“regulaciÓn ige-mediada de la ciclooxigenasa-2 y la
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“REGULACIÓN IgE-MEDIADA DE
LA CICLOOXIGENASA-2 Y
LA INTERLEUQUINA-8
EN LEUCOCITOS HUMANOS”
TRABAJO DE INVESTIGACIÓN PRESENTADO
PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN BIOLOGÍA POR
PEDRO JOSÉ CHACÓN FERNÁNDEZ
SEVILLA 2005
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA
Y BIOLOGÍA MOLECULAR
D. Francisco Sobrino Beneyto, Catedrático del Departamento de Bioquímica Médica
y Biología Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sevilla y D.
Francisco J. Monteseirín Mateo, Doctor en Medicina y Cirugía y médico adjunto del
Servicio Regional de Inmunología y Alergia del Hospital Universitario Virgen Macarena
de Sevilla.
Certifican que:
Pedro José Chacón Fernández, licenciado en Biología, ha realizado bajo su
dirección el trabajo titulado “REGULACIÓN IgE-MEDIADA DE LA
CICLOOXIGENASA-2 Y LA INTERLEUQUINA-8 EN LEUCOCITOS HUMANOS”,
que reúne los méritos suficientes para optar al grado de Doctor.
Sevilla, 4 de abril de 2005.
Dr. Francisco Sobrino Beneyto. Dr. Francisco J. Monteseirín Mateo
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA
Y BIOLOGÍA MOLECULAR
FACULTAD DE MEDICINA
A mis padres, por estar siempre ahí.
A mi hermana, por su cariño y compresión.
AGRADECIMIENTOS
Al Doctor Francisco Sobrino Beneyto, por su ayuda, críticas y su dedicación
incondicional, que han hecho posible la culminación de este trabajo. Gracias Paco, por
contagiarme el espíritu investigador y por todos esos consejos científicos que me
dabas en los momentos en los que acudía a tu despacho con algún “problemilla”.
Al Doctor Francisco Javier Monteseirín Mateo por haberme permitido alcanzar una de
mis mayores ilusiones, por su colaboración y participación constante. Gracias por tus
explicaciones sobre alergia, sin las cuales no hubiera podido realizar este proyecto.
Al Doctor José Conde Hernández, jefe del Servicio de Alergia, por todo su apoyo.
Gracias a mis compañeros del laboratorio de Alergia, en especial a Antonio Vega
Rioja. En mis seis años en el laboratorio, lo hemos compartido todo, desde una pipeta
hasta un paquete de patatas. Juntos hemos pasado ratos de alegría, agobios y dudas.
Gracias porque sin ti, este trabajo no se habría hecho realidad. Gracias también a
María Jesús Camacho y a Inés Bonilla, mis primeras maestras en el laboratorio, a José
Luis Pérez y a Lourdes Fernández, “los buscadores de pacientes”. A Mercedes, Mónica,
Carmen, Pablo, Lorena, Inma, Adeli, José Manuel, Rocío, los residentes y todos
aquellos que pasaron y siguen por el laboratorio, por los buenos ratos que hemos
pasado juntos. Gracias a las enfermeras y auxiliares del Servicio de Alergia y de la
Unidad de Extracciones, en especial a Reme, Lola, Mercedes, Isabel, Coral y María.
A los profesores del Departamento de Bioquímica, Francisco J. Bedoya, Juan Jiménez
y Remedios Ramírez, con quien he participado en tantas comidas y reuniones, y en
especial a Elizabeth Pintado, por haberme ayudado a resolver mis dudas sobre
biología molecular.
A los que fueron y son compañeros del Departamento de Bioquímica, muy
especialmente a Rajaa El Bekay, mi confidente mientras estuviste y MI MAESTRA, en
mayúsculas. Tú me enseñaste que hay que ser “siempre positivo”. A Victoria Bonilla,
mi compañera de “batallas”, con la que he compartido cursos, células, reactivos y
hasta buenos y malos momentos. A Gonzalo Alba, “el pedazo de pan” del
Departamento, por los momentos de risa que hemos pasado juntos. A todos los
demás, Moisés, Karim, Juan, Gladis, Pilar, Raquel, Marga, Raquel Martínez y Nabil,
por todos los momentos que compartimos.
Al profesor José Martín Nieto, por su colaboración a la hora de corregir los trabajos.
A la gente de secretaría, Mari Carmen, Carmen y Joaquín.
Gracias a mis amigas Raquel del Toro y Margarita Cabrera, y especialmente a María
Ceballos, compañeras de facultad y en esta tarea investigadora, siempre dispuestas a
resolverme las dudas que me iban surgiendo con los experimentos.
A mis AMIGOS, Ángel, Mireya y Javi, por ser como son, por estar a mi lado y por
ofrecerme siempre su ayuda. Gracias por darme vuestra AMISTAD.
A toda mi familia, especialmente a mis tíos Paco y Chari, que me han ayudado de una
u otra manera.
Por último, agradezco a los pacientes, sin ellos realmente este trabajo no hubiera
visto la luz.
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 8
I. EL SISTEMA INMUNE. CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE. ................................. 3
I.1. LOS LINFOCITOS. ................................................................................ 3
a) Los linfocitos pequeños: linfocitos T y B. ............................................ 4
• Linfocitos T. ................................................................................ 4
• Linfocitos B................................................................................. 5
b) Los linfocitos grandes granulares: linfocitos NK. .................................. 6
I.2. LOS NEUTRÓFILOS............................................................................... 7
II. MECANISMOS DEL SISTEMA INMUNE: LOS PROCESOS ALÉRGICOS. ...............10
II.1. La alergia: un tipo de hipersensibilidad. ................................................10
II.2. La inmunoglobulina E. ........................................................................11
II.3. La cascada alérgica: desde la exposición al alergeno hasta la síntesis de
inmunoglobulina E; Papel fundamental de los linfocitos. .................................12
II.4. Receptores de IgE..............................................................................14
a) Receptor de alta afinidad, tipo I ó FcεRI. ..........................................14
b) Receptor de baja afinidad, tipo II, CD23 ó FcεRII...............................14
c) Receptor tipo III ó Galectina 3. ........................................................14
II.5) Activación celular dependiente de IgE: liberación de mediadores e
inflamación. .............................................................................................15
II.6) La alergia y los neutrófilos. .................................................................16
III. INTERMEDIARIOS DE SEÑALIZACIÓN Y VÍAS DE TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES.
................................................................................................................18
III.1. LAS ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO: CONCEPTO, FUNCIÓN Y
SÍNTESIS. ...............................................................................................18
a) El complejo NADPH-oxidasa.............................................................19
b) Otros sistemas productores de ROS..................................................20
III.2. EL CALCIO.......................................................................................20
III.3. PROTEÍNAS QUINASAS ACTIVADAS POR MITÓGENOS (MAPKs). ..............22
a) Activación de ERK MAPK. ................................................................24
b) Activación de p38 MAPK. ................................................................ 24
c) Activación de JNK MAPK. ................................................................ 25
III.4. CALMODULINA/CALCINEURINA. ......................................................... 25
III.5. El factor de transcripción NF-AT. ........................................................ 28
III.6. El factor de transcripción NF-κB. ........................................................ 30
IV. LAS CICLOOXIGENASAS. ........................................................................ 35
IV.1. La familia de las ciclooxigenasas......................................................... 35
IV.2. COX-1: del gen a la proteína. ............................................................. 36
IV.3. COX-2: del gen a la proteína. ............................................................. 36
IV.4. Variantes de la COX-1. La COX-3. ....................................................... 38
IV.5. Estructura de la COX-1 y COX-2. ........................................................ 38
IV.6. La síntesis de prostaglandinas. Catálisis ciclooxigenasa y peroxidasa........ 40
IV.7. Inhibición de la ciclooxigenasas. ......................................................... 43
IV.8. Regulación de la expesión de las ciclooxigenasas. ................................. 44
a) Regulación por sistemas de señalización dependientes de proteínas
quinasas. ............................................................................................. 45
b) Regulación a nivel transcripcional. ................................................... 45
c) Regulación a nivel post-transcripcional. ............................................ 47
IV.9. Papel fisiológico de los productos de las ciclooxigenasas........................ 48
IV.10. COX-2 en la alergia y otras patologías. .............................................. 49
a) COX-2 en la alergia. ...................................................................... 49
b) COX-2 en otras patologías. ............................................................. 51
V. QUIMIOQUINAS: IL-8. ............................................................................. 53
V.1. Las quimioquinas y sus receptores. Estructura y clasificación. .................. 53
V.2. La Interleuquina-8. Generalidades........................................................ 54
V.3. La interleuquina-8: del gen a la proteína............................................... 55
V.4. Regulación de la expresión de IL-8...................................................... 56
a) Regulación por intermediarios de señalización. .................................. 56
b) Regulación por sistemas de señalización dependientes de proteínas
quinasas. ..............................................................................................57
c) Regulación a nivel transcripcional. ....................................................57
d) Regulación a nivel post-transcripcional..............................................59
V.5. Funciones biológicas de la IL-8. ...........................................................59
V.6. IL-8 en la alergia y otras patologías. ....................................................61
a) IL-8 en la alergia ...........................................................................61
b) IL-8 en otras patologías ..................................................................61
OBJETIVOS..................................................................................................63
MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................67
I. MATERIALES Y REACTIVOS. .......................................................................69
II. MÉTODOS. .............................................................................................72
II.1. PACIENTES Y CONTROLES...................................................................72
a) Test in vivo (Test-cutáneo)..............................................................72
b) Test in vitro: determinación de los niveles séricos de IgE específica. .....74
c) Características de los sujetos en estudio. ..........................................75
II.2. OBTENCIÓN DE CÉLULAS A PARTIR DE SANGRE PERIFÉRICA. ..................76
a) Obtención de células mononucleares (linfocitos y monocitos). ..............76
b) Purificación de linfocitos (eliminación de monocitos residuales).............77
c) Obtención de subpoblaciones linfocitarias T, B y NK. ...........................78
d) Obtención de células granulocíticas. .................................................78
e) Purificación de neutrófilos (eliminación de eosinófilos residuales). .........80
II.3. CUANTIFICACIÓN DEL NÚMERO DE CÉLULAS Y DETERMINACIÓN DE LA
VIABILIDAD CELULAR................................................................................80
II.4. CULTIVO CELULAR. ............................................................................81
II.5. OBTENCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS ....................................81
a) Obtención de proteínas para el análisis de las ciclooxigenasas. .............81
b) Obtención de proteínas para el análisis de las MAPKs. .........................82
c) Cuantificación de proteínas..............................................................82
II.6. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR WESTERN-TRANSFERENCIA. .................... 84
a) Preparación de muestras. ............................................................... 84
b) Electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-
PAGE).................................................................................................. 84
c) Transferencia de proteínas a membranas de fluoruro de polivinilideno
(PVDF)................................................................................................. 85
d) Incubación de las membranas con anticuerpos. ................................. 85
e) Detección de bandas específicas por quimioluminiscencia.................... 86
f) Limpieza de una membrana de anticuerpos (“stripping”)..................... 87
II.7. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR INMUNOCITOQUÍMICA. ........................... 87
II.8. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR CITOMETRÍA DE FLUJO............................ 88
II.9. DISOCIACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS UNIDAS A SUPERFICIE CELULAR Y
DETERMINACIÓN DE IgE e IgG ESPECÍFICA “CELULAR”. ............................... 89
II.10. ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE ARN MENSAJEROS (ARNm) POR RT-PCR. ... 90
a) Obtención del ARN celular total. ...................................................... 90
b) Cuantificación de la concentración de ARN. ....................................... 91
c) Transcripción inversa del ARNm a ADN complementario (ADNc). .......... 91
d) Amplificación del ADNc por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
convencional......................................................................................... 92
e) Separación de los productos obtenidos por PCR convencional mediante
electroforesis en geles de agarosa. .......................................................... 93
f) Amplificación del ADNc por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
a tiempo real. ....................................................................................... 94
g) Cuantificación de la expresión génica a partir de la PCR a tiempo real. .. 95
II.11. MÉTODO DE ANÁLISIS DE ACTIVIDAD CALCINEURINA.......................... 96
a) Marcaje del péptido. ...................................................................... 96
b) Preparación de los extractos celulares. ............................................. 97
c) Incubación del extracto celular con el péptido marcado...................... 97
d) Cálculo de los resultados. ............................................................... 98
II.12.ANÁLISIS DEL CAMBIO EN LA MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA (EMSA:
ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAY)................................................98
a) Preparación de extractos nucleares...................................................98
b) Marcaje de los oligonucleótidos con γ 32P-ATP. ...................................99
c) Reacción de unión oligo-extracto nuclear, electroforesis y revelado. ....100
II.13. CUANTIFICACIÓN DE PROSTAGLANDINAS. ........................................101
II.14. CUANTIFICACIÓN DE CITOQUINAS...................................................102
II.15. ANÁLISIS ESTADÍSTICO..................................................................102
RESULTADOS Y DISCUSIONES ...................................................................103
INDUCCIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LA CICLOOXIGENASA-2 POR ALERGENOS EN
LINFOCITOS DE PACIENTES ALÉRGICOS.......................................................105
I. Inducción de la COX-2 por alergenos específicos en linfocitos humanos. ......106
II. Papel de la IgE en la inducción, mediada por alergenos, de la COX-2 por los
linfocitos humanos. .................................................................................108
III. La COX-2 inducida por un mecanismo IgE-dependiente se localiza en la zona
citosólica perinuclear. ..............................................................................111
IV. La inducción IgE-dependiente de la COX-2 tienen lugar principalmente a
través del receptor CD23 de los linfocitos humanos. ....................................111
V. Las subpoblaciones linfocitarias T, B y NK expresan la COX-2 tras estimulación
dependiente de IgE. ................................................................................113
VI. Análisis de la actividad enzimática de la COX-2 tras estimulación IgE-
dependiente...........................................................................................115
VII. Inducción del ARNm de la COX-2 por activación IgE-mediada..................117
VIII. Implicación de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) en la
inducción de la COX-2 por un mecanismo dependiente de IgE. ......................118
IX. Papel de otras proteínas quinasas en la inducción IgE-dependiente de la COX-
2 en linfocitos humanos. ..........................................................................123
X. Estudio de la participación de la vía de señalización calcineurina/factor de
transcripción NF-AT en la inducción IgE-dependiente de la COX-2 en linfocitos
humanos. ............................................................................................. 124
XI. Implicación del factor de transcripción NF-κB en la inducción IgE-dependiente
de la COX-2 por linfocitos humanos. ......................................................... 127
XII. Efecto de la inhibición de la COX-2 sobre la producción de las citoquinas IL-8
y TNF-α por los linfocitos humanos. .......................................................... 131
XIII. Modulación de la expresión IgE-dependiente de la COX-2 por fármacos
usados en el tratamiento de los procesos alérgicos...................................... 134
DISCUSIÓN........................................................................................... 137
LOS NEUTRÓFILOS HUMANOS PRODUCEN IL-8 POR ACTIVACIÓN IgE MEDIADA 147
I. Inducción de la producción de IL-8 por alergenos específicos en neutrófilos
humanos. ............................................................................................. 148
II. Papel de la IgE en la producción de IL-8 por los neutrófilos humanos. ....... 148
III. Inducción de la expresión del ARNm de la IL-8 por estimulación IgE-
dependiente. ......................................................................................... 154
IV. La producción IgE-dependiente de la IL-8 es dependiente de rutas activadas
por calcio y por especies reactivas de oxígeno. ........................................... 155
V. Implicación de la calcineurina en la producción IgE-dependiente de IL-8 por los
neutrófilos humanos. .............................................................................. 158
DISCUSIÓN........................................................................................... 161
CONCLUSIONES ........................................................................................ 167
BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................... .. 171
ABREVIATURAS ........................................................................................ 209
CURRÍCULUM VITAE ................................................................................. 213
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
3
I. EL SISTEMA INMUNE. CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE.
El sistema inmune de los vertebrados consiste en una serie de órganos y varios tipos
diferentes de células que han evolucionado para reconocer de modo específico las
sustancias que “le son extrañas” o antígenos, y así poder eliminarlas.
