renan gomes toledo - uenf1.2.3 fatores de virulência e mecanismos de evasão..... 10 1.2.3.1 pb18 e...

INTERAÇÕES ENTRE O FUNGO PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS E O

SISTEMA COMPLEMENTO: COMPARAÇÃO ENTRE CEPAS DE ALTA

E DE BAIXA VIRULÊNCIA

RENAN GOMES TOLEDO

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE - UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ,

ABRIL DE 2008.




RENAN GOMES TOLEDO

Dissertação de Mestrado apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro como parte das exigências para obtenção do Título de Mestre em Biociências e Biotecnologia.

Orientadora: Drª. Thereza Liberman Kipnis

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE - UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ,

ABRIL DE 2008.




RENAN GOMES TOLEDO

Dissertação de Mestrado apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro como parte das exigências para obtenção do Título de Mestre em Biociências e Biotecnologia.

Aprovada em 04 de abril de 2008

Comissão examinadora:

THEREZA LIBERMAN KIPNIS (ORIENTADORA – IN MEMORIAM)

Ph.D, Ciências Biomédicas – LBR/UENF

WILMAR DIAS DA SILVA (CO-ORIENTADOR) Ph.D, Ciências Biomédicas – LBR/UENF

MILTON MASAHIKO KANASHIRO Doutor em Imunologia – LBR/UENF

MARIA DE FÁTIMA SARRO DA SILVA Doutora em Microbiologia – LBCT/UENF

ANTÔNIO CARLOS DA SILVA Doutor em Imunologia – DBCG/UERJ

IV

Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biologia do Reconhecer do Centro

de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy

Ribeiro.

Apoio Financeiro:

- Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF)

- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

- Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de

Janeiro (FAPERJ)

V

Dedico este trabalho

a meus pais e

à minha amada esposa Marina.

VI

ÍNDICE

RESUMO.................................................................................................................. X

ABSTRACT.............................................................................................................. XI

ABREVIATURAS E SIGLAS................................................................................... XII

ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS......................................................................... XIII

1. INTRODUÇÃO.................................................................................................... 01

1.1 O SISTEMA COMPLEMENTO......................................................................... 01

1.1.1 A via clássica................................................................................................ 02

1.1.2 A via alternativa............................................................................................ 03

1.1.3 A via das lectinas......................................................................................... 04

1.1.4 A regulação do sistema complemento...................................................... 05

1.2 A PARACOCCIDIOIDOMICOSE...................................................................... 06

1.2.1 Breve histórico, ecoepidemiologia e classificação.................................. 06

1.2.2 Manifestações clínicas, diagnóstico e tratamento................................... 08

1.2.3 Fatores de virulência e mecanismos de evasão....................................... 10

1.2.3.1 Pb18 e Pb265: caracterização do grau de virulência............................. 11

1.2.4 Mecanismos de resistência à paracoccidioidomicose............................. 13

1.2.4.1 A paracoccidioidomicose e o sistema complemento............................ 13

2. OBJETIVO........................................................................................................ 16

3. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................. 17

3.1 ANIMAIS PARA EXPERIMENTAÇÃO............................................................. 17

3.2 MANIPULAÇÃO DO P. brasiliensis................................................................ 17

3.2.1 Cepas............................................................................................................. 17

3.2.2 Manutenção do fungo em cultura................................................................ 17

3.2.3 Reativação dos fatores de virulência.......................................................... 18

3.2.4 Viabilidade fúngica.......................................................................................

fúngica........................................................................................

18

3.2.5 Preparo de leveduras vivas de P. brasiliensis para ensaios in vitro de ativação do complemento.....................................................................................

18

3.2.6 Preparo de extrato de leveduras vivas de P. brasiliensis para ensaios in vitro de ativação do complemento...................................................................

19

VII

3.2.7 Liofilização de leveduras vivas de P. brasiliensis para ensaios in vitro de ativação do complemento................................................................................

19

3.3 OBTENÇÃO DO SORO HUMANO.................................................................... 20

3.4 ENSAIOS DE ATIVAÇÃO E CONSUMO DO COMPLEMENTO...................... 20

3.4.1 Delineamento

experimental..........................................................................

20

3.4.1.1 Preparo de zymosan para ensaios imunoenzimáticos................................. 21

3.4.1.2 Preparo de imunocomplexos para ensaios imunoenzimáticos.................... 21

3.4.1.3 Preparo de manana para ensaios imunoenzimáticos.................................. 21

3.4.2 Titulação do sistema complemento............................................................ 21

3.4.2.1 ELISA – fragmentos de C3 e C4.................................................................. 21

3.4.2.2 ELISA – MBL ............................................................................................... 22

4. RESULTADOS.................................................................................................... 24

4.1 CONSUMO DE C4 POR EXTRATO BRUTO DE P. brasiliensis.................... 24

4.2 CONSUMO DE C3............................................................................................ 25

4.3 DOSAGEM DE MBL RESIDUAL...................................................................... 26

4.4 ENSAIOS COMPARATIVOS ENTRE VIA CLÁSSICA E VIAS DAS

LECTINAS...............................................................................................................

27

5. DISCUSSÃO........................................................................................................ 37

6. CONCLUSÕES.................................................................................................... 44

7. PRÓXIMAS ETAPAS........................................................................................... 45

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 46

9. ANEXOS.............................................................................................................. 58

VIII

RESUMO

A blastomicose sul-americana, doença de Lutz-Splendore-Almeida ou

paracoccidioidomicose (PCM) é causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis (P.

brasiliensis), cujas manifestações clínicas estão relacionadas com lesões

granulomatosas localizadas nos pulmões até infecção disseminada.

O P. brasiliensis, possui em sua parede celular um repertório de carboidratos

composto por resíduos de manose. Esses resíduos são potenciais candidatos à

ativação da via das lectinas do sistema complemento. Esse sistema é composto

pelas vias clássica, alternativa e das lectinas. Cada uma delas é iniciada por

ativadores distintos, mas acabam por convergir para um ponto em comum da

cascata, culminando na formação de um poro protéico lítico para patógenos.

Este trabalho estudou a ativação da via das lectinas do sistema complemento

humano pelo consumo dos componentes C4 e MBL, elementos chave dessa via.

Avaliamos também as diferenças de consumo desses componentes por leveduras

de cepas com graus de virulência distintos: Pb18 (altamente virulenta), Pb18 (94)

(variante avirulenta da Pb18) e Pb265 (levemente virulenta).

Nossos resultados mostraram que o P. brasiliensis é capaz de consumir C4 e

MBL em condições favoráveis para ativação da via das lectinas. Verificamos também

que as cepas Pb265 e Pb18(94) consomem C4 em maiores níveis do que a cepa

Pb18. Ao contrário, culturas de Pb18 que estavam sendo subcultivadas por longos

períodos, tiveram seu nível de depleção de C4 reduzido se comparado com o Pb18.

Os ensaios foram realizados com leveduras vivas ou liofilizadas e os resultados

foram equivalentes.

Concluímos que o P. brasiliensis foi capaz de consumir os componentes MBL

e C4 nas condições experimentais utilizadas, o que indica fortemente que o fungo

pode ativar a via das lectinas do sistema complemento humano, in vitro.

Palavras-chave: Paracoccidioides brasiliensis; sistema complemento; via das

lectinas; ELISA.

IX

ABSTRACT

The South-American blastomycosis, Lutz-Splendore-Almeida’s disease or

paracoccidioidomycosis (PCM) is caused by Paracoccidioides brasiliensis (P.

brasiliensis) fungus, which clinical manifestations is associated with granulomatous

lesions in lungs to disseminated infection.

P. brasiliensis possess on its cell wall a carbohydrate repertoire that is

composed by mannose residues. These residues are potentials candidates for lectin

pathway activation. The complement system is formed by classical pathway,

alternative pathway and lectin pathway. Each one of them is initiated by distinct

activators, but they finish for converging in common to a point of the cascade,

culminating in the formation of litic proteic pore for pathogens.

This work studied the activation of the lectin pathway of the human

complement system for the consumption of the C4 and MBL components, elements

key of this pathway. We also evaluate the differences of consumption of these

components for yeasts with distinct degrees of virulence: Pb18 (high virulence), Pb18

(94) (non virulent variant of the Pb18) and Pb265 (low virulence).

Our results showed that the P. brasiliensis is capable to consume C4 and MBL

in favorable conditions for lectin pathway activation. We also perceive that strains

Pb265 and Pb18(94) consumes C4 in highest levels that strain Pb18. In contrast,

cultures of Pb18 that they were being subcultivated for long periods, had its level of

depletion of reduced if compared C4 with the Pb18. The assays were carried through

with alive or liofilized yeasts and the results were equivalents.

We conclude that P. brasiliensis was capable to consume components MBL

and C4 in conditions experimental used, what strong indicates that fungus can

activate the lectin pathway of the human complement system, in vitro.

Keywords: Paracoccidioides brasiliensis; complement system; lectin pathway;

hemolytic assay; ELISA.

X

ABREVIATURAS E SIGLAS

CaCl2 Cloreto de cálcio

ECA e ECO Respectivamente, eritrócitos de carneiro e eritrócitos de coelho

EDTA Ethylenediaminotetraacetic acid

EGTA Ethylene glycol-bis[-aminosehtylenether]-N,N,N’,N’-tetraacetic acid

ELISA Enzyme-linked immunosorbant assay

GVBS Tampão VBS com gelatina

HCl Ácido clorídrico

H2O2 Peróxido de hidrogênio

H2SO4 Ácido sulfúrico

IgG Imunoglobulina da classe G

MAC Complexo de ataque à membranas (Membrane attack complex)

MBL Lectina ligante de manose (Mannose-binding lectin)

MgCl2 Cloreto de magnésio

NaCl Cloreto de sódio

OPD Ortofenildiamina

PBS Tampão fosfato-salina (Phosphate buffer saline)

PCM Paracoccidioidomicose

SFE Salina fisiológica estéril

SC Sistema complemento

SHN Soro humano normal

VBS Tampão veronal-salina (Veronal Buffer Saline), pH 7,5

VA Via alternativa do sistema complemento

VC Via clássica do sistema complemento

VL Via das lectinas do sistema complemento

XI

ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1: Dosagem por ensaio imunoenzimático de C4c depositado em poços

sensibilizados com extratos de Pb18 e Pb265.....................................................

24

Figura 2: Dosagem de fragmentos de C3 por ensaio imunoenzimático.............. 25

Figura 3: Dosagem de MBL residual por ensaio imunoenzimático........................ 26

Figura 4: Deposição de C4c de soros suficiente e deficiente em MBL utilizando

ativadores da VC e da VA.......................................................................................

27

Figura 5: Deposição de C4c por soros MBLdef ou MBLsuf incubados com P.

brasiliensis em condições de ativação da VC ou VL.............................................

28

Figura 6: Deposição de C1q e C4b por soros MBLsuf incubados com P.

brasiliensis em condições de ativação da VC ou VL.............................................

30

Figura 7: Consumo de C4 residual na VL de amostras pré-tratadas com Pb18

ou Pb265 nos tempos de 5, 15, 30 e 60 minutos..................................................

31

Figura 8: Consumo de C4 residual na VL ou VC de amostras pré-tratadas com

Pb18 ou Pb265 vivas ou liofilizadas em diferentes concentrações........................

32


ou Pb265 vivas em diferentes concentrações.......................................................

33

Figura 10: Consumo de C4 residual na VL de amostras pré-tratadas com Pb18,

Pb18(94) ou Pb265 vivas ou liofilizadas em diferentes concentrações..................

34

Figura 11: Consumo de C4 residual na VC de amostras de soro MBLsuf ou

MBLdef pré-tratadas com Pb18, Pb18 subcultivado, Pb18(94) ou Pb265

liofilizadas, em diferentes concentrações..............................................................

35


reisolado, Pb18 subcultivado, Pb18(94) ou Pb265 liofilizados em diferentes

concentrações.......................................................................................................

36

Toledo, R. G, 2008 – Introdução 1

1. INTRODUÇÃO

1.1 O SISTEMA COMPLEMENTO

No final do século XIX foi identificado em soro fresco um fator sensível ao

calor (55ºC) que agia “complementando” a ação de anticorpos específicos na lise de

bactérias e eritrócitos. Posteriormente, tal fator foi denominado de sistema

complemento (SC) (Bordet & Gengou, 1901).

O SC de mamíferos é formado por um conjunto com mais de 30 proteínas

encontradas solúveis no plasma ou expostas como receptores na superfície de

determinadas células. Sua ativação se dá em cascata pela interação seqüencial dos

componentes desse sistema. Muitas proteínas do complemento se apresentam no

soro como zimogênios. Dessa forma, quando há a clivagem de um dos

componentes iniciais, estes adquirem atividade enzimática e afinidade pela próxima

proteína do sistema, clivando-a. Esta última, por sua vez, age sobre o próximo

ícone da cascata e, assim, seqüencialmente. Essas sucessivas clivagens causam a

liberação de peptídeos, como C3a, C4a e C5a, que são importantes fatores

quimiotáticos, fragmentos opsonizantes e anafilatoxinas (Dias da Silva et al., 1967;

Hugli, 1981; Rother & Rother, 1986; Rother & Till, 1988; Müller-Eberhard, 1988).

A ativação do SC pode ser iniciada basicamente por três vias principais: a via

clássica (VC), a via alternativa (VA) e a via das lectinas (VL), sendo que a ativação

de cada uma delas ocorre por fatores distintos (Knoebel et al., 1974; Pangburn &

Müller-Eberhard, 1984; Ikeda et al., 1987). A via clássica ativa-se com a presença

de imunocomplexos, sendo a primeira via descrita. Em seguida descobriu-se uma

via que se ativava independentemente da presença de anticorpos sendo chamada,

então, de via alternativa. A via das lectinas foi a via mais recentemente descoberta.

