regulation de l’ampkinase fabrizio andreelli chu bichat et inserm u 695
DESCRIPTION
REGULATION DE l’AMPkinase Fabrizio Andreelli CHU Bichat et INSERM U 695. L’énergie…c’est la vie !!. Lipolyse (à jeun). Lipogenèse (nourri). TG alimentaires. AGL. TG. AGL + glycérol. Au moins deux phénomènes. Résistance à l’insuline. Altération de l’insulinosécrétion. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
REGULATION DE l’AMPkinaseREGULATION DE l’AMPkinase
Fabrizio AndreelliFabrizio Andreelli
CHU Bichat et INSERM U 695CHU Bichat et INSERM U 695
L’énergie…c’est la vie !!L’énergie…c’est la vie !!
Lipogenèse(nourri)
Lipolyse(à jeun)
TG alimentaires
AGL
TG
AGL + glycérol
Au moins deux phénomènes
Résistance à l’insuline Altération de l’insulinosécrétion
Un phénotype stéréotypé…
Production hépatique de glucoseStéatose hépatique
InsulinorésistanceLipolyse accrue
Insulinorésistance
AGLGlycérol
C.Tour de tailleC.Tour de taille
J Vague 1947
Lipotoxicité et TAV
TG
AGL
StéatoseMuscle
Cellule
AGLinsulinorésistance
insulinosécrétion
Nature 2006
Relations TAV et NASH
Greco AV et al. Diabetes 2002Greco AV et al. Diabetes 2002
Dépôts lipidiques extra-adipocytaires: muscle
NASH chez l’hommeNature 2006
Dépôts lipidiques extra-adipocytaires: foie
Jia MD et al, Diabetes 2000
Dépôts lipidiques extra-adipocytaires: beta cell
Rat OLEFT
Cancello R et al. Diabetes 2005
Miyazaki Y et al. AJP 2002
Syndrome métabolique
Tour de taille mesuréTour de taille mesuré
En position debout et en expiration douceEn position debout et en expiration douce
A mi-hauteur entreA mi-hauteur entre
rebord costal inférieurrebord costal inférieur crête iliaquecrête iliaque
d’après Lean (1995)d’après Lean (1995)
Risque élevéRisque élevéRisqueRisque
102 cm102 cm 94 cm94 cmHommeHomme
88 cm88 cm 80 cm80 cmFemme Femme
Obésité - répartitionObésité - répartition
Conséquences du syndrome métabolique
Insulinorésistance Diabète de type 2Sd métabolique
Risque cardio-vasculaire
Intra-abdominal adiposity and glucose metabolism
Pouliot et al 1992
IAA: intra-abdominal adipositySignificantly different from 1non-obese, 2obese with low intra-abdominal adiposity levels
Time (min) Time (min)
1
1
11
11,2
11
1mm
ol/
L
0
3
6
9
12
15
0 60 120 180
1,2
0
400
800
1200
1,2
1,2
1,2 1,2
1,21,2
1,2
1,2
1
Are
a
1,2
Are
a
0 60 120 180
pm
ol/
L
InsulinGlucose
Non-obese Obese low IAA Obese high IAA
AGL
Tissu adipeuxabdominal
AMPKinaseChangements métaboliques
Effets enzymatiques
Effets géniques
Environnement hormonal
regulatory SU
regulatory SU
catalytic SU
Structure de l'AMP-kinaseStructure de l'AMP-kinase
1, 1, 22
1, 1, 2, 2, 33
N488I R531GT400NH383RR302Q
R225Q mutation 3
mutations 2
1, 1, 22
AMPK
Catalytic domain binding
N C
N C
N C
bindingGlycogen binding
AMP/ATP binding
CBS1 CBS2
AMPK kinase
CBS3 CBS4
Thr172
Catalyticsubunit
Regulatorysubunit
Structure of AMP-activated protein kinaseStructure of AMP-activated protein kinase
LKB1CaMKK
AMP is signal of energy depletionAMP is signal of energy depletion
fatty acid oxidation
fatty acid synthesis
ATPAdenylate kinase
ADP ATP
physical exercise
• ischemia• hypoxia
AMP
AMP
