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Questo report è valido elettronicamente, perché costituisce copia esatta controllata e firmata del certificato di analisi originale, conservato in accordo alle procedure di Norme di Buona Prassi di Laboratorio UNIFE.

REPORT CHALLENGE TEST METODO ISO 11930:2012

Valutazione “in vitro” della stabilità microbiologica di un prodotto cosmetico

in base al metodo ISO 11930:2012, secondo il Regolamento 1223/2009 According the European Regulation 1223/2009 the evaluation of antimicrobial

preservation in cosmetic products by the method ISO 11930:2012.

PRODOTTO / PRODUCT:

ANTIOX CREMA

COMMITTENTE / CUSTOMER: AMBROSIALAB S.R.L. via Mortara 171 - 44121 Ferrara

Data report: 25/07/2013 / Date: July 25th 2013




CHALLENGE TEST: METODO DELL’EFFICACIA PRESERVANTE PRESERVATIVE EFFICACY METHOD ISO 11930:2012 - REG. 1223/2009

PREMESSA In base al Regolamento Europeo 1223/2009 la valutazione “in vitro” della stabilità microbiologica di un prodotto cosmetico è effettuato secondo la norma ISO (International Organization for Standardization), applicando il metodo ISO 11930:2012. Questa norma ISO (International Organization for Standardization) è utilizzata per la valutazione complessiva della protezione antimicrobica di un cosmetico, che comprende: -le caratteristiche chimiche del sistema conservante; -le caratteristiche della formulazione: -il design del packaging; - il processo di fabbricazione (norme GMP). 1-SCOPO DEL TEST Verificare nel tempo la stabilità microbiologica di un cosmetico lo stoccaggio e l’uso. Il test prevede la contaminazione del prodotto con microrganismi di diversa specie e la successiva valutazione della variazione di carica microbica mediante il conteggio in piastra del numero dei germi vivi ad intervalli di tempo regolari per un periodo di 28 giorni. La capacità di difesa del prodotto cosmetico dall’aggressione microbica viene verificata in base all’osservazione della riduzione di carica microbica (per ciascun ceppo microbico in esame) entro un certo intervallo di tempo, secondo i criteri di accettabilità della norma ISO 11930:2012. 2-FASI DEL CHALLENGE TEST

Le fasi procedurali consistono in: ü Conta microbica preliminare sui campioni da esaminare. ü Preparazione dei microrganismi per l’inoculo. ü Inoculo dei campioni. ü Controlli ad intervalli prestabiliti della sopravvivenza dei microrganismi. ü Valutazione dei risultati.

FOREWORD According to the European Regulation 1223/2009 evaluation "in vitro" microbiological stability of a cosmetic is carried out in accordance with ISO (International Organization for Standardization) by the method ISO 11930:2012. This ISO (International Organization for Standardization) is to be used in the overall evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product, which comprises: -chemical preservation; -Inherent characteristics of the formulation: -package design; -manufacturing process (GMP).

1-PURPOSE OF THE TEST

Checking the microbiological stability of the cosmetic product (storage and use) over time. The test is carried out by contaminating the product with microorganisms from several species, and by subsequently assessing the change in the microbial load by plate counting the number of live germs after pre-determined time spans. The cosmetic formulation’s capacity of defending against microbial attack is verified based on the observation of the reduction of the count viable total (for each test microbial strain) within a given time span, according to the criteria of acceptability emanated by ISO 11930:2012.

2-CHALLENGE TEST STEPS

Challenge test can be carried out by following different methodological procedures, however its procedure could be summarized in: ü Preliminary microbial count on test samples. ü Preparation of microorganisms for the inoculum. ü Inoculation of samples. ü Check of microorganism survival at pre-determined intervals. ü Evaluation of the results.




3-METODO ISO 11930:2012 TEST DI EFFICACIA DEL PRESERVANTE La norma ISO (International Organization for Standardization) 11930:2012, descrive come eseguire le analisi microbiologiche per la valutazione dell’efficacia microbicida del sistema conservante di un cosmetico, sottoposto ad una contaminazione microbica “in vitro”. 3.1-MATERIALI E METODI.

