UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

QUÍMICA FARMACÉUTICO BIOLÓGICALaboratorio de Microbiología General I

Equipo 2. Integrantes: Alavez González Teresa de Jesús, Muñiz Ángeles Marcela Irene, Piñón Rosales Jennifer Celeste,

Flores Rebollo Cruz.Asesora: Q.F.B. Beatriz Elena Arellano Pimentel

Reporte experimental práctica 15: Análisis microbiológico de la leche

ResumenSe realizó un análisis general para determinar la calidad de la leche de diferentes tipos o marcas como; leche lala, deslactosada ultra pasteurizada, alpura entera y leche de establo.

IntroducciónLa leche es una suspensión coloidal heterogénea que comprende partículas de grasa, caseína, lactosa, trazas de calcio, fósforo y compuestos de potasio, lactalbuminas y algunas vitaminas.

Por su aporte nutricional la leche es uno de los alimentos de mayor importancia en muchos países del mundo.

No obstante, este alimento, cuando no es manejado de manera adecuada, es un excelente vehículo para la transmisión de enfermedades al hombre, tanto las de carácter zoonotico como las ocasionadas por patógenos que se producen por la contaminación de los productos durante los procesos de obtención y transformación de la leche.

La leche por sus características y composición es un medio propicio para el desarrollo de los siguientes microorganismos:

El desarrollo microbiano en la leche ocasiona una serie de modificaciones químicas que pueden dar lugar a procesos alterativos y a procesos útiles. Muchos de sus componentes pueden degradarse, pero las alteraciones más acusadas resultan de la degradación de los tres componentes fundamentales: lactosa, proteínas y grasa.

La lactosa, azúcar de la leche, es la principal fuente de energía de las bacterias y puede experimentar diferentes fermentaciones. Cualesquiera que sean las bacterias que fermentan la lactosa, siempre habrá producción de ácidos orgánicos, con la coagulación o no de las proteínas de la leche (dependiendo del nivel de acidificación) y la formación o no de gas. Por otra parte, algunas bacterias que actúan sobre el azúcar de la leche, pueden formar sustancias viscosas.

Las proteínas, en general, se descomponen tras la coagulación de la leche, dando lugar a sabores y olores desagradables. La materia grasa es hidrolizada por las lipasas

Bacterias gram (+)

*Lacticas*Micrococos

*Estafilococos*Esporulados

*Diversas

Bacterias gram (-)

*Enterobacterias

*Acromobacterias

*Micobacterias*Diversas

microbianas, reacción lenta, que influye rápidamente sobre el sabor de la leche.

Los tipos de deterioro que suelen observarse en la leche cruda incluyen: la fermentación, coagulación, proteólisis, mucosidad, coloraciones diversas, y producción de aromas y sabores anormales.Las pruebas para establecer la presencia de bacterias u/o coliformes en la leche;

Reducción de azul de metileno: Cuando se añade una pequeña cantidad de azul de metileno a la leche y la mezcla se incuba a 37ºC, se produce una decoloración debida al metabolismo bacteriano; la velocidad a la que se produce el cambio de color es directamente proporcional al número de gérmenes  presentes. La mayor parte de los microorganismos cuando se multiplican son capaces de modificar el potencial de oxido de reducción (H) de la leche lo suficiente como para transformar el azul de metileno en sus derivados incoloro

Prueba de la leche con tornasol: Permite diferenciar organismos sobre la base de sus múltiples reacciones metabólicas en un medio lácteo como; fermentación de lactosa, caseólisis y coagulación de la caseína.

1. Fermentación de lactosa, cuando un organismo es capaz de fermentar lactosa, produce principalmente acido láctico, con una condición acida indicada por el cambio de color del medio que se vuelve rojo rosado.

2. Reducción del tornasol, el tornasol es un indicador de pH e indicador de oxido-reducción, algunos organismos son capaces de reducir el tornasol a una leucobase.

3. Formación del coagulo, Las enzimas proteolíticas provocan la

hidrólisis de las proteínas de la leche, lo que da como resultado su coagulación. La renina es la enzima responsable de la formación del coagulo.