AMP
AMP
AMP
ATP
ADP
LKB1LKB1CaMKKCaMKK
Pi
H2O
PhosphatasesPhosphatases
AMP
AMP
AMP
AMPKAMPK
ATP
ATP-generation
ADP
ADP
ATP-consuming
= -AMPK
Regulation of AMP-activated protein kinaseRegulation of AMP-activated protein kinase• glucose deprivation• metabolic poisons AMP/ATPAMP/ATP
Regulation of AMP-activated protein kinaseRegulation of AMP-activated protein kinase
CBS4
T172
CBS4
AMPKK
AMPAMP: Catalytic subunit
: Scaffold/glycogen-binding
: Regulatory (AMP-binding)
AMPAMP ATP ATP
P
LKB1
CaMKKinactiveAMPK
activeAMPK
InsulineInsulinePP
IRS-1IRS-1
PI-3 kinase
GlucoseGlucose GlucoseGlucose
Glut4Glut4
Ox
Stockage
AMPK+
AICAR
Bergeron R et al. AJP 1999
Bergeron R et al. Diabetes 2001
Le traitement de rongeur par AICARLe traitement de rongeur par AICAR
-augmente la captation intramusculaire de glucose même-augmente la captation intramusculaire de glucose mêmeen présence d’une insulinorésistanceen présence d’une insulinorésistance
*rongeur sain*rongeur sain*rongeur obèse*rongeur obèse
Winder WW. J Appl Physiol 2001
Mu J et al. Mol Cell 2001
Mu J et al. Mol Cell 2001
Mu J et al. 2003
La réduction spécifique de l’activité de l’AMPK dans les muscles
-s’associe à une diminution de la captation de glucose contraction dépendante
-réduit la synthèse de glycogène
-altère sa re-synthèse post-exercice physique
-n’altère pas la signalisation de l’insuline musculaire
-n’altère pas la sensibilité à l’insuline in vivo ni la glycémie
Les mutations activatrices des sous-unités de l’AMPK
entraînent une accumulation de glycogène intramusculaire
(muscle squelettique 3 et cœur 2) et participent à la physiopathologie
des syndromes de pré-excitation cardiaque (WPW).
Arad M et al. Circulation 2003
L’activation de l’AMPK musculaire par la contraction ou l’AICARaugmente la synthèse de glycogène musculaire
Les mutations activatrices de l’AMPK dans le muscle ou le cœur provoquent l’accumulation de glycogène et favorisent des troubles deconduction
Le traitement de rongeur par AICARLe traitement de rongeur par AICAR
-augmente la captation intramusculaire de glucose-augmente la captation intramusculaire de glucose
-réduit la production hépatique de glucose et la stéatose hépatique-réduit la production hépatique de glucose et la stéatose hépatique
*rongeur sain*rongeur sain*rongeur obèse*rongeur obèse
Bergeron R et al. Diabetes 2001
Zhou G et al. J Clin Invest 2001
FFAFFA
Acyl-CoAAcyl-CoA
Malonyl-CoAMalonyl-CoA
Acétyl-CoAAcétyl-CoA
CPT-1
-Oxydation-Oxydation
Acétyl-CoAAcétyl-CoA
GlucoseGlucose
Glucose-6PGlucose-6P
PyruvatePyruvate
CitrateCitrateKrebsKrebs
FFAFFA
Acétyl-CoA carboxylaseAcétyl-CoA carboxylase(ACC)(ACC)
AMPKAMPK
MetformineMetformine
+
-
L’activation pharmacologique de l’AMPK L’activation pharmacologique de l’AMPK
-augmente la captation intramusculaire de glucose-augmente la captation intramusculaire de glucose
-réduit la production hépatique de glucose-réduit la production hépatique de glucose
-réduit la lipogenèse hépatique-réduit la lipogenèse hépatique
*rongeur sain*rongeur sain*rongeur obèse*rongeur obèse
Intérêt thérapeutique dans le diabète de type 2 !!
