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FURB – FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE DE BLUMENAUCENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIAAcadêmico: Antônio Guarrilha Junior
Monira PioliTalita Grahl
Victor Henrique lucasDisciplina: Bioquimica
Curso: Odontologia - I semestreProfessora: Ana L. B. Zeni
Relatório deAulas
Práticas
1
SUMÁRIO
1. pH e indicadores................................................................pag.04
1.1 Introdução.........................................................................pag.04
1.2 Materiais e métodos.........................................................pag.04
1.3 Resultados e discussões.................................................pag.05
1.4 Conclusões........................................................................pag.07
2. Carboidratos.......................................................................pag.09
2.1 Introdução.........................................................................pag.09
2.2 Materiais e métodos.........................................................pag.10
2.3 Resultados e discussões................................................pag.11
2.4 Conclusões.......................................................................pag.14
3. Lipídios................................................................................pag.15
3.1 Introdução..........................................................................pag.15
3.2 Materiais e métodos..........................................................pag.15
3.3 Resultados e discussões.................................................pag.16
3.4 Conclusões........................................................................pag.18
4. Proteínas.............................................................................pag.19
4.1 Introdução...........................................................................pag.19
4.2 Materiais e métodos..........................................................pag.19
4.3 Resultados e
discussões..................................................pag.20
4.4 Conclusões.........................................................................pag.2
3
5. Aminoácidos.......................................................................pag.24
5.1 Introdução..........................................................................pag.24
5.2 Materiais e métodos..........................................................pag.25
2
5.3 Resultados e
discussões..................................................pag.25
5.4 Conclusões.........................................................................pag.2
6
6. Enzimas...............................................................................pag.27
6.1 Introdução..........................................................................pag.27
6.2 Materiais e métodos..........................................................pag.27
6.3 Resultados e
discussões..................................................pag.28
6.4 Conclusões.........................................................................pag.3
0
Referências...............................................................................pag.31
3
1. pH E INDICADORES
1.1. INTRODUÇÃO
O Potencial Hidrogeniônico (pH) consiste num índice que indica a
acidez, neutralidade ou alcalinidade de um meio qualquer.
As substâncias em geral, podem ser caracterizadas pelo seu valor de pH,
sendo que este é determinado pela concentração de íons de Hidrogênio (H+).
Quanto menor o pH de uma substância, maior a concentração de íons H+ e
menor a concentração de íons OH-.
“o pH de uma solução aquosa pode ser medido aproximadamente
usando-se vários corantes indicadores como, litmus, fenolftaleína e
fenol vermelho, os quais sofrem transformações coloridas sempre que
um próton dissocia-se da molécula dos mesmos.”
(LEHNINGER, NELSON E COX, 1993, pg. 69)
Na aula prática de pH e indicadores foram realizados experimentos
como objetivo de determinar o pH de amostras mediante uso de indicadores e
produzir um indicador a partir do repolho roxo.
Relevantes observações notadas nas experiências foram os resultados
de acidez e alcalinidade das varias substancias medidas, onde um pH acima
de 7 é tido como básico e abaixo de 7 como ácido sendo que a medida 7
representa sua neutralidade.
1.2 MATERIAIS E MÉTODOS
Nesta determinada aula prática foi usado diversos materiais, dos quais
serão citados a seguir:
4
a) Indicadores: tornassol, fenolftaleína, papel universal, pHmetro e
substrato retirado do repolho roxo.
b) Soluções: NaOH, HCl, H2O, CH3COOH, NH4OH e uma solução
de livre escolha, entre coca – cola, detergente, café, suco de fruta, xampu, chá
e amônia, no qual optamos pelo uso da coca – cola.
c) Materiais laboratoriais: tubos de ensaio, estante, Becker, folhas de
gaze, vidro relógio, fogareiro com bico de buzo, pipeta.
Para a execução das experiências foram realizados diversos
procedimentos.
Em um primeiro momento foi retirada uma pequena porção de repolho
roxo, adicionada a um Becker e fervido até liberar a cor. A solução foi posta em
repouso por um período de 30 minutos aproximadamente e filtrada em um
pedaço de gaze logo após esse período, sendo usado como indicador de pH,
onde em soluções ácidas adquiri de coloração vermelha e soluções básicas
coloração de azul a verde.
Em procedimentos seguintes foram identificados ácidos e bases através
do uso de indicadores:
I – foram dispostos em vidro relógio pedaços de papel indicador
tornassol e papel universal, onde foram gotejadas com auxilio de pipetas as
soluções escolhidas. Observou-se a coloração dos papeis para obtenção e
registro dos resultados.
II – através do indicador líquido fenolftaleína de 2 a 5 gotas adicionadas
a 2 ml das soluções em um tubo de ensaio, observou-se a coloração adquirida
pelas soluções para registro dos resultado.
III – usando o indicador do repolho roxo, foi repetido todo o
procedimento anterior.
IV – utilizando a Coca-Cola como solução obtivemos o resultado de pH
da mesma, através do uso do pHmetro.
1.3 RESULTADOS E DISCUÇÕES
Experiência - I
Solução Coloração do papel Coloração do papel
5
tornassol universal
NaOH Azul (base) 13
HCl Vermelho (ácido) 0
H2O Vermelho (ácido) 4
CH3COOH Vermelho (ácido) 5
NH4OH Azul (base) 9
As substancias que obtiveram coloração vermelha no papel tornassol e
numeração abaixo de 7 no papel universal (HCl, H2O, CH3COOH), são
consideradas com pH ácido por apresentarem maior concentração de ións de
hidrogênio H+. Já as substancias que obtiveram coloração azul no papel
tornassol e numeração maior que 7 no papel universal (NaOH, NH4OH), são
consideradas bases, portanto apresentam maior concentração de OH-.
