relatorio1 dns açucares

OBTENÇÃO DE CURVAS PADRÃO PARA AÇÚCARES REDUTORES, AÇÚCARES SOLÚVEIS

TOTAIS, PROTEÍNAS E AMINOÁCIDOS

GRUPO 2

2002

GRUPO 2

OBTENÇÃO DE CURVAS PADRÃO PARA AÇÚCARES REDUTORES, AÇÚCARES SOLÚVEIS TOTAIS,

PROTEÍNAS E AMINOÁCIDOS

1º Relatório apresentado a disciplina Laboratório de Bioquímica de Plantas como parte das exigências do curso de Agronomia/Fisiologia vegetal em nível de Mestrado.

Professor

Luiz Edson Mota de Oliveira

LAVRAS

MINAS GERAIS - BRASIL

GRUPO 2

OBTENÇÃO DE CURVAS PADRÃO PARA AÇÚCARES REDUTORES, AÇÚCARES SOLÚVEIS TOTAIS,

PROTEÍNAS E AMINOÁCIDOS

1º Relatório apresentado a disciplina Laboratório de Bioquímica de Plantas como parte das exigências do curso de Agronomia/Fisiologia Vegetal em nível de Mestrado

Composição do Grupo:

Andrea Yu Kwan Villar Shan Ms/Agroquímica

Cristiano Martinotto Agrônomo

Inês Angélica Cordeiro Gomes Bióloga

Teresa Cristina L. L. de Sá e M. Marques Ms/Fitotecnia

Luiz Edson Mota de Oliveira

(Professor da Disciplina)

LAVRAS

MINAS GERAIS - BRASIL

1 INTRODUÇÃO

A análise química de uma amostra é em primeira ordem qualitativa. Uma

vez identificada a natureza de seus constituintes ou parte deles, faz-se necessário

sua determinação quantitativa, que dispõem atualmente de diversas técnicas as

quais dependem da natureza da informação que se busca, da amostra disponível

e relativa proporção do componente a ser determinado.

Um método extremamente empregado em determinações quantitativas

de biomoléculas (açúcares, proteínas e ácidos nucleicos) é a colorimetria que

consiste basicamente na comparação, em condições bem definidas, entre a cor

provocada pela substância presente em quantidade desconhecida numa amostra,

com a mesma cor provocada por uma quantidade conhecida do material, num

padrão.

Entre os métodos colorimétricos, a espectrofotometria tomou proporções

gigantescas no que diz respeito a sua utilização pois é um método de

comparação sensível, rápido e cujos resultados apresentam-se com maior

exatidão. Seu princípio baseia-se na comparação de sinais gerados pela diferença

entre as radiações transmitidas por soluções tomadas como referência e as

radiações transmitidas pelas amostras analisadas, num determinado

comprimento de onda, emitido pelo aparelho (espectrofotômetro), e que é

característico da absorção do composto que se quer identificar. Dessa forma,

pode-se construir curvas padrões cujas equações de regressão são utilizadas para

a quantificação dos compostos em amostras desconhecidas.

1

2 REFERENCIAL TEÓRICO

A colorimetria relaciona-se com a comparação entre a variação de cor

decorrente da mudança de concentração de determinado componente numa

solução, provocada pela formação de um complexo corado por meio da adição

de um reagente apropriado a esse sistema.

As variações entre as análises colorimétricas originam-se da utilização

de um dos seis diferentes métodos de comparação quantitativa (Série padrão,

Duplicação, Diluição, Balanceamento, Fotômetro Fotoelétrico) ou por mais de

um deles em combinação.

A espectrofotometria é o método comparativo mais utilizado por

apresentar maior sensibilidade e exatidão de resultados. Fundamenta-se nos

princípios teóricos da lei de Lambert-Beer as quais explicam a absorção da luz

em função da espessura do meio e relaciona-na com a absorbância ou

transmitância dos eletrólitos presentes no meio reacional. De fato, esta lei foi

gerada pela fusão de duas leis pré-concebidas e complementares, fundamentadas

nos experimentos de dois pesquisadores e sua tradução matemática implica na

definição de dois parâmetros: a Absorbância (A) referida também como

densidade óptica, e a Transmitância (T).

A porcentagem de radiação que atravessa uma solução homogênea é

designada por transmitância. Contudo, os resultados espectrofotométricos são

expressos geralmente em absorbâncias (A). Este parâmetro, segundo a lei de

Beer-Lambert, apresenta sobre a transmitância a vantagem de variar linearmente

com a concentração das amostras.

