respuesta inmune innata pulmonar frente a la infección

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

Cátedra de Inmunología e Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral (IDEHU-CONICET)

Respuesta inmune innata

pulmonar frente a la infección

inhalatoria por Brucella abortus

Tesis presentada para optar al título de

Doctor de la Universidad de Buenos Aires

Tesista: Bioq. María Soledad Hielpos

Director: Dr. Pablo César Baldi

Co-directora: Dra. Mariana Cristina Ferrero

2016

Agradecimientos

Al Dr. Pablo Baldi, por haberme aceptado en su laboratorio, por la guía, la confianza y la paciencia. Por todas esas ganas y muchas horas de enseñanza para lograr la superación como profesional

A la Dra Mariana Ferrero, por haber estado incondicionalmente, por las ganas y pujanza que son ejemplo y por todas las horas de BSL3 compartidas

Al Dr. Alberto Fossati, gracias por aceptarme en el grupo y por su amistad.

Al Dr. Diego Comerci, por permitirnos utilizar las instalaciones del Bioterio BLS3 del IIB-INTECH, por las cepas Brucella GFP y Brucella abortus btpAbtpB-. Por las valiosas sugerencias y generosidad.

Al Dr. Sergio Costa, por permitirnos trabajar en su laboratorio, y por sus valiosas sugerencias.

Al Dr. Horacio Salomón y a los integrantes del INBIRS, por permitirnos trabajar en el BSL3.

A la Dra. Silvia Vanzulli, por su gran colaboración en las observaciones microscópicas de los cortes histológicos de pulmón y por su paciencia y buena predisposición.

A los Drs. Jorge Caneva y Alejandro Bertolotti y a Viviana Martinez de Fundación Favaloro por la buena predisposición para colaborar con las muestras pulmonares.

A las instituciones, UBA, CONICET y ANPCyT por brindarme la ayuda económica y la infraestructura necesarias para realizar este trabajo.

A Andrea, y el resto de mis compañeros de laboratorio: Cora, Romi, Florencia, Josefina e Iván. Gracias por su amistad, las discusiones, la valiosa ayuda y los mates. Gracias por hacer del laboratorio un lugar donde querer volver todas las mañanas.

Al resto de mis compañeros del IDEHU, gracias por la buena onda, la ayuda sin condiciones, los mates y la contención. A los que están y a los que siguen su camino por otros lugares.

A mis amigos bioquímicos/farmacéuticos, por la amistad y sostén de tantos años.

A mis amigos músicos, por enseñarme que la vida tiene muchos colores, sonidos, matices y ritmos. Que cada faceta de uno mismo nutre a la otra. No hay belleza más grande que hacer música con ustedes.

A Nico, gracias. Todo resulta más fácil.

A mi Familia: Mamá, Papá y Marian. Gracias por su apoyo incondicional. Por la contención en los buenos y malos momentos. Por las ganas y el motor incansable que son y la felicidad que siento con ustedes.

Parte de los resultados incluídos en este trabajo de Tesis fueron publicados en el siguiente artículo:

CCL20 and beta-defensin 2 production by human lung epithelial cells

and macrophages in response to Brucella abortus infection

M. Soledad Hielpos, Mariana C. Ferrero, Andrea G. Fernández , Josefina

Bonetto , Carlos A. Fossati and Pablo C. Baldi. PLoS ONE 10(10): e0140408.

doi:10.1371/journal.pone.0140408

Resumen.

La brucelosis es una zoonosis causada por bacterias intracelulares gram

negativas del género Brucella, las cuales afectan a animales domésticos y salvajes, y

pueden transmitirse al hombre por diversas vías. Una de estas vías es la inhalación

de aerosoles contaminados. La brucelosis afecta a 500.000 personas en todo el

mundo cada año y en Argentina se producirían anualmente entre 10.000 y 20.000

nuevos casos. La importancia de la vía inhalatoria ha quedado de manifiesto en

brotes epidémicos vinculados a la generación de aerosoles contaminados en

ámbitos laborales, particularmente en laboratorios microbiológicos y en

mataderos. Se estima que se requieren tan sólo 10 a 100 organismos aerosolizados

para generar infección en seres humanos, y es por ello que Brucella se considera

altamente infectiva cuando se adquiere por vía aerógena y es clasificada por el CDC

como agente bioterrorista. A pesar de la importancia de las vías respiratorias para

la entrada de Brucella en el organismo, se desconoce casi por completo la

respuesta inmune pulmonar a la infección inhalatoria por Brucella spp.

El objetivo general de este trabajo de Tesis fue evaluar la interacción de

Brucella abortus con la mucosa respiratoria y sus componentes en las primeras

etapas de la infección para caracterizar la respuesta inmune innata y

antimicrobiana desencadenada en el pulmón, así como evaluar los mecanismos

que utiliza la bacteria para evadir la vigilancia inmunológica pulmonar y

diseminarse sistémicamente. Para ello desarrollamos un modelo murino de

infección intratraqueal por B. abortus que nos permitió evaluar la respuesta

inmune innata durante la primera semana de infección, y analizar un posible

mecanismo de evasión de la inmunidad. También se realizaron estudios in vitro

para evaluar la respuesta de las principales células conformantes de los tejidos

pulmonares.

Los resultados de esta Tesis demuestran que B. abortus genera una

respuesta inmune pulmonar retardada y de baja intensidad, a pesar que es capaz

de infectar y persistir en pulmón murino, pudiéndose diseminar desde el sitio de

infección hacia los órganos periféricos tan tempranamente como 1 día p.i.. Se

detecta en pulmón un leve aumento de las citoquinas IL-1β y MCP-1 a 3 días p.i. y

sólo con cargas bacterianas altas (106 UFC/ ratón), mientras que el resto de las

citoquinas proinflamatorias (IL-12, KC, TNF-α e IFN-γ) no se diferencian del

control hasta 7 días p.i. El análisis histológico demostró que la infección con B.

abortus produce cambios en la composición celular del pulmón afectado,

observándose un leve infiltrado de células mononucleares. Sin embargo, la

citometría no permitió precisar la identidad de las células infiltrantes. Cuando se

infectaron los ratones intratraquealmente con una mutante doble de B. abortus

para las proteínas BtpA y BtpB (btpAbtpB-), involucradas en el bloqueo de la

señalización por TLRs, la histología pulmonar reveló un mayor infiltrado de células

mononucleares que en los pulmones de ratones infectados con la cepa salvaje (wt).

Esto sugiere que las proteínas Btp modulan el reclutamiento de las células

inmunes hacia el pulmón. A diferencia de lo que ocurre en el pulmón, el recuento

de bacterias viables en los órganos periféricos de los ratones infectados por vía

intratraqueal con la doble mutante fue mucho menor que en los ratones infectados

con la cepa wt. Esto podría deberse a que las proteínas Btp modulan los

mecanismos inmunes involucrados en la eliminación de la bacteria en los órganos

periféricos. Los mayores niveles de citoquinas en el bazo de los animales

infectados con la doble mutante avalaron esta hipótesis. Este estudio es el primero

en demostrar in vivo que las proteínas Btp le confieren una ventaja de

supervivencia a B. abortus.

Asimismo se realizaron ensayos para evaluar la capacidad de modulación

de las proteínas Btp frente a agonistas TLR administrados exógenamente. Se halló

que la sobrevida de B. abortus en el ambiente pulmonar previamente inflamado

con LPS de E. coli depende sustancialmente de la expresión de estas proteínas.

Para tener una aproximación a la interacción hospedador-patógeno en

infecciones humanas debe recurrirse a modelos in vitro realizados con células de

origen humano. Para ello se realizaron infecciones de cultivos primarios de

pneumocitos humanos y explantos pulmonares, y se midieron citoquinas y

quemoquinas en sobrenadante de cultivo mediante ELISA. Los resultados indican

que las células epiteliales alveolares son pobres respondedoras frente a la

infección directa por B. abortus en cuanto a secreción de citoquinas

proinflamatorias, al igual que los explantos pulmonares, si bien estos últimos

responden con mayores niveles de citoquinas.

El epitelio respiratorio también responde a las infecciones con la

producción de CCL20 y β-defensinas, los cuales actúan en forma dual como

péptidos antimicrobianos y como quemoquinas. Se evaluó su expresión y secreción

en un modelo de infección in vitro de líneas celulares humanas, THP-1 (monocitos),

Calu-6 (bronquiales) y A549 (alveolares) y en cultivo primario de pneumocitos y

explantos humanos. Además se evaluó in vitro la actividad antimicrobiana de

ambos péptidos frente a B. abortus. Se observó que las células epiteliales humanas

secretan CCL20 y beta-defensina 2 en respuesta a la infección por B. abortus o a las

citoquinas producidas por monocitos infectados. Ambas moléculas son producidas

en concentraciones que no parecen tener actividad antimicrobiana contra B.

abortus, pero que podrían mediar funciones inmunomoduladoras durante la

infección.

En conclusión, la infección inhalatoria por Brucella abortus genera una

respuesta innata pulmonar de poca intensidad que le permite sobrevivir en

pulmón y probablemente facilita su diseminación a otros órganos. La persistencia

pulmonar de la bacteria posiblemente se vea facilitada, entre otros factores, por su

capacidad de supervivencia intracelular y sus mecanismos de modulación de la

respuesta inmune innata.

Indice.

Introducción general 2

1 Historia 2

2 Generalidades de la brucelosis 2

3 Brucella spp 4

3-1 Caracteristicas del género 4

3-2 Estructura antigénica 6

4 Mecanismos patogénicos de Brucella.Factores de virulencia y mecanismo de evasión del sistema inmune

8

4-1 Glucano β1-2 cíclico inhibe la fusión con el lisosoma 10

4-2 El sistema de secreción tipo IV 10

4-3 Brucella TIR containing protein (Btp) 11

4-4 LPS 12

5 Contagio inhalatorio de la brucelosis 13

6 Principales células de las vías respiratorias 14

6-1 Células epiteliales 14

6-2 Macrófagos alveolares 15

6-3 Células dendríticas 17

7 La interacción de los patógenos con la mucosa respiratoria 18

7-1Reconocimiento de patógenos por las células de las vías respiratorias. 18

7-2 La respuesta del epitelio respiratorio a los patógenos 22

7-3 Mecanismos de infección a través de la mucosa respiratoria 23

Hipótesis de trabajo 25

Objetivos 26

Capítulo 1 Respuesta inmune a la infección intratraqueal con B. abortus y efecto modulador de las proteínas Btp

27

Introducción 28

Materiales y Métodos 31

Resultados 41

Conclusiones 70

Capítulo 2 Caracterización de la infección in vitro de pneumocitos tipo II primarios humanos con B. abortus 2308

84

Introducción 85


Resultados 92

Conclusiones 99

Capítulo 3 Respuesta antimicrobiana pulmonar frente a infecciones con B. abortus

103

Introducción 104


Resultados 112

Conclusiones 126

Conclusiones 132

Bibliografía 135

Introducción general

Introducción General

2

1-Historia

Las bacterias del género Brucella fueron aisladas por primera vez en 1887

por David Bruce de los bazos de soldados que morían en la isla de Malta por una

enfermedad conocida en ese entonces como Fiebre de Malta. El reservorio del

agente causal no fue descubierto hasta 1904, cuando se lo aisló de orina y leche de

cabras aparentemente sanas. Cuando se suspendió el consumo de leche cruda de

cabra, la incidencia de la enfermedad descendió en forma brusca. La bacteria se

denominó inicialmente Micrococcus melitensis, y luego fue rebautizada con el

nombre de Brucella melitensis en honor a su descubridor. El segundo

microorganismo del grupo fue aislado por Bang en Dinamarca en 1897 de ganado

que padecía de aborto infeccioso (enfermedad de Bang), y al que inicialmente se

denominó Bacillus abortus. El tercer miembro del grupo fue cultivado en EE.UU. en

1914 del feto de una cerda expulsado prematuramente (Bacillus suis). En 1920

Evans reconoció que los tres microorganismos estaban estrechamente

emparentados y los incluyó en un género aparte, denominado Brucella (Rivero

Puente et al., 1978).

2- Generalidades de brucelosis

La brucelosis es una zoonosis endémica causada por bacterias Gram

negativas del género Brucella, las cuales se comportan como parásitos

intracelulares facultativos. Esta enfermedad afecta al hombre y a distintas especies

animales, incluyendo varias relacionadas con la alimentación y la actividad laboral

ganadera (Serre et al., 1989).

La infección afecta primariamente al aparato genito-urinario del ganado

doméstico como bovinos, ovinos, caprinos y porcinos, como así también de caninos

y de especies salvajes como camellos, bisontes, búfalos, roedores, delfines, etc.

(FAO-WHO Joint Expert Committee on Brucellosis., 1986). La enfermedad del


3

ganado causa disminución de la capacidad reproductora, abortos, parición de

terneros débiles y contaminación de lácteos y carnes. Resulta entonces un

importante problema sanitario y económico.

La incidencia de la brucelosis es muy alta en nuestro país, donde no sólo hay

un importante consumo de lácteos y carnes, sino que además la producción y

elaboración de estos productos es una de las principales actividades económicas,

convirtiendo a la brucelosis en una de las enfermedades laborales más

importantes. Datos obtenidos por el SENASA en el año 2005 muestran que la

prevalencia de la brucelosis en los bovinos a nivel nacional fue del 2.15%. Sin

embargo, una encuesta realizada el mismo año por el INTA Bariloche, la Dirección

de Ganadería de la provincia de Río Negro y el Laboratorio de Brucelosis de la

Fundación Barrera Patagónica revelaron que la prevalencia de la enfermedad en la

ganadería bovina es más elevada que la informada por el SENASA. Los resultados

mostraron un 21.4% de establecimientos positivos a Brucella abortus -con un

rango de 10% al 40%- y una tasa de reaccionantes del 3.7%.

La transmisión de la brucelosis al hombre se produce por contacto con el

animal infectado o sus tejidos o secreciones de animales infectados, y/o por

consumo de lácteos no pasteurizados o carne insuficientemente cocida. Por lo

tanto, constituye una enfermedad laboral y alimentaria, y la población de mayor

riesgo se encuentra conformada por trabajadores de la industria de la carne,

veterinarios, peones de campo, transportistas de ganado o de productos derivados

de éste, y empleados de laboratorios de diagnóstico microbiológico o de

producción de cepas vacunales de Brucella. La infección puede ocurrir también en

personas (residentes o turistas) que tienen contacto con animales infectados en

zonas endémicas o que consumen alimentos derivados del ganado infectado

(especialmente lácteos no pasteurizados) (Crespo León et al., 1993; Moreno-Lafont

et al. 1995). La entrada de las bacterias se puede producir por contacto directo de

la piel lesionada con material infectado, por el ingreso de aerosoles a través de las

vías conjuntival o inhalatoria, o por ingestión de alimentos contaminados. Además,

la entrada por inoculación accidental con cepas vacunales es frecuente en peones y

veterinarios (Serre et al., 1989; Wallach et al. 1997; Bouza et al. 2005).


4

Cuando las bacterias del género Brucella infectan al hombre pueden

provocarle una severa infección aguda, que cursa con bacteriemia. Si la

enfermedad se diagnostica tempranamente y se trata en forma adecuada tiene una

evolución en general favorable. Aunque actualmente constituye una enfermedad

de baja mortalidad, en algunos individuos deja secuelas discapacitantes de

magnitud variable. La brucelosis humana cursa con fiebre, adenopatías,

hepatoesplenomegalia, mialgias, artralgias, astenia y sudores. Se han propuesto

muchas clasificaciones de los estadios clínicos de la brucelosis, pero el más

aceptado es aquel que define enfermedad aguda o crónica en base al tiempo de

evolución de los síntomas (Young et al., 1989). Se considera pacientes agudos a

aquellos que refieren haber padecido síntomas compatibles con brucelosis durante

un lapso de hasta 1 año previo a la consulta. Mientras que se clasifican como

crónicos aquellos pacientes que refieren haber padecido dichos síntomas durante

un lapso superior a 1 año.

En las formas agudas de la enfermedad, la administración precoz y

prolongada de una apropiada combinación de antibióticos provoca la remisión del

cuadro clínico en al menos el 90% de los pacientes. La asociación de doxiciclina y

estreptomicina constituye el tratamiento de elección ya que en estas condiciones

se presenta un menor porcentaje de pacientes con recaídas (Montejo et al. 1993)La

administración de doxiciclina y rifampicina es empleada como tratamiento

alternativo.

Es interesante notar que la virulencia y la tendencia a la cronicidad varían

entre especies de Brucella, siendo B. abortus y B. suis las de mayor tendencia a la

cronicidad. Por el contrario, B. melitensis produce las infecciones más fulminantes,

tanto para humanos como para animales (Young et al., 1989).

3- Brucella spp.

3.1. Características del género

Desde la creación del género Brucella en 1920 se fueron incorporando al

mismo nuevas especies y biotipos. Se caracterizaron tres nuevas especies (B. ovis,

B. neotomae, y B. canis) y las especies de B. abortus y B. suis se subdividieron en


5

ocho y cuatro biotipos respectivamente. En el resto de las especies de Brucella no

se caracterizaron biotipos diferenciados (Rivero Puente et al., 1978). Se ha

detectado la infección por Brucella en mamíferos marinos debida a dos nuevas

especies: B. ceti y B. pinnipedialis (Godfroid et al. 2005). En los últimos años se ha

aislado una nueva especie, B. microti, a partir de topillos de campo (Microtus

arvalis) y de zorros (Scholz et al. 2008; Scholz et al. 2009)y otra especie, B.

inopinata, en una paciente con un implante mamario infectado (Scholz et al. 2010).

Las bacterias del género Brucella pertenecen a la clase -proteobacterias,

orden Rhizobiales, familia Brucellaceae. El orden Rhizobiales incluye también,

entre otros, a los géneros Bartonella, Afipia, Ochrobactrum, Agrobacterium,

Rhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium y Sinorhizobium. Según el tipo de

colonias que forman en cultivo las distintas especies del género Brucella se

clasifican en lisas o rugosas. Las especies lisas son: B. abortus, B. melitensis, B.

neotomae, B. suis, B. pinnipedialis y B. ceti; las especies rugosas son: B. canis y B.

ovis.

De las especies del género Brucella identificadas hasta el presente sólo cinco

son comprobadamente patógenas para el hombre: B. melitensis, cuyos reservorios

naturales son cabras y ovejas; B. abortus, que infecta principalmente a bovinos; B.

suis a porcinos, B. canis a caninos, y B. pinnipedialis y B. ceti a mamíferos marinos.

En cambio, B. neotomae y B. ovis, cuyos reservorios naturales son ratas y ovejas,

respectivamente, no provocan enfermedad humana (Ko & Splitter 2003). (Tabla

1). La patogenicidad para el hombre de las nuevas especies (B. microti y B.

inopinata) no ha sido claramente establecida.


6

Tabla 1: Características de las diferentes especies del género Brucella.

Especie

Hospedador

Patogenicidad-

Hombre

B. abortus Bovinos moderada

Especies

lisas

B. melitensis caprinos y ovinos elevada

B. suis Porcinos moderada

B. neotomae Roedores no posee

B. pinnipedialis/

B. ceti Mamíferos marinos moderada

B. ovis Ovinos no posee Especies

rugosas B. canis Caninos moderada

Los miembros del género Brucella son bacilos cocoides, pequeños, Gram

negativos, inmóviles, no esporulantes y que no producen cápsulas ni flagelos. Estas

bacterias son microorganismos intracelulares facultativos capaces de sobrevivir y

multiplicarse dentro de las células del sistema reticuloendotelial y tejidos

asociados; se considera que esta cualidad es el factor que les confiere virulencia.

Son capaces de infectar a fagocitos profesionales (macrófagos, neutrófilos,

linfocitos B y células dendríticas)(Young 1995; Elzer et al. 1996; Porte et al. 1999;

Zwerdling et al. 2009) y no profesionales (células HeLa, células Vero, epitelio

alveolar) (Detilleux et al. 1990a; Ferrero et al. 2009)

3.2. Estructura antigénica

Siendo las bacterias del género Brucella microorganismos Gram negativos,

su envoltura celular está formada por una membrana interna, una membrana

externa y un espacio periplasmático intermedio (Ilustración 1). Este último

contiene algunas enzimas y proteínas relacionadas con el transporte de solutos, y

un gel glucopeptídico denominado peptidoglicano, responsable de la forma e

integridad osmótica de la bacteria.


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Ilustración 1: Esquema representativo de la membrana de Brucella spp.

La membrana externa contiene distribuidos asimétricamente fosfolípidos,

proteínas y un lipopolisacárido (LPS) considerado el principal antígeno (Ag) de la

bacteria. El LPS consta de una parte glucolipídica (Lípido A) inserta en la

membrana externa, y por tanto no expuesta en la superficie, y otra exclusivamente

polisacarídica dirigida hacia el exterior actuando como soporte o unión del resto

de la molécula a la superficie bacteriana. La parte polisacarídica del LPS se divide

en dos secciones: el núcleo, más interno y la cadena O. El Ag “O” es la porción

antigénicamente dominante de la molécula y está constituido por unidades

repetitivas de oligosacáridos en los cuales suelen residir los determinantes

antigénicos del LPS de las cepas lisas. Este segmento está ausente en el LPS de las

cepas del tipo rugoso.

Asociadas al LPS y formando parte de la membrana se encuentran proteínas

de la membrana externa (Omps), muchas de las cuales han sido caracterizadas

desde el punto de vista genético, inmunológico, estructural y funcional (Cloeckaert

et al. 2002). Estas proteínas se han dividido en tres grupos de acuerdo a su peso

molecular: proteínas de entre 89 y 94 kDa (grupo 1), entre 35 y 40 kDa (grupo 2), y

entre 25 y 30 kDa (grupo 3). Las proteínas de los grupos 2 y 3 se encuentran en


8

mayor cantidad y son conocidas como Omp “mayores”. Las proteínas del grupo 1

junto con otras con pesos moleculares entre 10 y 20 kDa, son denominadas Omp

“menores”. Se conoce que las proteínas del grupo 2 funcionan como porinas

(Douglas et al. 1984; Mobasheri et al. 1997; Marquis & Ficht 1993; Cloeckaert et al.

1996) mientras que las proteínas del grupo 3 son similares a la OmpA de E. coli

(Verstreate et al. 1982). Tibor et al. (1999) han demostrado que las Omp 10, 16 y

19 son lipoproteínas. A través de diversos estudios se ha confirmado la

inmunogenicidad de las Omp y su posible utilidad como vacunas (Bowden et al.

1998; Winter et al. 1983; Pasquevich et al. 2009).

El espacio periplasmático, comprendido entre la membrana externa y la

citoplasmática está constituido por el mucopéptido, formado por peptidoglucano

conteniendo glucosamina, ácido murámico, alanina, ácido glutámico y ácido

-diaminopimélico. En este espacio se han identificado proteínas tales como

p39(de Fays et al. 1999), bp26 (Rossetti et al. 1996) y Cu/Zn superóxido dismutasa

(Bricker et al. 1990). Además se ha informado la asociación de lipoproteínas con el

peptidoglucano (Cloeckaert et al. 1992) y con la membrana externa (Gómez-Miguel

et al. 1987). La fracción citoplasmática contiene ADN, ARN, la fracción ribosomal, y

una gran cantidad de proteínas solubles.

4- Mecanismos patogénicos de Brucella. Factores de

virulencia y mecanismos de evasión inmune.

Las bacterias patogénicas han desarrollado varias estrategias para contrarrestar

los mecanismos de defensa del huésped y crear un nicho de replicación favorable.

Algunas de estas estrategias afectan a mecanismos de la respuesta inmune innata,

tales como la muerte por fagocitos profesionales. Las bacterias pueden evadir la

degradación que ocurre en la vía endocítica inhibiendo la fagocitosis, manipulando

componentes de la célula huésped tales como las Rho GTPasas, modificando el

tráfico de la vía endocítica, etc.

Brucella spp. son bacterias intracelulares facultativas que replican dentro

de la célula huésped. Incluso se ha propuesto considerarlas “parásitos

intracelulares facultativamente extracelulares”, teniendo en cuenta que su forma

de vida habitual es la intracelular y que facultativamente pueden crecer en medios


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nutritivos (Moreno & Moriyon 2002). Los factores bacterianos implicados en la

supervivencia y replicación intracelular constituyen los principales factores de

virulencia, ya que las mutantes defectivas para éstos han resultado avirulentas

(Hong et al. 2000; Lestrate et al. 2000).

Brucella reside en los tejidos del sistema retículoendotelial y sobrevive

intracelularmente en macrófagos, lo cual es esencial para el establecimiento,

desarrollo y cronicidad de la enfermedad. Ha sido propuesto, y parcialmente

demostrado, que la supervivencia intracelular de Brucella en macrófagos resulta

de su capacidad de manipular la vía endocítica, inhibiendo la fusión entre la

vacuola que contiene a la bacteria y los lisosomas. Se ha observado que las especies

con LPS liso pueden evadir la fusión de la vesícula que las contiene con el lisosoma

mientras que las especies con LPS rugoso (carecen del antígeno O) se unen

rápidamente a los lisosomas y son eliminadas. El mecanismo por el cual la cadena

O del LPS permite a la bacteria evitar la fusión con el lisosoma puede estar

determinado por interacciones con un receptor particular y/o por modificaciones

en las propiedades de la membrana de la vacuola que contiene a la bacteria.

Brucella lisa muerta por calor también puede retardar la fusión con el lisosoma

(Porte et al., 2003). Sin embargo, el retardo dependiente de la cadena O del LPS es

un fenómeno transitorio y no sería suficiente para la superviviencia intracelular

por largo tiempo de la bacteria lisa viva, sugiriendo que es necesaria la presencia

de otros factores para asegurar la supervivencia intracelular de la bacteria.

Brucella reside en un comparimiento acidificado que se fusiona con

componentes de la vía endocítica temprana inmediatamente después de su

entrada en el macrófago (Porte et al. 1999; Celli et al. 2003).. Allí es expuesta al

estallido oxidativo (Jiang et al. 1993). Luego, las cepas virulentas de Brucella llegan

al fagosoma replicativo o “brucelosoma”, donde es inhibida la fusión con el

lisosoma y el pH aumenta (Roop et al. 2004; Köhler et al. 2003). En células HeLa,

Brucella abortus y Brucella melitensis previenen la fusión con los lisosomas,

escapando así de la vía endocítica antes de interaccionar con los endosomas

tardíos. Estas bacterias transitan en una vacuola con características de

autofagosoma y se replican en un compartimiento caracterizado por la presencia

de marcadores de retículo endoplasmático (Pizarro-Cerdá, Méresse, et al. 1998;


10

Pizarro-Cerdá, Moreno, et al. 1998; Delrue et al. 2001). En coincidencia con estos

hallazgos, observaciones en células Vero o trofoblastos de cabras preñadas han

mostrado la presencia de Brucella spp. replicándose en el retículo endoplásmico

(Anderson & Cheville 1986; Detilleux et al. 1990b). Se han identificado dos factores

relacionados con la evasión de la fusión fagosoma-lisosoma: el glucano cíclico y el

aparato de secreción de Tipo IV.

4-1. Glucano 1-2 cíclico inhibe la fusión con el lisosoma.

Un mecanismo usado por Brucella para modular el tráfico intracelular

involucra al Glucano 1-2 cíclico (Arellano-Reynoso et al. 2005). Este componente

periplasmático es producido por organismos de la subdivisión -2 proteobacteria,

en los que está involucrado en la osmoregulación. En el caso de Brucella, se ha

demostrado que las mutantes en el gen codificante para la sintetasa de este

compuesto (cgs) son incapaces de evitar la fusión con los lisosomas o alcanzar la

organela replicativa derivada del retículo endoplasmático, indicando que la

producción de Glucano 1-2 cíclico es necesaria para el apropiado tráfico

intracelular (Arellano-Reynoso et al. 2005; Briones et al. 2001). De acuerdo con

este resultado, el agregado de Glucano 1-2 cíclico exógeno a la mutante cgs

durante el crecimiento previo a la infección restablece la capacidad de la bacteria

de manipular el tráfico intracelular (Arellano-Reynoso et al. 2005).