Experiência - II
SOLUCÃO Coloração da fenolftaleína
NaOH Vermelho (8,0 - 10,0)
HCl Incolor
H2O Incolor
CH3COOH Incolor
NH4OH Vermelho (8,o – 10,0)
Neste experimento foi usado um indicador, a fenolftaleína, onde sua
característica em solução acida é incolor, e em solução básica vermelho (8,0 –
10,0). Desta forma as soluções HCl, H2O e CH3COOH são Básicas, pois o
resultado foi Incolor, e as soluções NaOH e NH4OH coloração vermelha,
solução acida.
Experiência – III
SOLUCÃO Coloração do repolho roxo
NaOH Verde
6
HCl Rosa forte
H2O Roxo
CH3COOH Rosa
NH4OH Verde
Nesta experiência, utilizamos como indicador o repolho roxo. Analisando
os resultados dos níveis de acidez, observa-se que as soluções onde a
coloração foi verde, era básicas, e as soluções em rosa e rox,o indica um pH
mais acido.
Experiência - IV
SOLUCAO Papel Tornassol Papel Universal
Coca-cola Vermelho (Acido) 2
Observamos que a Coca-cola é uma substancia acida, pois a coloração
indicada no papel tornassol vermelho e no papel universal pH 2 indicaram sua
acidez.
Medimos através do pHmetro as soluções NaOH, HCl, H2O, CH3COOH,
NH4OH.
SOLUCAO pHmetro
NaOH 12.6
HCl 0
H2O 4.0
CH3 COOH 2.5
NH4OH 9.8
O pHmetro ou medidor de pH é um aparelho usado para medição de pH,
mais preciso. Nessas soluções medidas, as acidas foram HCl, H2O e
CH3COOH, sendo que o pH foi menor que 7, e as básicas NaOH e NH4OH,
pH maior que 7.7
1.4 CONCLUSÃO
Observando as experiência realizadas, e os resultados em cada uma
delas, podemos concluir que a medição de pH sendo através do papel
tornassol ou universal observando a coloração destes, ou também com o uso
do pHmetro para ter uma medição de forma mais precisa, assim, identificar as
soluções acida ou básicas, é importante para a manutenção da vida, como
Lehninger, Nelson e Cox (1995), citam que, o pH afeta a estrutura e a
atividade das macromoléculas biológicas como, por exemplo, a atividade
catalítica das enzimas.
O pH também é usado para identificar doenças, através da medição dos
níveis de pH do sangue e urina.
8
2. COLORAÇÃO DE CARBOIDRATOS
2.1. Introdução
Os carboidratos são as biomoléculas mais abundantes na natureza,
apresentam como fórmula geral: [C(H2O)]n, daí o nome "carboidrato", ou
"hidratos de carbono" e são moléculas que desempenham uma ampla
variedade de funções, entre elas: fonte de energia, reserva de energia,
estrutural e matéria prima para a biossíntese de outras biomoléculas.
“ Os animais podem sintetizar alguns carboidratos a partir de gorduras e proteínas, porém a maior parte dos carboidratos animais originam-se fundamentalmente, de plantas”(MURRAY, GRANNER, MAYES, RODWELL, 2002, pg. 149)
Os carboidratos podem ser classificados em monossacarídeos,
dissacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos.
Os monossacarídeos, também chamados de açúcares simples,
consistem numa só unidade cetônica. O mais abundante é o açúcar de seis
carbonos D-glucose; é o monossacarídeo fundamental de onde muitos são
derivados. A D-glucose é o principal combustível para a maioria dos
organismos e o monômero primário básico dos polissacarídeos mais
abundantes, tais como o amido e a celulose.
São carboidratos ditos glicosídeos, pois são formados a partir da ligação
de 2 monossacarídeos através de ligações especiais denominadas "Ligações
glicosídicas". A ligação glicosídica ocorre entre o carbono anomérico de um
monossacarídeo e qualquer outro carbono do monossacarídeo seguinte,
através de suas hidroxilas e com a saída de uma molécula de água.
São os carboidratos complexos, macromoléculas formadas por milhares
de unidades monossacarídicas ligadas entre si por ligações glicosídicas, unidas
em longas cadeias lineares ou ramificadas. Os polissacarídeos possuem duas
9
funções biológicas principais, como forma armazenadora de combustível e
como elementos estruturais.(Harper, pg,149)
Na aula prática de coloração de carboidratos, tivemos como objetivo
identificar através de vários reagentes os hidratos de carbono nas substâncias,
os hidratos de carbono redutores e desvendar qual a solução problema
proposta nas experiências.
2.2. Materiais e métodos
Vários materiais foram utilizados nestes experimentos:
a) reagentes: solução de hidratos de carbono, reagentes de Molisch
(naftol 5% em álcool), ácido sulfúrico concentrado, reagentes de Lugol (5g de
iodo + 10g de iodeto de potássio em 10ml de agua), reagente de Benedict e
reativos de Barfoed.
b) soluções: água, glicose, sacarose, amido, frutose, lactose, matose e
uma solução problema.
c) vidrarias e instrumentais: tubos de ensaio, estante, fogareiro com bico
de buzo, pipetas, conta gotas.
Cada experiência teve seus próprios passos e métodos:
I. No primeiro momento foi realizada experiência usando-se o reagente
de Molisch. Foram preparados 5 tubos com soluções diferentes e
acrescentados 2 gotas de reativo de Molisch. No passo seguinte foi agitado os
tubos e adicionado 2ml de ácido sulfúrico concentrado em cada tubo, para
observar e interpretar os resultados obtidos.