4. Peptonización, la hidrólisis de la caseína por la actividad enzimática produce una conversión final del precipitado caseinógeno en un líquido claro.

5. Formación de gas, los gases de CO2

y H2 se forman como resultado final de la fermentación de la lactosa.

Sembrado en agar base leche, y determinación de coliformes por vaciado en placa.

 

 ObjetivoRealizar un análisis bacteriológico en

muestras de leche de establo y pasteurizada, para observar si es apta o no para el consumo humano.

Material

Material Cepa y medios Pipetas

estériles 1 y 5 mL

Baño metabólico a 37ºC

Asas bacteriológicas Termómetro

5 tubos estériles de 13X100

5 tubos de leche tornasol

4 cajas para agar base leche

4 cajas de petri estériles

Cepa desconocida

Medio agar bilis rojo violeta estéril

Colorante azul de metileno

Diversas muestras de leche comercial

Metodología

Reduccion azul de metileno

Se colocó 5 mL de cada tipo de leche, en condiciones esteriles en un tubo. El cual se puso en baño metabolico a 37ºC con una gota de azul de metileno. Se observo el tiempo en el que se dio el cambio de color.

Prueba de la leche con tornasol

Se adicionó 1 mL de cada tipo de leche a cada tubo de leche tornasol. Se incubo a 37ºC/24hrs.

Sembrado en placa de agar

base lecheSe sembró por estria en tres cuadrantes una muestra de leche, en agar base leche.

Determinacion de coliformes

Se sembró en 4 cajas petri esteriles, 0.1 mL y 1 mL de dos tipos de leche. Se agregó agar bilis rojo violeta, por el metodo de vaciado en placa a 37ºC/24.

Prueba de Leche Tornasol Muestr

aProduc

ción de

Ácidos(Rosa)

Producción de Álcalis(Azul)

Producción de

Gas(Burbuj

as)

Presenta

Coagulación

(Gelificación)

Presenta

Peptonación

(Grumos)

Reducción del

tornasol

(Blanco)

Lipolisis

(Capa

oleosa)

Imagen de

muestras.

Liconsa

Alpura

Establo

Lala

Deslactosada ultra

pasteurizada

Pequeño

botón rosa en

superficie

Botón azul en fondo

Resultados

Tabla 1. Reducción de azul de metilenoMuestra Clase de leche Tiempo de reducciónLiconsa regular dos horas con treinta

minutosAlpura entera buena calidad mas de 5 horasLala buena calidad mas de 5 horasEstablo mala calidad 30 minutosDeslactosada ultra pasteurizada

buena calidad mas de 5 horas

Tabla 3. Sembrado en placas agar base lecheMuestra Resultado Liconsa Prueba

Negativa a hidrolisis de caseína

Establo Prueba negativa a hidrolisis de caseína

Ultra pasteurizada deslactosada

Prueba negativa a hidrolisis de caseína

Bacteria desconocida

Prueba negativa a hidrolisis de caseína

Tabla 4. Determinación de coliformesMUESTRA Conteo de

colonias/mLLiconsa 0.1 mL Solo se observo

la presencia de 8 colonias.

Liconsa 1 mL se contaron 71 colonias formadas

Establo 0.1 mL sobrepasan las 300 UFC

Establo 1 mL En esta se puede a ver a distancia solo una colonia grande pero hubo mas de 300 UFC.

Análisis de resultados y conclusionesAlavez González Teresa de JesúsAnálisis de resultados

Los resultados derivados del análisis microbiológico a muestras de leche no pasteurizada (de establo), pasteurizada (liconsa y alpura entera y lala) y deslactosada ultrapasteurizada, revelaron su calidad con la presencia de bacterias reductoras (reacción con azul de metileno), observación de las reacciones que llevan a cabo microorganismos presentes en leche liconsa con las pruebas bioquímicas de leche tornasol/litmus-milk, determinación de coliformes con la técnica de dilución y vaciado en placa, así como la inoculación en placas de agar leche para observar el desarrollo de las placas en muestras de leche y Corynebacterium equi. Todo esto con el fin de observar que la leche es una mezcla de grasas, vitaminas, proteínas y agua que provee a bacterias patógenas para el ser humano (coliformes) como microorganismos benéficos la oportunidad de coexistir; sin embargo, las bacterias coliformes (características en estas pruebas por su crecimiento a 37°C y fermentar lactosa) son de interés médico y entre mayor sea su concentración/límite según la NOM-184-SSA1-2002, puede desencadenar enfermedades a los consumidores de productos lácteos.