Entretanto, todas elas acabam por convergir para um ponto em comum do sistema

e, a partir deste, seguem uma rota única até o fim da cascata. Resumidamente, a

VC, a VA e a VL têm em comum a ativação do terceiro componente do sistema,

chamado de C3, que é a peça central de toda cascata. Em seguida, há a ativação

sucessiva de outros componentes levando à formação do complexo lítico conhecido

como MAC (membrane attack complex) (Hu et al., 1981; Podack et al., 1982). Além

dessas três vias atualmente reconhecidas, um trabalho recente confirmou suspeitas

antigas de que o SC também poderia ser ativado por trombina na ausência de C3,


comprovando uma ligação direta com o sistema de coagulação sanguínea (Hugli,

1977; Huber-Lang et al, 2006).

Evolutivamente, a VA do SC já é encontrada nos deuterostomados desde os

equinodermos (ouriços e estrelas-do-mar) e tunicados até os mamíferos. Isso indica

que possivelmente ela é a via mais antiga do SC, e que surgiu nos animais há mais

de 700 milhões de anos atrás. A VL aparece nos agnatas (lampreias) e, a partir dos

peixes cartilaginosos e ósseos, a VC já é detectada. É interessante notar que o

aparecimento da VC está estreitamente acompanhado pelo surgimento dos

anticorpos nos peixes mandibulados. Não há, contudo, registros do SC nos

protostomados (anelídeos, moluscos e artrópodes) (Sunyer, 1998; Sahu & Lambris,

2001; Nonaka & Yoshizaki, 2004).

1.1.1 A via clássica:

O componente que inicia a ativação da VC é um grande oligômero associado

a serino-proteases chamado de C1 (410 kDa). C1 é formado pela associação de 5

moléculas: C1q(1), C1r(2) e C1s(2). C1q forma-se pela associação de subunidades

com um domínio de colágeno em forma de haste dotadas de uma região globular

em uma das extremidades. Essas subunidades unidas geram uma estrutura

semelhante a um ramalhete. Os domínios globulares seriam comparados às flores

desse ramalhete e são responsáveis pela ligação da molécula C1q a seu substrato.

Ligados a C1q estão dímeros de C1r e C1s, que são serino-proteases.

Funcionalmente C1q possui domínios que se ligam à porção Fc (fragmento

cristalizável) de anticorpos dos tipos IgM e IgG quando estes formam

imunocomplexos ou agregados. SIGN-R1, uma lectina tipo-C que atua como

receptor de carboidratos bacterianos em células dendríticas foliculares, por

exemplo, também é capaz de se ligar a C1q promovendo a ativação da via de

maneira independente de anticorpos (Kang et al., 2006). C1r torna-se ativo pelas

mudanças conformacionais derivadas da ligação de C1 a seu substrato e cliva C1s,

na presença de Ca2+, o qual adquire atividade sobre os componentes C4 e C2 (Sim,

et al., 1977; Sim, 1981; Colomb et al., 1984). C4 é clivado em C4a e C4b: C4a,

peptídeo de aproximadamente 9 kDa, possui atividade inflamatória, não participa da

cascata de ativação do complemento e é liberado do sistema; C4b, fragmento

maior, apresenta alta capacidade de ligação com superfícies celulares em geral,

principalmente de patógenos. Em seguida, C2 liga-se a C4b, na presença de Mg2+,


formando o complexo C4bC2. Este pode sofrer ação de C1 através de C1s,

gerando um novo complexo com atividade catalítica sobre C3: C4bC2b ou C4b2b

(Vogt et al., 1981; Nagasawa & Stroud, 1977). Assim como ocorre com C4, o

fragmento menor C2a não possui participação na cascata e é liberado para a fase

fluida. Essa C3 convertase cliva C3 em C3a e C3b, sendo que o menor fragmento,

C3a, não participa mais da cascata; e C3b torna-se a principal molécula

opsonizante do sistema espalhando-se e ligando-se a superfícies de patógenos.

C4b2b pode também formar uma C5 convertase através da agregação de uma

molécula de C3b ao complexo, formando C4b2b3b (Vogt et al., 1978). Ao ser

clivado pela C5 convertase anterior esse componente libera um fragmento menor,

C5a, e um fragmento maior, C5b, o qual pode ligar-se na superfície de patógenos.

Os passos subseqüentes da cascata são compartilhados por todas as três

vias: ocorre a ligação seqüencial dos demais componentes séricos da cascata, C6,

C7, C8 e, finalmente, a polimerização de C9. A estrutura formada é chamada de

C5b-9 ou MAC, onde as várias unidades de C9 formam um poro protéico com

capacidade de inserir-se em membranas celulares, levando à lise de patógenos

(Müller-Eberhard, 1984; Matsushita et al., 2000; Gadjeva et al., 2001; Fujita, 2002).

A VC é a única das vias do SC que faz conexão entre a imunidade inata e

imunidade adquirida através da ativação por imunocomplexos.

1.1.2 A via alternativa:

Na circulação sanguínea há cerca de 1 a 2 mg por mL do componente C3, a

proteína mais abundante do SC. Essa molécula, que é composta por uma cadeia α

(110 kDa) e por uma cadeia β (75 kDa), unidas covalentemente por uma ponte de

enxofre, é capaz de se ligar covalentemente à superfície de bactérias, fungos,

protozoários e helmintos através de ligações tipo éster ou amida (Tack et al., 1980).

Essa característica é adquirida após a clivagem da molécula por uma enzima (C3

convertase) ou pela hidrólise espontânea de uma ligação tioéster intracadeia α do

componente C3, que passa ser chamado de C3*H2O (Müller-Eberhard et al., 1966;

Tack et al., 1980). Entretanto, apesar desse último evento ocorrer normalmente,

sem qualquer auxílio enzimático, ele é extremamente efêmero. Assim, se a

molécula C3*H2O não se estabilizar por ligação de seus novos sítios expostos, ela

perde sua reatividade. Essa estabilidade pode ser fornecida pela ligação do C3.H2O

a um componente sérico do SC denominado fator B (fB) (Lachmann & Nicol, 1973).


Unido ao C3*H2O, o fB permite que uma outra molécula, o fator D (fD), que é uma

proteinase naturalmente ativa, clive-o em dois fragmentos: Ba, que é liberado, e Bb,

fragmento maior que permanece ligado a C3*H2O (Niemann et al., 1984). Dessa

forma, o novo complexo, C3*H2OBb, torna-se uma serino-proteinase chamada de

C3 convertase de ativação da VA. Ao atuar sobre moléculas de C3, na presença de

Mg2+, há a formação de dois fragmentos, chamados de C3a (9 kDa) e C3b (176

kDa). O fragmento maior pode, eventualmente, se ligar a superfícies celulares

atuando como agente opsonizante e/ou ligando-se a moléculas de fB e transformar-

se em uma C3 convertase (C3bBb) que amplificará a cascata clivando mais C3

(Müller-Eberhard & Schreiber, 1980). Essa enzima pode ainda unir-se a outra

unidade de C3b, o que faz surgir um novo complexo enzimático: C3bBb3b, que

passa a ter o componente C5 como substrato (Medicus et al., 1976; Discipio, 1981).

Em seguida, a ativação da VA encontra o ponto comum entre as três vias, podendo

culminar na formação do MAC como já descrito para a VC.

1.1.3 A via das lectinas:

A via das lectinas ou via das lectinas ligantes de manose (VL) do SC é a via

mais recentemente descrita (Mizuno et al., 1981; Kawasaki et al., 1983). A ativação

dessa via é feita por microorganismos que possuem em sua superfície

componentes ricos em resíduos de carboidratos. Esses resíduos interagem com

uma proteína denominada MBL (mannose-binding lectin), que é um tipo de lectina

encontrada no soro animal sob as formas mono ou oligomérica. A MBL está

agrupada na família das colectinas, denominação de lectinas que possuem

domínios de colágeno em sua estrutura, e que comporta outras lectinas como as

proteínas surfactantes A e D encontradas na mucosa do trato respiratório (Malhotra

et al., 1994; Gadjeva et al., 2001).

A MBL é composta por uma região amino-terminal rica em cisteína, uma

região de colágeno em forma de haste e uma região globular chamada CRD

(carbohydrate recognition domain) que reconhece grupamentos hidroxil nas

posições 3 e 4 de anéis de piranose de resíduos de manose e N-acetil-glucosamina

(GlcNAc) devidamente espaçados na superfície de microorganismos ou mesmo em

células de vertebrados (Holmskov et al., 1994; Hansen & Holmskov, 1998).

Recentemente, McMullen et al. (2006) demonstraram in vitro e in vivo que a MBL

também seria capaz de se ligar à anticorpos tipo IgM, gerando ativação da VL.


Essa molécula forma grandes oligômeros de 3 a 6 subunidades (~350 kDa) e

sua estrutura aparenta-se com a de um ramalhete, semelhante à molécula C1q

(Hansen & Holmskov, 1998; Gadjeva et al., 2001). Associadas aos oligômeros de

MBL estão duas moléculas chamadas de MASP-1 e MASP-2 (MBL-associated

serine protease) (Matsushita & Fujita, 1992; Thiel et al., 1997; Thiel et al., 2000).

Quando uma MBL liga-se em seu substrato na presença de Ca2+ e Mg2+, as MASP-

1 e -2 agem sobre dois componentes do SC, C4 e C2, clivando-os em dois

fragmentos cada: C4b e C2b, fragmentos maiores, e C4a e C2a fragmentos

menores. Enquanto esses últimos são liberados, os dois primeiros unem-se

organizando uma enzima C3 convertase (C4b2b) que fica aderida na membrana do

patógeno, semelhante ao que ocorre na VC. Essa enzima, além de clivar C3 em

C3a e C3b, pode também formar uma C5 convertase através de sua ligação a uma

molécula de C3b (C4b2b3b) (Matsushita & Fujita, 1992; Matsushita et al., 2000).

Selander et al. (2006) comprovaram que MBL também seria capaz de gerar C3

convertases em soro humano deficiente de C2, indicando uma ligação até não

observada com a VA.

Como já detalhado para a VC, a cascata de ativação da VL pode dar

continuidade e alcançar a seqüência comum às três vias: a formação do complexo

de ataque a membranas, o MAC.

1.1.4 A regulação do sistema complemento:

A regulação da ativação do SC necessita de precisão e eficiência. Tal

regulação é alcançada pela presença de várias proteínas plasmáticas ou ancoradas

em membranas celulares que interrompem e impedem a ativação do sistema. O

consumo desnecessário de componentes e a prevenção de danos ao próprio

organismo são os objetivos essenciais dessa regulação.

Controlando a VC, existe um regulador importante chamado de inibidor de C1

(C1-Inh). Essa proteína encontra-se ligada reversivelmente no complexo C1.

Quando C1 liga-se a regiões Fc de anticorpos em imunocomplexos, C1-Inh desloca-

se permitindo que C1r e C1s ativem-se e clivem C4 e C2. Após um determinado

período de clivagem, C1-Inh liga-se irreversivelmente nas serino-proteases C1r e

C1s, impedindo posteriores clivagens de seus substratos (Ziccardi, 1981; Perkins,

1990).


Outro importante regulador do sistema é o chamado fator I (fI), que atua

sobre os componentes C3b e C4b, clivando-os em outros fragmentos como iC3b e

iC4b, que posteriormente são clivados pelo mesmo fator em C3c, C3dg e C3f; e C4c

e C4d, respectivamente. Esses fragmentos liberados podem opsonizar

imunocomplexos circulantes e membranas celulares, mediando sua ligação a células

que contenham receptores para complemento em sua superfície e subseqüente

fagocitose. C3b, por exemplo, é ligante para o receptor CR1 (complement receptor

1); iC3b é ligante para os receptores CR1, CR3 e CR4; e C3dg é ligante para CR2.

(Fujita et al., 1978; Nagasawa et al., 1980; Lachmann et al.,1982).

Outro mecanismo regulador aumenta o tempo de decaimento das

convertases do SC é uma proteína denominada DAF (decay accelerating factor)

Para isso, proteínas de membrana como a DAF, e proteínas do soro como o fator H

(fH) e a C4BP (C4b binding protein) atuam eficazmente sobre as C3 e C5

convertases do sistema. Fator H e C4BP atuam também como co-fatores do fI, o

que otimiza a clivagem de C3b e C4b (Gigli et al., 1979; Medof et al., 1984,

Kinoshita & Nussenzweig, 1984).

Atuando diretamente sobre o complexo lítico MAC, existem também alguns

reguladores como a vitronectina, a clusterina, a HRF (homologous restriction factor)

e a CD59 (cluster of differentiation 59). Essas proteínas, ancoradas à membrana ou

solúveis no plasma, atuam sobre o complexos C5b-8 ou C5b-9 bloqueando sua

formação (Muller-Eberhard, 1984; Podack & Tscohpp, 1984; Podack et al., 1984;

Peitsch & Preissner, 1988).