II. No segundo experimento foi utilizado o reagente de Lugol. Foram
preparados 6 tubos com soluções de agua, glicose, sacarose, amido, pequena
fração de algodão com agua e a solução problema, e acrescentado 2 gotas de
reagente de Lugol. Foi observado, aquecido, resfriado e novamente observado
para podermos obter os resultados positivos nas soluções que continham
amido.
III. Identificação de hidratos de carbono redutores foi nosso passo
seguinte, onde foram preparados 7 tubos de ensaio com água, glicose, frutose,
sacarose, amido, lactose e a solução problema. Adicionados aos tubos o
10
reagente de Benedict. Aquecidos por mais ou menos 5 minutos em banho-
maria fervente, foram observados e analisados os resultados para carboidratos
redutores.
IV. Agora fazendo uma reação com Barfoed, para monossacarídeos
redutores, foram utilizados 5 tubos com glicose, maltose, amido, água destilada
e a solução problema. A 2,5ml do reativo de Barfoed foi adicionado 1ml de
cada solução a ser testada. Fervendo durante 1 minuto em banho maria, todas
as soluções foram comparadas com a do tubo branco que continha água
destilada. Os resultados revelaram os monossacarídeos redutores.
V. Em um último experimento fizemos a inversão da sacarose. Em um
tubo de ensaio foi pipetado 5ml de solução de sacarose e acrescentado 0,5ml
de HCl. Fervido por 2 minutos deixamos reservado. O HCl rompe a ligação
glicosídica, assim separamos a glicose e a frutose.
Para termos a certeza do rompimento das moléculas em outro tubo de
ensaio pipetamos 2ml do reativo de Benedict. Adicionando 0,5ml da sacarose
já invertida, fervemos e observamos o aparecimento de um precipitado
vermelho-tijolo.( Roteiro de aulas práticas).
2.3 Resultados e discussões
Experimento I:
Para a reação com o reagente e Molisch tivemos os seguintes resultado:
a) Para I ml de água o resultado foi negativo.
b) Para I ml de glicose 0,I M, o resultado foi positivo.
c) Para I ml de sacarose 0,I M, o resultado foi positivo.
d) Para I ml de amido 0,I %, o resultado foi positivo.
e) Na solução problema o resultado final também foi positivo.
Os ácidos concentrados causa a desidratação de monossacarídeos. As
pentoses dão como produto final o furfural, e as hexoses o hidroximetilfurfural.
Estes derivados se condensam com o alfa-naftol, originando produtos
11
coloridos. Se um oligossacarídeo ou polissacarídeo estiver presente, ele é
primeiro hidrolisado em seus monossacarídeos constituintes, que são então
desidratados. Essa reação é considerada geral para os carboidratos, e não é
específica pois se processa com outras substâncias.
O surgimento de um anel de coloração lilás estável indica que houve
formação de furfurais, revelando a presença de açúcares na amostra. Assim
nas soluções onde o resultado foi positivo obteve-se este anel revelando estes
açucares.(roteiro de aulas práticas).
Experimento II
Resultados para reação com Lugol:
a) I ml de agua, resultado negativo.
b) I ml de glicose 0,I M, resultado negativo.
c) I ml de sacarose 0,I M, resultado negativo.
d) I ml de amido 0,I %, resultado positivo (coloração azul)
e) Solução problema, resultado negativo.
f) pequena fração de algodão com I ml de água, resultado negativo.
Como o Lugol não reage com monossacarídeos, dissacarídeos e
celuloses, nas reações com agua, glicose, sacarose, e também na solução os
resultados foram negativos. Na presença do amido a coloração se tornou azul,
dando um resultado positivo, sabendo-se que este reagente que é a base de
iodo reage com polissacarídeos.
Desta maneira obtivemos a primeira resposta para nossa solução
problema, onde descobrimos que ao grupo de polissacarídeos ela não
pertencia.(roteiro de aulas práticas)
Experimento III
Resultados na identificação de hidratos de carbono redutores com
reagente de Benedict:
12
a) I ml de água, resultado negativo (coloração azul).
b) I ml de glicose 0,I M, resultado positivo (coloração telha).
c) I ml de frutose 0,I M, resultado positivo (coloração telha).
d) I ml de sacarose 0,I M, resultado negativo (coloração azul).
e) I ml de amido 0,I%, resultado negativo (coloração azul).
f) I ml de lactose 0,I M, resultado positivo ( coloração telha).
g) solução problema 1ml, resultado positivo ( coloração telha).
Os carboidratos redutores possuem grupos aldeídos ou cetonas livres ou
potencialmente livres, sofrendo oxidação em solução alcalina de íons metálicos
como o cobre. Os íons cúpricos (Cu++) são reduzidos pela carbonila dos
carboidratos a íons cuprosos(Cu+) formando o óxido cuproso, que tem cor
vermelho tijolo. (intermed99.vilabol.uol.com.br/bioquimica2.html).
O carboidratos redutores são monossacarídeos e somente alguns
dissacarídeos. A sacarose que é um dissacarídeo, não sofre oxidação porque
possui dois carbonos anoméricos envolvidos na ligação glicosídica.
Obtivemos a nossa segunda descoberta referente a solução problema,
pois como o resultado foi positivo para a reação dando a coloração telha, agora
sabemos que ou ela é um monossacarídeo ou um .(roteiro de aulas praticas).