4-2. El sistema de secreción de Tipo IV.

Aunque las vesículas que contienen Brucella (VCB) experimentan algunas

interacciones con la vía endocítica, estas interacciones son transitorias. En estadios

tempranos de la maduración de la VCB se observa la acidificación de la vacuola, lo

cual coincide con la adquisición de un marcador asociado al estadio endosomal

tardío, la glicoproteína-1 de membrana asociada al lisosoma (LAMP-1) (Porte et al.

1999; Celli et al. 2003). Sin embargo la VCB no adquiere otros marcadores de la vía

endocítica (Pizarro-Cerdá, Méresse, et al. 1998; Celli et al. 2003), indicando que la

vesícula se desvía de la vía endocítica antes de alcanzar el estado de endosoma

tardío. No se conoce aún el mecanismo por el cual la VCB adquiere LAMP-1 y si la

adquisición temprana de este marcador es necesaria para la maduración de la VCB.

En contraste, se sabe que la acidificación es esencial para la supervivencia de


11

Brucella y es necesaria para la expresión intracelular del aparato de secreción de

Tipo IV de Brucella codificado por el operón virB (Boschiroli et al. 2002).

El operón virB, identificado en distintas especies de Brucella (Hong et al.

2000; Lestrate et al. 2000; Delrue et al. 2001; O’Callaghan et al. 1999; Foulongne et

al. 2000; Sieira et al. 2000), es fundamental para la supervivencia intracelular de la

bacteria. Esta región es homóloga al operón virB de A. tumefaciens, el cual incluye

los genes de 12 proteínas (VirB1 a VirB12) que conforman un aparato de secreción

de Tipo IV (O’Callaghan et al. 1999). Estos sistemas se encargan de la secreción o

exportación de proteínas o complejos de nucleoproteínas, y muchos se encuentran

en patógenos animales o vegetales como A. tumefaciens, Bordetella pertussis,

Helicobacter pylori, o el patógeno intracelular Legionella pneumophila (Christie

2001).

Un operón virB funcional es necesario para el establecimiento y

mantenimiento de la infección persistente por Brucella, y se ha observado que

varias mutantes en genes virB son avirulentas en el modelo murino (Hong et al.

2000; Lestrate et al. 2000; Sieira et al. 2000; Delpino et al. 2009). A su vez, este

sistema es necesario para la supervivencia intracelular en macrófagos, células

HeLa y osteoblastos (Delrue et al. 2001; O’Callaghan et al. 1999; Foulongne et al.

2000; Sieira et al. 2000; Delpino et al. 2009). Se ha demostrado que el operón virB

está involucrado en la maduración de la vacuola que contiene a Brucella,

convirtiéndola en una organela que permite la replicación de la bacteria (Delrue et

al. 2001; Comerci et al. 2001). En años recientes se han identificado en Brucella

algunas proteínas que serían secretadas en forma dependiente de la expresión de

genes virB, lo cual hace presumir que son secretadas por el aparato de secreción

tipo IV(Marchesini et al. 2011; Myeni et al. 2013).

4-3. Brucella TIR containing protein (Btp)

Recientemente se ha demostrado que Brucella abortus expresa dos

proteínas con dominios TIR llamadas BtpA y BtpB, las cuales son secretadas por el

sistema de secreción de tipo IV de la bacteria y se localizan en el citosol de las

células infectadas. BtpA y BtpB interfieren en la señalización de TLR2, TLR4 y

TLR5, y están involucradas en la capacidad de B. abortus de reduccir la maduración


12

de las células dendríticas y de inhibir la secreción de citoquinas proinflamatorias

(Salcedo et al 2008 y 2013), por lo que serían un importante factor de regulación

de la inmunidad innata. Además se ha demostrado que BtpA purificada inhibe la

muerte celular inducida por células T CD8+ y de esta manera controla la respuesta

inmune adaptativa (Durward et al. 2012).

En estudios in vivo, se demostró que B. abortus mutante para BtpB se

encuentra atenuada en un modelo de infección intraperitoneal de ratones

inmunocomprometidos carentes del factor regulador de interferón (IFR-1-/-), sin

embargo no se vió atenuación en ratones Balb/c cepa salvaje (Salcedo et al. 2013).

Por lo tanto, a pesar de haberse demostrado su capacidad inmunomoduladora in

vitro, aún se desconoce el rol de las proteínas Btp durante la infección por Brucella

en animales inmunocompetentes.

4-4. LPS

El LPS de Brucella posee multiples propiedades que le otorgan a la bacteria

la capacidad para evadir parcialmente al sistema immune. Exhibe caracteristicas

particulares que le permite evadir la detección por el receptor TLR4. La mayoria de

los LPS de las bacterias entéricas poseen un lípido A con ácidos grasos cortos,

mientras que en Brucella los mismos son largos (Lapaque et al. 2006), lo cual, junto

con patrones de glicosilacion del polisacárido (Gil-Ramírez et al. 2014), hacen que

las caracteristicas de endotoxina se vean disminuídas debido a una activación casi

nula del receptor TLR4. Se ha observado, por ejemplo, que la dosis de LPS de B.

abortus necesaria para inducir la producción de un determinado nivel de TNF-α

por monocitos humanos es 1000 veces mayor que la dosis de LPS de Escherichia

coli(Giambartolomei et al. 2004). Además, el LPS no canónico de Brucella le

confiere resistencia a la activación del complemento por la vía de las lectinas y

resistencia a la actividad microbicida de algunos péptidos antimicrobianos

(Fernandez-Prada et al. 2001; Corbeil et al. 1988).


13

5- Contagio inhalatorio de la brucelosis

Como se mencionó anteriormente, el hombre puede adquirir la infección

por Brucella por contacto directo de la piel lesionada con material infectado, pero

las formas más frecuentes de infección son el ingreso de aerosoles a través de las

vías conjuntival o inhalatoria, y la ingestión de alimentos contaminados.

El ingreso por mucosas es también la forma principal de contagio entre los

animales, aunque en este caso se suma la vía venérea y por lo tanto la mucosa

genital (no relevante para la infección humana). Los animales tienen por

costumbre oler y lamer los restos fetales o placentarios, que en el caso del aborto

por Brucella spp. contienen enormes cantidades de estas bacterias.

La transmisión de Brucella por vía aérea en empleados de laboratorios

productores de la cepa vacunal o de laboratorios de análisis microbiológicos ha

sido ampliamente documentada (Memish & Mah 2001; Wallach et al. 1997; Martin-

Mazuelos et al. 1994; Staszkiewicz et al. 1991; Ollé-Goig & Canela-Soler 1987;

Montes et al. 1986; Nelson et al. 1975; SULKIN 1961; TREVER et al. 1959;

Huddleson & Munger 1940). La forma más frecuente de adquisición de la infección

es la inhalación de aerosoles contaminados producidos de forma accidental

durante la manipulación de esta bacteria (Martin-Mazuelos et al. 1994). De hecho

la brucelosis es considerada una de las infecciones más comunes entre las

adquiridas en laboratorios microbiológicos y los aerosoles han sido implicados en

la mayoría de los casos (Yagupsky & Baron 2005). También se han producido

brotes de brucelosis humana en mataderos debidos a aerosoles generados durante

la faena de animales infectados (Kaufmann et al. 1980), y en trabajadores rurales,

entre otras causas, por la manipulación de guano seco de animales infectados que

es empleado como fertilizante (Wallach et al. 1997).

Las numerosas evidencias sobre la transmisión de esta bacteria por

aerosoles han hecho que Brucella sea considerada como un agente potencial de

bioterrorismo (Miller et al. 1987; Davos et al., 1981)En la década de 1950, B. suis

fue el primer agente en un arma biológica en los Estados Unidos, y otros países han

considerado emplear a Brucella para el mismo fin (Bossi et al. 2004; Pappas et al.

2006). Se ha estimado que se requieren tan sólo 10 a 100 organismos


14

aerosolizados para generar infección en seres humanos, y es por ello que Brucella

se considera altamente infectiva cuando se adquiere por vía aerógena (Bossi et al.

2004). Como resultado, B. melitensis, B. abortus y B. suis han sido clasificados como

agentes para bioterrorismo de categoría B por el Centro para el Control y la

Prevención de Enfermedades Infecciosas (CDC) (Bhattacharjee et al. 2006; Pappas

et al. 2006). La ausencia de una vacuna para uso en seres humanos aumenta la

preocupación sobre el posible uso de Brucella como arma biológica.

6 Principales células de las vías respiratorias

6-1. Células epiteliales

La mucosa respiratoria incluye distintos tipos de células epiteliales según el

nivel anatómico que se considere. El epitelio de los conductos aéreos es un epitelio

columnar pseudoestratificado el cual está compuesto por tres tipos celulares:

células ciliadas, células secretorias y células basales. Esta capa de epitelio

pseudoestratificado disminuye gradualmente su grosor desde las vías aéreas más

grandes (tráquea y bronquios) hasta formar una capa muy delgada de epitelio en

los bronquiolos terminales (Ilustración 2). Las células epiteliales bronquiales

constituyen una barrera física estrecha recubierta por una capa de moco que

impide la penetración de agentes patógenos al cuerpo. El moco y los movimientos

ciliares les permiten a las células epiteliales bronquiales atrapar y eliminar los

microorganismos. El epitelio bronquial también produce sustancias

antimicrobianas, incluyendo lisozima, lactoferrina, colectinas, y péptidos

antimicrobianos, que proporcionan una cubierta protectora adicional. Además de

estas funciones, que siempre están activas, las células epiteliales bronquiales

también son capaces de reconocer y responder a los microorganismos, secretando

citoquinas que dan inicio a una respuesta inflamatoria local (Kaiser & Diamond

2000).

El epitelio alveolar forma una capa muy delgada de células que cubren el

99% de la superficie interna del pulmón y está compuesto por dos tipos de células

morfológicamente distintas llamadas neumocitos tipo I y tipo II. Los neumocitos

tipo I tienen un núcleo protruido y extensiones citoplasmáticas extremadamente

finas, cubren más del 90% de la superficie del espacio alveolar. Su principal


15

función es participar del intercambio gaseoso en el alvéolo. Las funciones de los

neumocitos de tipo II son la producción y almacenamiento de surfactante, el

transporte de solutos e iones y la reparación alveolar (Ilustración 2). Además, se

ha demostrado que los neumocitos tipo II juegan un rol muy importante en la

regulación de la respuesta inmune en pulmón. Expresan moléculas de

histocompatibilidad de clase II, moléculas de adhesión (Cunningham et al. 1994) y

secretan citoquinas en respuesta a patógenos (Gentry et al. 2007).

La mayoría de los estudios in vitro sobre interacción del epitelio pulmonar

humano con patógenos han sido realizados con líneas de células bronquiales

(principalmente BEAS-2B y 16HBE14o-) y de células alveolares (línea A549 de

neumocitos tipo II).

6-2. Macrófagos alveolares

Los macrófagos alveolares (MA) constituyen aproximadamente el 93% de la

población de macrófagos pulmonares (Marriott & Dockrell 2007). Los MA están

estratégicamente situados en la luz de los alvéolos y los conductos alveolares y son

por lo tanto las primeras células del sistema inmune en contactar los patógenos y

antígenos inhalados en el tracto respiratorio inferior. Los MA poseen una vida útil

de aproximadamente 3 meses (Thomas et al. 1976). La longevidad de estas células

se debe a mecanismos de resistencia a la apoptosis constitutiva(Liu et al. 2001).

Hay aproximadamente un MA en cada alvéolo. Los monocitos de la sangre al

ingresar en los pulmones se diferencian en MA bajo la influencia de factores locales

(células alveolares de tipo II, epitelio bronquial, citoquinas, surfactante), aunque la

replicación in situ de los MA también contribuye a mantener la población total en

el pulmón (Blussé van Oud Alblas et al. 1981). Los MA, a diferencia de los

macrófagos intersticiales de pulmón, poseen alta capacidad fagocítica y secretan

mayores cantidades de TNF-α en respuesta a patógenos, pero son menos eficientes

en la presentación de antígenos (Franke-Ullmann et al. 1996).


16

Ilustración 2: Ilustración del epitelio de los pulmones en las vías respiratorias

superiores (bronquios) (a), las vías respiratorias inferiores (bronquiolos) (b), y los

alvéolos (c). (A) Células 16HBE14o (1000 x): análisis de microscopía electrónica de células

cultivadas en Transwell durante 1 semana a una densidad de 105 células/ cm2. La capa de

células 16HBE14o se compone de células cuboidales. (B) Células Calu-3 (2600 x): Análisis

de microscopía electrónica de las células cultivadas en Transwell durante 2 semanas con

una densidad de 2x105 células/cm2. La monocapa de células Calu-3 está compuesta por

células con forma de columnas. (C) monocapa hAEpC (1000 x): Análisis de microscopía

electrónica de las células cultivadas por 1 semana en Transwell a una densidad de 6x105

células/cm2. Las células hAEpC poseen una morfología similar al de las células epiteliales

alveolares de tipo I. Reproducido de Forbes et al., 2005.

En condiciones normales (no inflamatorias) los MA se mantienen en un

estado de reposo para evitar una excesiva inflamación, produciendo pocas

citoquinas inflamatorias (Holt 1978). El objetivo principal es evitar daños en las

células epiteliales de tipo I y tipo II en respuesta a antígenos inofensivos. Además,

los MA suprimen activamente la inducción de la inmunidad adaptativa a través de

sus efectos sobre células dendríticas alveolares e intersticiales y células T. Estudios

previos han demostrado que la eliminación in vivo de los MA mediante liposomas

cargados de clodronato da lugar a reacciones inflamatorias fuertes en respuesta a


17

partículas inofensivas y antígenos solubles (Thepen et al. 1989). Los MA se

adhieren estrechamente a las células epiteliales alveolares en la pared alveolar y

están separados por una distancia de sólo 0.2-0.5 mm de las células dendríticas

intersticiales. En ratones donde se han eliminado los MA, las células dendríticas

muestran un aumento en su capacidad presentadora de antígenos (Holt et al.

1993).

En un proceso infeccioso los MA se activan aumentando su capacidad

fagocítica y secretando citoquinas (TNF-α e IL-6) y quemoquinas (IL-8) que

promueven el reclutamiento de neutrófilos (Franke-Ullmann et al. 1996; Marriott

& Dockrell 2007). En la fase de resolución de la inflamación, los MA son también

capaces de fagocitar células inflamatorias apoptóticas (Jennings et al. 2005) e

incluso pueden contribuir a la inducción de la apoptosis en estas células. In vitro,

los MA son capaces de inducir la apoptosis a través de Fas ligando y de otros

ligandos para receptores de muerte en células blanco susceptibles como

monocitos, linfocitos y neutrófilos (Badley et al. 1997; Dockrell et al. 2001).

6-3. Células dendríticas.

Las células dendríticas (CD) comparten el precursor común con MA, pero se

diferencian en su ubicación pulmonar (submucosa de la vía aérea), morfología,

expresión de receptores, procesamiento de antígenos y función. Las CD forman una

malla en la submucosa de la nasofaringe, tráquea, y el árbol bronquial similar al

que forman las células de Langerhans de la piel. Las CD son células presentadoras

de antígenos extremadamente eficientes pero son débiles fagocitos. Luego de

capturar el antígeno, las CD migran a los ganglios linfáticos regionales y presentan

péptidos antigénicos para producir una activación enérgica de las células T (a

distancia de la delicada superficie alveolar).


18

7. La interacción de los patógenos con la mucosa respiratoria.

7-1. Reconocimiento de patógenos por las células de las vías

respiratorias.

El sistema inmune de los mamíferos está compuesto por dos ramas, el

sistema inmune innato y el sistema inmune adaptativo, que trabajan en conjunto

para proporcionar resistencia a la infección. La respuesta inmune innata es la

primera línea de defensa del huésped y es responsable del reconocimiento

inmediato de los agentes agresores y de controlar la invasión microbiana

(Medzhitov & Janeway 1997). Los componentes celulares del sistema inmune

innato son neutrófilos, macrófagos, células asesinas naturales (natural killers o

NK), basófilos, mastocitos, eosinófilos y otros.

En el tracto respiratorio, el epitelio que reviste las vías respiratorias es el

primer punto de contacto para las sustancias inhaladas tales como contaminantes

del medio ambiente, el humo del cigarrillo, alérgenos en el aire, y los

microorganismos (Diamond et al. 2000). Aunque el tracto respiratorio superior

está colonizado por bacterias, el tracto respiratorio inferior suele ser un ambiente

estéril. En los últimos años ha quedado claro que las células epiteliales de las vías

respiratorias no sólo proporcionan una barrera pasiva, sino que también

contribuyen activamente al sistema inmune innato (Diamond et al. 2000; Holgate

et al. 2000). El epitelio de las vías respiratorias reconoce a los patógenos y

responde iniciando una respuesta inflamatoria. Esta respuesta consiste en un

aumento en la liberación de, por ejemplo, péptidos antimicrobianos en el lumen de

las vías respiratorias, y la liberación de citoquinas en la submucosa, que inician una

reacción inflamatoria (Bals et al. 2004). Dicha reacción inflamatoria incluye el

reclutamiento de fagocitos, que sirven para eliminar los microorganismos que no

fueron eliminados por el mismo epitelio, y de células dendríticas y linfocitos que

pueden ayudar a montar una respuesta inmune adaptativa. Por lo tanto, los

mecanismos desencadenados por el epitelio de las vías respiratorias luego de

reconocer a los agentes patógenos son esenciales para montar una respuesta

protectora por el sistema inmune(Bals et al. 2004; Diamond et al. 2000).


19

La respuesta inmune innata depende de receptores codificados por una

línea germinal evolutivamente antigua llamados receptores de reconocimiento de

patrones (pattern-recognition receptors, PRRs), los cuales reconocen estructuras

antigénicas altamente conservadas (Akira et al. 2006; Lee & Kim 2007; Trinchieri

& Sher 2007). Este sistema de reconocimiento codificado genéticamente le permite

al huésped reconocer rápidamente una amplia variedad de patógenos. Los PRRs

reconocen componentes microbianos conocidos como patrones moleculares

asociados a patógenos (PAMPs), los cuales son moléculas esenciales para la

supervivencia de los microorganismos y son relativamente invariantes. Las células

del sistema inmune innato, incluyendo macrófagos y células dendríticas, utilizan

los PRRs para reconocer los PAMPs presentes en los microorganismos.

La inmunidad innata incluye al menos 4 familias de PRRs: receptores tipo

Toll (TLRs), receptores tipo RIG (RLRs), receptores tipo NOD (NLRs) y la familia de

receptores HIN200. Mientras que los TLRs se localizan en membrana plasmática y

endosomal y se especializan en su mayoría en la vigilancia del espacio extracelular,

las otras 3 familias de receptores vigilan el entorno intracelular

Con el descubrimiento de los receptores de tipo toll (Toll-like receptor,

TLR) se produjo un gran avance en la comprensión de la capacidad del sistema

inmune innato para reconocer rápidamente los agentes patógenos. Hasta la fecha,

se han identificado 10 TLR humanos (Akira et al. 2006; Lee & Kim 2007; Trinchieri

& Sher 2007). Los TLR están presentes en casi todas las células del cuerpo y

pueden estar localizados en la membrana plasmática o en vesículas intracelulares

dependiendo del la naturaleza del patógeno que va a ser reconocido (Akira et al.

2006; Lee & Kim 2007; Trinchieri & Sher 2007) (Ilustración 3).

Las células epiteliales de las vías respiratorias expresan una variedad de

TLR que pueden ayudarles a montar una respuesta adecuada a la exposición

microbiana (Brightbill & Modlin 2000; Medzhitov & Janeway 2000). Se ha

demostrado la expresión de diversos TLR en células BEAS-2B, A549, 16HBE14o- y

otras líneas de epitelio respiratorio (Sha et al. 2004; Mayer & Dalpke 2007). La

activación de los TLR en las células epiteliales regula la expresión de una variedad


20

de genes, incluyendo los que codifican citoquinas, quemoquinas y péptidos

antimicrobianos.

Las células epiteliales de las vías respiratorias expresan principalmente

TLR2 a TLR6 (Sha et al. 2004; Homma et al. 2004). TLR4 es un componente central

en la respuesta de las células al LPS y es expresado por las células epiteliales

respiratorias (Sha et al. 2004; Mayer et al. 2007). TLR2 reconoce una amplia gama

de productos microbianos de las bacterias Gram-positivas, Gram-negativas y

hongos. TLR2 dimeriza con TLR1 ó TLR6, y reconoce componentes bacterianos

tales como lipoproteínas, peptidoglicano (PGN), ácido lipoteicoico y algunas

proteínas de la envoltura vírica, como las expresadas por el virus del sarampión y

el citomegalovirus humano. TLR5 reconoce flagelina, que es un componente de los

flagelos de las bacterias. TLR3 es esencial en la respuesta a la doble cadena (dc) de

ácido ribonucleico (ARN) que se produce durante las infecciones virales

(Alexopoulou et al. 2001). TLR3 ha sido implicado en la respuesta de las células

epiteliales respiratorias, por ejemplo a rinovirus, y ARNdc sintéticos (ácido

poliinosínico-policitidílico). Esta respuesta no sólo consiste en un incremento en la

expresión de las quemoquinas (Duits et al. 2003; Gern et al. 2003), sino también de

β-defensinas humanas (Duits et al., 2003). TLR9 media la respuesta al ácido

desoxirribonucleico (ADN) de las bacterias. Un estudio reciente mostró que TLR9

media la respuesta de líneas de células epiteliales bronquiales al CpG, resultando

en la expresión de la interleuquina-8 (IL-8) (Mayer et al., 2007). Los TLR están

estratégicamente posicionados en las células epiteliales y les permiten reconocer

organismos que se encuentran con frecuencia en la superficie de las mucosas.

Recientemente se han identificado receptores citosólicos de reconocimiento

de patógenos (Akira et al. 2006; Lee & Kim 2007; Trinchieri & Sher 2007). Entre

estos receptores se encuentran helicasas de ARN citoplasmáticas que se expresan

en las células epiteliales de las vías respiratorias y detectan ARNdc viral

independientemente de TLR3 (Ilustración 3) (Liu et al. 2007; Opitz et al. 2007).

Además, algunos miembros de la familia de proteínas NACHT-LRR (LNR), que

incluyen tanto las proteínas de dominio de oligomerización de unión a nucleótidos

(NOD) y proteínas que poseen dominios de unión a pirina (NALPs), reconocen

componentes microbianos en el citosol (Ilustración 3) (Akira et al. 2006; Lee &


21

Kim 2007; Fritz et al. 2006). NOD1 y NOD2, reconocen péptidos derivados del PGN,

ácido γ-D-glutamil-mesodiaminopimélico y muramil dipéptido respectivamente, y

se expresan en las células epiteliales de las vías respiratorias (Opitz et al. 2004).

Algunos NLRs y la proteína AIM2 de la familia HIN200 responden a la detección

de infecciones y señales de estrés ensamblando complejos proteicos citosólicos

denominados inflamasomas, cuya función central es la activación autocatalítica de

la caspasa-1 (Lamkanfi & Dixit 2012). La caspasa-1 es producida como zimógeno

inactivo. La consecuencia mejor caracterizada de la activación de caspasa-1 en los

inflamasomas es la secreción de las citoquinas proinflamatorias IL-1β e IL-18. En la

mayoría de los modelos experimentales, los ratones deficientes en caspasa-1 no

producen IL-1β e IL-18 maduras (Lamkanfi & Dixit 2012).

IL-1β es una potente citoquina proinflamatoria, que produce efectos locales

y sistémicos, teniendo como blancos a leucocitos, células endoteliales y epiteliales,

y fibroblastos, y células esplénicas, cerebrales y hepáticas. IL-1β mejora la

capacidad fagocítica de neutrófilos y monocitos e induce la expresión del receptor

C3b de complemento. Además incrementa la producción de especies reactivas del

oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) en neutrófilos ante el reconocimiento de

ligandos de origen microbiano. IL-1β induce además la secreción local de las

quemoquinas MIP-2 y KC, atractantes de neutrófilos, y estimula la expresión de las

moléculas de adhesión ICAM-1 y ELAM en células endoteliales. En el hígado

estimula la producción de proteínas del complemento y proteína C reactiva, y en el

bazo promueve la proliferación linfocitaria. Por su parte, IL-18 actúa en forma

colaborativa con IL-12 para inducir la producción de IFN-γ por células NK y

linfocitos T. También induce en neutrófilos la producción de ROS y la secreción de

IL-6 (Chen & Schroder 2013). Un aspecto notorio de ambas citoquinas es que

carecen de péptido señal y por lo tanto no son secretadas por la vía convencional

de Retículo Endoplásmico-Golgi. En cambio, su secreción, si bien no se conoce el

mecanismo, depende de la activación de inflamasomas y el clivaje autocatalítico de

la procaspasa-1 (Lamkanfi & Dixit 2012)


22

7-2. La respuesta del epitelio respiratorio a los patógenos

Como lo mencionáramos, las células epiteliales se encuentran en los sitios

de contacto con el ambiente externo por lo que son a menudo las primeras células

en interactuar con los patógenos microbianos. De hecho, la adherencia bacteriana a

las células epiteliales es un requisito previo para la colonización y posterior

infección (Beachey & Courtney 1989; Geme 1996), y las células epiteliales a través

de esta interacción tienen la oportunidad de reconocer y responder a los

patógenos. En el epitelio respiratorio esa respuesta incluye la secreción de

citoquinas proinflamatorias (IL-1, IL-6, TNF-α) y quemoquinas (IL-8, MCP-1,

eotaxina, CCL20) que dan inicio a una respuesta inflamatoria (Koyama et al. 2000;

Arnold et al. 1994; Gentry et al. 2007; Rittig et al. 2003; Mayer & Dalpke 2007).

Ilustración 3: Resumen de la influencia de las células epiteliales en la respuesta

inmune innata y adaptativa, así como en procesos anti-inflamatorios en las vías

respiratorias. La parte izquierda de la figura muestra los perfiles de expresión de PRRs en

el epitelio. Los TLR reconocen patógenos en la superficie celular del epitelio respiratorio.

Por el contrario, TLR3, NOD y helicasas a ARN reconocen patógenos intracelulares.

Después de la activación de los PRRs, las células epiteliales producen una amplia gama de

moléculas que aumentan la respuesta inmune innata y adaptativa, el reclutamiento de

células o median respuestas antiinflamatorias. Reproducido de Kato et al., 2007.


23

In vivo, el epitelio respiratorio se ubica muy próximo a las células

endoteliales de la microvasculatura pulmonar, por lo cual las quemoquinas

producidas por el epitelio alveolar infectado pueden inducir la migración de

fagocitos profesionales al sitio de infección. Este fenómeno de atracción de

fagocitos ha sido reproducido en modelos alveolares in vitro (Hurley et al. 2006;

Herold et al. 2006). Entre las quemoquinas secretadas por las células epiteliales en

respuesta a patógenos, IL-8 y MCP-1 juegan un rol muy importante en el

reclutamiento de fagocitos profesionales al sitio de infección. IL-8, y su homólogo

murino CXCL1 o también llamado KC, pertenece a la familia de las quemoquinas

CXC, es quimioatractante de neutrófilos y linfocitos T, y es secretada por una

amplia variedad de células (macrófagos, fibroblastos, células endoteliales, células

epiteliales, etc.) en respuesta a múltiples estímulos (Baggiolini et al. 1989; Bazzoni

et al. 1991; Van Damme et al. 1994). MCP-1 es un miembro de la familia de

quemoquinas CC que desempeña un papel fundamental en el reclutamiento y la

activación de los monocitos durante la inflamación aguda (Tangirala et al. 1997).

En los pulmones humanos MCP-1 se expresa en una variedad de tipos de celulares,

como ser macrófagos, células endoteliales, epiteliales bronquiales, y células del

músculo liso (Antoniades et al. 1992; Iyonaga et al. 1994; Car et al. 1994).