A lei de Lambert :

‘...quando uma luz monocromática passa através de um meio

transparente, a taxa de diminuição da intensidade com a espessura do meio é

proporcional à intensidade da luz’,

2

explica claramente que a intensidade da luz emitida diminui

exponencialmente com a espessura do meio absorvedor ou que qualquer camada

do meio, com uma certa espessura absorve sempre a mesma fração de luz

incidente sobre ela. Matematicamente temos:

onde T = Transmitância; It = Luz transmitida;

I0 = Luz incidente

onde A = Absorbância

então

Entretanto a lei de Lambert diz respeito a absorção e a transmissão da

luz de radiação monocromática em função da espessura da camada absorvedora.

Posteriormente, Beer demonstrou por meio de seus experimentos, ser possível

determinar quantitativamente concentrações diferentes entre soluções, a luz das

experiências de Lambert.

A lei de Beer:

‘a intensidade de um feixe de luz monocromática diminui

exponencialmente com a concentração da substância absorvedora’,

explica o efeito da concentração de um constituinte corado, numa

solução, sobre a transmissão ou a absorção da luz e estabelece relação entre

transmitância, concentração e a espessura da camada absorvedora.

c A

onde A = Absorbância;

= coeficiente de absorção molar;

l = comp. do percurso da luz através da amostra.

3

A união entre estas duas leis gerou a lei de Lambert-Beer em que:

= =

A utilização destes princípios teóricos permitem construir um gráfico

comparativo de A ou log 1/T x concentração da substância de onde obtém-se

uma reta y = ax + b onde x = concentração da substância e y = absorbância ou

transmitância. Por comparação determinam-se concentrações desconhecidas de

substâncias em soluções, de um mesmo material, medindo-se a absorbância ou

transmitância obtidas com as mesmas variáveis.

Tecnicamente, a espectrofotometria dispõem da combinação de um

fotômetro de filtro e um espectrômetro, que por meio de um sistema ótico,

provoca a dispersão da radiação incidente. A união operacional destes dois

instrumentos gerou o espectrofotômetro que permite o uso de faixas de luz

monocromáticas que podem variar continuamente. Assim, são gerados sinais

correspondentes à diferença entre as radiações transmitidas por soluções

tomadas como referência e as radiações transmitidas pelas amostras analisadas,

num determinado comprimento de onda. Esses aparelhos podem ser constituídos

de feixe simples ou duplo. Os primeiros operam, em geral, com maior exatidão

(aproximadamente 0,2 %) quando contém um circuito zero para a medida da

transmitância o que implica em um sinal do amplificador que é

contrabalanceado com um sinal elétrico conhecido. Nos espectrofotômetros de

feixe duplo, um feixe dá o sinal de referência e o outro, o sinal de medida, e

então são comparados continuamente várias vezes por segundo. Assim,

respostas do detector, flutuações na intensidade da fonte e ganho do

amplificador são compensados.

4

Diferentes reações colorimétricas podem ser utilizadas para o

desenvolvimento de complexos corados e sua escolha depende do tipo de

molécula a ser analisada ou seja sua reatividade, e o tipo de instrumentação de

leitura. Dentre elas podem-se citar:

Quantificação de Proteínas

- Método do Biureto: baseia-se no doseamento de complexos de cor

púrpura formados em soluções alcalinas pela complexação de Cu2+ com duas ou

mais ligações peptídicas (Figura 1). Embora altamente específico para peptídios

e proteínas, este método está sujeito a interferências por parte de compostos

presentes nas amostras que interagem com Cu2+ (por exemplo açúcares redutores

e grupamentos amídicos) além de apresentar baixa sensibilidade.

Figura 1: Complexo corado pelo método do biureto.

- Método de Bradford (Bradford, 1977): é o mais comumente utilizado

pelo fato do Comassie Blue exibir um máximo de absorção de radiações com o

comprimento de onda de 595 nm, quando complexado com proteínas e baixa

sensibilidade a interferências por parte de compostos de natureza não proteica.

- Reação de Folin-Ciocalteau (método de Lowry) (Lowry et al, 1951):

baseia-se na complexação da proteína com o cobre alcalino e a redução do

5

fosfomolibdato-fosfotungstato a ácido fosfomolibdotúngtico provocada pelos

redutores tirosina e triptofano presentes nas proteínas em níveis mais

constantes. Esta reação resulta em coloração azul. A vantagem desta reação

reside em poder trabalhar tanto com amostras sólidas ou em soluções.