3-METHOD ISO 11930:2012 PRESERVATION EFFICACY TEST Cosmetics Microbiology. Evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product (ISO 11930:2012) 3.1-MATERIALS AND METHODS

Microrganismi utilizzati ATCC / ATCC microorganisms for antibacterial testing:

Staphylococcus aureus (Gram+/ Bacteria Gram positive) ATCC* 6538 Pseudomonas aeruginosa (Gram- / Bacteria Gram negative) ATCC* 9027 Escherichia coli (Gram- / Bacteria Gram negative) ATCC* 8739 Candida albicans (Lievito / Yeast) ATCC* 10231 Aspergillus brasiliensis (Muffa / Molds) ATCC* 16404 *ATCC (American Type Collection Control)

Entità dell’inoculo microbico: La concentrazione dell’inoculo (tempo zero : T0) deve essere compresa tra 105 e 106 Unità Formante Colonia [UFC (microrganismi vitali)] / gr di prodotto. Batteri: 106 ufc/gr. Miceti: 105 ufc/gr. Diluente: soluzione Ringer (soluzione fisiologica) Neutralizzante appropriato al test antimicrobico: Eugon LT 100 liquid broth. Terreni di coltura ü Tryptic Soy Broth (TSB) per la preparazione delle

sospensioni microbiche dei ceppi standard utilizzati ü Tryptic Soy Agar (TSA) per i batteri. ü Sabouraud Dextrose Agar (SDA) + CFL per

Candida albicans. ü Potato Dextose Agar per Aspergillus brasiliensis

Inoculum concentration at T0: The inoculum concentration (Time 0: T0) should be between 105 and 106 Colony-forming units [CFU (count viable total) ]/ gr. of the product. For bacteria : the bacterial inoculum of 106 ufc/gr. For fungi (Yeasts and Molds) : the fungal inoculum of 105 ufc/gr.. Diluent: Ringer solution Neutralizer: Eugon LT 100 liquid broth Neutralizing Broth should inactive the preservative and allow for unrestrained microbial growth. Medium: ü Tryptic Soy Broth (TSB) for the vitality of the

microbial suspensions ATCC. ü Tryptic Soy Agar (TSA) for bacteria ü Sabouraud Dextrose Agar (SDA) + CFL for

Candida albicans. ü Potato Dextose Agar for Aspergillus brasiliensis




Tecnica analitica: Si utilizza per il metodo di semina in superficie in piastra Petri. Il prodotto di prova inoculato viene conservato a temperatura ambiente. Tempo di verifica del Challenge test Il tempo di verifica per ogni campione e per ogni ceppo standard corrisponde al momento dell’inoculazione del microrganismo (tempo 0=T0) e dopo 7, 14 e 28 giorni, per verificare l’abbattimento totale dell’inoculo iniziale. Espressione dei risultati Nel certificato di analisi i risultati sono espressi in ufc (unità formanti colonia) / gr per ogni microrganismo in funzione degi intervalli di tempo prestabiliti. 4-CRITERI DI ACCETTABILITÀ: CRITERIO A - B Il prodotto in esame deve presentare attività inibente nei confronti dei microrganismi utilizzati secondo i criteri di accettabilità del metodo ISO 11930:2012. Il metodo prevede i seguenti criteri per la valutazione dell'efficacia del sistema di conservazione:

Analytical Technique Plate-count method: spreading plate in duplicate using medium agar. A neutralizer is incorporated the plated agar when recovering bacteria by streaking plates. The inoculated samples are incubated at room temperature. Evaluation of test time The total incubation time of the sample is 28 days and the controls for the verification of the possible reduction of microorganisms by the preserving system are performed after 7, 14 and 28 days from the inoculation. Expression of the results. In the certificate of analysis shows the values cfu (colony forming units) / g for each micro-organism as a function of the predetermined time intervals. 4-ACCEPTANCE CRITERIA: CRITERION A and B The product was tested for the preservative efficacy testing against the microorganisms used according to the criteria of acceptability method ISO 11930:2012. The method provides the following criteria for the evaluation of the efficacy of the preserving system:

TABLE 1: Log reduction value (Rx= log N0-Log Nx) requireda

Microorganisms: Sampling Time Limit of acceptability

METHOD ISO 11930 After

7 days After

14 days After

28 days

BACTERIA (A Criteria) ≥3 ≥3 and NIb ≥3 and NIb ACCEPTABLE YEASTS: Candida albicans (A Criteria) ≥1 ≥1 and NIb ≥1 and NIb ACCEPTABLE MOLDS : Aspergillus brasiliensis (A Criteria) - ≥0 c ≥1and NIb ACCEPTABLE

BACTERIA (B Criteria) Not performed >3 ≥3 and NIb ACCEPTABLE YEASTS: Candida albicans (B Criteria) Not performed ≥1 ≥1 and NIb ACCEPTABLE MOLDS : Aspergillus brasiliensis (B Criteria) - ≥0 c ≥1and NIb ACCEPTABLE a: in this test, on acceptable range of deviation of 0÷6 log is accepted b: NI no increase in the count from the previous contact time c: R x - 0 when lg N0-lg Nx (no increase from the initial count) R:Reduction / Riduzione N0= number of microorganisms inoculated at time T0 Nx= number of surviving microorganisms at each sampling time Tx




I criteri di interpretazione sono: Criterio A : dopo 7 giorni: riduzione di almeno 3 logaritmi per i batteri e almeno 1 logaritmo di Candida albicans; dopo 14 giorni: riduzione di almeno 3 logaritmi per i batteri (senza alcun aumento rispetto a quello precedente), almeno 1 logaritmo per Candida albicans (senza alcun aumento rispetto a quello precedente) e nessun incremento rispetto tempo zero per Aspergillus brasiliensis; dopo 28 giorni: riduzione di almeno 3 logaritmi per i batteri (senza alcun aumento rispetto a quello precedente), almeno 1 logaritmo per Candida albicans (senza alcun aumento rispetto a quello precedente) e almeno 1 logaritmo Aspergillus brasiliensis. Criterio B: • dopo 14 giorni: riduzione di almeno 3 logaritmi per i batteri, almeno 1 logaritmo per Candida albicans e nessun aumento rispetto al tempo zero per Aspergillus brasiliensis; • dopo 28 giorni: riduzione di almeno 3 logaritmi per i batteri (senza alcun aumento rispetto a quello precedente), di almeno 1 logaritmo per Candida albicans (un aumento rispetto a quello precedente) e nessun aumento per Aspergillus brasiliensis; Conformità al criterio A: il rischio microbiologico è accettabile: il prodotto cosmetico è considerato protetto contro la proliferazione microbica e non è necessario considerare altri fattori che sono indipendenti dal la formulazione. Conformità al criterio B: il rischio microbiologico è accettabile, ma la valutazione del rischio microbiologico dovrà prendere in considerazione anche i fattori di controllo indipendenti dalla formulazione, quali le caratteristiche del packaging , per ridurre il rischio microbiologico.

The criteria for interpretation are: Criterion A is assigned if obtained results satisfy at the same time all the conditions reported below: after 7 days: reduction of at least 3 logarithms for the bacteria and at least 1 logarithm for Candida albicans; after 14 days: reduction of at least 3 logarithms for the bacteria (without any increase with respect to the previous time), at least 1 logarithm for Candida albicans (without any increase with respect to the previous time) and no increase with respect to time zero for Aspergillus brasiliensis; after 28 days: reduction of at least 3 logarithms for the bacteria (without any increase with respect to the previous time), at least 1 logarithm for Candida albicans (without any increase with respect to the previous time) and at least 1 logarithm for Aspergillus brasiliensis Criterion B is assigned if the obtained results satisfy at the same time all the conditions reported below: after 14 days: reduction of at least 3 logarithms for the bacteria, at least 1 logarithm for Candida albicans and no increase with respect to time zero for Aspergillus brasiliensis after 28 days: reduction of at least 3 logarithms for the bacteria (without any increase with respect to the previous time), of at least 1 logarithm for Candida albicans (any increase with respect to the previous time) and no increase for Aspergillus brasiliensis If at the end of the challenge test the sample is in accordance with the A criterio: the microbiological risk is acceptable: the cosmetic product is considered protected against the microbial proliferation and it is not necessary to consider other factors that are independent from the formulation. If at the end of the challenge test the sample is in accordance with the B criterion: the microbiological risk is acceptable, whereby the level of protection is acceptable if the risk analysis demonstrates the existence of control factors not related to the formulation, such as the characteristics of the packaging, to reduce the microbiological risk.