Las células del sistema inmune están presentes normalmente como células circulantes
en la sangre o en la linfa, como grupos anatómicamente definidos en los órganos y
tejidos linfoides o como células dispersas residentes en los tejidos. La disposición
anatómica de estas células y su capacidad para intercambiarse entre la sangre o la
linfa y los tejidos, es de especial importancia para que la respuesta inmune se
desempeñe de manera correcta. A groso modo las células del sistema inmune se
pueden dividir en tres grandes grupos: 1).- Los linfocitos (que reconocen y responden
de forma específica ante los antígenos extraños); 2).-Las células accesorias, que no
son específicas para los antígenos extraños, pero que contribuyen a que los linfocitos
reconozcan éstos y se activen, y entre las que se encuentran los macrófagos y las
células presentadoras de antígeno; 3).-Las células efectoras, que ayudan a los
linfocitos activados a desempeñar su función. Incluyen a los macrófagos y a los
granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos). También los linfocitos estimulados
por el antígeno pueden funcionar como células efectoras (Jerne, 1973).
I.1. LOS LINFOCITOS.
En un frotis sanguíneo, los linfocitos aparecen como células blancas muy
heterogéneas con un tamaño de 6-10 μm de diámetro y una morfología muy diversa
en cuanto a la relación núcleo/citoplasma (N/C), grado de tinción y presencia o
ausencia de gránulos azurófilos en su interior. En la circulación, mediante microscopía
óptica y utilizando una tinción hematológica, como el Giemsa, se pueden distinguir
dos tipos de células linfoides en reposo. Por un lado, los denominados linfocitos
pequeños, que presentan una relación N/C grande y no tienen gránulos azurófilos. Por
el otro los llamados linfocitos grandes granulares, que muestran una relación N/C más
baja y presentan gránulos azurófilos (figura 1). Tanto uno como otros, se producen
INTRODUCCIÓN
4
en los órganos linfoides primarios (timo y médula ósea) a un ritmo muy elevado (109
al día) y entre todas las células blancas circulantes del sistema inmune constituyen un
20%. Su vida media oscila entre días, meses e incluso varios años. (Esto último
ocurre con las llamadas células memoria) (Zucker-Franklin y col., 1980).
a) Los linfocitos pequeños: linfocitos T y B.
Linfocitos T.
Sus precursores se originan en la médula ósea y desde ésta salen inmaduros para
madurar y diferenciarse en el timo (de ahí su nombre, “T”, de timo). Constituyen el
60-65% de los linfocitos circulantes y funcionalmente se pueden dividir en dos
subclases, los linfocitos T colaboradores, cooperadores o “helper” (Th) y los linfocitos
T citotóxicos o citolíticos (Tc). Los primeros, tras estimulación antigénica, secretan
hormonas proteicas, citoquinas o interleuquinas (IL), cuya función es promover la
proliferación, diferenciación y activación de las células T y demás células inmunes. Los
segundos reconocen y lisan células infectadas por virus y otros microorganismos
intracelulares. Morfológicamente, todas las células T se caracterizan porque son
portadoras de una estructura citoplásmica denominada “Cuerpo de Gall”, que consiste
en una acumulación de lisosomas primarios que se encuentran asociados a una gotita
lipídica (Zucker-Franklin y col., 1980). Hasta un 20% de células Th y un 35% de
células Tc aparecen con aspecto granuloso, con lisosomas primarios dispersos por el
citoplasma, y un aparato de Golgi bien desarrollado. En preparaciones microscópicas,
no existen diferencias que permitan identificar los distintos subtipos de linfocitos T.
Figura. 1. Visualización al microscopio óptico de un linfocito pequeño (A) y un linfocito grande
granular (B).
B A
INTRODUCCIÓN
5
Para distinguirlos se usa el sistema de nomenclatura universal CD, basado en
marcadores de superficie celular que identifican a un tipo celular o un determinado
estado de diferenciación celular (Möller y col., 1983). Teniendo en cuenta esto, todos
los linfocitos T se distinguen porque presentan un marcador superficial característico,
el CD3, que es parte del receptor para antígenos del linfocito T ó TCR. Dentro de los
T, los Th se reconocen porque expresan la molécula CD4 y los Tc porque expresan la
CD8. La serie CD4+ se divide, funcionalmente, a su vez en Th1 y Th2, según el patrón
de citoquinas que secretan. Los Th1 secretan mayoritariamente IL-2, IFN-γ, TNF-α, e
IL-12. Los Th2 secretan en su mayoría, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10 (Mosmann y
col., 1986). Hay también quienes consideran los Th0, que secretan a la vez tanto las
citoquinas Th1 como las Th2. De forma similar, los CD8+ (Tc) son divididos en Tc1 y
Tc2 (Sad y col., 1995). Las células Tc1 producen citoquinas Th1 y las Tc2 citoquinas
Th2.
Si no se encuentran con el antígeno, los linfocitos T en reposo mueren en unos pocos
días o semanas, manteniéndose la población a un nivel estable por el desarrollo de
nuevas células a partir de los precursores de la médula ósea. En cambio, si se
produce contacto antigénico, los linfocitos T entran en un proceso denominado
transformación blástica, que las convierte en células efectoras. En este estado
aumentan de tamaño (10-12 μm) y adquieren un anillo más ancho de citoplasma,
más orgánulos y mayores cantidades de ARN. A nivel funcional, los cambios más
característicos son la expresión en su superficie de receptores para la IL-2 ó CD25,
receptores de transferrina ó CD71 y las moléculas CD69 y CD38.
Algunas de las estirpes de células T estimuladas por el antígeno no evolucionan hacia
células efectoras sino que se diferencian en células de memoria, muy poco conocidas
(Dutton y col., 1998).
Linfocitos B.
Sus precursores se originan en la médula ósea y es allí donde maduran y desde
donde salen ya maduros. (Su nombre se debe a que derivan de la médula ósea, “B”
INTRODUCCIÓN
6
del inglés: Bone marrow). Representan alrededor del 5-15% de los linfocitos
circulantes y se caracterizan morfológicamente por la ausencia tanto de cuerpo de
Gall como de aspecto granuloso. Sus citoplasmas se encuentran ocupados sobre todo
por ribosomas aislados y sólo ocasionalmente pueden encontrase formas activas, con
retículo endoplásmico rugoso en desarrollo (Zucker-Franklin y col., 1980). Se
caracterizan por la expresión constitutiva, en su membrana, de inmunoglobulinas,
que junto con otras moléculas de superficie, CD79a y CD79b (expresadas únicamente
en estos linfocitos) actúan como receptor específicos para el antígeno de la célula B
(BCR). También las moléculas CD19 y CD21, que constituyen el llamado correceptor
de la célula B y la molécula CD20 cuya función no se conoce con exactitud, sirven de
marcadores exclusivos para las células B.
Cuando los linfocitos B se encuentran con los antígenos, sufren el proceso de
transformación blástica: adquieren la capacidad efectora de secretar
inmunoglobulinas y expresan en su superficie nuevos marcadores. Por ejemplo,
receptores para citoquinas, como IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R e IL-6R, receptores para
la transferrina (CD71), aumento de moléculas del complejo mayor de
histocompatibilidad de clase II (MHCII) y expresión de CD69 y CD23. Algunas de
estas células B productoras de anticuerpos a menudo evolucionan hacia formas
especializadas denominadas células plasmáticas, que pueden diferenciarse por
presentar un núcleo excéntrico, citoplasma abundante con un retículo endoplásmico
rugoso denso y un gran aparato de Golgi. Estas células plasmáticas rara vez se
observan en circulación, ya que normalmente se encuentran en los órganos linfoides
secundarios (Viau y col., 2005).
De igual forma que los linfocitos T, algunas de los linfocitos B activados por antígeno
pueden evolucionar hasta células de memoria (Mackay, 1993).
b) Los linfocitos grandes granulares: linfocitos NK.
Constituyen la tercera población de los linfocitos totales y representan hasta el 20%
de los mismos. Bajo un criterio negativo se caracterizan por ser BCR-/TCR-, por lo que
también se conocen como células nulas. Sus precursores se originan en la médula
INTRODUCCIÓN
7
ósea y parece, aunque no se conoce bien, que maduran en el mismo lugar, pudiendo
acabar también su maduración en los tejidos. Morfológicamente, se caracterizan
porque presentan gran cantidad de gránulos azurófilos. Funcionalmente son los
encargados de matar células tumorales y células infectadas por virus, razón por la
que se conocen también como células agresoras naturales o NK (del inglés: Natural
Killer). Superficialmente son las únicas que expresan una serie de receptores
característicos denominados receptores KAR (del inglés, killer activatory receptors) y
receptores KIR (del inglés, killer inhibitory receptors), que están implicados en su
activación y desarrollo de su función (Gumpérez y col., 1995; Moretta y col., 2004).
Otro marcador superficial es el CD56 (molécula de adhesión a células nerviosas).
Como los linfocitos T, son capaces de secretar citoquinas, como el IFN-γ, el TNF-α y la
IL-1.
I.2. LOS NEUTRÓFILOS.
Constituyen el 65-75% del total de leucocitos sanguíneos y representan más del 90%
de los granulocitos circulantes. Derivan de la médula ósea y es allí donde se
desarrollan y maduran y desde donde salen al torrente sanguíneo, donde tienen una
vida media de 8-20 horas (Zucker-Franklin y col., 1980). Circulantes en la sangre son
capaces de migrar a los lugares donde se producen fenómenos de inflamación en
respuesta a factores atrayentes o quimiotácticos (tales como la IL-8, el factor del
complemento C5a o el leucotrieno B4) y allí llevan a cabo la fagocitosis de las
partículas extrañas (Lee y col., 2003).
Morfológicamente tienen un diámetro de 10–20 μm y se caracterizan porque
presentan un núcleo multilobulado (con 3-5 lóbulos normalmente, conectados con
finos puentes), visible al microscopio óptico con tinción de Giemsa (Figura 2). Por
esta razón se denominan también leucocitos polimorfonucleares. Además muestran
un citoplasma con un retículo endoplásmico muy pequeño, con pocas mitocondrias,
inclusiones de glucógeno y gran cantidad de gránulos que ocupan la totalidad del
citoplasma excepto la periferia de la membrana, donde existe una banda de
INTRODUCCIÓN
8
filamentos de actina, responsable de la capacidad quimiotáctica de estas células.
Estos gránulos prácticamente no se tiñen con las técnicas histológicas comunes de
eosina-hematoxilina y presentan distintas funciones en la defensa del huésped. Los
distintos gránulos que podemos encontrar en los neutrófilos son (Borregaard y col.,
1993; Faurschou y col., 2003):
Los gránulos primarios o azurófilos, que contienen una serie de enzimas tales
como, mieloperoxidasa (MPO), muraminidasa (lisozima), elastasa, proteínas
catiónicas e hidrolasas ácidas (eficaces a pH 5), todas dirigidas a potenciar la
digestión y la actividad microbicida de los macrófagos.
Los gránulos secundarios (o específicos), que contienen entre otras enzimas,
lisozima, lactoferrina, colagenasa y una proteína transportadora de la vitamina
B12, todas reguladoras de la inflamación.
Los gránulos terciarios, caracterizados por la presencia de gelatinasa y
emparentados con los lisosomas convencionales.
En superficie no expresan un marcador definitorio de linaje, pero sí gran cantidad de
moléculas, tales como receptores para la IgG (CD64, CD32 y CD16), receptor para la
IgA (CD81), moléculas de adhesión (CD11a/CD18 ó LFA-1, CD11c/CD18) o receptor
para el complemento, como el CD35. Su función es esencial como primera línea de
defensa del huésped contra gran variedad de patógenos, para lo cual desarrollan
numerosos procesos citotóxicos. Muchos de esos procesos están mediados por
interacciones específicas con otras células, como macrófagos o células endoteliales
(en lo que las intervienen las moléculas de adhesión), y/o por reconocimiento
específico de las partículas extrañas (en lo que intervienen los receptores para la IgG
y el complemento que unen partículas opsonizadas). Consecuencia de todo ello es la
activación de estas células y su consiguiente degranulación.
Cuando los neutrófilos se activan, además del liberar el contenido de los gránulos,
son capaces de producir, a través del llamado “estallido respiratorio”, especies
reactivas de oxígeno (ROS). Estos ROS, junto con a las proteasas granulares son
INTRODUCCIÓN
9
usados para eliminar los microorganismos y controlar la diseminación de las
enfermedades (Babior y col., 2002; Roos y col., 2003), y a veces pueden incluso
lesionar tejidos normales de la vecindad inmediata (Weiss, 1989). En cuanto a
citoquinas se refiere, los neutrófilos secretan mayoritariamente IL-8, aunque también
son capaces de sintetizar, entre otras, IL-1β, IL-12, VEGF, MIP-α/β e IP-10 (Scapini y
col., 2000).
Figura. 2. Visualización al microscopio óptico de un neutrófilo.
INTRODUCCIÓN
10
II. MECANISMOS DEL SISTEMA INMUNE: LOS PROCESOS ALÉRGICOS.
II.1. La alergia: un tipo de hipersensibilidad.
Aunque la alergia o atopia es una enfermedad descrita en el hombre a principios del
siglo XX, sus causas y mecanismos aún están en estudio. Afecta al 20% de la
población en los países industrializados y comprende un amplio abanico de afecciones
tales como la rinitis, el asma, la dermatitis atópica y las alergias alimentarias. En el
desarrollo del proceso alérgico intervienen factores genéticos y medioambientales,
pero sus conexiones internas y su prevalencia aún no están del todo dilucidadas.
Desde hace años se conoce que las reacciones alérgicas son causadas como
consecuencia de una reacción de hipersensibilidad. Así se denomina la respuesta
inmune que se produce de forma exagerada o inapropiada, causando fenómenos
inflamatorios y lesiones titulares. Aunque se han descrito cuatro tipos de cuadros de
hipersensibilidad, la hipersensibilidad de tipo I (que ocurre en los procesos alérgicos)
es la que se ha estudiado durante más tiempo.
Los individuos que sufren hipersensibilidad de tipo I se denominan alérgicos o
atópicos y se dice que sufren alergia. La hipersensibilidad de este tipo también se
denomina "inmediata", ya que aparece a los pocos minutos del contacto con la
sustancia extraña, que en este caso se denomina alergeno. Fuentes típicas de
alergenos incluyen, entre otros, ácaros, pólenes, mohos, epitelios animales, parásitos
y alimentos. Para la mayoría de los sujetos los alergenos son nocivos y sólo causan
enfermedad en los atópicos debido a la respuesta que en ellos provocan. En ocasiones
esta respuesta es exacerbada y descontrolada y se manifiesta a nivel sistémico. Se
habla entonces de anafilaxia generalizada o shock anafiláctico, y puede cursar con la
muerte del sujeto.
La expresión clínica de la alergia resulta de la culminación de una serie de eventos,
incluidos en dos fases. La primera fase o fase precoz engloba varias etapas:
Exposición al alergeno.
Producción de anticuerpos específicos para este alergeno.
INTRODUCCIÓN
11
Unión de las moléculas de IgE a la superficie de células efectoras.
Reexposición al alergeno.
Unión del alergeno a la IgE en la superficie de las células efectoras.
Producción de mediadores por parte de las células efectoras primarias.
La segunda fase o fase retardada, más prolongada, se caracteriza por la infiltración
del foco inflamatorio por células efectoras secundarias que van a liberar a su vez
otros mediadores inflamatorios secundarios (Standworth, 1973).
II.2. La inmunoglobulina E.
Estudios iniciales demostraron que las “sustancias” séricas implicadas en el
desencadenamiento de una respuesta alérgica correspondían a un isotipo específico
de inmunoglobulinas, a la que dieron el nombre de IgE. Ésta es una inmunoglobulina
de peso molecular de 196 kDa, un coeficiente de sedimentación de 8S y un alto
contenido de hidratos de carbono (12%). Está constituida por dos cadenas ligeras
(kappa o lambda) y dos pesadas (epsilon). Las cadenas pesadas se encuentran
formadas por una región variable V y cuatro dominios (CH1-CH4) constantes. Es
termolábil, no atraviesa la placenta y no fija complemento. En el suero circula como
anticuerpo divalente, tiene vida media de 2 días y medio y presenta niveles totales
menores de 200 ng/ml (1000 veces menor a la cantidad de IgG). En condiciones
patológicas, como la alergia, este valor puede aumentar hasta 300-600 ng/ml, e
incluso superiores. Ya que un gran número de sujetos alérgicos muestran un nivel
sérico de IgE elevado se podría pensar que la determinación del nivel sérico total de
la IgE se puede usar como marcador de enfermedad alérgica. Sin embargo el valor
predictivo de ello es limitado: por una parte hay enfermos con una IgE total en un
rango normal; por otra hay determinadas formas clínicas hiperreactivas (como la
parasitosis por helmintos) que también cursan con niveles elevados de IgE. Esto hace
que normalmente se estudie el nivel de IgE específica contra un determinado
alergeno, que sí es indicador de atopia (Ishizaka, 1988; Barranco-Sanz y col., 2004).
