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Duplicación del DNA Duplicación del DNA en bacterias y arqueobacterias en bacterias y arqueobacterias y comparación con eucariontesy comparación con eucariontes

Prof. Bernal Gdo. Garro MoraProf. Bernal Gdo. Garro Mora

05/17/17BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR DE BACTERIAS Y

ARQUEAS- REPLICACIÓN1

Pyrococcus furiosus

Replisoma bacteriano

Replisoma arqueano tipo eucarionte

CONTENIDOS

Generalidades

Inicio de la replicación

Montaje de las helicasas

Activación del origen y ensamblaje del replisoma

Reacciones del cebado (priming)

La maquinaria molecular de la replicación



Generalidades

La maquinaria molecular básica para el copiado del DNA es conservada en los tres dominios de vida: Archaea, Bacteria y Eukarya.

Lo anterior implica la centralidad de la estabilidad en la transmisión de la información genética que, finalmente, determina el fenotipo celular.

DNA de E. coli: 5 millones de pb y 1.6 mm.

DNA en célula 2N humana: 6 billones de pb y unos 2 m (la compactación con histonas lo hace condensar su tamaño unos dos millones de veces).

Una de las características de la maquinaria molecular de la copia del DNA es la alta fidelidad.

Pese a la mayor cantidad de DNA en las células eucariontes, esta maquinaria debe estar especialmente adaptada en bacterias, ya que muchas tienen ciclos de vida de alrededor de 20-30 minutos.



REPLICACIÓN: CONCEPTOS BÁSICOS



REPLICACIÓN DEL DNA EN PROCARIONTES



Orígenes de la replicación




Secuencias en el DNA que son reconocidas por las proteínas que inician el proceso.

Existen diferencias para el inicio de la replicación en los tres dominios.

No obstante, otras características muy conservadas indican que el proceso ya estaba presente en el último ancestro común universal.

Bacterias: un origen de replicación y horquillas replicantes que se mueven en direcciones opuestas




E. coli: velocidad de replicación de 1 Kpb/s y cromosoma único de 4.4 Mpb, dos replicones, tiempo de copiado de 30 minutos.

Comparación: los eucariontes tienen varios orígenes y replicones por cromosoma.

Las horquillas de replicación procariontes son unas 20 veces más veloces que las eucariontes.

Comparación: tener más orígenes en eucariontes permite disminuir el tiempo de copia de grandes cromosomas y que se formen cromátides hermanas asociadas físicamente.




En las bacterias los orígenes son secuencias bastante bien establecidas (ori), a las que se unen las proteínas de reconocimiento de tales secuencias.

Comparación: en los eucariontes ( a excepción de Saccharomyces cerevisiae) la secuencia no es un factor diferenciante de los orígenes. Es más importante la organización de la cromatina que la secuencia.

Muchos orígenes eucariontes se encuentran en regiones transcripcionalmente activas, que facilitan la asociación de proteínas de inicio de la replicación.

Saccharomyces cerevisiae, eucarionte que sí diferencia sus orígenes de replicación mediante secuencias específicas del DNA, tal como lo hacen las bacterias.




Por ejemplo, oriC en E. coli tiene trece-meros y nonámeros conservados.

Tiene unas 250 pares de bases.

Son secuencias ricas en AT.




Los tres dominios usan proteínas de unión al origen.

Estas proteínas son de la familia AAA+.

Las proteínas AAA+ normalmente forman multímeros.

Ejemplo: DnaA es un filamento formado por múltiples unidades repetidas, que se enrolla en el origen.



Orígenes de la replicación El filamento de DnaA

une ATP para usarlo en la apertura de las secuencias ricas en AT.

Se genera una burbuja de ssDNA en el origen, en la cual se monta la helicasa.

Comparación. Los eucariontes usan en lugar de DnaA un hexámero llamado ORC (seis proteínas relacionadas a la familia AAA+), que se unen a los orígenes.

ORC no desenrrolla las secuencias a las que se une y en eso es diferente a DnaA.

Arqueas: usan proteínas AAA+ que están relacionadas a la subunidad mayor (Orc1) del ORC eucarionte.

Nota: la DnaA y el ORC se usan en otras funciones además de la replicación.



Orígenes y cromosomas en arqueas Orígenes en arqueas: las que se

han caracterizado muestran una combinación entre bacterias y eucariontes.

Algunas tienen sólo un origen en el cromosoma en tanto otras especies tienen varios.

Ploidía del genoma de las arqueobacterias: Varía enormemente según el taxón.

Algunas tienen un ciclo 1C-2C. (C= cromosoma).

Otras arqueas pueden tener hasta 25 copias de sus genoma por célula proliferativa!!!! (25C!).