Se al termine del test sfida il campione non soddisfa né l'una né i criteri B (criterio no A no B), la valutazione antimicrobica del prodotto dovrà essere valutato considerando esclusivamente la stima del rischio microbiologico (prodotto confezionato in mono-dose, nel rispetto delle norme di buona prassi di produzione (GMP), per garantire la qualità microbiologica del prodotto finito. La sicurezza microbiologica di un prodotto cosmetico è basata sulla combinazione di diversi fattori, non solo basati ai risultati del Challenge test, ma anche alla formulazione dei prodotti, alle condizioni di utilizzo e al tipo di confezione che li contiene, alla modalità di produzione e di confezionamento in conformità alle norme di buona fabbricazione (GMP).

If at the end of the challenge test the sample does not satisfy neither the A nor the B criteria: the antimicrobial evaluation of the product will have to be evaluated considering exclusively the estimation of the microbiological risk ( a single-dose product and on condition that the microbiological quality of this product is guaranteed at the moment of the production (GMP). The microbiological safety of a cosmetic product is based on a combination of several factors, not only based on the results of the Challenge test, but also to the formulation of the products under the conditions of use and the type of packaging that contains them, the mode of production and packaging in accordance with good manufacturing practice (GMP).

5-BIBLIOGRAFIA û Regolamento (CE) 1223/2009: regolamento sui cosmetici, approvato dal Parlamento europeo e dal Consiglio, allo scopo di armonizzare le disposizioni già esistenti in materia (Direttiva Europea 76/768/CEE e succ. mod.); Gazzetta Ufficiale dell’Unione europea: 22 dicembre 2009. û Linee guida COLIPA sui requisiti del documento informativo “Product Information File (PIF)” – 15 dicembre 2011. û Norma ISO (International Organization for Standardization) 11930:2012.

5-BIBLIOGRAPHY:

û Regulation (EC) No 1223/2009 (the “Cosmetic Products Regulation”), replaced the European Union (EU) Cosmetics Directive 76/768/EEC, which harmonizes and simplifies the cosmetics regulations across the EU member states by Product Information File (PIF). û COLIPA Guidelines “Product Information File (PIF)”- December 15th 2011. û ISO (International Organization for Standardization) 11930:2012.




CERTIFICATO DI ANALISI: Certificate of analysis: Challenge test ISO 11930:2012

COMMITTENTE / CUSTOMER: AMBROSIALAB S.R.L. via Mortara 171 - 44121 Ferrara

Data ricevimento campione: 21/06/2013 Periodo di Analisi: Data inizio del test: 24/06/2013 ÷ Data fine test 19/07/2013. Date of testing: 2013-06-24 End date test: 2013-07-19. PRODOTTO / PRODUCT: ANTIOX CREMA

Microrganismi/ Microorganisms test T0

inoculum T 2 gg. T7 gg. T14 gg. T28 gg.

Stafilococcus aureus ATCC 6538 1,9x106 <10 <10 <10 <10 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 2,5x106 1,0x103 <10 <10 <10 Escherichia coli ATCC 8739 2,3x106 <10 <10 <10 <10 Candida albicans ATCC 10231 1,6x105 1,0x104 <10 <10 <10 Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 1,8x105 <10 <10 <10 <10 I dati esprimono le unità formanti colonia (ufc) relative ad 1 gr di prodotto; / The data express the colony forming units [cfu] relative to 1 g of product; T= intervallo di tempo di analisi. / T= time of analysis. TVC= Total Vital Count prima dell’esecuzione del Challenge test= <10 cfu/gr. / TVC [Total Vital Count] before the execution of the test.=<10 cfu/g. TABELLA RIDUZIONE LOG MICROBICA / LOG REDUCTION OF BACTERIA AND MOLDS TABLE:

Microrganismi test/ Microorganisms test RIDUZIONE LOG / LOG REDUCTION T2gg. T7gg. T14gg. T28gg. Criterio A di Accettabilità

Stafilococcus aureus ATCC 6538 ≥ 6 Log NI NI NI ACCETTABILE / ACCEPTABLE Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 ≥ 3 Log 6 Log NI NI ACCETTABILE / ACCEPTABLE Escherichia coli ATCC 8739 ≥ 6 Log NI NI NI ACCETTABILE / ACCEPTABLE Candida albicans ATCC 10231 ≥ 1 Log 5 Log NI NI ACCETTABILE / ACCEPTABLE Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 ≥ 5 Log NI NI NI ACCETTABILE / ACCEPTABLE

I dati esprimono la riduzione microbica in LOG in funzione del tempo. (NI=nessun incremento) / The data express the LOG reduction of inoculated germs relative to established control intervals. (NI: No Increase). Data report: 25/07/2013 / Date: July 25th 2013




GRAFICO/GRAFIC PRODOTTO / PRODUCT: ANTIOX CREMA

0,00E+00

1,00E+00

2,00E+00

3,00E+00

4,00E+00

5,00E+00

6,00E+00

7,00E+00

T0 T 2 gg T 7 gg T 14 gg T 28 ggTempo (giorni) / Time (days)

LO

G: c

fu/g

r (E

=val

ore

espo

nenz

iale

)

ST

PS

EC

CA

ASP

Variazione logaritmica della carica microbica rispetto alla carica inoculata. / Logarithmic variation of microbial load in the inoculated sample. LEGENDA: LOG cfu/gr: unità formanti colonia relative ad 1 gr o ml di prodotto espresse in valore logaritmico (numero scientifico E = esponenziale) / colony forming units relative to a gram (g) of product. Tempo di esecuzione / T= time of analysis.: T0.= tempo subito dopo l’inoculo del campione / microbial titer in the inoculated sample T2 g.= tempo dopo 2 giorni dall’inoculo iniziale del microrganismo / microbial titer at 2 days; T7 g.= tempo dopo 7 giorni dall’inoculo iniziale del microrganismo / microbial titer at 7 days; T14 g.= tempo dopo 14 giorni dall’inoculo iniziale del microrganismo / microbial titer at 14 days; T28 g.= tempo dopo 28 giorni dall’inoculo iniziale del microrganismo / microbial titer at 28 days.





CONCLUSIONI / CONCLUSIONS

In base ai risultati ottenuti il prodotto cosmetico è conforme al criterio A: il rischio microbiologico è accettabile, ed in generale, si riscontra il seguente comportamento: / According to the obtained results the cosmetic product complies with the criterion A: the microbiological risk is acceptable, and in general, we find the following behavior: Riduzione batterica / Bacterial reduction: Gram + : Riduzione inoculo entro 2 giorni / Reduction of the inoculum within 2 days Staphylococcus aureus Gram - : Riduzione inoculo entro 2 giorni / Reduction of the inoculum within 2 days Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa : Riduzione inoculo entro 7 giorni / Reduction of the inoculum within 7 days Riduzione micetica / Fungal Reduction: Candida albicans : Riduzione inoculo entro 7 giorni / Reduction of the inoculum within 7 days Aspergillus brasiliensis : Riduzione inoculo entro 2 giorni / Reduction of the inoculum within 2 days

Il sistema preservante, secondo i criteri di valutazione raccomandati dal metodo ISO 11930:2012 (REG. 1223/2009), del cosmetico esaminato denominato: / According to the assessment criteria recommended by the ISO 11930:2012 (European Regulation 1223/2009), the preservative system of the test cosmetic product called:

AMBROSIALAB SRL

ANTIOX CREMA

è conforme al criterio A e risulta ACCETTABILE, in quanto il sistema conservante si dimostra

efficace nei confronti dei microrganismi di prova, / in conforming to the criterion A and is ACCEPTABLE, and the preservative system shows efficacy against test microorganisms.


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