INTRODUCCIÓN
12
II.3. La cascada alérgica: desde la exposición al alergeno hasta la
síntesis de inmunoglobulina E; Papel fundamental de los linfocitos.
Cuando un alergeno entra en contacto con el organismo por vías aérea o cutánea, por
ejemplo, éste es captado por las células presentadoras de antígeno (CPA) como los
macrófagos y sobre todo las células de Langerhans y las células dendríticas foliculares
(Semper y col, 1996).
El alergeno pasa al citoplasma de la CPA por endocitosis y los lisosomas se encargan
de escindir sus cadenas polipeptídicas en péptidos sencillos, actividad denominada
procesamiento (Harding, 1996). Posteriormente la CPA migra a los ganglios linfáticos
regionales para que el antígeno exocitado y en el contexto del MHCII de la membrana
de la CPA, sea presentado a los linfocitos T (Krug y col., 1996). Estos linfocitos T
reconocen a través de su TCR a este alergeno y en respuesta a este reconocimiento
producen interleuquinas. Estas interleuquinas contribuyen a que los linfocitos B
maduren hasta células plasmáticas productoras de IgE específicas para ese alergeno.
De la población de linfocitos T, son los CD4+ (Th) los que más activamente participan
en los procesos atópicos, aunque también se ha visto participación de las células
CD8+. Los subtipos funcionales Th1 y Tc1 y los subtipos Th2 y Tc2 ejercen funciones
mutuamente antagonistas en la respuesta alérgica: las citoquinas Th1 (IL-2, IFN-γ,
TNF-α y linfotoxina), secretadas por los Th1 y Tc1, movilizan la defensa celular y
humoral contra patógenos intracelulares e inhiben la respuesta alérgica. Así, la IL-2 y
el IFN-γ suprimen la síntesis de IgE (Lack y col; 1994; Nakanishi y col, 1995). En
contraste, las citoquinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-6, IL-9 e IL-13), secretadas por los Th2 y
Tc2, coordinan la defensa contra patógenos extracelulares como helmintos y
controlan estrechamente las características de la atopia y el asma, especialmente la
síntesis de IgE (Robinson y col., 1992).
De todas las interleuquinas secretadas por los Th2 y Tc2, la IL-4 es la más importante
en la síntesis de IgE (Wills-Karp y col., 1996). Otra citoquina, íntimamente
relacionada con la IL-4 y también necesaria para la producción de la IgE, es la IL-13
INTRODUCCIÓN
13
(Punnonen y col., 1997). Esta última citoquina puede ser sintetizada, adicionalmente
a las células T, por las células NK (Hoshino y col., 1999). El hecho de que tanto la IL-
4 como la IL-13 sean requeridas para la producción de la IgE por las células B y a que
tengan efectos solapados se debe a que realizan su función a través de receptores
que comparten una estructura similar (Zurawski y col., 1993). Además de la IL-4 e
IL-13, las citoquinas IL-3, IL-5 e IL-9 producidas por los linfocitos activados
contribuyen a que la célula B madure a célula plasmática productora de IgE.
Junto a las citoquinas, la síntesis de IgE requiere de señales adicionales. Una de estas
señales es el contacto CD40-CD40 Ligando. CD40 es un antígeno expresado en la
superficie de los linfocitos B. Su unión con CD40 Ligando (o CD154) en la superficie
del linfocito T, potencia la síntesis de IgE y el crecimiento de la célula B (kawabe y
col., 1994). Otra señal es el contacto de CD80 y CD86 (o B7-1 y B7-2) en la
superficie del linfocito B con la molécula CD28 en el linfocito T. Esta interacción es
necesaria para la supervivencia del linfocito T y para la secreción de citoquinas
(Schartz, 1992; Yanagihara y col., 1998).
Una vez sintetizada por las los linfocitos B diferenciados hasta células plasmáticas, la
IgE difunde a los tejidos y al torrente sanguíneo y ejerce sus funciones en la
superficie de células efectoras (figura 3).
Figura 3. Cascada alérgica: exposición alergénica, síntesis de IgE y unión a célula efectora.
Procesamiento y presentación
Alergenos
MHC - TCR
APC
LINF. T
LINF. B
IgE
CÉLULA EFECTORA
Citoquinas
Procesamiento y presentación
Alergenos
MHC - TCR
APC
LINF. T
LINF. B
IgE
CÉLULA EFECTORA
Citoquinas
INTRODUCCIÓN
14
II.4. Receptores de IgE.
La IgE es capaz de unirse a la superficie celular por medio de receptores específicos.
Se han descrito tres tipos de receptores específicos para la IgE:
a) Receptor de alta afinidad, tipo I ó FcεRI.
Aunque esencial en los procesos celulares mediados por la IgE, el papel del receptor
de alta afinidad, FcεRI, en la regulación de los niveles séricos de la IgE parece
mínimo. Además, su entrecruzamiento aumenta su propia síntesis, lo que indica un
mecanismo de amplificación de los efectos biológicos de la IgE cuando el alergeno
está presente. Estructuralmente, cada molécula de FcεRI está constituida por cuatro
cadenas polipépticas, una α que une la IgE, otra β y dos γ, que transmiten la señal.
Aunque en un principio se pensaba que el receptor de alta afinidad aparecía
exclusivamente en basófilos y mastocitos, actualmente se sabe que se puede
encontrar en la superficie de las células de Langerhans epidermales, algunos
macrófagos dérmicos, algunos monocitos sanguíneos, eosinófilos activados y
neutrófilos (aMetzger y col., 1986; Novak y col., 2001; Soussi-Gounni, 1998).
b) Receptor de baja afinidad, tipo II, CD23 ó FcεRII.
El segundo tipo de receptor para la IgE fue identificado por su capacidad de unión en
células B humanas y líneas derivadas de células B y que corresponde con un antígeno
asociado con la diferenciación de estas células denominado CD23. Funcionalmente
regula la síntesis de IgE y puede intervenir en los procesos de activación celular.
Estructuralmente, CD23 es una proteína perteneciente a la superfamilia de las
lectinas tipo-C, que se puede expresar en células B, células T, células NK, monocitos,
células de Langerhans epidérmicas, neutrófilos, eosinófilos y plaquetas (Conrad y col.,
1990; Novak y col., 2001; Yamaoka y col., 1996).
c) Receptor tipo III ó Galectina 3.
El último receptor conocido para la IgE constituye un polipéptido perteneciente a la
familia de lectinas solubles o lectinas de tipo S. Presenta actividad intrínseca de unión
INTRODUCCIÓN
15
a galactosa y se corresponde con otros antígenos de la superficie celular
denominados Mac-2 o proteína de unión a IgE (εBP).
A diferencia de CD23 parece no intervenir en la regulación de la síntesis de IgE, pero
se cree que juega un papel importante en la activación celular. Galectina 3 se ha
encontrado en la superficie de linfocitos T activados, neutrófilos, mastocitos,
monocitos/macrófagos, células de Langerhans y queratinocitos (Liu, 1993; Joo y col.,
2001).
II.5) Activación celular dependiente de IgE: liberación de mediadores
e inflamación.
Cuando tras una segunda exposición antigénica la IgE ligada a los receptores de la
superficie celular “atrapa” a su correspondiente alergeno, se produce la activación de
estos receptores. Los receptores activados transmiten la señal para la liberación de
productos inflamatorios.
La reacción precoz alérgica está mediada por los mastocitos tisulares, que tras
activación a través del FcεRI por IgE, liberan una gran cantidad de mediadores. En los
sujetos alérgicos, por ejemplo, a los pocos minutos de una agresión antigénica se
observa un aumento del más del doble en el número de mastocitos del tejido en
cuestión, con características morfológicas de degranulación (bMetzger y col., 1986).
En la reacción tardía, en el lugar de la inflamación alérgica, se observa el
reclutamiento de otros leucocitos como neutrófilos, seguido de eosinófilos, basófilos,
linfocitos y monocitos. Este reclutamiento está iniciado por los efectos de los
productos liberados por los mastocitos, sobre las células del epitelio vascular. La
liberación de TNF-α, IL-4 e IL-13, por ejemplo, induce la producción de moléculas de
adhesión intercelular (E-selectinas, ICAM-1, VCAM-1), que se unen a las integrinas de
la membrana celular de los leucocitos como el MAC-1, posibilitando la migración
transendotelial de dichas células (Springer, 1990). A esta migración también
contribuyen factores quimiotácticos, como la interleuquina-5, por ejemplo, que es
quimiotáctica para los eosinófilos (O’Byrne y col., 1999).
INTRODUCCIÓN
16
En el caso del asma, el infiltrado celular se produce en las vías aéreas y a la
producción de estas citoquinas quimiotácticas, junto con otros mediadores, también
contribuyen las células epiteliales, endoteliales, musculares lisas y fibroblastos
bronquiales. Las células epiteliales, por ejemplo, son capaces de generar endotelinas,
bradiquinina, NO e interleuquinas (IL-6, IL-8, GM-CSF, TNF-α) que intervienen en la
migración de más leucocitos (Raeburn y col. 1994). Formando parte de la submucosa
aérea existe además un entramado de fibras y receptores nerviosos que asimismo
juegan un papel importante en el proceso inflamatorio. Las fibras aferentes
suministran información al sistema nervioso central sobre la respiración y la
broncotonicidad. Sus receptores de tipo sensorial amielínico son sensibles a los
mediadores liberados (histamina, bradiquinina…) y al ser estimulados por ellos liberan
péptidos activos como la sustancia P y la neuroquinina, mediadores que a su vez
favorecen la broncoconstricción (Barnes, 1996). También los receptores muscarínicos
son sensibles a estos mediadores, por ejemplo a la proteína mayor básica del
eosinófilo, y reaccionan dando broncoconstricción, aumento de la secreción de moco y
vasodilatación. La destrucción del epitelio con la secreción de factores de crecimiento
para las células epiteliales, fibras musculares lisas y fibroblastos, da como respuesta
una remodelación y regeneración de la mucosa. La afectación proteolítica de la
membrana basal va seguida de una deposición característica de depósito de fibras de
colágeno tipo III y IV (Cho y col., 1996). Todo ello conduce a una alteración
estructural de la vía aérea, que puede explicar una mayor hiperreactividad bronquial
observada en los sujetos asmáticos.
II.6) La alergia y los neutrófilos.
A pesar de que se reconoce la patología atópica como un proceso en el cual se induce
la liberación de mediadores y el acúmulo de células inflamatorias en el órgano de
choque, y de que varias de estas células inflamatorias (macrófagos, linfocitos,
mastocitos, basófilos, eosinófilos, neutrófilos y plaquetas) han demostrado estar
implicadas en la reacción alérgica, el papel desempeñado por cada una de ellas no
INTRODUCCIÓN
17
está del todo aclarado. Debido a la naturaleza crónica de los procesos alérgicos, los
leucocitos que persisten en los tejidos, especialmente eosinófilos y linfocitos, han sido
los más estudiados. Hasta hace poco tiempo se tenía una escasa noción del papel que
podía ejercer el neutrófilo en la reacción alérgica, una célula con un potencial
proinflamatorio y lesional importante y que se encuentra presente en el foco
inflamatorio alérgico. Sin embargo, existen fuertes evidencias experimentales de la
participación de los neutrófilos en los procesos alérgicos. Así, en el asma inducida por
alergenos o por ejercicio, los neutrófilos aumentan su actividad quimiotáctica y
expresan marcadores de activación (Lee y col., 1982; Nagy y col., 1982). En
pacientes asmáticos polínicos la exposición antigénica estacional se asocia con un
aumento de neutrófilos presentes en las biopsias bronquiales (Boulet y col., 1993) y
en asmáticos atópicos la estimulación endobronquial con alergenos produce un
aumento de la infiltración de estas células en la mucosa respiratoria (Montefort y col.,
1994). Por último, nuestro grupo ha demostrado un aumento en la producción de
radicales libres y calcio (Monteseirín y col., 1996; Monteseirín y col., 2002) así como
la liberación del contenido de los gránulos (mieloperoxidasa y elastasa) en neutrófilos
de sujetos alérgicos tras activación IgE-dependiente. (Monteseirín y col., 2001;
Monteseirín y col., 2003)
INTRODUCCIÓN
18
III. INTERMEDIARIOS DE SEÑALIZACIÓN Y VÍAS DE TRANSDUCCIÓN DE
SEÑALES.
Las células animales disponen de un elaborado sistema que les permite responder a
estímulos ambientales o estímulos que provienen de otras células. El sistema incluye
moléculas intermediarias de señalización y un gran número de proteínas que
constituyen vías o rutas que generan señales intracelulares. Entre los intermediarios
de señalización se destacan las especies reactivas de oxígeno y el calcio, y entre las
rutas de señalización intracelular sobresalen la de las MAPKs, la de la
calmodulina/calcineurina y los factores de transcripción NF-AT y NF-κB.
III.1. LAS ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO: CONCEPTO, FUNCIÓN Y
SÍNTESIS.
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) o radicales libres de oxígeno son formas de
oxígeno muy inestables que reaccionan con otras moléculas cediendo o recibiendo un
electrón. Se forman cuando el enlace covalente del oxígeno molecular se rompe
originando en los átomos electrones desapareados, que explican su alta reactividad.
Entre los ROS se encuentran el anión superóxido (O2.-), el peróxido de hidrógeno
(H2O2), el radical hidroxilo (.OH), el radical oxidrilo (.OH), el ión hipoclorito (OCl-) y el
oxígeno singlete (1O2).
Generalmente los ROS son considerados citotóxicos en la defensa inmune, porque
pueden causar daños oxidativos a los componentes celulares (Babior y col., 1973).
Sin embargo a bajas concentraciones pueden funcionar como mediadores fisiológicos
de las respuestas celulares, actuando como segundos mensajeros en las vías de
señalización celular (Forman y col., 2002; Finkel, 1998).
Todos los radicales libres sintetizados por los fagocitos tienen un precursor común, el
O2.-, que es sintetizado por reducción a partir del oxígeno molecular. Desde éste se
generan las demás especies reactivas. Así, por una reacción de dismutación
catalizada por la superóxido dismutasa (SOD), dos moléculas de O2.- son convertidas
en una molécula de H2O2 y otra de O2 (Fontecave y col., 1987). El H2O2 tiene un alto
INTRODUCCIÓN
19
potencial oxidante y reacciona con iones metálicos como el Fe2+ o el Cu1+, generando
a través de la química de Fenton, otros ROS muchos más reactivos como el radical
hidroxilo (OH-) o el radical oxidrilo (.OH) (Halliwell y col., 1992). Otra posibilidad es
que el H2O2 reaccione con el ión O2.- y origine, por la reacción de Haber-Weiss, .OH,
OH- y el oxígeno singlete (1O2) (Kehrer y col., 2000). También puede reaccionar con
el cloro produciendo hipoclorito (OCl–), en una reacción mediada por la
mieloperoxidasa (Hampton y col., 1998). El O2.- por su parte, reacciona con el óxido
nítrico (NO) producido por la NO-sintasa generando peroxinitrito (OONO-), un
intermediario de nitrógeno muy reactivo (Muijsers y col., 2000).
Un resumen de las reacciones de producción de los distintos radicales libres es
ilustrado en la figura 4.
Las células eucarióticas poseen mecanismos que controlan la producción de ROS y
sistemas que regulan su eliminación (Adler y col., 1999). Entre los sistemas
enzimáticos productores de ROS se encuentran:
a) El complejo NADPH-oxidasa.
Es el sistema más importante de producción de ROS de las células fagocíticas (Segal
y col. 1993; Babior y col., 2002; Roos y col., 2003). Actúa transfiriendo electrones
Figura. 4. Reacciones de producción de radicales libres.