AMPK1-/-
AMPK2-/-
Phenotypic analysis of AMPK KO micePhenotypic analysis of AMPK KO mice
AMPKAMPK1-/- AMPK1-/- AMPK2-/- KO is embryonic lethal2-/- KO is embryonic lethal
LoxP LoxP
+ CRERecombinase
Activity in vitro
- without DNA replication- without topo activity- without cofactors
+
+ CRECRE = Recombinase from bactériophage P1Recombinase from bactériophage P1
LoxP = 34bp sequence34bp sequence
DNADNA
Cre-loxP Strategy
x
mice harbouring a complete inactivation of 2
CREEIIApromoter( zygote)
Total inactivation of 2 AMPK
muscleliver
+/+ -/- +/+ -/-
1 KO1 KO
+/+ -/- +/+ -/-
muscleliver
2 KO2 KO
AMPK1
AMPK2
Characterization of AMPK KO miceCharacterization of AMPK KO mice
2 wt
2 ko
+/- +/+ -/-+/- +/+
1 wt1 ko
-/-
AMPK1
AMPK2
Western blotWestern blot
Southern blotSouthern blot
Western blotWestern blot
Southern blotSouthern blot
Jorgensen, JBC2004Jorgensen, JBC2004 Viollet, JCI2003Viollet, JCI2003
E9.5 dpc
Control 1-/- 2-/-
Alive no morphological differences
E11.5 dpcDead morphological aspect
of E10.5
1 KO -> embryonic lethality around 10.5 dpc.
AMPK complexes play an essential role during embryonic development.
AMPK2-/- mice are not obeseAMPK2-/- mice are not obese
0
10
20
30
40
body
wei
ght
(g)
+/+ -/-
Body weight
0
2
4
6
8
%of
fat
mas
s
+/+ -/-
% of fat mass
Foo
d in
take
(g/
d))
+/+ -/-
Food intake
0
1
2
3
4
F Andreelli, J Clin Invest 2001
Glucose tolerance test in AMPK KO miceGlucose tolerance test in AMPK KO mice
time (min)
50
100
150
200
250
300
350
glu
cose
(m
g/dl
)
0 20 40 60 80 100 120
AMPKAMPK1-/-1-/-control
1 KO1 KO
100
120
140
160
180
200
220
0 20 40 60 80 100 120
time (min)
*
***
glu
cose
(m
g/d
l)
2 KO2 KOcontrol
AMPKAMPK2-/-2-/-
+/+ -/-0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0
0,1
0,2
0,3*
+/+ -/-
InsulinemiaInsulinemiaat 20min (ng:ml)at 20min (ng:ml)
InsulinemiaInsulinemiaat 20min (ng:ml)at 20min (ng:ml)
F Andreelli, J Clin Invest 2001
-20
0
20
40
60
80
100
120
Glucose TO HGP Glycolysis Gln Synthesis
controlAMPK2 -/-
****
****
Metabolic parameters during euglycemic hyperinsulinemic clamp in AMPK2-/- mice
Metabolic parameters during euglycemic hyperinsulinemic clamp in AMPK2-/- mice
F Andreelli, J Clin Invest 2001
controlAMPK2-/-
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Gln synthesis
****
0
0,25
0,5
Total Gln content
**
Muscle glycogen during clamp in AMPK2-/- miceMuscle glycogen during clamp in AMPK2-/- mice
F Andreelli, J Clin Invest 2001
100
120
140
160
180
200
220
0 20 40 60 80 100 120 time (min)
*
***
glu
cose
(m
g/d
l)
controlAMPKAMPK2-/-2-/-
0
0,1
0,2
0,3*
+/+-/-
InsulinemiaInsulinemiaat 20min (ng:ml)at 20min (ng:ml)
-20
0
20
40
60
80
100
120
Glucose TO HGP Glycolysis Gln Synthesis
controlAMPK2 -/-
****
****
Metabolic parameters during euglycemichyperinsulinemic clamp in AMPK2-/- mice
Metabolic parameters during euglycemichyperinsulinemic clamp in AMPK2-/- mice
F Andreelli, J Clin Invest 2001
controlAMPK2-/-
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Gln synthesis
****
0
0,25
0,5
Total Gln content
**
Muscle glycogen during clamp in AMPK2-/- miceMuscle glycogen during clamp in AMPK2-/- mice
