replicacion del adn- expo
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Replicación del ADNReplicación del ADN
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La división celular requiere de la duplicación del material genético
mitosis
mitosis
meiosis
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Mecanismo generalMecanismo general
La misma estructura del ADN sugirió un mecanismo de replicación de la información◦Cada hebra sirve como
molde para replicar la complementaria
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PropiedadesPropiedades
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Semiconservativa: cada nueva molécula esta formada por una hebra parental y una recién sintetizada◦ Experimentos de Meselson y Stahl
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Bidireccional: Se da hacia ambos lados del sitio de inicio denominado origen de replicación
A cada lado de la burbuja de replicación se forma una horquilla de replicación
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Dirección de la síntesis: 5’ 3’
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Semidiscontinua: Una de las hebras no puede ser sintetizada de continuo◦ Consecuencia de la direccionalidad
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Replicación en procariotasReplicación en procariotas
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MecanismoMecanismo Inicio
◦ Reconocimiento de orígenes de replicación.◦ Separación de hebras. ◦ Posicionamiento de maquinaria transcripcional.
Elongación ◦ Crecimiento bidireccional de las horquillas de replicación.◦ Replicación semiconservativa, semidiscontinua,
coordinada.
Terminación ◦ Reconocimiento de señales de terminación.◦ Desensamble de replisomas.
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ADN polimerasas:◦ Pol I◦ Pol II◦ Pol III (replicasa)◦ Pol IV y V
Necesitan 3’ OH libre
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Maquinaria enzimáticaMaquinaria enzimáticaADN polimerasas: Síntesis de ADNPrimasas: Generación 3’OH libresLigasas: Unión los fragmentos de
OkazakiHelicasas: Separación de hebrasTopoisomerasas: Mantenimiento
del grado de superenrollamientoSSBs: Mantenimiento de simples
hebras
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InicioInicio
Reconocimiento del origen y apertura de las hebras
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ElongaciónElongación
Primasa: ◦ Sintetiza fragmentos
de ARN (cebadores) que provean los 3’ OH libres
◦ Puede comenzar sin necesidad de cebador
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ReplisomaReplisoma
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TerminaciónTerminación
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Replicación en eucariotasReplicación en eucariotas
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Los mecanismos son similaresMás de un origen de replicación por
cromosomaEs más complejoProteins Functions
RPA
PCNARFC
Pol α/primasePol δ / ε FENI DNA2 DNA ligase IMcm2-7
Single-stranded DNA binding; stimulates DNA polymerases; facilitates helicase loading
Stimulates DNA polymerases and RFC ATPaseDNA-dependent ATPase; primer-template DNA binding;
stimulates DNA polymerases; PCNA loading RNA-DNA primer synthesis DNA polymerase; 3'-5' exonucleaseNuclease for removal of DNA/RNA primersNuclease for removal of DNA/RNA primers Ligation of DNADNA helicase; primosome assembly, licensing factor
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ADN polimerasasADN polimerasas
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Ocurre durante la fase SUna única vez por ciclo
celular
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Horquilla eucariotaHorquilla eucariota
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TelómerosTelómeros
Son secuencias repetidas que se encuentran en los extremos de los cromosomas lineales
Entre otras funciones resuelven los problemas de replicar este tipo de cromosomas
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TelomerasaTelomerasa
Enzima capaz de resolver el problema de acortamiento de los extremos
Ribonucleoproteína
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Mantenimiento de la Mantenimiento de la información hereditariainformación hereditariaErrores durante la replicación:
◦Las ADN polimerasas no son 100% fieles◦Los errores son reparados en un alto
porcentaje de las veces◦Cuando los errores escapan los
mecanismos de reparación ocurren cambios en la secuencia del ADN: Mutaciones
Las mutaciones también pueden ocurrir por fenómenos post replicación (mutágenos físicos, químicos, etc.)
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Mecanismos de Mecanismos de reparaciónreparación
Las propias replicasas son capaces de reparar sus errores durante la elongación:◦actividad correctora de prueba (proofreading)◦Implica una actividad exonucleasa 3’ 5’
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Mecanismos de Mecanismos de reparaciónreparación
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Replicación de ADN Replicación de ADN in-vitroin-vitro: : PCRPCR Permite la amplificación de un fragmento de ADN de
interés Algunas aplicaciones:
◦ Clonado acelular de moléculas de ADN◦ Detección de secuencias sin purificación previa◦ Análisis de expresión génica◦ Secuenciación de ácidos nucleicos◦ Amplificación de ADN para su posterior clonación celular◦ Aplicaciones en medicina:
Diagnostico de enfermedades hereditarias/infecciosas Diagnóstico parental (amniocentesis, vellosidades coriónicas) Tipado de tejidos para transplantes Detección de células tumorales Estudios de asociación genotipo-fenotipo
◦ Técnicas forenses: huellas genéticas (Identificación de polimorfismos) Identificación individual Tests de paternidad
◦ Filogenia◦ Análisis de genética poblacional
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Reacción de replicación Reacción de replicación in-vitro:in-vitro:
MoldeADN polimerasa: Taq polimerasa
(termoestable)Cebadores:
◦ 3’ OH libre◦ Definen la región a amplificar
dNTPs (A, C, G, T)Condiciones para el funcionamiento de la
enzima:◦ Buffer◦ Mg++ (cofactor de la enzima)
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ProcedimientoProcedimiento
Desnaturalización del ADN (94ºC)
Agregado e hibridación de los cebadores (50ºC-65ºC dependiendo de los cebadores)
Elongación (72ºC)Repetición de
estas etapas (25-35 ciclos)
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Luego de terminados los ciclos se obtienen millones de moléculas de la región blanco
La hace una técnica extremadamente sensible◦Ventaja: se puede amplificar ADN
partiendo de muy poco material◦Desventaja: Contaminaciones
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Variantes del métodoVariantes del métodort- PCR:
◦Se usa una transcriptasa reversa para pasar una muestra de ARN a ADN obteniendose ADN copia (ADNc)
◦Se realiza un PCR para amplificar el ADNc de interés
◦Estudios de expresión génica◦Clonado de genes eucariotas
(eliminación de intrones)
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PCR cuantitativo (real time PCR, qPCR):◦Se diferencia en que en cada ciclo de
amplificación se cuantifica la cantidad de ADN obtenida
◦Permite inferir la cantidad de moléculas de molde que existía originalmente en la muestra: Cuantificación de la expresión génica Cuantificación de microorganismos
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Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN
Método de Sanger (nobel en 1980)Utiliza dideoxinucleotidos (ddNTPs)
para terminar una reacción de síntesis de ADN in-vitro
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Realizando 4 reacciones independientes (una para cada base) se puede inferir la secuencia original
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Secuenciación automáticaSecuenciación automática
Sigue el mismo principioA diferencia del método anterior cada
ddNTP se marca con una molecula fluorescente diferente
Esto permite realizar una unica reaccion en la cual estan presentes los 4 ddNTPs marcados
Los fragmentos obtenidos se separan por electroforesis capilar
La detección se realiza en un punto fijo al final de la corrida
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Secuenciación de Secuenciación de genomasgenomas
Cada reacción de secuencia es capaz de leer unas 500 pb
Como se obtuvo la secuencia continua del conjunto de los cromosomas humanos?
Cada cromosoma tiene en promedio 150Mb (genoma completo 109)
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Construcción de biblioteca de ADN genómico fragmentado al azar
Lectura de secuencias individualesLas secuencias individuales son solapadas y
ensambladas (contigs)Para asegurarse de que todas las
secuencias estén representadas se leen unas 10 veces la cantidad de bases del genoma
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La velocidad de producción de las secuencias ha ido en aumento.
Recientemente se dio un salto en este sentido con el desarrollo de los secuenciadores de “próxima generación”
No usan terminación de cadenaSe coloca una base cada vez y se detecta
cual fue incorporada a cada molécula que se esta secuenciando
Producen en una única reacción de secuencia millones de lecturas de fragmentos diferentes (paralelización)
108 1010 bases por corrida (menos de 1 día)De esta forma se secuencio el genoma
entero de Watson en menos de 1 mes a un “bajo” costo