O2 + e- O2.-
NADPH oxidasa
NAD(P)H oxidasa
Mitocondria
Xantina oxidasa...
O2.- + 2H+ H2O2 + O2
Superóxidodismutasa
D
H2O2 + Fe 2+ Fe 3+ + OH- + .OH Reacción de Fenton
O2.- + H2O2 OH- + .OH + 1O2
Reacción de Haber-Weiss
H2O2 + 2Cl- 2H+ + 2OCl-Mieloperoxidasa
O2.- + NO OONO-
O2 + e- O2.-
NADPH oxidasa
NAD(P)H oxidasa
Mitocondria
Xantina oxidasa...
O2 + e- O2.-
NADPH oxidasa
NAD(P)H oxidasa
Mitocondria
Xantina oxidasa...
O2.- + 2H+ H2O2 + O2
Superóxidodismutasa
DO2.- + 2H+ H2O2 + O2O2.- + 2H+ H2O2 + O2
Superóxidodismutasa
D
H2O2 + Fe 2+ Fe 3+ + OH- + .OH Reacción de Fenton
H2O2 + Fe 2+ Fe 3+ + OH- + .OH Reacción de Fenton
O2.- + H2O2 OH- + .OH + 1O2
Reacción de Haber-Weiss
O2.- + H2O2 OH- + .OH + 1O2
Reacción de Haber-Weiss
H2O2 + 2Cl- 2H+ + 2OCl-Mieloperoxidasa
H2O2 + 2Cl- 2H+ + 2OCl-Mieloperoxidasa
O2.- + NO OONO-O2.- + NO OONO-
INTRODUCCIÓN
20
desde el NADPH citoplásmico al oxígeno extracelular o intrafagosomal, generando O2..
En estado de reposo celular, el sistema está constituido por subunidades presentes en
las membranas de los gránulos y las vesículas secretoras (gp91phox y p22phox, que
forman el citocromo b558) y por subunidades citoplasmáticas (p47phox, p67phox,
p40phox). Cuando se produce la activación celular, ocurren los procesos de fusión de
vesículas y el citocromo b558 aparece sobre la superficie celular y la membrana de los
fagosomas. Simultáneamente, las subunidades citosólicas p47phox, p67phox, p40phox se
translocan a las membranas uniéndose al citocromo b558 y dando lugar a la forma
completa de la NADPH oxidasa. La translocación se facilita con la ayuda de pequeñas
proteínas de unión a GTP (Rac1, Rac2, Rap1). Tras su ensamblaje y activación la
NADPH oxidasa inicia la transferencia de electrones y la producción de O2.-.
Las células vasculares disponen de un sistema muy similar a éste como fuente de
ROS, que usa indistintamente tanto el NADPH como el NADH como donador de
electrones. Se denomina NAD(P)H oxidasa (Griendling y col., 2000).
b) Otros sistemas productores de ROS.
Además de la NADPH oxidasa, las células disponen de otros sistemas productores e
ROS, entre los que se encuentran, la cadena de transporte de electrones mitocondrial
la xantina oxidasa, el citocromo P-450 (Freeman, 1982), las monoamino oxidasas
(Jalkanen y col., 2001) y los sistemas conocidos genéricamente como Nox (Lambeth y
col., 2000).
III.2. EL CALCIO.
En las células del sistema inmune, como en la mayoría de las restantes células de
organismo, la señalización por calcio juega un papel muy importante en procesos tan
distintos como la homeostasis, la expresión génica o la apoptosis (Berridge y col.,
1998).
En células no excitables, la señalización por calcio se inicia con un aumento de los
niveles citoplásmicos a partir de los depósitos intracelulares. Este aumento
intracelular ocurre mayoritariamente a través de la ruta convencional de la fosfolipasa
INTRODUCCIÓN
21
C (normalmente β ó γ), que tras activación celular degrada el fosfatidilinositol 4,5
bifosfato (PIP2) hasta diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato (IP3). Esta última
molécula difunde por el citoplasma hasta las membranas del retículo endoplásmico
donde se acopla a receptores específicos (llamados receptores de IP3 ó IP3R), que se
activan y permiten la salida del calcio (Berridge, 1993). En los últimos años también
se viene apuntando a un papel de los receptores de rianodina (RyrR), activados por
ADP ribosa cíclica, y de los receptores activados por ácido nicotínico de adenina
dinucleótido fosfato (NAADPR), en la generación de los niveles intracelulares de
calcio, pero su participación y su papel exacto no se conocen (Lee y col., 2001).
El aumento de calcio intracelular está acoplado al influjo de calcio desde el exterior
tras la apertura de canales situados en la membrana plasmática. Mientras que el
aumento de calcio intracelular es sólo débil y sirve de “preludio”, el influjo de calcio
desde el exterior alcanza concentraciones mucho mayores y es el responsable de la
implicación del este ión en funciones tan diversas como el reconocimiento antigénico,
la expresión de citoquinas o la activación de la rutas intracelulares (como la de la
calmodulina/calcineurina, ver a continuación) en células B y T (Winslow y col., 2003;
Randriamampita y col., 2004), o la activación de la degranulación, la fagocitosis y la
apoptosis en granulocitos (Theander y col., 2002; Dewitt y col., 2002, Ayub y col.,
2004).
Los canales de calcio de la membrana plasmática responsables del influjo desde el
exterior pertenecen a la familia de los canales activados por depleción de los
depósitos intracelulares (SOC, del inglés store-operated channels). El canal SOC
mejor caracterizado a nivel funcional en células hematopoyéticas es el CRAC (del
inglés, Ca2+-released-activated Ca2+ channel) (Pakriya y col., 2003). No está
caracterizado a nivel molecular ni tampoco se conoce como se activa. Se postulan
tres ideas: a través de un mensajero intracelular denominado factor de influjo cálcico
(CIF), que difunde desde el retículo hasta la membrana plasmática y activa a los
canales CRAC; por medio de un cambio conformacional en los canales PI3R o en
INTRODUCCIÓN
22
alguna proteína del retículo que interacciona con los canales CRAC y los activa; o por
medio de vesículas de secreción que transportan los canales PI3R hasta la membrana
plasmática.
En los leucocitos otras estructuras pueden actuar como potenciales canales de calcio,
como ocurre con la anexinas, una familia de proteínas de unión a fosfolípidos que
pueden formar canales. Los linfocitos por ejemplo expresan la anexina V, cuya
función se desconoce (Kouric y col., 2000). Un esquema de los mecanismos que
controlan el movimiento del calcio celular se muestra en la figura 5.
III.3. PROTEÍNAS QUINASAS ACTIVADAS POR MITÓGENOS (MAPKs).
En mamíferos, el término general MAPK (del inglés mitogen-activated protein kinase)
comprende una superfamilia de proteínas quinasas con especificidad dual
serina/treonina (Ser/Thr)-quinasa que pueden ser activadas por una gran variedad de
estímulos. Su activación depende de la señal iniciada por receptores de factores de
crecimiento fosforilados en tirosina, de receptores de hormonas, de receptores
asociados a proteínas G o receptores de citoquinas inflamatorias. Además pueden ser
activadas por condiciones de estrés del entorno, como choque osmótico, irradiación o
Señal activadora
PIP2
DAGfosfolipasa C
?
cADPr
NAADP
?IP3
IP3R
¿NAADPR?
¿RyrR?
[Ca2+]i
CRAC
Ca2+Ca2+
Ca2+
Ca2+
Anne
xina
Retículo endoplasmático
Señal activadora
PIP2
DAGfosfolipasa C
?
cADPr
NAADP
?IP3
IP3R
¿NAADPR?
¿RyrR?
[Ca2+]i
CRAC
Ca2+Ca2+
Ca2+
Ca2+
Anne
xina
Retículo endoplasmático
Figura. 5. Esquema del movimiento del calcio en células no excitables.
INTRODUCCIÓN
23
lesiones en el ADN. La activación de las MAPKs en respuesta a estos estímulos
controla la expresión de genes, el metabolismo celular y funciones del citoesqueleto,
contribuyendo a la regulación de procesos celulares tan complejos como la migración,
mitogénesis, la diferenciación o la supervivencia celular. Estas MAPKs han sido
divididas en tres grandes grupos en función de los estímulos que inducen su
activación. Así por ejemplo, los factores de crecimiento o estímulos mitogénicos
promueven principalmente la activación de las quinasas ERK (del inglés, extracellular
signal-regulated kinase); mientras que, estímulos de estrés celular inducen la
activación de otras dos subfamilias, las p38 y las JNK/SAPK (c-jun NH2-terminal
kinase o stress-activated MAP Kinase) (Robinson y col., 1997; Johnson y col., 2002;
Kyosseva, 2004).
La activación de cada familia de MAPK se produce en forma de cascada (Dong y col.,
2002; Garrington y col. 1999). Dicha cascada está formada por tres módulos con
actividad quinasa, donde los miembros del módulo superior fosforilan y activan a los
miembros del módulo inferior. La especificidad de la respuesta de la MAPK viene dada
por la activación específica de determinados miembros de cada uno de estos módulos.
Estos módulos se esquematizan como MAPKKK-MAPKK-MAPK. De esta manera, el
tercer módulo, correspondiente a las familias ERK, p38 y JNK, serán fosforiladas y
activadas por un segundo módulo de MAPK quinasas (MAPKKs). Estas MAPKKs son
quinasas con especificidad dual y catalizan una doble fosforilación en tirosina y
treonina sobre las MAPKs necesaria para que éstas sean completamente activas. Por
otro lado, las MAPKKs serán fosforiladas y activadas por serina/treonina quinasas que
funcionan como MAPKK quinasas (MAPKKKs), el primer módulo. La regulación de
estas quinasas podría ser complicada por el gran número de combinaciones que
existen, pero no es así. Primero, las MAPKKs representan un número menor de
miembros que el de las MAPK. Segundo, las MAPKKs representan una alta
especificidad por sus sustratos MAPK, conduciendo a un mínimo de combinaciones en
los módulos MAPKK-MAPK. Tercero, las MAPKKKs presentan diferentes motivos de
regulación que los que presentan las MAPKK o MAPK. Por tanto, las MAPKKKs pueden
INTRODUCCIÓN
24
ser reguladas por una variedad de proteínas específicas activadas en respuesta a los
diferentes estímulos extracelulares. Por último, la regulación de la cascada MAPKKK-
MAPKK-MAPK dependerá de su interacción con unas proteínas adaptadoras
denominadas “scaffolding”. El papel de estas proteínas consiste en aumentar la
concentración local de las proteínas quinasas y sus sustratos específicos (Morrison y
col., 2003).
a) Activación de ERK MAPK.
La cascada de activación de ERK es la que ha sido más extensamente estudiada, ya
que se activa bajo el estímulo de numeroso agentes mitogénicos. ERK-1 y ERK-2,
conocidas también como p-44 y p-42 MAPK, son los primeros miembros que se
conocieron de esta subfamilia. Actualmente se sabe que existen al menos 6 miembros
más (ERK3-ERK-8) (Bogoyevitch y col., 2004). El segundo módulo de activación
(MAPKK) está compuesto por los miembros de la familia MEK: MEK-1 y MEK-2. De
todos los posibles estimuladores de MEK que se conocen, las isoformas Raf, Rac y
Mos, son quizás las únicas capaces de fosforilar a este segundo módulo. Una vez
activas, ERK 1/2 son capaces de fosforilar y regular numerosas proteínas, entre las
que se encuentran las quinasas RsK, MNK 1/2 ,MAPKAP-K2 y-3, proteínas citosólicas
como la PLA2 (fosfolipasa A2), el coactivador SRC-1 o los factores de transcripción C-
Fos, C-Jun, ATF-2 o ELK-1 (Roux y col., 2004; Rubinfeld y col., 2004) (figura 6).
b) Activación de p38 MAPK.
Este subgrupo de MAPKs comprende cuatro miembros de Ser/Thr quinasas de 38
KDa, de ahí su nombre. Estas isoformas se conocen como p38α, p38β, p38γ y p38δ.
Se activan fuertemente por condiciones de estrés en el entorno celular y/o citoquinas
inflamatorias, aunque también se ha descrito su activación por insulina o factores de
crecimiento. En este caso, el módulo MAPKKK lo comprenden miembros de la familia
MEKK (MEKK 1-4), de la familia ASK y de la familia TAK. Las isoformas MKK-3
(también MEK3 ó SKK2) y MKK-6 (MEK6 o SKK3) de la familia MEKK, son
mayoritariamente las componentes del módulo MAPKK y las responsables de la
INTRODUCCIÓN
25
fosforilación de p38. Por último, los principales sustratos de las p38 MAPK son las
quinasas MAPKAP-K2 y-3, PRAK, MNK 1/2 y MSK y los factores de transcripción ELK-
1, NFAT2 y ATF-2 (Roux y col., 2004; Kyriakis y col., 2001) (figura 6).
c) Activación de JNK MAPK.
Las quinasas JNK, también conocidas como SAPK, representan el tercer grupo de
MAPKs que han sido identificadas en mamíferos. Existen unas diez isoformas
diferentes de JNK, de entre 46-54 KDa. La cascada de señalización de la vía JNK
empieza con el primer módulo MAPKKK, que lo comprenden miembros de las familias
MEKK, ASK y TAK, al igual que en la vía p38 MAPK y otros miembros de la familias
MLK y tpl-2. Al segundo módulo MAPKK pertenecen las isoformas MKK4 y MKK7.
Entre los sustratos de JNK se encuentran proteínas que regulan los procesos de
apoptosis y muerte celular, como p53 y Bcl-2 y factores de transcripción como ATF-2,
ELK-1 y C-Jun (Kyriakis y col., 2001) (figura 6).
III.4. CALMODULINA/CALCINEURINA.
La calmodulina (CaM) es una proteína de 17 KDa de expresión ubicua, que actúa
como sensor de los niveles de calcio en las células eucarióticas. Presenta una
estructura globular, con dos subunidades, cada una de las cuales presenta dos
Figura. 6. Cascada de activación de las ERK, p38 y JNK MAPKs.
Raf Mos
MEK-1 MEK-2
ERK
Rsk
MNK 1/2
SRC-1
MAPKAP-K2/3
PLA2 C-Jun
C-Fos
ELK-1
ATF-2
MKK3 MKK4 MKK6
p38
ASK MEKK TAK
MAPKAP-K2/3
PRAK
MNK 1/2
MSK
ELK-1
NFAT2
ATF2
ASK MEKK TAK MLK tpl-2
p53
Bcl-2
ELK-1
C-Jun
ATF2
MKK4 MKK7
JNK
MAPKKK
MAPKK
MAPK
ERK ERK MAPKsMAPKs p38 p38 MAPKsMAPKs JNK JNK MAPKsMAPKs
Raf Mos
MEK-1 MEK-2
ERK
Rsk
MNK 1/2
SRC-1
MAPKAP-K2/3
PLA2 C-Jun
C-Fos
ELK-1
ATF-2
MKK3 MKK4 MKK6
p38
ASK MEKK TAK
MAPKAP-K2/3
PRAK
MNK 1/2
MSK
ELK-1
NFAT2
ATF2
ASK MEKK TAK MLK tpl-2
p53
Bcl-2
ELK-1
C-Jun
ATF2
MKK4 MKK7
JNK
MAPKKK
MAPKK
MAPK
ERK ERK MAPKsMAPKs p38 p38 MAPKsMAPKs JNK JNK MAPKsMAPKs
INTRODUCCIÓN
26
dominios tipo factor de crecimiento epidérmico (EF) de unión a calcio. La calmodulina
tiene por tanto 4 sitios de unión al calcio, y de éstos al menos 3 deben estar
ocupados por el ión para que el enzima sea catalíticamente activo. La calmodulina
una vez activa interviene en muchas rutas de señalización, activando a su vez la
función de varias quinasas (las calmodulinas-quinasas I y II, la quinasa de la cadena
ligera de miosina), fosfatasas (calcineurina), canales iónicos y otros enzimas
citosólicos, tales como la fosfodiesterasa, la adenilato ciclasa y la óxido nítrico sintasa
(Crivici y col., 1995).