F Andreelli, J Clin Invest 2001
F Andreelli, J Clin Invest 2001
In vitro glucose transport in AMPK2-/- muscleIn vitro glucose transport in AMPK2-/- muscleD
eoxy
gluc
ose
tran
spor
t (µ
mol
/g/h
)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
basal insulin+/+
SoleusSoleus
0
0,5
1
1,5
EDLEDL
basal insulin-/-
Deo
xygl
ucos
e tr
ansp
ort
(µm
ol/g
/h)
+/+ -/- +/+ -/- +/+ -/-
F Andreelli, J Clin Invest 2001
Insulin content per islet is similar: 67.2 16.2 ng/islet (AMPK2-/-) versus 63.9 16.5 ng/islet (control)
In vitro glucose-stimulated insulin secretionIn vitro glucose-stimulated insulin secretion
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
insu
lin
rele
ase
as %
con
tent
0 15 30 45 60 75 90 105 120
Time (min)
7.5 10 20 10
L-Arg
3 3 3 3 3 mM glucose
AMPK2-/-
control
F Andreelli, J Clin Invest 2001
AMPK2-/- mice do not present:- hypokaliemia- hyperleptinemia- increased TG content in pancreas
Why are AMPK2-/- mice insulinopenic? Why are AMPK2-/- mice insulinopenic?
modification of sympathetic and parasympathetic balance activity?
Urinary catecholamine levels in AMPK2-/- miceUrinary catecholamine levels in AMPK2-/- mice
0
10
20
30
40
50
**
urin
ary
epin
ephr
ine
(ng/
d)
0
10
20
30
40
50*
urin
ary
dopa
min
e (n
g/d)
0
500
1000
1500
2000
2500
**
uri n
ary
nore
p ine
phri
ne
(µg/
d)
epinephrineepinephrine norepinephrinenorepinephrinedopaminedopamine
+/+ -/- +/+ -/-+/+ -/-
F Andreelli, J Clin Invest 2001
-adrenergic antagonist treatment of AMPK2-/-mice-adrenergic antagonist treatment of AMPK2-/-mice
Glucose tolerance testGlucose tolerance testGlucose tolerance testGlucose tolerance test
0
50
100
150
200
250
300
0 20 40 60
Time (min)
0
50
100
150
200
250
300
0 20 40 60
Time (min)
***
**
% o
f ba
sal g
luco
se
% o
f ba
sal g
luco
se
saline phentolaminecontrol
saline phentolamineAMPK2-/-
F Andreelli, J Clin Invest 2001
use of AMPK-DN mice expressing a dominant use of AMPK-DN mice expressing a dominant inhibitory mutant of AMPK in skeletal muscle.inhibitory mutant of AMPK in skeletal muscle.
(Mu et al., 2001)(Mu et al., 2001)
Is impaired glycogen synthesis linked to the lack of AMPK activity in skeletal muscle?
Is impaired glycogen synthesis linked to the lack of AMPK activity in skeletal muscle?
creatine kinase promoter AMPK-DN
Glucose tolerance testGlucose tolerance test
0
100
200
300
400
500
-30 0 30 90time (min)
Glucose tolerance in AMPK-DN miceGlucose tolerance in AMPK-DN mice
60
AMPK-DN
seru
m g
luco
se (
mg/
dl)
control
Alpha 2-AMPK KO mice are insulin resistant--> In vivo insulin stimulated glycogen synthesis is reduced
AMPK DNmuscle
+-
Glycogen synthesis rateng/min.mg
Control
+0
Insulin
100
50
-AMPK KOAlpha 2
+-
*
Insulin resistance is not due to lack of muscle AMPK
Altered regulation of metabolism in AMPK2-/- miceAltered regulation of metabolism in AMPK2-/- mice
glucoseinsulin
high sympathetic tonehigh sympathetic tone
glycogen synthesisglycogen synthesis
catecholaminecatecholamine
insulininsulin
F Andreelli, J Clin Invest 2001
Rôle essentiel de la sous-unité alpha 2 dans les actions métaboliques de
l’AMPK.