Quantificação aminoácidos

- Reação da ninidrina (Schriner, 1983), : baseia-se na desaminação

oxidativa dos aminoácidos liberando amônia e reduzindo a ninidrina a

hidrindantina que posteriormente forma um complexo azul com a amônia

liberada (Figura 2).

Figura 2: Reação de ninidrina.

6

- Outros métodos estão relacionados na Tabela a seguir.

Tabela 1: Ensaios químicos para aminoácidos específicos.

Aas Reação Reagentes Cor

Arg Sakaguchi -naftol + hipoclorito de sódio Vermelho

Cys Nitroprussiato Nitroprussiato de sódio em amônia diluída Vermelho

Cys Sullivan4-sulfonato de sódio + 1,2- naftoquinona +

hidrosulfito de sódioVermelho

Hisr Pauly Ácido sulfanílico em solução alcalina Vermelho

Trp Ehrich p-dimetilaminobenzaldeído + HCl conc Azul

trp Kopkins-Cole Ácido glioxílico + H2SO4 Púrpura

Tyr Millon HgNO3 + HNO3 com traços de HNO2 Vermelho

Fonte: Schriner, 1983.

Quantificação de açúcares:

- Reação de Molish: indicada para açucares solúveis totais. Baseia-se na

hidrólise ácida das ligações glicosídicas resultando em hidroximetilfurfural e

furfural, que se complexam com o -naftol resultando em um complexo corado

(Figura 3).

Figura 3: Reação de Molish.

7

- Reação de antrona: a reação tem o mesmo princípio que a anterior

porém o reagente utilizado é a antrona resultando na formação de um complexo

corado de coloração verde (Figura 4).

Figura 4: Reação de antrona.

- Reação com DNS: indicada para açúcares redutores. Baseia-se na

redução do ácido 3,5-dinitrosalicílico a ácido 3-amino-5nitrosalicílico resultando

em um complexo de coloração laranja (Figura 5).

8

Figura 5: Reação com DNS.

- Reação de Somogy –Nelson: indicada para açúcares redutores. Baseia-

se na redução de cobre em meio alcalino pelo açúcar, resultando em óxido

cuproso (Cu2O). Esse composto formado é então oxidado em presença de ácido

arsenomolibdênio que passa a ácido arsenomolibdoso, um complexo de

coloração azul.

Além das reações colorimétricas/espectrofotométricas utilizadas para

quantificação de biomoléculas, outros métodos quantitativos podem ser citados

tais como:

Açúcares: - Periodato (IO4-): o método baseia-se na redução do

periodato pelos açúcares e posterior titulação do I2 formado, por

NaS2O3. O conteúdo de açúcares é doseado pelo Nº eq de I2.

Proteínas: - Método Kjeldahl: baseia-se na digestão da amostra com

H2SO4 concentrado em presença de um catalisador, sob condições

onde compostos de nitrogênio são convertidos a (NH4)2SO4. Por

destilação a vapor ou microdifusão na presença de uma base forte, a

amônia é liberada sendo captada novamente em um sistema

titulométrico que doseia a amônia formada. Pelo fato de todas as

proteínas conterem 16% de N em sua composição, isto é 1 mg de N

corresponde a 6,25 mg de proteína, é possível calcular a quantidade de

proteína presente.

9

3 MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Bioquímica de

Plantas do Departamento de Biologia/ Setor Fisiologia Vegetal da Universidade

federal de Lavras.

Na construção das curvas-padrão, foi utilizada: a espectrofometria, cujas

absorbâncias foram obtidas em espectrofotômetro de feixe simples Beckman

DU 640 B.

Os experimentos foram conduzidos em 2 repetições/curva padrão/cada

membro da equipe.

3.1 Construção de curva padrão de açúcares solúveis totais – Método Antrona

3.1.1 Preparo dos reagentes

Solução de glicose 60 g / mL (V = 100 mL).

Pesou-se 0,006 g de glicose (C6H12O6), adicionou-se aproximadamente

30 mL de água e completou-se o volume para 100 mL.

Reagente antrona (V =126 mL)

Pesou-se 0,24 g de antrona, adicionou-se 6 mL de água destilada e

posteriormente, 120 mL de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) vagarosamente.