1.2 A PARACOCCIDIOIDOMICOSE

1.2.1 Breve histórico, ecoepidemiologia e classificação:

A blastomicose sul-americana, doença de Lutz-Splendore-Almeida ou

paracoccidioidomicose (PCM) é causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis

(P. brasiliensis), cujas manifestações clínicas estão relacionadas com lesões

granulomatosas localizadas nos pulmões até infecção disseminada. Foi descrita em

1908 por Adolf Lutz, mas apenas em 1971, após um simpósio em Mendelin,

Colômbia, é que o termo “Paracoccidioidomicose” foi oficialmente reconhecido

(Lutz, 1908; Franco et al., 1994). É uma micose sistêmica restrita à América Latina


e que assume papel importante em países como Colômbia, Venezuela e,

principalmente, Brasil devido ao grande número de casos relatados, sendo o país

de maior incidência da doença (Lacaz et al., 1991; Franco et al., 1994).

O P. brasiliensis é um fungo que apresenta termodimorfismo (Negroni, 1931).

Quando no solo ou cultivado in vitro em meio sólido (25ºC), o P. brasiliensis cresce

como uma malha de hifas delgadas (0,8 a 2,5 μm de diâmetro) que podem

apresentar projeções laterais contendo pequenos esporos. Macroscopicamente

forma-se uma massa cerebriforme de textura lisa ou cotonosa, o que vai depender

da cepa e das condições de crescimento. Sob temperaturas próximas à temperatura

corpórea de seus hospedeiros (35~37ºC), os esporos modificam-se e começam a

apresentar brotamentos os quais assumem a forma de levedura, com 6 a 30 μm de

diâmetro. Essa nova forma possui um arranjo denominado “roda de leme”, no qual

uma levedura mãe é circundada por vários brotamentos de células filhas. Assim, o

fungo apresentaria duas estratégias distintas de sobrevivência: uma saprofítica,

habitando solos e outros substratos na forma filamentosa, que é a forma infectante

(através de esporos); e outra leveduriforme, dentro de seus hospedeiros (revisado

por Kwon-Chung & Bennett, 1992).

Após um século de descoberta e identificação, informações referentes à

ecologia do P. brasiliensis ainda são muito escassas. Sabe-se, por meio dos dados

epidemiológicos da doença causada pelo fungo, que este se distribui pela América

Latina, do México ao Uruguai, tendo preferência por regiões com verão úmido e

inverno seco, solos ácidos e ricos em matéria orgânica. Negroni e Albornoz são

alguns dos poucos autores que conseguiram isolar o P. brasiliensis diretamente do

solo (Argentina e Venezuela, respectivamente). Em laboratório, o fungo já foi

cultivado em diversos substratos como diferentes tipos de solo, esterco, casca de

milho, folhas do cafeeiro e outras vegetações típicas do Brasil (revisado por Kwon-

Chung & Bennett, 1992). Acredita-se que a propagação do P. brasiliensis na

natureza se dê através de esporos produzidos por sua forma micelial que poderiam

colonizar outros substratos ou infectar hospedeiros como o tatu (Dasypus

novemcinctus) e o grande morcego das frutas (Artibeus lituratus), dos quais o fungo

já foi isolado (Grose & Tamsitt, 1965; Greer & Bolanos, 1977; Naiff et al., 1986). Há

também outros relatos de isolamento do P. brasiliensis em primatas (Jonhson &

Lang, 1977), eqüinos e bovinos (Conti-Diaz & Rilla, 1972), e até mesmo de pingüins

(Garcia et al., 1993)


Atualmente o P. brasiliensis está acomodado no filo Ascomycota (PFDB -

Pathogenic Fungi Database). As classificações quanto à classe, ordem e família

ainda são muito discutidas, mas alguns especialistas da área têm apontado para a

classe Plectomycetes, ordem Onygenales, família Onygenaceae, a mesma família

da qual fazem parte os fungos Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis e

Coccidioides immitis (Bagagli et al, 2006).

Acredita-se que a família Onygenaceae surgiu há cerca de 150 milhões de

anos atrás (Jurássico). Bagagli et al. (2006) sugere que esse fato pode explicar a

relação entre o fungo e seu hospedeiro natural, o tatu (D. novemcinctus), cuja

origem data de 65 milhões de anos atrás (Paleoceno). Seriam espécies que

convivem a um tempo considerável quando comparado com o hospedeiro humano

(menos de 20.000 anos atrás, na América Latina), e que pode apresentar formas

severas da micose.

1.2.2 Manifestações clínicas, diagnóstico e tratamento:

Franco (1986) classificou a PCM em três formas principais: as formas aguda,

sub-aguda e crônica. As duas primeiras, também chamadas de PCM juvenil,

desenvolvem-se rapidamente (de semanas a poucos meses) sendo consideradas

severas devido à gravidade das lesões e à maior taxa de mortalidade dentre os

tipos de PCM, ocorrendo tipicamente em crianças e adolescentes. A forma crônica

ou adulta, no entanto, pode levar vários meses ou até anos para se manifestar e é a

micose mais comum (>90% dos casos). A doença acomete principalmente adultos

com idade entre 30 a 60 anos, afetando seriamente os pulmões, podendo

disseminar-se para outros órgãos como baço, fígado, linfonodos, etc., através da

circulação sanguínea. A PCM juvenil ocorre em igual freqüência entre crianças de

ambos os sexos (Londero & Mello, 1983). Contudo, na PCM adulta, há uma alta

incidência da micose em indivíduos do sexo masculino. A resistência do sexo

feminino a PCM é em grande parte atribuída aos hormônios derivados do estradiol

como o estrogênio. Esses compostos agem de forma inibitória na transformação

dos conídios do fungo para a forma infectante de leveduras (Restrepo et al., 1984;

Clemons et al., 1989).

Apesar do acometimento da região orofaringeal pela PCM, levando a danos

visíveis das mucosas em questão, a infecção oral não parece ser a via mais comum

de penetração do fungo. Esta afirmação é confirmada pelo fato de que cerca de


60% dos adultos e 40% das crianças habitantes de áreas endêmicas

(essencialmente trabalhadores rurais), como o estado do Rio de Janeiro, são

soropositivos para antígenos do P. brasiliensis, mas não apresentam sintomas da

doença nem sinais das lesões típicas da micose (Pedrosa, 1976). Alguns autores

(Montenegro & Franco, 1994; Del Negro et al., 1994), baseados em evidências

clínicas, postulam que a forma mais usual de infecção seja através dos pulmões. A

partir daí, o P. brasiliensis poderia atingir outras áreas do organismo ou até mesmo

ser eliminado pelo sistema imune.

O diagnóstico da PCM pode ser realizado através de métodos diretos e

indiretos (diagnóstico sorológico). A observação do estado clínico do paciente com

lesões ulcerativas na pele e, em especial, na orofaringe, esplenomegalia,

hepatomegalia, adenomegalia, emagrecimento, sinais de comprometimento do

sistema pulmonar e outros sintomas podem ser indícios da PCM. A partir daí,

exames mais gerais como raios-X do tórax, hemograma completo, provas

bioquímicas hepáticas, avaliação renal e metabólica e outros, bem como exames

específicos como imunodifusão quantitativa, a contra-imunoeletroforese e,

principalmente, o encontro de elementos fúngicos a partir de espécimes biológicos

do paciente (pus, escarro, biópsia) em microscopia ou cultivo em meio de cultura

próprio serão fundamentais para a correta avaliação do paciente (revisado por

Kwon-Chung & Bennett, 1992; Shikanai-Yasuda et al, 2006).

O P. brasiliensis é sensível aos principais antifúngicos, azólicos (cetoconazol,

itraconazol, fluconazol), sulfamídicos (sulfadiazina, associação

sulfametoxazol/trimetoprim) ou mesmo anfotericina B. Geralmente o itraconazol e a

sulfadiazina são prescritos para as manifestações mais brandas da doença,

enquanto a anfotericina B para os casos mais graves. Apesar da duração do

tratamento ser proporcional ao tipo de droga ministrada e à gravidade da doença,

em geral o tratamento é longo. Mais agravante ainda é se a micose estiver

associada à outra doença como a tuberculose, o que acontece em cerca de 5 a 10%

dos casos (Negro, 1982; Marques, 1985; Kwon-Chung & Bennett, 1992; Shikanai-

Yasuda et al, 2006).


1.2.3 Fatores de virulência e mecanismos de evasão:

Os antígenos do P. brasiliensis incluem componentes constitutivos e produtos

liberados pelo fungo, dos quais muitos são imunogênicos. Alguns já são conhecidos

há muito tempo, mas vários outros têm sido isolados e caracterizados recentemente.

A parede celular do P. brasiliensis é uma estrutura complexa formada por

glucanas, lipídeos, quitina e proteínas. A proporção desses componentes varia com

a forma do fungo: micélio ou levedura. Nos dois estados, glucanas e lipídeos

apresentam-se em proporções bastante similares, 36 a 47% e 5 a 10%,

respectivamente. As leveduras contam com 37 a 48% de quitina em contraposição

à forma micelial, com 7 a 18%. Entretanto, aquelas apresentam menor quantidade

de proteínas, 7 a 14%, quando comparadas a estas, com 24 a 41% (Kanetsuna et

al., 1969; Kanetsuna, 1972).

Dentre o repertório protéico, a glicoproteína de 43 kDa (gp43) é a molécula

mais antigênica conhecida e estudada do P. brasiliensis (Puccia et al, 1986). Essa

glicoproteína é constantemente secretada nas fases de crescimento exponencial do

fungo, mas também está constitutivamente ligada à sua parede celular. Hanna et al.

(2000) verificaram que, na presença de soro anti-gp43, a aderência do fungo a

células de mamífero era substancialmente reduzida, indicando a participação dessa

molécula nos eventos de adesão do P. brasiliensis. Popi et al. (2002) mostraram

que a gp43 atua também como inibidora da atividade fagocítica e fungicida de

macrófagos, evidenciando um mecanismo de evasão do fungo. Casabona-

Fortunato et al. (2000) identificaram um antígeno com propriedades lectínicas que é

expresso na superfície das leveduras, com predomínio nas regiões de brotamento.

Esse antígeno, que foi chamado de paracoccina, também foi capaz de se ligar à

laminina e induzir a liberação de óxido nítrico por macrófagos. Mais recentemente,

Andreotti et al. (2005) caracterizaram parcialmente uma adesina de 30kDa que se

liga especificamente à laminina. Gonzalez et al. (2005) também demonstraram a

capacidade de leveduras de P. brasiliensis em se ligar a laminina, fibrinogênio e

fibronectina através de duas proteínas de 19 kDa e 32 kDa, o que comprovou a

capacidade das leveduras de fixação aos tecidos do hospedeiro.

Gómez et al. (2001) demonstraram que leveduras de P. brasiliensis são

capazes de produzir também melanina, in vitro e durante a infecção. Silva et al.

(2006) avançou nesse sentido ao verificar que esse componente protege as

leveduras contra atividade antifúngica de macrófagos murinos por interferir em sua


ligação com receptores de lectina, diminui sua susceptibilidade à drogas como

anfotericina B, e protege as leveduras contra a ação de derivados azólicos.

Quanto aos carboidratos, análises da parede do fungo mostraram que -1,3-

glucanas constituem o principal polissacarídeo das hexoses das leveduras

enquanto que as paredes das formas miceliais são constituídas essencialmente por

-1,3-glucanas e galactomananas (Kanetsuna, 1972). Posteriormente, Azuma et al.,

(1974), estudaram a estrutura de galactomananas de várias espécies de fungos

patogênicos como Histoplasma capsulatum, Histoplasma duboisii, Blastomyces

dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, e demostraram suas propriedades

imunogênicas. San-Blas & San-Blas (1977) confirmaram essa antigenicidade, e

acrescentaram que a parede celular do P. brasiliensis não possuia a estabilidade

química anteriomente predita, mas que sua composição era dependente também

das condições ambientais. Em 1982, o mesmo grupo detectou em uma fração

solúvel em álcalis a presença de glicose, galactose e manose na forma micelial, e

essencialmente manose no estado leveduriforme do fungo. Assim, alterações de

caráter quantitativo e principalmente qualitativo desses carboidratos estariam

intimamente ligados às variações de virulência entre as diferentes cepas (San-Blas,

1982; Hogan & Klein, 1994). Toledo et al. (1995) isolaram glicolipídeos de leveduras

e micélio de P. brasiliensis e constataram reatividade de 100% com soro de

pacientes com PCM. Análises estruturais dessas moléculas revelaram a presença

de manose e galactose na proporção de 2:1. No mesmo ano, Travassos et al.,

caracterizaram o padrão de glicosilação da gp43, principal antígeno exógeno do

fungo. Esse estudo mostrou a proporção de 10:2:2 para –D-manopiranosil, -D-

galactofuranosil, e N-acetilglucosaminil, respectivamente, acentuando a presença

expressiva de resíduos de manose na glicoproteína.

1.2.3.1 Pb18 e Pb265: caracterização do grau de virulência

Em relação à virulência de algumas cepas conhecidas de P. brasiliensis,

Kashino et al. (1985) analisaram seis cepas de leveduras de P. brasiliensis quanto

às curvas de crescimento e patogenicidade a camundongos susceptíveis.

Classificaram a cepa Pb18 como a mais virulenta, e a Pb265 como a menos

virulenta. A cepa Pb2052 foi considerada virulenta, a PbSN e a IVIC Pb9 com

virulência intermediária, e a IVIC Pb267 como avirulenta. Singer-Vermes et al.