Ahora bien, de este análisis dependió la evaluación de las condiciones experimentales de trabajo como toma de muestra, limpieza del área, adición

del volumen adecuado, orden y rapidez en el desarrollo de todo lo mencionado, lo cual determinó una lectura adecuada y a tiempo para cada prueba.

En lo que confiere a la prueba con azul de metileno, es resaltable su propiedad como indicador de pH, dado que el viraje de color de un medio básico (azul) a un medio incoloro, mostraría la capacidad reductora de los microorganismos sometidos en el baño metabólico; teniendo así, que entre menor fuera la calidad de la leche se iba a observar el viraje del indicador en un tiempo menor. Por lo tanto, la leche que se redujo en un menor tiempo fue la de establo, cuyo resultado fue esperado, seguido de la leche liconsa que mostró positividad a la prueba en 2:30min.

La determinación de UFC por conteo en placa reveló que la leche liconsa posee 71 UFC, lo cual no es muy positivo para fomentar el consumo de este tipo de leche, a pesar de que es pasteurizada, revelando así los coliformes que presenta porque muy posiblemente no se lleven acabo las condiciones de pasteurización adecuadas.

Las pruebas bioquímicas desarrolladas a través de las pruebas que conforman a leche tornasol revelaron reacciones positivas características de microorganismos presentes en leche, teniendo una reactividad mínima en leche lala entera pasteurizada que indica una menor cantidad de microorganismos en este tipo de leche

Conclusiones

El desarrollo de un análisis microbiológico de la leche con diferentes tipos de pasteurización y no pasteurizada permite determinar la presencia de microorganismos coliformes en la leche liconsa y de establo con pruebas de azul de metileno y recuento en placa, teniendo en cuenta que el método de pasteurización empleado es importante así como las condiciones en que se desarrolla. Asimismo, se revelaron reacciones características de microorganismos presentes en la leche con las pruebas bioquímicas de litmus milk.

Muñiz Ángeles Marcela Irene Análisis de resultados

La prueba de leche tornasol sirve para diferenciar organismos sobre la base de sus múltiples reacciones metabólicas en un medio láctico. El tornasol incorporado a la leche es un indicador del pH y un indicador REDOX (oxido- reducción) que hace que el medio pueda indicar diversas funciones o reacciones como se muestra en la tabla de resultados, se observa que para la muestra de leche Liconsa hubo producción de Álcalis ya que se observa en la superficie un arillo color azul, también muestra gelificacion pues presenta coagulación, para la reacción de peptonacion se observan grupos en el la muestra esto debido a que se tiene presencia de la enzima proteolítica caseinasa, también se observó reducción de tornasol ya que la muestra se observa blanca, y también tubo lipolisis. Por otro lado para la muestra de leche Alpura solo hubo producción de álcalis pues la muestra es azul totalmente, y por ello se descartan las otras 6 reacciones. Para la leche de Establo, se pudieron determinar 4 reacciones una de ellas es la producción de ácidos pues la muestra se tornó un poco rosa, también presentó coagulación, peptonacion y reducción de tornasol. En la leche Lala solo se observó una reacción que fue de producción de Álcalis pues la muestra se ve ligeramente

azul o rosada ósea que no hubo fermentación de lactosa, por ultimo para la muestra de leche deslactosada ultra pasteurizada se observa rara ya que tuvo formación de 2 pequeños botones uno en superficie y el otro en el fondo rosa y azul respectivamente, por lo tanto tuvo producción de ácidos y álcalis, presenta coagulación y reducción de tornasol.

En la prueba de reducción de azul de metileno solo se puede decir que se esperaba que la leche de establo fuera de mala calidad, pues después de casi 30 minutos el color de la muestra cambio a blanco y esto porque el azul de metileno se redujo, para las otras muestras se observaron de buena calidad pues después de más de 2 horas que estuvieron en reacción no cambiaron así que se puede decir que no son tan malas.

