régulations post-transcriptionnelles de l'expression génétique au cours du développement...
TRANSCRIPT
Régulations post-transcriptionnelles de l'expressiongénétique au cours du développement
Luc PaillardCNRS UMR 6061Faculté de médecineUniversité Rennes 1
http://perso.univ-rennes1.fr/luc.paillard/ensgnmt/odonto080307.ppt
IntroductionPlace des régulations post-transcriptionnelles
Fonctions cellulaires
Activité des protéines
Activité "spécifique"(phosphorylations…)
Concentrations
Dégradation
Traduction
TraductibilitéConcentration d'ARNm
Dégradation des ARNm
Synthèse
Transcription Maturation
IntroductionMaturation des ARNm eucaryotes
ADN
ARN prémessagerTranscription
5' Ajout decoiffe (Cap)7mG-PPP-NExcision des introns
Epissage des exons
Exon 1 Exon 2 Exon 3
Intron 2Intron 1
Ajout d’une queue poly(A)à l’extrémité 3’
5'
Introduction Structure des ARNm eucaryotes
AAAA…AAA5' 3'
Coiffe (Cap)7mG-PPP-N
AUG STOP
Région 5'non codante
(5'UTR)
Région 3'non codante
(3'UTR)Phase codanteQueue poly(A)
Après l’épissage des exons!
3. Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codants
1. Epissages différentiels et développement
2. Traduction, stabilité et état d’adénylation
1. Epissages différentiels et développement
Exon 1 Exon 2 Exon 35'
Exon 3’ Exon 4
Exons alternatifs
Situation 1
Situation 2
1. Epissages différentiels et développement
Exon 1 Exon 2 Exon 35'
Exon 3’ Exon 4
Exon 1 Exon 2 Exon 35'
Exon 4
Saut d’exon
Et beaucoup d’autres possibilités…
Situation 1
Situation 2
Situation 1
Situation 2
Exons alternatifs
1. Epissages différentiels et développementL’exemple de la différenciation sexuelle chez la drosophile
Gène sex-lethal : transcription sous le contrôle de facteurs de transcriptionactiviteurs et inhibiteurs
Activateurs produits par le chromosome XInhibiteurs produits par des autosomes
Femelles XX : activateurs>inhibiteurs Synthèse sxlMale XY activateurs<inhibiteurs Pas de synthèse sxl
(Pas de compensation de dosage…)
1. Epissages différentiels et développementL’exemple de la différenciation sexuelle chez la drosophile
La protéine sxl contrôle l’épissage alternatif de transformer
Femelle : sxl
sxl
STOP
Protéine tra active
STOP
Male : pas de sxl
Protéine tra tronquée : inactive
1. Epissages différentiels et développementL’exemple de la différenciation sexuelle chez la drosophile
La protéine tra contrôle l’épissage alternatif de doublesex
Femelle : tra actif
tra
Male : tra inactif
Protéine dsx a un exon en plus chez la femelle que chez le male
Même activité de liaison à l’ADN,mais effets différents sur la transcription
Extrait (œufou embryon)
ARN
Northern blotFraction A-
Fraction A+
Oligo(dT)cellulose
Northern blot
Centrifugation surgradient de saccharose Polysomes
(traduit)
Monosomes(non traduit)
Northern blot
Northern blot
2. Traduction, stabilité et état d’adénylationL’exemple du développement précoce du xénope
Northern blot
1. Electrophorèse des ARN
Gel d'agarose
2. Transfert sur membrane
Membrane de nylon
3. Hybridation avec une sonde radioactivecomplémentaire d'un ARN
Sonde radiomarquéehybridée
4. Autoradiographie
Le film photo estimpressionné
par la radioactivité
Etat d'adénylation et traduction
Paris et Philippe (1990) Dev Biol 140, 221
Corrélation état A+ et traduction, état A- et absence de traduction
Stimulationtraductionnelle
Répressiontraductionnelle
Stable
Traduit Non traduit
Instable en général
Stable chez le xénope jusqu ’à la MBT