(1989) estudaram sete isolados de P. brasiliensis quanto à sua imunogenicidade e

patogenicidade também em camundongos suscetíveis ao fungo. Classificaram as

cepas Pb265 e IVIC Pb267 como levemente virulentas, as cepas Pb192, IVIC Pb9 e

PbSN como tendo virulência intermediária, a cepa Pb2052 como virulenta e,

finalmente, a cepa Pb18 como altamente virulenta. Essas duas últimas, Pb2052 e

Pb18, induziram uma forte resposta humoral específica contra o patógeno, indicando

seu grande poder imunogênico. Outro trabalho alertou para o fato de que a

virulência e imunogenicidade da cepa Pb18 poderiam ser gradualmente perdidas

quando o fungo é subcultivado por longos períodos. Esses pesquisadores também

mostraram que essa perda poderia ser recuperada através de alguns ciclos de

infecção em camundongos suscetíveis ou não com posterior reisolamento do P.

brasiliensis (Kashino et al., 1990).

Como mostrado acima, alguns trabalhos na década de 1980 caracterizaram

vários isolados de P. brasiliensis. A partir de então, as cepas Pb18 (altamente

virulenta) e Pb265 (levemente virulenta) começaram e ser usadas em modelos de

patogenicidade na PCM, já que seriam os dois extremos numa escala de virulência.

Figueiredo et al. (1993), utilizando as cepas Pb18 ou Pb265, estudou a produção do

fator de necrose tumoral (TNF) em camundongos C57Bl/6 desafiados com os dois

isolados de P. brasiliensis. O trabalho mostrou uma produção da citocina

expressivamente mais alta nos animais infectados com o Pb265 do que aqueles

infectados com o Pb18. Em 2000, Hanna et al., estudaram a aderência de leveduras

de P. brasiliensis em células Vero, in vitro. O foco do trabalho era verificar se a gp43,

que pode agir como ligante de laminina, estaria envolvida no processo de adesão e

invasão das células alvo. O grupo conseguiu demonstrar a participação da gp43

nesse processo, já que a adesão e invasão eram drasticamente diminuídas (85%)

quando o fungo era tratado com anti-gp43. Eles provaram também que o Pb18

adere-se muito mais às células Vero do que as leveduras da cepa Pb265, o que

indicaria um possível mecanismo de evasão do isolado mais virulento. Soares et al.

(2001) mostraram que monócitos humanos ativados ou não por interferon- (INF-)

não eram capazes de matar leveduras de Pb18, enquanto que monócitos ativados

adquiriam capacidade fungicida sobre leveduras de Pb265.


1.2.4 Mecanismos de resistência à paracoccidioidomicose:

A patogenicidade de alguns fungos está associada à resistência a atividade

fungicida e microbicida de polimorfonucleares (PMNs) e macrófagos (revisado por

Mansour & Levitz, 2002). O controle da infecção pelo P. brasiliensis depende de

uma resposta imune celular efetiva, geralmente associada ao padrão tipo 1 de

resposta imunológica, caracterizado pela síntese de citocinas que ativam

macrófagos e linfócitos T CD4+ e CD8+, resultando na formação de granulomas

compactos. A organização desta resposta imune celular permite o controle da

replicação do fungo, mas formas quiescentes podem persistir no interior do

granuloma. Pacientes infectados que evoluem para doença apresentam depressão

da resposta tipo 1, alteração esta que se correlaciona com a gravidade da doença.

Neste contexto, formas mais graves evoluem com predomínio de resposta

imunológica tipo 2, onde há maior ativação de linfócitos B, hipergamaglobulinemia e

altos títulos de anticorpos específicos, cuja magnitude, em geral, correlaciona-se

positivamente com a gravidade e disseminação da doença. Esta observação é

corroborada pelo encontro de queda importante do número de linfócitos CD4 nos

pacientes portadores de formas mais graves desta micose (Brummer et al., 1993;

Calich et al, 1994; Calich et al, 1998).

1.2.4.1 A paracoccidioidomicose e o sistema complemento:

As vias clássica (VC), alternativa (VA), e das lectinas (VL) do sistema

complemento exercem papel importante na opsonização e eliminação de

leveduras/fungos (Diamond et al., 1974; Kozel, 1996; Speth et al., 2004). Ainda

assim, há poucos trabalhos focados na relação entre as vias do SC e a infecção

pelo P. brasiliensis.

Calich et al. (1979) verificaram que o fungo P. brasiliensis pode induzir

consumo de C3 in vitro na presença de soro murino. Este efeito pôde ser inibido

com o prévio aquecimento do soro a 52ºC, que inativa o fator B, componente

exclusivo da VA; ou pelo tratamento com soro pré-incubado com EDTA,

seqüestrante de íons divalentes como Ca2+ e Mg2+ (co-fatores essenciais para

ativação da via clássica SC). Apesar das VC e VL necessitarem de ambos os íons

Ca2+ e Mg2+ para o funcionamento de suas serino-proteases e conseqüente

ativação das vias, a VA requer apenas a presença de Mg2+. Dessa forma, em


ambiente favorecedor da ativação da VA (na presença de EGTA juntamente com

Mg2+), não houve inibição do consumo de C3 o que confirmou a ativação da VA do

SC.

Munk et al. (1992) mostraram que em pacientes portadores da PCM havia

um aumento da relação C4d/C4, indicando a possível ativação da VC, enquanto os

níveis do fator B e Ba eram normais. Messias & Mohren (1994) fizeram algo

semelhante ao trabalho anterior, mas além de confirmarem a ativação da VC,

conseguiram detectar a ativação da VA pela quantidade significativa do fragmento

Ba no soro dos pacientes com PCM em relação aos controles. Munk & Dias da Silva

(1992) também observaram o consumo do componente C3 pelo fungo em soro

humano normal tratado com EGTA-MgCl2, bem como a ação opsonizante de alguns

componentes do complemento como C3, iC3b, C4 e C5b-9 sobre leveduras de P.

brasiliensis da cepa Pb18, através de imunofluorescência.

Fearon et al. (1978) demonstraram que resíduos de ácido siálico presentes

em membranas celulares regulam negativamente a ativação da via alternativa do

complemento pela aceleração do tempo de decaimento da C3 convertase dessa

via. Soares et al. (1993) identificaram a presença de ácido siálico na superfície de

leveduras e micélio do P. brasiliensis, sendo que em leveduras os níveis eram mais

que duas vezes maiores do que aqueles encontrados nas hifas. Dessa forma, essa

característica poderia estar sendo usada pelo patógeno como mecanismo de

proteção contra a atividade lítica do complemento.

Quanto à função lítica do MAC sobre as leveduras de Pb18, cepa

considerada virulenta, Burger et al. (1985) mostraram que camundongos deficientes

de C5 apresentavam a mesma suscetibilidade à infecção por P. brasiliensis que

animais suficientes em C5. Corroborando essa observação, Munk & Dias da Silva

(1992) utilizaram soro humano como fonte do complemento e estudaram a

deposição do complexo C5b-9 (MAC) em leveduras de Pb18. Apesar da presença

de fragmentos do complemento como C3c, C3d, C3g, fator H, fator B, C4 e C5b-9

na superfície do fungo, o que foi mostrado por ensaios de imunofluorescência,

nenhum efeito foi notado sobre a viabilidade fúngica. Calich et al. (1994), em um

trabalho sobre resistência murina à PCM experimental, também ressaltaram que

três linhagens murinas (A/Sn; A/J e DBA/2) resistentes ao Pb18 eram C5-

deficientes. Sendo o componente C5 a molécula central para a formação do MAC,

conclui-se que essa ferramenta do SC não seria efetiva contra leveduras de Pb18.


No entanto, até o momento não há nenhum estudo indicando se existiria qualquer

mecanismo evasivo do Pb18 frente ao MAC, ou mesmo fazendo um paralelo desse

comportamento com o de cepas de baixa virulência.

Em 1997, Crott et al. analisaram a interação de uma fração de

polissacarídeos insolúvel em álcalis (chamada de F1) da parede de leveduras de

PbHC e Pb18 (alta virulência), Pb9 (virulência média) e Pb265 (baixa virulência)

com o sistema complemento. A incubação das frações F1 das diferentes cepas com

soro humano normal resultou em vários graus de inibição. A fração da cepa menos

virulenta, Pb265, foi capaz de ativar mais fortemente as VC e VA do SC.

Posteriormente, o mesmo grupo (Biella et al., 2006) avaliou o efeito da fração F1 de

Pb18 sobre células B, considerando a participação dos receptores de complemento

CR1 e CR2 na regulação desses linfócitos. Verificaram in vitro que F1 aumenta a

expressão de moléculas como CD40, CD45RB e CD69, bem como aumenta a

quantidade de IgG no sobrenadante, sendo que o bloqueio dos referidos receptores

para complemento causa uma diminuição na produção dos anticorpos. Jiménez et

al. (2006) investigaram o papel do receptor de complemento CR3 na fagocitose de

conídios de P. brasiliensis por macrófagos murinos. Observaram que conídios

opsonizados com soro de camundongo tratado a 56ºC (inativação do complemento

pelo calor) e com EDTA ou com anticorpos anti-CR3 eram significativamente menos

fagocitados do que aqueles que haviam sido incubados com soro murino normal

(suficiente em complemento). Os dois trabalhos anteriores mostram o envolvimento

dos receptores de complemento CR1, CR2 e CR3 na infecção pelo P. brasiliensis

nos modelos utilizados.

Toledo, R. G, 2008 – Objetivos 16

2. OBJETIVO

Analisar comparativamente a ativação da via das lectinas do sistema

complemento humano por leveduras vivas e liofilizadas de Paracoccidioides

brasiliensis utilizando as cepas Pb18 (alta virulência), Pb18 subcultivada in vitro por

longos períodos (virulência atenuada), Pb18(94) (baixa virulência - mutante variante

da Pb18) e Pb265 (baixa virulência), in vitro.

Toledo, R. G, 2008 – Materiais e Métodos 17

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 ANIMAIS PARA EXPERIMENTAÇÃO

Camundongos machos C57Bl/6 IFN- KO cujas matrizes foram adquiridas do

CEMIB UNICAMP, foram criados e mantidos no “Biotério de Camundongos”,

LBR/CBB/UENF para recuperação dos fatores de virulência dos fungos como

descrito no item 3.2.3. Manutenção e manuseios experimentais dos camundongos

seguiram as recomendações estabelecidas pelos órgãos nacionais e internacionais

que regulam o bem estar animal.

3.2 MANIPULAÇÃO DO P. brasiliensis

3.2.1 Cepas

Neste trabalho foram utilizadas leveduras das cepas Pb18 (altamente

virulenta), reisoladas por 3 ciclos de infecção em camundongos ou subcultivadas in

vitro por longo perídodo (18 meses); Pb265 (levemente virulenta), e Pb18(94),

variante da cepa Pb18, porém avirulenta. Esta última foi gentilmente cedida pela Drª

Vera Calich (ICB/USP).

3.2.2 Manutenção do fungo em cultura

Leveduras das cepas Pb18, Pb265 e Pb18(94) foram mantidas em tubos de

vidro contendo meio de cultura sólido ágar-Sabouraud a 37C, sendo repicadas

semanalmente, e utilizadas ao 7º dia de cultura.

Porções das culturas em meio sólido eram retiradas com auxílio de uma alça

de platina e transferidas para garrafas plásticas de cultura contendo 5 ml de meio de

cultura líquido TOM (Puccia & Travassos, 1991). As culturas foram mantidas a 35C

em estufa B.O.D. (FANEM, 347), sob agitação constante na posição horizontal por

10 dias.

Para obtenção do sobrenadante de cultura, suplemento citado no item 3.2.3,

pequenas porções da cultura de leveduras de Pb265 foram colhidas com auxílio de

alça de platina e inoculadas em meio líquido TOM. Após sete dias de cultivo a fase

líquida da cultura foi coletada, centrifugada a 2.000 x g por 15 min (IEC Centra


CL3R, USA), o sobrenadante foi aliquotado em tubos tipo Falcon e estocado em

congelador convencional a -20ºC.

3.2.3 Reativação dos fatores de virulência do fungo

A recuperação ou manutenção dos fatores de virulência foi feita por 3 ciclos

de infecção/reisolamento em camundongos machos de acordo com Kashino et al.,

1990, com modificações. Foram inoculados intraperitonealmente 5,0 x 106 leveduras

em camundongos machos IFN- KO com um inóculo de 0,5 ml de PBS/animal. Ao

fim de duas semanas, fígado e baço dos animais foram colhidos, macerados em

placas de Petri (10mm) com salina fisiológica estéril e repicados sobre meio de

cultura ágar-BHI (brain-heart infusion) contendo 5% de soro eqüino e 5% de

sobrenadante filtrado de cultura líquida de Pb265 (Singer-Vermes,1992, com

modificações).

3.2.4 Viabilidade fúngica

Uma porção da cultura era colhida com alça de platina, depositada em um

tubo tipo Eppendorf e solubilizada em 1 mL de salina fisiológica. Esse tubo era

agitado por 1 a 3 min em aparelho Vortex e, posteriormente, seu conteúdo era

passado algumas vezes por um sistema de seringa/agulhas para desfazer os

grumos de células. Em seguida, as leveduras eram marcadas com o corante vital

Verde Janus B (Merck, Darmstadt, Alemanha) a 0,05% e as amostras aplicadas em

câmara de Neubauer para contagem por microscopia de campo claro, aumento de

200X (Berliner & Reca, 1966). Somente foram utilizadas preparações com

viabilidade superior a 85%.

3.2.5 Preparo de leveduras vivas de P. brasiliensis para ensaios in vitro de

ativação do complemento

Após verificação de viabilidade (item 3.2.4), as células foram lavadas três

vezes em 1 mL de salina fisiológica a 2.000 x g (IEC Centra CL3R, USA) por 5 min a

25ºC. Entre cada etapa de lavagem, as amostras foram agitadas em aparelho Vortex

por 30 segundos para sua homogeneização. O último sedimento foi ressuspendido

em 1 mL de salina fisiológica e uma pequena alíquota foi retirada, diluída 20X e


contada em câmara de Neubauer. A solução de leveduras inicial foi, então, ajustada

para o número de células desejado.

