regulacion de la plasticidad astrocitaria

5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA

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Departamento de Bioqumica y Biologa

Molecular

Unidad de Bioqumica, Facultad de Medicina

Regulacin de la plasticidad

astrocitaria por ibuprofeno y

FGF2

Mathieu Lichtenstein

TESIS DOCTORAL

Belleterra Junio 2011
http://inc.uab.cat/http://inc.uab.cat/


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Departamento de Bioqumica y Biologa

Molecular

Unidad de Bioqumica, Facultad de Medicina

Memoria de tesis doctoral presentada por Mathieu Lichtenstein para

optar al ttulo de doctor por la Universidad Autnoma de Barcelona.

Trabajo realizado en la Unidad de Bioqumica de la Facultad de

Medicina, del Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular

bajo la direccin de la Dra Elena Galea Rodrguez de Velasco.

Proyecto subvencionado por la Fundaci Marat de TV3 y Ministerio

de Ciencia e Innovacin

Bellaterra, 9 de Mayo de 2011

Doctorando Director de Tesis

Mathieu Lichtenstein Elena Galea
http://inc.uab.cat/http://inc.uab.cat/


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A mi madre, mis hermanos,

a Paco,

mis abuelos Marie et Robert, Jacqueline et Paul

y a todo el resto de la famila.


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NDICE

I. ndice......................................................................1

II. Abreviaturas ............................................................5

III. Resumen..................................................................7

IV. Introduccin ..........................................................11

1. Los astrocitos son un tipo celular altamente plstico ypolivalente1.1... Morfologa y tipos de astroci tos .........................................12

1.2 Fisiologa astrocitaria..........................................................13

Soporte neuronal

Gliotransmisin y participacin a

la sinapsis tripartita

Regulacin de los niveles sinpticos

de glutamatoAcoplamiento neurovascular

2. Participacin de los astrocitos en la neuroinflamacin2.1 Conceptos generales sobre la

inflamacin cerebral .............................................................19

2.2 Privilegio inmune del SNC......................................................19

2.3 La clulas gliales participan enla inmunidad innata del SNC ..............................................20

2.4 Los astrocitos en la inmunidad innata ..................................22

MCP1

ICAM1

COX2

2.5 Migracin astrocitaria.........................................................29

2.6... Rho-GTPasas .......................................................................31

1


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NDICE

3. FGF2 en la plasticidad astrocitaria3.1 Recpetores de FGF..................................................................34

3.2 Funciones generales de los FGF ...........................................36

3.3 FGF2 .........................................................................................38Descubr imiento y primeros trabajos

Estructura del FGF2

Secrecin del FGF2

3.4 FGF2 en el SNC........................................................................41

Control de la expresin de FGF2

Funciones de FGF2 en el SNC

3.5 Papel del FGF2 en la inflamacin cerebral ...........................48

4. Efecto protector de los antiinflamatorios no esteroideos sobre la

aparicin de la enfermedad de Alzheimer.

4.1 Etiologia y patologa de la enfermedad

de Alzheimer ...........................................................................50

4.2 Fases de la enfermedad de Alzheimer ..................................54

4.3 Tratamientos ............................................................................54

4.4 Efecto protector de los AINES sobre la AD

V. Objetivos...................................................................59

VI. Materiales y mtodos ...............................................61

1. Material biolgico

1.1 Cultivos primarios de astrocitos

1.2 Tratamiento farmacolgico de las clulas en cult ivo

1.3 Infecciones virales

2. Mtodos bioqumicos

2.1 PCR en tiempo real

2.2 Fraccionamiento subcelular

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NDICE

2.3 Western Blot

2.4 EMSA

2.5 ELISA para la deteccin de ICAM

2.6 ELISA para la deteccin de MCP2.7 G-LISA

3. Mtodos de biologa celular

3.1 Inmunofluorescencia

3.2 Ensayos de migracin

4. Mtodos estadsticos

VII. Resultados..............................................................71

1. Captulo 1: JNK/ERK/FAK mediate pro-migratory actions ofbasic fibroblast growth factor in astrocytes via MCP1 andCOX2 ............................................................................72

2. Captulo 2: Secretase-independent and RhoGTPase/PAK/ERK-dependent regulation of cytoskeleton dynamics inastrocytes by NSAIDs and derivatives. ...............................110

VIII. Discusin

1. Inflamacin cerebral como diana teraputica en enfermedadesneurodegenerativa........................................................141

2. Nuevo papel de las cascadas de quinasas en la sealizacininflamatoria...................................................................144

2.1 Sealizacin inflamtoria por FGF2

2.2 Regulacin de las kinasas PAK y ERK por los profenos

3. Nuevo papel de las RhoGTPasas en la sealizacininflamatoria...................................................................153

3.1 Dianas de los AINES en astrocitos

3.2 Nuevo papel de las RhoGTPasas en la sealizacin inflamatoria

3
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20930267http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20930267http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20930267http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20930267http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20930267http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20930267


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NDICE

4. Nuevo papel de la migracin en la respuestaInflamatoria...................................................................156

4.1 FGF2 promueve la migracin astrocitaria

4.2 Los profenos en la migracin astrocitaria

5. Conclusiones y valor teraputico ................................1655.1 FGF2

5.2 AINES

IX.Conclusiones .............................................................168

X. Otras publicaciones...................................................171

1. Staging anti-inflammatory therapy in Alzheimer's disease.

XI.Bibliografa .................................................................178

4
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21152343http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21152343


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ABREVIATURAS

AD Alzheimers disease

AINEs Anti-inflamatorios no esteroideos

APP Amyloid precursor protein

ATP Adenosina trifosfato

A Pptido -amiloide

BHE Barrera hemato-enceflica

cAMP AMP cclico

COX Ciclooxigenasa

CREB cAMP-response element binding

CSPG Chondroitin-sulfate proteoglycan

EAATs Excitatory aminoacid transporters

ELISA Enzyme-linked inmunoassay

ERK Extracelular response kinase

FAK Focal adhesion kinase

FGF Fibroblast growth factor

FGFR Fibroblast growth factor receptor

FRS2 Fibroblast growth factor receptor substrate

GLAST Glutamate/Aspartate transporter

GPCR G-coupled protein receptor

GTP Guanidina trifosfato

HSPG Heparan-sulfate proteoglycan

ICAM Intercelular adhesion molecule

IFN Interfern

IL Interleuquina

IP3 Inositol trifosfato

JNK c-Jun N-terminal kinase

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ABREVIATURAS

LPA cido lipofosfatdico

LPS Lipopolisacrido

MAPK Mitogen-activated protein kinase

MCP Monocyte chemoatractant protein

MS Multiple sclerosis

NF-kB Nuclear factor kB

PAK p21-activated kinase

PCR Polymerase chain reaction

PD Parkinsons disease

ROCK Rho kinase

SNC Sistema nervioso central

TNF Tumor necrosis factor

VCAM Vascular adhesion molecule

WB Western Blot

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Resumem


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RESUMEN

OBJETIVO GENERAL: Los astrocitos, el tipo celular ms abundante en el sistema

nervioso central (SNC) desempean un papel clave en la homeostasis, la

neurotransmisin y, como tema central en esta tesis, en la neuroinflamacin, es decir,

el conjunto de reacciones del cerebro al trauma, las infecciones virales o bacterianas,

o la neurodegeneracin. El astrocito es extremadamente plstico, respondiendo a un

amplio repertorio de estmulos fisiolgicos o insultos patolgicos con cambios

morfolgicos, migracin, o cambios funcionales por modificacin de su expresin

gnica. El objetivo de esta tesis ha sido estudiar la plasticidad astrocitaria en dos

paradigmas distintos relacionados con la neuroinflamacin. En el primer bloque hemos

estudiado el efecto de un factor trfico de especial importancia en el SNC, el Factor

Bsico de Fibroblastos, o FGF2, en la expresin de genes inflamatorios astrocitarios.

El FGF2 es un factor de crecimiento cuya expresin en el SNC adulto es muy alta,

localizada principalmente en astrocitos, y que se regula a la alza en condiciones

patolgicas como el Alzheimer- alrededor de la placas de amiloide- o el ictus. As

como las propiedades trficas del FGF2, y su papel en el desarrollo del cerebro, son

ampliamente conocidos, su papel en la respuesta inflamatoria est pobremente

caracterizado. En el segundo bloque hemos analizado la capacidad de frmacos anti-

inflamatorios no esteroideos (AINES) como el ibuprofeno y derivados (R-flurbiprofeno y

CHF5074) los cuales, segn estudios epidemiolgicos, reducen la aparicin de la

enfermedad de Alzheimer, de modular la dinmica del citoesqueleto de actina

astrocitario.METODOS/MODELOS: Modelo de inflamacin (LPS o scratch-wound en cultivos

primarios de astrocitos. Estudio expresion molculas: RTPCR, Western Blot,

inmunocitoqumica, ELISAS, GLISAS. Manipulacin mecanstica: inhibidores

farmacolgicos, sobreexpresin de protenas mutantes dominantes negativos o

constitutivamente activos.

RESULTADOS: En los cultivos primarios mostramos que FGF2 modula de una

manera bifsica la respuesta inflamatoria inducida por LPS aumentando en estados

iniciales la expresin de genes inflamatorios como el de la quimocina MCP1, mientras

que potencia su regulacin a la baja e inhibe la expresin de ICAM1 en estados ms

avanzados. Esta regulacin es dependiente de las vas de sealizacin de ERK, JNK

y FAK a travs de la activacin del receptor FGFR2 pero independiente del factor de

trasncripcin NF-kB. Mostramos tambin que el tratamiento de astrocitos con

ibuprofeno y derivados produce un rpido cambio morfolgico caracterizado por una

retraccin del soma y emisin de procesos dependiente de la modulacin de las

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RESUMEN

protenas Rho-GTPasas RhoA, Rac1 y cdc42 e independiente de las diana clsica de

los antiinflamatorios las ciclooxigenasas (COX2). Este fenotipo resulta en una

capacidad migratoria acelerada en el caso del ibuprofeno o inhibida en el caso del R-

Flurbiprofeno y CHF5074.