En un sistema biológico intacto, la comunicación entre las células epiteliales

y las células inmunes profesionales es necesaria para la inducción de una

respuesta innata y adaptativa eficiente. Debido a que las células epiteliales están

entre los primeros tipos celulares en interactuar con los patógenos inhalados,

conocer la contribución del epitelio respiratorio durante la invasión de las vías

aéreas por Brucella es crucial para dilucidar el proceso patogénico y puede además

contribuir al desarrollo de estrategias terapéuticas contra la brucelosis.

7-3. Mecanismos de infección a través de la mucosa respiratoria

A pesar de los mecanismos de defensa pulmonares, muchos patógenos

logran atravesar la barrera epitelial y alcanzar la circulación sistémica, con lo cual

se diseminan por el organismo. De hecho, no puede descartarse que la

transmigración de fagocitos hacia el sitio de infección contribuya en algunos casos


24

al pasaje de patógenos a través de la barrera epitelial alveolar, ya sea por alterar la

permeabilidad de la barrera epitelial o por exponer componentes de la membrana

celular basolateral que pueden servir de receptores para la adhesión de los

patógenos.

Distintos patógenos emplean mecanismos diferentes para atravesar la

barrera epitelial alveolar. El alvéolo contiene células epiteliales y macrófagos

alveolares, pero las primeras son mucho más numerosas (aproximadamente

30.000 versus 50). De esta manera, los patógenos podrían interactuar inicialmente

con las células epiteliales que lindan el espacio alveolar. De hecho, B. abortus y

numerosos patógenos (Mycobacterium tuberculosis, Burkholderia cepacia,

Francisella tularensis, Streptococcus pneumoniae) son capaces de invadir y/o

replicarse en células epiteliales alveolares o bronquiales humanas (Ferrero et al.

2009; Gentry et al. 2007; Birkness et al. 1999; Duff et al.). La invasión de células

epiteliales protege a la bacteria de la actividad bactericida de los macrófagos.

Además, algunos patógenos como Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium

tuberculosis y Bacillus anthracis pueden pasar a través de estas células (pasaje

transcelular) hacia las células endoteliales adyacentes y así acceder a la circulación

sistémica (Russell et al. 2008; Birkness et al. 1999). Otros patógenos como

Pseudomonas aeruginosa y Burkholderia cepacia dañan la barrera epitelial al

interferir con la integridad de las uniones estrechas (tight junctions) y así logran

traslocar el epitelio (pasaje paracelular) (Duff et al., 2006).

Para algunas infecciones pulmonares causadas por patógenos capaces de

sobrevivir en macrófagos se ha postulado que los macrófagos alveolares infectados

podrían migrar hacia la circulación sistémica. Este mecanismo de traslocación de la

barrera epitelial suele denominarse “caballo de Troya”, ya que el patógeno viaja

recluido en una célula. Se han obtenido resultados que apoyan este mecanismo en

el caso de Chlamydia pneumoniae y B. anthracis. (Gieffers et al. 2004; Passalacqua &

Bergman 2006). Pero la demostración definitiva se obtuvo en un trabajo reciente

que demostró que los macrófagos alveolares murinos migran constitutivamente a

los ganglios drenantes y pueden transportar patógenos desde el pulmón a esos

ganglios incluso antes que las células dendríticas (Kirby et al. 2009).

Recientemente se ha demostrado que Brucella utiliza este mecanismo para


25

atravesar la barrera epitelial pulmonar (Archambaud et al. 2010). Sin embargo,

todavía resta evaluar si junto con éste mecanismo, Brucella es capaz de traslocar el

epitelio respiratorio por algún mecanismo de pasaje transcelular o paracelular.

Hipotesis de trabajo

Luego de ser inhalada B. abortus logra diseminarse sistémicamente y

persistir en el pulmón murino por tiempos prolongados, lo que indicaría que la

respuesta inmune montada por el pulmón es insuficiente para controlar la

infección. Previamente demostramos que B. abortus infecta in vitro macrófagos

alveolares y células epiteliales pulmonares en los que induce la producción de

citoquinas de forma leve y tardía.

La hipótesis de este trabajo es que B. abortus es capaz de infectar y persistir en

el pulmón murino, y de diseminarse sistémicamente desde allí, gracias a su

capacidad de evadir y/o modular la respuesta inmune innata y antimicrobiana

pulmonar, probablemente mediante mecanismos múltiples.

26

OBJETIVOS

El objetivo general de este trabajo de tesis consiste en evaluar la interacción

de Brucella con la mucosa respiratoria en las primeras etapas de la infección para

caracterizar la respuesta inmune innata desencadenada en el pulmón, así como

evaluar los mecanismos que utiliza la bacteria para evadir la vigilancia

inmunológica en el pulmón y diseminarse sistémicamente.

Se plantean los siguientes objetivos particulares:

Evaluar la evolución temporal de la respuesta inmune local (citoquinas,

defensinas, reclutamiento de células inmunes y características histológicas)

y la cinética de diseminación bacteriana en ratones luego de la infección

intratraqueal con B. abortus.

Evaluar la evolución temporal de la respuesta inmune pulmonar a la

infección con una mutante de B. abortus deficiente en las proteínas que

contienen dominios TIR (BtpA y BtpB).

Evaluar in vivo si B. abortus es capaz de modular la respuesta inmune

pulmonar frente a agonistas de TLRs y si ese efecto está mediado por las

proteínas Btp.

Evaluar in vitro la capacidad de los macrófagos y células epiteliales

alveolares murinas infectadas con B. abortus o con mutantes para las

proteínas BtpA y BtpB para modular la respuesta proinflamatoria inducida

por agonistas de TLRs.

Evaluar la capacidad de B. abortus de sobrevivir y de modular la respuesta

inflamatoria pulmonar en animales previamente estimulados con un

agonista TLR por vía intratraqueal.

Determinar si la infección por Brucella abortus, o el estímulo con

sobrenadantes de cultivo de macrófagos infectados, inducen en células

epiteliales alveolares y bronquiales la producción de β-defensinas y CCL20.

Evaluar el efecto antimicrobiano de CCL20, hBD2 y hBD3 sobre B. abortus.

27

Capitulo 1

Respuesta inmune a la infección

intratraqueal con B. abortus y efecto

modulador de las proteínas Btp

28

Introducción

Capítulo 1- Introducción

29

Los modelos animales se han usado ampliamente en el estudio de la Brucelosis.

Si bien cada especie de Brucella tiene su hospedador preferencial, el modelo más

ampliamente usado en investigación es el modelo murino porque aporta

información valiosa para el estudio de virulencia de cepas, ensayos de protección

vacunal o para evaluar la fisiopatología de la enfermedad (Grillá et al. 2012; Ibañez

et al. 2013; Gil-Ramírez et al. 2014).

Como se mencionó anteriormente, son varias las vías plausibles de iniciar una

infección exitosa. En la mayor parte de los ensayos realizados en ratones la vía

preferencial de infección es la intraperitoneal debido a su simplicidad y practicidad

de aplicación, y la reproducibilidad de sus resultados. Sin embargo, esta forma no

representa eficientemente una vía natural de infección.

Brucella posee alta infectividad por vía respiratoria, y hasta el momento se han

realizado pocos estudios acerca de los mecanismos que utiliza la bacteria durante

la infección inhalatoria. Existen tres modelos experimentales para la infección

respiratoria: a) administración del inóculo de forma intranasal, b) administración

intratraqueal, y c) inhalación de aerosoles de suspensiones bacterianas. Sin

embargo, en las infecciones intranasales o por exposición a aerosoles no puede

descartarse que la bacteria, además de contactar a la mucosa respiratoria, entre en

contacto con la mucosa oral. La vía de administración intratraqueal asegura

reproducibilidad del inóculo administrado y localización exclusiva en las vías

respiratorias bajas (Revelli DA, Boylan JA 2012).

Estudios previos con el modelo de infección por aerosoles de B. abortus

revelaron colonización y persistencia de la bacteria en los pulmones de los ratones

infectados hasta 8 semanas p.i. Además, la bacteria puede diseminarse desde

pulmón hacia órganos periféricos, siendo bazo e hígado los órganos blancos

preferenciales, transportada en parte por los macrófagos alveolares residentes en

la luz alveolar que son las células preferencialmente infectadas (Kahl-McDonagh et

al. 2007; Archambaud et al. 2010).

Sin embargo, todavía no se ha caracterizado la respuesta inmune temprana a la

infección inhalatoria con B. abortus, y no se han realizado estudios utilizando la

infección intratraqueal del patógeno. En este capítulo nos enfocaremos en

Capítulo 1- Introducción

30

caracterizar, en un modelo murino de infección intratraqueal con B. abortus, la

cinética de diseminación de la bacteria y la respuesta inmune pulmonar montada

en la primera semana de la infección.

31

Materiales y Métodos

Capítulo 1 – Materiales y Métodos

32

Animales

Se utilizaron ratones Balb/C machos de 8 semanas de edad. Los mismos fueron

albergados en instalaciones de bioseguridad tipo 3, en el Instituto de

Investigaciones Biotecnológicas – Universidad de San Martín.

En los ensayos con animales genéticamente deficientes (knockout, KO) se

utilizaron ratones de 7 a 10 semanas de edad de la cepa C57BL/6 (cepa salvaje,

wild type o wt) o ratones KO para los genes il1r o casp1/casp11 derivados de

C57BL/6. Los experimentos fueron realizados en la Universidad General de Minas

Gerais, Brasil, en el laboratorio del Dr. Sergio Costa Oliveira.

Inoculación intratraqueal

El protocolo de inoculación fue adaptado de Revelli et al. (2012). Los ratones

fueron anestesiados inicialmente con isoflurano en cámara hermética (100 µl/L) y

una vez adormecidos, se inyectaron intraperitonealmente con una mezcla de

ketamina y xilazina (100 mg/kg, 1 mg/kg respectivamente). Luego, se

posicionaron sobre una plancha acrílica inclinada 45°, se sujetaron por las

extremidades, y con una pinza roma se posicionó la lengua de forma tal que la

tráquea fuera fácilmente visible (Figura 1). La aplicación de una fuente de

iluminación externa a la altura de la garganta hizo posible visualizar las cuerdas

vocales, las que constituyeron el punto de referencia para la inoculación. Se

Figura 1. Ratón Balb/c siendo inoculado por vía intratraqueal con 20 µl de Azul de

Evans al 1%. Se utiliza una jeringa Hamilton para dispensar el inóculo.


33

depositaron 20 µl del inóculo entre las cuerdas vocales mediante una jeringa

Hamilton acoplada a una aguja de extremo romo en ángulo de 45° y se dejó

reposar los animales hasta que se recuperaron de la anestesia.

En la puesta a punto de la técnica, para evaluar su eficacia se inocularon por vía

intratraqueal 20 µl de Azul de Evans al 1% en PBS. A las 2 y 24 h post-

administración se sacrificaron los animales y se colectaron los pulmones,

estómagos e intestinos. Se buscó presencia macroscópica de colorante en los

órganos.

Cepas de B. abortus y condiciones de crecimiento

Las cepas utilizadas en este estudio fueron:

B. abortus 2308 (wt)

B. abortus 2308 GFP (bacteria que expresa proteína fluorescente verde),

B. abortus 2308 btpAbtpB- (doble mutante para los genes btpA y btpB)

Las cepas genéticamente modificadas de B. abortus (GFP y btpAbtpB-) fueron

cedidas gentilmente por el Dr. Diego Comerci (Universidad de Gral. San Martín).

Todas las cepas se crecieron en caldo tripteína de soja a partir de colonias

obtenidas en agar tripteína de soja (TSA), siendo suplementado con kanamicina

(50 µg/ml) y gentamicina (5 µg/ml) para el crecimiento de B. abortus 2308

btpAbtpB-. Se estimó el número de unidades formadoras de colonia (UFC)

midiendo la densidad óptica del cultivo a 600 nm, y se determinó el inóculo exacto

por plaqueo de diluciones seriadas en TSA.

Infección intratraqueal

Los animales fueron infectados como se describió arriba con distintas dosis de

B. abortus 2308 (1x104 y 1x106 UFC por animal) o B. abortus btpAbtpB- (1x106 UFC

por animal) en 20 µl de buffer fosfato salino (PBS) estéril. Como control, otros

animales fueron inoculados con PBS. A distintos días post infección 4 o 5 animales

de cada lote fueron sacrificados y se obtuvieron los pulmones, bazo e hígado. Los

órganos de algunos animales por lote fueron homogeneizados para los ensayos de

recuento de UFC de B. abortus y la medición de citoquinas, mientras que los


34

órganos de otros animales fueron empleados para histología o para el análisis de

las poblaciones celulares por citometría de flujo. El esquema de infección y

obtención de las muestras para los diferentes estudios se describe abajo:

A 1, 2, 3 y 7 días post-inoculación los animales infectados y del lote control se

sacrificaron por dislocación cervical y se les extrajeron asépticamente pulmones,

hígado y bazo. Los órganos se homogenizaron en 2 ml de PBS estéril empleando un

homogenizador Ultra-Turrax (IKA, Staufen, Alemania). Una parte se alicuotó para

posterior recuento de UFC por plaqueo (en TSA suplementado con bacitracina y

ácido nalidíxico para permitir el recuento diferencial de B. abortus), y el remanente

se clarificó por centrifugación a 8000 rpm durante 15 min, previa adición de

inhibidor de proteasa (c0mplete, Roche) y de gentamicina (100 µg/ml) para matar

las bacterias viables. Los sobrenadantes de los homogenatos se conservaron a -

70ºC para la posterior determinación de citoquinas y quemoquinas por ELISA.

Producción de citoquinas

En los homogenatos de los órganos se cuantificó por ELISAs comerciales la

concentración de IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-10 (OptEIATM, BD Pharmingen, San Diego,

CA), MCP-1 y KC (DuoSet ELISA, R&D Systems, Minneapolis, USA) siguiendo las

instrucciones del fabricante.

Días p.i.

Infección 1 2 3 4 5 6 7

B. abortus

106 UFC

UFC

Citoquinas

UFC

Citoquinas

Histología

UFC

Citoquinas

UFC

Citoquinas

Histología

Citometría

B. abortus

104 UFC

UFC

Citoquinas

UFC

Citoquinas

UFC

Citoquinas

UFC

Citoquinas

Tabla 1. Esquema de infección y obtención de las muestras para los diferentes estudios


35

Análisis histológico

Los pulmones obtenidos a los 2 y 7 días p.i. se perfundieron y se fijaron en

paraformaldehido (PFA) al 4% en PBS durante 24 h, luego se incluyeron en

parafina y se realizaron cortes de 5 µm que posteriormente se tiñeron con

hematoxilina-eosina (H&E). Los cortes fueron analizados por una médica patóloga,

la Dra. Silvia Vanzulli perteneciente al equipo profesional de la Academia Nacional

de Medicina.

Análisis de poblaciones celulares por citometría de flujo

Se caracterizaron por citometría de flujo las poblaciones de células inmunes

presentes en el pulmón durante la infección. Para ello los pulmones obtenidos a 7

días p.i. de los lotes de animales infectados y del lote control se disgregaron

mecánicamente a través de una malla de 100 µm y luego la suspensión celular

obtenida se filtró a través de una malla de 40 µm. De esta forma se obtuvo una

suspensión sin agregados celulares.

Las células obtenidas de cada pulmón se contabilizaron por recuento en

cámara de Neubauer y se analizaron por citometría de flujo empleando

anticuerpos contra CD11c, CD11b, CD3, CD4, CD8 (BD Pharmingen, San Diego, CA)

y F4/80 (AbD Serotec, Düsseldorf, Germany) de ratón conjugados a diferentes

fluorocromos. Para ello 1x106 células en 100 µl de BSA 0.1% en PBS se incubaron

con diluciones apropiadas de los respectivos anticuerpos durante 1 h a 4°C, a

continuación las células se lavaron 2 veces con PBS BSA 0.1% y se fijaron con PFA

al 4%. Los análisis de citometría de flujo se realizaron en un equipo PARTEC PAS

III, evaluando 50000 eventos para cada muestra. Las células dendríticas fueron

definidas como CD11c+ y CD11b+, los macrófagos alveolares como F4/80+ CD11c+,

los macrófagos reclutados como F4/80+ CD11b+, y los linfocitos T CD4+ y CD8+ por

marcación con CD3+ y CD4+ y CD8+ respectivamente.

Aislamiento de Macrófagos Alveolares

Los MA se obtuvieron a partir de muestras de lavado broncoalveolar (BAL, por

sus siglas en inglés) de ratones BALB/c. Los ratones fueron sacrificados por

sobredosis de ketamina y xilazina (300 mg/kg, 4 mg/kg respectivamente) y luego


36

se expuso quirúrgicamente la tráquea. A través de una pequeña incisión en la

tráquea se instiló en los pulmones 1 ml de PBS con 1 mM de EDTA estéril

empleando una pipeta Pasteur de punta capilar. Los lavados se repitieron hasta

recuperar un volumen de 4 ml por animal. Finalizado el BAL, el líquido recuperado

se centrifugó a 200 xg durante 10 min a 4 °C y el sobrenadante se descartó. Las

células obtenidas se resuspendieron en medio de cultivo RPMI suplementado y se

colocaron sobre placa de cultivo de 48 pocillos a razón de 2x105 células/pocillo.

Luego de 2 h de incubación en estufa a 37ºC y 5% CO2, se descartó el sobrenadante

de cultivo y las células se lavaron varias veces con PBS estéril y se adicionó RPMI

suplementado a cada pocillo. Las células que quedan adheridas son MA.

Aislamiento de células epiteliales de pulmón (pneumocitos tipo II)

Las células pulmonares totales se obtuvieron siguiendo el protocolo

previamente descrito por Murphy y col. (1999). Para ello los ratones fueron

sacrificados por sobredosis de ketamina y xilazina como se describió arriba. La

unidad cardio-pulmonar fue extraída quirúrgicamente y los pulmones fueron

posteriormente perfundidos desde la aurícula con Solución A (0.130 M NaCl, 5.2

mM KCl, 10.6 mM HEPES, 2.6 mM Na2HPO4, 10 mM glucosa pH: 7.4). Los pulmones

fueron luego separados del corazón y cortados en pequeñas porciones con tijera.

Las porciones de tejido se lavaron tres veces con Solución A y luego se digirió dos

veces con tripsina (0.5 % en Solución A adicionada con 1.9 mM de CaCl2 y 1.29 mM

de MgSO4) a 37°C durante 15 min. La suspensión resultante fue colectada sobre

SFB con DNAsa (400U/10 ml), luego se filtraron secuencialmente por tamices de

100 µm y 40 µm, se lavaron y se dejaron adherir durante 90 min en placas de

plástico en DMEM/F12 suplementado con 5% SFB para eliminar las células más

adherentes. Las células no adheridas se colectaron y se centrifugaron en un

gradiente de Percoll discontinuo (1.089 g/l y 1.04 g/l). Las células colectadas en la

interfase de los gradientes de Percoll fueron lavadas dos veces con Solución A. Las

células se resuspendieron en DMEM/F12 5 % SFB y se sembraron en placa de 48

pocillos recubiertos previamente con colágeno bovino de tipo I. Las células

epiteliales se cultivaron hasta alcanzar confluencia antes de ser usadas en ensayos

de infección (4-5 días).


37

Inmunofluorescencia para citoqueratina.

Para caracterizar el origen epitelial de las células aisladas de pulmón se

sembraron 1,5 x105 células sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con colágeno

en placa de 24 pocillos y se realizó una inmunofluorescencia para evidenciar la

expresión de citoqueratina 7 (ck-7). Para ello, las células fueron fijadas con PFA al

4% durante 30 min a temperatura ambiente, luego se lavaron secuencialmente con

glicina 0.2% en PBS y PBS Tritón X-100 0.2%. Después del bloqueo con PBS-BSA

2% durante 2 h, las células fueron incubadas con una dilución apropiada del

anticuerpo anti ck-7 (Clon: RCK105, BD Pharmigen) durante toda la noche a 4°C.

Las células se lavaron dos veces y se incubaron con el anticuerpo anti-IgG de ratón

conjugado a rodamina durante 1 h a Tº ambiente. Finalmente las células se

lavaron, y los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (1µg/ml) durante 15 minutos y

se observaron en un microscopio de fluorescencia. Las células positivas para

citoqueratina confirman su origen epitelial.

Obtención de células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC):

Para la obtención de BMDC se extrajo medula ósea de fémures y tibias de

ratones Balb/C de 8 semanas de edad. Las células obtenidas se lavaron con RPMI

frío y se plaquearon a razón de 2x106 células en placa de 6 pocillos. Se cultivaron

en RPMI suplementado con 10% SFB Gibco, 0,01M de HEPES, 50 µM de 2-

βmercaptoetanol y 10% de sobrenadante proveniente de células J558 productoras

de GM-CSF. A los 9 días se cosecharon las células y como medida de pureza se

realizó un análisis de la expresión de CD11c.

Infección de cultivos primarios

Macrófagos Alveolares: Los MA fueron infectados con B. abortus WT, o con la

cepa mutante B. abortus btpAbtpB- a una MI de 100, durante 2 horas a 37 ºC.

Finalizada la incubación las células fueron lavadas repetidas veces e incubadas con

medio completo suplementado con 100 ug/ml de gentamicina para eliminar las

bacterias extracelulares. A 24 y 48 h luego de la adición de gentamicina, los

sobrenadantes de cultivo fueron cosechados y conservados a -70° C para luego

determinar TNF-α, IL-1, KC, IL-10 o IL-12 por ELISA, mientras que las células

fueron lavadas y lisadas con TRIzol para extraer RNA.


38

Pneumocitos: Las células epiteliales respiratorias se infectaron como se

describió arriba para MA, con excepción de la MI utilizada (que en este caso fue

250 bacterias/célula). Los pneumocitos se infectaron con B. abortus WT o

btpAbtpB-. A 24 h p.i., los sobrenadantes de cultivo fueron cosechados y

conservados a -70° C para luego determinar KC por ELISA.

Células dendríticas derivadas de médula ósea: Las células dendríticas se

infectaron como se describió arriba para los macrófagos alveolares modificando la

MI, que fue de 30 bacterias/célula. Los sobrenadantes se colectaron 24 h p.i. para

determinar IL-1β, TNF-α e IL-12 por ELISA.

Inmunofluorescencia para B. abortus.

Para detectar las bacterias intracelulares se sembraron 1,5 x105 células sobre

cubreobjetos de vidrio recubiertos con colágeno en placa de 24 pocillos, se

infectaron con B. abortus wt o btpAbtpB- a una MI de y se realizó una

inmunofluorescencia para evidenciar la expresión de citoqueratina 7

bacterias/células. Luego de 2 h, las células se lavaron y se incubaron con medio de

cultivo suplementado con gentamicina (100µg/ml) para eliminar las bacterias

extracelulares (tiempo 0). A distintos tiempos p.i., las células fueron fijadas con

PFA al 4% durante 30 min a temperatura ambiente, luego se lavaron con PBS

Tritón X-100 0.2%. Después del bloqueo con PBS-BSA 2% durante 2 h, las células

fueron incubadas con un sobrenadante de cultivo del hibridoma BC68 (IgG1(κ) anti-

LPS de Brucella, (Goldbaum et al. 1992)) durante 2 h a temperatura ambiente. Las

células se lavaron dos veces y se incubaron con el anticuerpo anti-IgG de ratón

conjugado a rodamina durante 1 h a temperatura ambiente. Finalmente las células

se lavaron, y los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (1µg/ml) durante 15

minutos y se observaron en un microscopio de fluorescencia. Las células positivas

para citoqueratina confirman su origen epitelial.

Retrotranscripción de ARN mensajero y Reacción en Cadena de la

Polimerasa (RT-PCR)

A partir de lisados en TRIzol se extrajo el ARN según recomendaciones del

fabricante y posteriormente se retrotranscribió utilizando la transcriptasa reversa

MMLV y oligodT como primers. Para evaluar los niveles de transcripción del ARN


39

mensajero de ciertas citoquinas se utilizó PCR y los siguientes primers en

concentraciones de 0.1 mM:

il1b

Primer sentido: 5’ TGCCAGGTTTTGACAGTGATG 3’

Primer antisentido: 5’ AAGGTCCACGGGAAAGACAC 3’

tgb1

Primer sentido: 5’ ACTGGAGTTGTACGGCAGTG 3’

Primer antisentido: 5’ GGATCCACTTCCAACCCAGG 3’

tnf

Primer sentido: 5’ GGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTGC 3’

Primer antisentido: 5’ ACATTCGAGGCTCCAGTGAATTCGG 3’

Los productos fueron analizados en geles de agarosa 2% teñidos con SYBRSafe

(Thermo Fisher). El análisis densitométrico se realizó utilizando el software

ImageJ, NIH.

Modulación de la respuesta inmune pulmonar a agonistas TLRs:

Ensayos in vivo

Se evaluó el rol de las proteínas Btp de Brucella en la respuesta inmune

pulmonar a agonistas de receptores TLR. Para ello ratones Balb/c machos fueron

separados en grupos de 5 animales e inoculados intratraquealmente con 106 UFC

de Brucella abortus (wild type; WT), B. abortus btpAbtpB- o PBS (control no

infectado). A 24 h post inoculación se administró intratraquealmente a todos los

grupos 5 µg de LPS de Escherichia coli (Cepa: 055:B5, Sigma). Los animales se

sacrificaron 24 horas más tarde y los pulmones fueron extraídos quirúrgicamente,

perfundidos y fijados para la posterior inclusión en parafina y tinción con

hematoxilina y eosina. Otros pulmones se homogenizaron y el sobrenadante de los


40

homogenatos se conservó a -70 °C para la posterior cuantificación de citoquinas

por ELISA.

Ensayos in vitro

Los macrófagos alveolares se infectaron como se describió arriba. A las 24 h

post-infección las células infectadas y las células no infectadas (control) se

estimularon con 1 µg de LPS de E. coli. A 24 h post-estimulación se cosecharon los

sobrenadantes de cultivo para medir IL-1β, IL-12 y KC por ELISA.

Supervivencia de B. abortus en pulmones estimulados con agonista

de TLR.

Para evaluar la supervivencia de B. abortus en pulmones que han sido

previamente estimulados con un agonista TLR4 se inoculó intratraquealmente a

ratones Balb/c machos con LPS de E. coli (5 µg/ratón) o PBS (control). Luego de 24

h todos los animales fueron infectados con B. abortus WT o btpAbtpB- , generando

4 grupos experimentales de 5 animales cada uno:

PBS/WT (Administración de PBS y posterior infección con B. abortus WT) PBS/btpAbtpB- (Administración de PBS y posterior infección con B. abortus

btpAbtpB-) LPS/WT (Administración de LPS y posterior infección con B. abortus WT) LPS/btpAbtpB- (Administración de LPS y posterior infección con B. abortus

btpAbtpB-)

A las 24 h post-infección los animales fueron sacrificados y los pulmones

fueron extraídos quirúrgicamente y homogenizados. A partir de este homogenato

se realizó recuento de UFC (por plaqueo en TSA) y medición de citoquinas.

Análisis Estadístico

Los datos se analizaron usando análisis de varianzas (ANOVA). Las

comparaciones entre grupos de datos fueron analizadas con el Test de Tukey’s y

aquellas contra el grupo control fueron analizadas con el test de Dunnett’s. Todos

los análisis estadísticos fueron realizados con el software GraphPad (San Diego,

CA).

41

Resultados

Capítulo 1 - Resultados

42

Figura 2. La tinta se encuentra en los pulmones a 2 h post-administración. El

inóculo de 20 µl de Azul de Evans se distribuye entre ambos pulmones-derecho e

izquierdo-(panel A) y no se encuentran rastros de tinta en estomago o intestinos (panel

C). Panel B. A 24 h pos administración el inóculo se encuentra distribuido

homogéneamente en los pulmones.

Puesta a punto de la técnica de inoculación intratraqueal

Para evaluar la distribución del inóculo administrado con la técnica de

inoculación intratraqueal adoptada, se administró con dicha técnica Azul de Evans

y se buscó macroscópicamente la presencia del colorante en distintos órganos.

Como se muestra en la Figura 2 a) luego de 2 horas de inoculación el colorante

se distribuye con preferencia en el pulmón izquierdo, situación que revierte 24 h

después, donde se encuentra distribuido homogéneamente en ambos pulmones.