3.2.6 Preparo de extrato de leveduras de P. brasiliensis para ensaios in

vitro de ativação do complemento

O preparo do extrato total de leveduras de P. brasiliensis foi adaptado de

Borges et al. (2005). Após obtenção da massa leveduriforme de culturas em meio

sólido por raspagem superficial de colônias com alça de platina (quatro tubos de

cultura), as células foram lavadas 3 vezes em 30 ml de tampão gelado Tris-Ca2+ (20

mM de Tris-HCl pH 8,8; e 2 mM de CaCl2) contendo inibidores de proteases

(Fluoreto de fenilmetanosulfonil - PMSF a 4mM; Iodoacetamida a 5mM; EDTA a

1mM). As células foram sedimentadas por centrifugação a 5.000 x g por 5 min. Em

seguida, o tubo contendo a massa celular foi imerso em nitrogênio líquido e o

congelado foi transferido para um gral, sendo macerado mecanicamente com auxílio

de um pistilo e sob constante presença de nitrogênio líquido até sua completa

pulverização. O macerado foi, então, ressuspendido em tampão gelado Tris-Ca2+,

homogeneizado em aparelho Vortex por 15 min e centrifugado por a 12.000 x g

(Hanil Mega 21R, Korea) por 15 min a 4 ºC. O sobrenadante foi dialisado

exaustivamente em água destilada por três noites a 4ºC para retirada dos inibidores

de proteases solúveis como EDTA (possível interferência nos ensaios do

complemento) e, a seguir, foi aliquotado e estocado a –70 ºC. Parte do lisado foi

utilizada para dosagem protéica por método de Lowry (1951).

3.2.7 Liofilização de leveduras de P. brasiliensis para ensaios in vitro de

ativação do complemento

Um grama (1g) para cada cepa de leveduras de P. brasiliensis foi colhido em

tubos de cultura, lavado e centrifugado como descrito no item 3.2.5. Os

sobrenadantes foram descartados, os sedimentados contendo as células foram

congelados por N2 líquido em uma fina camada nas paredes de tubos tipo Falcon, e

as amostras foram desidratadas em aparelho liofilizador no Laboratório de Química

e Função de Proteínas e Peptídeos (LQFPP) do Centro de Biociências e

Biotecnologia (CBB) da UENF por pelo menos 24 horas.


3.3 OBTENÇÃO DE SORO HUMANO

Sangue humano foi coletado de doadores sadios, aqui nomeados normais, ou

seja, sem histórico de contato com o P. brasiliensis, em tubos de ensaio que foram

deixados em repouso por 1h a 25ºC e 1h a 4ºC para completa coagulação. A seguir,

o coágulo foi solto das paredes dos tubos com auxílio de pipeta Pasteur e

centrifugado a 1.200 x g por 5 min a 4ºC. O sobrenadante foi, então, aliquotado em

tubos Eppendorf e mantido a -70ºC até o uso.

Para os ensaios da via das lectinas do complemento, basicamente os soros

de dois indivíduos foram utilizados: um deles com nível sérico de oligômeros de MBL

considerado alto (em torno de 3.500~4.000ng/mL), e que foi chamado de MBL

suficiente (MBLsuf); o outro apresentando níveis séricos de oligômeros de MBL não

detectados pelo kit (Antibodyshop, Dinamarca) utilizado (<20ng/mL) e que foi

denominado de MBL deficiente (MBLdef).

Todas as coletas foram realizadas com o total consentimento dos doadores.

3.4 ENSAIOS DE ATIVAÇÃO E CONSUMO DO COMPLEMENTO

3.4.1 Delineamento experimental

Amostras de soro humano normal (SHN) diluídas 1:4 em tampão GVBS Mg-

EGTA (para ativação da via alternativa) ou tampão GVBS/metais (para ativação da

via clássica ou das lectinas) foram incubadas por 30min a 36ºC em banho-maria

com diferentes tratamentos: 200 L de tampão + 100 L de SHN + 100 L salina

fisiológica apenas, ou contendo os diversos ativadores (zymosan, imunocomplexos,

manana, leveduras de P. brasiliensis). As amostras foram preparadas em tubos

Eppendorf no gelo, posteriormente incubadas e, por fim, centrifugadas a 2.000 x g

por 10 min a 4°C. Os sedimentos e os sobrenadantes foram recuperados em

separados e estocados a -70°C até o uso. Sobrenadantes foram usados para

analisar por métodos hemolíticos o estado funcional da cascata de ativação do

sistema complemento e quantificar pelo método de ELISA (Enzyme-linked

immunosorbent assay) componentes individuais posicionados em pontos chaves das

vias VC, VL e VA.


3.4.1.1 Preparo de zymosan para ensaios imunoenzimáticos

Parede celular de leveduras de Saccharomices cerevisae liofilizadas

(zymosan) foi colhida com auxílio de espátula, pesada e lavada em tubos Eppendorf

de 1,5 mL contendo 1 mL de salina fisiológica estéril. A cada etapa de lavagem, os

tubos eram semi-imergidos em água fervente por 5 min. A seguir, os tubos eram

centrifugados a 500 x g, o sobrenadante era desprezado, e um novo processo de

lavagem era iniciado até completar três vezes. O último sedimentado era utilizado

nos experimentos.

3.4.1.2 Preparo de imunocomplexos para ensaios imunoenzimáticos

O preparo de imunocomplexos foi feito pela incubação de soros de coelho

imunizados com ovalbumina (OVA) diluídos 1/4 em salina fisiológica e inativados a

56ºC por 45 min, juntamente com solução de ovalbumina em salina fisiológica. O

conjunto OVA/soro anti-OVA foi incubado por 60 min em banho-maria a 37ºC, e o

sedimentado contendo os imunocomplexos foi lavado três vezes em salina

fisiológica e ajustado para os ensaios.

3.4.1.3 Preparo de manana para ensaios imunoenzimáticos

Soluções-estoque de manana (Sigma, USA) em salina fisiológica eram

preparadas e congeladas a -20ºC para uso nos experimentos como fonte de manose

exógena.

3.4.2 Titulação do sistema complemento

3.4.2.1 ELISA - fragmentos de C3 e C4

Para detecção de fragmentos de C3 e C4 residuais, placas de 96 poços de

fundo plano (Nunc, MaxiSorp, USA) foram sensibilizadas com 10g/ orifício de

manana (via das lectinas) ou 1g de IgG humana (via clássica) em 100L de tampão

de cobertura por 2h a 37ºC em estufa. Em seguida, os poços foram bloqueados com

200L de BSA a 1% em PBS a 4ºC por toda noite (overnight – o.n.) (Roos et al.

2003).


Para verificar a formação dos fragmentos de C3 e C4 não residuais, placas de

96 poços foram sensibilizadas com diferentes tratamentos como tampão, zymosan,

manana, extrato de leveduras de Pb18 e Pb265, etc por 2h a 37ºC em estufa. Esses

poços foram bloqueados com 200L de BSA a 1% em PBS por 1h a 25ºC.

As placas preparadas conforme as descrições acima foram lavadas 03 vezes

com PBS e incubadas por 3 min a 37ºC em banho-maria com as amostras obtidas

conforme item anterior. É importante frisar que a aplicação das amostras é feita com

a placa sobre o gelo, para evitar ativação indesejada.

Desse ponto em diante, o procedimento foi o mesmo para todos os ensaios já

descritos neste item. As placas foram lavadas três (03) vezes com tampão PBS

contendo 0,05% de Tween20 (PBST 0,05%) e a possível deposição dos

componentes C3b, C4b ou fator Bb foi detectada por ELISA (Enzyme-linked

Immunosorbent assay) usando-se IgG policlonal de cabra anti-C3 (Sigma, USA), ou

IgG policlonal de coelho anti-C4 (Sigma, USA), ou IgG monoclonal de camundongo

anti-fB (Quidel, USA) como anticorpos primários. Após três (03) lavagens com PBST

0,05%, IgGs anti-IgG de cabra (Caltag, USA), ou anti-IgG de coelho (Sigma, USA),

ou anti-IgG de camundongo (Caltag, USA), todos conjugados a peroxidase, foram

usados como anticorpos secundários. Os poços foram lavados mais 03 vezes com

tampão PBST 1,0%.

A atividade da peroxidases foi detectada pela adição de 50L de solução

contendo OPD e H2O2. Após 5 min, a reação foi párada com 50L de H2SO4 3N e a

absorbância foi medida a 492 nm por leitor de microplacas (Dynatech MR 5000,

USA).

Mais detalhadamente, 40L/orifício de anti-C3 ou anti-C4 (1/3000 em solução

de bloqueio) foram adicionados e as placas foram incubadas por 1h a temperatura

ambiente. 40L/orifício de IgG anti-cabra (1/4000 em solução de bloqueio) ou IgG

anti-coelho (1/2000 em solução de bloqueio) conjugados à peroxidase foram

adicionados aos poços e as placas incubadas por 1h a temperatura ambiente.

3.4.2.2 ELISA – MBL

Os níveis de MBL residual foram medidos utilizando-se o kit MBL-oligomer

ELISA – Microwell strip version (Antibodyshop, Dinamarca). As amostras preparadas

conforme item 3.3.1 foram diluídas 1/100 em tampão de diluição e 100L foram


pipetados, em duplicata, em cada orifício. Após 1h de incubação sob constante

agitação (200 ciclos/min) e a 25ºC (Agitador Nova Técnica NT145, Brasil), o

conteúdo dos poços foi devidamente descartado e esses foram lavados três vezes

com 300L de solução de lavagem. A seguir, 100L de anticorpo monoclonal

biotinilado anti-MBL humana (específico para o domínio ligante de carboidratos da

MBL) foram aplicados em todos os poços e a placa foi incubada nas mesmas

condições descritas anteriormente. A placa foi, então, lavada como já descrito.

100L de streptavidina – HRP foram pipetados nos poços e esses foram incubados

e lavados como já citado. Logo após, os poços receberam 100L de solução

substrato TMB e as placas foram incubadas sem agitação e na ausência de luz por

15 min à temperatura ambiente. A reação foi interrompida pela adição de

100L/orifício de solução para tal fim. A placa foi gentilmente agitada por 20

segundos e lida a 450 ηm em leitor de ELISA.

A curva padrão para o ensaio foi construída a partir das leituras das amostras

padronizadas do próprio kit.

Toledo, R. G, 2008 – Resultados 24

4. RESULTADOS

4.1 CONSUMO DE C4 POR EXTRATO BRUTO DE P. brasiliensis

A fim de avaliar a ativação e deposição do componente C4 do complemento

por extrato bruto de leveduras de Pb18 (cepa altamente virulenta) e Pb265 (cepa

levemente virulenta), tais extratos foram obtidos como descrito no item 3.2.6 e

utilizados para forrar poços de placas de 96 poços. Os objetivos desse experimento

inicial foram identificar possíveis diferenças de ativação entre extratos de leveduras

de P. brasiliensis com diferentes graus de virulência, e ajustar um valor ótimo de

diluição para os extratos em questão. Os poços foram sensibilizados com

imunocomplexos (1g/poço), ou extratos das leveduras de Pb18 e Pb265 (ambos a

10g/poço), ou apenas com o tampão GVBS/metais. As placas receberam 100L

de SHN nas diluições apontadas na figura 1, sendo que o soro da amostra IC EDTA

foi diluído em tampão GVBS-EDTA e os demais diluídos em GVBS/metais. Após

incubação dos soros, a deposição de C4c do complemento foi avaliada. Houve

deposição acentuada de C4c pelos extratos de P. brasiliensis, apesar de não ter

havido diferença significativa na deposição de fragmentos de C4 por extratos das

cepas em questão nas diluições utilizadas. A diluição de 1:8 foi aquela onde

obtivemos os melhores títulos de deposição dos extratos nas repetições realizadas e

que foi utilizada como padrão para os experimentos posteriores. Os controles

negativos apenas com GVBS/metais e IC EDTA, assim como o controle positivo com

IC, funcionaram como esperado.


Figura 1: Dosagem por ensaio imunoenzimático de C4c: soro humano incubado em

poços sensibilizados com: tampão GBVS/metais; imunocomplexos de anti-OVA/OVA

(1g/poço) em tampão GVBS/metais; imunocomplexos de anti-OVA/OVA (1g/poço) em

tampão GVBS-EDTA; extrato de Pb18 (10g/poço); e extrato de Pb265 (10g/poço). Média de duas repetições em triplicata por amostra.