Polyadénylation
Désadénylation
AA..AACADRE DE LECTURE5 ’ 3 ’ CADRE DE LECTURE5 ’ 3 ’
Les variations de longueur de la queue poly(A)régulent l'expression génétique
Recherche d'éléments contrôlant lapolyadénylation cytoplasmique (1)
Certains ARNm sont polyadénylés pendant lamaturation ovocytaire
Mais qu’est-ce que la maturation ovocytaire?-Méiose (PI à MII)
- Pas de transcription- Peut être faite in vitro (progestérone)
Recherche d'éléments contrôlant lapolyadénylation cytoplasmique (2)
Alignement des séquences d'ARNmpolyadénylés pendant la
maturation ovocytaire
McGrew et al. (1989) Genes Dev 3, 803
Recherche d'éléments contrôlant lapolyadénylation cytoplasmique (3)
Test de la séquence : principe
A0
A+
t0 t1
A0
A+
t0 t1
ARN polyadénylépendant l'incubation
ARN non polyadénylépendant l'incubation
Injection d'ARN synthétisés in vitro, radiomarqués, contenantou non la séquence à tester
Extraction des ARN après incubation (en présence ou non de Pg)Électrophorèse, autoradiographie
Recherche d'éléments contrôlant lapolyadénylation cytoplasmique (4)
Test de la séquence : Résultats
McGrew et al. (1989) Genes Dev 3, 803
Une séquence non spécifique (AAUAAA)et une séquence spécifique sontnécessaires à la polyadénylation
cytoplasmique
La séquence spécifique a été appeléeCPE (Cytoplasmic Polyadenylation Element)
Régulation de la polyadénylationdépendante du CPE
Identification de la CPEB (CPE Binding protein)
Modèle : - Le CPE lie la CPEB- La CPEB provoque la polyadénylationdes ARNm auxquels elle est liée
Pourtant : - La CPEB est présente dès le débutde l'ovogenèse...
Régulation de l'activité de la CPEB
B. Pendant la maturation ovocytaire
Progesterone
CPEB
CPEBP
CPE AAA…AAA 3'
+
5'
Eg2 protein
Traduction
A. Dans l'ovocyte non maturé
CPEB
CPE 3'5' Pas de traduction
Fonction de la polyadénylation contrôlée par la CPEB
L’injection d’anticorps anti CPEB bloque la maturation ovocytaireIdentification de certains ARNm dont la polyadénylation
est nécessaire à la maturation (c-mos…)
Mais ce n’est pas tout!
Souris dont le gène CPEB est inactivé…
Fonction dans le fonctionnement neuronal
Et les désadénylations?
Contrôles aberrants de l’état d’adénylationdes ARNm et pathologies humaines
Exemple 1
L'ARNm -globine est très stable pendant la différenciation érythrocytaire
Cette stabilité lui est conférée par un élément de séquence dans la 3'UTR
Cet élément maintient une queue poly(A) longue sur l'ARNm -globine
Une forme de thalassémie est liée àl'inactivation de cet élément
Exemple 2
Les ARNm des cytokines ou proto-oncogènes sont souvent très instables
Cette instabilité leur est conférée par un élément de désadénylation dans la 3'UTR
L'inactivation de cet élément conduit à la surexpression de la protéine codée
Cette surexpression peut être associéeà une transformation cellulaire
Contrôles aberrants de l’état d’adénylationdes ARNm et pathologies humaines
3. Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codantsUne histoire récente…
Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519
miRNA RNAiPrix Nobel oct 2006
(C Mello, A Fire) siRNA
Et alors?
3. Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codantsUne histoire récente…
Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519
Mécanismes biochimiques
Biosynthèse des miRNA
Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519Reconnaissance d’un ARN
double brin par Argonaute!