En las placas de agar base leche las pruebas fueron negativas ya que no se mostró hidrolisis de caseína.

Por ultimo para la determinación de coliformes, se observó presencia de colonias en las placas sobre todo en las de la leche de establo, lo que nos indicaría que hay mucha presencia de coliformes lo que no sabemos es si son fecales ya que para ello se necesita el recuento por el número más probable.

ConclusionesPara concluir cabe mencionar que la leche es un producto de consumo masivo ya que proporciona muchas vitaminas por su composición, por lo tanto es importante la realización de este tipo de análisis para saber qué es lo que consumimos, pues no siempre todo será de buena calidad, y podría provocarnos enfermedades que nos saldrían más caras por no querer comprar un producto que lleva un mejor proceso, por eso al realizar dichas pruebas se puede saber que leche es mejor y las precauciones que se deben tener, ya que no siempre un proceso se pasteurización nos indica que el producto está 100% libre de microorganismos ya que por el tratamiento que se lleva a cabo puede contraer m.o. de otro lado, y así mismo perjudicar al consumidor, además de que esta claro que no será lo mismo observar la leche recién ordeñada a la que ya esta procesada así que no será aceptable encontrar coliformes en una leche pasteurizada. para finalizar solo diré que el análisis microbiológico en la leche es muy importante y necesario.

Flores Rebollo Cruz Análisis de resultadosSe puede observar que la leche alpura y lala son de buena calidad, a la reducción de azul

de metileno, y prueba de leche tornasol. sin embargo la leche de establo es de mala calidad a la reducción de azul de metileno, y prueba de tornasol.

La leche linconsa dio positivo a la mayoría de las pruebas de leche tornasol, indicando que hay una gran cantidad de bacterias las cuales emplean en su metabolismo; lactosa, caseína, proteínas o grasa y llevando a cabo reacciones que conllevan a la desnaturalización de la leche. Además se puede observar que hubo crecimiento considerable de coliformes en agar bilis rojo violeta, lo cual según las normas vigentes no debe haber presencia de coliformes en alimentos o bebidas para consumo humano. Lo que significa que es fuente de transmisión de enfermedades.

Conclusiones La leche es un medio de cultivo optimo para el crecimiento de microorganismos, por lo

tanto es muy importante tener las condiciones favorables para que la misma no se contamine, ya que es para consumo humano y pudiera favorecer con esto el crecimiento de organismos coliformes.

Para determinar el contenido optimo bacteriano, hay que basarse en la observación del cambio de color del azul de metileno. el tiempo que requiere este cambio depende del numero de bacterias, el consumo de oxigeno por ellas, de la multiplicación de dichas bacterias. Un tiempo de reducción corto es índice de falta de cuidado en la producción de la leche, falta de limpieza o falta de enfriamiento a temperaturas favorables para el crecimiento de microorganismos.

Piñón Rosales Jennifer Celeste.

Análisis de resultados

En la presente práctica se realizó el análisis de la calidad de la leche de diferentes muestras y procedencias, unas con procesos de esterilización y otras sin el mínimo proceso de desinfección, provenientes de un establo. En un aspecto social, algunos grupos de personas creen que la leche sin hervir ejerce mejor influencia en el ser humano nutrimentalmente, ya que según esto, el proceso al cual se somete la leche de vaca para su esterilización (calor), modifica las propiedades de las proteínas, sin embargo, con este análisis se puede observar que es importante el tratamiento de la leche cruda ya que conforme pasa por los conductos de la ubre y en el proceso de ordñamiento, esta sustancia rica en nutrientes se va contaminando de bacterias patógenas del medio, como lo son Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp., Yersinia enterocolitica, Sthaphylococcus aureus, Coxiella burnetti y Mycobacterium paratuberulosis. En los análisis que se realizaron, principalmente se determinó que tipo de leche era la más confiable, siendo la leche cruda la que presento más bacterias fermentadoras de lactosa, en la prueba de azul de metileno, pues a los 30 minutos, su color cambio a blanco total. Esta prueba no indica precisamente que las bacterias presentes sean patógenas pero tampoco lo rechaza. De igual forma, esta prueba demostró que la calidad de la leche (en cuanto a su conservación) es proporcional a su nivel de pasteurización. Los resultados obtenidos demostraron que la leche LALA, Alpura entera y Deslactosada ultrapasteurizada, son las leches con mejor calidad, siguiendo la leche Liconsa y con más baja calidad, la leche de establo.