4.2 CONSUMO DE C3

Utilizando mesmo modelo experimental do item anterior só que com os soros

diluídos apenas em 1:8, fizemos a dosagem da deposição de C3 sobre poços

forrados com extrato de Pb18 e Pb265. As figuras 2a e 2b mostram ensaios

semelhantes, mas com controles diferentes: figura 2a com imunocomplexos,

ativador da VC, e figura 2b com manana, ativador da VL. Controles negativos e

positivos dos dois experimentos se comportaram como esperado. Assim como para

C4, o ensaio confirmou a deposição de C3 pelos extratos estudados. Contudo, entre

os extratos não houve diferença nos níveis de deposição do componente C3.

a)


Figura 2: Dosagem de fragmentos de C3 por ensaio imunoenzimático. a) Ensaio com controles para VC. Soro humano incubado em poços sensibilizados com: tampão

GBVS/metais; imunocomplexos de anti-OVA/OVA (1g/poço) em tampão GVBS/metais;

imunocomplexos de anti-OVA/OVA (1g/poço) em tampão GVBS-EDTA; extrato de Pb18

(10g/poço); e extrato de Pb265 (10g/poço) b) Ensaio com controles para VL. Soro humano incubado em poços sensibilizados com: tampão GBVS/metais; imunocomplexos de

anti-OVA/OVA (1g/poço) em tampão GVBS/metais; manana (1g/poço) em tampão

GVBS/metais; manana (1g/poço) em tampão GVBS-EDTA; extrato de Pb18 (10g/poço); e

extrato de Pb265 (10g/poço). Dados de uma de três repetições com valores similares. Barras tipo (T) representam a M±DP de triplicatas para cada amostra.

4.3 DOSAGEM DE MBL RESIDUAL

Para avaliar o consumo de MBL pelo P. brasiliensis e verificar possíveis

diferenças de ativação entre cepas com graus distintos de virulência, diga-se Pb18

(altamente virulenta), Pb265 (levemente virulenta) e Pb18(94) (variante avirulenta da

Pb18), preparamos amostras de soro humano MBLsuf previamente incubadas com

ativadores da VL como manana e zymosan, ou com leveduras liofilizadas (item

3.2.7) ou vivas das cepas mencionadas anteriormente. Utilizamos como controles

negativos amostras apenas com os tampões GVBS/metais ou GVBS-EDTA, ou soro

humano MBLdef. Dos controles positivos conseguimos detectar consumo de MBL

apenas pelo zymosan na concentração utilizada (1mg/mL de soro). Das amostras do

fungo, verificamos consumo em todos os tratamentos, sendo que Pb265 e Pb18

liofilizados ou vivos consumiram MBL de forma similar, sendo que o Pb18 consumiu

mais que o Pb265 nas condições avaliadas. Entretanto, enquanto as amostras de

b)


Pb18(94) liofilizadas mostraram valores de consumo próximos aos do Pb18

liofilizado, o mesmo não ocorreu com a levedura viva. Pb18(94) consumiu mais MBL

nas amostras de soro incubadas com as células vivas do que aquelas tratadas

somente com o fungo liofilizado e até mesmo com zymosan. Esse ensaio foi

conduzido conforme descrito no item 3.4.2.2.

Figura 3: Dosagem de MBL residual por ensaio imunoenzimático. Amostras de soro

humano MBLsuf previamente incubadas com: tampão GVBS/metais; tampão GVBS-EDTA; manana (1mg/mL de soro); zymosan (1mg/mL de soro); leveduras de Pb265 liofilizadas (1mg/mL de soro); leveduras de Pb18(94) liofilizadas (1mg/mL de soro); leveduras de Pb18 liofilizadas (1mg/mL de soro); leveduras vivas de Pb265 (5x107 células/mL de soro); leveduras vivas de Pb18(94) (5x107 celulas/mL de soro); leveduras vivas de Pb18 (5x107 celulas/mL de soro). Dados de uma de duas repetições com valores similares. Barras tipo (T) representam a M±DP de triplicatas para cada amostra.

4.4 ENSAIOS COMPARATIVOS ENTRE VIA CLÁSSICA E VIA DAS LECTINAS

Soro humano MBLdef e MBLsuf foram previamente testados através do mesmo

kit utilizado para dosar MBL oligomérica (item 3.4.2.2) e usados para avaliar a

deposição de C4c nas VC e VL. A figura 4 mostra a detecção de fragmentos de C4

depositados por soros MBLdef e MBLsuf nos poços sensibilizados com IC, o que

mostra uma VC viável para ambos os soros. Contudo, quando manana é usada


como ativador, apenas o soro MBLsuf apresenta a deposição de C4c, indicando uma

VL funcional.

Figura 4: Deposição de C4c de soros suficiente e deficiente em MBL utilizando ativadores da VC e da VA. Amostras para sensibilização nos poços: apenas tampão

GVBS/metais; manana (10g/poço); IgG Humana (1g/poço). Os poços receberam posteriormente soro humano MBLsuf ou MBLdef. Dados de uma de duas repetições com valores similares.

As figuras 5a e 5b representam a dosagem de C4c residual de soros que

haviam sido previamente incubados com os tratamentos indicados, e posteriormente

colocados em contato com placas sensibilizadas com manana (figura 5a) ou IC

(figura 5b). No ensaio para VL, o controle com zymosan se mostrou eficiente em

consumir C4, já que em comparação com o SHN (que não havia sido incubado com

nenhum ativador como zymosan ou o P. brasiliensis) os títulos de C4 detectados

foram menores. Entretanto, o mesmo não se observou no ensaio para VC, onde não

houve diferença entre a amostra tratada com zymosan e a não tratada, isso para os

soros suficientes ou deficientes em MBL. Com relação aos tratamentos com as

cepas de P. brasiliensis não houve, nas concentrações empregadas, consumo de

C4 detectado em nenhum dos dois experimentos quando comparado com os soros

sem tratamento. Esse resultado abrangeu tanto os soros MBLdef quanto MBLsuf no

ensaio para VC.


Figura 5: Deposição de C4c por soros MBLdef ou MBLsuf incubados com P. brasiliensis em condições de ativação da VC ou VL. a) Ensaio com ativador para VL: poços das

placas foram sensibilizados com manana (10g/poço). As amostras de soro humano MBLsuf ou MBLdef foram previamente incubadas com: tampão GVBS/metais; leveduras vivas de Pb18 (1,0x107 células/mL de soro); leveduras vivas de Pb265 (1,0x107 células/mL de soro); ou zymosan (1mg/mL de soro). b) Ensaio com ativador para VC: poços das placas foram

sensibilizados com IgG Humana (1g/poço). Amostras de soro humano foram as mesmas do item a). Dados de uma de três repetições em triplicata com valores similares.

a)

b)


A partir desses ensaios iniciais, optamos por nos assegurar de que a

influência da VC nos experimentos da VL fosse pequena ou desprezível, já que as

condições de ativação para as duas vias é a mesma. Colocamos soro humano

MBLsuf que havia sido pré-incubado com alguns tratamentos como zymosan e P.

brasiliensis em contato com ativadores da VC e VL, manana e IC, respectivamente.

Avaliamos a deposição do fragmento C4b e de C1q do complemento. Nossa

intenção foi verificar se havia alguma diferença de deposição de um fragmento maior

de C4, como C4b; e principalmente comparar com o consumo de C1q e sua

deposição em ambiente sensibilizado com manana (VL). O que se pode observar na

figura 6a é que não houve diferença alguma no consumo de C1q entre os soros não-

tratado, tratado com o fungo ou com zymosan. O mesmo não ocorreu com C4b,

onde se percebe que houve o consumo desse fragmento pelo controle positivo,

zymosan. A figura 6b é resultado do mesmo experimento adaptado para VC. Esse

modelo experimental deixa claro que a influência da VC nos ensaios da VL é mínima

se comparado ao ensaio da própria VC, o que apóia os dados da abordagem

anterior (figura 5b).

a)


Figura 6: Deposição de C1q e C4b por soros MBLsuf incubados com P. brasiliensis em condições de ativação da VC ou VL. a) Ensaio com ativador para VL: poços das placas

foram sensibilizados com manana (10g/poço). As amostras de soro humano MBLsuf foram previamente incubadas com: tampão GVBS/metais; leveduras vivas de Pb18 (2,0x107 células/mL de soro); leveduras vivas de Pb265 (2,0x107 células/mL de soro); ou zymosan (1mg/mL de soro). b) Ensaio com ativador para VC: poços das placas foram sensibilizados

com IgG Humana (1g/poço). Amostras de soro humano foram as mesmas do item a). Dados de uma de três repetições em triplicata com valores similares.

A figura 7 foi gerada de ensaios que visavam encontrar diferenças de ativação

da VL em soros MBLsuf pré-incubados em diferentes intervalos de tempo com

concentração maior de leveduras vivas de P. brasiliensis. Até então estávamos

utilizando uma concentração do fungo na ordem 107 leveduras/mL de soro humano.

Como não havíamos encontrado diferenças firmes de ativação do fungo entre as

cepas Pb18 e Pb265, e mesmo com relação ao controle com zymosan, aumentamos

essa concentração para 108 células/mL de soro. Juntamente com essa mudança,

fizemos o ensaio incubando em banho-maria a 37ºC cada tratamento por 5, 15, 30 e

60 minutos. Usando o mesmo modelo de poços sensibilizados com 10g de

manana/poço, conduzimos o ensaio imunoenzimático para deposição de C4. Como

a figura revela o controle com zymosan se comportou como esperado, consumindo

fortemente C4 com relação a amostra sem qualquer tratamento, apenas com soro

puro. Neste ensaio e em suas repetições conseguimos detectar diferenças de

b)


consumo de C4 entre as cepas de P. brasiliensis e de maneira tempo/dependente.

Percebe-se que, na concentração utilizada, a cepa Pb265 (levemente virulenta)

apresentou um maior consumo de C4 do que a cepa Pb18 (altamente

virulenta).

Figura 7: Consumo de C4 residual na VL de amostras pré-tratadas com Pb18 ou Pb265 nos tempos de 5, 15, 30 e 60 minutos. Amostras de soro humano MBLsuf pré-incubadas

com: tampão GVBS/metais; zymosan (1mg/mL de soro); leveduras vivas de Pb18 (1,0x108 células/mL de soro); leveduras vivas de Pb26518 (1,0x108 células/mL de soro) Dados de uma de três repetições em triplicata com valores similares.

Partindo desses indícios de ativação entre cepas com diferentes graus de

virulência de P. brasiliensis, montamos um ensaio com tempo de pré-incubação de

30 minutos envolvendo uma curva de concentração de leveduras vivas e também

liofilizadas de P. brasiliensis com os seguintes pontos: 105, 106, 107 e 108 células

vivas/mL de soro MBLsuf; ou 1,0, 2,0 e 5,0 mg de células liofilizadas/mL de soro

MBLsuf. O controle com zymosan foi feito preparado com 0,5, 1,0 e 2,0 mg desse

ativador/mL de soro. A figura 8a confirma o ensaio anterior sobre o maior consumo

de C4 da VL pela cepa Pb265, só que agora demonstrado tanto para as leveduras

quanto para o fungo liofilizado. A cepa Pb18 não demonstrou diferenças de consumo

com as células liofilizadas, mas apenas na concentração de 108 células vivas/mL de


soro foi o ponto onde se detectou consumo. A figura 8b, realizada com base para a

VC e com as mesmas amostras, reforça mais uma vez o não envolvimento da VC

nesse modelo.

Figura 8: Consumo de C4 residual na VL ou VC de amostras pré-tratadas com Pb18 ou Pb265 vivas ou liofilizadas em diferentes concentrações. As amostras de soro humano

MBLsuf foram previamente incubadas com: tampão GVBS/metais; zymosan (0,5; 1,0 e 2,0 mg/mL de soro); leveduras liofilizadas de Pb18 (1,0; 2,0 e 5,0 mg/mL de soro); leveduras liofilizadas de Pb265 (1,0; 2,0 e 5,0 mg/mL de soro); leveduras vivas de Pb18 (1,0x106; 1,0x107 e 1,0x108 células/mL de soro); leveduras vivas de Pb265 (1,0x106; 1,0x107 e 1,0x108

a)

b)


células/mL de soro).a) Ensaio com ativador para VL: poços das placas foram sensibilizados

com manana (10g/poço). b) Ensaio com ativador para VC: poços das placas foram

sensibilizados com IgG Humana (1g/poço). Dados de uma de três repetições com valores similares. Barras tipo (T) representam a M±DP de triplicatas para cada amostra.

Em alguns ensaios utilizamos como controles soro MBLdef e soro MBLsuf pré-

incubado com diferentes concentrações de manana (1 e 5 mg/mL). A figura 9 mostra

um desses ensaios, onde mudamos também a concentração de P. brasiliensis

utilizada (106, 107, 5x107 e 108 leveduras/mL de soro) e obtivemos uma curva de

consumo ainda mais nítida que os ensaios anteriores. Tanto os controles com

manana quanto os controles com zymosan também se comportaram consumindo C4

de maneira dose dependente. Pb265, a linhagem pouco virulenta, confirma seu

maior potencial em consumir C4 do que leveduras de Pb18.

Figura 9: Consumo de C4 residual na VL de amostras pré-tratadas com Pb18 ou Pb265 vivas em diferentes concentrações. As amostras de soro humano MBLsuf foram

previamente incubadas com: tampão GVBS/metais; manana (1,0 e 5,0 mg/mL de soro); zymosan (0,1; 0,5 e 1,0 mg/mL de soro); leveduras vivas de Pb18 (1,0x106; 1,0x107; 5,0x107 e 1,0x108 células/mL de soro); leveduras vivas de Pb265 (1,0x106; 1,0x107; 5,0x107 e 1,0x108 células/mL de soro). poços das placas foram sensibilizados com manana

(10g/poço). Dados de uma de três repetições com valores similares. Barras tipo (T) representam a M±DP de triplicatas para cada amostra.

A figura 10 representa um experimento semelhante metodologicamente ao

anterior, mas com a inclusão de alguns tratamentos: o controle com soro MBLsuf

tratado com EDTA, seqüestrante de íons como Ca2+ e Mg2+, essenciais para


ativação da VC e da VL; e amostras tratadas com o fungo Pb18(94), cepa avirulenta

derivada da Pb18, vivo ou liofilizado. Comparando com o Pb265 e com o próprio

Pb18, o Pb18(94) mostrou níveis consumo de C4 maiores em ambas as formas, viva

ou desidratada. Este ensaio conseguiu detectar consumo também das amostras

preparadas com leveduras vivas de Pb18, mesmo que em menor escala que o

Pb265.