AMPK2-/- mice exhibit increased body weight
• Increased body weight in AMPK2-/- with no changes in food intake
Diabetes 2004
Increased adipose tissue mass in AMPK2-/- mice
• a 40% increase in total fat pad mass weight of AMPK2-/- mice
Diabetes 2004
Diabetes 2004Diabetes 2004
La délétion de la sous-unité alpha 2 de l’AMPK dans tous les tissus altère la sensibilité à l’insuline et prédispose
à l’obésité.
Intérêt en génétique humaine ?
Quid de l’effet tissu-spécifique de l’AMPK ?
KO alpha 2 spécifique du foie
Liver 2 KOAMPK1
AMPK2
WT liver 2
CREAlbuminpromoter
2flox x
Liver 2 KO
wt
deleted
floxed
fl/f
l; c
re-
l
iver
+/+
; cre
+
liv
er
fl/f
l; c
re+
l
iver
fl/f
l; c
re+
p
ancr
eas
fl/f
l; c
re+
h
ypot
hala
mus
fl/f
l; c
re+
a
dipo
se ti
ssue
fl/f
l; c
re+
m
uscl
e
fl/f
l; c
re+
l
iver
Andreelli F et al, Endocrinology 2006
Liver 2 KO viablefertile
AMPK1
AMPK2
WT Liver 2
CREAlbuminpromoter
2flox x
Liver 2 KO
liver
F Andreelli, Endocrinology, soumis
Insulinemia t40
0
0,2
0,4
0,6
0,8
ng/ml
2A2B
Control
Liver2KO
0
100
200
300
400
0 20 40 60Time (min)
glu
cose
(m
g/dl
)
*
***
**
F Andreelli, Endocrinology, soumis
3A
Control
Liver2KO
basal clamp
0
20
40
60
80
EGP EGP GlucoseTurnover
mg/
kg/m
in
*
3B
p-Akt
PB
S
INS
INS
INS
PB
S
INS
INS
INS
Control Liver2KO
total Akt
F Andreelli, Endocrinology, soumisPEPCK
0
2
4
6
8
10
G6Pase
5
*
Enz
ymat
icac
tivi
ty(U
/ g t
issu
e) 12
14
*
Control
Liver2KO
16
F Andreelli, Endocrinology, soumisAndreelli F et al, Endocrinology 2006 Andreelli F et al, Endocrinology 2006
Andreelli F et al, Endocrinology 2006Andreelli F et al, Endocrinology 2006
Régulation hormonale de la PHG
Insuline
Adiponectine
Leptine
Néoglucogenèse
-
-
Table adiponectine
Andreelli F et al, Endocrinology 2006
Pas de conséquence sur la signalisation de l’insulinePerte du contrôle de la PHG par la leptine et l’adiponectine
AMPKalpha 2AMPKalpha 2
LeptineLeptineAdiponectineAdiponectine
+
Néoglucogenèse
Insuline
Surexpression de l’AMPkinase
Adenovirusinjection1.109 pfu
Sacrifice48h infection
Expression of AMPK2-CA by in vivo adenovirus-mediated gene transfer in mice
Expression of AMPK2-CA by in vivo adenovirus-mediated gene transfer in mice
Adenovirus AMPK2-CA+
analysis of gene expression in fasted/refed conditions
effect on glycemia
Diabetes 2005
-> injection of adenovirus expressing constitutively active AMPK in control and diabetic mouse models
CA-AMPK
0
50
100
150
200
250
§§
Blo
od G
luco
se (
mg/
dl)
fasted glucosefasted glucose
§§
wt ob/ob
§
300
STZ
Rel
ativ
e m
RN
A L
evel
1.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
§§
§§
§
PEPCK mRNAPEPCK mRNA
wt ob/ob STZ
Liver AMPK targeting is sufficient to control glycemia in diabetic mice.