3.1.2 Obtenção da curva padrão

Adicionaram-se alíquotas de água destilada, glicose e antrona a sete

tubos de ensaio mantidos em banho de gelo conforme Tabela 2. Após, os tubos

foram agitados em vórtex e levados ao banho-maria à 100 ºC durante 3 minutos.

10

Os tubos foram resfriados em banho de gelo e levados para leitura em

espectrofotômetro ( = 620 nm).

Tabela 2: Alíquotas de reagentes requeridos para o meio reacional.

TubosGlicose (60 g / mL) Água Antrona

(mL)

1 0,0 1,0 2,0

2 0,1 0,9 2,0

3 0,2 0,8 2,0

4 0,4 0,6 2,0

5 0,6 0,4 2,0

6 0,8 0,2 2,0

7 1,0 0,0 2,0

3.2 Construção da curva padrão de açúcares redutores – Método DNS


Preparo da solução de glicose 10 g / mL (V = 10 mL).

Preparou-se uma solução de glicose 1M (0,01 g para 10 mL). Retirou-se

uma alíquota de 0,1 mL e diluiu-se para 10 mL.

Preparo do reagente DNS (ácido dinitrosalicílico) (V = 50 mL)

Dissolveu-se 15 g de Tartarato duplo de sódio e potássio (sal de Rochelle

- C4H2O6K+Na+) em 25 mL de água destilada. Levou-se ao aquecimento com

agitação constante até completa dissolução. Posteriormente, foram misturados a

solução de Rochelle recém preparada, 0,5 g de DNS e 10 mL de hidróxido de

sódio (NaOH) 2N e o volume foi completado para 50 mL.

11


Adicionaram-se alíquotas de água destilada, glicose e DNS a quatro

tubos de ensaio conforme Tabela 3. Os tubos foram agitados em vórtex e

levados ao banho-maria à 100 ºC durante 5 minutos. Após, foram resfriados à

temperatura ambiente, completados até 10 mL e levados para leitura em

espectrofotômetro ( = 540 nm).


TubosGlicose (10 g / mL) Água DNS

(mL)1 0,0 1,5 1,0

2 0,2 1,3 1,0

3 0,4 1,1 1,0

4 0,6 0,9 1,0

3.3 Construção de curva padrão para proteínas – Método Bradford

3.3.1 Preparo do reagente

Comassie Blue G-250 (V = 1L)

Dissolveu-se 0,1g de Comassie Blue G-250 em 50 mL de etanol 95%.

Adicionou-se 100 mL de ácido fosfórico (H3PO4) 85% e completou-se o volume

para 1L com água destilada. Deixou-se em agitação constante por 12 horas em

overnight.

Solução de BSA (Soro albumina bovina) 100 g / mL

Solução encontrava-se recém preparada não justificando a realização de

nova preparação.

12


Adicionaram-se alíquotas de água destilada, BSA e Comassie blue G-

250 a seis tubos de ensaio conforme Tabela 4. Após, os tubos foram agitados em

vórtex e levados para leitura em espectrofotômetro ( = 595 nm).


TubosBSA (100 g / mL) Água Comassie Blue G-250

(mL)1 0,0 0,10 5,0

2 0,02 0,08 5,0

3 0,04 0,06 5,0

4 0,06 0,04 5,0

5 0,08 0,02 5,0

6 0,10 0,00 5,0

3.4 Construção de curva padrão de -aminoácidos – Método da ninhidrina


Reagente A: Tampão citrato de sódio 0,2M – pH = 5,0 (V = 25 mL)

Solução tampão encontrava-se recém preparada não justificando a

realização de nova preparação.

Reagente B: Ninhidrina 5 % em metilcelosolve (V = 10 mL)

Pesou-se 0,5 g de ninhidrina e completou-se o volume para 10 mL com

metil celosolve (etileno glicol monoetil éter).

Reagente C: Solução de KCN 2 % em metilcelosolve (V = 100 mL) a

partir de KCN 0,01M

Pesou-se 0,065 g de Cianeto de potássio (KCN), dissolveu-se em água

destilada e completou-se o volume para 100 mL. Retirou-se uma alíquota de 2

13

mL dessa solução, transferiu-se para um balão volumétrico e completou-se o

volume para 100 mL com metilcelosolve.