Figura 10: Consumo de C4 residual na VL de amostras pré-tratadas com Pb18, Pb18(94) ou Pb265 vivas ou liofilizadas em diferentes concentrações. As amostras de

soro humano MBLsuf foram previamente incubadas com: tampão GVBS/metais; tampão GVBS-EDTA; manana (1,0; 2,0 e 5,0 mg/mL de soro); zymosan (0,025; 0,1 e 1,0 mg/mL de soro); leveduras liofilizadas de Pb265 (1,0; 2,0 e 5,0 mg/mL de soro); leveduras liofilizadas de Pb18(94) (1,0; 2,0 e 5,0 mg/mL de soro); leveduras liofilizadas de Pb18 (1,0; 2,0 e 5,0 mg/mL de soro); leveduras vivas de Pb265 (1,0x106; 1,0x107; 5,0x107 e 1,0x108 células/mL de soro); leveduras vivas de Pb18(94) (1,0x106; 1,0x107; 5,0x107 e 1,0x108 células/mL de soro); leveduras vivas de Pb18 (1,0x106; 1,0x107; 5,0x107 e 1,0x108 células/mL de soro).

Poços das placas foram sensibilizados com manana (10g/poço). Dados de uma de duas repetições com valores similares. Barras tipo (T) representam a M±DP de triplicatas para cada amostra.

Para dirimir qualquer dúvida com relação à não interferência da VC nos

experimentos da VL, montamos um ensaio comparativo do consumo de C4 entre

amostras preparadas com soro humano MBLsuf ou MBLdef (figura 11). Esses soros

foram pré-incubados com IC com diferentes concentrações de leveduras liofilizadas

de Pb18, Pb18 cultivado por longos períodos (subcultivado), Pb18(94) e Pb265. O

soro MBLdef foi incubado com 1, 2 ou 5mg/mL de soro, enquanto que o soro MBLsuf

foi incubado apenas com a maior concentração, 5mg/mL. Os controles positivos,

tanto MBLsuf quanto MBLdef, foram incubados na presença de imunocomplexos nas


diluições 1:4, 1:2 e 1:1. Os soro suficiente ou deficiente em MBL incubados na

presença de EDTA tiveram a deposição de C4 abolida. O controle positivo com IC a

1:4 em soro suficiente demonstrou um pequeno consumo. Sobre as demais

amostras, apenas a Pb265 e a Pb18 a 5mg/mL demonstraram um discreto consumo

do componente C4 do complemento. O restante não apresentou qualquer indício da

depleção de C4 quando comparado aos controles.

Figura 11: Consumo de C4 residual na VC de amostras de soro MBLsuf ou MBLdef pré-tratadas com Pb18, Pb18 subcultivado, Pb18(94) ou Pb265 liofilizados, em diferentes concentrações. Dados de uma de duas repetições com valores similares. As amostras

de soro humano MBLsuf ou MBLdef foram previamente incubadas com: tampão GVBS/metais; tampão GVBS-EDTA; imunocomplexos anti-OVA/OVA (1:4; 1:2; ou 1:1 vol/vol de soro); leveduras liofilizadas de Pb265 (1,0; 2,0 e 5,0 mg/mL de soro); leveduras liofilizadas de Pb18(94) (1,0; 2,0 e 5,0 mg/mL de soro); leveduras liofilizadas de Pb18 (1,0; 2,0 e 5,0 mg/mL de soro); leveduras liofilizadas de Pb18 subcultivadas (1,0; 2,0 e 5,0 mg/mL de soro).

Poços das placas foram sensibilizados com IgG humana (1g/poço). Barras tipo (T) representam a M±DP de triplicatas para cada amostra.

Por fim, preparamos amostras com base no experimento anterior utilizando

apenas leveduras liofilizadas de Pb18 que houvera sido recentemente reisolado por

passagem animal, Pb18 subcultivado, Pb18(94) e Pb265. As concentrações

empregadas foram de 1, 2 e 5mg/mL de soro MBLsuf. O agente sensibilizante dos

poços foi manose a 10g/poço, como nos outros ensaios da VL. As amostras

tratadas com Pb265 continuaram a consumir C4 semelhante aos dados já


mostrados, porém as amostras de Pb18 reisolado apresentaram níveis de consumo

próximos àqueles das amostras incubadas com o fungo Pb18(94). De maneira

oposta, leveduras liofilizadas de Pb18 subcultivado foram capazes de consumir C4

de maneira bem menor quando comparado ao Pb18 reisolado e até mesmo ao

Pb265.

Figura 12: Consumo de C4 residual na VL de amostras pré-tratadas com Pb18 reisolado, Pb18 subcultivado, Pb18(94) ou Pb265 liofilizados em diferentes concentrações. As amostras de soro humano MBLsuf foram previamente incubadas com:

tampão GVBS/metais; tampão GVBS-EDTA; manana (1,0 mg/mL de soro); zymosan (1,0 mg/mL de soro); leveduras liofilizadas de Pb265 (1,0; 2,0 e 5,0 mg/mL de soro); leveduras liofilizadas de Pb18(94) (1,0; 2,0 e 5,0 mg/mL de soro); leveduras liofilizadas de Pb18 reisolado (1,0; 2,0 e 5,0 mg/mL de soro) leveduras liofilizadas de Pb18 subcultivado (1,0; 2,0

e 5,0 mg/mL de soro). Poços das placas foram sensibilizados com manana (10g/poço). Dados de uma de duas repetições com valores similares. Barras tipo (T) representam a

M±DP de triplicatas para cada amostra.

Toledo, R. G, 2008 – Discussão 38

5. DISCUSSÃO

A relevância dos fungos patogênicos tem despertado cada vez mais

interesse. Isso é devido ao grande aumento do número de infecções oportunistas ou

não em pacientes imunocomprometidos, como portadores do HIV, pacientes

transplantados ou em tratamento contra o câncer. Fungos como Candida albicans,

Histoplasma capsulatum, Arpergillus fumigatus, Cryptococcus neoformans,

Coccidioides immitis e Paracoccidioides brasiliensis têm sido alvo constante de

estudos que visam entender melhor a relação entre esses organismos e o sistema

imune de seu possível hospedeiro: o homem.

Como já exposto no item 1.2.4.1, o sistema complemento é uma das

ferramentas do sistema imunológico humano envolvido diretamente em um quadro

de infecção fúngica (Diamond et al., 1974; Kozel, 1996; Speth et al., 2004). Apesar

de alguns patógenos como C. albicans e C. neoformans contarem com um número

bastante expressivo de estudos envolvendo sua relação com o complemento se

comparado aos estudos envolvendo o P. brasiliensis, no geral, ainda há muitas

lacunas a serem preenchidas no que tange o papel do complemento e as infecções

por esses microorganismos. Se focarmos então a via das lectinas, a mais

recentemente descoberta, essas lacunas serão ainda maiores ou até mesmo

inexistentes.

A superfície dos fungos é, como as células em geral, complexa, constituída

por componentes que exibem radicais –OH e –NH2, potencialmente capazes de

formar ligações covalentes éster ou amida com moléculas de C3 em processo de

hidrólise, C3(H2O), denominadas C3 reativo, abreviadamente, C3*. Esse potencial

em ativar a via alternativa (VA) do complemento já havia sido estudado e

comprovado por alguns trabalhos pioneiros como Calich et al. (1979); e Messias &

Mohren (1994), Crott et al. (1997) e Toledo (2005). A via clássica (VC) de igual modo

já foi abordada em alguns trabalhos como Munk et al. (1992), Munk & Dias da Silva

(1992), Messias & Mohren (1994), Crott et al. (1997) e Toledo (2005). Entretanto,

alguns trabalhos envolvendo a VC do SC, como Munk et al. (1992), Munk & Dias da

Silva (1992), e Messias & Mohren (1994), foram realizados quando a VL ainda

estava sendo desvendada. Começamos então a trabalhar, primeiro em nossa

graduação, e agora dando continuidade nesta dissertação, com a possibilidade de

ativação da VL pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, haja vista que


ainda não encontramos nenhum estudo publicado nesse sentido. Outro objetivo

importante de nosso trabalho foi a confirmação da ativação das VC e VA, fato que já

estava sendo abordado desde nosso trabalho monográfico através de ensaios

hemolíticos que confirmaram o envolvimento dessas duas vias na interação com

fungo da cepa Pb18 (altamente virulenta) (Toledo, 2005).

A ativação do SC pelas formas leveduriformes de P. brasiliensis foi analisada,

in vitro, pela seguinte abordagem experimental: a quantificação de componentes

individuais do SC por ensaio imunoenzimático nas amostras de SHN que estiveram

em contato com o fungo. Condições prevalentes para iniciação das vias de ativação

do SC foram estabelecidas realizando o contato fungo e SHN em GVBS/metais,

tampão que contém 1,5 x 10-4 M de Ca2+ e 5,0 x 10-4 M Mg2+, que favorece a

ativação de VC e VL. Ativadores conhecidos do SC, imunocomplexos pré-formados

na zona de equivalência (ativadores preferenciais da VC), zymosan (ativador da VA

e VL) e mananas (ativadores da VL), ou tampão (não ativador) estavam sempre

incluídos.

A participação da VL na deposição de fragmentos de C3 nas leveduras deve

ser considerada tanto secundária associada à VC, como primária, já que a superfície

celular dos fungos em geral, inclusive P. brasiliensis, contem carboidratos ricos em

mananas, ativadores potenciais da via VL que clivam C2 e C4 (Nigou et al., 2003;

Fujita et al., 2004). Da associação entre esses carboidratos e a proteína MBL,

formam-se complexos MBL-mananas que resultam na ativação das serina-proteases

MASP-1 e MASP-2 associadas com MBL que clivam C2 e C4, em C2b e C4b

formando o complexo C4bC2b (Jack et al., 2001).

Nossos experimentos iniciais visavam a padronização da diluição dos soros

humanos, das concentrações dos controles como manana, zymosan e

imunocomplexos (IC), e mesmo das concentrações do P. brasiliensis. Ao passo que

nosso trabalho anterior abordou apenas a ativação do sistema complemento por

uma linhagem reconhecida por apresentar alta virulência, a Pb18, no presente

optamos primariamente por comparar a capacidade de ativação de duas cepas: a já

mencionada Pb18 e a Pb265, cepa com leve virulência. Com o andamento de

nossas atividades, tivemos a oportunidade de incluir a cepa Pb18(94), gentilmente

cedida pela Drª Vera Calich (ICB/USP). Esta linhagem deriva da Pb18 original, mas

sabe-se que é avirulenta.


O foco principal de nossos ensaios foi colocar soro humano, MBL suficiente

ou deficiente, em contato com os diversos controles e com as leveduras de P.

brasiliensis por tempo determinado, e posteriormente medir a quantidade de

fragmentos de C4 (C4b e C4c), C3, C1q e MBL restantes nessas amostras, ou seja,

residuais.

Como já descrito principalmente no item 1.1.1, o componente C4 do sistema

complemento é um componente chave quando se fala nas VC e VL. Após a ligação

de C1q (VC) ou MBL (VL) a seus ativadores alvo, C4 é a primeira molécula, seguido

por C2 a se ligar a C1q ou MBL, sendo clivado em um fragmento menor, C4a, e um

fragmento maior, C4b. Eventualmente C4b pode sofrer ação de um fator plasmático

chamado fator I (fI), tornar-se iC4b, e posteriormente C4c e C4d. Justamente o

consumo desses fragmentos C4b e C4c estarão sendo medidos por ELISA. A figura

1 mostra um dos primeiros ensaios realizados onde procuramos estabelecer a

melhor diluição de soro humano para medir o consumo de C4. Optamos por

padronizar nossos experimentos com os soros diluídos sempre 8 vezes, em tampão

ou salina fisiológica. Apesar do background do ensaio ter sido relativamente alto, já

é possível perceber que os soros pré-tratados com extrato bruto de leveduras de

Pb18 ou Pb265 reduziram os níveis de C4 dessas amostras, quando comparamos

com o soro incubado apenas com tampão GVS/metais. Um questão que estará

talvez ameaçando nossos resultados é, se as VC e VL compartilham as mesmas

condições fisiológicas para atuarem, ou seja, ambas necessitam de um ambiente

com determinada quantidade de Ca2+ e Mg2+, como saber se a VC não estará

influenciando os resultados da VL? Com a VA é relativamente fácil, já que esta via

precisa apenas da presença de Mg2+ para atuar, pode-se excluir as outras duas vias

fornecendo condições controladas para a VA. Não se pode negar que há a

possibilidade do envolvimento de anticorpos naturais anti-manana já ressaltados em

alguns importantes estudos como Super et al. (1990) e Zhang et al. (1997). Super et

al. (1990) mostrou que houve uma grande variação do nível desses anticorpos no

soro dos 179 pacientes analisados. Os principais isotipos seria IgM, IgG e IgA. É

muito provável que alguns dos nossos doadores, mesmo que com a reduzida

possibilidade de contato com o P. brasiliensis, já possuam tais anticorpos em

decorrência do contato com outros fungos durante a vida. A presença desses

anticorpos poderia influenciar os resultados para a VL. Zhang et al. (1997)

demonstra, usando soro diluído em 40%, que anticorpos anti-manana podem servir


com agentes opsonizantes de leveduras de C. albicans. A partir desse ponto,

optamos por seguir nossos ensaios com uma diluição do soro maior (12,5%) e

fazendo a contrapartida de alguns ensaios com o soro deficiente em MBL como

contraprova. Acreditamos que a possível influência desses anticorpos naturais anti-

carboidratos não seja tão expressiva com esses cuidados tomados.