Experimento IV
Reação de Barfoed, resultados:
a) solução de glicose I%, resultado positivo ( monossacarídeo redutor).
b) solução de maltose I%, resultado negativo.
c) solução de amido I%, resultado negativo.
d) água destilada, resultado negativo.
e) solução problema, resultado positivo (monossacarídeo redutor).
13
Este teste foi parecido com o teste anterior. A diferença é que, como o
reagente de Barfoed é fracamente ácido apenas os monossacarídeos
obtiveram o resultado positivo para açucares redutores.
Com esse teste descobrimos o resultado final para nossa solução
problema, a qual tendo o resultado positivo ficou claro que ela pertence ao
grupo de monossacarídeos redutores. Para adiantar nossa experiência nos foi
dito qual era a solução. Assim ficamos sabendo que a solução era de frutose.
(roteiro de aulas praticas).
Experimento V
Inversão da sacarose, resultados:
a) quando adicionamos HCl a sacarose obtivemos o rompimento da
ligação glicosídica. Assim a glicose e a frutose ficaram separadas.
b) no segundo passo, adicionamos à solução de sacarose já invertida o
reagente de Benedict, o qual obtivemos resultado positivo para açucares
redutores, pois a frutose e a glicose separadas são monossacarídeos, assim
nossa coloração com o reagente de Benedict fico cor telha.
A sacarose por si só não é um açúcar redutor, pois possui dois carbonos
anoméricos em sua ligação glicosídica. Quando através do HCl, rompemos
essa ligação, obtivemos a glicose e a frutose separadas as quais, desta forma
são açucares redutores.
2.4 Conclusões
Ao término de todas nossas experiências, podemos concluir que
obtivemos os resultados desejados no início.
Conseguimos através do Molisch identificar a presença de carboidratos
nas substâncias, com o Lugol identificar a presença de amido, com o Benedict
os açucares redutores (mono e dissacarídeos), com o Barfoed os
14
monossacarídeos redutores, e ao final obtivemos a inversão da sacarose
através da adição de HCl na mesma.
Esta aula prática facilitou em grande escala o entendimento sobre
monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos, seus tipos de ligação, e as
reduções oxidativas nos açucares.
Todos os experimentos ocorreram de uma forma tranquila, sem grandes
problemas, onde conseguimos fazer os testes uma vez só, sem repetições.
3 LIPÍDIOS
3.1 Introdução
Os lipídios, também chamados de gorduras, são biomoléculas orgânicas
compostas, principalmente, por moléculas de hidrogênio, oxigênio, carbono.
Fazem parte ainda da composição dos lipídios outros elementos como, por
exemplo, o fósforo. Os lipídios possuem a característica de serem insolúveis na
água. Porém, são solúveis nos solventes orgânicos (álcool, éter, benzina, etc).
“ Os lipídios são constituintes importantes da dieta não só pelos seus elevados valores energéticos mas também pelas vitaminas lipossolúveis e ácidos graxos essenciais contidos na gordura dos alimentos naturais”.(MURRAY, GRANNER, MAYES, RODWELL, 2002, pg. 160)
Os lipídios possuem várias funções como isolantes elétricos, valores
energéticos, composição de algumas membranas celulares, isolantes térmicos
e facilitação de algumas reações químicas no organismo como: hormônios
sexuais, vitaminas lipossolúveis (vitaminas A, K, D e E) e as prostaglandinas.
Segundo Mayes (ibid, pg. 160), os lipídios são classificados em simples,
que seriam as gorduras e as ceras, e os complexos, que são os fosfolipídios,
glicolipídios, sulfolipídios e os aminolipídios.
A aula prática de lipídios teve como objetivo, observar a solubilidade dos
lipídios, observar a formação de sabões e por último, observar métodos
qualitativos de caracterização de lipídios importantes para os organismos vivos.
3.2 Materiais e métodos
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Os materiais usados nos testes foram:
a) reagentes: lecitina, clorofórmio, água, reativo de Hübl, etanol e NaOh
b) soluções: ácido oléico, ácido esteárico.
c) vidrarias e instrumentais: tubos de ensaio, espátula, conta gotas,
fogareiro com bico de buzo e algodão.
Métodos utilizados:
I. no teste de solubilidade foram adicionados a 2 tubos de ensaio uma
ponta de espátula de lecitina. No tubo nº 1 foi adicionado água e no tubo nº 2
adicionamos clorofórmio. Observando e analisando os tubos anotamos a
solubilidade ou não de cada substância testada.
II. no segundo teste, fizemos a diferenciação entre ácidos graxos
saturados e insaturados onde distribuímos os reagentes em 4 tubos. Um tubo
com clorofórmio, outro com ácido oléico, outro com ácido esteárico e outro com
lecitina e clorofórmio. A seguir, adicionamos aos 4 tubos, uma gota de reativo
de Hübl, onde agitamos e observamos as reações, assim prosseguimos
adicionando sempre uma gota até que chegasse a marca de 5 gotas, onde
obtivemos os resultados de saturações e insaturações.
III. no último teste fizemos a saponificação de ácidos graxos. Em um
tubo de ensaio que já continha 1 espátula de lipídio, acrescentamos 2 ml de
NaOH 10N, e 10 ml de etanol absoluto. Fechamos o tubo com algodão e
misturamos bem as soluções.
O próximo passo foi botar em banho maria, fervente onde agitamos
ocasionalmente até a formação de uma pasta. Depois de todo este processo
obtivemos o produto desejado da saponificação.(Roteiro de aulas práticas)
3.3 Resultados e discussões
Experimento I
Reagente TUBO 1 TUBO 2
Lecitina 1 ponta de espátula 1 ponta de espátula
Clorofórmio ---- 2 ml
16
Água 2 ml ----
a) no teste com o tubo nº1, a lecitina não solubilizou com a água.
b) no teste com o tubo nº2, a lecitina solubilizou com o clorofórmio.
Os lipídios devido a sua natureza apolar são geralmente insolúveis em
água solúveis em solventes apolares. Neste experimente podemos concluir
esta afirmação com os resultados obtidos acima.(roteiro de aula prática).
Experimento II
SOLUÇÕES TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 RESULTADOS
Padrão de
cor
(clorofórmio)
2ml ---- ---- 1,5 ml Saturado
Sol. Ácido
oléico
---- 2ml ---- ---- Insaturado
Sol. Ácido
esteárico
---- ---- 2ml ---- Saturado
Lecitina ---- ---- ---- 0,5ml Insaturado
Os ácidos graxos insaturados adicionam o iodo as ligações duplas
tornando-se saturados. O vermelho róseo que se observa no tubo que contém
somente clorofórmio é a cor característica das soluções em que o iodo se
encontra na forma livre.
Na experiência notamos que as soluções onde se perde a cor e o tom de
rosa fica cada vez mais fraco, são as soluções ditas insaturadas, que foi o caso
do ácido oléico e da lecitina. No ácido esteárico e no clorofórmio por manter a
cor forte, determinou-se soluções saturadas. Este teste foi feito com o reativo
17
de Hübl, que tem por característica tons de rosa forte para saturados e tons
fracos para insaturados.( Roteiro de aulas práticas)
Experimento III
Neste experimento obtivemos os seguintes resultados:
Com os lipídios complexos hidrolisados em meio alcalino no processo de
saponificação obtivemos a separação do glicerol do ácido graxo, onde o
glicerol é a parte liquida e o ácido graxo a pasta de sabão obtida.
3.4 Conclusões
Podemos concluir no final dos testes que os ácidos graxos na sua
maioria são insolúveis em água, e podem ser saturados ou não. No final
descobrimos o que acontece no “mistério” da saponificação, onde nossos avós
faziam e nós olhávamos e não entendíamos o que acontecia. Hoje temos a
explicação cientifica deste processo que se chama hidrolise de lipídeos
complexos em meio alcalino.
Os resultados que obtivemos foram os esperados e tudo ocorreu de
forma tranquila. Foram experimentos rápidos, realizados em uma hora mais ou
menos. Concluímos que os lipídios são muito importantes para a energia das
nossas células entre outras funções, e também que são eles os grandes
responsáveis por as pessoas engordarem, sendo armazenados em nosso
tecido adiposo.
18
4. CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS
4.1 INTRODUÇÃO
As são compostos orgânicos de alto peso molecular, formadas pelo
encadeamento de aminoácidos. Representam cerca do 70% do peso seco da
célula sendo, portanto, o composto orgânico mais abundante de matéria viva.
Tem papel também na nossa informação genética, expressa como
proteínas.
“Para cada proteína existe um segmento de DNA (um gene) que
guarda a informação, especificando sua sequência de aminoácidos”
(LEHNINGER, NELSON, COX , 1995, pg. 99)
O Objetivo da aula prática de caracterização de proteínas, foi o de
realizar diversos experimentos com a finalidade de se observar a desnaturação
das proteínas através de diversos métodos, sendo eles por ação do calor, por
ação de ácidos e álcalis fortes, por reação com metais pesados, por reação
com reagentes alcalóides ou por ação de solventes orgânicos.
4.2 MATERIAIS E MÉTODOS
Na execução destes experimentos foram usados os seguintes materiais:
d) Proteína: albumina bovina.
e) Soluções reagentes: HCl (ácido clorídrico) concentrado, NaOH 12N
(hidróxo de sódio), solução diluída de CuSO4(sulfato de cobre) a
0,5%, solução diluída de FeCl3(percloreto férrico) a 0,5%, solução
diluída de acetato de chumbo a 1%, solução diluída de ácido pícrico
a 0,25%, solução de ácido tricloroacético a 10%, acetona e butanol.
f) Materiais laboratoriais: tubos de ensaio, estante, pipeta, bico de
Bunsen.
19
O método aplicado para a obtenção dos devidos resultados se deu por
meio de atividades práticas.
A primeira atividade organizada foi a de observação da desnaturação de
2 ml da solução da proteína pela ação do calor, aquecendo-a diretamente na
chama.
A segunda, por reação de ácidos e álcalis fortes, foi realizada com a
adição de 2 ml de solução de albumina bovina, cuidadosamente, em um tubo
de ensaio contendo HCl concentrado e em um segundo tudo contendo NaOH
12N.
Em uma terceira prática, por reação de metais pesados, foram
preparados 3 tubos de ensaio contendo 2 ml de solução de albumina bovina
em cada um. No primeiro tubo, foi gotejado solução diluída de CuSO4(sulfato
de cobre) a 0,5% até ocorrer a precipitação. No segundo tubo, foi realizado o
mesmo procedimento, porém, com a solução diluída de FeCl3(percloreto
férrico) a 0,5%. E no terceiro tubo o procedimento se deu da mesma maneira
anterior, no entanto, com a solução diluída de acetato de chumbo a 1%.
Na quarta prática a desnaturção foi dada por reagentes alcalóides, com
o preparo de 2 tubos de ensaio contendo 2 ml de solução de albumina bovina.
Adicionando ao primeiro tubo, por meio de gotejamento lento, solução de
ácido píprico a 0,25%, e ao segundo tubo, foi realizado de mesma maneira, no
entanto, com a solução de ácido tricloroacético a 10%, ambos até que um
excesso de reagente seja adicionado.
A quinta e última atividade foi realizada para a observação da
desnaturação por ação de solventes orgânicos, onde foi adicionado a um
primeiro tubo 2 ml de acetona, e a outro tudo 2 ml de butanol e logo após
acrescentado 2 ml de solução de albumina bovina e homogenizado cada um
dos tubos, observando a intensidade de precipitação de cada tubo.
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Experiência – I
20
Com a experiência obtivemos a formação de um coágulo branco no
fundo do tubo de ensaio, formado por proteína desnaturada.
Essa desnaturação se dá pela quebra das diversas ligações que existem
na proteína, podendo ser das ligações iônicas, pontes de hidrogênio dentre
outras existentes nas estruturas secundárias, terciárias ou quaternárias.
“As proteínas possuem uma estrutura tridimensional
(conformação) bem definida, da qual dependem fundamentalmente
suas propriedades físicas, químicas e biológicas. Essa estrutura é
relativamente sensível à ação do calor, que causa desorganização
das cadeias peptídicas, com conseqüente alteração conformacional.
Esse fenômeno recebe o nome de desnaturação, e altera as
estruturas quaternária, terciária e secundária da proteína sem afetar
sua estrutura primária.”
(FREITAS DIAS, AUGUSTO NEVES, Site:
http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/
precipitacao_proteinas.htm, acesso: 13 de novembro de 2011, as
18:28)
Experiência – II
Durante este procedimento, obtivemos 2 resultados destintos, nos quais
foi observado uma mudança considerável de consistência e de cor.
No primeiro tubo, contendo HCl, foi observado, além da mudança de
consistência e cor, o surgimento de um solvente e um soluto ao fundo do tubo.
Já no segundo tubo, contendo NaOH 12N, a proteína após o
procedimento apresentou solidificação total além da mudança de coloração.
Experiência – III
Neste experimento foi possível observar que a albumina bovina ao entrar
em contato com a solução de CuSO4 a 0,5% se solidifica e apresenta uma
mudança de cor (esbranquiçada), enquanto no segundo tubo com uma solução
de FeCl3 a 0,5% ocorreu a presença de soluto em pouca quantidade e solvente
em grande quantidade; e em um terceiro tubo com acetato de chumbo foi
21
observado apenas uma mudança na coloração da mistura, de incolor para
branca.
Isso por que os cations de metais pesados formam um precipitado
insolúvel, com isso a carga líquida sobre a proteína é negativa, favorecendo a
interação dos cátions provenientes do sal.
Esse precipitado se torna mais intenso quando o pH esta acima do pI
(ponto isoelétrico), ou seja, no primeiro tubo o pH estava bem acima do pI, no
segundo tubo já estava mais a baixo do que no primeiro e no terceiro tubo o pH
se encontrava mais baixo que o pI.
Experiência – IV
Com este experimento foi possível observar que ao gotejar ácido pícrico
a 0,25% em uma solução de albumina bovina, a mistura apresenta uma
mudança de coloração com presença de partículas de soluto e mudança de
consistência.
Enquanto que em um segundo tubo, ao adicionar o ácido tricloroacético
a 10% o preparado muda sua coloração de incolor para levemente
esbranquiçado e muda também sua consistência.
Quando comparada com a experiência III, ocorre a precipitação abaixo
do ponto isoelétrico. Segundo Augusto Neves
(http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/
precipitacao_proteinas.htm) a precipitação ocorre abaixo do pI da proteína por
que a carga líquida da molécula é positiva, fazendo com que os ânions
provenientes dos ácidos interajam com maior facilidade com a molécula de
proteína.
Experiência – V
No seguinte experimento obtivemos resultados semelhante, com
mudanças de cor e consistência em ambos os tubos, porém no tubo que
continha acetona, observamos leve mudança de cor e consistência, enquanto
22
que no tubo contendo butanol foi de facil percepção uma mudança mais
acentuada de coloração do que de consistência.
Essa reação ocorre devido ao baixo valor de constante dielétrica dos
solventes orgânicos utilizados, fazendo com que a interação proteína-proteína
tenha maior aproveitamento do que o poder de solvatação da água, fazendo
com que a proteína precipite-se.
4.4 CONCLUSÃO
Vimos que em nosso cotidiano realizamos desnaturação de proteínas
sem nos darmos conta, como no simples ato de cozinhar um ovo, fazendo com
que a clara do ovo se torne uma substância branca e sólida.
Concluimos por meio das realizações que são varias as maneiras de
promover a precipitação de proteínas, podendo ser atingindo seu ponto
isoelétrico, como no caso de metais pesados. Dentre outras maneiras que
influenciam na propriedade física da proteína é a temperatura que diminui a
solubilidade da proteína e a ação de ácidos, bases, sais e solventes orgânicos
com os quais foram realizados os experimentos.
Foi possível compreender também que a desnaturação pode ser
reversível ou irreversível, onde soluções desnaturadas por ação de extremos
de pH, calor ou reagentes desnaturantes podem recuperar não só a sua forma
nativa como também sua atividade biológica, atavés do processo de
desnaturação, separando a solução de proteína e os reagentes desnaturantes,
fazendo com que a solução proteica retorne as condições iniciais.
23
5. TITULAÇÃO DE AMINOÁCIDO
5.1 INTRODUÇÃO
Um aminoácido é uma molécula orgânica formada por átomos de
carbono, hidrogênio, oxigênio, e nitrogênio unidos entre si de maneira
característica. Os aminoácidos são divididos em quatro partes: o grupo amina
(NH2), grupo carboxílico (COOH), hidrogênio, carbono alfa (todas essas partes
se ligam a ele), e um radical característico de cada aminoácido. Os
aminoácidos se unem através de ligações peptídicas, formando as proteínas.