Etanol 60 % (v/v) (V = 100 mL)

Mediu-se 63,1 mL de etanol 95%, transferiu-se para um balão

volumétrico e completou-se para 100 mL com água destilada.

Solução de Glicina 0,1 g /mL (V = 25 mL)

A solução encontrava-se recém preparada não justificando a realização

de nova preparação.


Adicionaram-se alíquotas de água destilada, glicina e reagentes A + B +

C (previamente misturados) a seis tubos de ensaio conforme Tabela 5. Após, os

tubos foram agitados em vortex e levados ao banho-maria à 100 ºC durante 20

minutos. Após o resfriamento à temperatura ambiente, adicionaram-se aos tubos,

alíquotas de etanol e agitaram-se novamente. Os tubos foram levados para

leitura em espectrofotômetro ( = 570 nm).


TubosGlicina (g /mL) Água Reagentes A+B+C Etanol 60 %

(mL)1 0,0 1,0 1,7 1,3

2 0,2 0,8 1,7 1,3

3 0,4 0,6 1,7 1,3

4 0,6 0,4 1,7 1,3

5 0,8 0,2 1,7 1,3

6 1,0 0,0 1,7 1,3

A = 0,5 mL; B = 0,2 mL; C = 1,0 mL.

14

3.5 Representação do gráfico de dispersão

Os gráficos de dispersão, foram construídos por meio das leituras de

absorbância, onde os pontos em cada concentração correspondem a média de

todos os componentes. Aplicou-se a regressão linear, cuja fórmula y = ax + b

servirá para determinar a concentração das substâncias extraídas de um tecido

vegetal, sendo y o valor da absorbância e x a concentração da biomolécula a ser

determinada.

15

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO


Tabela 6: Valor de absorbância de açúcares solúveis totais (Abs620 nm) de cada repetição.

TuboANDREA CRISTIANO INÊS TERESA

MédiaR1 R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2

01 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,000 0,0000 0,0000

02 0,1201 0,1342 0,0791 0,0532 0,1047 0,0930 0,0523 0,0590 0,0870

03 0,1783 0,1752 0,1234 0,1189 0,1412 0,1434 0,1073 0,1217 0,1387

04 0,2236 0,2301 0,2832 0,3222 0,3467 0,2768 0,2406 0,2591 0,2728

05 0,3023 0,3061 0,4162 0,4259 0,4342 0,4342 0,3471 0,3866 0,3828

06 0,4978 0,4957 0,5929 0,5780 0,5971 0,5877 0,4741 0,5156 0,5424

07 0,6149 0,5577 0,7018 0,7862 0,6531 0,5934 0,6912 0,5350 0,6417

Açúcares Solúveis Totais (g mL-1)

0 6 12 24 36 48 60

Abs

620

(nm

)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8 Y = 0,0111 + 0,01066 Xr ² = 0,9582

Figura 6. Curva padrão de açúcares solúveis totais. Cada ponto representa a média de 8 medições.

16

4.2 Construção da curva padrão de açúcares redutores – Método DNS

Tabela 7: Valor de absorbância de açúcares redutores (Abs540 nm) de cada repetição.


MédiaR1 R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2

01 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,000 0,0000 0,0000

02 0,1858 0,1913 0,2367 0,2059 0,1488 0,1805 0,1935 0,1174 0,1825

03 0,4114 0,4047 0,4611 0,4609 0,4434 0,4549 0,4687 0,3917 0,4371

04 0,7407 0,7145 0,6277 0,7137 0,7143 0,7854 0,7388 0,7263 0,7202

Açúcares Redutores (M)

0 2 4 6

Abs

540

(nm

)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8 Y = -0,02733 + 0,12076 Xr ² = 0,9790

Figura7: Curva padrão de açúcares redutores, cada ponto representa a média de 8 medições.

17

Açúcares redutores (g ml-1)

4.3 Construção de curva padrão para proteínas – Método Bradford

Tabela 8: Valor de absorbância de proteínas (Abs 595 nm) de cada repetição.


MédiaR! R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2

01 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000

02 0,2307 0,2244 0,2425 0,2576 0,2149 0,1665 0,2201 0,2031 0,2200

03 0,4269 0,4264 0,5851 0,4474 0,3804 0,4039 0,4103 0,4190 0,4374

04 0,6274 0,6243 0,6133 0,7113 0,5459 0,5300 0,6026 0,6007 0,6069

05 0,7539 0,7726 0,8000 0,8436 0,6754 0,6481 0,8106 0,7928 0,7622

06 1,0193 0,9871 0,9083 0,9013 0,7664 0,8131 0,9632 0,9920 0,9188

Proteína (g 0,1 mL-1)

0 20 40 60 80 100

Abs

595

(nm

)

0,0

0,4

0,8

1,2 Y = 0,0344 + 0,00913 Xr ² = 0,9637

Figura 8: Curva padrão de proteínas, cada ponto representa a média de 8 medições.

18

Proteína (g mL-1)

4.4 Construção de curva padrão para aminoácidos – Método da ninidrina

Tabela 9: Valor de absorbância de aminoácidos (Abs 570 nm) de cada repetição.


MédiaR! R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2

01 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000

02 0,1947 0,1859 0,2816 0,2861 0,2816 0,1902 0,1944 0,1992 0,0540

03 0,3529 0,3637 0,4485 0,4160 0,4485 0,3924 0,3111 0,2999 0,0698

04 0,5682 0,6714 0,6509 0,5980 0,6509 0,5996 0,6351 0,7113 0,0695

05 0,7280 0,7780 0,8495 0,9154 0,8495 0,8009 0,8145 0,9121 0,0743

06 0,9290 0,9173 0,9728 0,9686 0,9728 1,0220 0,9310 0,9425 0,0843

Aminoácidos (mol)

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Abs

570

(nm

)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2Y = 0,0153 + 0,9792 Xr ² = 0,98

Figura 9: Curva padrão de aminoácidos, cada ponto representa a média de 8 medições.

19

Aminoácidos (g mL-1)

4.5 Gráficos de dispersão

Para a construção dos gráficos de dispersão (Figuras 6, 7, 8 e 9) foram

utilizados os resultados mostrados nas Tabelas 6, 7, 8 e 9, respectivamente.

As equações de ajustes encontradas para os teores das biomoléculas

foram lineares (y = ax + b) e seus valores de R2 denotam boa correlação entre a

taxa de absorbância e as concentrações das soluções sendo que apenas para a

equação dos açúcares redutores (Figura 7) encontrou-se valor negativo na

intercessão da reta no eixo y (y = -0,02733 + 0,12076x). Uma maior variação

nas repetições, provavelmente, causou esta diferença na tendência da reta.

Maiores variações de desvio padrão, foram observados em todos os gráficos no

ponto de maior concentração da biomolécula.

Os pequenos desvios de R2 podem ser conseqüências dos desvios da lei

de Beer (Jeffery et al, 1992) que inferem:

Quantidades de eletrólitos maiores do que exigido para a reação

provocariam um deslocamento no máximo de absorção assim como

alteram o valor do coeficiente de absorção molar;

O Soluto corado pode ionizar-se, ou dissociar-se, ou associar-se em

solução variando a concentração;

A formação de complexos cuja composição depende da

concentração.

É importante notar que a linearidade constatada na lei de Lambert-Beer

se restringe a zonas de aplicabilidade características de cada método para as

condições experimentais utilizadas. Efetivamente, em concentrações de amostra

excessivamente reduzidas ou elevadas, poderão ocorrer erros originados,

respectivamente, pela falta de sensibilidade do método, ou pela acentuação da

turbidez das soluções devido à polimerização inespecífica de moléculas em

solução.

20

Fatores aliados às condições de trabalho do experimento colaboraram

para as inúmeras dificuldades encontradas pelo grupo principalmente em

questão de padronização e reprodutibilidade dos métodos. A má conservação

dos reagentes (prazo de validade, umidade, luz, contaminação) e vidrarias de

precisão (provetas, pipetas graduadas e automáticas, balões volumétricos)

observadas, podem ter aumentado as fontes de erro já que as análises são feitas

em microescala. Qualquer erro, seja na pipetagem ou na pesagem dos reagentes

ou ainda na composição química destes, poderia provocar alterações na resposta

final das curvas pois alteraria a constante de equilíbrio (Keq) para a formação do

complexo corado e, consequentemente a absorção da luz.

21

5 CONCLUSÕES

As zonas de aplicabilidade de cada ensaio devem ser determinadas

experimentalmente, antes de ensaiar qualquer amostra, de modo a garantir a

validade dos resultados experimentais obtidos para as soluções problema.

As curvas padrões obtidas apresentaram boa calibração e poderão ser

utilizadas para a determinação dos teores das biomoléculas (açúcares redutores,

açúcares totais e proteínas) em tecidos vegetais, nos próximos experimentos

exigidos pela disciplina.