No se encontraron rastros de colorante en los estómagos e intestinos, lo que

sugiere que no hay fuga de inóculo hacia el tracto digestivo.

B. abortus infecta y se disemina desde pulmón.

Para evaluar la cinética de supervivencia de Brucella en el modelo murino de

infección intratraqueal, se infectaron ratones Balb/c machos de 8 semanas de edad

con 106 o 104 UFC/animal de B. abortus. A 2 h, 1, 2, 3 y 7 días p.i. los ratones fueron


43

sacrificados para la extracción del pulmón, el bazo y el hígado, seguido de posterior

homogenización y recuento de UFC por plaqueo en TSA. En la Figura 3 se muestra

la cinética de replicación y diseminación.

Para ambas condiciones de infección se observa que el inóculo se encuentra en

los pulmones a 2 hs pi, y que el pulmón permanece infectado hasta el último día

evaluado.

Inóculo de 106 UFC/animal

Cuando los ratones son infectados con 106 UFC/ratón, se observan UFC en

pulmón desde las 2 horas p.i. Estas UFC representa un 76% de inoculo instilado. A

los 2 días p.i. el recuento de UFC disminuye un 78 % con respecto a las 2 h p.i. Sin

embargo, a los 3 días p.i. el número de UFC recupera los valores iníciales y se

mantiene hasta el final del estudio.

En hígado y bazo la bacteria se detecta recién a 1 día p.i., siendo el recuento en

bazo aproximadamente 5 veces mayor al del hígado.

Paralelamente a los recuentos en los homogenatos de pulmón, las UFC en los

órganos periféricos disminuyen hasta día 3 p.i. infección, mientras que al día 7 p.i.

se observa un aumento significativo de aproximadamente 1000 veces en el

recuento de UFC.


44

Figura 3. Curva de cinética de diseminación de B. abortus 2308. Ratones machos fueron

infectados con 106 o 104 UFC/animal. A distintos tiempos p.i. los pulmones, bazos e hígados

fueron extraídos y homogenizados y las bacterias viables presentes diluidas serialmente y

cultivadas en placas de TSA con bacitracina y ácido nalidíxico.

0 2 4 6 8100

101

102

103

104

105

106

107

Pulmón

Bazo

Hígado

Días pi

UF

C/ó

rgan

o

0 2 4 6 8100

101

102

103

104

105

Pulmón

Bazo

Hígado

Días pi

UF

C/ó

rgan

o

Inóculo de 104 UFC/animal

El recuento de UFC en pulmón de los animales infectados con 104 UFC/ratón

se mantiene sin variaciones significativas desde 2 hs p.i. hasta 7 días p.i. (Figura 3,

panel izquierdo). A diferencia de la infección con mayor inóculo, los recuentos en

órganos periféricos se detectan recién a 7 días p.i., conservando la relación entre

UFC para hígado y bazo observada con 106 UFC/animal, siendo el bazo el órgano

donde se registra el mayor número de UFC.

La respuesta pulmonar de citoquinas y quemoquinas es leve y

retardada en el tiempo.

Para caracterizar la respuesta inmune a la infección durante la primera

semana, se midieron citoquinas y quemoquinas en los homogenatos de pulmón y

bazo de animales infectados. Se analizaron citoquinas pro-inflamatorias (IL-1β,

TNF-α, IL-12 e IFN-γ), quemoquinas (KC y MCP-1) y citoquinas antiinflamatorias

(IL-10)

Como se muestra en la Figura 4, la infección con inóculo de 106 UFC/animal de

B. abortus no produce cambios significativos en los niveles de las citoquinas

analizadas en homogenatos de pulmón durante los primeros dos días p.i. Hacia el

tercer día p.i. se observa un aumento significativo en IL-1β y en MCP-1 que alcanza


45

valores máximos a 7 días p.i. Mientras que los niveles de IL-12, KC e IFN-γ

aumentan significativamente a los 7 días p.i.

No se observan aumentos significativos en la producción de TNF-α en pulmón

en respuesta a la infección con 106 UFC/animal durante los tres primeros días de

infección, mientras que a 7 días los niveles de TNF-α aumentan significativamente

en los homogenatos de pulmones de los animales infectados

Al infectar con inóculo bajo no se registran cambios significativos en los niveles

medidos de citoquinas y quemoquinas de los homogenatos de pulmón totales para

ninguna de las citoquinas analizadas, salvo para IL-12, que aumenta

significativamente en los animales no infectados a 7 días p.i. (Figura 5).

B. abortus produce escasos cambios histológicos en pulmón.

Para evaluar los cambios inflamatorios a nivel histológico producidos por la

bacteria en pulmón, se analizaron pulmones fijados en PFA 4% y coloreados con

hematoxilina y eosina 2 y 7 días p.i.

Los pulmones de los ratones infectados muestran a 2 días p.i. pocos sitios de

extravasación hemática alveolar. No existen focos inflamatorios perivasculares o

peribronquiales, sin embargo se observa infiltrado intersticial de aspecto

mononuclear. A 7 días p.i. el infiltrado intersticial es de menor magnitud a pesar

que se observa un aumento en los focos de extravasación hemática (Figura 6).

Citometría de flujo

En base a los resultados obtenidos del análisis histológico, donde se evidenció

un aumento de la celularidad de aspecto monocítico, se quiso caracterizar las

distintas poblaciones en los pulmones a 7 días pi. Para ello, se infectaron animales

por vía intratraqueal con 106 UFC/animal de B. abortus y se realizó un análisis

citométrico de las suspensiones celulares obtenidas mediante disgregación

mecánica del órgano. Se realizó un recuento de células totales para cada

suspensión de cada grupo y el análisis citométrico se ajustó a la cantidad total de

células recuperadas por pulmón.


46

Como se observa en la Figura 7 panel izquierdo, se detectó un aumento en el

número de células recuperadas de los pulmones de ratones infectados con B.

abortus en comparación con los de ratones no infectados, aunque no logramos

atribuir la causa a ninguna población celular analizada.

En concordancia con el infiltrado mononuclear observado en los cortes de

hematoxilina-eosina, se observa una tendencia al aumento en los linfocitos T CD4+

y CD8+ en los pulmones de los animales infectados (figura 7, panel derecho), que

no llega a la significancia. Tampoco se observan cambios significativos para las

poblaciones de células dendríticas (CD11b+, CD11c+) o macrófagos alveolares

(F4/80+ CD11c+).


47

Figura 4.Panel de citoquinas correspondiente a la infección con 106 UFC/animal. IL-1β, TNF-α, KC, MCP-1, IL-10, IL-12 e IFN-γ se midieron por ELISA en homogenatos de pulmón entero. *p<0.05, ** p<0.01, respecto del grupo no infectado (NI) para cada tiempo

1 2 3 70

200

400

600

800

1000

I

NI

**

**

Días p.i.

IL-1

(p

g/m

l)

1 2 3 70

1000

2000

3000

4000NI

I

****

*

Días p.i.

TN

F (

pg

/ml)

1 2 3 70

100

200

300

400

500NI

I

*

Días p.i.

IL-1

2 (

pg

/ml)

1 2 3 70

100

200

300

400NI

I*

Días p.i.

IFN (

pg

/ml)

1 2 3 70

100

200

300

400NI

I**

Días p.i.

KC

(p

g/m

l)

1 2 3 70

200

400

600

800NI

I

*

**

Días p.i.

MC

P-1

(p

g/m

l)

1 2 3 70

100

200

300NI

I

* *

Días p.i.

IL-1

0 (

pg

/ml)


48

Figura 5 Panel de citoquinas correspondiente a la infección con 104 UFC/animal. IL-1β, TNF-α, KC, MCP-1, IL-10, IL-12 e IFNγ se midieron por ELISA en homogenatos de pulmón entero. *p<0.05, respecto del grupo no infectado (NI)

1 2 3 70

200

400

600

800NI

I

Días p.i.

IL-1

(p

g/m

l)

1 2 3 70

100

200

300

400

500NI

I

Días p.i.

KC

(p

g/m

l)

1 2 3 70

500

1000

1500

*

Días p.i.

IL-1

2 (

pg

/ml)

1 2 3 70

50

100

150NI

I

Días p.i.

TN

F (

pg

/ml)

1 2 3 70

500

1000

1500NI

I

Días p.i.

IL-1

0 (

pg

/ml)

1 2 3 70

20

40

60

NI

I

Días p.i.

MC

P-1

(p

g/m

l)

1 2 3 70

200

400

600

800

Días p.i.

IFN (

pg

/ml)


49

Figura 6.Histología de ratones no infectados e infectados con 106 UFC de B. abortus.

A 2 y 7 días post-infección los ratones fueron sacrificados y los pulmones fijados en PFA

4% para posterior procesamiento y tinción con hematoxilina y eosina.

Figura 7.Citometría de ratones no infectados e infectados con 106 UFC de B. abortus.

A 7 días post-infección los ratones fueron sacrificados y los pulmones disgregados

mecánicamente. Las células totales fueron contadas (panel izquierdo) y luego marcada

con las diluciones óptimas de los distintos anticuerpos. Se analizaron: Células

dendríticas (CD11b+ CD11c+), Macrófagos alveolares (F4/80+ CD11c+), Macrófagos

reclutados (F4/80+ CD11b+), Linfocitos T CD4+ (CD3+ CD4+) Linfocitos T CD8+ (CD3+

CD8+)(panel derecho)

Control Infectados0

2

4

6

8**

N°

cé

lula

s/p

ulm

ón

(x10

6)

0

1

2

3

4

No infectados

Infectados

Dendríticas Macrófagosalveolares

Linfocitos T

CD4+

Linfocitos T

CD8+

N°

celu

las/p

ulm

ón

(x10

5)

2

7

No infectado Infectado

Día

s p

ost

infe

cció

n

infe

cció

n


50

Cinética de supervivencia de B. abortus btpAbtpB- luego de la

infección intratraqueal

Como lo mencionáramos, Brucella expresa las proteínas BtpA y BtpB que

contienen dominios TIR y se secretan al citosol de las células infectadas. Se ha

demostrado que estas proteínas afectan la señalización de TLR2, TLR4 y TLR5,

provocando reducción en la secreción de la IL-12 y TNF-α por células dendríticas

(Salcedo et al 2008 y 2013). Sin embargo, su papel en la modulación de la

respuesta inmune pulmonar a Brucella es aún desconocido, como así también su

rol en la diseminación sistémica de la bacteria desde el pulmón. Los resultados

descriptos arriba demuestran que los pulmones de los ratones infectados con B.

abortus producen una respuesta proinflamatoria retardada y limitada, con muy

pocos signos de inflamación en el análisis histológico. En base a estos antecedentes

nos propusimos evaluar la relevancia de las proteínas Btp en el modelo de

infección intratraqueal murina. Para ello se infectaron ratones con 106 UFC de una

cepa mutante de B. abortus que carece de estas proteínas, denominada B. abortus

btpAbtpB- (en adelante btpAbtpB-), y se colectaron pulmón, bazo e hígado que

posteriormente fueron homogenizados y plaqueados en TSA para recuento de UFC.

El recuento bacteriano en el pulmón a 2 h p.i. correspondió al 33 % del inóculo

inicial. Como se muestra en la Figura 8, los valores de UFC se mantuvieron casi sin

alteraciones desde las 2 h p.i hasta finalizado el estudio. La carga bacteriana viable

a 2 h p.i. fue menor respecto del ensayo realizado con la cepa WT, donde al mismo

tiempo p.i. se obtenía un 77 % del inóculo (1,65 0,52) x105 UFC/pulmón. La

mutante btpAbtpB- persistió en pulmón hasta el final del ensayo, con una tendencia

a la disminución de las UFC, aunque esta diferencia no fue estadísticamente

significativa. No se registró la disminución hacia el día 2 p.i. que se ve en la

infección con la cepa WT. Al día 2 p.i. se obtuvieron recuentos similares para

ambas infecciones, pero a diferencia de la infección con bacteria WT, la doble

mutante no es capaz de replicar y aumentar su recuento hacia el día 3 p.i. Las UFC

en bazo e hígado fueron detectables (límite de detección: 32 UFC/órgano) recién a

7 días p.i., a diferencia de la infección por la cepa WT, donde se detecta bacteria

viable en bazo e hígado 1 día p.i. y replicación a 7 días p.i.


51

Figura 8. Curva de cinética de diseminación de B. abortus wt y btpAbtpB-. Ratones

machos fueron infectados con 106 UFC/animal. A distintos tiempos p.i. los pulmones,

bazos e hígados fueron extraídos y homogenizados y las bacterias viables presentes

diluidas serialmente y cultivadas en placas de TSA y para B. abortus wt y btpAbtpB-

suplementadas con gentamicina (5 µg/ml) y kanamicina (50 µg/ml).

0 2 4 6 8100

101

102

103

104

105

106

107

Pulmón btpAbtpB-

Bazo btpAbtpB-

Hígado btpAbtpB-

Pulmón wt

Bazo wt

Hígado wt

Días p.i.

UF

C/ó

rgan

o

La infección con B. abortus btpAbtpB- produce signos moderados de

inflamación en el pulmón

Se evaluó si las proteínas Btp podrían estar involucradas en la regulación de la

respuesta inmune observada luego de la infección intratraqueal con la cepa salvaje.

Para ello se inocularon ratones Balb/c con 106 UFC de btpAbtpB-. Los pulmones se

colectaron a 2 y 7 días p.i., se incluyeron en parafina y se tiñeron con H&E.

En los cortes correspondientes a 2 días p.i. se observaron focos tipo

bronconeumónico, compuestos de un infiltrado celular con predominio

mononuclear, mientras que en la luz alveolar se observaron hematíes y fibrina

(Figura 9). A los 7 días p.i. se observaron los mismos signos, pero con presencia de

hemorragia perivascular. Comparando con la histología de la infección con la cepa

WT (Figura 6) se ve un mayor infiltrado celular de características diferentes. Estos

resultados indican que en ausencia de las proteínas Btp B. abortus provoca un

mayor infiltrado de células en el parénquima pulmonar de los ratones infectados.


52

Figura 9 Histología de ratones infectados con B. abortus btpAbtpB- (106 UFC), 2

y 7 días p.i.

Respuesta inmune sistémica a la infección intratraqueal con B.

abortus btpAbtpB-

La Figura 8 muestra diferencias en las cargas bacterianas en bazo e hígado

luego de la infección intratraqueal con la cepa WT y la doble mutante btpAbtpB-.

Esta diferencias podrían deberse a una repuesta inmune diferencial en los órganos

periféricos para ambas cepas. Para probar esta hipótesis evaluamos la respuesta

inmune en bazo e hígado de los ratones infectados con dichas cepas. Para ello se

cuantificaron a los mismos tiempos p.i. las citoquinas IL-1β, TNF-α, IL-12 y la

quemoquina KC en homogenatos de bazos e hígados de los animales infectados con

la cepa WT y con la doble mutante.

Los resultados muestran un aumento en la secreción de IL-1β, TNF-α e IL-12 a

las 24 h p.i. en bazos de animales infectados con la doble mutante respecto del


53

grupo control inoculado con PBS (Figura 10). El aumento de IL-12 es moderado,

pero significativamente distinto. Este aumento respecto de los controles no se

registra en los bazos de los animales infectados con la cepa WT. La infección con

ambas cepas produce un aumento de KC a 24 hs.

No se registran diferencias significativas para IL-1β, TNF-α o KC a los días 2, 3 o

7 p.i. para ninguna de las dos cepas. Existe un aumento significativo de IL-12 a día

7 p.i. en bazos de animales infectados con la cepa WT que no se detecta en los

bazos de los ratones infectados con la btpAbtpB-. No se detectaron aumentos en la

secreción de ninguna de las citoquinas estudiadas en los homogenatos de hígados

de los animales infectados para ninguna de las cepas respecto de los controles sin

infectar (datos no mostrados)

B. abortus btpAbtpB- modula la respuesta en citoquinas de los MA

Los resultados histológicos obtenidos de la infección in vivo con btpAbtpB-

sugieren que las proteínas Btp están involucradas en la modulación de la respuesta

inmune innata en el pulmón. Teniendo en cuenta que los macrófagos alveolares

(MA) constituyen la primera línea de defensa frente a la entrada de un potencial

patógeno, evaluamos si las proteínas Btp son capaces de modificar la respuesta

inmune de estas células. Para ello, se estudió la secreción de quemoquinas y

citoquinas por MA infectados in vitro con cepa WT y con la cepa btpAbtpB-, así

como la capacidad de estas bacterias para replicar intracelularmente en dichas

células.

Se evaluó la expresión de citoquinas proinflamatorias y antiinflamatorias por

MA infectados con las cepas WT y btpAbtpB-. Para ello se midieron los niveles de

transcriptos de mRNA para IL-1β y TGF-β en MA a 24 h p.i. mediante PCR y

posterior densitometría de geles de agarosa.

Como se muestra en la Figura 11, la transcripción del ARNm de IL-1β fue mayor

en MA infectados con btpAbtpB- que en aquellos infectados con la cepa WT

(p<0.05). A su vez, ambas infecciones resultaron en un mayor nivel de

transcripción respecto de los MA no infectados.


54

Figura 10. Panel de citoquinas correspondiente a la infección con 106 UFC/animal de B. abortus WT (izquierda) o B. abortus btpAbtpB-. IL-1β, TNF-α, KC, e IL-12 se midieron por ELISA en homogenatos de bazos enteros. *p<0.05, ** p<0.01,*** p<0.001 respecto del grupo no infectado (NI) Para cada tiempo

1 2 3 70

100

200

300NI

I

Días p.i.

IL-1

(p

g/m

l)

1 2 3 70

200

400

600

800NI

I

*

Días p.i.

IL-1

(p

g/m

l)

1 2 3 70

50

100

150NI

I

Días p.i.

TN

F-

(p

g/m

l)

1 2 3 70

100

200

300NI

I

*

Días p.i.

TN

F-

(p

g/m

l)

1 2 3 70

20

40

60NI

I

**

Días p.i.

KC

(p

g/m

l)

1 2 3 70

50

100

150NI

I*

Días p.i.

KC

(p

g/m

l)

1 2 3 70

200

400

600

800

NI

I

**

*

Días p.i.

IL-1

2 (

pg

/ml)

1 2 3 70

100

200

300

400

500NI

I

****

Días p.i.

IL-1

2 (

pg

/ml)


55

Figura 11. Expresión de il1b y tgfb en macrófagos alveolares infectados con B. abortus WT y

mutante btpAbtpB-. Las células fueron infectadas con 100 bacterias/célula y luego de 24 h

lisadas, y su ARNm retrotranscripto y medido por PCR semicuantitativa. En el panel superior se

muestra una imagen representativa de las bandas obtenidas en gel de agarosa. En el panel

inferior el resultado de la semicuantificación por densitometría realizada con el programa

ImageJ. *p<0.05, respecto de no infectado (NI)

La transcripción de TGF-β se encuentra aumentada en ambas infecciones, sin

evidenciar diferencias entre la inducción por la infección con la cepa WT o con

btpAbtpB-. Al evaluar la producción de ARN mensajero para TNF-α no se

detectaron diferencias significativas en ninguna de las tres condiciones ensayadas

(no mostrado).

NI wt btpAbtpB-0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

**

p<0.05

IL1B

/GA

DP

H

NI wt btpAbtpB-

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

* *

TG

FB

/GA

DP

H

ns

Se midieron también mediante ELISA comerciales los niveles de secreción de

IL-1β, IFN-γ y KC a 24 y 48 hs p.i. en los sobrenadantes de macrófagos alveolares

infectados. La infecciones con las cepas WT y btpAbtpB- aumentaron

significativamente la secreción de todas las citoquinas ensayadas cuando las

comparamos con la secreción basal de las células sin infectar tanto a 24 h como a

48 h p.i. (Figura 12). Sin embargo, la infección con btpAbtpB- produjo una

secreción significativamente más alta que la infección con la cepa WT a las 24 h p.i.

para todas las citoquinas ensayadas. Además, a las 48 h p.i. es mayor la secreción


56

Figura 12. Secreción de IL1β, IFN-γ y KC en macrófagos alveolares. Las células fueron infectadas

con 100 bacterias/célula y luego de 24 h o 48 h el sobrenadante fue colectado y las citoquinas

medidas por ELISA. *p<0.05, ** p<0.01,*** p<0.001 respecto de no infectado (NI)

NI btpAbtpB- wt NI btpAbtpB- wt0

200

400

600

800

24h 48h

***

p<0.01

**

mIF

N (

pg

/ml)


500

1000

1500

24h 48h

***

***

* *

p<0.05

IL-1

(p

g/m

l)

p<0.05


1000

2000

3000

4000

5000

6000

30000

40000

P<0.01

***

***

ns

24 h 48 h

*** ***

KC

(p

g/m

l)


57

Figura 13. Curva de replicación de B. abortus wt y btpAbtpB- en macrófagos alveolares

primarios murinos. Las células fueron infectadas con 100 bacterias/célula y luego de 24 h las

células fueron lisadas selectivamente y las bacterias intracelulares viables cuantificadas

mediante el crecimiento en TSA.

de IL-1β por los MA infectados con btpAbtpB- que por los infectados con la cepa

WT. La secreción de IFN-γ no resulta significativamente diferente para ambas

infecciones, pero muestra una tendencia cercana a la significancia.

Estas diferencias observadas entre las cepas respecto de la inducción de

citoquinas no se deben a diferencias en la capacidad de replicación ni a la carga de

bacterias intracelulares dado que como se ve en la Figura 13, ambas bacterias son

capaces de ingresar a las células en la misma magnitud, y replican eficientemente,

sin registrarse cambios significativos en la tasa de incremento.

0 1 2104

105

106

107

108

wt

btpAbtpB-

Días p.i.

UF

C/m

l


58

Supervivencia de B. abortus luego de la infección intratraqueal en

ratones KO para caspasa-1 e IL-1R

Los resultados presentados anteriormente demuestran que la expresión de IL-

1β es modulada por las proteínas Btp durante la infección por B. abortus. Cabe

preguntarse entonces cuál es la importancia de esa modulación para el éxito de la

infección pulmonar por esta bacteria. Diversos estudios en modelos murinos de

infección respiratoria por otros patógenos indican que la respuesta local de IL-1β

es fundamental para el control efectivo de dichas infecciones en el pulmón. Por ello

nos propusimos determinar si IL-1β tienen un rol protectivo en el pulmón durante

la infección inhalatoria in vivo por B. abortus. Para ello se infectaron ratones

C57BL/6 (cepa WT) o genéticamente deficientes (KO) para caspasa-1 (enzima

indispensable para el clivaje del precursor pro-IL-1β) o para el receptor de IL-1

(IL-R) como se describió en M&M. A distintos tiempos p.i., los ratones fueron

sacrificados, sus pulmones colectados y homogenizados y este homogenato fue

plaqueado para obtener recuento de UFC en pulmones enteros.

Como muestra la Figura 14, el recuento de UFC en los pulmones de los ratones

KO para IL-1R se incrementa al día 2 y 7 p.i., mientras que el recuento de UFC en

pulmones de ratones WT disminuye a 2 días p.i. y recupera aproximadamente el

mismo número de UFC hacia día 7 p.i. Los recuentos pulmonares para los ratones

KO para caspasa-1/11 disminuyen también hacía día 2 p.i., pero aumentan

significativamente hacia día 7 respecto de los ratones WT. Estos resultados

sugieren que IL-1 tiene un rol protectivo en el control de la infección intratraqueal

por B. abortus


59

Figura 14. Curva de cinética de diseminación de B. abortus wt en ratones KO para

caspasa1/11 e IL-1R. Ratones machos fueron infectados con 106 UFC/animal. A distintos

tiempos p.i. los pulmones, bazos e hígados fueron extraídos y homogenizados y las

bacterias viables presentes diluidas serialmente y cultivadas en placas de TSA. * marca

p<0.05 respecto del grupo wt para cada tiempo ensayado.

0 2 4 6 8103

104

105

106

107

108

KO caspasa-1/11

KO IL-1R

wt

*

*

Días p.i.

UF

C/p

ulm

ón

KO cas1/11 KO IL-1R wt100

101

102

103

104

105 *

UF

C/h

ígad

o

KO cas1/11 KO IL-1R wt100

101

102

103

104

105

ns

UF

C/b

azo

7 días p.i.

B. abortus WT y btpAbtpB- infectan y replican en pneumocitos tipo

II murinos

Trabajos previos del grupo han demostrado la capacidad de B. abortus de

invadir y replicar en líneas de células epiteliales respiratorias humanas, así como

también la respuesta de estos a la infección (Ferrero et al. 2009; Ferrero et al.

2010). Sin embargo hasta el momento no se ha descripto la interacción de Brucella

abortus con las células alveolares del epitelio respiratorio murino. Considerando la

importancia de dichas células epiteliales en la fisiología pulmonar, y en vista de su

capacidad de participar en la respuesta inmune innata decidimos evaluar el efecto

de la infección sobre un cultivo primario de pneumocitos tipo II murinos.

Se evaluó mediante microscopía de fluorescencia la capacidad de Brucella de

infectar pneumocitos murinos. Para ello se infectó un cultivo primario de

pneumocitos con B. abortus expresando GFP y a las 24 h p.i. se fijó y se realizó una

marcación con un anticuerpo contra citoqueratina-7.


60

Figura 15 Infección de pneumocitos tipo II primarios murinos por Brucella abortus

GFP. Panel izquierdo. Pneumoctos tipo II marcados con citoqueratina-7 (Ck-7 rojo) y

DAPI (azul). Panel derecho. Pneumocitos tipo II marcados con citoqueratina-7 (rojo) y

DAPI (azul) e infectados con B. abortus GFP a una MI de 250 (verde).

Figura 16 Infección de pneumocitos tipo II primarios murinos por Brucella abortus

wt o btpAbtpB-. Las células se infectaron con una MI de 250 bacterias/células de Brucella

abortus wt o btpAbtpB-. Luego de 2 h p.i. las células fueron lisadas selectivamente y las

bacterias intracelulares viables cuantificadas mediante el crecimiento en TSA.

Como muestra la Figura 15, B. abortus puede invadir células positivas para

marcación de citoqueratina 7, la bacteria se observa en el citoplasma y en posición

perinuclear como se describió previamente para otras infecciones por Brucella en

líneas celulares epiteliales (Ferrero et al. 2009).

De manera similar se comparó la capacidad de infección y replicación intracelular

de la cepa B. abortus WT y la mutante btpAbtpB- en neumocitos primarios. No se

observan diferencias en el número de bacterias intracelulares para las cepas a 2 h

p.i. (Figura16). En la Figura 17, se observa un aumento leve en la carga intracelular

de ambas cepas entre las 2 h y las 48 h p.i.

wt btpAbtpB-0

20000

40000

60000ns

UF

C/m

l


61

Figura 17. Infección de pneumocitos tipo II primarios murinos por Brucella abortus wt o btpAbtpB-. Las células se infectaron con

una MI de 250 bacterias/células de Brucella abortus wt o btpAbtpB-. Luego de distintos tiempos p.i. las células fueron permeabilizadas

y las bacterias intracelulares detectadas con un anticuerpo anti-LPS de Brucella y posterior marca con un anticuerpo anti-raton

conjugado con rodamina.


62

Figura 18. Infección de pneumocitos tipo II primarios murinos por Brucella abortus

wt y btpAbtpB-. Las células se infectaron con una MI de 250 bacterias/células de Brucella

abortus wt o btpAbtpB-, luego de 24 h p.i. los sobrenadantes de cultivo fueron colectados

y KC medido mediante ELISA. ** p<0.01 respecto de no infectado (NI)

Btp modula la secreción de KC en pneumocitos tipo II murinos

Con el objetivo de evaluar el rol de las proteínas Btp en la respuesta inmune de los

pneumocitos tipo II murinos ante la infección, se infectó un cultivo primario de estas

células con B. abortus 2308 y la mutante btpAbtpB- y se midió la concentración de la

quemoquina KC en el sobrenadante de cultivo a 24 h p.i.