A figura 2 é o resultado de um experimento já antes realizado por nós apenas

com a presença da cepa Pb18. Com a inclusão da cepa Pb265 percebemos, mesmo

que discretamente, que esta possui a capacidade de consumir o componente central

do sistema complemento: o C3. Esse fato confirma os resultados de Calich et al.

(1979), onde esse grupo mostrou o consumo de C3 por leveduras vivas de Pb18,

mas adiciona a cepa Pb265 que ainda não havia sido abordada.

Paralelamente aos ensaios de consumo de C4 e C3, avaliamos também o

consumo do principal componente da VL, a lectina ligante de manose (MBL). A

figura 3 mostra um dos ensaios que fizemos para tal fim, confirma nossos resultados

anteriores, os de que a cepa Pb18 seria capaz de consumir MBL quando incubada in

vitro com soros MBLsuf, e adiciona a relação entre esse consumo e duas novas

cepas, a Pb265 e a Pb18(94). Percebe-se que leveduras vivas de Pb18(94)

consomem mais MBL que as outras cepas e até mesmo que o controle com

zymosan. O uso partículas liofilizadas de Saccharomyces cerevisiae (zymosan)

como controle para a VL também é comprovado visto que todos os nossos ensaios

demonstraram que esse componente é capaz de consumir MBL. Outro fator

importante é que fizemos o ensaio utilizando também as leveduras de P. brasiliensis

liofilizadas, ou seja, praticamente apenas as paredes celulares que possuem em sua

composição sabidamente resíduos de mananas (Kanetsuna, 1972).

A partir desse ponto, começamos a medir a relação de consumo de

fragmentos de C4, principalmente, com as VC e VL. Após alguns ensaios

preliminares (figura 4), o consumo de C4c não havia sido detectado para nenhuma

das vias e para nenhuma cepa utilizada, sendo que os controles se comportavam

como esperado (figura 5). Mudamos então o alvo de C4c, molécula menor e gerada

posteriormente por reguladores de ativação do SC, para C4b. A figura 6 mostra, a

exemplo da anterior, que nenhum consumo mesmo de C4b havia sido medido para

as amostras incubadas com Pb18 ou Pb265. Novamente para verificar se havia

alguma influência da VC nos ensaios para VL, medimos também o consumo do

componente C1q (figura 6). Com relação ao controle do soro + tampão, tanto o


ensaio da VL (figura 6a) quanto o ensaio para VC (figura 6b) mostraram que não

estava havendo depleção de C1q nesse modelo experimental.

Escolhemos repetir o mesmo formato dos ensaios anteriores, mas com

algumas diferenças. Utilizamos anticorpo anti-C4 policlonal para detecção, variamos

o tempo de incubação em 5, 15, 30 e 60 minutos e aumentamos a quantidade de

fungo incubada com os soros. A figura 7 mostra claramente que a cepa Pb265 foi

capaz de consumir C4 de maneira tempo-dependente. O consumo para Pb18 foi

bem mais discreto. Essa diferença de ativação pode ser entendida, se no âmbito da

VL, que há vários trabalhos apontando para a grande diferença na composição da

parede celular do P. brasiliensis nas diferentes cepas (Kanetsuna, 1972; San-Blas &

San-Blas, 1977, San-Blas, 1982; Hogan &Klein, 1994). Essas diferenças atingem

desde o repertório protéico até a composição e quantidade de carboidratos

presentes na parede do fungo. Assim, a priori, podemos caminhar no sentido de que

essa diferença de virulência entre as cepas Pb18 e Pb265 tenha ligação direta com

a composição de suas paredes celulares.

Ensaios posteriores reforçaram a idéia de que as cepas menos virulentas

poderiam consumir mais C4 e MBL (vide ensaio em que a cepa Pb18(94), variante

avirulenta da Pb18, apresentou maiores níveis de consumo de MBL). Os ensaios

das figuras 8 e 9 confirmam isso e acrescentam que leveduras de P. brasiliensis

liofilizadas também se comportariam da mesma maneira. É importante esse fato,

pois ajuda a reforçar que o agente ativador do complemento estaria localizado na

parede celular do fungo e não dependeria da célula estar viva para haver esse

consumo de C4 e MBL. A figura 10 representa um experimento semelhante ao da

figura 9, mas com a presença da cepa Pb18(94). Das três cepas nesse ensaio, a

Pb18(94) foi aquela que apresentou maior capacidade em consumir C4. Masuoka

(2004) revisou muito propriamente a relação entre o repertório de carboidratos de C.

albicans e outros fungos patogênicos com sua infectividade.

No ensaio da figura 11, colocamos em paralelo a ativação de amostras

incubadas com as diferentes cepas do fungo com soro MBLsuf e MBLdef. Não

encontramos diferenças expressivas de consumo entre esses soros em relação aos

controles e entre as cepas. Aliás, a amostra de Pb265 com soro MBLdef foram as

únicas que aparentemente demonstrou algum consumo de C4.

Kashino et al. (1990) fizeram um trabalho pioneiro em comparar a

patogenicidade de cepas de P. brasiliensis com pouco tempo de cultivo in vitro com


aquelas que já haviam sendo cultivadas por longos anos. Esse grupo encontrou que

culturas subcultivadas por longos períodos iam perdendo sua virulência,

característica que podia ser revertida se a mesma cultura sofresse passagens em

meio animal, como três ciclos de reinfecção em camundongos, por exemplo.

Partindo desse fato, elaboramos um ensaio em que testamos soros incubados com

o fungo recentemente reisolado com a mesma cepa que havia sendo cultivada por 4

anos. A figura 12 revela que as culturas subcultivadas de Pb18 diminuem em muito

sua capacidade de depletar C4, não se assemelhando às cepas menos virulentas,

como seria esperado. É certo que o ambiente in vitro, em condições controladas de

temperatura e nutrientes, e sem o estresse fisiológico e imunológico ocasionado pelo

ambiente de infecção do hospedeiro, permite que as leveduras alterem sua

composição da parede celular sem qualquer tipo de prejuízo por não haver a forte

seleção do ambiente in vivo. Essa parece ser a explicação mais contundente para

explicar a relação entre o subcultivo in vitro, a perda de virulência, e a conseqüente

alteração da relação entre o fungo e o complemento. Entretanto, a qualidade das

mudanças sofridas nesse processo não era foco desse trabalho, apesar de ser um

caminho interessante a ser percorrido.

Acreditamos que não restam quanto à capacidade de leveduras, vivas ou não

de P. brasiliensis, em ativar a via das lectinas do sistema complemento humano.

Juntamente com os dados de nosso trabalho anterior (Toledo, 2005), fica clara a

capacidade do fungo em ativar a VA, a VC e também a VL do SC. O papel dessa

ativação quanto à lise das leveduras em camundongos parece não ser tão relevante,

como predito por Burger et al. (1985), onde esse trabalho mostrou que animais

deficientes ou suficientes em C5 apresentavam o mesmo grau de infecção. Porém, o

papel do complemento como agente opsonizante e sinalizador do sistema imune

ainda não foi bem estudado. Sabe-se hoje que, além da VC, a VL pode exercer

também um importante papel quando moléculas de MBL cobrem o patógeno,

podendo atuar como potencializador de fagocitose de Neisseria meningitidis (Jack et

al., 2001; Jack et al., 2005) e sua deficiência está diretamente ligada à infecções

bacterianas e virais (Takahashi et al., 2006). Eisen & Minchinton (2003) publicaram

uma revisão que reúne os principais trabalhos envolvendo a MBL e sua relação com

doenças infecciosas como aspergilose, candidíase, meningite, malária e até mesmo

infecções por influenza A e HIV. Portanto, não é difícil concluir que a via das lectinas

pode desempenhar um papel importante na paracoccidioidomicose, sendo como


agente sinalizador quimiotático pela liberação de fragmentos como C4a e C5a,

sendo como agente opsonizante, interferindo na interação das leveduras com

neutrófilos, macrófagos e células dendríticas.

Toledo, R. G, 2008 – Conclusões 45

6. CONCLUSÕES

- Leveduras vivas ou liofilizadas do fungo dimórfico Paracoccidioides

brasiliensis são capazes de consumir os componentes C4 e MBL do

complemento humano;

- Leveduras da cepa menos virulenta, Pb265, apresentou maiores níveis de

consumo de C4 do que a cepa altamente virulenta, Pb18;

- Leveduras da cepa Pb18(94), variante avirulenta da Pb18, comportou-se

semelhantemente à Pb265, consumindo mais C4 do que a Pb18;

- Leveduras de Pb18 cultivadas por longos períodos (subcultivo) perdem a

capacidade consumir C4;

- A via das lectinas do sistema complemento humano pode ser ativada pelo

Paracoccidioides brasiliensis, in vitro.

Toledo, R. G, 2008 – Próximas Etapas 46

7. PRÓXIMAS ETAPAS

- Identificar e purificar o(s) componente(s) da célula leveduriforme de P.

brasiliensis que ativa(m) o sistema complemento.

- Verificar se há coincidência entre a presença desses componentes na célula

leveduriforme de P. brasiliensis, ativação do sistema e virulência.

- Identificar os fragmentos de C3 e C4 que se depositam ativamente na parede

da célula leveduriforme de P. brasiliensis.

- Analisar os efeitos da presença desses fragmentos nas interações entre

célula leveduriforme de P. brasiliensis e macrófagos.

- Comparar o processo inflamatório desencadeado em modelos experimentais

in vivo, por células leveduriformes de P. brasiliensis in natura e opsonizadas

com fragmentos de C3.

Toledo, R. G, 2008 – Referências Bibliográficas 47

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Formatação segundo a NBR 6023 da ABNT (ago/2002), com exceção do número de autores citados, que a norma preconiza até 03 e acima disso apenas o primeiro autor seguido de “et al.”.

Toledo, R. G, 2008 – Anexos 59

9. ANEXOS

1) Ácido sulfúrico (H2SO4) 3N

H2SO4 42,5 g

H2O destilada q.s.p. 500 mL

2) Ácido cítrico (C6H8O7) 0,1M

C6H8O7. H2O 2,14 g


3) Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4) 0,2M

Na2HPO4 2,84 g


4) Hidróxido de sódio (NaOH) 2N

NaOH 8,0 g


5) Meio de cultura – ágar-SABOURAUD

Dextrose 2,0 g

Peptona de caseína 1,0 g

Extrato de levedura 0,5 g

Ágar 1,5 g


- Autoclavar por 15 min a 120ºC.

6) Meio de cultura – TOM (modificado)

Dextrose 16,1 g

Peptona de caseína 15,0 g

Extrato de levedura 6,1 g

K2HPO4 0,31 g

KH2PO4 0,31 g

MgSO4.7H2O 0,12 g

MnSO4. H2O 0,006 g

FeSO4 0,006 g


NaCl 0,006 g


- Ajustar pH para 6,3 com NaOH 1N;

- Autoclavar por 15 min a 120ºC.

7) Solução de Alsever

D-glicose 20,5 g

Citrato de sódio. 2H2O 7,9 g

NaCl 4,2 g

Ácido Cítrico 0,4 g


- Ajustar pH para 6,5.

- Filtrar em condições estéreis.

8) Solução de MgEGTA

EGTA 76 g

MgCl2 (anidro) 0,41 g


- Ajustar pH para 7,4 com NaOH 10N.

9) Solução estoque de metais

MgCl2.6H2O 203,3 g

CaCl2.2H2O 22,1 g

H2O destilada q.s.p. 1000

10) Solução de EDTA 1M

EDTA dissódico 37,2 g


- Ajustar pH para 7,65 ± 0,05 com NaOH 2N.

11) Solução salina fisiológica (NaCl a 0,9%)

NaCl 4,5 g



12) Tampão ácido (revelador para ELISA)

Na2HPO4 (0,2M) 3,5 mL

C6H8O7. H2O (0,1M) 3,25 mL

H2O destilada 5,7 mL

OPD 5,0 mg

H2O2 5,0 μL

- O OPD e o H2O2 devem ser adicionados imediatamente antes do uso.

13) Tampão carbonato 0,1M pH 8.2

NaHCO3 2,1g

mL H2O destilada q.s.p. 250 mL

- Ajustar pH para 8,2 com HCl 6N.

14) Tampão salina fosfato 0,15M pH 7.2~7.4 (PBS 1X)

NaCl 8,0 g

KCl 0,2 g

KH2PO4 0,2 g

Na2HPO4. 7H2O 2,86 g


- Ajustar pH para 7,2.

15) Tampão VBS 1X

Na-5,57 dietilbarbiturato 1,2 g

NaCl 8,3 g


- Ajustar pH para 7,35 ± 0,05 com HCl 2N.

16) Tampão VBS MgEGTA ou *GVBS MgEGTA

VBS 1X q.s.p. 1000 mL

Solução MgEGTA 50 mL

* Gelatina 1,0 g

- Checar pH: 7,35 ± 0,05.


17) Tampão VBS/metais ou *GVBS/metais


Solução estoque de metais 1,0 mL

* Gelatina 1,0 g

- Checar pH: 7,35 ± 0,05.

18) Tampão VBS - EDTA


Solução de EDTA 0,1M 100 mL

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