22

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BRADFORD, M.M. A rapid and snsitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilising the principle of protein - dye binding. Anal. Biochem, v. 72, p. 248-254, 1976.

CLARK, J.M. Bioquímica experimental. Zaragoza: editorial Acribia, 1966, 290 p.

CORN, E.E.; STUMPF, P.K. Introdução a Bioquímica. 4 ed. tradução, MENNUCCI et al. São Paulo: Edgard Blücher, 1980. 525 p.

JEFFERY, G.H., BASSETT, J., MENDHAM, R.C., DENNEY. 5. ed. Vogel: Análise Química Quantitativa. Rio de janeiro: Guanabara Koogan S.A., 1992, 712 p.

LEHNINGER, A.L. et al. Princípios de Bioquímica. 2a ed. São Paulo, Sarvier Ltda. 1996. 839p.

LOWRY, O.H.; ROSEBROUCHE, N.J.; FAN, A.L.; RANDALL, R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem, v. 193, p. 265, 1951.

OHLWEILER, O.A. Química analítica quantitativa. Rio de Janeiro: Livros técnicos Científicos. Brasília. INL, v. 1,2,3.1974.

OTTO ALCIDES OHLWEILER. 1981. Fundamentos de Análise Instrumental. Livros Técnicos e Científicos Editora S.A. Rio de Janeiro.

SHRINER, R. L.; FUSON, R. C.; CURTIN, D. Y.; MORRIL, T. C. Identificação sistemática dos compostos orgânicos: manual de laboratório. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara dois, 1983. 520p.

SOARES, B. G.; SOUZA, N. A. de; PIRES, D.X. Química orgânica: teoria e técnicas de preparação, purificação e identificação de compostos orgânicos. Rio de Janeiro: Guanabara, 1988. 322p.

23

QUESTIONÁRIO 1

Preparo de soluções e reagentes para análise Bioquímica

1) Quais os critérios e cuidados a serem utilizados na escolha de uma solução

tampão?

A escolha de uma solução tampão deve ser estabelecida buscando-se eficiência e

maior capacidade tamponante da mesma. Para tal, existem dois fatores

determinantes:

Concentração do sistema = Concentração dos componentes do sistema

Relação

inferindo pela equação de Henderson-Hasselbach:

Ou seja, uma solução tampão apresentará capacidade tamponante em um

intervalo correspondente a uma unidade de pH abaixo do pKa até uma unidade

de pH acima do pKa.

Portanto, a eficiência de uma solução tampão tende a ser maior quanto maior for

a proximidade entre pH da solução e pKa do ácido conjugado pois o

tamponamento ocorre em torno do pKa.

2) Qual é o princípio da “ação tamponante” de uma solução tampão?

O princípio gira em torno da capacidade desta solução em resistir a mudanças

bruscas de pH em intervalos próximos ao seu pKa.

24

3) Explique o princípio do desenvolvimento de cor resultante da reação do(s)

reagente(s) específico(s) utilizados para os métodos de determinação de

aminoácidos, proteínas, açucares redutores e totais. Mostre as reações.

Relatório, capítulo 2.

4) Construa as figuras representativas das curvas padrões determinando

inclusive suas equações de regressão.


5) Compare os métodos de quantificação utilizados nesta aula com os

disponíveis na literatura.


6) Tem-se uma solução de 25 ppm de Ca na forma de CaCl2. Qual o volume

dessa solução é necessário para preparar 100 mL de um padrão de Ca 0,3 mM.

25 V = 0,3 x 0,1 L

V = 0,0012 L = 1,2 mL

7) Transformar para ppm os seguintes valores:

a) 0,0015%;

25

b) 22,3 mg/L

c) 40 mg/100 mL

d) 125 g/ 5 L;

e) 0,025%;

26

f) 1000ppb;

g) 312 mg/ L;

h) 312 g/m3;

i) 3 g/T;

j) 5 mg/ mL;

27

k) 0,07 g/1000 mL;

m) (NH4)2SO4 - 5 mM. Quantos ppm de N, S, H e O?

n) MgHPO4 – 10 mM. Quantos ppm de Mg, P, H e O?

28

8) Uma solução de KNO3 tem 140 ppm de N. Quantos ppm tem de K?