Pyrococcus furiosus, arquea capaz de vivir a más de 100 °C.05/17/17BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR DE BACTERIAS Y


Orígenes y cromosomas en arqueas

La velocidad de avance de las horquillas es intermedia entre bacterias y eucariontes: unas 10 veces más veloz que en Eukarya.

Las proteínas de inicio de replicación (tipo AAA+) están relacionadas con la eucarionte ORC pero dependiendo de la arquea así es el número de subunidades que usa. Arqueobacteria del género Sulfolobus.



Montaje de la helicasa



Helicasas y replicación Las proteínas de unión a los orígenes de replicación en bacterias, arqueas y eucariontes tienen

como función el montaje de dos helicasas.

Las helicasas dan origen a dos asas de replicación, que se mueven en direcciones opuestas.

En los tres dominios: las helicasas son hexámeros que se ensamblan alrededor de la cadena parental.

Mediante hidrólisis de ATP se van translocando a lo largo de la cadena y fuerzan el desenrrollamiento del DNA.

Existen semejanzas entre las helicasas replicativas y ciertas enzimas hexaméricas de virus (como el antígeno T del virus simio 40 y la helicasa E1 del virus del papiloma humano).



Topoisomerasas



Helicasas



Helicasa bacteriana Homohexámero que se carga en las cadenas

ssDNA que genera la DnaA en el oriC.

Viaja en dirección 5´- 3´ en la cadena en la que se una.

Esta direccionalidad hace que la helicasa se coloque alrededor de la cadena rezagada en la horquilla.

La helicasa bacteriana es una ATPasa con estructura de plegamiento tipo RecA.



Helicasa eucarionte Heterohexámero denominado complejo

MCM2-7.

Cada una de las seis unidades MCM está codificada por un gene distinto pero con secuencias relacionadas.

Las proteínas MCM son ATPasas de la familia AAA+.

La polaridad es contraria a la que existe en La polaridad es contraria a la que existe en bacterias: las MCM se mueve de 3´- 5´y corre bacterias: las MCM se mueve de 3´- 5´y corre en la cadena directora.en la cadena directora.



Helicasa eucarionte Activación de la helicasa:

La helicasa eucarionte se carga como un doble hexámero a través del cual pasa dsDNA.

Debe luego hacer la transición a ssDNA para activarse.

Dicha transición-activación depende de la unión con proteínas como la Cdc45 y la GINS: esto origina la helicasa activa CMG (Cdc45-MCM2-7-GINS).

Esto implica una forma de control del inicio de la replicación, distinto del bacteriano.

Helicasa eucarionte activa CMG



Helicasa arqueana

También es un doble hexámero (como la eucarionte).

Está constituida por una proteína MCM relacionada con la helicasa celular eucarionte.

Se desplaza en la cadena directora en la dirección 3´- 5´.

No requiere de proteínas accesorias para su actividad catalítica como helicasa.



Otros factores necesarios

Además de las proteínas para unión al origen, las células necesitan otros factores para el montaje de las helicasas.

Antes del montaje:

Bacterias: la DnaB está unida a la DnaC.

Eucariontes: la MCM está unida a Cdt1.

Estas proteínas favorecen la aproximación de las helicasas al origen.

DnaC bacteriano:

De la familia AAA+.

Carga a DnaB inactiva e interacciona con DnaA, por medio de lo cual se carga a DnaB al ssDNA de la burbuja formada en el oriC por DnaA.

Hidrólisis de ATP: expulsa a DnaC y favorece la activación de DnaB (la helicasa).



Otros factores necesarios

Cdt1 eucarionte:

Conduce a MCM 2-7 al complejo ORC-Cdc6 unido al origen.

Al cargar a CMC, ocurre hidrólisis de ATP por Cdc6, que sale del complejo y se libera Cdt1 también.

En arqueas:

Hay proteína de unión Orc1/Cdc6, del tipo AAA+.

No se ha identificado el análogo de Cdt1, por lo cual la helicasa podría unirse por sí sola al complejo en el origen.



Activación del origen y ensamblaje del replisoma



Complejo pre-replicativo eucarionte Los detalles del montaje de las helicasas y su

activación no se conocen bien en ninguno de los tres dominios.

El complejo pre-replicativo eucarionte (MCM2-7/Cdt1/Cdc6/ORC) permanece inactivo hasta que la célula se haya comprometido a entrar en la fase S del ciclo celular.

La CDK y la DDK (Dbf4/quinasa Cdc7) controlan la activación del origen.

Son quinasas con poca actividad en G1 pero que aumentan su acción en la fase S.