Se registró un aumento significativo de KC respecto del control para las

infecciones con la doble mutante. Los niveles alcanzados en sobrenadante de células

infectadas con la mutante que no posee las proteínas Btp fueron significativamente

mayores (p<0.05) que en las células infectadas con la cepa WT (Figura 18).

NI wt btpAbtpB-

0

1000

2000

3000

**

**

p<0.05

KC

(p

g/m

l)

Las proteínas Btp modulan la secreción de citoquinas en BMDC

Las células dendríticas son una fuente importante de citoquinas en un escenario de

infección. Teniendo en cuenta que las proteínas Btp modulan TNF-α e IL-12 en este

tipo celular, quisimos evaluar el efecto de estas proteínas sobre la producción de IL-

1β. Para ello se diferenciaron células dendríticas a partir de células precursoras de

médula ósea murina y se infectaron con B. abortus 2308 WT y btpAbtpB-. Como

control positivo se estimularon células con LPS de E. coli (1 µg/ml). A las 24 h p.i. se


63

Figura 19 Infección de BMDC murinas por Brucella abortus wt btpAbtpB-. Las células se

infectaron con una MI de 30 bacterias/células de Brucella abortus wt o btpAbtpB-. Luego de

24 h p.i. los sobrenadantes de cultivo fueron colectados y las citoquinas medidas mediante

ELISA. *p<0.05, ** p<0.01,*** p<0.001 respecto de no infectado (NI)

colectó el sobrenadante y se midieron las citoquinas IL1β, TNF-α e IL-12. Los

resultados se muestran en la Figura 19.

NI btpAbtpB- wt LPS0

500

1000

1500

20006000

8000

10000

12000

* *

***

p<0.001

IL-1

(p

g/m

l)


1000

2000

3000

4000

8000

10000

12000

***

*

***

p<0.001

TN

F-

(p

g/m

l)


5000

10000

15000

20000

p<0.01

**

*

***

IL-1

2 (

pg

/ml)


64

En todas las citoquinas analizadas se detectaron niveles menores en la infección

con B. abortus WT con respecto a la infección con la mutante btpAbtpB-. La citoquina

con mayor modulación fue IL-1β, con un aumento de aproximadamente 15 veces en la

infección con btpAbtpB- respecto de la infección con WT. TNF-α aumenta

aproximadamente 10 veces respecto del control. IL-12 duplica el valor en

sobrenadantes de células dendríticas infectadas con btpAbtpB- respecto de las

infectadas con wt. Estos resultados, junto con los obtenidos de TNF-α, se encuentran

en concordancia con lo reportado en bibliografía (Salcedo et al. 2013).

Las proteínas Btp modulan la respuesta inmune pulmonar frente a

agonistas TLR

Los ensayos realizados hasta este momento indicaban que las proteínas Btp de B.

abortus pueden modular la respuesta inflamatoria a esta bacteria in vivo y por

distintos tipos celulares in vitro. Para evaluar la potencia inhibitoria de las proteínas

Btp se diseñó un ensayo en el que los ratones fueron inoculados intratraquealmente

con PBS, B. abortus WT o la mutante btpAbtpB- 24 h antes de la administración

intratraqueal de LPS de E. coli. Al día siguiente se sacrificaron los animales y se

realizaron cortes histológicos de los pulmones colectados.

Como muestra en la Figura 20, la administración del agonista TLR4 a ratones que

habían recibido PBS (PBS/LPS) genera inflamación y produce un infiltrado con

predominio de polimorfonucleares, aunque también se encuentran presentes células

mononucleares. Cuando se pre-infecta con B. abortus WT y luego se estimula con LPS

(WT/LPS) se observa una histología casi comparable con la de los pulmones controles

(PBS/PBS, no mostrado), con signos débiles de vasocongestión. Sin embargo, cuando

se infecta con btpAbtpB- y luego se estimula con LPS se observan signos inflamatorios

con infiltrado de células polimorfonucleares, células mononucleares y vasocongestión.

Si bien este infiltrado inflamatorio es menor que el del grupo PBS/LPS, es también

definitivamente mayor al del grupo WT/LPS.


65

Figura 20. Histología de ratones no infectados e infectados con 106 UFC de B.

abortus y 24 h después inoculados con agonista TLR4 (LPS de E. coli). A 2 días post-

infección los ratones fueron sacrificados y los pulmones fijados en PFA 4% para

posterior procesamiento y tinción con hematoxilina y eosina.

Para evaluar la producción de citoquinas en los pulmones de estos ratones, se

colectaron y homogenizaron los pulmones de los distintos grupos, y se midió IL-1β,

TNF-α, KC, IL-12 e IFN-γ. Los resultados se muestran en la Figura 21

Los niveles de citoquina tuvieron alta variabilidad entre mediciones dentro de un

mismo grupo, sin embargo arrojaron diferencias significativas en los niveles de IL-1β

e IFN-γ.

La concentración de IL-1β en homogenatos de pulmones de animales PBS/LPS no

difiere significativamente de la de los animales WT/LPS. En contraste, los pulmones

del grupo btpAbtpB-/LPS poseen una mayor concentración de IL-1β.

También se observa un aumento de concentración de INF-γ para ambas

infecciones, siendo la correspondiente al grupo btpAbtpB-/LPS significativamente

mayor que WT/LPS. No se registran diferencias significativas para TNF-α, KC o IL-12.

Sin embargo, para KC, se observa una tendencia a una disminución de la

concentración en los pulmones del grupo WT/LPS respecto del PBS/LPS y del

btpAbtpB-/LPS que no es estadísticamente significativa.


66

Figura 21. Panel de citoquinas correspondiente a la infección con 106 UFC/animal

de B. abortus wt o btpAbtpB- y 24 h después, inoculados con agonista TLR4 (LPS de E.

coli). A 2 días post-infección los ratones fueron sacrificados y los pulmones extraídos y

homogenizados. IL-1β, TNF-α, KC, IFN-γ e IL-12 se midieron por ELISA en los

homogenatos. *p<0.05, ** p<0.01,*** p<0.001 respecto de no infectado (NI)

PBS wt btpAbtpB-0

2000

4000

6000

8000p=0.08

*

LPS 24h p.i.

IL-1

(p

g/m

l)

PBS wt btpAbtpB-0

200

400

600

LPS 24h p.i.

TN

F (

pg

/ml)

PBS wt btpAbtpB-0

1000

2000

3000

4000

5000

LPS 24h p.i.

KC

(p

g/m

l)

PBS wt btpAbtpB-0

2000

4000

6000

8000

LPS 24h p.i.

IL-1

2 (

pg

/ml)

NI wt btpAbtpB-0

50

100

150

200

250

LPS 24h p.i.

*

***

p<0.01

IFN

- (

pg

/ml)


67

Las proteinas Btp modulan la respuesta de MA infectados frente a un

agonista TLR4

Teniendo en cuenta la capacidad de las proteínas Btp de modular la respuesta

inflamatoria pulmonar total, como se mostró en la sección anterior, resultó de interés

evaluar este efecto a nivel de macrófagos alveolares (MA). Para evaluar la capacidad

moduladora de las proteínas Btp, se infectaron MA con B. abortus WT o btpAbtpB-.

Luego de 24 h p.i. las células se estimularon con LPS de E. coli (1µg/mL) como

agonista TLR4 y al día siguiente se colectó sobrenadante para analizar los niveles de

IL-1β, IL-12 y KC por ELISA. Loa resultados se muestran en la Figura 22.

La infección con la cepa WT seguida de estimulación con LPS induce un aumento

significativo de los niveles de IL-1β e IFN-γ respecto del control no infectado

estimulado con LPS, mientras que no se registran diferencias para IL-12 o KC.

Si bien no existen modulaciones negativas respecto de los MA sin infectar

estimulados con LPS, si se midió un aumento significativo de los niveles de IL-12, IFN-

γ e IL-1β en los sobrenadantes de los macrófagos infectados con la doble mutante

respecto de los infectados con la cepa WT.

B. abortus WT sobrevive en pulmones estimulados con LPS

Brucella abortus btpAbtpB- produce signos de inflamación moderada en los

pulmones de los ratones infectados. Sin embargo, este reclutamiento de células y

ambiente proinflamatorio no afecta finalmente el recuento de UFC en pulmón. Una

posible explicación es que el grado de inflamación generada, aunque mayor que el

inducido por la cepa WT, sea insuficiente para controlar la infección. Si esto fuera así,

cabe la posibilidad de que una respuesta inflamatoria pulmonar más marcada pueda

controlar a la bacteria. Nos propusimos entonces evaluar la capacidad de la bacteria

de sobrevivir en el ambiente inflamatorio producido por un agonista TLR4. Para ello

administramos intratraquealmente LPS de E. coli a ratones Balb/c y a las 24 h post-

administración se infectaron por vía intratraqueal con B. abortus WT y con la mutante


68

Figura 22. Secreción de IL1β, IL-12, IFN-γ y KC en macrófagos alveolares. Las

células fueron infectadas con MI de 100 bacterias/célula y luego de 24 h estimulados

con LPS de E. coli. Al día siguiente el sobrenadante fue colectado y las citoquinas

medidas por ELISA. *p<0.05, ** p<0.01,*** p<0.001 respecto de no infectado (NI)

NI btpAbtpB- wt0

1000

2000

3000

4000

5000

6000 ***

**

LPS 24h p.i.

p<0.001

mIL

-1

(p

g/m

l)

NI btpAbtpB-

wt0

500

1000

1500

2000

2500

*

p<0.05

LPS 24h p.i.

IL-1

2 (

pg

/ml)

NI btpAbtpB- wt0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

LPS 24h p.i.

ns

KC

(p

g/m

l)

NI btpAbtpB- wt0

2000

4000

6000

8000

LPS 24h p.i.

***

p<0.05

IFN

- (

pg

/ml)

***

btpAbtpB-. Los pulmones de los animales fueron extraídos a las 24 h p.i. y

homogenizados, y las UFC se midieron por plaqueo en TSA y las citoquinas por ELISA.

Cuando los animales fueron estimulados intratraquealmente con LPS de E. coli y

posteriormente infectados con B. abortus WT, no se observaron cambios significativos

en los recuentos de UFC en los pulmones respecto de aquellos ratones controles que

recibieron PBS previo a la infección (Figura 23).

Sin embargo, cuando se administró LPS y posteriormente se infectó con la mutante

btpAbtpB- se observó una disminución de un 97% del inóculo respecto del grupo

pretratado con PBS e infectado con la misma cepa, con uno de los recuentos por

debajo del límite de detección de la técnica. Estos resultados sugieren que en ausencia


69

de Btp B. abortus es sensible a la repuesta inmune pulmonar desencadenada por

agonistas de TLR4.

Al analizar los niveles de citoquinas en los homogenatos de los pulmones se

observa que no existen diferencias significativas en los niveles de las citoquinas

analizadas para los grupos administrados con PBS o LPS y posteriormente infectados

con la cepa WT (PBS/WT, LPS/WT respectivamente), sugiriendo una modulación del

efecto del LPS en el grupo LPS/WT.

Esta modulación de la respuesta en la secreción no se observa en los grupos

infectados con la mutante btpAbtpB-, donde se registra un aumento de IL-1β para el

grupo que fue administrado con LPS y posteriormente infectado con la doble mutante

(LPS/btpAbtpB-) respecto de los animales administrados con PBS e infectados con la

mutante (PBS/btpAbtpB-). Los niveles de secreción de IL-1β del grupo LPS/btpAbtpB-

son mayores a los medidos para el grupo LPS/WT, indicando una modulación por

parte de la bacteria WT aún una vez establecida la respuesta al agonista TLR, que no

puede ser realizada por la doble mutante. Sin embargo, no se registran diferencias en

los pulmones de los grupos PBS/btpAbtpB- versus PBS/WT.

Un perfil similar de secreción se registra para KC e IL-12, donde los niveles de

secreción de la quemoquina y la citoquina aumentan en los pulmones del grupo

LPS/btpAbtpB, siendo significativamente mayor que los del grupo LPS/WT. Aquí sí se

registra una diferencia en la secreción de los grupos PBS/btpAbtpB y PBS/WT, siendo

el primero significativamente superior al segundo.


70

Figura 23.Supervivencia de B. abortus wt y btpAbtpB- en pulmones estimulados con LPS.

(A) Recuento de UFC en homogenatos de pulmones totales 24 h p.i. inoculados previamente

con PBS o LPS de E. coli. (B) Secreción de IL1β, TNF-α, IFN-γ y KC en homogenatos de

pulmón enteros, medido por ELISA. *p<0.05, ** p<0.01 respecto del grupo PBS/btpAbtpB-

PBS LPS PBS LPS100

101

102

103

104

105

106

wt btpAbtpB-

*ns

UF

C/ó

rgan

o

PBS LPS PBS LPS0

200

400

600

800

wt btpAbtpB-

TN

F (

pg

/ml)

PBS LPS PBS LPS0

1000

2000

3000

4000

5000

wt btpAbtpB-

p<0.05

**

IL-1

(p

g/m

l)

PBS LPS PBS LPS0

500

1000

1500

2000

wt btpAbtpB-

p<0.05

p<0.001

**

KC

(p

g/m

l)

PBS LPS PBS LPS0

200

400

600

800

1000

p<0.001

wt btpAbtpB -

*

p<0.05

IL-1

2 (

pg

/ml)

A

B

71

Discusión

Capítulo 1 - Discusión

72

Existen muchos patógenos que infectan y colonizan las vías aéreas. Varios de ellos

generan inflamación y sintomatología pulmonar característica, desplegando toda su

capacidad patogénica en un florido cuadro localizado predominantemente en el

pulmón (Scharf et al. 2010a; de Vries et al. 2009). Otros patógenos como Brucella,

usan el pulmón como puerta de entrada para luego diseminarse hacia otros órganos,

produciendo escasas manifestaciones pulmonares. En el caso de Brucella dichas

manifestaciones se presentan en un bajo porcentaje de pacientes, e incluye: neumonía

lobular, neumonía intersticial o derrame pleural (Pappas et al. 2003)

Estudios in vitro realizados previamente por nuestro grupo indican que Brucella

puede infectar varios tipos celulares constituyentes del pulmón y, que estas células

responden a la infección con un perfil levemente proinflamatorio ya sea directamente

o indirectamente por interacción con otras células infectadas (Ferrero et al. 2009;

Ferrero et al. 2010; Ferrero et al. 2014)

El objetivo de este trabajo de Tesis fue evaluar la infección por Brucella de ratones

Balb/c en las primeras etapas para caracterizar la respuesta inmune innata

desencadenada en el pulmón, así como evaluar los mecanismos que utiliza la bacteria

para evadir la vigilancia inmunológica en el pulmón y diseminarse sistémicamente.

Los resultados obtenidos indican que B. abortus es capaz de infectar y persistir en

pulmón murino, pudiéndose diseminar desde el sitio de infección hacia los órganos

periféricos. Si bien esto fue descripto en un trabajo previo, (Kahl-McDonagh, Arenas-

Gamboa, and Ficht 2007), en aquella oportunidad se puso el foco en tiempos más

tardíos de la infección, abarcando desde la primera a la octava semana p.i. En este

trabajo de Tesis evaluamos la respuesta inmune innata y la cinética de diseminación

durante la primera semana p.i. Nuestros resultados indican que Brucella es capaz de

diseminarse a otros órganos tan tempranamente como 1 día p.i., lo que concuerda con

otro trabajo donde encontraron diseminación desde pulmón ya a las 18 hs p.i.

(Archambaud et al. 2010). Mientras que en ese estudio los animales se infectaron por

inhalación de aerosoles, en esta Tesis se utilizó la inoculación intratraqueal. Si bien

ésta no replica exactamente la inhalación, tiene como ventaja la certeza de cantidad de


73

inóculo que se deposita y que asegura la entrada por vías aéreas inferiores, lo cual, a

diferencia de la infección por inhalación, permite descartar el ingreso contaminante

por vía digestiva o conjuntival (Watson et al. 1969; Driscoll et al. 2000; Munder et al.

2002)

Brucella abortus exhibe una rápida diseminación desde pulmón hacia órganos

periféricos y una persistencia prolongada en pulmón(Archambaud et al. 2010; Kahl-

McDonagh et al. 2007). Esto podría deberse, al menos en parte, a una escasa respuesta

inmune pulmonar, posiblemente modulada por la bacteria en el momento de la

infección para lograr una diseminación más efectiva. Además se han reportado

manifestaciones pulmonares en pacientes infectados con B. abortus en una incidencia

muy baja (5-7%) (Pappas et al. 2003) Por ello decidimos evaluar la respuesta inmune

innata que se monta en el pulmón frente a Brucella en los primeros días de infección.

Para ello evaluamos los niveles de citoquinas en los pulmones de los animales

infectados.

Nuestros resultados muestran un leve aumento de las citoquinas IL-1β y MCP-1 a 3

días p.i. y sólo con cargas bacterianas altas (106 UFC/ ratón), mientras que el resto de

las citoquinas proinflamatorias (IL-12, KC, TNF-α e IFN-γ) no se diferencian del

control hasta 7 días p.i. A diferencia de B. abortus, patógenos respiratorios como

Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis o Klebsiella pneumoniae aumentan la

concentración de citoquinas o quemoquinas proinflamatorias en el pulmón o en el

líquido de lavado broncoalveolar entre las 6 y las 24 hs p.i. (Brieland et al. 1994;

Gutbier et al. 2015; Rosen et al. 2015). En contraste, la respuesta a B. abortus parece

débil y retardada en el tiempo. En relación con esta escasa capacidad proinflamatoria

de B. abortus cabe mencionar que en infecciones intraperitoneales realizadas en

paralelo con B. abortus y Salmonella en modelos murinos se encontró un aumento en

la concentración sérica de las citoquinas IL-10, IL-1β, IL-6 y TNF-α en los animales

infectados con Salmonella a diferencia de los infectados con Brucella (Barquero-Calvo

et al. 2007).

Las citoquinas TNF-α, IL-12 e IFN-γ son necesarias para mejorar la capacidad

bactericida de los macrófagos contra B. abortus (Murphy et al. 2001). En nuestro


74

modelo de infección intratraqueal estas citoquinas recién aumentan en los animales

infectados hacia el día 7 p.i. y para inóculos elevados de 106 UFC/animal. La ausencia

de una respuesta innata temprana podría favorecer la diseminación sistémica de la

bacteria desde el sitio inicial de infección, debido a que a los 7 días postinfección,

cuando la secreción de citoquinas en pulmón es mayor, la bacteria ya colonizó y

replicó en bazo e hígado. Además, los niveles de TNF-α en pulmones de animales

infectados en los dos primeros días p.i. son menores que en los controles. Se han

reportado mecanismos de evasión de la bacteria que disminuyen la secreción de TNF-

α en infecciones in vitro, que también podrían estar actuando in vivo. Trabajos previos

del grupo mostraron que vesículas de membrana externa de B. abortus, así como la

proteína VirB7 de esta bacteria, inhiben la secreción de TNF-α en monocitos de la

línea THP-1 en respuesta a agonistas TLR (Pollak et al. 2012). Otros estudios han

demostrado que una proteína de membrana externa de 25 kDa de Brucella produce el

mismo efecto (Jubier-Maurin et al. 2001).

Se puede concluir que la respuesta inmune innata contra Brucella en los primeros

días p.i. es de carácter levemente proinflamatorio, y se monta cuando ya han sido

colonizados los principales órganos periféricos.

El análisis histológico demostró que la infección con B. abortus produce cambios

en la composición celular del pulmón afectado, observándose un leve infiltrado de

células mononucleares. Sin embargo, la citometría no permitió precisar la identidad

de las células infiltrantes. No se observaron cambios en células dendríticas (CD11b+,

CD11c+, F4/80-,) o macrófagos alveolares (F4/80+, CD11c+, CD11b-) pero hubo una

tendencia a un mayor número de linfocitos CD4+ o CD8+ en los pulmones de los

animales infectados. Este infiltrado leve concuerda con los niveles bajos y retardados

de quemoquinas obtenidos en los homogenatos. Sin embargo, se observa un mayor

número de células totales en los homogenatos de los ratones infectados que en los

controles, lo que podría deberse a un reclutamiento de células que todavía no hemos

tipificado. En concordancia con nuestros resultados, trabajos publicados describen

que ratones infectados con B. melitensis aerosolizada presentan cambios histológicos

leves durante el transcurso de la infección (Mense et al. 2001). Asimismo, en un

modelo de infección intranasal de Macaca mulatta con B. melitensis se detectaron


75

alteraciones histológicas en los pulmones infectados correspondiente a una mínima

neumonía en una pequeña porción de los animales (Mense et al. 2004).

El reconocimiento antigénico por TLR induce una cascada de señalización que

desencadena la transcripción de citoquinas proinflamatorias. Teniendo en cuenta que

durante la infección intratraqueal con B. abortus en el modelo murino se genera una

escasa y retarda secreción de las mismas, decidimos evaluar el efecto de las proteínas

BtpA y BtpB de Brucella sobre la respuesta inmune desencadenada por la infección

intratraqueal. In vitro, estas proteínas son potentes inhibidores de TLR2, TLR5 y TLR9

en células dendríticas derivadas de médula ósea murina (Salcedo et al. 2013).

Cuando se infectaron los ratones intratraquealmente con la doble mutante

btpAbtpB- de B. abortus la histología pulmonar reveló un mayor infiltrado de células

mononucleares que los pulmones de ratones infectados con la cepa wt. Esto sugiere

que las proteínas Btp modulan el reclutamiento de las células inmunes hacia el

pulmón. Aun así, el infiltrado inflamatorio generado por la doble mutante no fue

sustancial y tampoco fue comparable al descripto para bacterias que son patógenos

pulmonares, como Legionella pneumophila, donde se evidencia una clara neumonía

con un importante infiltrado neutrofílico (Brieland et al. 1994)

Este aumento en el infiltrado de pulmones infectados con la doble mutante podría

haber supuesto un aumento en la eliminación de la bacteria, asumiendo que más

células inmunes en el sitio de infección lograrían controlar la replicación o

persistencia. Sin embargo, al realizar el recuento de UFC de la mutante en los

homogenatos de pulmón no se registraron cambios en su número desde las dos horas

p.i. hasta el día 7 p.i. Esto resulta interesante, ya que a pesar del mayor infiltrado

inflamatorio pulmonar no se logra eliminar más eficientemente a la bacteria. Resta

caracterizar por citometría el infiltrado producido en respuesta a la mutante Btp. A

diferencia de lo que ocurre en el pulmón, el recuento de bacterias viables en los

órganos periféricos de los ratones infectados por vía intratraqueal con la doble

mutante fue mucho menor que en los órganos de los ratones infectados con la cepa wt,

cercano al límite de detección de la técnica. Este menor recuento en órganos

periféricos sugiere dos posibilidades: a) que las proteínas Btp participan en la


76

diseminación desde el pulmón hacia los órganos periféricos, con lo cual la mutante

tiene una menor capacidad de diseminación, o b) que las proteínas Btp modulan los

mecanismos inmunes involucrados en la eliminación de la bacteria en los órganos

periféricos. Para abordar la segunda posibilidad evaluamos el perfil de citoquinas en

los bazos de animales infectados con la cepa salvaje o con la doble mutante para

evaluar diferencias que podrían indicar una mayor activación inmune del bazo en los

ratones infectados con la mutante. Los resultados mostraron que los valores de IL-1β,

IL-12, TNF-α y KC a 1 día p.i. aumentan significativamente en los ratones infectados

con la cepa doble mutante a diferencia de lo que ocurre en los bazos de los animales

infectados con la wt, donde no se detectaron aumentos en la producción de citoquinas

respecto de los animales no infectados para ningún tiempo analizado, con la excepción

de KC a 1 día p.i., que coincide con la primera detección de bacteria en el órgano. Esto

sugiere que la menor carga bacteriana de la doble mutante en órganos periféricos

luego de la infección intratraqueal se debería, al menos en parte, a su menor

capacidad de modular la respuesta inmune antibacteriana en esos órganos. Cabe

destacar que, hasta donde sabemos, este estudio es el primero en demostrar in vivo

que las proteínas Btp le confieren una ventaja de supervivencia a B. abortus, ya que

hasta el momento esto sólo se había explorado en estudios in vitro.

El alvéolo pulmonar está formado por diversos tipos celulares, incluyendo

pneumocitos tipo I y II, células endoteliales y macrófagos alveolares (MA). Los MA son

las principales células fagocíticas ubicadas en la luz alveolar, y son capaces de

responder a los patógenos inhalados iniciando la respuesta inmune pulmonar. En el

caso de B. abortus estudios previos indican que la bacteria establece su nicho

replicativo en MA, los cuales responden a la infección con una secreción retardada y

disminuida de citoquinas proinflamatorias en comparación con la estimulación por

agonistas TLR4 como el LPS de E. coli (Ferrero et al., 2014). Estos datos sugieren que

B. abortus posee algún mecanismo inhibitorio de la secreción de citoquinas o de la

activación de MA. En concordancia con esta hipótesis, los estudios realizados en este

trabajo de Tesis sugieren que las proteínas Btp tendrían un rol en el control de la

secreción de citoquinas por los MA, indicado tanto por la menor transcripción del gen

de IL-1β (il1b) como por la menor secreción de varias citoquinas (IL-1β, IFN-γ y KC)


77

en los MA infectados con la cepa wt respecto de los infectados con la mutante

btpAbtpB-. Trabajos previos demostraron resultados similares para la transcripción

de il1b y tnf en esplenocitos de ratones IRF-1-/- infectados con B. melitensis y su

mutante knock-out para BtpB (TcpB), proteína homóloga a su homónima en B. abortus

(Radhakrishnan et al. 2009). En nuestras investigaciones, la transcripción de tnf no

resultó modificada respecto de los MA sin infectar a 24 h p.i. Existen reportes donde el

aumento de la transcripción para tnf en macrófagos alveolares ocurre a tiempos más

tempranos, como 4h, (Becker et al. 2005), y cabe la posibilidad que el momento de

transcripción diferencial quede por fuera de nuestro tiempo de medida.

Además de la modulación de citoquinas, pueden existir otros mecanismos de

evasión del sistema inmune. Francisella tularensis evade el sistema inmune mediante

la inducción de la secreción de TGF-β en bazo y pulmón (Bosio et al. 2007). En

nuestro caso la infección de MA con B. abortus también generó un aumento de la

transcripción de tgfb, no siendo afectado por la presencia de las proteínas Btp. Si este

aumento en la transcripción de ARNm se refleja efectivamente en un aumento en la

concentración de la citoquina extracelular, es posible que sea este otro mecanismo de

control de la respuesta inmune.

Estudiamos también la capacidad de las proteínas Btp de modular la secreción

de citoquinas: IL-1β, IFN-γ y KC en MA infectados con B. abortus. Para IFN-γ y KC

encontramos que las proteínas Btp podían modular la secreción a 24 h p.i.,

bloqueando la secreción de IFN-γ. Sin embargo, a 48 h p.i. ya no se observa la

modulación.

Al analizar la concentración de IL-1β (el producto clivado, secretado y con

actividad biológica del gen il1b) en sobrenadante de cultivo de MA infectados, se

detectó un aumento para ambas infecciones, siendo el mayor para la infección con la

doble mutante. Esto concuerda con las diferencias en la expresión a nivel de ARNm.

Para la secreción de IL-1β es necesaria la conjunción de dos señales: 1) la activación

de un receptor TLR y consecuente incremento en la producción del precursor pro-IL-

1β, 2) la activación de los inflamasomas, lo cual conduce a la activación de caspasa-1

que madura por clivaje la pro-IL-1β (forma no secretada) a IL-1β (forma secretada)

(Bauernfeind & Hornung 2013). Con los estudios que hemos realizado hasta el


78

momento no se puede determinar a qué nivel estarían actuando las proteínas Btp para

disminuir la secreción de IL-1β en MA infectados, pero dada su conocida actividad

inhibitoria sobre la señalización de TLRs es posible que el mecanismo de acción sea

mediante la inhibición de la “señal 1”.

La IL-1β es una citoquina crítica para la mayoría de los procesos infecciosos.

