ClaseFosforilación Oxidativa

Dr. Dante Miranda Wilson

ADAPTACIONES EVOLUTIVAS ANTE LA APARICION DEL OXÍGENO

ANAEROBIOS

RETIRARSE A UN AMBIENTE ANAEROBIO

USO DE OXÍGENO MORIR

FOSFORILACIÓNOXIDATIVA

El ser humano vive porque es capaz de realizar múltiples reacciones químicas, reguladas e integradas a una velocidad compatible con la máxima sobrevida en condiciones fisiológicas

Para realizar este trabajo químico se requiere ENERGÍA

1. Glicolisis

2. Descarboxilación oxidativa de piruvato

3. Oxidación de ácidos grasos4.Amino ácidos

Poder Reductor

Respiración Celular

Poder reductor:Electrones con un alto potencial de transferencia

Transporte de electrones genera:•∆ pH•Potencial eléctrico

Fosforilación Oxidativa

• Es un proceso mediante el cual la energía liberada durante la oxidación de NADH y FADH2 es convertida en energía química (ATP).

• Lugar: Mitocondria

•Nº y actividad reflejo de actividad metabólica Ej. la mitad del contenido citosólico de cardiomiocitos correspondea mitocondrias.Hepatocitos contienen entre 800-2000 mitocondrias.Eritrocitos no tienen mitocondrias.Mb externa contiene porina.

Fosforilación oxidativa:

Potencial Redox ∆E°’ ∆G°’ (Potencial de transferenciade fosforilo)

∆Gº’ = - nf ∆Eº’

Complejo I

Complejo III

Complejo IV

NADH deshidrogenasa

Citocromo reductasa

FADH2 (succinato deshidrogenasa)

Complejo II

Componentes de la cadena transportadora de electrones mitocondrial

Oxidant or reductantEnzyme complex Mass (kd) Subunits Prosthetic group Matrix side Membrane

coreCytosolic side

NADH-Q oxidoreductase

880 34 FMN NADH Q

Fe-SSuccinate-Q reductase

140 4 FAD Succinate Q

Fe-SQ-cytochrome coxidoreductase

250 10 Heme bH Q Cytochrome c

Heme bL

Heme c1

Fe-SCytochrome coxidase

160 10 Heme a Cytochrome c

Heme a3

CuA and CuB

7*

0*

1*

3*

Sources: J. W. DePierre and L. Ernster, Annu. Rev. Biochem. 46(1977):215; Y. Hatefi, Annu Rev. Biochem. 54(1985);1015; and J. E. Walker, Q. Rev. Biophys. 25(1992):253.

*: Subunidades codificadas por DNA mitocondrial

FMNNADH FMN en Complejo I

Centros Fe-S

Fe+3 + e- Fe+2

FMN en Complejo I

Fe+3 + e- Fe+2

Coenzima Q

Coenzima Q

Citocromo reductasa

2 3

Succinato Fumarato

FAD

AcilCoA1Glicerol-3P

G3PDH(FAD)ETF (FAD)

FADH2

FAD

Fe-S

Hem b

UQ/UQH2

Succinato Deshidrogenasa

Complejo IIICitocromoReductasa

Oxido Reductasa (Fe-S)

Citocromo

Proteína de transferencia de electrones que contiene un grupo prostético Hem

QH2

Fe+2-Cit c

CitocromoOxidasa

Citocromo Oxidasa (grupos Hem y Cu)

Citocromo c es una estructura altamente conservada:

•Presente en todo organismo con mitocondria•cit c de cualquier especie eucariótica reacciona in vitro con la citocromo oxidasa de cualquier especie.•Los potenciales de reducción de los cit c estudiados están cercanos a los +0,25 v.•Los espectros de absorción son indistinguibles.•cit c de procariótes se parecen a cit c de eucariótes.•26 de 104 aa se han mantenido invariables por más de 1,5 billones de años (aa ligandos de hem, gli)

Resumen:

Inhibidores Fosforilación Oxidativa

Inhibidores Fosforilación Oxidativa

Name Function Site of ActionRotenone e- transport inhibitor Complex I

Amytal e- transport inhibitor Complex I

Antimycin A e- transport inhibitor Complex III

Cyanide e- transport inhibitor Complex IV

Carbon Monoxide e- transport inhibitor Complex IV

Azide e- transport inhibitor Complex IV

2,4,-dinitrophenol Uncoupling agent transmembrane H+ carrier

Pentachlorophenol Uncoupling agent transmembrane H+ carrier

Oligomycin Inhibits ATP synthase ATP synthase

Regulación Fosforilación Oxidativa

+ ADPADP cerca delagotamiento

SINTESIS DE ATP

1961: Teoría Quimiosmótica propuesta por Peter Mitchell

Evidencias:

• Transporte de electrones genera gradiente de H+ ,pH lado citosólico1,4 unidades menor que pH matriz.• Potencial de membrana es de +0,14 v.• ATP es sintetizado cuando existe una gradiente de protones en ausencia de transporte de electrones.Ej.