Ad -galAd CA-AMPK
Diabetes 2005
FFAFFA
Acyl-CoAAcyl-CoA
Malonyl-CoAMalonyl-CoA
Acétyl-CoAAcétyl-CoA
CPT-1
-Oxydation-Oxydation
Acétyl-CoAAcétyl-CoA
GlucoseGlucose
Glucose-6PGlucose-6P
PyruvatePyruvate
CitrateCitrateKrebsKrebs
FFAFFA
Acétyl-CoA carboxylaseAcétyl-CoA carboxylase(ACC)(ACC)
AMPKAMPK
LeptineLeptineAdiponectineAdiponectineMetformineMetformine
TZDsTZDs
+
-
Patti ME, Kahn BB. Nature Medicine 2004
Rôle essentiel de la sous-unité alpha 2 de l’AMPK dans les actions
métaboliques. Rôle de la SU alpha 1 ?
AMPK1 KO mice are anemicAMPK1 KO mice are anemic
0
2
4
6
8
10
12
RBC (106/ml)
***
+/+ -/-0
10
20
30
40
50
60
-/-+/+
Ht (%)
***
0
4
8
12
16
20
-/-+/+
Hb (g/dl)
***
0
4
8
12
16
20
Hb (g/dl)
+/+ -/-0
2
4
6
8
10
12
RBC (106/ml)
-/-+/+
1 KO1 KO
2 KO2 KO
0
10
20
30
40
50
60
-/-+/+
Ht (%)
0
200
400
600
800
1000
1200***
iron
(µ
g/g
)
+/+ -/-
Splenomegaly in AMPK1 KO miceSplenomegaly in AMPK1 KO mice
control AMPK1-/-
Expression of AMPK1 isoform in RBCExpression of AMPK1 isoform in RBC
AMPK1
AMPK2
control 1-/- 2-/-
Exclusive expression of AMPK1 isoform in RBC= specific role for AMPK1 in RBC integrity.
ATP utilization in RBC
Glucose phosphorylation
Phosphorylation of membrane proteins
Ionic pumps
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
ATP
*
ATP content in AMPK1 -/- RBCATP content in AMPK1 -/- RBC
+/+ -/-
brain
AMPKAMPK
Liver
muscle
heart red blood cells
adipose tissue
hepatic glucose productionhepatic glucose productionfatty acid metabolismfatty acid metabolism
cardiac ischemiacardiac ischemia
glucose transportglucose transportglycogen synthesisglycogen synthesis
lipolysislipolysis
food intakefood intakeinsulin sensitivityinsulin sensitivity
ion transportion transport
AMPK2 AMPK1
Institut Cochin, ParisInstitut Cochin, ParisInstitut Cochin, ParisInstitut Cochin, Paris
Viollet BenoitMarc Foretz
Myriam BennounClaire Cheret
Axel KahnSophie Vaulont
Copenhagen Muscle Copenhagen Muscle Research CenterResearch Center
Copenhagen Muscle Copenhagen Muscle Research CenterResearch Center
University of ToulouseUniversity of ToulouseUniversity of ToulouseUniversity of Toulouse
Christophe PerrinRémy Burcelin
Sebastian B. JørgensenJørgen F.P. Wojtaszewski
Erik A. Richter
Howard Hughes Howard Hughes Medical InstituteMedical Institute
Howard Hughes Howard Hughes Medical InstituteMedical Institute
Morris J. BirnbaumJames Mu
Les Thiazolidinediones
Moller DE et al, Int J Obes 2003 Wilson TM et al, Ann Rev Biochem 2001