Regulación del inicio en bacterias Los procesos de carga de la helicasa y

de su activación para desenrollar el DNA al cortar los enlaces de hidrógeno entre las bases, son mecanismos importantes del control de la replicación.

Estos puntos de control son distintos en bacterias y eucariontes.

En E. coli, Seq1A bloquea a oriC e impide la unión de DnaA.



Regulación del inicio en bacterias

SeqA se une solamente al DNA hemimetilado (y, por ende, recién replicado).

En condiciones óptimas de crecimiento, E. coli re-comienza la replicación en OriC sin haber aún terminado el ciclo anterior.

Esto se debe a que en las bacterias las etapas del ciclo celular no son tan determinadas como en eucariontes.



Regulación del inicio en bacterias

La DnaA interactúa con DnaB-C.

Cuando DnaC es expulsado por acción de ATPasa, la acción helicasa de DnaB inicia la separación de las dos cadenas del DNA.

Se recluta la primasa.

Se recluta la DNA polimerasa III.

Se conforma la horquilla de replicación madura.05/17/17

BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR DE BACTERIAS Y ARQUEAS- REPLICACIÓN

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Regulación del inicio en eucariontes

El proceso de regulación del inicio y del resto de la replicación eucarionte requiere de mayor número de proteínas que en las bacterias.

Hay una regulación molecular compleja para pasar de una fase a la siguiente del ciclo celular, lo que lo hace mucho más definido que para el caso de las bacterias.




Pre-RC: se forma al salir de la fase M (en células rápidamente proliferativas) o en G1.

MCM 2-7 permanece inactiva después de montarse en el dsDNA.

Las quinasas de la fase S promueven la unión de la cromatina con factores proteicos para la activación de los orígenes (como GINS y Cdc45).




GINS y Cdc45 activan la helicasa MCM 2-7.

Durante la fase S la Cdt1 y la Cdc6 son eliminadas para evitar más montaje de MCM 2-7 en esa fase.

El montaje de MCM 2-7 se denomina ‘permisión’ de los orígenes en la salida de la fase M o en G1.

Como la activación ocurre en la fase S, la permisión y la activación están separadas y así se evita la iniciación de los orígenes más de una vez por ciclo celular.



Reacciones que llevan al cebado (priming) y máquina molecular de replicación



Primasa

Para el inicio de la replicación se necesita una RNA pol dependiente de DNA (primasa).

Esta enzima sintetiza un primer del cual la DNA pol extiende la síntesis.

El priming o cebado ocurre solamente en ssDNA, por lo que se requiere de previo la acción de las helicasas.

DnaG: la primasa monomérica en E. coli se une a la helicasa DnaB y sintetiza un primer de 12 nucleótidos.



Primasa La unión con DnaG ayuda con

la liberación de la reguladora DnaC de la DnaB: primado y desenrrollamiento están íntimamente coordinados.

Comparación con eucariontes: la primasa es un complejo de cuatro subunidades llamada DNApol α/primasa y sintetiza un primer híbrido RNA (12 nucleótidos)-DNA (25 nucleótidos).

Proceso general del ensamblaje del replisoma en el origen de replicación.



Fragmentos de Okazaki

Son largos en las bacterias (1-2 kb).

Son más cortos en eucariontes (100-200 pb).

Las proteínas del primado en los fragmentos de Okazaki se conocen mejor en bacterias que en eucariontes, ya que éstos poseen más proteínas que no tienen homólogos claramente identificados en las bacterias.



Máquina de replicación: replisoma

Máquina multiproteica que sintetiza las dos cadenas hijas de manera simultánea.

Elementos moleculares principales compartidos por todas las células:

1. DNA polimerasas1. DNA polimerasas 2. proteínas de unión de cadenas sencillas (SSBPs)2. proteínas de unión de cadenas sencillas (SSBPs)

3. helicasa3. helicasa 4. primasa4. primasa

5. montador pentamérico del asa de agarre (loading clamp)5. montador pentamérico del asa de agarre (loading clamp) 6. asa de agarre circular deslizante (slidding clamp)6. asa de agarre circular deslizante (slidding clamp)




Existen diferencias en la forma de organización de estas moléculas según el tipo celular.

La maquinaria de replicación se denomina replisoma.

En el replisoma bacteriano la DnaB se ubica en la cadena rezagada.

Tres DNA pol III se unen al cargador del asa.

El cargador une la helicasa y ensambla a las asas β en los sitios primados conforme la primasa los va cebando.




