcla con 1 00 mi de agar nutriente a unos 50- 60 oc y se
sirven las placas de Petri. En cada placa se pueden ensayar no más de
4 cepas.
+ MEDIO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA DESCOMPOSICIÓN
DE CASE/NA (Gordon y Smith, 1955).
A. Skim milk en polvo
Agua destilada
B. Agar
Agua destilada
1.0 g
10.0 mi
2.0 g
90ml
Esterilizar por separado, mezclar y servir.
+ MEDIO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA DESCOMPOSICIÓN
DEALMIDON
A) Medio base
Agar nutriente 100 mi
B) Solución de almidón
81
Almidón
Agua destilada
1.0 g
5.0 mi
Mezclar y disolver (8), agregar al medio base (A).
+ MEDIO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA DESCOMPOSICIÓN
DE UREA
Puede usarse caldo de urea "BBL" empleado en los laboratorios
clínicos para detectar actividad ureasa.
+ MEDIO PARA LA DETERMINACIÓN DE REDUCCIÓN DEL
NITRATO
Puede Utilizarse caldo nitrato empelado en los laboratorios
clínicos para detectar reducción del nitrato a nitritos.
+ MEDIO PARA DETERMINAR HIDRÓLISIS DE LA QUITINA:
Quitina seca (sigma) 4.0 g
K2HP04 0.7 g
KH2P04 0.3 g
MgS04. 5H20 0.5 g
FeS04. ?H20 0.01 g
ZnS04 0.001 g
MnCI2 0.001 g
Agar 20g
Agua destilada 1.0 L
Esterilizar y ajustar a pH 8.0 con NaOH (5 N) estéril.
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+ MEDIO PARA DETERMINAR RESISTENCIA A LA L/SOZIMA
(Gordon y Barnett, 1977).
A) Caldo glicerol
Peptona
Extracto de carne
Glicerol
Agua destilada
Ajustar a pH 7. O
B) Solución lisozima
Lisozima
Agua destilada estéril
5.0 g
3.0 g
70.0 mi
1.0 L
0.1 g (6.000-
10.000 U/mg)
100.0 mi
Esterilizar la solución B por filtración. Mezclar 5.0 mi de la
solución B con 95.0 mi de solución A y distribuir
asépticamente en tubos estériles. Como control inocular
caldo glicerol sin lisozima.
+UTILIZACIÓN DE FUENTES DE NITRÓGENO (Locci, 1989).
AJ. Medio base:
Glucosa 10.0 g
MgS04.?H20 0.5 g
NaCI 0.5 g
FeS04.?HzO 0.01 g
KzHP04 1.0 g
Agar 12.0 g
Agua destilada 1.0 L
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B) Fuentes de nitrógeno:
Las siguientes fuentes de nitrógeno se agregaron para una
concentración final de 0.1 % (p/v):
- Acido DL-a-amino-n-butírico
- L-arginina
- L-cisteina
- Nitrato de potasio
- L-asparagina
+SOLUCIONES Y PATRONES
1) Solución salina fisiológica (SSF):
NaCI
Agua destilada
0.85 g
100.0 mi
2) Patrón de McFarland (Tubo N° 0.5) (Lennette y col., 1974)
A) Solución de cloruro de bario 0.048 M
BaCI2. 2H20 1.175 % (p/v)
8) Acido sulfúrico 0.36N 1 % (v/v)
C) Mezclar 0.5 mi de solución A con 99.5 mi de solución B.
Mezclar y envasar en tubo de vidrio con rosca y tapa de
baquelita.
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