La calcineurina (CaN), también conocida como fosfatasa 2B (PP2B), es una
serina/treonina fosfatasa altamente conservada y dependiente del calcio celular y del
enzima calmodulina (Klee, 1998; Aramburu J, 2000). Está ubicuamente expresada y
se presenta en forma heterodimérica con dos subunidades: una de 59 kDa,
denominada calcineurina A (CaN-A), con isoformas (CaN-Aα, CaN-Aβ y CaN-Aγ,
respectivamente), y una de 19 KDa denominada calcineurina B (CaN-B), con dos
isoformas (CaN-B1, CaN-B2). La CaN-A, que es la subunidad catalítica, presenta un
dominio catalítico, un dominio de unión a CaN-B, un dominio de unión a CaM y un
dominio carboxilo terminal con actividad autoinhibitoria. La CaN-B, que es la
subunidad reguladora, presenta cuatro dominios EF de unión al calcio. Un esquema de
la estructura y activación del enzima se muestra en la figura 7. En condiciones
basales, la subunidad CaN-A es inestable e inactiva debido a la función de
autoinhibición del dominio carboxilo terminal. La unión de la subunidad CaN-B (ligada
a calcio) estabiliza a la subunidad catalítica, que sigue siendo inactiva. La llegada la
CaM (unida también al Ca2+) al sitio de unión en la subunidad catalítica permite un
cambio conformacional que conlleva la activación del enzima.
La función de la CaN en las rutas de transmisión de señales celular fue establecida
estudiando cuál era la diana molecular de una serie de drogas, como la ciclosporina A
(CsA) y el tacrolimo (FK506) (Liu y col., 1991; Ho y col., 1996; Ruhlmann y col.,
1997). Estos productos microbianos cruzan la membrana celular y se unen a
INTRODUCCIÓN
27
proteínas intracelulares denominadas inmunofilinas, que incluyen las ciclofilinas (Cyp)
y la proteína de unión 12 (FKB12). La unión inmunosupresor-inmunofilina es de alta
afinidad y da lugar a la formación de complejos nuevos, CsA-ciclofilina y FK506-
FKBP12. Las inmunofilinas son proteínas abundantes presentes en muchos tipos
celulares, que se creen participan en plegamientos proteicos y en el transporte
intracelular similar a las chaperoninas. Sólo una pequeña fracción del contenido
celular de inmunofilinas queda ocupada con las drogas y sin embargo se consigue
inmunosupresión. Esto es debido a que los complejos formados entre CsA-ciclofilina y
FK506-FKB12 adquieren nuevas propiedades, como es el de poder unirse e inhibir
competitivamente la actividad fosfatasa de la CaN. Se ha demostrado que los sitios de
unión para estos complejos sobre la CaN no son idénticos pero están solapados
(Cárdenas y col., 1995).
Hasta la fecha se han descrito 4 inhibidores naturales de la calcineurina, la proteína
adaptadora “scafolding” Akap79, que impide su acceso a los sustratos (klauck y col.,
1996), la proteína Cabin-1, que directamente bloquea la actividad calcineurina (Sun y
col., 1998); la proteína CHP, que es homóloga a la subunidad B de la calcineurina y
Inactiva, inestable
CaN-ACaN-B + Ca2+ CaM + Ca2+
Inactiva Activa
abierta
CaN-A
CaN-B
Dominio catalítico
Unión a
CaN-B
Unión a
CaM
Dominio autoinhibitorio
4 dominios EF
ESTRUCTURA
ACTIVACIÓN E INHIBICIÓN
Inmunofilinas
(Cyp, FKBP12)
Inmunosupresores
(CsA, FK506)
+ Inhibición
Inactiva, inestable
CaN-ACaN-B + Ca2+ CaM + Ca2+
Inactiva Activa
abierta
CaN-A
CaN-B
Dominio catalítico
Unión a
CaN-B
Unión a
CaM
Dominio autoinhibitorio
4 dominios EF
CaN-A
CaN-B
Dominio catalítico
Unión a
CaN-B
Unión a
CaM
Dominio autoinhibitorio
4 dominios EF
ESTRUCTURA
ACTIVACIÓN E INHIBICIÓN
Inmunofilinas
(Cyp, FKBP12)
Inmunosupresores
(CsA, FK506)
+ Inhibición
Fig. 7. Estructura y activación de la fosfatasa 2B/calcineurina.
INTRODUCCIÓN
28
que se une a la subunidad A e impide que ésta se active (Lin y col., 1999) y la DSCR1
o calcipresina 1, que interacciona con la subunidad A (Genesca, 2003).
III.5. El factor de transcripción NF-AT.
NF-AT es una familia de factores de transcripción descritos inicialmente en células del
sistema inmune, integrada por al menos 5 miembros, 4 de los cuales (NF-AT 1-4), se
expresan en el citoplasma de células en reposo, mientras que el quinto miembro,
NFAT5, se caracteriza por presentar una localización constitutivamente nuclear
(López-Rodríguez y col, 1999; Rao y col., 1997; Crabtree y col., 2002) Los distintos
NF-ATs, excluyendo NF-AT5, son proteínas que presentan gran homología entre sí,
con dos dominios conservados: uno de unión al ADN (DNA binding domain, “DBD”), y
otro denominado región homóloga para NF-AT (NF-AT homology region,“NHR”). Este
último contiene una (en NF-AT1 y NF-AT3) o dos (en NF-AT2 y NF-AT4) secuencias
consenso PxIxIT de unión a la fosfatasa CaN y un gran número de residuos de serinas
distribuidos en 4 motivos (SRR-1, SPxx, SRR-2 y KTS), entre los cuales se sitúa una
señal de localización nuclear (NLS). Además de estos dominios, NF-AT 1-4 disponen
de dos dominios de transactivación, uno en el extremo carboxilo y otro en el amino.
Por su parte, NF-AT5, tiene una DBD análoga a la que presentan los otros miembros
pero no tiene secuencia de unión a la calcineurina. En su lugar, presenta una
secuencia NLS, que le confiere su presencia nuclear constitutiva.
Funcionalmente, NF-AT juega un papel fundamental en la inducción de la
transcripción de algunos genes de interleuquinas como el de la IL-2, IL-4, TNF-α, GM-
CSF, IL-3 ó IL-5. Dado el papel central de estas citoquinas en el control y desarrollo
del sistema inmune, es comprensible que la inhibición de NF-AT, tenga efectos que
conduzca a situaciones de inmunosupresión (Hogan y col., 2003).
La activación de NF-AT requiere de señales iniciadas por el influjo de Ca2+ y está
regulada por la acción de la CaN. De esta forma, en estado de reposo, NF-AT está
altamente fosforilado en los residuos de serina de los 4 motivos del dominio NHR.
Esta fosforilación enmascara la señal NLS, por lo que NF-AT se localiza en el
INTRODUCCIÓN
29
citoplasma. La movilización de calcio a través de receptores CRAC conduce a una
activación de la CaN que desfosforila 3 de los 4 motivos del dominio NHR (todos
menos SRR-2). Esta desfosforilación permite un cambio conformacional que lleva a la
exposición de la secuencia NLS y la consiguiente translocación del complejo CaN-NF-
AT al núcleo. En este transporte se ha postulado que interviene el transportador
Rch1. En el núcleo es capaz de interaccionar con otros factores de transcripción como
AP-1, c-Maf, ICER, p21SNFT, GATA, EGR, Oct, HNF3, IRF-4 y MEF-2, y con ellos se
une a elementos específicos en el ADN, activando la transcripción génica (Hogan y
col., 2003; Grabtree y col., 2002). Como ocurre con otros factores de transcripción la
actividad transcripcional de NF-AT puede ser regulada por modificación de sus dos
dominios de transactivación. Aunque este aspecto no se ha estudiado a fondo, parece
que las quinasas Cot/tpl-2 y Pim1 son capaces de potenciar la transactivación de NF-
AT1 y NF-AT2 (de Gregorio y col., 2001; Rainio y col., 2002).
Una vez en el núcleo, NF-AT necesita una estancia sostenida para transactivar los
genes que regula. Dicha estancia en el núcleo viene determinada fundamentalmente
por la duración de la elevación de los niveles de Ca2+ intracelular. Por otro lado,
también está condicionada por la activación de determinadas quinasas que
promueven su refosforilación. Entre estas quinasas se ha descrito la implicación de la
GSK-3 (Beals y col. 1997), que fosforila los motivos SPxx y para lo que requiere de la
acción de la PKA (Sheridan y col., 2002). Otras quinasas que también participan son
la CK1α (Zhu y col., 1998), la MEKK1 y JNK1 (Chow y col., 1997) y la p38 MAPK
(Gómez del Arco y col., 2000).
Posiblemente, los residuos de serina que son refosforilados necesiten volver a su
conformación inicial y en esto se ha sugerido que interviene la peptidil propil
isomerasa Pin-1 (Liu y col., 2001). Tampoco está claro si el NF-AT refosforilado
expone una señal de exporte desde el núcleo (NES), como se sugiere para NF-AT2
(Kleem y col., 1997) o si esta función es conferida por proteínas tales como la 14.3.3,
como se sugiere para NF-AT3 (Chow y col., 2000). Sea un caso u otro, parece que en
INTRODUCCIÓN
30
la exportación está implicado el intercambiador CRM1 (Zhu y col., 1999). Un esquema
general de activación de NF-AT es ilustrado en la figura 8.
Aunque generalmente se piensa que NF-AT activa la transcripción de genes,
recientemente se ha descrito que NF-AT puede también reprimirlos o silenciarlos,
como ocurre con el gen cdk4 (Im y col., 2004). En este caso se piensa que NF-AT
interacciona con las histonas desacetilasas.
III.6. El factor de transcripción NF-κB.
Fue identificado inicialmente como un factor nuclear implicado en la expresión del gen
de la cadena ligera de las inmunoglobulinas, de ahí su nombre. Estructuralmente NF-
κB es un complejo homo o heterodimérico, que puede estar compuesto por varias
subunidades proteicas denominadas p50, p65, p52, c-Rel y RelB. Estas subunidades
presentan la particularidad de compartir en el extremo N-terminal una región de
unión al ADN altamente conservada denominada dominio de homología a la proteína
viral v-rel (RHD) responsable de la unión al ADN y de la dimerización. También esta
CaN B
NLS
COOH
NH2
DBD
NLS
P P P PPPPP
CaN ACaMCa 2+ +
NLS
COOH
NH2
DBD
NLS
P P P PPPPP
CaN A
CaMCaN B
COOH
NH2DBD
NLS
PP
CaN A
CaMCaN B
NH
2
COOHDBD
NLS
P
P
CaN
A
CaM
CaN
B
¿CRM1?¿CRM1? ¿RCH1?¿RCH1?
CaN B
NLS
COOH
NH2
DBD
NLS
P P P PPPPP
CaN A
AP-1
QUINASASQUINASAS¿GSK-3?
¿p38?
CK-1 α
MEKK-1
NF-AT
CaN
CITOPLASMA
NÚCLEO
NH2
CaN B
NLS
COOH
NH2
DBD
NLS
P P P PPPPP
CaN A
CaN B
NLS
COOH
NH2
DBD
NLS
PP PP PP PPPPPPPPPP
CaN ACaMCaMCa 2+ +
NLS
COOH
NH2
DBD
NLS
P P P PPPPP NLS
COOH
NH2
DBD
NLS
PP PP PP PPPPPPPPPP
CaN A
CaMCaMCaN B
COOH
NH2DBD
NLS
NLS
PPPP
CaN A
CaMCaMCaN B
NH
2
COOHDBD
NLS
NLS
PP
PP
CaN
A
CaM
CaM
CaN
B
¿CRM1?¿CRM1? ¿RCH1?¿RCH1?
CaN B
NLS
COOH
NH2
DBD
NLS
PP PP PP PPPPPPPPPP
CaN A
AP-1
QUINASASQUINASAS¿GSK-3?
¿p38?
CK-1 α
MEKK-1
NF-AT
CaN
CITOPLASMA
NÚCLEO
NH2
Figura. 8. Activación del factor de transcripción NF-AT.
INTRODUCCIÓN
31
región permite la localización en el núcleo debido a que en ella se encuentra una
secuencia NLS de localización nuclear (Ghosh y col., 1998; Hayden y col., 2004).
Mientras que las subunidades p65, c-Rel y RelB se sintetizan como tales, las
subunidades p50 y p52 se originan como grandes proteinas precursoras (p105 y
p100, respectivamente). p50 se origina por procesamiento constitutivo a partir de
p105 y p52 se forma a partir de p100 en un complejo proceso que implica pasos de
fosforilación y ubiquitinización (Amir y col., 2004). La subunidades p65, c-Rel y RelB
son activas transcripcionalmente debido a que contienen un dominio de
transactivación (TAD) en su extremo C-terminal, y de todas ellas p65 es
particularmente activa, ya que contiene dos dominios TADs. A diferencia de las
anteriores, p50 y p52 son transcripcionalmente inactivas y los dímeros p50/p50 ó
p52/p52 reprimen la transcripción génica (Ghosh y col., 2002). Sin embargo estas
subunidades pueden inducir la transcripción génica formando dímeros con p65, c-Rel
y RelB. De todos los dímeros posibles, el conjunto p65/p50 suele ser el más
abundante y el prototípico.
NF-κB es un factor de transcripción altamente regulado. Así sus subunidades
aparecen retenidas en el citoplasma celular por proteínas de la familia I-κB (proteínas
inhibidoras de κ-B), con 7 miembros, denominados I-κBα, I-κBβ, I-κBε, I-κBγ, I-κBNS y
los precursores p100 y p105 (Ghosh y col., 1998). Las proteínas Iκ-B inhiben a NF-κB
porque se unen al dominio RHD enmascarando la secuencia NLS. La proteína I-κBβ
enmascara la secuencia NLS de p65 y de p50, mientras que IκB-α sólo es capaz de
enmascarar la señal NLS de p65, pero no de p50. Además, IκB-α contiene una
secuencia de exportación desde el núcleo (NES). Esos hechos sugieren que mientras
que I-κBβ sólo aparece en el citosol, IκB-α pueda encontrarse en el núcleo formando
complejos NF-κB/IκBα.
Clásicamente, la “activación canónica” de NF-κB, en respuesta a citoquinas
proinflamatorias, mitógenos o proteínas virales, conlleva un punto crítico: la
activación del llamado complejo quinasa de Iκ-B (IKK), que fosforila a I-κB en
INTRODUCCIÓN
32
residuos de serina (Ghosh y col., 2002). I-κB fosforilada es reconocida por la proteína
β-TrCp, que la acopla a una ubiquitina ligasa específica perteneciente a la familia SCF,
para que ésta lleve a cabo su poliubiquitinización en residuos de lisina (Ben-Neriah,
2002). Una vez ubiquitinado, I-κB es degradado por la subunidad 26S del
proteasoma. De esta forma, NF-κB libre se puede translocar al núcleo, unirse a
elementos específicos en el ADN, y activar la transcripción génica. El complejo IKK
está constituido por tres subunidades asociadas íntimamente, dos de ellas catalíticas
IKK-α e IKK-β, y otra reguladora, NEMO. La activación de ambas IKK depende de su
capacidad para dimerizar y de que sean fosforiladas en serina. De las tres
subunidades, IKK-β y NEMO parecen ser esenciales para el funcionamiento del
complejo (Israel, 2000). La función de IKKα en este modelo no está completamente
aclarada; sólo se conoce que a diferencia de IKKβ que es exclusivamente citosólica,
IKKα puede ser reclutada hasta el núcleo en regiones promotoras de genes
regulados por NF-κB, para fosforilar, junto a otras proteínas como RSK1, MSK1 o
MSKL, a la histona H3 y contribuir a la expresión génica (Yamamoto y col., 2003).
Con respecto a las quinasas que fosforilan “corriente arriba” a IKK, varios trabajos
han señalado la importancia de la familia MAPKKK. En este sentido se ha descrito la
posible participación de NIK, MEKK1, MEKK3 y Cot/tpl-2. También se han implicado a
las quinasas PKC ξ y TAK1 (Schmitz y col., 2004).