Estudios realizados en ratones knockout mostraron que los inflamasomas

dependientes de la proteína adaptadora ASC (necesarios para la maduración y

secreción de IL-1β e IL-18) contribuyen al control de la infección con B. abortus por

vía intraperitoneal (Gomes et al. 2013). Sin embargo, en estudios realizados en

ratones KO para IL-1β no se encontraron diferencias en las UFC de B. abortus

recuperadas a 14 días p.i. de bazos de animales infectados intraperitonealmente

(Weiss et al. 2005). El rol de los inflamasomas en la respuesta pulmonar a Brucella es

todavía desconocido. El rol de protector de IL-1β en la respuesta inmune pulmonar

depende del agente infeccioso, habiéndose reportado casos donde juega un papel

protector, como en Mycobacterium tuberculosis (Yamada et al. 2000), y otros casos

donde el patógeno se beneficia de la inflamación producida, como el caso de

Streptococcus pneumonie (Lemon et al. 2015).

Para evaluar la importancia de IL-1β en la defensa contra la infección intratraqueal

por B. abortus se infectaron ratones C57BL/6 wt y knock-out para el receptor de IL-1β

(IL-1R) y para caspasa-1, y luego se midieron las UFC en los homogenatos

pulmonares. Se debió recurrir a la cepa C57BL/6 ya que los ratones knock-out

disponibles fueron derivados de esa cepa. La cinética de replicación de B. abortus en

los ratones C57BL/6 wt fue similar a la obtenida en ratones Balb/c en los tiempos

analizados (2 y 7 días p.i.) mostrando que, al menos en lo que respecta a la

permisividad a la replicación bacteriana, ambas cepas de ratones se comportan igual.

Hallamos que en ausencia de receptores para IL-1 la bacteria aumenta su recuento a

los 7 días p.i. respecto del inóculo inicial. Sin embargo, el recuento de bacterias a los 2

y los 7 días p.i. es mayor en los ratones KO para IL-1R. El aumento en el recuento de

bacterias viables en los pulmones de los ratones deficientes en IL-1R muestra la

importancia de IL-1 para el control pulmonar de la infección por B. abortus.


79

Los epitelios son parte importante de la respuesta inmune innata. No sólo forman

una barrera física al ingreso de microorganismos y partículas, sino que también

pueden secretar citoquinas y quemoquinas en respuesta a antígenos microbianos y a

factores solubles producidos por células inmunes. Además de los MA, los pneumocitos

son un tipo celular inmunológicamente activo en el alveólo. Para evaluar la

contribución de este tipo celular en la infección murina aislamos pneumocitos tipo II a

partir de pulmón y los infectamos con B. abortus wt y las mutantes en proteínas Btp.

En este estudio demostramos que Brucella puede infectar pneumocitos murinos,

los que a su vez responden secretando KC y MCP-1 de manera dependiente de la

multiplicidad de infección. Sin embargo, la cantidad de KC secretada luego de la

infección con la cepa wt fue mucho menor que para la infección con mutantes simples

o dobles para las proteínas Btp, donde los valores específicos de secreción de KC se

duplican respecto de la infección con wt. Esto indica que si bien Brucella es capaz de

infectar pneumocitos y generar una respuesta inmune, la expresión de las proteínas

Btp en la bacteria atenúa en parte dicha respuesta.

En los trabajos donde se describieron por primera vez las mutantes para las

proteínas Btp se demostró que estas proteínas pueden modular la secreción de TNF-α

e IL-12 en células dendríticas infectadas con B. abortus (Salcedo et al. 2008; Salcedo et

al. 2013). Las células dendríticas (CD) tienen un importante papel en la respuesta

inmune pulmonar ya que por su localización inmediatamente debajo de los

pneumocitos pueden captar antígenos luminales (a través de sus proyecciones

interdigitantes) o antígenos que traslocan el epitelio. En respuesta a la detección de

antígenos foráneos las CD se activan, incrementando la expresión de moléculas del

CMH pero también la secreción de diversas citoquinas, incluyendo IL-12 e IL-1β.

Además, en algunas infecciones pulmonares las células dendríticas pueden actuar

como transportadores (“caballos de Troya”) de bacterias viables hacia los ganglios

drenantes, contribuyendo a la diseminación del patógeno. Este fenómeno se verifica

en el caso de la infección inhalatoria por Brucella, ya que tanto los MA como las células

dendríticas pulmonares migran a los ganglios drenantes portando bacteria viable

(Archambaud et al. 2010). Teniendo en cuenta estos antecedentes y nuestros

resultados que indican la importancia de IL-1β en el control pulmonar de la infección


80

por B. abortus, nos pareció importante determinar si las proteínas Btp también

pueden modular la expresión de IL-1β en CD. Los resultados obtenidos indicaron que

las proteínas Btp inhiben la secreción de IL-1β en CD infectadas con B. abortus, (junto

con una inhibición de TNF-α e IL-12 como ya estaba descripto).

En conjunto los resultados obtenidos indican la capacidad de B. abortus de

modular la respuesta inmune de células pulmonares fagocíticas y no fagocíticas, lo

cual podría contribuir a su supervivencia prolongada en el pulmón. Además, teniendo

en cuenta que en el contexto fisiológico del alvéolo los distintos tipos celulares están

en estrecha proximidad y se estimulan o inhiben recíprocamente a través de factores

solubles, la modulación de las citoquinas producidas por un tipo celular podría

influenciar la secreción de las producidas por otro.

Diversos patógenos suprimen activamente la respuesta inmune para asegurar su

supervivencia en el hospedador. En muchos casos la inmunosupresión no es específica

para antígenos del patógeno sino que afecta a la respuesta inmune a estímulos

antigénicos generales (ej. PAMPs) aplicados con posterioridad a la infección (Bosio et

al. 2007). Teniendo en cuenta la falta de activación inmune observada en los

pulmones de los ratones durante los primeros días luego de la infección con B. abortus

y la modulación que ejercen las proteínas Btp de la bacteria sobre la secreción de

citoquinas en macrófagos alveolares, pneumocitos y células dendríticas quisimos

evaluar la capacidad de B. abortus de suprimir activamente la respuesta inflamatoria a

un agonista TLR. Para estos estudios elegimos el LPS de E. coli, un conocido agonista

TLR4.

Como se esperaba, los pulmones de los ratones estimulados con LPS de E. coli

luego del pretratamiento con PBS mostraron altos grados de infiltrado intersticial. En

cambio, aquellos provenientes de ratones previamente infectados con B. abortus wt y

luego estimulados con LPS (grupo wt/LPS) exhibieron un infiltrado escaso o nulo. Por

otra parte, cuando la preinfección se realizó con la doble mutante Btp se obtuvo un

infiltrado intermedio entre el observado en el grupo PBS/LPS y el observado en el

grupo wt/LPS. Estos resultados indicarían que la infección por B. abortus modula la


81

respuesta inmune pulmonar a un agonista TLR4 (LPS de E. coli) y que las proteínas

Btp son sólo parcialmente responsables de ese fenómeno.

El efecto de la preinfección con B. abortus sobre la respuesta a LPS de E. coli se

evaluó también a nivel de la producción de citoquinas en homogenatos de pulmón. Los

niveles de la quemoquina KC fueron menores (aunque las diferencias no fueron

estadísticamente significativas) en el grupo wt/LPS respecto de los grupos PBS/LPS y

btpAbtpB-/LPS. Esto podría explicar la diferencia en los infiltrados pulmonares

observados en los estudios histológicos, ya que KC es un quimioatractante de

neutrófilos. Resta por evaluar si la preinfección con la cepa wt puede modular también

otras quemoquinas inducidas por LPS en el pulmón. Es sabido que KC es secretada por

células epiteliales en respuesta a agonistas TLR y citoquinas proinflamatorias como

IL-1β. A su vez, es secretada por MA también en respuesta a PAMPs. Notablemente,

hallamos que KC no es modulada por la preinfección con B. abortus en MA estimulados

con LPS, con lo que es posible que las diferencias de KC entre grupos observada en los

homogenatos pulmonares se deban a la modulación de citoquinas que estimulan su

secreción, como IL-1β (ver luego).

En homogenatos pulmonares de los 3 grupos experimentales se evaluaron

también los niveles de IL-1β e IFN-γ. A diferencia de lo observado con KC, en el caso

de estas citoquinas no se observaron diferencias entre el grupo wt/LPS y el grupo

PBS/LPS, lo cual en principio sugeriría que la preinfección con B. abortus no modula la

producción de IL-1β inducida por el estímulo con LPS. Sin embargo, cuando la

preinfección se realizó con la doble mutante (grupo btpAbtpB-/LPS) se obtuvieron

niveles de IL-1β significativamente mayores a los del grupo wt/LPS. Esto demuestra

que las proteínas Btp contribuyen a disminuir la respuesta de IL-1β en pulmones

estimulados con LPS, a pesar de que la preinfección con B. abortus wt no pareció tener

un efecto modulador. Una posible explicación a estos resultados aparentemente

contradictorios es que, en el ensayo de preinfección con la cepa wt el efecto

antiinflamatorio (a nivel de IL-1β) producido por las proteínas Btp de la bacteria se

vea contrarrestado por un efecto proinflamatorio producido por los propios antígenos

de B. abortus, generando un efecto neto neutro que no difiere del producido por el

PBS. Es decir que en ambos grupos (PBS/LPS y wt/LPS) la secreción de IL-1β


82

observada se debería sólo al efecto del LPS de E. coli. En el caso de la preinfección con

la mutante, en cambio, al desaparecer el efecto antiinflamatorio de las proteínas Btp

se pondría en evidencia el efecto proinflamatorio sumado del LPS y de los antígenos

de B. abortus, dando como resultado una mayor secreción de IL-1β.

Los resultados obtenidos en experimentos similares realizados con MA aislados

siguieron el mismo perfil: se halló muy disminuida la concentración de IL-1β e IFN-γ

en células preinfectadas con la cepa wt y luego estimuladas con LPS (wt/LPS) respecto

de las infectadas con la doble mutante (btpAbtpB-/LPS), demostrando el rol

modulador de las proteínas Btp. Para ambas citoquinas, no obstante, los niveles

producidos por MA del grupo wt/LPS fueron algo mayores que los de las células

pretratadas con PBS (PBS/LPS). Sólo en el caso de IL-12 los niveles de los grupos

wt/PBS y PBS/LPS fueron similares.

Conjuntamente estos resultados indican que B. abortus, a través de sus proteínas

Btp, ejerce algún grado de modulación inmune disminuyendo el grado de

reclutamiento de células y la producción de KC inducidos por el LPS de E. coli en

pulmón. Por otra parte, si bien en las condiciones experimentales evaluadas no se

logró demostrar que B. abortus module otras citoquinas proinflamatorias en

comparación con los ratones o los MA no preinfectados, los resultados sugieren

fuertemente la capacidad de las proteínas Btp de modular la producción de tales

citoquinas ante el estímulo con LPS.

La activación previa de los receptores TLR pulmonares por agonistas específicos

puede incrementar los mecanismos efectores de la inmunidad innata frente al ingreso

posterior de un patógeno. A este fenómeno se lo conoce como resistencia innata

estimulada. La protección contra bacterias conferida por este mecanismo se ha

probado con diferentes patógenos respiratorios, como Bordetella pertussis,

Streptococcus pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa (Errea et al. 2010; Evans et al.

2010). Para probar la capacidad de la respuesta inmune innata pulmonar estimulada

por LPS para eliminar B. abortus, infectamos intratraquealmente ratones

condicionados previamente con LPS de E. coli (también administrado por vía

intratraqueal).


83

Nuestros resultados muestran que B. abortus resiste la inmunidad innata inducida

por LPS ya que no se observan diferencias significativas en los recuentos de bacterias

viables en los pulmones de los animales pre-condicionados con LPS respecto de los

controles pre-condicionados con PBS. Estos resultados contrastan de alguna manera

con un estudio previo que demostró que los macrófagos murinos estimulados con LPS

de E. coli tienen mayor poder bactericida frente a B. abortus (Barquero-Calvo et al.

2007). No obstante, debe tenerse en cuenta que en un caso se trata de una infección in

vivo por vía mucosa y en el otro caso se trata de una infección in vitro sobre un único

tipo celular.

La capacidad de sobrevida de B. abortus en el ambiente pulmonar previamente

inflamado con LPS de E. coli parece depender sustancialmente de las proteínas Btp. A

diferencia de lo observado con la cepa wt, la mutante carente de estas proteínas

exhibe un recuento disminuido en los pulmones de animales precondicionados con

LPS en comparación con los de animales administrados con PBS. A su vez, este grupo

(LPS/btpAbtpB-) produce altos niveles de citoquinas proinflamatorias, condición que

podría ser causal del recuento disminuído. En conjunto los resultados sugieren que B.

abortus puede resistir los fenómenos inflamatorios pulmonares desencadenados por

el LPS sólo si puede comenzar a modularlos (gracias a la expresión de proteínas Btp),

mientras que si no puede hacerlo (por carecer de estas proteínas) su supervivencia

pulmonar se ve afectada.

Aunque no sabemos cómo opera exactamente esa modulación, un escenario

posible es que al momento de administrar B. abortus wt (24 h post-LPS) todavía

quede LPS de E. coli en las vías aéreas, de forma tal que las proteínas Btp detienen la

estimulación de TLR4 por el LPS remanente (y la estimulación de otros TLR por

antígenos de B. abortus). Por otra parte, aunque ya no quedara LPS en las vías

respiratorias, la preadministración de este PAMP habrá inducido el reclutamiento y

preactivación de células fagocíticas como ha sido indicado por estudios previos (Le

Feuvre et al. 2002; Deng et al. 2013). En ese caso habrá una mayor densidad de

receptores TLR, incrementando la capacidad de detectar antígenos de B. abortus y de

desencadenar mecanismos microbicidas. La capacidad de las proteínas Btp de inhibir


84

la señalización por TLRs podría ser crucial para proteger a la bacteria de esos

mecanismos.

En conjunto, los resultados obtenidos indicarían que las proteínas Btp conferirían

a B. abortus características que le permitirían modular la respuesta inmune en el

pulmón favoreciendo su supervivencia y permitiendo su diseminación hacia órganos

periféricos.

Hasta donde sabemos, estos resultados muestran por primera vez in vivo el rol

inmunomodulador de las proteínas Btp en pulmón. Por otra parte, es el primer

estudio en demostrar la participación de estas proteínas en la supervivencia de las

bacterias en órganos blanco. Estos resultados podrían contribuir no solo a entender la

infección inhalatoria por Brucella y al diseño de estrategias de profilaxis, sino que

además sienta precedentes sobre mecanismos de inmunoevasión que podrían ser

compartidos por otros patógenos respiratorios.

85

Capítulo 2

Caracterización de la infección in vitro de pneumocitos

tipo II primarios humanos con B. abortus 2308

86

Introducción

Capítulo 2 - Introducción

87

El epitelio respiratorio cumple no sólo una función de barrera anatómica, sino

que además expresa receptores capaces de reconocer moléculas microbianas y puede

responder a la presencia de patógenos secretando citoquinas (IL-1β, IL-6, TNF-α) y

quemoquinas (IL-8, MCP-1, eotaxina, CCL20) que dan inicio a una respuesta

inflamatoria (Sha et al. 2004; Mayer & Dalpke 2007; Koyama et al. 2000; Starner et al.

2003).

En el primer capitulo de esta Tesis evaluamos in vivo en ratones la respuesta

inmune inntata pulmonar a Brucella abortus y analizamos in vitro la respuesta de los

tipos celulares pulmonares más importantes (neumocitos y macrófagos alveolares)

obtenidos de pulmones murinos. Aunque el modelo de ratón es imprescindible para

poder evaluar distintos aspectos de la infección y para caracterizar el rol de distintas

moléculas del sistema inmune, cabe recordar que el ratón no es un hospedador

natural de la infección por Brucella. Para tener una aproximación a la interacción

hospedador-patógeno en infecciones humanas debe recurrise a modelos in vitro

realizados con células de origen humano.

Recientemente nuestro grupo de trabajo ha demostrado que el epitelio

pulmonar humano responde a la infección por Brucella secretando citoquinas, aunque

a niveles bajos. Sin embargo, puede también responder a la infección de manera

indirecta, luego del estímulo con citoquinas proinflamatorias producidas por

macrófagos infectados, secretando IL-8, MCP-1 y GM-CSF (Ferrero et al., 2010). En el

sentido inverso, citoquinas secretadas por las células epiteliales infectadas son

capaces de inducir en los macrófagos la secreción de MCP-1. Estos resultados sugieren

que durante la infección por Brucella el epitelio respiratorio humano podría montar

una leve respuesta inflamatoria en forma directa o indirecta. No obstante, debe

tenerse en cuenta que tales estudios se realizaron con líneas celulares alveolares

(A549) y bronquiales (Calu-6) establecidas a partir de tumores pulmonares. Por lo

tanto, dado que no se trata de células normales, nos interesó validar tales resultados

utilizando células pulmonares primarias.


88

Otro aspecto de la interacción entre Brucella y el epitelio alveolar que puede ser

mejor evaluada con un cultivo primario es la capacidad de la bacteria de traslocar la

barrera epitelial. Como se mencionó en la Introducción general, no se conocen con

precisión los mecanismos por los cuales la bacteria logra pasar del lumen alveolar a la

circulación sistémica, aunque un estudio hecho en ratones sugiere que la bacteria

podría ser transportada a los ganglios linfáticos por macrófagos alveolares infectados

(mecanismo que se conoce como “caballo de Troya” dado que Brucella puede

sobrevivir dentro de los macrófagos) (Archambaud et al 2003). No obstante, existen

otros posibles mecanismos (descriptos para patógenos de ingreso inhalatorio) que no

han sido explorados hasta el momento y que también podrían contribuir a la

traslocación epitelial de Brucella. En particular nos interesó evaluar el pasaje

transcelular y el pasaje paracelular. En el primer caso el patógeno ingresa por el polo

apical del epitelio y egresa por la cara basolateral, con lo cual no altera las uniones

intercelulares y las propiedades de barrera del epitelio se mantienen intactas. En el

segundo caso el patógeno atraviesa el espacio entre células (espacio paracelular) en

sentido apical-basal, para lo cual necesita alterar las uniones intercelulares, lo cual se

traduce en un aumento de la permeabilidad de la barrera epitelial. Para realizar

estudios in vitro sobre estos mecanismos es imprescindible contar con un cultivo de

células epiteliales confluente y polarizado, con formación de uniones estrechas entre

células que redunden en una verdadera barrera epitelial. Este tipo de cultivos no se

logra con la línea celular A549, que es la única línea humana de neumocitos tipo II,

dado que no se establecen buenas uniones intercelulares (Steimer et al 2005). En

cambio, si se logran con cultivos primarios de pneumocitos.

89

Materiales y Métodos


90

Crecimiento de B. abortus

B. abortus 2308 se creció en caldo tripteína de soja a partir de colonias obtenidas

en agar tripteína de soja (TSA). Se estimó el número de unidades formadoras de

colonia (UFC) midiendo la densidad óptica del cultivo a 600 nm, y se determinó el

inóculo exacto por plaqueo de diluciones seriadas en TSA.

Aislamiento y purificación de células epiteliales

Los pneumocitos tipo II fueron aislados de tejido pulmonar siguiendo los

procedimientos publicados (Murphy et al. 1999). Las muestras fueron cedidas por la

Unidad de Trasplante Pulmonar Hospital Favaloro, a través de un convenio de

colaboración entre esta institución y el CONICET, protocolo N° 3099. Las muestras de

tejido humano pulmonar fueron obtenidas de zonas saludables y normales de los

límites de seguridad que se extraen junto a los tumores pulmones durante las cirugías.

Brevemente, los tejidos fueron lavados con Solución A (0.130 M NaCl,5.2 mM KCl, 10.6

mM HEPES, 2.6 mM Na2HPO4, 10 mM D-glucosa, pH 7.4) para remover el exceso de

sangre y contaminaciones. Luego el tejido fue picado en piezas de 1 mm de grosor. El

tejido fue digerido con tripsina (0.5% en solución A adicionado con 1.9 mM CaCl2 y

1.29 mM de MgSO4) y luego incubado a 37°C durante 20 minutos en agitación. El

digesto fue filtrado a través de una malla de 100 µm y colectado sobre SFB

conteniendo DNAsa (400 U/ml, SIGMA). Esta suspensión se filtró por una malla de 40

µm. El filtrado fue centrifugado y el pellet enriquecido con pneumocitos tipo II fue

resuspendido en medio de cultivo y dispensado sobre placas de 6 pocillos para

permitir la adhesión de leucocitos y células adherentes contaminantes. Las placas

fueron incubadas en la estufa a 37º C durante 2 h. Finalizada la incubación las células

no adherentes fueron colectadas y separadas en un gradiente de densidad discontinuo

de Percoll (1.089 g/ml y 1.040 g/ml). La capa celular interfacial enriquecida en

pneumocitos tipo II fue colectada y lavada dos veces con Solución A. Las células fueron

contadas por exclusión con azul Trypan y sembradas en placas de 48 pocillos

previamente tratadas con colágeno de tipo I bovino, seroalbúmina bovina y

fibronectina humana. Las células se dejaron adherir durante 36 h, luego el medio de

cultivo fue cambiado cada 48 h hasta llegar a confluencia (5 a 6 días).


91

Explantos de pulmón humanos.

Para obtener los explantos el tejido pulmonar fue cortado en fragmentos de

aproximadamente 1 cm3, los que fueron cultivados en 1 ml de RPMI 1640 en placa de

24 pocillos. Para la infección se incubaron con 1 ml de una suspensión 1x108 UFC/ml

de B. abortus.

Infección de cultivos celulares

Las células epiteliales respiratorias se infectaron con B. abortus 2308 a MI de 100,

250, 500 o 1000 bacteria/célula durante 2 horas a 37 ºC. Finalizada la incubación las

células fueron lavadas repetidas veces e incubadas con medio completo suplementado

con 100 ug/ml de gentamicina para eliminar las bacterias extracelulares. A diferentes

tiempos luego de la adición de gentamicina (24 y 48 h), los sobrenadantes de cultivo

fueron cosechados y conservados a -80° C para luego determinar TNF-α, IL-1β, IL-8 o

KC, CCl-20 o MCP-1 por ELISAs comerciales, mientras que las células fueron lavadas,

lisadas con Tritón X-100 al 0.2% en agua destilada estéril, y plaqueadas para

determinar el número de UFC.

Infección de explantos

Los explantos de pulmón se infectaron con 108 UFC de B. abortus 2308 durante 24

horas a 37 ºC. A 24 hs se agregó gentamicina a los sobrenadantes e inmediatamente

fueron colectados y conservados a -80° C para luego determinar TNF-α, IL-1β, IL-6,

CCL5, CCL20 o MCP-1 por ELISAs comerciales.

Ensayos de traslocación

Pneumocitos aislados de pulmón humano como se describió anteriormente fueron

cultivados sobre insertos Transwell de 0.4 µm de poro y superficie de 0.33 cm2

previamente recubiertos con colágeno, fibronectina y seroalbúmina bovina, a una

densidad de 150.000 células por filtro durante 11 días. Periódicamente se midió la

resistencia eléctrica transmembrana (TEER) y una vez alcanzado un valor >700 Ω.cm2

(condición donde se establece la monocapa confluente) se realizaron los ensayos de

traslocación.


92

Pasaje paracelular.

Se adicionó B. abortus en el compartimiento superior (cara apical) del cultivo de

pneumocitos (MI 200 bacterias/célula) junto con dextrán de 40 kDa conjugado a FITC

(200µg/ml) en medio de cultivo (medio SAGM suplementado, sin antibióticos). Luego

de 2 o 4 h de incubación se colectó una alícuota de medio del compartimento inferior

(cara basolateral del cultivo) y se plaqueó para realizar recuento de bacterias viables,

mientras que otra alícuota se conservó para medir fluorescencia. Como control se

usaron monocapas celulares tratadas sólo con Dextrán-FITC (sin bacterias) y

Transwell sin monocapa celular (como control de pasaje máximo).

Pasaje transcelular.

Se infectaron monocapas confluentes de pneumocitos cultivados en Transwell con

B. abortus a una MI de 200 bacterias/células y luego de dos horas de incubación se

eliminaron las bacterias extracelulares incubando 40 min a 37°C con medio SAGM

suplementado con gentamicina y estreptomicina. Finalizada la incubación se lavaron

ambos compartimientos, apical y basal, y se adicionó medio sin antibióticos en el basal

y Dextrán-FITC en el superior. Para evaluar el pasaje transcelular se colectó medio

del compartimiento basal a las 24 h p.i. y se plaqueó en TSA para recuento de

bacterias viables. A su vez se midió fluorescencia en el medio colectado para

comprobar la integridad de la monocapa celular.

La presencia de bacteria y ausencia de fluorescencia indica que la bacteria puede

traslocar a través del epitelio o endotelio polarizado sin dañar la integridad de la

barrera celular, lo que sugeriría una ruta transcelular de traslocación. Mientras que la

presencia de bacteria y de Dextrán-FITC en el compartimiento inferior indicaría

traslocación paracelular (con alteración de la permeabilidad de membrana).

93

Resultados


94

B. abortus induce la secreción de citoquinas y quemoquinas en cultivo primario

alveolar humano

Trabajos previos del grupo demuestran que B. abortus es incapaz de estimular la

secreción de citoquinas y quemoquinas en la línea de células alveolares tumorales

A549 mediante la infección directa, aún cuando es capaz de replicar hasta 48 hs p.i.

(Ferrero et al. 2009). Para corroborar la respuesta a B. abortus por parte del epitelio

alveolar humano normal se desarrolló un modelo de cultivo primario de pneumocitos

tipo II humanos provenientes de donantes sanos de pulmón. El cultivo se dejó llegar a

confluencia (aproximadamente 7 días de cultivo) y posteriormente se infectó con B.

abortus 2308 a distintas MI. Para evaluar la respuesta inmune se midió IL-6, IL-8,

CCL20, CCL5 y MCP-1 en sobrenadante de cultivo, y para evaluar la replicación

intracelular de la bacteria las células se lisaron y se realizó recuento de UFC en placa.

Como muestra la Figura 24, B. abortus fue capaz de invadir y replicar

intracelularmente, alcanzando el máximo de UFC intracelulares hacia las 48 h p.i. y la

mayor tasa de replicación durante las primeras 24 hs p.i. A 72 hs p.i. existe un

descenso marcado en el recuento de bacterias intracelulares, llegando hasta valores

menores que los iniciales.

Las células respondieron a la infección por B. abortus secretando quemoquinas

como CCL-20, IL-8 y MCP-1 de manera MI dependiente. IL-8 aumentó en respuesta a la

infección de manera significativa para todas las MI ensayadas a 24 y 48 h p.i., con

mayores niveles a las 48 h p.i. Por otro lado, CCL20 sólo registró un aumento

significativo a 24 h p.i. cuando se infecta con una MI de 1000 bacterias/células. A 48 h

los niveles se vuelven significativos para todas las MI. Los niveles de MCP-1 e IL-6

permanecen no significativos respecto del control a 24 h p.i. y a 48 h p.i. sólo las

células infectadas con MI de 1000 bacterias/células aumentan la secreción respecto

de los controles. No se detectaron niveles significativos de IL-1β o de TNF-α (no

mostrado)


95

0 20 40 60 80100

101

102

103

104

h p.i.

UF

C/m

l

NI

250

500

1000

IL-1 N

I25

050

0

1000

IL-1

0

1000

2000

3000

4000

5000

24 48

*

** ****

**

**

IL-8

(p

g/m

l)

NI

250

500

1000

IL-1 N

I25

050

010

00

IL-1

0

2000

4000

6000

24 48

*** ****

***

***

CC

L20 (

pg

/ml)

NI

250

500

1000

IL-1 N

I25

050

0

1000

IL-1

0

5000

10000

15000

24 48

***

*

MC

P-1

(p

g/m

l)

NI

500

1000

IL-1 N

I25

050

0

1000

IL-1

0

1000

2000

3000

4000

5000

*

24 48

*** ***

IL-6

(p

g/m

l)

A

B

Figura 24. A) Replicación de B. abortus 2308 Las células fueron infectadas a una

MI de 250 y a distintos tiempos p.i. lisadas y diluidas para realizar el recuento de

bacterias viables intracelulares por plaqueo en TSA. B) Nivel de expresión de

citoquinas y quemoquinas en respuesta a la infección por cultivo primario de

pneumocitos humanos. Las células fueron infectadas a MI de 250, 500 y 1000 o

estimuladas con 1 ng/ml de IL-1β y 24 o 48 h p.i. los sobrenadantes colectados y las

proteínas medidas por ELISA comerciales. *p<0.05, ** p<0.01,*** p<0.001 respecto de

no infectado (NI) para cada tiempo.