Exp por Stoeckenius y Racker

• NADH deshidrogenasa, citocromo reductasa y citocromo oxidasa bombean protones fuera de la matriz.• La fosforilación oxidativa no ocurre en preparaciones solubles o suspensión de membranas.• Sustancias que disipan la gradiente de protones desacoplan la oxidación de la fosforilación.

Exp usando radionuclidos y fracciones F1 aisladas revelaron:

Enz:ADP + Pi Enz:ATP

Esto indicaba que la síntesis de ATP por F1 no requería energía y que elmovimiento de protones serviría para liberar el ATP sintetizado.

Complejo V: ATP Sintasa

Cataliza la síntesis de ATP usando la energía de la gradiente de protonescuando regresan a la matriz a través de la ATP sintasa.

ATP sintasa se pudo observar mediante estudios de microscopía electrónica evidenciándose como partículas pequeñas unidas a la membrana interna de la mitocondria.

Al remover por agitación la partícula sobresaliente se perdía la capacidad de síntesis de ATP y se mantenía el transporte de electrones.

ATP sintasaComplejo V

F1: αβγδε(α3,β3,γ,δ,ε)

Fo: a,b,cMatriz mitocondrial

Movimiento de protones a través de subunidad c de complejo Fo

Evidencia experimental que demuestra la rotación de subunidadesGamma.

•Mutación de aspártico por asparagina en gamma impide el movimiento de protones.

Estudios de cristalografía de ATP sintasa (F1) en presencia deADP y de análogo de ATP no hidrolizable revelaron que ADP se unía a una subunidad beta, el análogo de ATP a otra subunidad beta, mientras que latercera subunidad estaba vacía.Se pudo inferir entonces que cada subunidad beta tiene una diferenteconformación dependiendo de la presencia del sustrato.

El movimiento de la subunidad gamma sería la que induciría el cambioconformacional.

Estequiometría de síntesis de ATP por H+ transportados

CI: 4 H+ /2e 2H+ /e

CIII: 4 H+ /2e 2H+ /e

CIV: 4 H+ /4e H+ /e

2,5 ATP por cada NADH1,5 ATP por cada FADH2

Transporte de ATP al citosol:

ATP-ADP translocasa

Transporte de NADH citosólico:

por glicerol 3-fosfato

Transporte de NADH:

por malato-aspartato

Malato/α-cetoglutaratoantiporter

Transportadores mitocondriales

Reaction sequence ATP yield per glucose molecule

Glycolysis: Conversion of glucose into pyruvate (in the cytosol)

Phosphorylation of glucose - 1

Phosphorylation of fructose 6-phosphate - 1

Dephosphorylation of 2 molecules of 1,3-BPG + 2

Dephosphorylation of 2 molecules of phosphoenolpyruvate + 2

2 molecules of NADH are formed in the oxidation of 2 molecules of glyceraldehyde 3-phosphate

Conversion of pyruvate into acetyl CoA (inside mitochondria)

2 molecules of NADH are formed

Citric acid cycle (inside mitochondria)

2 molecules of guanosine triphosphate are formed from 2 molecules of succinyl CoA + 2

6 molecules of NADH are formed in the oxidation of 2 molecules each of isocitrate, α-ketoglutarate, and malate2 molecules of FADH2 are formed in the oxidation of 2 molecules of succinate

Oxidative phosphorylation (inside mitochondria)

2 molecules of NADH formed in glycolysis; each yields 1.5 molecules of ATP (assuming transport of NADH by the glycerol 3-phosphate shuttle)

+ 3

2 molecules of NADH formed in the oxidative decarboxylation of pyruvate; each yields 2.5 molecules of ATP

+ 5

2 molecules of FADH2 formed in the citric acid cycle; each yields 1.5 molecules of ATP + 3

6 molecules of NADH formed in the citric acid cycle; each yields 2.5 molecules of ATP + 15

net yield per molecule of glucose + 30

Source: The ATP yield of oxidative phosphorylation is based on values given in P. C. Hinkle, M. A. Kumar, A. Resetar, and D. L. Harris, Biochemistry 30(1991):3576.Note: The current value of 30 molecules of ATP per molecule of glucose supersedes the earlier one of 36 molecules of ATP. The stoichiometriesof proton pumping, ATP synthesis, and metabolite transport should be regarded as estimates. About two more molecules of ATP are formed per molecule of glucose oxidized when the malate-aspartate shuttle rather than the glycerol 3-phosphate shuttle is used.

Adaptación al frío por proteína desacoplante

UCP-1

La vía de disipación de protones es activada por ácidos grasos liberados de triglicéridos en respuesta a señales hormonales, tal como agonistas β-adrenérgicos.

NE

Rβ

cAMPTG

Ac. Grasos

PKA

+

Molécula desacoplante:

H+

Bajo pHAlto pH

Generación de radicales de oxígeno asociado al transporte de electrones

Efectos en envejecimiento por modificación de macromoléculas y DNA mitocondrial

Enfermedades mitocondriales:Origen hereditario. Mutaciones en tRNA que afectan la síntesis de proteínasllevando a la disminución de Complejo I y Citocromo c Oxidasa:

Neuropatía ópticaMELAS ( encefalopatía mitocondrial con acidosis láctica)

Mecanismos defensivos: