renée ventura-clapier (châtenay- malabry)

TABLE RONDE TECHNOLOGIQUE

«Ta Cathy t’a kitté »

NAD, NADH Michel Rigoulet (Bordeaux)

ATP, ADP et AMP. Renée Ventura-Clapier (Châtenay-

Malabry)

La glycolyseGlucose extracel

mitochondries

Lactate

Dégradation du glycogène

NADH

NAD+

O'Rourke, B. et al. Physiology 2005;20:303

Production d’ATP par les mitochondries

Cr

PCr

Signalisation énergétique



NAD, NADH Michel Rigoulet (Bordeaux)

Dosage NAD+, NADH

Comme toujours 2 questions:que veut-on réellement mesurer?Quelle information attend-on de la mesure?

1) un exemple de kit

Protocole promega

La méthode même prudemment appliquée ne permet pas:

On peut cependant sur certains types cellulaires l’appliquer après une étape de séparation rapide cytosol/mitochondries

Pour la mesure du rapport des formes libres (NAD+/NADH) Dans les différents compartiments, il faut appliquer la bonnevieille recette des marqueurs enzymatiques…..

de connaître les fractions liées et libres;

leur compartimentation cellulaire;

donne un rapport NAD+/NADH peu instructif

CytosolMatrice

Wilson D.F. et al, B.J. (1974) 140, 57‐64

• Si on veut estimer les changements d’états rédox du couple NAD+/NADH en direct et « localement » il existe d’autres méthodes semi-quantitatives:

• Fluorescence par exemple….



Renée Ventura-Clapier (Châtenay-Malabry)

ATP, ADP et AMP

Kits de mesure ADP/ATP

• Abcam. Ab65313. ADP/ATP Ratio AssayKit (Bioluminescent)

• BioAssay Kit de mesure ADP/ATP• ApoSENSOR™ ADP/ATP Ratio

Bioluminescence Assay Kit• Sigma-Aldrich Assay kit ADP/ATP

Description

The changes in ADP/ATP ratio have been used to differentiate the different modes of cell death and viability. Increased levels of ATP and decreased levels of ADP have been recognized in proliferating cells. In contrast, decreased levels of ATP and increased levels of ADP are recognized in apoptotic cells. The decrease in ATP and increase in ADP are much more pronounced in necrosis than apoptosis.

Principe du test

• The assay involves two steps. In the first step, the workingreagent lyses cells to release ATP and ADP. In the presence of luciferase, ATP immediately reacts with the Substrate D-luciferin to produce light. The light intensity is a direct measureof intracellular ATP concentration.

ATP + D-luciferin + O2 ⇒ oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + light

• In the second step, the ADP is converted to ATP through an enzyme reaction. This newly formed ATP then reacts with the D-luciferin as in the first step. This non-radioactive, homogeneous cell-based assay is performed in microplates.

AMP-Glo™ Assay

Interférence avec l’ATP

Régulation des ATPases

• La réaction ATPasiqueMgATP + H2O ⇒ MgADP + Pi + H+

• Régulation cinétiquePotentiel de phosphorylation Pp = [ATP] /[ADP] + Pi cœur normal > 300 mM-1

• Régulation thermodynamiqueEnergie libre d’hydrolyse d’ATPΔG~ATP= ΔG0

~ATP – RT ln [ATP]/[ADP].[Pi]Cœur normal 60-70 kJ/mol selon les substrats

ΔGATP ex: le cœur

Ingwall JS ATP and the heart. Kluwer academics publisher 2002

Compartimentation des nucléotides

ATPase

ATP ADP

mito

mitochondries

Créatinekinase

complexes glycolytiques

cytosol

Adenylatekinase

Méthodes de mesure des nucléotides

• Dosages enzymatiques• HPLC • Luminescence, kits• 31P Résonance magnétique nucléaire

Comment mesurer les nucléotides

• Rapide«Freeze clamp» des tissus (secondes)• Conserver à -80°C (stable pour ~ 3 ans)• Homogénéiser les tissus dans l’azote liquide• Extraction à l’acide (perchlorique) pour

dénaturer les protéines• Prélever le surnageant et le neutraliser

Mesure des nucléotides par HPLC

colonnes Partisil SAX. Détection à 254 nm

Normalisation par:poids frais, poids sec, protéines tissulaires, volume d’eau intracellulaire


Mesure des nucléotides par spectrophotométrie

– PCr et ATPATP + Glucose ⇒ Glucose 6 phosphate

HexokinaseGlucose 6 phosphate + NADP ⇒ gluconate 6Phosphate + NADPH

Glucose 6P dehydrogénasePCr + ADP ⇒ ATP + Créatine

Creatine kinase- ADP et AMP

ADP + PEP + ⇒ ATP + pyruvatePyruvate kinase

Pyruvate + NADH + H+ ⇒ lactate + NAD+LDH

AMP+ATP ⇒ 2ADPAdenylate kinase

– CréatineCréatine + diacetyl a-naphtol = réaction colorée rouge

– PiPi + Ascorbate + molybdate = réaction colorée bleue

Bergmeyer HU Methods of enzymatic analysis. Academic Press 1974

340 nm

340 nm

520 nm

820 nm

Luminescence

Luminescence de la luciférase

ATP + D-luciferin + O2 ⇒ oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + light

Myokinase pour mesurer l’ADP2ADP ⇔ ATP + AMP

Mesure des nucléotides par RMN 31P

[H]+ [Mg]++

[sucres P]

[Phosphateinorganique]

[PhosphoCréatine]

[ATP]

βαγ

Pi

PCr

γ -A

TP

α -A

TP

β -A

TP

SP

-20 ppm-10010

O2

PERFUSAT

SONDE

Jauge de pression

PCr, ATP, Pi

Pas l’ADP ni l’AMP

Mesures d’ADP, AMP, Pi• Mesurer dans des extraits n’est pas fiable, pourquoi?

• Pour l’ADP: surtout dans les tissus musculaires, l’ADP est lié à de nombreuses macromolécules

• ADP mesuré = ADP actif + ADP lié

• C’est identique pour l’AMP

• AMP mesuré = AMP actif + AMP lié

• Pour le Pi: problème de la labilité de la PCr ou ATP

ADP ADP ADP ADP ADP ADP ADP ADP

Filament d’actine

Contenus mitochondriaux• Dans le cœur 30-40% du volume est mitochondrial

• Les mitochondries de foie contiennent une forte proportion de nucléotides adényliques

Joubert et al Biochemistry 2001, 40, 2129-2137

Détermination des nucléotides métaboliquement actifs dans le muscle

• Les valeurs ATP, PCr, PI, sont données par 31P RMN ou spectrophotométrie

• L’ADP est calculé par la réaction CKPCr + ADP + H+ ⇔ Cr + ADP

[ADP] = [ATP].[Cr]/Keq[PCr].[H+]

• L’AMP est calculé par la réaction AK ou myokinase

2[ADP] ⇔ [ATP] + [AMP][AMP] = [ADP]2 / [ATP].Keq

Comparaison des mesures par HPLC et RMN


ΔGATP ex: le cœur

ischémie

RMN + calculsΔGATP = -58,7 kJ/mole11 mM ATP40 µM ADP5 mM Pi

Valeurs HPLC/spectroΔGATP = -49,3 kJ/mole11 mM ATP1,5 mM ADP5 mM Pi

RMN ischémieΔGATP = -43 kJ/mole3,4 mM ATP1,9 mM ADP41 mM Pi

HPLCspectroRMN

[Nucléotides] dans le coeur

Ingwall JS ATP and the heart. Kluwer academics publisher

1,17ADPtotal0.040.22ADP free

0.0064 (0.2)ADPf/ATP

0,231.4AMPtotal0.00020.0014AMPfree

0.04*10-3 (0.04)AMP/ATP

634ATPmMnmol/mg protein

Zhang L et al. AJP 2007;293:H457-H466

Sensibilité de l’AMPK à l’AMP

• Total [AMP] par HPLC: 350 µM. [AMP] cytosolique par RMN: 0,4 µM

L’activité de l’AMPK corrèle avec le contenu en AMP cytosolique

alors que l’ AMP total et le rapport AMP/ATP ne changent pas.

Cyt AMP Total AMP

totalAMP/ATP cytAMP/ATP

Km=2 µM

Frederich, Balschi JBC 2002;277:1928-32

AMP kinase et hypertrophie cardiaque

Tian R et al. Circulation 2001 104(14):1664-9

Dans la littérature coeur• The Journal of Biological Chemistry

Abcam assay kit.

ADP/ATP ratio 0.82 ± 0.28

• Antioxidant & Redox SignalingATP assay kit (Bioluminescence assay kit HS II; Roche)

40 µM ATPATP

Dans « Cell metabolism » muscle et foie

(kit Roche)

ATP5 µM

(HPLC)

Dans le muscle

Dans le foieATP

13000 mMATP

0.12µM

tissu hépatocyte

tissu C2C12

ATP0.33 µM

tissu

tissu

Calculer les nucléotides dans le foie

• On utilise les réactions de la glycolyse àl’équilibre pour calculer l’ADP

• Et l’adénylate kinase pour calculer l’AMP

2[ADP] ⇔ [ATP] + [AMP][AMP] = [ADP]2 / [ATP].Keq

Conclusions

• Les nucléotides sont compartimentés.• Les [] métaboliquement actives d’ADP et

AMP sont << concentrations totales• Les nucléotides sont très labiles• Aucune méthode ne mesure les

concentrations métaboliquement actives• Elle ne peuvent qu’être calculées• Dans tous les cas, vérifier les valeurs

absolues!!!!!!

renée ventura-clapier (châtenay- malabry)

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