96

B. abortus induce la secreción de quemoquinas en Explantos de pulmón humano

Para lograr una mejor aproximación al parénquima pulmonar se evaluó la

respuesta inmune en un modelo de explantos de pulmones humanos infectados con B.

abortus. Se cosecharon los sobrenadantes de los explantos pulmonares a las 24 h

luego de ser infectados con B. abortus 2308 para la posterior determinación de

citoquinas por ELISA. Los resultados obtenidos mostraron que la infección con B.

Figura 25 Secreción de citoquinas y quemoquinas en modelo de explanto de pulmón

humano. Los sobrenadantes de los explantos de pulmón humano fueron colectados 24 h p.i.,

y las citoquinas medidas por ELISA comerciales. *p<0.05, ** p<0.01,respecto de no infectado

(NI)

NI B. abortus IL-10

1000

2000

3000

4000

*

***

CC

L20 (

pg

/ml)

NI B. abortus IL-10

500

1000

1500

2000

MC

P-1

(p

g/m

l)

NI B. abortus IL-10

200

400

600

800

*

CC

L-5

(p

g/m

l)

NI B. abortus IL-10

100000

200000

300000

400000

**

**

IL-6

(p

g/m

l)

NI B. abortus IL-10

100

200

300*

IL-1

(p

g/m

l)

NI B. abortus IL-10

200

400

600

800

**

**

TN

F-

(p

g/m

l)


97

abortus induce la secreción de CCL20, CCL5, IL-1β y TNF-α, mientras que no se

observan aumentos significativos respecto de control (NI) para MCP-1 (Figura 25). En

el tiempo p.i. evaluado, los niveles de IL-6 se redujeron en los sobrenadantes de

explantos infectados respecto del control y del estímulo con IL-1β.

Ensayo de traslocación de B. abortus en una monocapa confluente de

pneumocitos tipo II humanos.

Como se demostró arriba (figura 24 A), B. abortus puede infectar y replicar en

pneumocitos humanos tipo II. Es posible que estas células puedan actuar como

mediadores del paso de B. abortus hacía el torrente sanguíneo, debido a su

proximidad y su extensa superficie de contacto con los capilares que conforman el

pulmón. Para corroborar esta hipótesis, cultivamos pneumocitos tipo II humanos

primarios en Transwells y, una vez alcanzada la formación de una monocapa

polarizada (determinada por un TEER de más de 1000 Ω.cm2, (Elberts et al. 1999;

Fuchs et al. 2003)), aproximadamente a los 11 días de cultivo, se evaluó el pasaje

paracelular (pasaje por el espacio adyacente a las células) y el transcelular (pasaje

transitando por el interior de las células).

Pasaje paracelular

Para evaluar el pasaje paracelular, se depositó en el lado apical de las células una

suspensión de B. abortus equivalente a una MI de 100 bacterias/células junto con una

solución de dextrán marcado con FITC. A las 2 y 4 h post administración se colectó

medio del compartimiento inferior (cara basolateral), se diluyó y se plaqueó en placas

de TSA para determinar el número de bacterias viables.

Los resultados mostrados en la figura 26 y en la tabla 2 indican que Brucella

abortus puede traslocar las monocopas de pneumocitos humanos. Luego de 2 y 4 h

p.i., se recuperan UFC en el compartimiento basal que es acompañado de un aumento

en la permeabilidad al dextrán-FITC, lo que sugiere disrupción de la monocapa. La

bacteria pasa eficientemente a través de los poros del inserto Transwell, como se ve

en los recuentos del filtro sin células, usado como control de pasaje máximo.


98

Fluorescencia Dextran-FITC

0

1000

2000

3000

400010000

20000

30000

40000NI

I 2h

I 4h

S/C 2 h

S/C 4 h*

Un

idad

es a

rbit

rari

as

UFC/ml en compartimiento basolateral

0

100

200

300

400

500

8000

10000

12000

14000 2 h

4 h

S/C 2 h

S/C 4 h

UF

C/m

l

A B

2 h p.i. 4 h p.i.

Unidades arbitrarias de fluorescencia

UFC Unidades

arbitrarias de fluorescencia

UFC

No infectado 734 534 B. abortus 2018 208 225 106 3171 303 363 124 Sin células 36751 10000 31375 11250

Pasaje transcelular.

Para evaluar el pasaje transcelular, monocapas de pneumocitos humanos se

infectaron con B. abortus a una MI de 100 bacterias/células y luego de 2 h se eliminó

las bacterias extracelulares con gentamicina durante 40 minutos, de manera que la

únicas bacterias viables remanentes fuesen aquellas que se encontraban en el

compartimiento intracelular. Luego de 24 h, se colectó medio del compartimiento

basal y se plaqueó sobre placas de TSA. También se realizó recuento de las bacterias

intracelulares como control.

TABLA 2 Fluorescencia y recuento de bacterias viables en medio del compartimiento basal a 2 y 4 hs.

Figura 26 A) Fluorescencia en medio del compartimiento basal. NI, no infectado, I,

infectado, S/C Sin células. B) Recuento de bacterias viables en medio del compartimiento

basal a 2 y 4 hs. *p<0.05, respecto de no infectado (NI)


99

Como muestra la tabla 3, la infección de la monocapa fue exitosa, pero no se

detectó recuento de bacteria viable en el compartimiento basal. Estos resultados

indican que B. abortus no tiene la capacidad de translocar el epitelio por la vía

transcelular.

Unidades

arbitrarias de

fluorescencia

UFC medio

basal

UFC

intracelulares

Basal 2714 778 - -

B. abortus 5048 2060 0 150 106

Sin células 105371 3,1x105 -

TABLA 3 Fluorescencia en medio del compartimiento basal.y recuento de bacterias

viables a 24 hs.

100

Discusión


101

Las células epiteliales de las vías aéreas son una de las primeras barreras con las

que se encuentran los patógenos transmitidos por aire. No solo actúan como barrera

física, si no que pueden iniciar la respuesta inmune mediante la detección del

patógeno y la consecuente secreción de mediadores solubles como las citoquinas y

quemoquinas(Sha et al. 2004; Mayer & Dalpke 2007).

Trabajos previos del grupo demostraron que la línea celular A549 (pneumocitos

tipo II de origen tumoral humano) no secreta las quemoquinas IL-8 o MCP-1 en

respuesta a la infección con B. abortus, a pesar de que la bacteria es capaz de replicar

eficientemente dentro de ellas (Ferrero et al. 2010; Ferrero et al. 2009). En este

capítulo demostramos que el cultivo primario de pneumocitos tipo II también es

permisivo a la replicación de B. abortus, pero es capaz de responder con aumento de

secreción de IL-8 a diferencia de la línea A549. En cambio, los niveles de MCP-1 y de

otras cuatro citoquinas analizadas (CCL20, IL-6, IL-1β y TNF-α) no se diferenciaron

significativamente de los controles no infectados a 24 h p.i. aunque si se

incrementaron en respuesta al estímulo con IL-1β. Sólo se registaron algunos

aumentos significativos de estas citoquinas a las 48 h p.i. y para multiplicidades de

infección elevadas. Estos resultados indican que las células epiteliales alveolares son

pobres respondedoras frente a la infección por B. abortus, en concordancia con los

estudios in vitro realizados previamente por el grupo con células A549.

El ambiente pulmonar se constituye de numerosas células que interactúan entre sí

y con la matriz extracelular, generando redes de complejas dependencias e

interacciones que determinan finalmente el resultado de la respuesta inmune. Para

abordar la problemática de la interacción de Brucella con el pulmón humano

decidimos utilizar un modelo de explantos de tejido pulmonar humano. Estos modelos

se han utilizado para el estudio de otros patógenos pulmonares(Jäger et al. 2014;

Nicholas et al. 2015). Para ello analizamos la secreción de citoquinas y quemoquinas

en sobrenadante de cultivo de explantos. Similarmente a los resultados obtenidos en

infecciones de pneumocitos tipo II, existe un aumento leve de las quemoquinas CCL20

y CCL5 en respuesta a la infección, mientras que MCP-1 no se modula. Además,

aumentan moderadamente los niveles de citoquinas proinflamatorias como IL-1β o


102

TNF-α. Esto concuerda con un perfil proinflamatorio leve. Nuestros resultados

muestran una disminución en los niveles de IL-6 en los explantos infectados con B.

abortus. La implicancia de esta disminución es difícil de predecir, debido a su rol

controvertido en inflamación pulmonar (Yu 2002)

La diferencia entre los perfiles de secreción de citoquinas entre el modelo de

explanto y el cultivo celular es evidente, y es importante el subsecuente estudio de las

otras células que componen pulmón como macrófagos alveolares y células

endoteliales y la relevancia de los factores secretados en la respuesta inmune final.

Trabajos previos del grupo han demostrado que factores solubles secretados por

monocitos de la línea humana THP-1 pueden inducir la secreción de citoquinas y

quemoquinas en líneas de células epiteliales humanas (Ferrero et al. 2010). Si bien

existen diferencias fenotípicas y funcionales entre estos monocitos y los macrófagos

alveolares, es un fuerte indicio predictivo de lo que puede ocurrir.

Estos resultados representan la continuación del estudio de la interacción entre

Brucella y el epitelio respiratorio humano, demostrando que la bacteria produce una

respuesta inmune levemente proinflamatoria en tejido y cultivo de células humanas.

Brucella puede colonizar distintos órganos desde su entrada por pulmón. Una de

las preguntas fundamentales respecto de este fenómeno es cómo hace la bacteria para

atravesar la barrera epitelial pulmonar desde su sitio de ingreso inicial (el lumen

alveolar o bronquial). Existen estudios que demuestran que puede ser transportada

por macrófagos alveolares en primera instancia y luego por células dendríticas hacia

los ganglios mesentéricos, mecanismo denominado “Caballo de Troya”(Archambaud

et al. 2010). Sin embargo, es posible que existan otros mecanismos de traslocación

actuando en simultáneo. Debido a la anatomía de los alvéolos pulmonares, la distancia

que separa la luz alveolar de los capilares sanguíneos es muy poca (0,4 µm), con lo que

una pequeña disrupción implicaría inmediato acceso a la circulación sistémica. Es por

esto que se evaluó la posibilidad que B. abortus pueda atravesar una monocapa

confluente de pneumocitos humanos, ya sea de manera paracelular, alterando las

uniones intercelulares, o transcelular, ingresando por el lado apical de las células,


103

transitándolas y egresando por el lado basal. Estudios previos del grupo demostraron

que Brucella no es capaz de traslocar paracelular o transcelularmente una monocapa

polarizada de células 16HBE14o-, que se consideran como el mejor modelo de epitelio

bronquial respiratorio humano (Ferrero, Tesis Doctoral, 2010), pero restaba realizar

los estudios con monocapas de pneumocitos primarios.

Nuestros resultados muestran que Brucella es capaz de atravesar

paracelularmente la monocapa de pneumocitos humanos, ya que se detectan bacterias

viables en el medio basal luego de 2 y 4 h de incubación con la bacteria en el lado

apical. Además acompaña a este pasaje un aumento en la permeabilidad a dextrán,

macromolécula usada como control de integridad de epitelio. No detectamos pasaje

transcelular a 24 h p.i., a pesar de que las células se infectaron exitosamente. Es

posible que el pasaje paracelular ocurra en las infecciones in vivo, ya que en la

histología de la infección intratraqueal murina se observó extravasación de hematíes

hacia la luz alveolar, sugiriendo incremento en la permeabilidad epitelio alveolar.

Ambos resultados sugieren la posibilidad de que haya un mecanismo de disrupción de

las uniones estrechas del epitelio alveolar pulmonar activo por Brucella durante la

infección, que deberá seguir siendo investigado. Los resultados obtenidos sugieren

que además del mecanismo de caballo de Troya, ya demostrado por Archambaud et al,

podrían existir otros mecanismos para la diseminación sistémica de B. abortus.

104

Capítulo 3

Respuesta antimicrobiana pulmonar frente a infecciones con

B. abortus

105

Introducción


106

Las células epiteliales de las vías aéreas son las primeras células que entran en

contacto con los microorganismos inhalados, y por lo tanto están preparadas para

montar respuestas inmunes rápidas. Como mencionamos previamente, el epitelio

respiratorio responde a la presencia de patógenos con una respuesta inflamatoria, (Li

et al. 2012; Sha et al. 2004), la cual puede ser aumentada por la acción estimulatoria

de las citoquinas secretadas por los macrófagos alveolares(Marriott et al. 2012; Ishii

et al. 2005; Korpi-Steiner et al. 2010).

Los factores producidos por el epitelio respiratorio en respuesta a la infección

incluyen beta-defensinas, péptidos antimicrobianos pequeños que pueden ser

encontrados en los fluidos respiratorios junto con otros componentes

antimicrobianos, como la lisozima y la catelicidina. La beta-defensina 2 (hBD2) es la

defensina más expresada en pulmón, y su expresión es estimulada durante las

infecciones o inflamación (Doss et al. 2010). Todas las defensinas son péptidos

catiónicos pequeños con propiedades microbicidas que contienen 6 residuos de

cisteína altamente conservados que forman tres puentes disulfuro intramoleculares.

Se ha postulado que estos péptidos interaccionan electrostáticamente con las cargas

negativas de la superficie de las membranas celulares, de las cuales son responsables

el LPS y algunos componentes de bacterias gram positivas. Esto lleva a una alteración

de la estructura de la membrana y a la creación de un poro que genera la filtración del

contenido celular (Lai & Gallo 2009). La hBD2 es efectiva contra varios patógenos in

vivo incluidos Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa, Klebsiella pneumonie, entre

otros (Pazgier et al. 2006).

El epitelio respiratorio también responde a las infecciones con la producción de

varias quemoquinas incluida CCL20. Es un potente quimioatractante de células

dendríticas inmaduras, linfocitos T de memoria y linfocitos B. CCL20 y su receptor

específico CCR6 median el reclutamiento in vivo de células dendríticas y linfocitos en

varios tejidos, incluyendo el pulmón (Osterholzer et al. 2005; Phadke et al. 2007;

Thomas et al. 2007). El repertorio de células con receptor CCR6 también incluyen a

células Th17 (Hirota et al. 2007), hecho relevante para la respuesta inmune a agentes

infecciosos.


107

hBD2 y CCL20 comparten ciertas características. Ambos factores interactúan con

el receptor CCR6 (Ghannam et al. 2011; Röhrl et al. 2010; Yang et al. 1999; Barabas et

al. 2013) y como consecuencia hBD2 puede quimioatraer a linfocitos T de memoria,

células dendríticas inmaduras, mastocitos y neutrófilos (Yang et al. 1999; Niyonsaba

et al. 2002; Niyonsaba et al. 2004). En contraste, aunque CCL20 fue descripta

inicialmente como quemoquina, estudios recientes demostraron que esta molécula

puede tener actividad antimicrobiana frente a bacterias Gram positivas y Gram

negativas (Starner et al. 2003; Yang et al. 2003; Chan et al. 2008).

Debido a sus propiedades quimiotácticas y antimicrobianas, se postula que ambas

tienen un rol importante en la respuesta inmune innata pulmonar a patógenos

inhalados. (Ito et al. 2011; Schutte & McCray 2002; Tecle et al. 2010) Varios estudios

han demostrado la producción de hBD2 en varios tejidos en respuesta a infecciones,

sin embargo nada se sabe de la producción de hBD2 o CCL20 en la infección de células

epiteliales de pulmón en respuesta a la infección por Brucella, ni de las actividades

antimicrobianas de estas sustancias frente a este patógeno. Decidimos investigar estos

aspectos para ampliar la caracterización de la respuesta innata pulmonar a la

infección por B. abortus.

108

Materiales y métodos

Capítulo 3 –Materiales y Métodos

109

Cultivo celular.

La línea celular A549 (pneumocitos tipo II humanos) fue crecida en DMEM

suplementado con 10% SFB, 2mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina 100 ug/ml

de estreptomicina. Las células Calu-6 fueron crecidas en RPMI 1640 suplementado de

la misma forma.

Para los ensayos de infección todas las células epiteliales fueron sembradas a una

densidad de 2x105 células en placas de 24 pocillos y cultivadas en atmosfera con 5%

de CO2 a 37°C en medio suplementado sin antibióticos.

Aislamiento de monocitos humanos de sangre periférica.

La sangre de donantes anónimos fue diluída al medio y separada mediante

gradiente estándar de Fycoll-Hipaque. Luego de obtenida la capa enriquecida en

células mononucleares, se contaron en cámara de Neubauer y se sembraron en placas

de plástico de 48 pocillos a razón de 1x106 células/pocillo. Luego de 2 h de incubación

a 37°C y 5% de CO2 se lavaron las células no adheridas múltiples veces con PBS. Las

células remanentes fueron mayoritariamente monocitos.

Explantos de pulmón humanos.

Las muestras de tejido humano pulmonar fueron obtenidas de zonas saludables y

normales del tejido marginal de seguridad que se extrae junto a los tumores pulmones

durante las cirugías. Las muestras fueron cedidas por la Unidad de Trasplante

Pulmonar del Hospital Favaloro, a través de un convenio de colaboración entre esta

institución y el CONICET (protocolo N°3099). Para obtener los explantos el tejido

pulmar fue cortado en fragmentos de aproximadamente 1 cm3 que fueron cultivados

en 1 ml RPMI 1640 en placa de 24 pocillos. Para la infección se incubaron con 1 ml de

una suspensión 1x108 UFC/ml de B. abortus.

Aislamiento de células primarias de pulmón

Los pneumocitos tipo II fueron aislados de tejido pulmonar obtenido como se

describió arriba, siguiendo procedimientos publicados (Murphy et al. 1999).


110

Brevemente, los tejidos fueron lavados con Solución A (0.130 M NaCl, 5.2 mM KCl,

10.6 mM HEPES, 2.6 mM Na2HPO4, 10 mM D-glucosa, pH 7.4) para remover el exceso

de sangre y contaminaciones. Luego el tejido fue picado en piezas de 1 mm de grosor.

El tejido fue digerido con tripsina (0.5% en solución A adicionado con 1.9 mM CaCl2 y

1.29 mM de MgSO4) y luego incubado a 37°C durante 20 minutos en agitación. El

digesto fue filtrado a través de una malla de 100 µm y colectado sobre SFB

conteniendo DNAsa (400 U/ml, Sigma). Esta suspensión se filtró por una malla de 40

µm. El filtrado fue centrifugado y el pellet enriquecido con pneumocitos tipo II fue

resuspendido en medio de cultivo y dispensado sobre placas de 6 pocillos para

permitir la adhesión de leucocitos y células adherentes contaminantes. Las placas

fueron incubadas en la estufa a 37º C durante 2 h. Finalizada la incubación las células

no adherentes fueron colectadas y separadas en un gradiente de densidad discontinuo

de Percoll (1.089 g/ml y 1.040 g/ml). La capa celular interfacial enriquecida en

pneumocitos tipo II fue colectada y lavada dos veces con Solución A. Las células fueron

contadas por exclusión con azul Trypan y sembradas en placas de 48 pocillos

previamente tratadas con colágeno de tipo I bovino, seroalbúmina bovina y

fibronectina humana. Las células se dejaron adherir durante 36 h, luego el medio de

cultivo fue cambiado cada 48 h hasta llegar a confluencia (5 a 6 días).

Infecciones celulares.

Las infecciones de las células respiratorias con Brucella fueron realizadas a

distintas multiplicidades de infección (MI). Luego de dispensar la suspensión

bacteriana, las placas fueron centrifugadas y posteriormente incubadas durante 2

horas a 37 °C. Al finalizar la incubación, cada pocillo fue lavado tres veces con PBS

estéril. Para eliminar las bacterias intracelulares, las monocapas infectadas se

incubaron con medio suplementado con gentamicina y estreptomicina (100 µg/ml y

50 µg/ml respectivamente). A diferentes tiempos p.i. los sobrenadantes de cultivo

fueron colectados para medir péptidos antimicrobianos por ELISA comerciales.


111

Análisis de la producción de péptidos antimicrobianos en respuesta a

antígenos

Las células fueron cultivadas en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 x 105

células/pocillo y luego estimuladas con distintos antígenos de B. abortus (HKBA, LPS,

L-Omp19) o con agonistas TLR (LPS de E. coli y Pam3CSK4). Los cultivos fueron

incubados durante 24 h. Luego, los sobrenadantes fueron cosechados y conservados a

-70°C hasta ser analizados.

Estimulación con medio condicionado.

La línea premonocítica humana THP-1 fue infectada con B. abortus a una MI de

100 bacterias/célula durante 2 h y luego lavada con PBS para eliminar bacterias

extracelulares. El medio condicionado de monocitos fue cosechado a 24 h p.i.,

esterilizado mediante el filtrado a través de filtros de nitrocelulosa de poro 0.22 µm y

usado para estimular células epiteliales. El medio condicionado de THP-1 no

infectadas fue usado como control.

Para la estimulación, el medio condicionado fue usado en diluciones 1/2, 1/5 o

1/10. Luego de 24 h post-estimulación los sobrenadantes de los cultivos fueron

cosechados para medir péptidos antimicrobianos. Para calcular la secreción específica

por parte de los cultivos, los niveles ya presentes en los medios condicionados

utilizados para estimular fueron sustraídos. Los experimentos de neutralización

fueron realizados con el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1Ra) o con un anticuerpo

neutralizante anti- TNF-α humano. Las células epiteliales fueron pre-incubadas por 1

h con IL-1Ra antes de la adición del medio condicionado. Para el ensayo de inhibición

de TNF-α, el medio condicionado de células THP-1 fue preincubado con el anticuerpo

1 h previa a su adición a las células epiteliales.

PCR semicuantitativa.

Los niveles de transcripción de ARNm para hBD2 fueron determinados mediante

PCR semicuantitativa usando primers descriptos previamente. Las células epiteliales

fueron lavadas con PBS y el RNA total fue aislado usando TRIzol. La transcripción


112

reversa de 2 µg ARN total se realizó con reactivos y métodos estándard. El ADN copia

correspondiente a 200 ng de ARN fue amplificado mediante PCR conteniendo 1 mM de

primers específicos para hBD2 con un indicador de copia, gliceraldehido-3-fosfato

deshidrogenasa (GAPDH). Los productos fueron visualizados mediante una

electroforesis en gel de agarosa 2% y SYBRsafe. La especificidad del fragmento

amplificado fue corroborada mediante secuenciación.

Ensayos de actividad antimicrobiana

Para realizar los ensayos antimicrobianos se utilizaron 104 UFC en crecimiento

exponencial de B. abortus 2308, B. abortus RB51 o E. coli 25922 en buffer fosfato 10

mM pH 7.4. Las bacterias fueron incubadas con CCL20, hBD2 o hBD3 recombinantes

(PeproTech, Rocky Hill, NJ) a distintas concentraciones finales (0.1 a 50 μg/ml)

durante 2h a 37°C. Luego, fueron diluidas y plaqueadas en TSA para realizar el

recuento de UFC.

113

Resultados


114

B. abortus induce secreción de CCL20 pero no de hBD2 en células

epiteliales respiratorias y macrófagos.

Dado que varios patógenos estimulan la producción de hBD2 y CCL20 por parte de

las células epiteliales en respuesta a infecciones (Rivas-Santiago et al. 2005; Scharf et

al. 2010b; Harder et al. 2000), quisimos determinar si la infección con B. abortus

estimula la expresión de estos factores.

Los análisis por PCR y ELISA mostraron que B. abortus no induce la expresión ni la

secreción de hBD2 en la línea A549 (Figura 27) o Calu-6 (no mostrado), aunque ambas

líneas fueron capaces de responder a IL-1β con un aumento en la expresión del ARNm

para hBD2.

En contraste, la infección con B. abortus aumentó la secreción de CCL20 de forma

dependiente de MI en ambas líneas celulares, aunque los niveles fueron más bajos en

A549. Los niveles de CCL20 producidos por cultivos primarios de pneumocitos

humanos dieron niveles similares a los producidos por Calu-6 (Figura 28).

La producción de hBD2 y CCL20 en respuesta a la infección con B. abortus también

fue evaluada en la línea celular de monocitos THP-1 (Figura 28). La infección de

células THP-1 con B. abortus a una MI de 10 o 100 bacterias/célula no produjo

inducción de la expresión de ARNm de hBD2 a ninguno de los tiempos estudiados. Por

lo contrario, la infección indujo un aumento significativo en la secreción de CCL20 por

parte de monocitos THP-1 de una manera dependiente de la MI. En concordancia con

estos resultados, los monocitos aislados de sangre periférica y los macrófagos

derivados de monocitos produjeron cantidades significativas de CCL20 en respuesta a

la infección con B. abortus.


115

Como detallamos en el Capítulo 1, B. abortus posee dos proteínas Btp que

interrumpen la señalización de receptores TLR por competir con los dominios TIR de

las moléculas de transducción de la señal. Debido a que hBD2 es secretada en

respuesta a diversos patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) como LPS

(Kaiser & Diamond 2000), Pam3CSK4 (Klein-Patel et al. 2006), flagelina (Takahashi et

al. 2001) y motivos CpG del ADN (Platz et al. 2004) decidimos evaluar el rol de las

proteínas Btp de B. abortus en la modulación de la secreción de hBD2. Hasta el

momento no se encuentran reportes de la capacidad moduladora de estas proteínas

en células no fagocíticas o en relación a la modulación de péptidos antimicrobianos.

Para ello infectamos pneumocitos tipo II humanos con B. abortus 2308 (wt) o con una

cepa mutante para las proteínas BtpA y BtpB (B abortus btpAbtpB-), y evaluamos la

expresión de hBD2 como se describió previamente. Como se observa en la Figura 29,

la infección con btpAbtpB- aumentó significativamente la expresión de hBD2 en

pneumocitos humanos con respecto a las células no infectadas o infectadas con wt.

Estos resultados sugieren que las proteínas Btp de B. abortus están implicadas en la

inhibición de la transcripción de hBD2 en células epiteliales respiratorias infectadas.

Figura 27. Las células alveolares humanas no responden a la infección por B. abortus. A549 fueron infectas con B. abortus a diferentes MI. A 24 h p.i. los niveles de mRNA fueron determinados por PCR semicuantitativa y las concentraciones de péptido en los sobrenadantes de cultivo fue determinada por ELISA. ** p<0.01, respecto de no infectado (NI)


116

Calu-6

NI

50 200

500

1000

IL-1

0

200

400

600

800

******

**

MI

**

CC

L20(p

g/m

l)

A549

NI

50 200

500

1000

IL-1

0

30

60

90

3000

6000

MI

***

CC

L20 (

pg

/ml)

NI

200

500

1000

IL-1

0

500

10002000

2500

3000

3500

4000

***

MI

***

Pneumocitos tipo II primarios

CC

L20 (

pg

/ml)

Monocitos

NI

10 50 100

0

100

200

300

MI

***

*****

CC

L20 (

pg

/ml)

THP-1

NI

10 50 100

0

500

1000

1500

2000

MI

***

***

***

CC

L20 (

pg

/ml)

Macrófagos

NI

10 50 100

0

200

400

600

800

1000

MI

***

**

ns

CC

L20 (

pg

/ml)

A B

Figura 28. B. abortus induce la secreción de CCL20 por las células epiteliales de las vías aéreas y monocitos humanos. (A) Calu-6, A549 y pneumocitos tipo II primarios fueron infectados con B. abortus a diferentes MI o estimulados con IL-1β (1ng/ml). (B) THP-1, monocitos humanos derivados de sangre periférica y macrófagos derivados de monocitos fueron infectados con B. abortus a MI de 10 a 100 o no infectados (NI). Los sobrenadantes fueron colectados a 48 h, y los niveles de CCl20 medidos por ELISA. *p<0.05, ** p<0.01,*** p<0.001 respecto de no infectado (NI)


117

NI btpAbtpB- wt0.0

0.1

0.2

0.3

0.4p<0.05

*

hB

D2/G

AD

PH

Como indicamos más arriba, las células epiteliales pulmonares respondieron a la

infección por B. abortus con producción de CCL20. Para ahondar en la importancia

fisiológica de dicha secreción, los niveles de esta quemoquina fueron evaluados en un

modelo de explantos humanos pulmonares. Como se muestra en la Figura 30 a las 24

h p.i. los niveles de CCL20 en los sobrenadantes de cultivo de los explantos infectados

fueron significativamente más altos que aquellos producidos por explantos no

infectados.

NI I0

1000

2000

3000

*

Pulmón 1

CC

L20 (

pg

/ml)

NI I0

1000

2000

3000

*

Pulmón 2

CC

L20 (

pg

/ml)

Figura 30. B. abortus induce la secreción de CCL20 en explantos de tejido de pulmón humano. Muestras de pulmón humano de aproximadamente 1 cm3 de dos donantes distintos fueron incubadas con 108 B. abortus o medio por 24 hs. Los niveles de CCL20 fueron medidos por ELISA en sobrenadantes de cultivo de explantos infectados (I) o no infectados (NI). *p<0.05, respecto de no infectado

.

Figura 29. Las proteínas Btp inhiben el aumento de la transcripción de hBD2.

Pneumocitos primarios humanos fueron infectados con B. abortus 2308 (wt) o con B.

abortus btpAbtpB- (btpAbtpB-). 24 h p.i. se lisaron las células y se midió la expresión de

ARNm específico mediante PCR semicuantitativa. Los valores fueron normalizados

respecto de GAPDH. NI: células no infectadas. *p<0.05, respecto de no infectado (NI)

.


118

La inducción de CCL20 por la infección es mediada por L-Omp19 y no por LPS de B.

abortus

Se evaluó si la viabilidad de B. abortus es necesaria para inducir la producción de

CCL20 por células epiteliales de pulmón y macrófagos. Para ello, se evaluó la

capacidad de Brucella muerta por calor (Heat killed Brucella abortus-HKBA) (Figura

31) para estimular la producción de CCL20. El LPS de E. coli induce la expresión e

CCL20 en distintos tipos celulares, incluidos los pneumocitos tipo II (Thorley et al.

2005; Hosokawa et al. 2005), por ello lo cual se lo empleó como control positivo. La

secreción de CCL20 fue significativamente mayor que los controles en los

sobrenadantes de células A549, THP-1 y Calu-6 estimuladas con 1 x 109 bacterias/ml

de HKBA. Estos resultados sugieren que la secreción de CCL20 puede ser inducida por

un componente estructural de B. abortus. Se ha descripto que las lipoproteínas de

Brucella inducen la producción de citoquinas por parte de distintos tipos

celulares(Giambartolomei et al. 2004; Ferrero et al. 2011). Nuestra hipótesis es que

las lipoproteínas podrían estar involucradas en el aumento de la producción de

CCL20. Para investigar esta hipótesis, estimulamos células A549, Calu-6 y THP-1 con

L-Omp19, lipoproteína modelo de B. abortus, y colectamos los sobrenadantes a las 24

h p.i. para medir CCL20.

Como se muestra en la Figura 31, L-Omp19 induce un aumento significativo en la

secreción de CCL20 de manera dependiente de la MI en los tres tipos celulares

estudiados. La producción de CCL20 también fue evaluada luego de la incubación de

las células con un hexapéptido sintético (Pam3SCK4) que mimetiza la estructura del

dominio lipídico de las lipoproteínas bacterianas. En contraposición, el LPS de B.

abortus no indujo producción de CCL20 incluso cuando se lo utilizó a alta

concentración (5 µg/ml). En conjunto, estos resultados indican que las lipoproteínas

de B. abortus están involucradas en la inducción de la secreción de CCL20 por parte de

células epiteliales pulmonares y monocitos en contacto con la bacteria


119

TLR2 media la secreción de CCL20 por las células bronquiales y monocitos

infectados con B. abortus

Nuestros resultados indican que las lipoproteínas de Brucella pero no su LPS

inducen la secreción de CCL20 por células epiteliales pulmonares y monocitos, por lo

cual hipotetizamos que TLR2 podría llegar a estar involucrado en la red de

señalización que lleva a la secreción de CCL20. Para evaluar esta hipótesis, monocitos

THP-1 y células epiteliales Calu-6 fueron incubadas con un anticuerpo bloqueante

anti-TLR2 antes de la infección con B. abortus. El bloqueo de TLR2 redujo

significativamente la secreción de CCL20 en las células infectadas (67.5% de

inhibición para Calu-6 y 77.9% para THP-1) mientras que la incubación con el control

de isotipo no modificó la secreción de CCL20 en ningún tipo celular (Figura 32).


120

A549

NE 9

10

810

710 5 1 5 1

0.1 1

0.1 1

0.1

0

100

200

300

400

HKBA P3CLPS Ba LPS Ec

**

**

**

**

OMP

*

CC

L20 (

pg

/ml)

Calu-6N

E 91

0

81

0

71

0 5 1 5 1

0.1 1

0.1 1

0.1

0

250

5001000

3000

HKBA P3CLPS Ba LPS Ec

**

**

**

**

OMP

**

CC

L20

(p

g/m

l)

THP-1

NE 9

10

81

0

71

0 5 1 5 1

0.1 1

0.1 1

0.1

0

2000

4000

6000

8000

10000

**

**

**

****

HKBA P3CLPS Ba LPS EcOMP

CC

L20

(p

g/m

l)

Figura 31. Producción de CCL20 por células epiteliales pulmonares y monocitos en

respuesta a antígenos de B. abortus y agonistas de TLR. Las células fueron estimuladas

con Brucella muerta por calor (HKBA), L-OMP19 (OMP), LPS de B. abortus (LPS Ba) o

agonistas TLR como LPS de E. coli (LPSEc) o el hexapéptido (P3C). La concentración

en el sobrenadante de cultivo fue determinada por ELISA. *p<0.05, ** p<0.01,

respecto de no estimulado (NE)


121

NI anti TLR-2 Isotipo0

200

400

600

Calu-6

B. abortus

ns

****** ***

*

CC

L20 (

pg

/ml)

NI anti TLR-2 Isotipo0

500

1000

1500

2000 *** ***

*

ns

***

THP-1

B. abortus

CC

L20 (

pg

/ml)

Figura 32. TLR2 media la secreción de CCL20 por las células bronquiales y monocitos infectados con B. abortus. Calu-6 y THP-1 fueron preincubadas con el anticuerpo neutralizante contra TLR-2 o con un control de isotipo durante 1 h a 37°C previo a la infección con B. abortus. Los sobrenadantes de cultivo fueron colectados 24 h p.i. y medidos por ELISA. *p<0.05, *** p<0.001 respecto de no infectado (NI)

.


122

Factores secretados por monocitos infectados con B. abortus aumentan la

secreción de CCL20 y hBD2 por las células epiteliales alveolares.

Se ha demostrado que las células epiteliales secretan CCL20 y hBD2 en respuesta a

citoquinas inflamatorias como TNF-α e IL-1β (Harder et al. 2000; Reibman et al.

2003). En el pulmón los macrófagos alveolares residentes y los monocitos reclutados

a los focos de infección pueden responder a B. abortus con citoquinas proinflamatorias

que, a su vez, podrían estimular la producción de CCL20 y hBD2 por las células

epiteliales. Para evaluar esta hipótesis, células A549 fueron estimuladas con distintas

diluciones de medio condicionado de monocitos THP-1 infectados con B. abortus

(MCI). Luego de 24 h post estimulación se midió CCL20 y hBD2 en los sobrenadantes

de las células estimuladas. En paralelo, otras células fueron estimuladas con las

mismas diluciones de sobrenadante de monocitos no infectados. Los niveles de CCL20

y de hBD2 presentes en los MCI fueron restados para determinar la secreción

específica.

Como se muestra en la Figura 33, las células A549 produjeron CCL20 en respuesta

al estímulo con MCI en forma dependiente de la dosis (dilución) de este medio

condicionado. En cambio, el estímulo con medio condicionado de monocitos THP-1 no

infectados (MCNI) no produjo cambios significativos en la secreción de CCL20.

Mientras que no se había detectado transcripción de ARNm de hBD2 en las células

A549 infectadas directamente con B. abortus, la estimulación de estas células con MCI

logró inducir un aumento de la transcripción. Para correlacionar los niveles de

transcripción con la concentración de proteína, se midió hBD2 en sobrenadantes de

cultivo de las células epiteliales. Como se muestra en la Figura 33, la adición de medio

condicionado de monocitos THP-1 no infectados (MCNI) no estimula la secreción de

hBD2 respecto del basal, mientras que la estimulación con MCI aumentó la secreción

de esta defensina. Estos datos sugieren que la secreción de hBD2 por células

estimuladas con MCI es mayor que la observada cuando estas células son infectadas

directamente con B. abortus.


123

Figura 33. Factores secretados por monocitos infectados con B. abortus pueden aumentar la secreción de CCL20 y hBD2 por parte de las células alveolares epiteliales, Las células fueron expuestas a diferentes diluciones de MCI y luego de 24 h los niveles de transcripción y la concentración de CCL20 y hBD2 fueron medidos en los sobrenadantes de cultivo. *p<0.05, ** p<0.01 respecto de no infectado (NI)

.


124

Teniendo en cuenta que TNF-α e IL-1β inducen la secreción de CCL20 y hBD2 en

células alveolares pulmonares (Harder et al. 2000; Reibman et al. 2003; Tsutsumi-

Ishii & Nagaoka 2003), y que ambas citoquinas son secretadas por macrófagos

infectados con B. abortus (Ferrero et al. 2010; Ferrero et al. 2014), estas citoquinas

fueron consideradas candidatos para mediar los efectos del MCI. Para evaluarlo, se

utilizó un anticuerpo neutralizante contra TNF-α y el antagonista del receptor de IL-1,

IL-1Ra. El pretratamiento del MCI con el anticuerpo anti-TNF-α no reduce la secreción

de CCL20 o de hBD2 en las células pulmonares (Figura 34). Sin embargo, el

tratamiento de las células A549 con IL-1Ra antes de la estimulación con MCI redujo la

secreción de CCL20 en un 48.3% y 86% para las diluciones 1/5 y 1/2

respectivamente. La secreción de hBD2 por las células estimuladas con MCI también

fue reducida en un 63.6% luego del tratamiento con IL-1Ra, mientras que los niveles

de ARNm bajaron hasta niveles no detectables. Estos resultados sugieren que IL-1β es

esencial para la secreción de CCL20 y hBD2 en células A549 estimuladas con MCI.

Actividad antimicrobiana

Se probó la actividad antimicrobiana de los péptidos CCL20 y hBD2 frente a B.

abortus usando un ensayo de recuento de UFC luego de la incubación durante dos

horas de 104 UFC en buffer fosfato 10 mM con distintas concentraciones de los

péptidos. La dosis letal 50 (DL50, aquella que elimina la mitad de las UFC) de CCL20

para B. abortus fue mayor a 50 µg/ml (Figura 35). La capacidad de CCL20 de eliminar

E. coli 25922 también fue evaluada como control positivo. La DL50 para E. coli fue 1.5

µg/ml. Dada la resistencia de B. abortus a CCL20 evaluamos si la presencia del

lipopolisacárido O del LPS podría tener un efecto protectivo. Para probar esto,

evaluamos la actividad antimicrobiana de CCL20 contra B. abortus RB51, una cepa

vacunal que carece el lipopolisacárido O. Como se ve en la Figura 35, CCL20 tuvo una

DL50 de 8.7 µg/ml para B. abortus RB51, sugiriendo que el lipopolisacárido O está

involucrado en la resistencia de B. abortus a los efectos de CCL20.

También se estudió la actividad antimicrobiana de hBD2 y hBD3 contra las

distintas cepas de B. abortus. En el caso de B. abortus 2308 ninguno de los péptidos


125

logro disminuir la cantidad de UFC a las concentraciones ensayadas (hasta 50 µg/ml),

mientras que cuando se coincubó B. abortus RB51 con hBD3 se observó una

disminución de las UFC a la mayor concentración ensayada.

Figura 34. IL-1β media el aumento de CCL20 y hBD2 en células alveolares estimuladas con MCI. A549 fueron preincubadas con IL-1Ra por 1 h a 37°C antes de la estimulación con el medio condicionado de THP-1 infectadas con B. abortus. 24 h post-estimulación se midieron los niveles de CCL20 y hBD2 en los sobrenadantes de cultivo y los niveles de expresión de hBD2 en las células. NE: sobrenadantes de células no estimuladas ** p<0.01,*** p<0.001 respecto de no estimulado (NI)


126

B.abortus 2308

0 0,1 1 10 500.0

0.5

1.04

5

6

hBD2 (g/ml)

log

(U

FC

/po

cill

o)

B. abortus RB51

0 0.1 1 10 500.0

0.5

1.04

5

6

hBD2(ug/ml)

log

(U

FC

/po

cill

o)

E. coli 25922

0 0,5 5100

101

102105

106

*

hBD2(ug/ml)

UF

C/p

ocill

o

B. abortus 2308

0 0,1 1 10 500

1

2

3

4

5**

CCL20 (ug/ml)

log

(U

FC

/po

cill

o)

B. abortus RB51

0 0,1 1 10 500

1

2

3

4

5

*

***

***

CCL20 (ug/ml)

log

(U

FC

/po

cill

o)

E. coli 25922

0 0,1 1 10 500

1

2

3

4

5

* **

CCL20 (ug/ml)

log

(U

FC

/po

cill

o)

B. abortus 2308

0 0,1 1 10 500

1

2

34.0

4.5

5.0

hBD3 (ug/ml)

log

(UF

C/p

ocill

o)

B. abortus RB51

0 0.1 1 10 500

1

2

3

4

5

6

****

hBD3 (ug/ml)

log

(UF

C/p

ocillo

)

E. coli 25922

0 0.5 50

1

2

34.0

4.5

5.0

5.5

6.0

***

hBD3 (ug/ml)

log

(UF

C/p

ocill

o)

Figura 35. Actividad antimicrobiana de CCL20 y hBD2. B. abortus 2308, B. abortus RB51, y E. coli 25922 fueron incubadas con diferentes concentraciones de los péptidos antimicrobianos durante 2 h en buffer fosfato 10 mM y luego las UFC determinadas por plaqueo en TSA. *p<0.05, ** p<0.01,*** p<0.001 respecto concentración 0 µg/ml.

.

127

Discusión


128

Los péptidos antimicrobianos son considerados un componente de defensa

importante del húesped en las superficies mucosas, incluido el pulmón. Las beta-

defensinas producidas por las células epiteliales respiratorias y los macrófagos

alveolares son secretadas al líquido de la superficie del tubo respiratorio, y aumentan

sus niveles durante los procesos inflamatorios e infecciosos. Además de su actividad

antimicrobiana directa, las beta-defensinas tienen múltiples roles como mediadores

de la inflamación(Schutte & McCray 2002; Tecle et al. 2010; Bals 2000). Asimismo, se

ha demostrado que CCL20 es producida por las células epiteliales de pulmón y puede

ser inducida por algunas infecciones.(Starner et al. 2003; Sim et al. 2009; Thorley et al.

2005) Diversos estudios han sugerido que en el pulmón, CCL20 no sólo puede ejercer

actividades quimiotácticas sobre linfocitos y células dendríticas(Grahnert et al. 2014),

sino que también puede exhibir actividad antimicrobiana(Starner et al. 2003). A pesar

de los roles conocidos de CCL20 y hBD2 en la defensa pulmonar contra infecciones y

la habilidad de Brucella spp. para infectar hospedadores por vía inhalatoria, nada se

sabe de la expresión de estas moléculas en células epiteliales de pulmón infectadas y

su actividad antimicrobiana contra este patógeno.

Los resultados indican que B. abortus induce la expresión de CCL20 en líneas

celulares alveolares humanas (A549) o bronquiales (Calu-6) y también en células

alveolares primarias obtenidas de pulmones humanos. Estos resultados están en

concordancia con otros reportados para células epiteliales de las vías aéreas

infectadas por otros patógenos (Sim et al. 2009; Park et al. 2010; Yamamoto et al.

2012) o estimuladas con antígenos microbianos (Pichavant et al. 2006; Van Maele et

al. 2014). CCL20 también es producida por monocitos/macrófagos en respuesta a

infecciones o antígenos microbianos. Esto puede ser relevante durante infecciones

pulmonares dada la presencia de macrófagos alveolares residentes y el reclutamiento

de monocitos por quemoquinas inflamatorias. En particular, estudios previos han

mostrado que células epiteliales pulmonares producen MCP-1, un quimioatractante

para monocitos(Ferrero et al. 2010). En este capítulo demostramos que la línea

monocítica THP-1, así como también monocitos y macrófagos derivados de monocitos

primarios responden a la infección por B. abortus con un incremento en la producción


129

de CCL20. Además, la misma respuesta se vió en explantos de tejido humano infectado

con B. abortus ex vivo, sugiriendo fuertemente que el aumento en la secreción de

CCL20 puede ocurrir en pulmones de pacientes infectados.

Conjuntamente estos resultados sugieren que los distintos tipo celulares pueden

responder a la infección con B. abortus con producción de CCL20, contribuyendo

potencialmente al reclutamiento de linfocitos y células dendríticas hacia el sitio de

infección. Los niveles alcanzados por las células epiteliales, monocitos, macrófagos y

explantos son compatibles con los reportados para la quimiotaxis de células

dendríticas y linfocitos (Thorley et al. 2005; Miao et al. 2012; Baggetta et al. 2010;

Hirota et al. 2007)

La inducción de CCl20 por B. abortus parece ser independiente de la viabilidad

celular, debido a que también fue inducida por HKBA en A549, Calu-6 y THP-1. Estos

resultados concuerdan con estudios previos donde muestran la inducción de

diferentes citoquinas y quemoquinas por HKBA en distintos tipos celulares

(Giambartolomei et al. 2004; Ferrero et al. 2011). Además, esos estudios demostraron

que las respuestas inducidas por HKBA fueron mediadas por lipoproteínas de B.

abortus y no por su LPS. Nuestros resultados concuerdan con esos estudios debido a

que encontramos que CCL20 se secreta en respuesta a la estimulación con L-Omp19

pero no al LPS de Brucella. También en concordancia con esos estudios, la respuesta

es dependiente de TLR2. La incapacidad del LPS de B. abortus de inducir secreción de

CCL20 concuerda con la baja actividad proinflamatoria descripta para esta molécula,

debida principalmente a su inusual lípido A (Giambartolomei et al. 2004; Goldstein et

al. 1992; Qureshi et al. 1994).

Contrariamente a los resultados obtenidos con CCL20, no se observa inducción de

hBD2 a nivel de ARNm o proteína en las células humanas o monocitos infectados con

B. abortus aunque el ARNm sí se incrementó en respuesta a IL-1β que fue utilizado

como control positivo. Estos resultados contrastan con aquellos encontrados en

infecciones de células epiteliales por otros patógenos cono Mycobacterium


130

tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa o Aspergillus fumigatus (Alekseeva et al. 2009;

Rivas-Santiago et al. 2005; Harder et al. 2000; Moranta et al. 2010).

Las BD contribuyen a la protección de las mucosas contra los patógenos, por lo que

es razonable postular que los patógenos han desarrollado estrategias de

supervivencia contra ellas. En este sentido, se ha demostrado que la cápsula de

polisacárido de Klebsiella pneumoniae, le confiere un rol protectivo dual confiriéndole

resistencia a la acción microbicida de las β-defensinas a la vez que inhibe su

transcripción en células alveolares respiratorias humanas (Moranta et al. 2010).

Shigella flexneri también suprime la transcripción de péptidos antimicrobianos a los

que es sensible en células epiteliales colónicas humanas. Nuestros resultados

muestran que Brucella también es capaz de inhibir la transcripción de hBD2 en

pneumocitos primarios murinos. Se ha demostrado que los receptores TLR están

involucrados en la transcripción y secreción de hBD en células epiteliales de

diferentes orígenes (Takahashi et al. 2001; Duits et al. 2003; Kaiser & Diamond 2000;

Platz et al. 2004) En los últimos años se han descripto dos proteínas de Brucella, BtpA

y BtpB, capaces de interferir en las vías de señalización de TLR2, TLR4 y como

consecuencia de ello, controlan la activación de células dendríticas y macrófagos. Sin

embargo el rol de estas proteínas en la producción de citoquinas y defensinas por las

células epiteliales respiratorias no ha sido evaluado. Nosotros demostramos que los

pneumocitos primarios expresan significativamente más hBD2 cuando son infectados

con una cepa mutante de B. abortus para los genes que codifican para btpA y btpB.

Estos resultados sugieren que las proteínas Btp de Brucella son capaces de interferir

en la transcripción de hBD2. Se requerirán otros estudios para evaluar el rol de estas

proteínas en la regulación de la transcripción de otros péptidos antimicrobianos

No existen estudios que comparen en paralelo la secreción de hBD2 y de CCL20 en

células pulmonares epiteliales en respuesta a patógenos o a antígenos microbianos.

En células colónicas epiteliales (Caco-2) ambas moléculas fueron inducidas a nivel de

ARNm por la infección con la cepa salvaje de E. coli enteropatogénica, mientras que

sólo CCL20 fue inducida por la mutante carente de flagelina (Khan et al. 2008). Esto

sugiere que, al menos en este modelo, la inducción de vías de señalización que


131

desembocan en la producción de CCL20 difiere de aquellas involucradas en la

expresión de hBD2.

Aunque las células epiteliales no produjeron hBD2 en respuesta a la infección con

B. abortus, hay que tener en cuenta que en el contexto pulmonar existen interacciones

entre estas células con los fagocitos residentes o reclutados. Estas interacciones

podrían amplifica la respuesta inmune a patógenos. Como modelo de este tipo de

interacciones, estimulamos las células epiteliales pulmonares con medio condicionado

de monocitos infectados con B. abortus (MCI). Notablemente encontramos que la

expresión de hBD2 fue significativamente inducida en A549 por MCI y un efecto

similar fue observado para CCL20. Los experimentos usando bloqueantes revelaron

que IL-1β, pero no TNF-α, participa en la inducción de hBD2 y la secreción de CCL20

por MCI. Estos resultados son parecidos a los previamente reportados por nuestro

grupo para la respuesta de quemoquinas por las A549 y células bronquiales humanas

a MCI (Ferrero et al. 2010). En ese trabajo las células epiteliales tenían una pobre o

nula respuesta proinflamatoria a la infección directa con B. abortus pero exhibían un

marcado incremento en la producción de quemoquinas (IL-8 y MCP-1) luego de la

estimulación con MCI. IL-1β fue la responsable de estas inducciones en A549 y TNF-α

en las células bronquiales.

Además de su función inmunomoduladora, ambas CCL20 y hBD2 han demostrado

tener actividad antimicrobiana contra ciertas bacterias Gram positivas y negativas

(Yang et al. 2003; Harder et al. 2000). Sin embargo, la actividad antimicrobiana contra

B. abortus nunca fue testeada. Encontramos que CCL20 tiene actividad microbicida in

vitro con una DL50 mayor a 50 µg, siendo ampliamente mayor que la DL50 para E. coli

(1.5 µg/ml). La DL para B. abortus fue significativamente superior que aquella

reportada para distintas bacterias incluyendo: Pseudomonas aeruginosa, Moraxella

catarrhalis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus o Streptococcus pyogenes, las

cuales se encuentran en un rango de 0.2 a 10 µg/ml(Yang et al. 2003). Por lo tanto, B.

abortus parece resistente a la acción antimicrobiana de CCL20, comparativamente a la

sensibilidad de otras bacterias.


132

Como las células epiteliales pulmonares estimuladas con MCI produjeron hBD2,

fue de interés probar la acción antimicrobiana de esta defensina frente a B. abortus.

Mientras que las DL50 para P. aeruginosa y E. coli se encuentran alrededor de los 5

µg/ml (Harder et al. 2000), B. abortus resistió hasta 50 µg/ml de hBD2 y hBD3. Esto

concuerda con otros reportes donde se probaron otros péptidos antimicrobianos de

diferentes familias, como la polimixina B, la melitina (abejas), magainina (piel de

sapo) y cecropina (cerdo)(Halling 1996).

Los niveles de hBD2 y CCL20 secretados por las células epiteliales pulmonares en

respuesta a la infección por B. abortus, ya sea por infección directa o indirectamente a

través de la estimulación con MCI, son mucho más bajos que la DL50 de ambos

péptidos antimicrobianos para esta bacteria. Estos resultados sugieren que el rol de

estas moléculas durante la infección sería el de quimioatractantes y no el de

antimicrobianos.

La resistencia de ambas cepas lisas de Brucella a estos péptidos antimicrobianos

ha sido atribuida al lipopolisacárido O en el LPS de la bacteria, debido a que las cepas

lisas son más resistentes a los péptidos catiónicos (polimixina, cecropina, melitina)

que las cepas rugosas (De Tejada et al. 1995). Cuando se ensayó hBD2, no se observo

sensibilidad diferencial para la cepa rugosa, mientras que hBD3 logró ejercer un

efecto microbicida a concentraciones de 50 µg/ml.

En conjunto, estos resultados muestran que las células epiteliales humanas

secretan CCL20 y hBD2 en respuesta a la infección por B. abortus o a las citoquinas

producidas por monocitos infectados. Mientras que estas moléculas son producidas en

concentraciones que no parecen tener actividad antimicrobiana, podrían estar

involucradas en funciones inmunomoduladoras durante la infección con Brucella

abortus, como el reclutamiento y la activación de monocitos y otras células inmunes.

133

Conclusiones

Conclusiones

134

Capitulo 1:

La respuesta inmune innata contra Brucella en los primeros días p.i. es de

carácter levemente proinflamatorio, y se monta cuando ya han sido

colonizados los principales órganos periféricos

Las proteínas Btp de B. abortus modulan el reclutamiento de las células

inmunes hacia el pulmón y contribuyen a la colonización de órganos

periféricos (bazo e hígado) desde pulmón.

B. abortus puede modular la respuesta inmune de células pulmonares

fagocíticas y no fagocíticas (células epiteliales alveolares, macrófagos

alveolares y células dendríticas)

B. abortus, a través de sus proteínas Btp, ejerce algún grado de modulación

inmune disminuyendo el reclutamiento de células y la producción de KC

inducidos por el LPS de E. coli en pulmón

La capacidad de sobrevida de B. abortus en el ambiente pulmonar previamente

inflamado con LPS de E. coli depende de las proteínas Btp.

Capítulo 2:

Las células epiteliales alveolares humanas son pobres respondedoras frente a

la infección directa por B. abortus en cuanto a secreción de citoquinas

proinflamatorias, al igual que los explantos pulmonares, si bien estos últimos

responden con mayores niveles de citoquinas.

Brucella es capaz de atravesar por vía paracelular una monocapa de

pneumocitos humanos polarizados

Conclusiones

135

Capítulo 3:

Las células epiteliales humanas secretan CCL20 y beta-defensina 2 en

respuesta a la infección por B. abortus o a las citoquinas producidas por

monocitos infectados.

B. abortus es resistente a la acción antimicrobiana in vitro de CCL20, hBD2 y

hBD3 a dosis mucho mayores que las producidas por el epitelio infectado o

estimulado.

Conclusión general

En conclusión, la infección inhalatoria por Brucella abortus genera una respuesta

innata pulmonar de poca intensidad que le permite sobrevivir en pulmón y

probablemente facilita su diseminación a otros órganos. Es probable que el pasaje de

la bacteria a la circulación sistémica ocurra, al menos en parte, por pasaje paracelular

a través del epitelio alveolar. La persistencia pulmonar de la bacteria posiblemente se

vea facilitada, entre otros factores, por su capacidad de supervivencia intracelular y

sus mecanismos de modulación de la respuesta inmune innata

136

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