Para que as células possam produzir suas proteínas, elas precisam de
aminoácidos, que podem ser obtidos a partir da alimentação ou serem
fabricados pelo próprio organismo.
Uma solução tampão, solução tamponada ou simplesmente tampão é
aquela solução capaz de manter aproximadamente constante o valor do seu
pH quando é adicionado à ela um ácido ou base ou quando uma diluição
ocorre, através da doação de prótons, e os aminoácidos possuem esta função
tampão.
“As enzimas que catalisam as reações celulares e muitas das
moléculas sobre as quais elas agempossuem grupos ionizáveis com
valores de pKa característicos. Os grupos aminoprotonados ( - NH3) e
os grupos carboxila dos aminoácidos e os grupos fosfatos dos
nucleotídeos, por exemplo, funcionam como ácidos fracos;[...] A
constância do pH é conseguida primariamente através da existência
de tampóes biológicos: estes são misturas de ácidosfracos e suas
bases conjugadas”
(LEHNINGER, NELSON, COX, 1995, pg. 71)
24
A titulação é simplesmente a adição ou remoção gradual de prótons de
uma determinada substância e nesta aula prática foi utilizado este
procedimento com o objetivo de mudar o pH da solução de glicina com o intuito
de observar as curvas de titulação da glicina, através da perda de prótons do
grupo carboxílico (COOH), como relatam Lehninger, Nelson e Cox (1995) onde
cada molécula de base que é adicionada na solução de glicina, resulta na
perda de um próton deste aminoácido.
5.2 MATERIAIS E MÉTODOS
Para a execução do referido procedimento foram utilizados os seguintes
materiais:
a) aminoácido: glicina
b) solução reagente: NaOH
c) materiais laboratoriais: bureta, béquer, pHmetro e pipeta.
O método utilizado através desta atividade prática foi pipetar 10 ml de
solução de glicina em um béquer e medir seu pH e anotá-lo e logo após, por
intermédio da bureta, acrescentar 0,5 ml de solução de NaOH e aferir o pH e
novamente e anotá-lo, repetindo o procedimento quantas vezes fossem
necessáiro, com fins de acompanhar a mudança de pH e observar a curva de
titulação da solução de glicina e poder aferir sua constante de dissociação (pK)
e assim poder calcular o ponto isoelétrico (pI) da solução.
Devido a glicina apresentar função de tampão, ou seja, possuir um grupo
ácido capaz de doar prótons quando em contato com a base, que no nosso
caso foi o NaOH, fez com que o processo se extendesse por um tempo maior.
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÕES
25
pK1 = 2.17 pI = 9,99 pK2 = 12,17
Como podemos observar, na literatura o pK1 da glicina é 2,3 enquanto
que o pK2 é 9,6 , no entanto na nossa atividade os pKs não foram exatos com
os da literatura. Isso pode ocorrer por que a glicina possui dois grupos
ionizáveis com capacidade tamponante: -COOH/-COO- em pH ácido e -NH3+/-
NH2 em pH alcalino e duas zonas de tamponamento entre os pHs 1,3 e 3,3
(dependente do grupo carboxila) e entre os pHs 8,6 e 10,6 (dependente do
grupamento amino).
5.4 CONCLUSÃO
Através da experiência realizada foi possível concluirmos que
dependendo do meio em que se encontram, os aminoácidos podem receber ou
doar elétrons atuando assim como ácidos (na forma protonado, podendo doar
prótons), neutros (com a forma protonada e a forma receptora de prótons em
equilíbrio) e base (base conjugada do ácido correspondente, ou seja, perdeu
prótons e agora é receptora deles).
26
6.ENZIMAS – Amilase e Invertase
6.1 INTRODUÇÃO
Enzimas são proteínas, estimulam reações químicas essenciais para a
vida. Catalisam centenas de reações que ocorrem no metabolismo, sendo a
catalise essencial para o funcionamento dos organismos em tempo apropriado.
Sem catalise as reações químicas necessárias para digerir alimentos,
contração de músculos ou enviar impulsos nervosos não ocorreria em
velocidade util. A sua principal característica é a especialidade com o substrato,
cada substrato possui uma enzima especifica, que associados se encaixam
como “chave e fechadura”.
“A maioria das enzimas são proteínas, com exceção de um
pequeno grupo de moléculas de RNA com propriedades catalíticas,
todas as enzimas são proteínas. A sua atividade catalítica depende
da integridade da sua conformação protéica nativa. Essa atividade
catalítica geralmente se perde caso uma enzima seja desnaturada ou
dissociada em subunidades. Assim as estruturas preoteicas primaria,
secundaria, terciária e quaternária das enzimas são essenciais para o
exercício da atividade catalítica.”
(LEHNINGER, NELSON, COX, 1995, pg. 99)
Na aula pratica de enzimas, amilase salivar, o principal objetivo era
observar através dos experimentos, as reações e resultados verificando a
presença de açúcar redutor e amido.
6.2 MATERIAIS E MÉTODOS
Neste experimento, Especificidade Enzimática, utilizamos os seguintes
materiais:Materiais laboratoriais: Tubos de ensaio, proveta, pipetas, béquer,
cálice, funil, tela de amianto, gase e bico de bunsen.
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Soluções: 2 ml de saliva (alunos), invertase, sacarose, amido, maltoses,
glicose e frutose.
a) Reagentes: reagente Benedict e reagente Lugol.
Iniciando o experimento, 2ml de saliva foi diluída na porção de 1:10.
Após, em quatro tubos de ensaio, identificados em tudo A, B, C e D, foram
adicionados as seguintes soluções:
I. 2ml de Invertase + 2ml de Sacarose 0,1M;
II. 2ml de Invertase + 2ml de Amido 0,1%
III. 2ml de Amilase Salivar + 2ml de Sacarose 0,1M
IV. 2ml de Amilase Salivar + 2ml de Amido 0,1%
Em seguida, 15 minutos de incubação a 40 OC, foi dividido o volume dos
tubos B e D em duas porções: B1/B2 e D1/D2. Verificou-se a presença de
Amido nas amostras B1 e D1 usando 3 gotas de Lugol, após resfriamento.
Entao verificamos a presença de Acucar Redutor nas amostras B2, D2, A e C,
adicionando 1ml de reagente Benedict aquecimento.
6.3RESULTADOS E DISCUSSÕES
ENZIMA SUBSTRATO PRODUTORES Reação
A Invertase Sacarose Gli/Fru (Benedict) (Positivo) Telha
B1 Invertase Amido (Lugol) (Negativo) Turvo
B2 Invertase Amido (Benedict) (Negativo)
C Amilase Sacarose (Benedict) (Negativo) Azul
D1 Amilase Amido Maltoses (Lugol) (Negativo)
D2 Amilase Amido Maltoses (Negativo)
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(Benedict) Diferente
Azul é positivo para o reagente Lugol e Telha é positivo para o reagente
Benedict. Com o reagente Lugol verifica-se a presença de Amido e com
reagente Benedict presença de açúcar redutor.
No tubo A, observamos os seguintes resultados: a Invertase (Enzima)
quebra a Sacarose (Substrato) e forma o produto, açúcar redutor, adicionando
Benedict, observamos a presença de açúcares. Invertase + Sacarose = Glicose
+ Frutose. Resultado positivo, cor telha.
No tubo B1, Invertase não hidrolisa amido, usando Lugol, foi detectado a
presença de Amido. Invertase + Amido = Amido. Resultado positivo, turvo.
No tubo B2, Invertase e Amido com reagente Benedict, o Amido não se
transformou em açúcar redutor. Invertase + Amido = Amido. Resultado
negativo, sem a presença de amido.
No tubo C, Amilase e Sacarose com reagente Benedict, a amilase
salivar não hidrolisa a Sacarose, desta forma não ocorreu a quebra da
Sacarose em açúcar redutor. Amilase + Sacarose = Sacarose. Resultado
negativo, cor azul.
No tubo D1, Amilase e Amido com reagente Lugol, formação do produto
Maltose, a amilase salivar quebrou o amido, e não foi identificada a presença
do amido. Amilase + Amido = Maltose. Resultado negativo.
No tubo D2, Amilase e amido com o reagente Benedict, formando
maltose como produto, o resultado esperado seria negativo, pois o amido não
se transforma em açúcar redutor. Porem em nossa solução, o resultado obtido
foi diferente do esperado, positivo, não degradou todo o amido. Podem ter
ocorrido diversos fatores que influenciaram no resultado. O pH, agitação, pouco
amilase como já citado, pouca enzima ou desnaturação.
“A atividade enzimática é afetada pelo valor do Ph. As
enzimas tem um pH ótimo ou uma região de pH ótimo no qual sua
29
atividade é máxima; em valores de pH maiores ou menores sua
atividade diminui.”
(LEHNINGER, NELSON, COX, 1995, pg. 163)
Apesar de a amilase salivar degradar amido em maltoses (fato
observado no teste de Lugol) a quantidade de maltoses produzidas, não foi
capaz de efetuar um resultado negativo com Benedict.
A especificidade enzimática é uma característica importante, cada
enzima atua e se encaixa no substrato de modo que os centros ativos
coincidem perfeitamente.
“ Especificidade é a habilidade da enzima, de discriminar
entre dois substratos competidores. Se o sitio ativo de uma enzima
tem grupos funcionais arranjados de forma ótima para formar uma
variedade de interações fracas com um dado substrato no estado de
transição, a enzima não seria capaz de interagir tão bem com
qualquer outro substrato.
(LEHNINGER, NELSON, COX , 1995, pg. 153)
6.4CONCLUSÃO
Com os experimentos realizados nesta aula pratica, observamos as
reações e seus resultados, onde a Amilase degrada o amido em maltose, a
invertase degrada a sacarose em açúcar redutor.
Ao colocarmos a amilase em contato com a sacarose e a invertase em
contato com o amido elas não foram degradadas, ou seja, a enzima não era
especifica sobre o substrato. As reações que o resultado foi positivo, as
enzimas atuaram com o substrato.
Em um caso especifico no tubo D2 obtivemos um resultado diferente do
esperado, que era positivo. Há diversos fatores que poderiam ter influenciado
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na reação como o pH, agitação, pouca amilase, pouca enzima ou
desnaturação.
Referências
Lehninger, A.L.; Nelson, D. L.; Cox, M. M. Princípios de bioquímica.
São Paulo: Sarvier, 1995.
Universidade Federal de Santa Catarina. Departamento de química. O
mundo das proteínas. Disponível em:
www.qmc.ufsc.br/qmcweb/artigos/proteínas.html . Acesso em 14/11/ 2011 as
14:30.
Universidade Estadual Paulista. Departamento de ciências
farmacêuticas. Experimentos de bioquímica. Disponível em:
http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/
precipitacao_proteinas.htm . Acesso em 14/11/2011 as 10:25.
http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/
const_microorg/carboidratos.htm.
http://intermed99.vilabol.uol.com.br/bioquimica2.html.
http://www.todabiologia.com/dicionario/lipidios.htm.
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