Aparte de lo comentado hasta ahora, la actividad NF-κB se regula también a nivel
transcripcional, por fosforilación de p65 en la región RHD y los dominios de
transactivación. De esta manera, p65 puede ser fosforilado en residuos de serina por
multitud de quinasas, entre las que se encuentran la PKA, la CKII, la GSK-3, la PKCξ,
la MSK1, la CaMK IV o el complejo TBK/KAK. Recientemente también se ha señalado
que p65 es fosforilada por una quinasa desconocida en un residuo de treonina. Esta
fosforilación se supone que regula la estabilidad de p65. Así la p65 fosforilada en
treonina se asocia con el enzima peptidil propil isomerasa Pin-1, que isomeriza los
residuos de serina y treonina fosforilados que preceden a una prolina. Pin-1 estabiliza
INTRODUCCIÓN
33
p65 regulando negativamente a SOCS-1, una proteína capaz de ubiquitinar p65 para
que sea degradado en el proteasoma. Además, Pin-1 impide que se una con Ik-Bα y
potencia su localización nuclear (Schmitz y col., 2004).
p65 una vez fosforilada es capaz de reclutar al coactivador CBP/p300, ser acetilada y
de esta forma potenciar la transcripción (Ghosh y col., 2004). También se ha descrito
que p65 acetilada disminuye su afinidad por I-κBα. Un esquema general de activación
de NF-κB es ilustrado en la figura 9.
En lo se refiere a la terminación de la activación de NF-κB, se ha descrito que Iκ-Bα
juega un papel importante. De esta forma, I-κBα, se sintetiza tras la activación de
NF-κB, en un proceso de retroalimentación negativa, ya que su gen está regulado por
el mismo factor de transcripción que reprime. Una vez que cesa la señal activadora,
Figura. 9. Activación del factor de transcripción NF-κB.
cBP/P300
Señal activadora
¿ NIK, MEKK1, MEKK3, Cot/tpl-2, PKC ξ , TAK1 ?
IKKα IKKβ
NEMOP
CITOPLASMA
NÚCLEO
IKKα IKKβ
NEMOP P
PP
p50
I-κBβ
p65p50
I-κBβ
PP
P
P
p65
p65p50
I-κBβ
PP
P
β-Trcp
SCF Ub. ligasa
p65p50
I-κBβP
P
P
Proteasoma
26S
NLS
p50 p65
I-κBβ
P
¿ PKA, CKII, CaMKIV, GSK·3
MSK1,PKCξ,TBK/KAK ?
NLS
p50 p65
P P
P
NLS
p50 p65
P P
P
Pin-1
NLS
p50 p65
PP
P
NLS
p50 p65
PP
P
cBP/P300
NLS
p50 p65
PP
PAcAc
cBP/P300
Señal activadora
¿ NIK, MEKK1, MEKK3, Cot/tpl-2, PKC ξ , TAK1 ?
IKKα IKKβ
NEMOPP
CITOPLASMA
NÚCLEO
IKKα IKKβ
NEMO
IKKα IKKβ
NEMOPP PP
PPPP
p50
I-κBβ
p65p50
I-κBβ
PP
P
p65p50
I-κBβ
PPPP
PP
PP
p65
p65p50
I-κBβ
PPPP
PP
β-Trcp
SCF Ub. ligasa
p65p50
I-κBβPP
PP
PP
Proteasoma
26S
NLS
p50 p65
NLS
p50 p65p50 p65
I-κBβ
PP
¿ PKA, CKII, CaMKIV, GSK·3
MSK1,PKCξ,TBK/KAK ?
NLS
p50 p65
P P
P
NLS
p50 p65
NLS
p50 p65p50 p65
PP PP
PP
NLS
p50 p65
P P
P
NLS
p50 p65
NLS
p50 p65p50 p65
PP PP
PP
Pin-1
NLS
p50 p65
PP
P
NLS
p50 p65p50 p65
PPPP
PP
NLS
p50 p65
PP
P
NLS
p50 p65p50 p65
PPPP
PP
cBP/P300
NLS
p50 p65p50 p65
PPP
PPAcAc
INTRODUCCIÓN
34
p65 es desacetilado y desfosforilado. En esta forma, puede ser capturado en el núcleo
por el recién sintetizado IκB-α y re-exportado al citosol gracias a la secuencia de
exportación presente en Iκ-Bα (Schmitz y col., 2004).
INTRODUCCIÓN
35
IV. LAS CICLOOXIGENASAS.
IV.1. La familia de las ciclooxigenasas.
La familia de las ciclooxigenasas (COXs) comprende un grupo de dos isoenzimas de
tipo oxidorreducta que catalizan la biosíntesis de eicosanoides (prostaglandinas,
prostaciclinas y tromboxanos) por oxigenación del ácido araquidónico. Sus
componentes, se denominan respectivamente ciclooxigenasas -1, y -2 (COX-1 y
COX-2), aunque también se conocen como prostaglandinas sintasas -1 y -2 (PGHS-1
y PGHS-2) (Vane y col, 1998).
Se encuentran muy conservadas y están presenten en todos los vertebrados,
encontrándose incluso en algunos invertebrados, como en los corales y esponjas. Este
hecho hace suponer que aparecieron muy tempranamente en la evolución y se ha
sugerido que ambos isoenzimas resultaron de una duplicación génica (Jarving y col.,
2004). En organismos unicelulares, insectos y plantas no se han encontrado, pero en
ellos se han identificado las llamadas oxigenasas inducibles por patógenos (PIOXs),
que también son capaces de oxigenar ácidos grasos poliinsaturados y que comparten
un 30% de homología con las COXs (Sanz y col., 1998).
De los dos componentes de la familia COX, el primer enzima en identificarse fue la
COX-1. Esta proteína se expresa normalmente de forma constitutiva y está presente
en casi todos los tejidos a niveles constantes. Los metabolitos del ácido araquidónico
derivados de la COX-1 son responsables del mantenimiento de las condiciones
fisiológicas básicas del organismo, como es el caso de la citoprotección de la mucosa
gástrica. El segundo isoenzima, la COX-2, en contraste con la COX-1, no se detecta
en la mayoría de los tejidos; su expresión puede ser inducida por estímulos
proinflamatorios, factores de crecimiento o agentes tumorogénicos. Este enzima está
implicado en la producción de prostaglandinas que participan en procesos de estrés,
patológicos e inflamatorios (Smith y col., 2000).
INTRODUCCIÓN
36
IV.2. COX-1: del gen a la proteína.
La COX-1 es codificada por el gen Cox-1 que se encuentra localizado en el
cromosoma 9 (q32-q33.3). Cox-1 es un gen de mantenimiento (“housekeeping”), de
aproximadamente 28 Kb de longitud, que contiene 11 exones y 10 intrones. El
promotor no tiene caja TATA y presenta 2 sitios ricos en citosina-guanina para Sp1,
que se cree están implicados en la transcripción de este gen. La expresión de cox-1
es generalmente constitutiva y ubicua, y por ello, se conoce poco sobre los elementos
del promotor que la controlan (Kraemer y col., 1992). Sin embargo también puede
ser inducida, como por ejemplo durante la diferenciación de las células
megacarioblásticas, pero los factores de transcripción que intervienen en esta
regulación no han sido definidos (Tanabe y col., 2002).
La transcripción de cox-1 resulta en 3 variantes de ARNm, de 2.8 Kb, 4.5 Kb y 5.2 Kb.
El que se produzca una u otra variante depende de cuál de los tres sitios de
poliadenilación alternativos que posee sea usado. El transcrito de 2.8 Kb es
generalmente el más abundante en todos los tejidos, el de 4.5 Kb está poco
caracterizado y el de 5.2 Kb se expresa mayoritariamente (incluso a niveles
superiores al de 2.8 Kb) en la vejiga y el colon (Hla, 1996).
El ARNm se traduce hasta una proteína de 576 aminoácidos y aproximadamente 67
KDa de peso molecular. Esta proteína sufre un proceso de N-glicosilación en tres
residuos de asparragina, que se piensa juega un papel importante en el plegamiento
de la proteína. Se localiza mayoritariamente en el retículo endoplásmico, debido a una
versión modificada de la secuencia KDEL que presenta en el extremo C-terminal, que
actúa como señal de retención de proteínas en este compartimento celular (Morita y
col., 1995).
IV.3. COX-2: del gen a la proteína.
La COX-2 está codificada por el gen Cox-2 que se encuentra localizado en el
cromosoma 1 (q25.2-25.3) (Kraemer y col., 1992). Cox-2 es un gen más compacto
que Cox-1, de aproximadamente 8 Kb de longitud, que contiene 10 exones y 9
INTRODUCCIÓN
37
intrones, siendo los intrones más cortos que los de la COX-1. El promotor del gen
muestra caja TATA canónica y sitios para varios factores de transcripción que incluyen
un motivo NF-IL6, dos sitios AP-2, tres sitios Sp1, 2 sitios NF-AT, dos sitios NF-κB, un
motivo CRE y un sitio E-box (Appleby y col., 1994; Iñiguez y col., 2000).
Consecuentemente, la expresión de cox-2 puede ser regulada por un amplio rango de
mediadores y agentes.
El gen cox-2 se transcribe hasta variantes de ARNm de 2.2 Kb, 3.8 Kb y 4.2 Kb, por
el uso de dos sitios de poliadenilación alternativos. El transcrito de 4.2 Kb es el que se
encuentra mayoritariamente, ya que el sitio de poliadenilación situado más corriente
abajo es el que se usa preferentemente. El ARNm para la COX-2 también se
caracteriza por presentar en la zona 3’ UTR (unstranslated region) hasta un total de
23 (~2 Kb) elementos ricos en adenosina-uridina (AUUUA), relacionados con la
inestabilidad, eficiencia traduccional y rápido recambio. Esta es una diferencia básica
con el ARNm para la COX-1, que sólo presenta un elemento (~ 0.7 kb) (Ristimaki y
col., 1996).
El ARNm se traduce hasta una proteína de 604 aminoácidos y un tamaño de
aproximadamente 69-72 KDa, que comparte una homología del 60% con la COX-1
(Garavito y col., 2003). Esta proteína puede sufrir un proceso de N-glicosilación hasta
en cuatro residuos de asparragina, dando lugar a dos o tres formas glicosiladas
(Nemeth y col., 2001). La función de estos estados de glicosilación es desconocida.
Como la COX-1, presenta una versión modificada de la secuencia KDEL en el extremo
C-terminal por lo que también se localiza mayoritariamente en el retículo
endoplásmico. Además de esta secuencia dispone de otra de unos 18 aminoácidos,
próxima a ella, cuya función se desconoce. Debido a su estructura (ver a
continuación) también se puede encontrar en la membrana nuclear (Morita y col.,
1995).
INTRODUCCIÓN
38
IV.4. Variantes de la COX-1. La COX-3.
En los últimos años, varios autores han identificado formas alternativas de COX-1,
obtenidas todas ellas por maduración alternativa del ARNm trascrito desde el gen
cox-1.
La primera variante de maduración descrita consiste en una forma de COX-1 mal
plegada. Este mal plegamiento se debe a una deleción de los últimos 111 pb del exón
9, que elimina la señal para la N-glicosilación. Su función se desconoce pero se ha
observado que se expresa en bajos niveles en el miometrio (Moore y col., 1999). La
segunda variante de la COX-1 carece del exón 1 y retiene parte del intrón 2. Ya que el
exón 1 contiene el codón de iniciación, parece que este ARNm maduro daría lugar a
una proteína “sin sentido”. Interesantemente este tipo de ARNm se ha encontrado en
tumores colorectales (Vogiaris y col., 2000). Más recientemente, se ha descrito una
variante en tejidos cerebrales caninos que contiene el intrón 1. Esta variante,
expresada en células de insectos, da lugar a una proteína que se ha denominado
COX-3, que tiene una reducida actividad catalítica sensible a drogas analgésicas y
antipiréticas como la dipirona o el paracetamol. Hasta ahora, en el hombre no se ha
identificado una proteína con las características de la COX-3, aunque se ha visto
expresión de un ARNm de COX-1 que retiene parte del intrón 1 en córtex cerebral,
corazón y músculo (Chandrasekharan y col., 2002). Junto con la COX-3, se
detectaron otras variantes que también contienen el intrón 1, pero que carecen de los
exones 5-8 y que se han denominado PCOX-1 (parcial COX-1). La deleción de los
exones, resulta en la pérdida de 219 aminoácidos del dominio catalítico del enzima.
Por tanto las PCOX-1 no pueden sintetizar prostaglandinas. Sin embargo, sí pueden
actuar como oxidasas o isomerasas. Se han descrito dos formas de PCOX-1, PCOX-
1a que contiene el intrón 1 y PCOX-1b, que carece de él.
IV.5. Estructura de la COX-1 y COX-2.
La estructura general de los dos enzimas es muy similar, presentándose como
homodímeros tanto estructural como funcionalmente. La estructura de cada
INTRODUCCIÓN
39
monómero consiste en tres dominios: un dominio “factor de crecimiento epidérmico”
(EGF) de 50 aminoácidos, un motivo de unión a membrana (MBD) de otros 50
aminoácidos y un dominio catalítico de unos 460 aminoácidos (Kurambail y col.,
1996) (figura 10). El dominio EGF constituye la zona de unión de cada uno de los
monómeros, que se unen mediante puentes disulfuro e interacciones hidrofóbicas. Se
sitúa en el extremo N-terminal, donde también se localiza el péptido señal, que dirige
a las proteínas al lumen del retículo endoplásmico. Este péptido señal es de 22 a 26
aminoácidos en la COX-1, y de 17 en la COX-2, y es eliminado una vez que se
sintetizan las proteínas. En la COX-3, la retención del intrón 1 hace que el péptido
señal se retenga (Chandrasekharan y col., 2002). El dominio MDB está formado por
cuatro hélices anfipáticas que crean una superficie hidrofóbica que le permite
interaccionar con la bicapa lipídica de las membranas microsomales del lumen del
retículo. El dominio catalítico es globular y contiene 2 lóbulos y los 2 centros activos
del enzima, el centro ciclooxigenasa y el centro peroxidasa. El centro peroxidasa se
localiza en una hendidura localizada en la interfase de los 2 lóbulos, y en este lugar se
sitúa también un grupo hemo. En cuanto al sitio activo ciclooxigenasa, éste se
encuentra dispuesto al final de un estrecho canal hidrofóbico de 25 Å, cuya entrada
está enmarcada por las 4 hélices anfipáticas del dominio DBD. Una diferencia
importante entre los sitios activos ciclooxigenasa de la COX-1 y de la COX-2 es que el
canal hidrofóbico de la COX-2 es un 25% mayor y tiene una forma ligeramente
diferente que el de la COX-1. Esto se debe básicamente al cambio en un aminoácido
en la secuencia de los 24 primeros residuos que constituyen el sitio activo: el
aminoácido de la posición 523, que es isoleucina para la COX-2 cambia a valina en la
COX-1. En el extremo del dominio catalítico se sitúa también la versión modificada de
la secuencia KDEL. Las ciclooxigenasas también muestran varios canales para agua
en su estructura, pero no está claro si sólo juegan un papel estructural o si están
implicados en los procesos de catálisis.
INTRODUCCIÓN
40
IV.6. La síntesis de prostaglandinas. Catálisis ciclooxigenasa y
peroxidasa.
Aunque los enzimas COX-1 y COX-2 poseen 2 sitios activos con 2 tipos de actividades
enzimáticas (ciclooxigenasa y peroxidasa), generalmente se usa el término
“ciclooxigenasa” para referirse a ambas actividades.
La COX-1 y la COX-2 catalizan la conversión del ácido araquidónico (AA) hasta
prostaglandinas en una reacción en 2 pasos (figura 11) (Kulmacz y col., 2003). En el
primer paso, por actividad cicloxigenasa, 2 moléculas de oxígeno son añadidas al AA
generando prostaglandina G2 (PGG2). En el segundo paso, por actividad peroxidasa, la
PGG2 es rápidamente reducida hasta prostaglandina H2 (PGH2). Finalmente, la PGH2
producida es convertida hasta las demás prostaglandinas (es decir, prostaglandinas
D2, E2, F2α), tromboxano A2 (TXA2) o prostaciclinas (PGI2) por sintasas específicas de
tejido y célula (Vane y col., 1998). En rutas paralelas a las de las ciclooxigenasas, el
ácido araquidónico puede ser convertido hasta leucotrienos por vía de la 5-
lipooxigenasa o hasta los ácidos eicosatetraenoicos (HETE) por acción de las 11-, 12-
ó 15- lipooxigenasa (figura 11).
EGF
MBD
COX
POX
EGF
MBD
COX
POX
Figura 10. Estructura general de cada subunidad monomérica de las ciclooxigenasas.
INTRODUCCIÓN
41
La reacción ciclooxigenasa es dependiente de peróxidos y requiere que el hierro del
grupo hemo se reduzca, mientras que la reacción peroxidasa puede operar de forma
independiente. La catálisis llevada a cabo por los enzimas COX-1 y COX-2, parece que
ocurre de la siguiente forma (Marnett y col., 1999): Inicialmente un oxidante
endógeno cuya naturaleza no se conoce, pero que puede ser por ejemplo el
peroxinitrito, reacciona con el Fe3+ del grupo hemo situado en el sitio peroxidasa,
Figura 11. Síntesis de prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos a partir del
ácido araquidónico.
Ácido araquidónico
COOH
PGH2
COOHO
OHO
COOHO
OOH
PGG2
O
PGI2
OHOH
O
COOH
PGE2
OHOH
OH
COOH
PGF2
OHOH
OH
COOH
PGD2
6-cetoPGF1α
OHOH
OHCOOH
O
TXB2
OHOH
COOH
OH
O
TXA2
OH
COOH
O
O
COX-1 o COX-2
COOH
OHOH
O
COX-1 o COX-2
TXA sintasaPGI sintasa
PGD sin
tasa PGF sintasa
PGE sintasa
11-, 12- ó 15- HpETE
11-, 12- ó 15- HETE
5-HpETE
LTA4
LTB4LTC4
LTD4
LTE4
11-, 12- ó 15- Lipooxigenasa 5- Lipooxigenasa
Ácido araquidónico
COOHCOOH
PGH2
COOHO
OHO
COOHO
OHO
COOHO
OOH
PGG2
O
PGI2
OHOH
O
COOH
PGE2
OHOH
O
COOH
PGE2
OHOH
OH
COOH
PGF2
OHOH
OH
COOH
PGF2
OHOH
OH
COOH
PGD2
6-cetoPGF1α
OHOH
OHCOOH
O
TXB2
OHOH
COOH
OH
OOH
OH
COOH
OH
O
TXA2
OH
COOH
O
O
OH
COOH
O
O
COX-1 o COX-2
COOH
OHOH
O
OHOH
O
COX-1 o COX-2
TXA sintasaPGI sintasa
PGD sin
tasa PGF sintasa
PGE sintasa
11-, 12- ó 15- HpETE
11-, 12- ó 15- HETE
5-HpETE
LTA4
LTB4LTC4
LTD4
LTE4
11-, 12- ó 15- Lipooxigenasa 5- Lipooxigenasa
INTRODUCCIÓN
42
reduciéndose este oxidante y originándose un radical ferril-oxoporfirina o
intermediario I. El intermediario I sufre una reducción intramolecular por
transferencia de un electrón desde el residuo Tyr385, un importante aminoácido que
se dispone al final del canal hidrofóbico del sitio ciclooxigenasa, resultando en el
intermediario II (ferril-oxo hemo) y un radical tirosilo. Mientras que el intermediario II
es reducido por un reductor endógeno desconocido y puede continuar el ciclo, el
radical tirosilo inicia la reacción ciclooxigenasa. De esta forma, cuando el sitio
ciclooxigenasa es ocupado por un ácido graso apropiado como el ácido araquidónico,
el radical tirosilo sustrae un H al carbono 13, dando lugar a un radical araquidonato,
el cual reacciona entonces con un oxígeno molecular para producir un radical 11-
hidroperoxilo. Este radical a su vez forma un endoperóxido entre los carbonos 11 y 9,
que se cicla, reaccionando con una segunda molécula de oxígeno, produciendo PGG2
(figura 12). La PGG2 entones es reducida por la actividad peroxidasa hasta PGH2.
Este proceso de producción de PGH2 por las prostaglandinas ocurre en un ciclo
catalítico muy corto de aproximadamente 1 ó 2 minutos. Una posible explicación a
esta observación sea que en un determinado momento los enzimas se inactiven. No
Figura 12. Reacción de catálisis ciclooxigenasa.
Fe3+
Fe4+= O.
Fe4+= O
Hemo
Intermediario I:
radical ferril-oxo-porfirina
Intermediario II:
ferril-oxo hemo
oxidante oxidante reducido
e- reductor
Tyr 385-OH
Tyr 385-O.
AA
Tyr 385-OHAA + -
O2
11 -hidroperoxilo PGG2
O2
INTRODUCCIÓN
43
se sabe qué fenómeno interviene en esta inactivación pero se sugiere que quizás
ocurra por formación de un radical tirosilo en una posición diferente a la Tyr535, que
provoque un cambio conformacional en las proteínas, impidiendo así su
funcionamiento.
IV.7. Inhibición de la ciclooxigenasas.
Los inhibidores de las ciclooxigenasas, también llamados drogas anti-inflamatorias no
esteroideas (AINEs) se han prescrito típicamente contra los procesos que cursan con
inflamación y fiebre. Comparten características estructurales con el AA, lo que impide
que éste interaccione con el canal hidrofóbico de los enzimas y explica por qué
disminuyen la biosíntesis de prostaglandinas. Incluyen un gran número de
compuestos, que se dividen en 2 grandes grupos según su modo de comportamiento:
(a) clásicos, no específicos de isoformas, que a su vez se dividen en varios grupos
según su origen y estructura y (b) inhibidores selectivos para la COX-2 (Tabla I).
Los AINEs clásicos inhiben tanto la COX-1 y COX-2, aunque actúan más
eficientemente sobre la COX-1 (Munroe y col., 1995). El uso continuado de los
mismos provoca efectos no deseados, como úlceras gastroduodenales sangrantes
(Brun y col., 2001), asociados con la inhibición de la COX-1. En contraste, los
inhibidores selectivos para la COX-2 son mucho más selectivos para esta isoforma
que para la COX-1 y no muestran efectos indeseados.
Por otra parte, aunque todos los AINEs compiten con el AA por el sitio activo, cada
AINE presenta un modo de inhibición, que se puede incluir dentro de tres modos de
inhibición generales (DeWitt, 1999): (a) Unión rápida y de forma reversible (ej.
Ibuprofeno, ácido mefenámico, ácido flufenámico, piroxicam, naproxeno); (b) unión
reversible y rápida con baja afinidad seguida de unión, dependiente de tiempo,
reversible y lenta (pseudoirreversible). Producen un cambio conformacional en la
proteína (ej. Flurbiprofeno, indometacina, diclofenaco, acido meclofenámico) y (c)
unión rápida y reversible seguida de modificación covalente (ej. unión de la aspirina
por acetilación del residuo Ser530).
INTRODUCCIÓN
44
Los AINEs selectivos para la COX-2 “aprovechan” la estructura del sitio activo de esta
isoforma para llevar a cabo su inhibición. Normalmente presentan en su estructura un
grupo sulfonamida, metilsulfóxido o tioéter, que entra en el bolsillo hidrofóbico, más
amplio que el de la COX-1, produciendo un cambio conformacional que inactiva al
enzima. Inhiben, por tanto de forma dependiente de tiempo, pseudoirreversible, a la
COX-2. Como ocurre con los AINEs clásicos, el mecanismo de inhibición dependiente
de tiempo no se conoce muy bien, pero parece que para los inhibidores selectivos de
la COX-2 que contienen residuos sulfonamida o metilsulfóxido, implica interacción con
el residuo Arg 513 (Kurumbail y col., 1996). Sin embargo esto no es general, porque
por ejemplo la inhibición del metilsulfóxido NS-398 no depende de interacción con
Arg513 sino con Arg120, el mismo residuo al que se unen los AINES clásicos acídicos
(Rieke y col., 1999)
IV.8. Regulación de la expresión de las ciclooxigenasas.
Debido a que la COX-1 se expresa constitutivamente, no sufre apenas procesos de
regulación. En cambio, ya que la COX-2 está relacionada con fenómenos patológicos,
su expresión está muy regulada. Esta regulación está controlada a grandes rasgos por
- Celecoxib - NS-398- Rofecoxib - Valdecoxib
AINEs selectivos (Inhiben COX-2)
- Diclofenaco- Alclofenaco
- Deriv. Ácido fenilacético - Tolmetin- Fenclofenaco
- NabumetonaCOMPUESTOSNO ACÍDICOS
- Piroxicam - Tenoxicam- Isoxicam - MeloxicamOXICAMS
- Fenilbutazona - OxifenilbutazonaPIRAZOLONAS
- Ac. mefenámico - Ac. flufenámico- Ac. meclofenámico
DERIVADOSÁCIDO FENÁMICO
- Flurbiprofeno - ketoprofeno- Suprofeno - Ibuprofeno- Naproxeno - Fenoprofeno- Carprofeno
DERIVADOSÁCIDO PROPIÓNICO
- Etodolac- Deriv. Ácido carbo- - Indometacina
y herocíclico - Sulindac- Oxaprocina
DERIVADOSÁCIDO ACÉTICO
- Aspirina - Diflunisal- Disalcid - Trilitrate
DERIVADOSÁCIDO SALICÍLICO
AIN
Es
clá
sicos
(no s
ele
ctivos)
- Celecoxib - NS-398- Rofecoxib - Valdecoxib
AINEs selectivos (Inhiben COX-2)
- Diclofenaco- Alclofenaco
- Deriv. Ácido fenilacético - Tolmetin- Fenclofenaco
- NabumetonaCOMPUESTOSNO ACÍDICOS
- Piroxicam - Tenoxicam- Isoxicam - MeloxicamOXICAMS
- Fenilbutazona - OxifenilbutazonaPIRAZOLONAS
- Ac. mefenámico - Ac. flufenámico- Ac. meclofenámico
DERIVADOSÁCIDO FENÁMICO
- Flurbiprofeno - ketoprofeno- Suprofeno - Ibuprofeno- Naproxeno - Fenoprofeno- Carprofeno
DERIVADOSÁCIDO PROPIÓNICO
- Etodolac- Deriv. Ácido carbo- - Indometacina
y herocíclico - Sulindac- Oxaprocina
DERIVADOSÁCIDO ACÉTICO
- Aspirina - Diflunisal- Disalcid - Trilitrate
DERIVADOSÁCIDO SALICÍLICO
AIN
Es
clá
sicos
(no s
ele
ctivos)
- Diclofenaco- Alclofenaco
- Deriv. Ácido fenilacético - Tolmetin- Fenclofenaco
- NabumetonaCOMPUESTOSNO ACÍDICOS
- Piroxicam - Tenoxicam- Isoxicam - MeloxicamOXICAMS
- Fenilbutazona - OxifenilbutazonaPIRAZOLONAS
- Ac. mefenámico - Ac. flufenámico- Ac. meclofenámico
DERIVADOSÁCIDO FENÁMICO
- Flurbiprofeno - ketoprofeno- Suprofeno - Ibuprofeno- Naproxeno - Fenoprofeno- Carprofeno
DERIVADOSÁCIDO PROPIÓNICO
- Etodolac- Deriv. Ácido carbo- - Indometacina
y herocíclico - Sulindac- Oxaprocina
DERIVADOSÁCIDO ACÉTICO
- Aspirina - Diflunisal- Disalcid - Trilitrate
DERIVADOSÁCIDO SALICÍLICO
AIN
Es
clá
sicos
(no s
ele
ctivos)
Tabla I. Clasificación de los AINEs.
INTRODUCCIÓN
45
sistemas de señalización dependientes de proteínas quinasas y por elementos
reguladores a nivel transcripcional y post-transcripcional.
a) Regulación por sistemas de señalización dependientes de
proteínas quinasas.
La cascada de las MAPKs es una de las rutas de señalización más importantes
implicadas en la expresión del gen de la COX-2. ERK MAPKs, p38 MAPKs y JNK
MAPKs, participan en la regulación de la expresión de la COX-2 en un amplio espectro
de células como por ejemplo monocitos (Dean y col., 1999), células de nueroblastoma
(Fiebich y col., 2000), células epiteliales alveolares (bChen y col., 2001) o células
epiteliales mamarias (Subbaramaiah y col., 1998). Las vías de las JNK y p38 MAPKs
suelen ser compartidas en la inducción por activadores tales como citoquinas
inflamatorias, endotoxinas bacterianas y situaciones de estrés ambiental tales como
radiación ionizante, hiperosmolaridad, o estrés oxidativo. En cambio, la vía de las ERK
MAPKs es usada en la expresión dependiente de oncogenes o mitógenos. La
dependencia de estas quinasas se ha demostrado por el uso de mutantes
constitutivamente activos, mutantes negativos o con el uso de inhibidores
farmacológicos específicos (Tanabe y col., 2002; Smith y col., 2000). Junto a las
MAPKs se ha descrito la participación de otras rutas de señalización dependientes de
proteínas quinasas en la regulación de la COX-2, como es el caso de la proteína
quinaza C (PKC), proteína quinasa A (PKA) o fosfatidilinositol-3 quinasa (PI-3K). Así,
por ejemplo, se ha apuntado a la implicación de estas rutas en la expresión de la
COX-2 en células de la granulosa (Wu y col., 2002), osteoblastos (Wadhwa y col.,
2002), macrófagos (Misra y col., 2001) o células epiteliales de colon (Weaver y col.,
2001) tras la luteinización, carga mecánica, ligación a través de la α-2-macroblobulina
o estimulación con TNF-α, respectivamente.
b) Regulación a nivel transcripcional.
Como se ha comentado, el promotor de la COX-2 contiene sitios de unión para un
grupo de factores de transcripción (NF-AT, NF-κB, NF-IL6, AP-2, Sp1, CRE y E-box)
INTRODUCCIÓN
46
que actúan como elementos reguladores positivos para la transcripción del gen
(Appleby y col. 1994).
Entre ellos, se ha demostrado que NF-AT regula la expresión de la COX-2 en linfocitos
T tratados con ésteres de forbol o inhibidores de proteinas tirosina fosfatasas,
respectivamente (Iñiguez y col., 2000; Barat y col; 2003). Mutaciones puntuales o
mutaciones completas en los sitios de unión para NF-AT disminuyen y abolen,
respectivamente, la expresión de la COX-2 inducidas por estos agentes. El
requerimiento de este factor de transcripción también se ha observado en células
endoteliales estimuladas con factor de crecimiento vascular (VEGF) (Hernández y col.,
2001) o agentes que movilizan calcio (Robida y col., 2000), o en células mesangiales
tratadas con endotelina-1 (Sugimoto y col., 2001). En todos estos casos el efecto de
cada uno de los diferentes inductores es inhibido por el tratamiento con el
inmunosupresor ciclosporina A, sugiriendo la implicación de la fosfatasa calcineurina
en la inducción de la COX-2 dependiente de NF-AT.
Por otra parte, NF-κB es el principal regulador de la expresión de la COX-2 inducida
por TNF-α, hipoxia, endotelina, IL-1-β y LPS en osteoblastos (Yamamoto y col.,
1995), sinoviocitos (Crofford y col., 1997), células epiteliales (Chen y col., 2000;
bChen y col. 2001; Jobin y col. 1998), células endoteliales (Schmedtje y col., 1997),
hepatocitos (Gallois y col., 1998) o macrófagos (D’Acquisto y col., 1997). Evidencias
de que la activación de que NF-κB es requerida para la inducción por estos
tratamientos incluyen experimentos que muestran inhibición de la expresión de la
COX-2 por oligonucleótidos antisentido para este factor de transcripción (Crofford y
col., 1997), expresión de dominantes negativos para I-κB (Jobin y col., 1998) y el uso
de inhibidores del proteasoma (Jobin y col., 1998). Además mutaciones en los sitios
de unión para NF-κB son capaces de atenuar la activación transcripcional del
promotor de la COX-2 inducida por estos agentes (Yamamoto y col., 1995).
La regulación de la COX-2 por los restantes factores de transcripción está menos
estudiada. En general se sabe que estos factores suelen actuar cooperativamente con
INTRODUCCIÓN
47
otros. NF-IL6, por ejemplo, potencia la inducción dependiente de NF-κB de la COX-2
en macrófagos murinos tratados con LPS (Wadleigh y col., 2000).
El elemento en respuesta a AMPc (CRE) regula, junto con NF-IL6, la inducción de la
COX-2 promovida por TPA y LPS en células vasculares (Inoue y col., 1995).