Fonction des miRNA
L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNmcible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN
1. Hybridation imparfaite sur les 22 nt :
Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519
Conséquence : inhibition de latraduction de l’ARNm cible
Voie miRNA « classique » chez l’animal
Fonction des miRNA
L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNmcible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN
2. Hybridation sur la totalité des 22 nt :
Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519
Conséquence : dégradationde l’ARNm cible
Voie miRNA « classique » chez la plante
Fonction des miRNA
L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNmcible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN
2. Hybridation sur la totalité des 22 nt :
Conséquence : dégradation de l’ARNm cible
Voie miRNA « classique » chez la plante…
… Mais si l’on apporte un ARN double brin parfaitementcomplémentaire d’un ARNm cible chez l’animal, cela provoque
sa dégradation… voie « siRNA » chez l’animal
Reprenons…
miRNA : ARN double brin (2*22nt) codé par le génomede la cellule (sous forme d’un précurseur qui est maturé)
Environ 250 chez l’humain
S’apparie imparfaitement à un ARN cible et inhibe satraduction (animal), ou s’apparie parfaitement et provoque
sa dégradation (plante) (Il y a des exceptions…)
En général, un miRNA s’apparie aux 3’UTR d’un ou plusieurs ARNm
siRNA : ARN double brin (2*22nt) apporté par l’expérimentateurdans une cellule animale
S’apparie parfaitement à un ARNm cible et provoque sa dégradation
Utilisation des siRNA
L’expression d’un ARN double brin (2*22nt) dans une celluleanimale provoque la dégradation des ARNm dont la séquence
est parfaitement identique à celle de l’un des deux brins
Applications en recherche…
… Et en médecine?
Régulations post-transcriptionnelles parles miRNA et développement
L’exemple de Caenorhabditis elegans
La vulve de Caenorhabditis elegans
*
proximité de la vulve.
Formation de la vulve
*
proximité de la vulve.
P6.p se divise en cellules qui sedifférencieront en cellules centrales
de la vulve
P5.p et P7.p se divisent en cellules qui sedifférencieront en cellules latérales
de la vulve
Rôle de AC (induction)
Les inductions dans la formation de la vulve
Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330
Première induction(voie EGF)
Deuxième induction(voie Notch)
« Marqueurs » de destinée cellulaire
La GFP “marque” les cellules P5.p et P7.p, mais pas P6.p
Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330
Contrôle
Le miRNA mir-61 est présent dans P5.p et P7.p, mais pas P6.p
… Sauf si on exprime le miRNA mir-61 dans P6.p
Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330
Contrôle
Expression de mir-61dans P6.p
… Sauf si on fait s’exprimer le miRNA mir-61 dans P6.p
Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330
Contrôle
Expression de mir-61dans P6.p
mir-61 exprimé dans P6.p « fait devenir » P6.p comme P5.p et P7.p
Recherche d’un ARNm cible de mir-61
Fonction de la protéine codée par cet ARNm :faire « devenir une cellule comme P6.p »
Dans l’embryon normal : mir-61 est présent dans P5.p et P7.pIl empêche l’expression de cet ARN dans P5.p et P7.p
P5.p et P7.p deviennent « comme P5.p et P7.p »
Si on exprime mir-61 dans P6.pIl empêche l’expression de cet ARNm dans P6.p aussi
P6.p devient « comme P5.p et P7.p »
ARNm codant la protéine vav-1
Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330
D’où la fonction d’un miRNA dansla mise en place de la vulve…
… Implication dans d’autres processus de développementchez C. elegans
Le cycle de C. elegans
Alvarez-Garcia et Mlska 2005 Development 132, 4653
Les mutants hétérochrones chez C. elegans
Alvarez-Garcia et Mlska 2005 Development 132, 4653
Rôle de miRNA dans la coordination d’évènementsde développement chez C. elegans
miRNA et pathologies humaines (1)
Mutation dans la 3’UTR de SLITRK1, au niveau du site de reconnaissance de miR-189
Perte de la répression traductionnelle de SLITRK1 : surexpression de la protéine SLITRK1
Responsable de la maladie?
miRNA et pathologies humaines (2)
miRNA et pathologies humaines (3)