9) Para obtermos 10 litros de uma solução de Ca 160 ppm, quanto de

Ca(NO3)2 .4H2O é preciso?

10) Preparar uma solução de 1 M em K, a partir de K2SO4.

11) Preparar 1 litro de solução que contenha 195 ppm de K e tendo como

solução estoque KNO3 1 M.

29

12) O que é normalidade, molaridade, molalidade e ppm?

Normalidade (N): nº de equivalente-grama do soluto dissolvido em um litro

de solução.

onde Nº eq = nº de equivalente-grama; V = volume

expressa em mol L-1

onde

eq g = equivalente-grama;

N º ionizáveis = Ácido = nº de H+ ionizáveis

Base = nº de OH- ionizáveis

Sal = nº do elemento de maior Nox

Concentração molar ou molaridade (M): nº de mols de soluto dissolvidos em

um litro de solução, ou seja:

expressa em mol L-1 ou g L-1 ou g cm-3.

onde n = nº de mols; V = volume da solução.

Se onde m = massa do soluto; PM = peso molecular do soluto.

30

Então, molaridade pode também ser definida por:

Concentração molal (): nº de mols de soluto dissolvido em um quilograma

de solvente.

onde = molalidade; n = nº de mols; m = massa da solução.

expressa em mol Kg-1 ou g Kg-1

Partes por milhão (ppm): indica o nº de partes de soluto em um milhão de

partes de solução.

1ppm (p/p) = expressa em mg Kg-1 ou mg g-1

1ppm (v/v) = expressa em mg L-1

1ppm (p/v) = expressa em mg L-1 ou mg mL-1

Obs. É interessante ressaltar que os termos molalidade e molaridade estão sendo

substituídos por ppm (molalidade está completamente abolido) visto que a

tendência atual é somente trabalhar em termos de massa/massa.

Fazendo correlações encontra-se:

1 ppm (p/p) = expressa em mg Kg-1 ou g g-1

1 ppm (v/v) = expressa em L L-1

1 ppm (p/v) = expressa em mg L-1 ou g mL-1

1 M = 1000 ppm então 1 ppm = 1 mM

31

13) Como são divididos quimicamente os aminoácidos?

Os aminoácidos são divididos em quatro grupos de acordo com a polaridade do

seus grupamento R lateral. São eles:

Aminoácidos com R = grupos apolares (hidrofóbicos)

32

Aminoácidos com R = grupos polares neutros (hidrofílicos)

Aminoácidos com R = grupos polares ácidos

33

Aminoácidos com R = grupos polares básicos

14) O que é precisão, exatidão e sensibilidade do método?

A exatidão é a concordância entre o resultado determinado e o

verdadeiro ou em outras palavras, exprime a correção de uma medida. A

precisão é a concordância de uma ou mais medidas de uma mesma variável, ou

seja, exprime a reprodutibilidade de uma análise.

Sensibilidade é a capacidade de aparelhos ou instrumentos ou análises,

de reagir à mínima ação ou variação de influências físicas externas, tais como

peso, pressão, temperatura, concentração, etc.

34

SUMÁRIO

1

INTRODUÇÃO.....................................................................................................1

2 REFERENCIAL TEÓRICO..............................................................................2

3 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................10


10

3.1.1 Preparo dos Reagentes...............................................................................10

3.1.2 Obtenção da curva padrão.........................................................................10

3.2 Construção da curva padrão de açúcares redutores – Método DNS..............11

3.2.1 Preparo dos reagentes................................................................................11

3.2.2 Obtenção da curva padrão...........................................................................12

3.3 Construção de curva padrão para proteínas – Método Bradford....................12

3.3.1 Preparo do reagente...................................................................................12


3.4 Construção de curva padrão de -aminoácidos - Método Da Ninhidrina 13

3.4.1 Preparo dos reagentes..................................................................................13


3.5 Representação do gráfico de dispersão..........................................................15

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................16

4.1 Construção de curva padrão de açúcares solúveis totais – Método Antrona. 16

4.2 Construção da curva padrão de açúcares redutores – Método DNS..............17

4.3 Construção de curva padrão para proteínas – Método Bradford....................18

4.4 Construção de curva padrão para aminoácidos – Método da Ninidrina.........19

4.5 Gráficos de dispersão.....................................................................................20

5 CONCLUSÕES...............................................................................................22

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................23

ANEXO - QUESTIONÁRIO................................................................................24

relatorio1 dns açucares

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