El complejo de carga del asa tiene 3 subunidades τ

Las subunidades τ se unen a 3 DNA pol III

Cada vez que DnaG forma un primer, el cargador coloca un asa de agarre β

La DNA pol III usa el asa de agarre para extender el fragmento de Okazaki

La helicasa homohexamérica (DnaB) se une a las subunidades



Enzimas y proteínas de la horquilla de replicación

Enzima (función)

Bacterias (E. coli)

Eucariontes (H. sapiens)

Primasa DnaG Primasa

Helicasa DnaB Complejo MCM

SSBP SSBs RPAs

Topoisomerasas Girasa, topoisomerasa I Topoisomerasas I y II



Enzimas y proteínas de la horquilla de replicación

Estas moléculas interactúan con el DNA de manera independiente de la secuencia de nucleótidos.

Usan mecanismos variados para la interacción:

DNA polimerasa: reconoce la estructura y carga negativa del esqueleto de fosfatos, interactúa con los residuos que forman puentes de hidrógeno en el surco menor.

Helicasas: tienen estructuras que les permiten rodear al DNA.

SSBPs: aprovechan las interacciones hidrófobas entre pares de bases.



Topoisomerasas I y II Las topoisomerasas resuelven los superenrrollamientos que se forman al

relajar al DNA en la horquilla de replicación.

Remueven los superenrrollamientos positivos que se forman frente a la horquilla.

Estos se deben a la acción de la helicasa.

Sin las topoisomerasas la horquilla de replicación se trancaría.

La topoisomerasa II pasa una parte de dsDNA no replicado a través de un corte en la cadena doble cercana.

Las topoisomerasas I realizan la misma acción pero cortando solo una de las dos cadenas.



Proteínas de unión a cadena sencilla

Las SSBPs se unen en un número pequeño a las cadenas simples de DNA y las protegen de las nucleasas. Cuando se van uniendo proteínas adicionales, la unión se da preferentemente junto a las SSBPs ya ligadas. Hasta que las cadenas ssDNA originalmente elegidas están totalmente cubiertas, es que las SSBPs ligan nuevas

cadenas. La cobertura con las proteínas hace que el DNA se extienda y se evita la formación de enlaces entre bases.



DNA polimerasas de E. coliPolimerasa Cantidad de

subunidadesFunción

Pol I 1 Remoción de los primers, reparación

Pol II (DinA) 1 Reparación Pol III (núcleo) 3 Replicación del cromosoma

Pol III (holoenzima) 9 Replicación del cromosoma

Pol IV (DinB) 1 Reparación Pol V (UmuC,UmuD’2C)

3 Reparación



DNA pol III E. coli tiene al menos 5 tipos de polimerasas de

DNA (una célula eucarionte puede tener hasta 15, siendo las principales la α/primasa, la pol δ y la pol ε).

La DNA pol III es la principal enzima de replicación.

Muy procesiva (une muchos nucleótidos).

Se ubica en un complejo llamado holoenzima, que eleva su procesividad.



Holoenzima DNA polimerasa III

La holoenzima permite elevar la procesividad.

Contiene dos copias de la pol III (enzima core) y una copia del complejo γ (el cargador del asa de agarre de 5 unidades).

Este complejo cargador se une a las dos polimerasas III (mediante τ) y es esencial para su funcionamiento.

El brazo flexible de τ permite que las dos polimerasas III se muevan con la independencia necesaria para la replicación de las cadenas directora y rezagada.



DNA pol I

Presenta actividad exonucleasa 3-5’ que le permite remover nucleótidos de RNA o de DNA upstream del sitio de síntesis.

Remueve los primers.

No muy procesiva (20-100 nucleótidos por vez).

Tanto la DNApol III como la pol I son muy exactas y tienen actividad correctora, que no existe en los otros tres tipos de polimerasas.



Modelo del trombón Explica la replicación coordinada de las dos cadenas en las horquilla de replicación bacteriana, por medio de las dos unidades de DNA pol III.

La DNA pol III interactúa con la helicasa que viaja en la cadena rezagada en dirección 5’-3’, mediante la subunidad τ.

El complejo γ mantiene los componentes de la maquinaria de replicación en contacto.



Modelo del trombón De manera periódica, la

primasa interactúa con la helicasa y sistetiza un primer sobre la cadena rezagada.



Modelo del trombón Cuando la DNA pol

III completa un fragmento de Okazaki es liberada del asa de agarre deslizante y del DNA.

Como la subunidad τ la mantiene unida al complejo, pronto se liga al siguiente cebador.



Modelo del trombón La sección de la cadena

rezagada que fue recién cebada es tomada por el complejo cargador, que ensambla una asa de agarre deslizante en el punto de unión de la cadena molde con el primer.



Modelo del trombón Este complejo se liga a la

DNA pol III que reinicia la elongación del nuevo fragmento de Okazaki.



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