En cuanto a la prueba de tornasol se determinó que tipo de reacciones bioquímicas se llevaron a cabo en cada muestra. En esta prueba, la presencia de las especies de Enterococcus se visualiza porque estas bacterias reducen el tornasol a un color blanco, ésta reacción se observa en la muestra de Liconsa, Establo y en la deslactosada ultrapasteurizada. Únicamente las muestras de leche de establo y Deslactosada ultrapasteurizada, produjeron ácidos mostrando una capa rosa. Las muestras de Liconsa, Alpura entera y LALA, fueron las que presentaron una alcalinización coloreando el medio de azul. Ninguna muestra produjo gas. Presentaron coagulación, las muestras de Liconsa, Establo, y la Deslactosada ultrapasteurizada. La reacción de peptonación se llevó a cabo en las muestras de Liconsa y Establo, indicativo de porque tienen menor tiempo de degradación. Y por último únicamente en la muestra de Liconsa, se realizó la reacción de lipólisis.

Al inocular una muestra de cada tipo de leche, en agar base leche, se pudo observar la presencia de diferentes tipos de bacterias y si realizaron o no, la hidrólisis de la caseína, reacción que se observó mediante la formación de un halo transparente alrededor de una colonia. Solo en la leche de establo se pudo

observar una ligera hidrolisis de la caseína, y se pudieron observar mínimo dos colonias con morfología distinta, no se puede determinar específicamente que tipo de bacteria es, pero por el agar que es base leche, se sabe que algunas bacterias como Lactococcus lactis, Escherichia coli y Enteroccus faecalis crecen en este medio.

Incluso, la bacteria que se inoculo como desconocida en la prueba pasada, tuvo un buen crecimiento que incluso, confirmó las sospechas de ser Corynebacterium equi (Rhodococcus equi) por el color salmón de las colonias, y realizó una pequeña hidrólisis.

En la determinación de coliformes, se analizaron muestras de leche de establo y Liconsa a diferentes concentraciones, los resultados obtenidos demostraron que aun siendo de calidad media, la leche de Liconsa presenta menor número de coliformes que la de establo. Retomando párrafos anteriores, es importante que aunque se creá que la leche cruda aporta mayores nutrientes, seá por lo menos hervida para destruir bacterias patógenas que dependiendo de la especie produce una infección en el ser humano desde leve a peligrosa, no precisamente por qué la hembra ordeñada esté enferma, sino por que el proceso de ordeñamiento se lleva a cabo, exponiendo la leche directamente al medio ambiente, y el lugar puede estar ya contaminado por heces, que es de donde provienen principalmente las enterobacterias patógenas y el cuerpo humano es un buen hospedador.

Conclusiones

Se analizaron distintas muestras de leche de vaca, un alimento que aporta gran cantidad de nutrientes y que en países y zonas de bajos recursos es altamente distribuido. La diferencia básicamente fue el proceso de esterilización, por el cual se eliminan bacterias patógenas que causan enfermedades en el hombre desde infecciones estomacales hasta la muerte. Las leches pasteurizadas y ultrapasteurizadas, son fueron las mostraron ser de mayor calidad siguiendo la muestra de Liconsa y por último la leche de establo. El análisis bacteriológico es importante en los alimentos puesto que son un medio de transporte de microorganismos que va directamente al hombre, y durante su procesamiento si no se toman las medidas sanitarias correspondientes pueden contaminarse y tener un efecto adverso al que fueron fabricados.

Referencias consultadas

Bailón, Lira Lucia, et. al. , Atlas de pruebas bioquímicas para identificar bacterias, UNAM, 2003.

http://www.edutecne.utn.edu.ar/sem_fi_qui_micrb_09/microbiologia_leche.pdf