CONCLUSIONES: Los resultados expuestos en esta tesis demuestran el papel

inmunomodulador del FGF2 en la respuesta inflamatoria astrocitaria. Especulamos

que el carcter bifsico de la respuesta permite los efectos beneficiosos de la

inflamacin pero evitando su cronificacin. Adems mostramos que los profenos son

capaces de promover la aparicin de fenmenos plsticos en astrocitos a travs de la

modulacin de nuevas dianas como las Rho-GTPasas, abriendo nuevas perspectivas

en la terapia de enfermedades neurodegenerativas en las que los astrocitos estn

implicados.

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RESUMEN

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Introduccin


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INTRODUCCIN

1. Los astrocitos son un tipo celular altamente plstico y

polivalente.

1.1 Morfologa ytipos de astrocitos

Los astrocitos, representan un 90% del total de clulas del SNC (Sistema Nervioso

Central) y son una poblacin diversa, siendo su presencia ms abundante en reas

cerebrales determinadas como el hipocampo o el cerebelo (Norenberg, 1979). In vivo,

presentan una morfologa estrellada, extendiendo desde el soma numerosos procesos

que rodean a las neuronas vecinas y contactan con los microvasos cerebrales

(Nedergaard et al., 2003). Estos procesos, altamente ramificados, se caracterizan por

la presencia de la protena glial acdica fibrilar (GFAP) que se utiliza muy a menudo

como marcador de astrocitos. Poseen una morfologa altamente compleja y

heterognea, y cada uno de ellos ocupa compartimentos o territorios bien definidos

que apenas solapan con el de los astrocitos vecinos (Bushong et al., 2002;Wang and

Bordey, 2008), con los que est conectado a travs de canales tipo gap junction

formando un sincitio funcional (Konietzko and Muller, 1994). Las gap junctions,

formadas por protenas de la familia de las conexinas, son permeables a molculas

cargadas y permiten el flujo de sustratos energticos desde los vasos hasta las

neuronas que se hallan en el territorio de un astrocito (Simard et al., 2003)

Histricamente se ha dividido a los astrocitos en dos grupos atendiendo a su

morfologa y ubicacin. As, los astrocitos protoplasmticos, localizados en la materia

gris cerebral, presentan muchos procesos ramificados que contactan sinapsis y vasos

cerebrales (Frederickson and Silver, 1991), mientras que los astrocitos fibrosos se

localizan en la materia blanca y poseen menos procesos, ms largos y sin ramificar,

que contactan con los ndulos de Ranvier (Wang and Bordey, 2008). Esta clasificacin

puede considerarse actualmente simplista ya que dos astrocitos adyacentes y de

morfologa comparable pueden tener perfiles de expresin muy diferentes. Estudios deexpresin por microarrays demuestran que en realidad hay pocos genes que se

expresen especficamente en todos los astrocitos, y que se producen patrones de

expresin dependientes de la localizacin celular (Bachoo et al., 2004).

A grandes rasgos, los astrocitos presentan un soma relativamente pequeo de 7-9 m

desde donde extienden entre cinco a ocho procesos principales que se ramifican

uniformemente en pequeos apndices distribuidos uniformemente que se infiltran en

la intrincada red neuronal incluyendo terminales sinpticos, dendritas y espinasdendrticas en un volumen que puede llegar a ocupar 66000 m3. Esta morfologa les

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INTRODUCCIN

permite interaccionar con la mayora de tipos celulares del SNC. En este sentido, se

considera que el 99% de la microvasculatura cerebral est cubierta por pies

astrocitarios (Kacem et al., 1998) y que en el dominio de un solo astrocito en corteza o

hipocampo de un roedor se pueden localizar hasta 105sinapsis (Bushong et al., 2002),

Alaza et al 2007), un valor que en humanos resulta superior, hasta el punto que se ha

propuesto que una caracterstica del cerebro humanos en relacin al de otros

mamferos, es su complejidad astrocitaria (Oberheim et al., 2009).

Se puede considerar a los astrocitos como unidades de integracin local de la

informacin sinptica y no-sinptica de la microregin que cubre cada uno de ellos. La

membrana plasmtica de los astrocitos contiene microdominios especficos que origina

seales intracelulares que pueden propagarse en estos dominios sin afectar la

totalidad de la clula, permitiendo el control por fracciones de territorio dominados por

un astrocito de manera independiente (Wang and Bordey, 2008).

Es importante destacar que todas estas observaciones sobre la morfologa astrocitaria

realizadas in vivo, no se reproducen en cultivos puros de astrocitos in vitro. En efecto,

la mayora de protocolos para conseguir este tipo celular en cultivo da como resultado

monocapas confluentes de astrocitos de morfologa epitelioide (plana y poligonal) que

no reproducen su morfologa original in vivo (McCarthy and de, 1980;Won and Oh,

2000). sta se consigue al tratar las clulas con diferentes factores como el cAMP

(Won and Oh, 2000) algunos neurotransmisores como la noradrenalina (Shao et al.,

1994) o el ATP (Neary et al., 1994) y con factores de crecimiento como el EGF o el

FGF2 (Heffron and Mandell, 2005). Tambin la presencia de neuronas en co-cultivos

de neuronas-astrocitos, genera en estos ltimos una morfologa estrellada. Estas

observaciones denotan que probablemente la compleja morfologa estrellada de los

astrocitos in vivo, depende de numerosos factores, entre ellos el entorno en el que se

encuentren.

1.2 Fisiologa astrocitaria

1.2.1 Soporte neuronal

Se han descrito numerosas funciones esenciales para los astrocitos, especialmente

aquellas relacionadas con el correcto funcionamiento de las neuronas y de la

transmisin neuronal. Ambos tipos celulares comparten varias funciones sobre todo

en el terreno metablico, aunque los astrocitos estn a menudo mejor posicionados

que las neuronas, poseen mecanismos ms eficientes y disponen de reservas

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INTRODUCCIN

energticas mayores para realizarlas (Fuller et al., 2009). Entre estas funciones de

soporte estructural y metablico las ms importantes son:

- Soporte metablico a neuronas, captando glucosa desde los microvasos y

transformndola a lactato mediante la gliclisis, que al ser liberado al medio

extracelular constituye el principal sustrato energtico para las neuronas

(Tekkok et al., 2005;Pellerin, 2005). Adems los astrocitos son las nicas

clulas del SNC capaces de almacenar reservas de glucosa en forma de

glucgeno, las cuales pueden movilizarse en respuesta a algunos

neurotransmisores (Brunet et al., 2010;Gavillet et al., 2008)

- Regulacin de la concentracin extracelular de iones. La actividad

neuronal, es decir, la generacin de impulsos nerviosos entre neuronas, genera

en el espacio extracelular un gran aumento en las concentraciones de K+y de

protones (resultado del metabolismo del piruvato por parte de las neuronas). La

acumulacin de estos productos, en altas concentraciones, dificultan el

correcto funcionamiento de la actividad neuronal. Los astrocitos disponen de

canales que permiten recaptar especficamente estos iones, y trasladarlos a

zonas donde su concentracin es menor, o directamente al torrente sanguneo

(revisado en Simard and Nedergaard, 2004)

- Sntesis y liberacin de glutatin. El glutatin es un tripptido que en el SNC

es principalmente sintetizado por los astrocitos, y tiene varias funciones

esenciales como antioxidante frente a las especies reactivas de oxgeno, pero

tambin como cofactor en procesos de sntesis de protenas y cidos

nucleicos. Los astrocitos liberan el dipptido CysGly, precursor del glutatin,

que puede ser recaptado por las neuronas (revisado en Dringen and Hirrlinger,

2003).

1.2.2 Gliotransmisin y participacin a la sinapsis t ripartita

El hecho de que no sean clulas excitables elctricamente llev a la conclusin

incorrecta de que los astrocitos eran elementos pasivos en la neurotransmisin. Los

astrocitos expresan en sus membranas receptores acoplados a protena G, (GPCRs)

que les permiten responder a neurotransmisores. Este descubrimiento, all en los 70

(McCarthy and de, 1978;van et al., 1978) puso de manifiesto que poda responder aestmulos extracelulares que se pensaba que eran dirigidos exclusivamente a las

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INTRODUCCIN

neuronas. A travs de la estimulacin de estos receptores se desencadenan vas de

sealizacin, entre ellas la de calcio y el cAMP, que permiten a los astrocitos

comunicarse entre ellos y con otras clulas vecinas. Hasta entonces la visin

predominante era que los astrocitos eran clulas elctricamente silentes y por lo tanto

no participaban en la neurotransmisin. El descubrimiento de que los astrocitos

respondan a estmulos extracelulares mediante fluctuaciones de Ca2+ puso de

maifiesto que se trataba de clulas excitables, aunque esta excitabilidad no dependa

de potenciales de accin y que existe un sistema de comunicacin neurona-astocito

que permite ligar la actividad neuronal con las ondas de Ca2+ astrocitarias (Agulhon et

al., 2008). Actualmente se sabe que astrocitos expresan una batera de receptores

para la mayora de sustancia neuroactivas incluyendo neurotransmisores,

neuropptidos, factores de crecimiento y citoquinas, que les permiten responder a

estmulos a los que tambin responden las neuronas.

La va molecular ms estudiada en la elevacin del calcio citoslocio es la de la

PLC/IP3. Tras la activacin de los GPCRs, la formacin del segundo mensajero IP3, y

su subsiguiente unin a receptores IP3R, permite la liberacin de Ca2+ del retculo

endoplasmtico (aunque existen otros almacenes de calcio intracelular). Las

oscilaciones de calcio pueden ser muy variables, segn su amplitud, duracin y

frecuencia. Segn estos parmetros afectarn nicamente un microdominio del

astrocito, o se propagarn por toda la clula afectando incluso las clulas vecinas. As,

los astrocitos son clulas capaces de discriminar estmulos de diversos orgenes e

integrar seales concomitantes (Fiacco et al., 2009;Petravicz et al., 2008). Se han

descrito tambin oscilaciones de Ca2+ espontneas, es decir independientes de

seales neuronales. Estas oscilaciones se observan in vivo y podran depender de

canales de calcio dependientes de voltaje (Parri and Crunelli, 2003).

Diversos estudios han puesto de manifiesto que las seales de Ca2+

puedenpropagarse de un astrocito a otro recorriendo distancias relativamente largas. Esto

descubrimientos in vitro, por estimulacin elctrica, mecnica o qumica, han dado a

pensar que puede existir una red de comunicacin entre astrocitos (Sul et al., 2004).

No obstante no queda claro si este fenmeno se reproduce en condiciones

fisiolgicas. Estudios in vivomuestran que en respuesta a estmulos fisiolgicos no se

generan ondas de Ca2+que viajen de una zona a otra. Ms bien se observa que cada

uno de los astrocitos estimulados responde de manera ms bien independiente

(Schummers et al., 2008). Existen dos modelos que podran explicar cmo las sealesde calcio se propagan de una clula a otra. Intracelularmente el IP3 generado en

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INTRODUCCIN

respuesta a una seal extracelular puede difundir a travs de las gap-junctions que

unen a los astrocitos entre ellos (Newman, 2001) Extracelularmente, la elevacin del

calcio intracelular puede promover la liberacin de factores como el ATP, que a su vez

podran excitar a las clulas vecinas (Innocenti et al., 2000).

La sealizacin por Ca2+ en algunos casos promueve la rpida liberacin de los

denominados gliotransmisores, molculas provenientes del astrocito que son activas in

situsobre neuronas pre- y post-sinpticas modulando su actividad, como el glutamato,

la D-Serina, el ATP, algunas prostaglandinas y el TNF-, revisado en (Halassa et al.,

2007). Todos estos descubrimientos han colocado a los astrocitos en un puesto muy

activo en la neurotransmisin, aadiendo un nuevo elemento, la glia perisinptica, en

el tradicional modelo de la sinapsis formada por las neuronas pre- y postsinpticas.

Este nuevo modelo recibe el nombre de sinapsis tripartita y es sujeto de un activo

debate en la actualidad (Perea et al., 2009).

1.2.3 Regulacin de los niveles sinpticos de glutamato.

El glutamato es considerado como el principal neurotransmisor excitador en el SNC y

est involucrado en la mayora de procesos que conforman el funcionamiento normal

del SNC como la cognicin, la memoria y el aprendizaje. Aproximadamente el 90% de

las neuronas liberan glutamato al ser excitadas. ste es liberado al espacio sinptico

por exocitosis de las vesculas que lo contienen, donde difunde hasta unirse a sus

receptores en la membrana post-sinptica. Para permitir una sealizacin sinptica

fina, el glutamato sobrante debe ser retirado rpidamente del espacio sinptico

(Danbolt, 2001).

Adems, el glutamato es una potente neurotoxina, y la excitoxicidad producida por

glutamato participa en numerosas patologas del SNC. Altas concentraciones

extracelulares de este neurotransmisor producen una sobrestimulacin de lasneuronas, que provoca daos en stas y que pueden llevar a su muerte, bien por una

va rpida dependiente de Ca2+, bien por apoptosis como ocurre en enfermedades

neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (AD).

El glutamato liberado al espacio intersinptico es rpidamente recaptado por los

astrocitos circundantes, terminando as su funcin neurotransmisora y evitando la

sobrestimulacin neuronal. La recaptacin se lleva a trmino mediante transportadores

especficos para glutamato presentes en la membrana de los astrocitos, siendo losprincipales EAAT1 (GLT1) y EAAT2 (GLAST1). El glutamato recaptado es

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INTRODUCCIN

transformado a glutamina, a travs de la glutamina sintasa, enzima de expresin

localizada principalmente en astrocitos, y se libera al medio donde es recaptada de

nuevo por las neuronas. El glutamato es recaptado por los EAATs astrocitarios juntos

con tres iones Na+, produciendo una aumento intracelular en la concentracin de este

in. Para reducirla, los astrocitos utilizan la ATPasa Na+/K+, provocando una demanda

energtica en estas clulas que como consecuencia activan las vas de la gliclisis.

Este aumento intracelular de los niveles de Na+ a causa de la recaptacin de

glutamato sirve como un sistema integrador entre la actividad neuronal con la

utilizacin de glucosa y confiere a los astrocitos un nivel adicional de control sobre la

actividad sinptica (Magistretti et al., 1999;Azarias et al., 2011;Danbolt, 2001).

Figura1.

Metabolismo

de

la

recaptacin

del

glutamato

en

la

sinapsis

glutamatrgica.

De

Ma istretti

et

al,

1999

En esta lnea, la recaptacin de glutamato es un proceso dinmico y se incrementa

durante la actividad neuronal, incluyendo la potenciacin a largo trmino (LTP).

Descubrimientos recientes han demostrado que la expresin de los EAATs son

regulados a nivel de la sinapsis por la interaccin neurona-astrocito mediante el

sistema de sealizacin de las efrinas. En el rea CA1 del hipocampo la presencia del

receptor de efrina A4 en la neurona post-sinptica, a travs de su interaccin con suligando, la efrina A3, que se encuentra expresada en los procesos astrocitarios peri-

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INTRODUCCIN

sinppticos, disminuye la expresin de los EAATs gliales (Carmona et al., 2009) y es

capaz de modular la LTP (Filosa et al., 2009). La sealizacin ephrin-A3/EphA4

modula tambin la longitud y morfologa de las espinas dendrticas (Murai et al., 2003).

En resumen, esta va de sealizacin controla bidireccionalmente la funcin sinptica y

el transporte de glutamato, incidiendo directamente en la funcin hipocampal, una

evidencia adicional sobre la participacin de los astrocitos en la transmisin sinptica.

Se ha mostrado que la regulacin dinmica de los EAATs participa en procesos de

aprendizaje. En ratas sometidas al test del laberinto acutico de Morris, se ha

observado una disminucin en los niveles de expresin en hipocampo de GLAST y

EAAC1 (transportador de glutamato neuronal). Los autores proponen que esta

disminucin en las primeras fases del aprendizaje espacial podra permitir una

transmisin sinptica glutamatrgica de mayor intensidad durante las fases crticas del

aprendizaje (Fraticelli-Torres et al., 2010).

1.2.4Acoplamiento neurovascular

A travs de la interaccin con las clulas endoteliales los astrocitos controlan tambin

la formacin de la barrera hematoenceflica (Abbott et al., 2006), y son capaces de

regular el flujo sanguneo cerebral. El control del flujo sanguneo cerebral (CBF) es

vital para mantener el aporte energtico necesario para el funcionamiento neuronal

correcto. Descubrimientos recientes muestran que los astrocitos participan

directamente en el control del CBF, permitiendo acoplar las demandas energticas de

las neuronas de un rea con alta actividad neuronal con un incremento en el flujo

sanguneo. Este nivel de control parece depender de la gliotransmisin dependiente

de Ca2+ que conlleva variaciones en el tono arteriolar en una zona determinada. As, la

elevacin de la concetracin de Ca2+ intracelular conlleva a la formacin de la

prostaglandina PGE2 capaz de producir vasodilatacin en los capilares cerebrales

(Mulligan and MacVicar, 2004).

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INTRODUCCIN

2. Participacin de los astrocitos a la neuroinflamacin

2.1 Conceptos generales sobre la inflamacin cerebral

La inflamacin es una reaccin de defensa de los tejidos destinada a neutralizarestmulos perjudiciales y restaurar la integridad tisular. En enfermedades

neurodegenerativas la inflamacin tiene lugar como una respuesta local conducida por

las clulas gliales y el endotelio cerebral.

De una manera simplista, segn su duracin en el tiempo la neuroinflamacin puede

clasificarse en aguda o crnica. La inflamacin aguda consta de las reacciones

inmediatas de las clulas gliales a un dao, y es bsicamente un proceso defensivo

que prepara el terreno para la reparacin del rea lesionada. La inflamacin crnica escaracterstica de las enfermedades neurodegenerativas en las que existe un estmulo

que persiste en el tiempo y se caracteriza por una activacin glial sostenida (Streit et

al., 2004) y en algunos casos, como en la esclerosis mltiple, por la acumulacin de

leucocitos en el parnquima cerebral. Bioqumicamente, el grado de activacin viene

determinado por el espectro de mediadores inflamatorios generados por las clulas

gliales. Este espectro incluye prostaglandinas, protenas del complemento, citoquinas,

quimiocinas, proteasas, molculas de adhesin y radicales libres (McGeer and

McGeer, 2004).

2.2. Privilegio inmune del SNC

El sistema nervioso central (SNC) presenta particularidades en cuanto a la respuesta

inflamatoria respecto a la inflamacin sistmica. La magnitud de las respuestas

inflamatorias en el parnquima cerebral es menor comparada con la de otros tejidos,

fenmeno conocido como privilegio inmune del cerebro (Matyszak, 1998). Esta menor

reactividad inflamatoria est basada en la existencia de la barrera hematoenceflica

(Pachter et al., 2003) y en la presencia de molculas endgenas con propiedades anti-

inflamatorias como la noradrenalina (Frohman et al., 1988;Feinstein et al., 2002;Galea

et al., 2003a).

1. La barrera hematoenceflica (BHE) representa una especializacin del endotelio

cerebral que se caracteriza por una densa red de uniones estrechas entre clulas

endoteliales y la presencia de numerosos procesos astrocitarios que se encuentran

rodeando los vasos cerebrales. Estas caractersticas confieren a la BHE la capacidad

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INTRODUCCIN

de restringir el acceso de clulas inmunes y sustancias potencialmente nocivas de la

circulacin sistmica al SNC (Wolburg and Lippoldt, 2002).

2. Existen en el SNC sistemas neuronales con capacidad inmunomoduladora: Este

sera el caso de locus coeruleus que manda proyecciones a todo el cerebro y a la

espina dorsal y que en primates produce el 70% de la noradrenalina cerebral (Galea et

al., 2003b). La noradrenalina ejerce un papel inmunomodulador sobre la produccin de

molculas proinflamatorias en clulas gliales (astrocitos y microgla) (Galea and

Feinstein, 1999a) y el endotelio cerebral (Balyasnikova et al., 2000). Estos tres tipos

celulares son los principales responsables del desarrollo de la respuesta inflamatoria

en el cerebro.

3. El SNC es un tejido extremadamente rico en todo tipo de factores de crecimiento y

neurotrofinas. La expresin de algunos de estos factores est regulada por la

activacin de receptores beta-adrenrgicos (que son reconocidos por la noradrenalina)

(Riva et al., 1998a) y podran estar mediando los efectos de los sistemas

neuromoduladores. La hiptesis de la primera parte de este trabajo es que los

factores de crecimiento pueden regular las respuestas in flamatorias en el SNC.

2.3 La clulas gliales participan en la inmunidad innata del SNC

El sistema inmunitario posee dos grandes rutas de defensa: la inmunidad innata y la

adquirida. La inmunidad innata representa la capacidad inmediata del organismo de

responder a patgenos y otros tipos de trauma, y se caracteriza por la produccin de

novo de mediadores para eliminar los microorganismos y reparar el dao, bien

directamente o a travs de la activacin de clulas fagocticas. Estos mediadores son

las citoquinas, quimiocinas y protenas del complemento. En el SNC los genes que

codifican protenas que participan en la inmunidad innata pueden ser inducidos no slo

por microorganismos sino que tambin por clulas daadas en lesiones y patologasneurodegenerativas (Rivest, 2003;Becher et al., 2000) La inmunidad adquirida se

desarrolla frente a un antgeno especfico y es mediada por clulas del sistema

inmunitario: limfocitos B y T, requiriendo complejas reorganizaciones gnicas para la

produccin de anticuerpos.

Las clulas gliales participan activamente en la respuesta inmune innata del cerebro,

respondiendo ante la presencia de microorganismos patgenos. Los sistemas de

reconocimiento enfocados a patrones moleculares presentes sobre los patgenos(PAMP) son la base de la inmunidad innata, la cual inicia y dirige la respuesta inmune

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INTRODUCCIN

adaptativa. Entre estos sistema de reconocimiento de patrones moleculares destacan

la familia de los toll-like-receptors(TLRs). Existen hasta once miembros de esta familia

de receptores transmembrana, cada uno de los cuales presenta especificidad por

ligandos presentes en patgenos y son expresados de manera tejido-especfica

(Iwasaki and Medzhitov, 2004). As algunos TLRs reconocen molculas que se

encuentran en la superficie de patgeno, el TLR2 (como heterodmero con TLR1 o

TLR6) se activa tras la unin a lipoprotenas de origen bacteriano, TLR4 se une al

lipopolisacrido de la pared de bacterias gram negativas y a protenas de origen vrico,

mientras que el TLR5 reconoce una protena presente en los flagelos de algunas

bacterias denominada flagelina. Algunos TLRs son capaces de detectar la presencia

intracelular de cidos nuclecos de origen bacteriano o vrico; TLR3 reconoce ARN de

doble cadena, los TLR7/8 reconoce RNA de cadena sencilla y el TLR9 ADN

hipometilado rico en CpG. (Liew et al., 2005). La capacidad de los TLRs de reconocer

cidos nucleicos debe de tenerse en cuenta a la hora de realizar experimentos en los

que se pretende introducir construcciones de ARN mediante transfecciones utilizando

reactivos lpidicos (la mayora de kits comerciales de transfeccin utilizan molculas de

origen lipdico), para silenciar genes mediante siRNA, ya que algunas clulas, entre

ellas los astrocitos, desencadena una respuesta inmune a cadenas cortas de ARN en

conjuncin con lpidos a travs de la activacin de los TLR3 y 7 (Gorina et al., 2009).

Tras la unin de los TLRs a sus ligandos, protenas adaptadoras como MyD88, MAL,

TRIF y TRAM, son reclutadas al dominio intracelular de los receptores y se unen a l a

travs de dominios TIR. Este reclutamiento permite la activacin de kinasas de la

familia IRAK (IL-1 receptor-asociated kinases) 1,2 y 4. IRAK4 es la primera en ser

reclutada, y tas su activacin fosforila a IRAK1, que es capaz de activar a otros

efectores de esta va de sealizacin como son las kinasas del inhibidor de NF-B

(IB) que reciben el acrnimo IKK. La fosforilacin del IB por parte de las IKKs,

resulta en su degradacin va el proteasoma y en la traslocacin nuclear del factor detranscripcin NF-B que media la transcripcin de genes inflamatorios generando una

respuesta pro-inflamatoria (Flannery and Bowie, 2010;Flannery et al., 2011).

Adicionalmente a la capacidad de los TLRs de reconocer PAMPs (Patogen-associated

molecular patterns) presentes en patgenos, recientemente se ha descubierto que

stos pueden ser activados por ligandos endgenos, a los que se conoce como

DAMPs (Danger-associated molecular patterns). Los TLRs extracelulares 2 y 4

reconocen molculas liberadas al medio extracelular por clulas muertes o daadasque han perdido la integridad de la membrana plasmtica. Entre los putativos DAMPs

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INTRODUCCIN

que activan a TLR2 y 4 se encuentran algunas protenas de choque trmico (HSPs),

protenas del gurpo HMGB1, el cido hialurnico, la fibronectina o el heparan sulfato

(Sirisinha, 2011). El amplio perfil de expresin de los TLRs y su capacidad de de

reconocer a muchos ligandos que se encuentran presentes a consecuencia de

situaciones de infecciones, heridas o estrs, hacen que la sealizacin por TLR

constituya un mecanismo de respuesta rpida frente al dao tisular. Debido a esto,

empiezan a ser considerados como dianas teraputicas, tanto para prevenir el shock

sptico que puede aparecer como consecuencia a algunas infecciones (Kuno et al.,

2009), o en enfermedades autoinmunes en las que los TLR parecen jugar un papel

como es el caso del lupus eritromatoso, la artritis reumatoide, la esclerosis mltiple u

otras patologas como la enfermedad de Alzheimer (Midwood et al., 2009;Marta et al.,

2009).

Los astrocitos expresan el TLR4 (Qin et al., 2005;Bowman et al., 2003a) que reconoce

el LPS (lipopolisacrido). Esta molcula ha sido ampliamente utilizada como estmulo

inflamatorio en todo tipo de modelos celulares y animales por su capacidad de inducir

una respuesta inmune/inflamatoria de tipo innata. La induccin de la respuesta

inflamatoria por LPS se produce por la accin coordinada de 4 protenas que

reconocen a esta endotoxina. Inicialmente LBP (LPS-binding protein) interacciona con

las membranas bacterianas ricas en LPS, o agregados de LPS, catalizando la

extraccin y transfiriendo los monmeros de endotoxina a CD14, que a su vez los

transfiere a la protena MD2. La heterodimerizacin de esta ltima protena con los

receptores TLR4 desencadenan las vas de sealizacin de las que se ha hablado

anteriormente. Es importante destacar que tanto LBP como CD14 son capaces de

detectar a LPS, incluso a muy bajas concentraciones (Jerala, 2007;Teghanemt et al.,

2007). El modelo inflamatorio inducido por LPS es relativamente fcil y econmico de

establecer y presenta la ventaja de que activa vas de transduccin de seales

comunes a las citoquinas inflamatorias IL-1 y TNF- (Palsson-McDermott and O'Neill,2004), conocidas por ser las iniciadoras de diversas patologas con componente

inflamatorio.

2.4 Los astrocitos en la inmunidad innata

La respuesta de los astrocitos a condiciones patolgicas como la inflamacin o lesin,

recibe el nombre de astrogliosis y se caracteriza por hipertrofia, proliferacin, y

migracin a las zona daadas acompaado de un aumento de la expresin de

protenas como GFAP (Hozumi et al., 1990;Pekny and Pekna, 2004), vimentina(Ekmark-Lewen et al., 2010), S100 (Willoughby et al., 2004) y el receptor B de

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INTRODUCCIN

endotelinas (ETbR) (Peters et al., 2003). Estos marcadores han sido los ms utilizados

para detectar astrocitos reactivos en el SNC en todo tipo de trastornos neurolgicos.

Adems, en el proceso de astrogliosis se sobreexpresan un buen nmero de

molculas de diversos tipos como citoquinas, quimiocinas (Meeuwsen et al., 2003),

molculas de adhesin (Lee and Benveniste, 1999), enzimas del sistema xido-

reduccin, enzimas sintetizadoras de mediadores de inflamacin como NOS2 o COX2

(Galea et al., 1994), componentes de la matriz extracelular, entre ellos los

proteoglicanos (McKeon et al., 1999) y factores de crecimiento (Miklic et al.,

2004;Suzuki et al., 2006).

La astrogliosis puede variar cualitativa y cuantitativamente segn la naturaleza de la

lesin y el microentorno de la zona lesionada, poniendo de manifiesto la plasticidad de

los astrocitos reactivos. En general, la activacin de los astrocitos se considera un

mecanismo beneficioso a travs del cual el SNC normal responde a un dao y

reestablece la homeostasis (Faulkner et al., 2004a). Sin embargo la activacin glial

crnica, caracterstica de las enfermedades neurodegenerativas y de lesiones como la

seccin medular, se considera patolgica en parte por la sobreexpresin de citoquinas

pro-inflamatorias y por la formacin de la cicatriz glial que impide la regeneracin

axonal (Ridet et al., 1997;Wilhelmsson et al., 2004). La naturaleza dual de la reaccin

astrocitaria fue puesta de manifiesto en un estudio donde se muestra que la ablacin

qumica de los astrocitos, en el SNC lesionado. La ausencia de astrocitos reactivos

resulta en una mayor prdida de neuronas adyacentes a la lesin, as como en un fallo

en el restablecimiento de la integridad de la BHE y una mayor infiltracin de leucocitos.

Estos datos ilustran el papel reparador de los astrocitos reactivos en respuesta a

lesiones. Por otra parte la prdida de astrocitos est asociada a un dramtico

incremento en el crecimiento local de neuritas indicando que la formacin de la cicatriz

glial constituye un impedimento para regeneracin axonal (Bush et al., 1999;Faulkner

et al., 2004b).

La cicatriz glial representa un intento por parte de los astrocitos de aislar la zona

lesionada para evitar daos secundarios a las regiones adyacentes al foco. Est

constituida por astrocitos hipertrofiados que presentan alta expresin de GFAP,

rodeados de una densa matriz extracelular formada por una red molecular muy rica en

condroitn-sulfato proteoglicanos (CSPG). Los CSPG, entre ellos el neurocn y

fosfacn (Morgenstern et al., 2002), son glicoprotenas de muy alto molecular, cuya

parte glucdica, entre otros factores, es la que convierte la cicatriz glial en restrictivapara el crecimiento axonal y por la tanto a la completa regeneracin funcional de los

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INTRODUCCIN

tejidos afectados. Sin embargo, estudios recientes muestran que la formacin y

composicin de la cicatriz glial pueden modularse, resultando en una resolucin de la

lesin acompaada de una mejora en la recuperacin funcional, poniendo en duda la

idea preestablecida de que la presencia de esta cicatriz es siempre perjudicial. As, un

estudio (Renault-Mihara et al., 2011) muestra, que el tratamiento de ratas a las que se

efecta una lesin de espina dorsal con un inhibidor de la GSK3, resulta un aumento

en la migracin astrocitaria, asociada a una mayor compactacin, entendida como

aislamiento, del infiltrado celular inflamatorio, a una reduccin de la desmielinizacin y

a un incremento en el crecimiento axonal. En la misma lnea el tratamiento con FGF2

en un modelo similar de seccin de espina dorsal, da lugar a una mejora en la

recuperacin funcional debido a modificaciones en la composicin de la cicatriz glial

que permiten el crecimiento axonal (Kasai et al., 2010). Estos estudios ponen de

manifiesto que la modulacin de la migracin astrocitaria representa una diana

teraputica en procesos de regeneracin.

El carcter difuso de la reactividad astrocitaria en el SNC sugiere un papel de

mediadores solubles como las citoquinas, y/o a la presencia de un sincitio integrado

entre astrocitos que permite la transferencia de informacin a largas distancias.

Existen evidencias que muestran tanto in vivo como in vitro que ambos sistemas,

mediadores solubles y conexin por sincitio, son operativos en el SNC lesionado. En

este sentido la funcin de las citoquinas en el establecimiento, mantenimiento y, en

algunos casos, resolucin de la reactividad astrocitaria han sido ampliamente

caracterizadas y sigue siendo un tema activamente estudiado. Las citoquinas son

glicopptidos solubles de bajo peso molecular que actan de manera autocrina o

paracrina mediante la interaccin con receptores de membrana. La mayora de

citoquinas pueden actuar como ligando para ms de un receptor. Aqullas con un

claro papel en iniciar las astrogliosis son la IL-1(Giulian et al., 1988;Herx and Yong,

2001) y el TNF- (Rostworowski et al., 1997), mientras que el IFN- (Yong et al.,1991;Balasingam et al., 1994) jugara un papel potenciador, mientras que existen

citoquinas con un claro papel antiinflamatorio como el TGF-(Shrikant et al., 1996a) o

neuroprotector como la IL-6 (Quintana et al., 2008).

Hay que tener en cuenta que el trmino neuroinflamacin engloba fenmenos tan

diversos como la respuesta de las clulas gliales a infecciones, a mecanismos

reparadores como los que ocurren durante la isquemia o las lesiones de espina dorsal,

o a las reacciones a las que estn sometidas los astrocitos en la fases inicialesasintomticas que, en la mayor parte de los casos, preceden la manifestacin de

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INTRODUCCIN

muchas enfermedades neurodegenerativas. Todos estos procesos inflamatorios, que

pueden considerarse relacionados de alguna manera, no tendran por qu estar

incluidos en un mismo grupo. En efecto, el patrn de expresin gnico de un astrocito

reactivo puede variar segn cul sea la naturaleza del estmulo inflamatorio. Adems

existe una heterogeneidad astrocitaria durante la reactividad glial, que hasta el

momento ha sido pobremente caracterizada. Por eso, hemos credo conveniente

escoger genes candidatos, que cubren diferentes aspectos de la reactividad

astrocitaria, para el estudio de la modulacin de la plasticidad astrocitaria. Estos genes

son la MCP1, ICAM1 y COX2.

2.4.1 MCP1

MCP1 (Monocyte chemoatractant molecule), otramente denominada CCL2, es unaquimiocina de 20kDA que es secretada al medio extracelular donde ejerce sus

funciones. Pertenece al grupo de las quimiocinas tipo CC, que comparten la

caracterstica de presentar en su secuencia aminoacdica dos residuos de cistena

adyacentes (Laing and Secombes, 2004). Las quimiocinas son un amplio grupo de

protenas funcionalmente relacionadas, que, al generar gradientes de concentracin,

guan y atraen al tejido lesionado, a un extenso espectro de clulas inmunes, entre

ellas monocitos, leucocitos, clulas NK y clulas T, y que adems son capaces de

sealizar de manera parecida a las citoquinas (Ubogu et al., 2006). Adicionalmente albien establecido papel que ejercen en el sistema inmune, las quimiocinas ejercen

funciones en el SNC tanto en condiciones fisiolgicas como patolgicas. Por ejemplo,

CXCL1, CXCL8, y CXCL12 regulan la liberacin de neurotransmisores y la actividad

de canales inicos en las pre- y post-sinapsis. (Bertollini et al., 2006). La expresin de

la MCP1 se localiza en poblaciones concretas de neuronas colinrgicas,

dopaminrgicas y de Purkinje en el SNC normal, colocalizando con neurotransmisores

y neuropptidos, sugiriendo un papel como modulador de la actividad neuronal

(Banisadr et al., 2005). En la patologa, las quimiocinas y sus receptores participan en

la patognesis y desarrollo de enfermedades neurodegenerativas, como la

enfermedad de Alzheimer (Kiyota et al., 2009;Xia and Hyman, 1999) y la esclerosis

mltiple y en trastornos neurolgicos como la isquemia y la demencia asociada al

SIDA (Eugenin et al., 2006;Dhillon et al., 2008).

En particular, la MCP1 ha sido implicado en el dao neuronal que ocurre en la

isquemia y en la esclerosis mltiple ya que los animales KO (knock out) para esta

quimiocina o para su principal receptor, el CCR2, son resistentes a la EAE

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INTRODUCCIN

(experimental autoinmune encephalomyelitis, modelo in vivo de la esclerosis mltiple)

(Fife et al., 2000) o presentan un menor dao cerebral en respuesta a modelos de

isquemia (Hughes et al., 2002). Adems de su papel quimiotctico sobre los monocitos

y la microgla (Tanuma et al., 2006;El-Hage et al., 2006), recientemente se han

descrito nuevas funciones neuroprotectoras para la MCP1. As, reduce la muerte

neuronal en cultivo inducida por excitotoxicidad, por exposicin a protenas del virus

del VIH (Eugenin et al., 2003) o durante la deprivacin de oxgeno y glucosa (Madrigal

et al., 2009a). Adicionalmente participa en el reclutamiento de precursores neuronales

tras un episodio isqumico (Yan et al., 2007;Xu et al., 2007). Recientemente, se ha

publicado un trabajo que muestra que la MCP1 podra tener per se, un papel

neuromodulador en los astrocitos, disminuyendo la expresin de citoquinas, como la

IL-6, tras un estmulo pro-inflamatorio (Semple et al., 2010b) Todos estos resultados

hacen pensar que la MCP1 desempea un papel importante en procesos de

regeneracin en el SNC.

A pesar de que varios tipos celulares, incluyendo neuronas, endotelio y gla, pueden

expresar la MCP1, (Thibeault et al., 2001;Flugel et al., 2001), los astrocitos parecen

ser su principal fuente en respuesta a lesiones (Khorooshi et al., 2008;Glabinski et al.,

1996). El gen de la MCP1, es del tipo early-response, y se transcribe de manera

rpida en respuesta a estmulos especficos por la accin de factores de trancripcin

como NF-B (Giraud et al., 2010), HIF1 (Mojsilovic-Petrovic et al., 2007) y CEBPs

(Abraham et al., 2005). Su expresin aumenta dramticamente en respuesta a

estmulos proinflamatorios como el TNF (Gao et al., 2010;Giraud et al., 2010), LPS

(Thompson and Van Eldik, 2009), o por A(Smits et al., 2002;Prat et al., 2000) pero es

tambin regulable por gliotransmisores como la noradrenalina (Madrigal et al., 2010) y

ATP (Panenka et al., 2001). La presencia del principal receptor para la MCP1, el

CCR2, de tipo 7 dominios transmembrana asociado a protenas G, se expresa en

astrocitos, sugiriendo que puede tener funciones autocrinas (Andjelkovic et al., 2002)aunque poco se conoce sobre el papel de esta quimiocina sobre los astrocitos. Un

nico estudio muestra que, durante la formacin de las placas de amiloide en estados

iniciales de la enfermedad de Alzheimer, los astrocitos migran hacia las placas

siguiendo un gradiente de MCP1 hasta que contactan fsicamente con el Ade stas,

momento en el cual se detienen. Los autores (Wyss-Coray et al., 2003a) sugieren que

los astrocitos atrados de esta manera a las placas son capaces de degradar el A. La

recopilacin de estos datos pone de manifiesto que es importante estudiar el posible

efecto autocrino de la MCP1, en fenmenos en que la migracin astrocitaria estimplicada.

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INTRODUCCIN

2.4.2 ICAM1

La molcula de adhesin intracelular (ICAM1) juega un papel importante en las

reacciones inflamatorias en el SNC. ICAM1 es una glicoprotena transmembrana

integral que contiene 5 dominios Ig-like extracelulares. Acta como ligando de las

integrinas del tipo 2 LFA-1 (CD11a/CD18) y Mac-1 (CD11b/CD18) expresadas tanto

por leucocitos y macrfagos como por la microglia. En el cerebro adulto normal se

expresa en bajos niveles y de manera constitutiva en las clulas endoteliales de los

microvasos y en los astrocitos perivasculares , siendo su expresin regulable durante

condiciones inflamatorias (Dietrich, 2002). In vitro su expresin se regula a la alza en

respuesta a citoquinas como TNF-, Il-1.(Fabry et al., 1992)

Su papel en la extravasacin de leucocitos a travs de las paredes vasculares ha sido

extensamente estudiado. Este proceso consta de diversas fases. Inicialmente los

leucocitos deben interaccionan con componentes de la matriz extracelular de los vasos

como las selectinas. A continuacin se produce la adhesin firme a las membranas

luminales de las clulas endoteliales, proceso en el que participan diversas protenas

de membrana como selectinas, VCAM e ICAM. La interaccin de la ICAM con sus

receptores presentes en los leucocitos genera cascadas de sealizacin que conllevan

la activacin del leucocito, permitiendo la diapedesis de estos, entre las culas

endoteliales que forman el vaso para llegar al parnquima del tejido. Hasta hace poco

el papel de la ICAM se limitaba a ser de ancla para los leucocitos, pero nuevos

descubrimientos demuestran su dominio intracelular es tambin capaz de sealizar

tras la interaccin con Mac-1 y LFA-1, dando lugar a cambios en la dinmica del

citoesqueleto y de la expresin gnica en el endotelio (Greenwood et al.,

2002;Dietrich, 2002).

El significado funcional de la expresin de ICAM en astrocitos ha sido poco estudiado,

y su estudio se ha limitado a la interaccin intercelular entre astrocitos y leucocitos. Suexpresin se ve aumentada en algunas de las enfermedades neurodegenerativas

como AD, PD y MS. En la AD, los astrocitos que rodean las placas de amiloide son

positivos para ICAM. En el interior de las placas se encuentran tambin clulas

microgliales que expresan los co-receptores para la ICAM, sugiriendo un papel para la

interaccin entre astrocitos y microglia mediada por la interaccin LFA/ICAM en la AD.

(Akiyama et al., 1993) Se ha descrito tambin la sobre-expresin de ICAM en

esclerosis mltiple y la enfermedad de Parkinson. Estudios in vitrodemuestran que la

mutacin de la -sinuclena causante de las formas autosmicas dominantes de la PDes capaz de incrementar la ICAM (Klegeris et al., 2006) y que la expresin de sta se

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INTRODUCCIN

ve aumentada en la substantia nigrade pacientes con dicha enfermedad (Miklossy et

al., 2006).

La activacin de la ICAM puede mimetizarse en astrocitos en cultivo mediante el uso

de anticuerpos anti-ICAM, que generan cross-linkingde esta protena (Etienne et al.,

1998). As, el uso de anticuerpos anti-ICAM desencadena la expresin de TNF- y IL-

6 a travs de las vas de las MAPK y AMPc.(Etienne-Manneville et al., 1999;Lee et al.,

2000) Las consequencias de la activacin de ICAM sobre la morfologa y migracin

astrocitarias no han sido estudiadas.

2.4.3 COX2

Las ciclo-oxigenasas (COX) son enzimas claves en la sntesis de prostaglandinas que

regulan el paso limitante de la produccin de stas utilizando como sustrato el cido

araquidnico. Se conocen dos principales isoformas, siendo la COX1 de expresin

ubicua y constitutiva y la COX2 de carcter inducible en numerosos tipos celulares en

respuesta a estmulos inflamatorios. Las prostaglandinas regulan mltiples funciones

fisiolgicas, como el acoplamiento neurovascular, y desempean un papel importante

en el control de la respuesta inmune innata, actuando bien como segundos

mensajeros pro-inflamatorios (Verma et al., 2011) de manera paracrina mediante de la

activacin de receptores de prostaglandinas, protenas de membrana asociadas a

protenas G, o anti-inflamatoria por activacin de los receptores nucleares PPAR

(Martinez-Gras et al., 2011), segn el tipo de prostaglandina y el contexto celular.

La COX2 se expresa en clulas gliales y endoteliales en condiciones de inflamacin

pero existen algunas situaciones en las que su loclizacin es principalmente

astrocitaria. Por ejemplo, se expresa principalmente en astrocitos en respuesta a

isquemia, mientras la COX1 se observan en neuronas y microgla tanto en basal comoen isquemia (Wu et al., 2011). Se induce tambin por inyeccin de cido kanico intra-

hipocampal especficamente en astrocitos de CA1 y CA3 (Serrano-Perez et al., 2011).

Su expresin es dependiente de factores de transcripcin como NF-kB (Serrano-Perez

et al., 2011) y NFAT (Blanco et al., 2010), AP1 y PPAR(Aleshin et al., 2009). El A la

induce de manera dependiente de NF-B, asociado a un aumento en la liberacin de

PGE2 (Blanco et al., 2010). Las prostaglandinas son molculas vasoactivas. En este

sentido, los astrocitos actan como puentes en el acoplamiento neurovascular, el ATP

liberado por los propios astrocitos en respuesta a la actividad neuronal, induce laexpresin de COX2 que sintetiza prostaglandinas que al actuar sobre las clulas

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INTRODUCCIN

endoteliales regulan el flujo cerebral y participan en la proteccin ofrecida por el

precondicionamento isqumico (Birnbaum et al., 2005). Las prostaglandinas pueden

participar en la neurotransmisin ya que aumentan excitabilidad neuronal asociado a

un incremento en las sinapsis excitadoras (Koch et al., 2010). A pesar de que los

mecanismos de expresin de la COX2 han sido ampliamente estudiados, y su

presencia se interpreta muy a menudo como un marcador de inflamacin, poco se

conoce sobre el papel de la COX2 y las prostaglandinas sobre los astrocitos.

En otro contexto, es bien conocida la participacin de la COX2 en el desarrollo de

tumores y el establecimiento de metstasis, revisado en (Harris, 2007). En esta lnea,

se ha detectado la sobre-expresin de COX2 en diferentes tipos de tumores y se

conoce que las prostaglandinas son capaces de estimular la migracin de clulas

cancerosas, y que este efecto se revierte en presencia de inhibidores especficos del

enzima como son el NS398 y el celecoxib (Rodriguez et al., 2008), y ocurre a travs de

la activacin de receptores de prostaglandinas. Teniendo en cuenta estos resultados,

resulta interesante preguntarse si la COX2 puede intervenir en fenmenos de

plasticidad astrocitaria como es la migracin.

2.5 Migracin astrocitaria

La migracin celular es esencial para la organizacin y mantenimiento de la integridad

tisular y participa en el desarrollo embrionario, regeneracin, inflamacin e invasin a

travs de la matriz extracelular (Lauffenburger, 1996). La migracin celular es un

proceso vital en todos los organismos multicelulares y es importante no solamente

durante el desarrollo sino que tambin durante toda la vida en fenmenos como la

regeneracin y la inmunidad. La migracin celular es dirigida por seales

extracelulares que actan como atrayentes o repelentes. Estas seales desencadenan

respuestas intracelulares que incluyen cambios en el citoesqueleto (tanto microtbulosde tubulina como microfilamentos de actina), en el transporte vesicular y en la

expresin gnica.

Cuando el SNC atraviesa una situacin traumtica, los astrocitos reactivos migran a

los bordes de la zona lesionada y/o inflamada donde forman la cicatriz glial, separando

el tejido sano de la zona daada. (Ellison et al. 1998; Saadoun et al. 2005).

Numerosas evidencia tanto in vivo como in vitro sealan a los mediadores

inflamatorios, incluyendo citoquinas, factores de crecimiento y ligandos de losreceptores Toll-like (TLRs), como directores de la astrogliosis (Ghirnikar et al.1998;

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INTRODUCCIN

Caso et al. 2007), aunque el efecto beneficioso o deletreo de los procesos

inflamatorios sigue siendo tema de debate (Kriz, 2006).

Un papel importante de los mediadores inflamatorios podra ser el de regular la

capacidad migratoria de los astrocitos a las zonas daadas (Norton et al. 1992;

Ghirnikar et al. 1998). En numerosos estudios se muestras que citoquinas y LPS son

capaces de estimular la migracin de diferentes tipos celulares. Por ejemplo la IL-1

promueve la migracin de clulas de msculo liso vasculares (Delbosc et al. 2008) y

en clulas tubulares de rin humano (Zhang et al. 2005), TNF- en clulas

epidermales de Langherhans (Griffiths et al. 2005, TNF- e IFN- en precursores

multipotentes neurales (Ben-Hur et al. 2003). Aunque la IL-1 es capaz de dar lugar a

astrogliosis in vivo (Giulian et al. 1988), esta misma citoquina inhibe la migracin de

astrocitos fetales humanos in vitro (John et al. 2004), a diferencia de otros trabajos

(Sato et al., 2011). El papel de los mediadores inflamatorios en la migracin

astrocitaria no queda claro, por ejemplo el LPS, no es capaz de estimular migracin en

astrocitos (Sato et al., 2011), aunque en presencia de otros mediadores de la

inflamacin, como molculas lipdicas como el LPA, s es capaz de acelerar este

proceso. Por lo tanto, parece claro que existe cierta especificidad en las molculas

capaces de regular los fenmenos de migracin astrocitaria.

Es importante destacar tambin que en los ltimos aos est cobrando importancia la

hiptesis de que enzimas que participan en la respuesta inflamatoria pueden participar

tambin en un incremento de la capacidad migratoria de los astrocitos reactivos. De

esta manera MMP-9, una metaloproteinasa capaz de degradar componentes de la

matriz extracelular y ya implicada en otros fenmenos migratorios como en el

establecimiento de metstasis (van Kempen and Coussens, 2002), parece ser pro-

migratoria, ya que al inhibir su actividad, astrocitos tratados con TGF- disminuyen la

velocidad de migracin (Hsieh et al., 2010). Asimismo, la sintasa de xido ntricoinducible (iNOS) es capaz de estimular la migracin astrocitaria a travs de su

producto, el xido ntrico y las especies reactivas de oxgeno que de l se derivan

(Wang et al., 2010). Queda por ver si otras molculas que participan en la reaccin

inflamatoria como las quimiocinas, por su conocido papel de establecer gradientes

quimiotcticos que son reconocidos por las clulas inmunes para localizar zonas de

lesin, y la ciclooxigneasa-2 (COX2), que juega un papel claro en la formacin de

metstasis, o molculas de adhesin como ICAM y VCAM promueven la migracin

astrocitaria.

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37/221

INTRODUCCIN

2.6. Part icipacin de las Rho GTPasas en la reactividad glial

A modo de resumen, el primer paso en la migracin celular es la emisin de un

proyeccin o proceso gua (leading edge), formado por un lamelipodio, que al crecer

establece nuevos puntos de adhesin al frente del sentido migratorio, seguido de una

contraccin del soma celular y la prdida de los puntos de anclaje de la clula en su

parte trasera lo que permite el avance de la clula. Todos estos pasos son posibles

por la reorganizacin del citoesqueleto de actina, el ensamblaje y desensamblaje de

las adhesiones focales y el establecimiento de la polaridad celular que determina el

sentido de la migracin. Estos procesos deben estar coordinados localmente de una

manera muy fina, tanto en el espacio como en el tiempo, para generar un movimiento

productivo. Se han descrito mltiples vas de sealizacin involucradas en el control de

la migracin celular como las MAPKs y las fosfolipasas, pero una familia de protenas,

las Rho GTPasas, destaca sobre las dems por desarrollar un papel esencial en la

regulacin de las vas bioqumicas relevantes en la migracin.

Las Rho-GTPasas son una familia de protenas G pequeas que, fluctuando entre

estados activos (cuando se encuentran unidas a GTP) e inactivos (al transformar el

GTP a GDP) coordinan cambios en la organizacin del citoesqueleto de actina y en la

transcripcin de genes, regulando as procesos biolgicos como la morfognesis, la

quimiotaxis, el crecimiento de los axones y la progresin del ciclo celular. La actividad

de las Rho-GTPasas est regulada por las GEFs (guanine-nucleotide-exchange

factors) que facilitan el intercambio de GDP por GTP y por las GAPs (GTPase

activating proteins), que tienen el efecto contrario al aumentar la velocidad de

hidrlisis del GTP. En su forma inactiva las Rho-GTPasas se encuentran formando un

complejo con GDIs (GDP-dissociation inhibitors) en el citoplasma mientras que su

activacin implica translocacin a la membrana con la que interaccionan mediante una

isoprenilacin. Las Rho-GTPasas incluyen a las Rho (A, B y C), las Rac, y las Cdc42,

que regulan diferentes aspectos de la dinmica del citoesqueleto. Generalizando, lasRho activan la formacin de complejos actina-miosina que forman las fibras de estrs

en cuyo extremo se forman focos de adhesin a la matriz extracelular. Las Rac

inducen la formacin de una red de filamentos de actina en la periferia celular que da

lugar a la formacin de lamelipodios, mientras que las Cdc42 inducen extensiones

ricas en actina en la membrana llamadas filopodios (revisin en Bishop and Hall,

2000)). En su conformacin activada las Rho-GTPasas son capaces de interaccionar

de manera especfica con sus protenas efectoras que median sus efectos. La

serina/treonina kinasa ROCK es activada por la unin a Rho-GTP (Kubo andYamashita, 2007), as como mDia (Narumiya et al., 2009); por otro lado Rac1 y cdc42-

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INTRODUCCIN

GTP promueven la actividad de la kinasa PAK (Szczepanowska, 2009;rias-Romero et

al., 2010), entre otras (Bishop and Hall, 2000).

Existe un cierto consenso en atribuir la formacin de las protrusiones que establecen

el sentido migratorio y el establecimiento de la polaridad celular a la cdc42 (Yokota et

al., 2010) y a la Rac1, mientras que la RhoA regula adhesin/deadhesin de la parte

trasera mediante el control de la contractibilidad de las fibras de actina-miosina, y la

formacin de adhesiones focales. Las adhesiones focales son microrregiones

especializadas de la membrana plasmtica, que constituyen puntos de unin con el

sustrato. Estas uniones se establecen a travs de protenas como las integrinas que

reconocen componentes de la matriz extracelular a los que se unen, y actan como

anclas que ligan en el citoesqueleto de actina con la matriz a travs de toda una serie

de protenas adaptadoras. Entre ellas se encuentran la paxilina (Yu et al., 2010) o la

kinasa de adhesiones focales (FAK). La FAK regula el reciclaje

(formacin/desensamblaje) de las adhesiones focales a travs de la fosforilacin de

varias protenas efectoras, y su actividad est directamente relacionada con la

adhesin y migracin celular (Chalkiadaki et al., 2011).

Se han desarrollado distinto modelos experimentales in vitropara poner de manifiesto

la capacidad migratoria de las clulas y as estudiar las vas de sealizacin

implicadas en este fenmeno. Uno de los ms utilizados, el ensayo de scratch wound

assay, consiste en realizar una herida en una monocapa de clulas confluentes,

eliminando los contactos inhibidores clula-clula, estimulando as la migracin celular

para regenerar la herida. En el caso de los astrocitos, stos se polarizan en direccin

perpendicular a la herida, emitiendo largos procesos y cerrando totalmente zona libre

de clulas 48h despus de su generacin (Etienne-Manneville, 2006). Este ensayo

reproduce varios de los fenmenos que ocurren durante la migracin in vivo, y permite

ensayar cmo modulan la capacidad migratoria frmacos y molculas sobre lapolaridad, morfologa y velocidad migratoria.

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INTRODUCCIN

3. FGF2 en la plasticidad astrocitaria

Los factores de crecimiento fibroblstico (FGF) y sus receptores (FGFR) constituyen

un elaborado sistema de sealizacin que participa en numerosos procesos durante eldesarrollo embionario y la edad adulta en virtualmente todos los tejidos en mamferos.

Fue una de las primeras familias de factores de crecimiento en ser descritas. El primer

miembro de esta familia fue identificado por su capacidad de estimular la proliferacin

de fibroblastos, de all su nombre. Hasta la fecha se conocen veintitrs miembros de

esta familia que sealizan a travs de cuatro receptores distintos. No todos los FGFs

pueden ser detectados en todas las especies incluyendo la humana. As, en humanos

el FGF15 no se detecta en el genoma resultando en un total de veintids miembros de

esta familia (Itoh and Ornitz, 2008). Por anlisis filogentico la familia de los genesFGF humanos pueden dividirse en siete subfamilias compartiendo algunos de los

miembros de cada subfamilia funciones y patrones de expresin parecidos.

La mayora de FGFs se expresan durante el desarrollo con patrones de expresin

diferenciales y muy dinmicos. En el adulto la expresin de algunos de estos factores

se mantiene y en algunos casos de manera muy restringida a ciertos rganos. A

menudo varios FGFs se co-expresan en el mismo tejido, lo que resulta en cierta

redundancia funcional que se refleja en la generacin de KOs para FGFs especficos.

Este es el caso del ratn KO para FGF2, que es viable y no presenta un fenotipo

dramtico a pesar de que este factor est implicado en procesos tan importantes como

la induccin del mesodermo, angiognesis y formacin de extremidades (Ortega et al.,

1998). Es posible que la redundancia funcional haya sido un mecanismo seleccionado

evolutivamente para conferir robustez a un sistema de sealizacin

Los genes de todos los FGFs conocidos se estructuran en tres exones codificantes

siendo el exn 1 el que contiene el codn de inicio (Arnaud et al., 1999;Prats et al.,

1989). An as numerosos FGFs presentan secuencias codificantes en 5 cuya

transcripcin se inicia a travs de codones CUG alternativos. Respecto a su

localizacin cromosmica los genes de los FGF no se localizan en un cluster

delimitado si no que muestran una localizacin altamente dispersa en el genoma (Itoh

and Ornitz, 2008).

Los FGFs son molculas evolutivamente antiguas. Han sido identificados tanto en

invertebrados como en vertebrados, pero no se encuentran en el genoma de

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INTRODUCCIN

organismos unicelulares como E. coli o S. cerevisae.En Drosophila se conoce un solo

gen de FGF, branchless, y en C. Elegans dos (egl-17 and let-756), contrastando con el

alto nmero de FGFs identificados en vertebrados. La mayora de protenas FGF

ortlogas se encuentran altamente conservadas entre especies mostrando un 90% de

identidad en la secuencia aminoacdica. El tamao de estos factores oscila entre 17 y

34 kD y la mayora contienen un secuencia interna altamente conservada de 28

aminocidos (core domain) que determinan la interaccin con heparina y con los

FGFRs (Beenken and Mohammadi, 2009).

3.1 Los FGF sealizan a travs de los FGFR

Los FGFs ejercen sus funciones extracelulares a travs de la unin y activacin de

receptores de alta afinidad presente en la membrana extracelular, los FGFR. Los

FGFR son una subfamilia de receptores tirosina-quinasa de membrana, que en

vertebrados consta de cuatro miembros FGFR1-4. Son protenas con un solo dominio

transmembrana con un motivo de unin a ligando extracelular y dominios tirosina-

kinasa intracelulares. La regin extracelular est compuesta de tres dominios Ig (IgI,

IgII, IgIII) que son los responsables de la unin a FGF, determinando las especificidad

y afinidad por el ligando. Localizado entre los dominios IgI y II, se halla un motivo de

aa cidos (acdic box domain) seguido de un motivo de unin a heparina y un dominio

de homologa a molculas de adhesin (CHD). Estos dominios permiten la interaccin

de los FGFRs con molculas de la matriz extracelular, principalmente la heparina de

los heparan-sulfato-proteoglicanos (HSPGs) y molculas de adhesin como N-CAM.

Contigua a la parte extracelular se encuentra el domino transmembrana seguido de la

parte intracelular. Esta ltima consta de una regin yuxtamembrana, un dominio

tirosina-quinasa partido por un dominio interquinasa no cataltico y una cola C-terminal

corta. Adems del dominio cataltico, la regin intercelular contiene varios motivos de

fosforilacin as como de unin a protenas adaptadoras como FRS2 (Mohammadi et

al., 2005a;McKeehan et al., 1999;Gotoh, 2008).

La mayora de FGFs pueden unirse a ms de un FGFR. La diversidad de funciones

que presentan los distintos FGFs se consigue, a parte de la existencia de cuatro

receptores diferentes, gracias a la generacin de isoformas por splicingalternativo en

los ARN mensajeros de los receptores. La regin con un mayor impacto sobre la

afinidad del ligando por el receptor es la IgIII, para la cual existen tres variantes de

splicingdenominadas IgIIIa, IgIIIb, IgIIIc (Mohammadi et al., 2005b).

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41/221

INTRODUCCIN

El mecanismo de activacin de los FGFR no est del todo dilucidado. Se piensa que el

mecanismo comn a todos los receptores es la formacin de dos complejos FGF-

FGFR independientes que son de baja afinidad. Estos complejos pueden dimerizar y

subsecuentemente ser conectados por una molcula de heparina o HSPGs

estabilizando y activando el complejo, formado finalmente por dos molculas de FGF,

dos de FGFR y una de heparina (McKeehan et al., 1999).

La activacin del complejo conlleva un aumento en la actividad tirosina quinasa del

dominio intracelular resultando en la autofosforilacin de varios residuos tirosina del

propio receptor. Estas fosforilaciones sirven como puntos de amarre (docking sites)

para el reclutamiento y unin de varias protenas de docking como FRS2, GAB1,

protenas adaptadoras como GRB2 y protenas sealizadoras como la fosfatasa Shp2.

Las interacciones entre estas protenas se llevan a cabo a travs de dominio SH2 (src-

homology2) y PTB (phosphotyrosine binding). Estos componentes se ensamblan en

complejos sealizadores que inician distintas vas de sealizacin que modifican la

expresin gnica y el comportamiento celular

Figura2.PrincipalesvasdetrasduccindesealesactivadasporlaactivacindelFGFR1.Launin del FGFR con su ligando, provoca la dimerizacin del receptor y la activacin de diversasvas de trasduccin de seales. La activacin de la fosfolipasa C (PLC) y la movilizacin de calciointracelular producen cambios morfolgicos en la clula, mientras que la accin de la fosfatidil-inositol kinasa (PI3K) media la activacin de la proten quinasa B que regula la supervivenciacelular. La estimulacin de la va de las MAP quinasas transduce las seales iniciadas por elreceptor al ncleo modificando la expresin de genes. (Mohammandi et al, 2005)

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INTRODUCCIN

Un fenmeno intrigante en la sealizacin por receptores FGFR es que, segn el

contexto y el tipo celular, tras la unin del ligando al receptor, el complejo es

internalizado y transportado al ncleo (Clarke et al., 2001). Esto sugiere que el

complejo ligando-receptor puede tener acciones nucleares facilitando la expresin de

genes (Peng et al., 2002;Stachowiak et al., 2003). Este proceso de internalizacin y

sealizacin intracrina representa una peculiaridad del sistema FGF-FGFR sobre otros

sistemas de sealizacin por factores trficos a los que se atribuye un mecanismo de

accin paracrino.

3.2 Funciones de los FGFs

Un nmero relativamente bajo de factores de crecimiento orquestan el desarrollo,

sealizando sobre clulas indiferenciadas proliferacin, diferenciacin y organizacin

en patrones especficos. Entre ellos se encuentran los FGFs y su receptores

involucrados en la mayora de procesos embrionarios tempranos como: el

establecimiento de los ejes corporales, formacin del mesodermo y el endodermo,

induccin neural y regionalizacin de la placa neural y somitognesis (Bottcher and

Niehrs, 2005;Mason et al., 2004).

Los FGFs a menudo sealizan de manera direccional y recproca en fronteras epitelio-

mesenquimales. Por ejemplo en vertebrados, en el desarrollo de las extremidades, el

FGF10 expresado por el mesodermo de placa lateral induce la formacin de la cresta

apical ectodrmica. La cresta expresa entonces FGF8 con el que sealiza sobre el

mesodermo. Esta sealizacin direccional inicia feedback loops, que junto con otros

factores solubles, promueven el crecimiento y la correcta organizacin de la

extremidad (Grieshammer et al., 1996). La expresin diferencial de las distintas

variantes de splicingde los receptores FGFR (que determinan la especificidad por el

ligando) permite esta sealizacin direccional evitando la sealizacin autocrina sobre

el mismo compartimiento.

Los FGFs juegan un papel importante en el desarrollo del SNC. El FGF3 y FGF8 han

sido implicados en el establecimiento de la regionalizacin del la estructuras

embrionarias que darn lugar al SNC maduro (Raible and Brand, 2004). Adems

participan en el desarrollo de los rganos sensoriales, en la condrognesis y en la

formacin del sistema esqueltico, de las extremidades, as como del corazn y

sistema digestivo

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INTRODUCCIN

Para estudiar las funciones de los FGF, el abordaje utilizando en la mayora de los

casos ha sido la generacin de knock-outs mediante recombinacin homloga. Los

fenotipos varan de una letalidad severa embrionaria por fallos importantes en la

organognesis a cambios sutiles en el adulto. Es difcil atribuir funciones especficas a

cada uno de los FGFs por la redundancia funcional que presentan. An as, algunas

de las subfamilias de los FGFs presentan funciones bien delimitadas.

Figura3.AgrupacinfilogenticadelosFGFsdemamferoporsubfamilias.Anlisis

filogenticos sugieren que los FGFs pueden dividirse en siete subfamilias quecontienen entre dos y cuatro miembros. La longitud de las ramificaciones esproporcional a la distancia evolutiva de cada uno de los genes. (Ithoh N., 2008).

La familia de hFGF (formado por los FGF19, FGF21, FGF23) presenta un claro papel

en la regulacin metablica, funcionando como hormonas endocrinas. FGF19 podra

ser un regulador energtico por su control sobre el metabolismo de lpidos y formacinde bilis, FGF21 regula tambin el metabolismo de la glucosa y lpidos, mientras que

FGF23 controla el metabolismo de la vitamina D e iones fosfato. Otra peculiaridad de

esta subfamilia es que sus miembros muestran poca afinidad por los FGFRs,

requiriendo la presencia de co-receptores como Klotho y -Klotho para activar los

FGFR de manera eficiente (Itoh, 2010).

La familia del FGF11 (FGF11-14) se expresan tanto en el SNC en desarrollo como en

el adulto lo que hace pensar que estos factores desarrollan un papel importante en eldesarrollo y mantenimiento de este sistema, Como peculiaridad los miembros de esta

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INTRODUCCIN

subfamilia no se secretan y su localizacin subcelular es principalmente nuclear

(Smallwood et al., 1996). La familia del FGF7 (FGF7, FGF10 y FGF22) presenta

funciones en la formacin de sinapsis como organizadores presinpticos. (Umemori et

al., 2004).

Las dems subfamilias de FGFs no presentan funciones ms definidas. En

organismos adultos los FGFs estn implicados en la regeneracin de tejidos,

angiognesis y homeostasis tisular (Lee and Kay, 2006a;Chang et al., 2006). Tiene

adems una importancia capital en cncer. Los FGF3-6 fueron inicialmente

identificados como proto-oncogenes. Adems junto con los FGFRs, los FGFs tiene un

importante papel en la proliferacin celular. Numerosas evidencias muestran que estn

involucrados en la carcinognesis y formacin de tumores de origen mamario, de piel,

de prstata, del tracto urinario, as como de patologas de tipo hematolgico (Lin and

Wang, 2010;Knights and Cook, 2010).

Adems por la importancia de la sealizacin de FGFs en el desarrollo del sistema

esqueltico, mutaciones en los FGFR generan displasias esquelticas que se pueden

agrupar en dos grupos: acondroplasias (Aviezer et al., 2003), la forma ms comn de

enanismo de origen gentico en humanos o craneosinostosis (cierre prematuro de las

suturas craneales, (Hatch, 2010).

3.3. FGF2

3.3.1 Descubr imiento y primeros t rabajos

El FGF2 fue uno de los primeros factores de crecimiento en ser descubierto, hace ms

de 30 aos. Se identific en extractos de la glndula pituitaria bovina un factor capaz

de estimular la proliferacin de fibroblastos murinos (Armelin, 1973). Posteriormente

Gospodarowich et al lo purificaron de la pituitaria y lo nombraron factor de crecimiento

de fibroblastos (FGF). El FGF2 se expresa en grandes cantidades en esta glndula,as como en el resto del cerebro, representando 5 mg de factor por kg de tejido. El

FGF2 se purifica con un punto isoelctrico de pH 9.6 por lo que fue llamado bFGF (b

de bsico) para diferenciarlo del aFGF (acdico o FGF1), que fue caracterizado en la

misma poca. Se demostr tambin que el FGF2 actuaba a travs de receptores de

membrana (Neufeld and Gospodarowicz, 1985).

La sospecha de que se tratara de un factor neurotrfico vena dada por haber sido

purificado en la pituitaria y en el cerebro. En 1986 se demostr que el FGF2 mejorabala supervivencia de neuronas corticales en cultivo (Morrison et al., 1986). Ms tarde el

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45/221

INTRODUCCIN

FGF2 humano fue clonado de fibroblastos de piel y se determin que estimulaba la

proliferacin celular al ser transfectado su cDNA y que se secretaba al medio

extracelular (Kurokawa et al., 1987). Desde entonces las funciones que se atribuyen al

FGF2 no han parado de aumentar.

3.3.2 Estructura del FGF2

El FGF2 es un polipptido de cadena sencilla compuesto por 146 aminocidos que

carece de la secuencia seal de secrecin pero ha adquirido una secuencia de

localizacin nuclear NLS (Florkiewicz et al., 1991). Se originan mltiples isoformas del

FGF2, todas provenientes del mismo ARNm, por el uso alternativo de distintos inicios

de la traduccin en el extremo 3 del mensajero. La isoforma de 18kDa se sintetiza a

partir del codn AUG, a diferencia de las isoformas de mayor peso molecular (HMW:

21, 21.5 y 22kDa en rata) que se sintetizan a partir de los codones CUG upstream.

Todas las isoformas de alto peso molecular contienen la NLS en su extremo N-

terminal, lo que causa su acumulacin nuclear. Esta localizacin nuclear es ms

prominente en el nucleolo a pesar de que distribuye por todo el ncleo. Por el

contrario, el FGF2 18kDa, que no posee la NLS, presenta una localizacin

predominantemente citoplasmtica y es secretado al medio extracelular por

mecanismos independientes del aparato de Golgi, donde puede ejercer sus funciones

extracelulares a travs de los FGFR1-4 (Mohammadi et al., 2005c)

GFAP FGF2

GFAP FGF2

18 kD

21 kD

22 kD

18 kD

B

NUCCITC

22KD

21 kD

22 kD 21KD

18KD

39

Esquema

4.

Isoformas

del

bFGF

y

localizacin

subcelular

en

astrocitos. A, Diagrama mostrando laestructura polipeptdica con los sitios de inicio de transcripcin de las distintas isoformas del FGF2(Adaptado de Ornitz et al.); B, Inmunocitoqumica para la GFAP (verde) y FGF2 (rojo) mostrando lalocalizacin predominantemente nuclear de FGF2 en astrocitos primatios en cultivo, identificados porla deteccin de GFAP. C, Western Blot de fracciones nucleares y citoslicas de astrocitos. El FGF2de 18kD es exclusivamente citoslico y el ncleo est enriquecido en isoformas de alto pesomolecular.


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INTRODUCCIN

Las isoformas de alto peso molecular se expresan de manera especfica de tejido

detectndose in vivo en el cerebro y corazn entre otros tejidos y ejercen funciones

intracrinas en las clulas que los expresan. Su funcin es poco conocida pero parece

tener un papel en la regeneracin y la supervivencia de los tejidos en los que se

expresa, a travs de la interaccin con otras protenas como el factor antiapopttico

Api65 o factores de splicing como SMN ( survival of motoneurons) (Claus et al.,

2003;Gringel et al., 2004), lo que hace pensar que algunas de las funciones intracrinas

del FGF2 de alto peso molecular podran acontecer a travs de la regulacin del

splicingde diversos trnscritos.

3.3.3 Secrecin del FGF2

La mayora de factores solubles de origen pep

regulacion de la plasticidad astrocitaria

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