El elemento “E-box” presente en el promotor de la COX-2 une la proteína USF-1. Este
elemento parece ser esencial, junto con NF-IL6 en la activación de la COX-2 en
células de la granulosa de rata (Morris y col, 1996).
c) Regulación a nivel post-transcripcional.
Constituye el principal mecanismo de regulación de la expresión de la COX-2. Opera a
través de los elementos AUUUA situados en la zona 3’ UTR del ARNm de la COX-2. En
el transcrito corto (2.8 kb) se encuentran hasta 7 copias de elementos AUUUA, 6 de
los cuales se agrupan en una región altamente conservada o CR1, que se sitúa justo a
continuación del codón de terminación de la traducción. En el transcrito más largo
(4.6 Kb) se encuentran 15 elementos AUUUA adicionales, tres de los cuales se
agrupan en un segundo motivo conservado o CR2 (Sully y col., 2004). Estos
elementos AUUUA o AREs (del inglés, “A-U elements”) son muy importantes en la
modulación de la estabilidad del ARNm de la COX-2 en respuesta a estímulos
externos. Así la función de la región CR1, que es la más potente desestabilizadora de
las dos, se ve bloqueada por activación de la ruta p38 MAPK, que actúa como un
potente estabilizador del ARNm de la COX-2 (Dean y col., 1999; Clark y col., 2003),
posiblemente regulando la deadenilización.
Los AREs también regulan la estabilidad del ARNm interaccionando con proteínas de
unión al ARN que regulan positiva o negativamente los procesos de deadenilación y
degradación 3’Õ5’ (Guhaniyogi y col., 2001). Hasta la fecha se ha demostrado que un
gran número de proteínas de unión a ARN son capaces de interaccionar con la zona
CR1 3’ UTR del ARNm de la COX-2. Entre éstas se encuentran AUF-1 y AUF-2 (Dean
y col., 2002), que son miembros de la familia de ribonucleoproteínas heterogéneas
nucleares (hnRNP) de la familia D, que actúan tanto estabilizando como
INTRODUCCIÓN
48
desestabilizando el ARNm, dependiendo del contexto e isoforma; la hnRNPA0, una
proteína cuya fosforilación está regulada por la p38 MAPK (Rousseau y col., 2002);
HuR, que es un factor estabilizante del ARNm (Dixon y col., 2001); los represores
transcripcionales TIA-1 y TIAR (Dixon y col., 2003); la proteína desestabilizante
tristetrapolina (TTP), también fosforilable por la p38 MAPK (Sawaoka y col., 2003), la
proteína CUGBP2, que estabiliza el ARNm de la COX-2 pero impide su traducción
(Mukhopadhyay y col., 2003) o la proteína FBP1 de la familia hnRNPK que podría
estimular la desestabilización por reclutamiento del exosoma, que degrada el ARN
(Sully y col., 2004; aChen y col., 2001).
De todas estas proteínas la más estudiada es la HuR. Esta proteína se cree que
estabiliza al mensajero, porque lo exporta al citoplasma. Así HuR es capaz de
asociarse a las proteínas pp32 y APRIL que transporta a HuR fuera del núcleo a través
del intercambiador nuclear CRM-1 (Cock y col., 2003).
IV.9. Papel fisiológico de los productos de las ciclooxigenasas.
Los productos de las ciclooxigenasas median gran cantidad de procesos fisiológicos y
realizan sus funciones biológicas por unión a receptores específicos acoplados a
proteínas G, que se denominan con la letra “P” (de prostaglandinas) y el prefijo “D”,
“E”, “F”, “I”, o “T”, dependiendo de si unen las prostaglandinas D, E, F, I o los
tromboxanos. Otras prostaglandinas, como las ciclopentenonas que incluyen a la
PGJ2, la 15-deoxi Δ12,14-PGJ2 y la PGA2, pueden activar receptores nucleares de tipo
PPAR, pero no está claro si estas prostaglandinas se sintetizan bajo condiciones
fisiológicas.
Entre los distintos procesos fisiológicos donde participan las prostaglandinas y
tromboxanos se destacan la inflamación, el dolor, la fiebre, la regulación del tránsito
intestinal, la regulación de la fisiología renal, la regulación del sistema cardiovascular,
la regulación de la fisiología del pulmón, la regulación del sistema nervioso, la
regulación del sistema inmune y la regulación de la reproducción (Morita y col., 2002;
Simons y col., 2004).
INTRODUCCIÓN
49
En la siguiente tabla II se resumen las principales acciones fisiológicas de los
productos de las ciclooxigenasas.
IV.10. COX-2 en la alergia y otras patologías.
Cada vez hay más datos que apuntan a que la inducción y regulación de la
ciclooxigenasa-2 puede ser un elemento clave en los procesos patofisiológicos de un
gran número de enfermedades.
a) COX-2 en la alergia.
Estudios iniciales sugirieron que la expresión de la COX-2 puede ser inducida en las
vías aéreas de sujetos asmáticos por citoquinas cuyos niveles se encuentran elevados
en las mismas. Así, se ha demostrado que la IL-1β, el TNF-α o la bradiquinina son
capaces de inducir la COX-2 en varios tipos celulares de las vías aéreas como células
epiteliales (Newton y col., 1997), células de músculo liso (Belvisi y col., 1997) y
fibroblastos (Endo y col., 1995).
Se han realizado análisis de la expresión de la COX-2 en las vías aéreas de pacientes
alérgicos, pero los datos son conflictivos. Por un lado, hay estudios que indican que la
Tabla II. Principales acciones fisiológicas de los productos de las ciclooxigenasas.
PGE2
Vasodilatación
Aumento permeabilidad vascular
Diuresis
Natriuresis
Eritema inflamatorio
Fiebre
Contracciones uterinas
Hiperalgesia
Liberación de renina
Reducción secreción ácidos gástricos
Estimulación mucosa gástrica
Estimulación secreción bicarbonato duodenal
Insomnio
Inhibición producción de citoquinas
Inhibición producción O2-
Inhibición producción leucotrienos
PGI2
Vasodilatación
Inhibición agregación plaquetaria
Fiebre
Hiperalgesia
Liberación de renina
Reducción secreción ácidos gástricos
Estimulación mucosa gástrica
Estimulación secreción bicarbonato duodenal
PGF2
Vasoconstricción
Diuresis
Natriuresis
Fiebre
Contracciones uterinas
Implantación embrión
PartoPGD2
Vasodilatación
Activación mastocitos
Broncoconstricción
Regulación ciclo del sueño
PGF2
Activación y agregación plaquetaria
vasoconstricción
PRINCIPALES ACCIONES FISIOLÓGICAS DE LOS PRODUCTOS DE LAS CICLOOXIGENASAS
PGE2
Vasodilatación
Aumento permeabilidad vascular
Diuresis
Natriuresis
Eritema inflamatorio
Fiebre
Contracciones uterinas
Hiperalgesia
Liberación de renina
Reducción secreción ácidos gástricos
Estimulación mucosa gástrica
Estimulación secreción bicarbonato duodenal
Insomnio
Inhibición producción de citoquinas
Inhibición producción O2-
Inhibición producción leucotrienos
PGI2
Vasodilatación
Inhibición agregación plaquetaria
Fiebre
Hiperalgesia
Liberación de renina
Reducción secreción ácidos gástricos
Estimulación mucosa gástrica
Estimulación secreción bicarbonato duodenal
PGF2
Vasoconstricción
Diuresis
Natriuresis
Fiebre
Contracciones uterinas
Implantación embrión
PartoPGD2
Vasodilatación
Activación mastocitos
Broncoconstricción
Regulación ciclo del sueño
PGF2
Activación y agregación plaquetaria
vasoconstricción
PRINCIPALES ACCIONES FISIOLÓGICAS DE LOS PRODUCTOS DE LAS CICLOOXIGENASAS
INTRODUCCIÓN
50
expresión de la COX-2 en el epitelio respiratorio de pacientes alérgicos no se modifica
(ni aumenta ni disminuye) en condiciones de asma estable (Demoly y col., 1997) o
asma estacional (Seymour y col., 2001). Por el otro, un mayor marcaje
inmunohistoquímico para la proteína COX-2 se ha encontrado en esputo inducido,
infiltrado inflamatorio submucoso y epitelio aéreo de sujetos asmáticos, comparado
con sujetos sanos (Sousa y col., 1997; Taha y col., 2000; Profita y col; 2003).
También, una mayor expresión del ARNm para la COX-2 se ha observado en el
epitelio aéreo (Redington y col., 2001) o en células polimorfonucleares de sangre
periférica (Kuitert y col., 1996) de sujetos asmáticos comparado con donantes sanos.
Los resultados en animales de experimentación también son muy dispares. Estudios
con cerdos sensibilizados a ovoalbúmina señalan un aumento del ARNm de la COX-2
tras estimulación antigénica, manteniéndose el ARNm de la COX-1 sin cambio alguno
(Oguma y col., 2002). Experimentos con ratones deficientes para los genes de las
ciclooxigenasas, presentan resultados diversos; ratones knockout para la COX-2
muestran mayor inflamación alérgica que ratones silvestres (Gavett y col., 1999).
Otro estudio, en cambio, sostiene que son los ratones Knockout para la COX-1 los que
manifiestan mayor inflamación alérgica que los silvestres, mientras que los ratones
knockout para la COX-2 no muestran diferencias (Carey y col., 2003).
En cuanto a los productos de la COX-2, los efectos son muy diversos dependiendo de
qué tipo de mediador se sintetize y de cómo actúe.
Así, la PGE2, a bajas concentraciones se une a receptores EP y tiene un papel anti-
inflamatorio y broncoprotector: previene la broncoconstricción inducida por alergeno,
atenúa las respuestas alérgicas temprana y tardía (Gauvreau y col, 1999), previene el
asma inducido por ejercicio (Melillo y col., 1994), inhibe la síntesis de IgE, y reduce la
respuesta celular de los mastocitos, eosinófilos, macrófagos y linfocitos T (Pavord y
col., 1995). En cambio, a altas concentraciones la PGE2 se une a receptotes TP (de
tromboxanos) y causa constricción de las células del músculo liso de las vías aéreas
(Gardiner y col, 1980).
INTRODUCCIÓN
51
Al igual que la PGE2, la PGI2 tiene un papel anti-inflamatorio y broncoprotector: ofrece
protección contra la broncoconstricción inducida por ejercicio (Bianco y col., 1990) y
regula la respuesta celular y la síntesis de citoquinas TH2 e IgE (Nagao y col., 2003).A
pesar de ello, las acciones de la PGI2 no son muy duraderas, porque es muy inestable
y de forma espontánea se degrada hasta 6-ceto-PGF1α, que carece de actividad
biológica.
La PGD2 es el principal eicosanoide observado en las vías aéreas de sujetos alérgicos
estimulados in vivo con alergeno (Murray y col. 1986). Tiene un importante papel
pro-inflamatorio y actúa como un potente broncoconstrictor en las vías aéreas
humanas (Hardy y col., 1984). Fundamentalmente ejerce su actividad biológica a
través de 2 tipos de receptores, el clásico o receptor DP y un receptor alternativo o
receptor CRTH2. A través de DP regula la producción de citoquinas TH2 (Matsuoka y
col., 2000) y a través de CRTH2 regula la migración de eosinófilos, basófilos y
linfocitos (Hirai y col., 2001).
La PGF2α es también sintetizada por las células de músculo liso de las vías aéreas y
comparte las características pro-inflamatorias de la PGD2, pero su acción es menos
potente (Thomson y col., 1981).
Por último, el tromboxano A es un potente agente broncoconstrictor que juega un
importante papel en la hiperreactividad bronquial (O’Byrne y col., 1991) y activa la
síntesis de leucotrienos (Noveral y col., 1992). Igual que ocurre con la prostaciclina,
el TXA2 es muy inestable y se degrada hasta TXB2, que carece de actividad biológica.
b) COX-2 en otras patologías.
Además de en los procesos alérgicos, la COX-2 se ha relacionado con otras patologías
que incluyen enfermedades inflamatorias crónicas como la artritis reumatoide,
osteoartritis o lupus eritematoso (Siegle y col., 1998; Xu y col., 2004). También se ha
asociado con gastritis relacionadas con Helicobacter pylori (McCarthy y col., 1999), en
glaucomas (Maihöfner y col., 2001) o en la enfermedad de Alzeheimer (Pasinetti y
col., 2001). En cuanto a la biología del cáncer, se ha encontrado una expresión
INTRODUCCIÓN
52
anormal de COX-2 en cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de estómago, y
adenocarcinomas colorectales, pancreáticos o de próstata (Presccott y col., 2000;
Thun y col., 2002).
INTRODUCCIÓN
53
V. QUIMIOQUINAS: IL-8.
V.1. Las quimioquinas y sus receptores. Estructura y clasificación.
Las quimioquinas son un grupo de citoquinas secretadas por diversas células y
caracterizadas porque además de desempeñar su actividad paracrina/autocrina (como
las citoquinas) poseen la interesante capacidad de ejercer quimiotaxis sobre distintos
tipos celulares, entre los que se encuentran los leucocitos (Baggiolini y col., 1994).
Están involucradas en una amplia variedad de procesos fisiológicos y patológicos,
como la migración y activación celular, los procesos tumorales y de angiogénesis, la
producción de colágeno y la proliferación de los precursores hematopoyéticos
(Gerard y col., 2001).
Estas moléculas son polipéptidos de bajo peso molecular (alrededor de 8-10 KDa) y
con 70-130 aminoácidos, entre los cuales, generalmente, los últimos 4 aminoácidos
del extremo N-terminal son cisteínas muy conservadas. Estas 4 cisteínas permiten la
formación de 2 puentes disulfuro (Cys1-Cys3; Cys2-Cys4) que son responsables de la
estructura tridimensional (Baggiolini y col., 1994; Mantovani y col., 1999).
Tradicionalmente, se han clasificado en 2 subfamilias en función de la posición de las
2 primeras cisteínas. Así en la familia CXC (o α) las 2 cisteínas están separadas por
un aminoácido, mientras que en la familia C-C (o β) las cisteínas son adyacentes. Sin
embargo existen otras quimioquinas que difieren de la estructura general de las dos
categorías anteriormente descritas. Una excepción es la linfotactina que presenta 2
cisteínas conservadas en lugar de 4 (Kennedy y col., 1995) y que constituye una
tercera familia denominada C, y la frantalquina o neurotactina, que presenta 3
aminoácidos entre las 2 primeras cisteínas y que constituye la familia CX3C (Bazan y
col., 1997).
Los efectos biológicos de las quimioquinas son producidos por unión a receptores que
se expresan sobre la superficie celular. Estos receptores pertenecen a la superfamilia
de proteínas de membrana, presentan siete dominios transmembrana y están
acoplados a proteínas G. La mayor parte de ellos, tienen la capacidad de ser
“promiscuos”, es decir, presentan la capacidad de unir más de una quimioquina. De
INTRODUCCIÓN
54
igual forma la mayor parte de las quimioquinas pueden interaccionar con más de un
receptor. De esta forma, se explica que las quimioquinas sean redundantes en su
acción (Baggiolini y col., 1994).
Debido a la gran variedad de quimioquinas (40 hasta la fecha) y receptores descritos
y a la velocidad con la que se descubrían, pronto surgió el problema de que varios
grupos de investigación informaban acerca de la misma molécula con distintos
nombres. Debido a ello, las quimioquinas y sus receptores son denominados desde
1999 con un nombre sistemático de acuerdo con las siguientes directrices: los
receptores se denominan CXC, CC, XC o CX3X (según la estructura de la quimioquina
que unen) seguido de la letra “R” (de receptor) y un número cronológico. Las
quimioquinas, en cambio, se denominan CXC, CC, XC o CX3X seguido de “L” (de
ligando) y el número correspondiente de su gen. Los genes se nombran desde hace
mucho tiempo como SCY (de “small secreted cytoquines”) y un número cronológico
(Zlotnik y col., 2000).
V.2. La Interleuquina-8. Generalidades.
Se caracteriza por ser una proteína activadora de los neutrófilos (de ahí el nombre de
NAP-1) con efectos biológicos similares a diversas sustancias quimiotácticas como el
factor del complemento C5a, el leucotrieno B4 (LTB4), el factor activador plaquetario
(PAF) o los péptidos bacterianos.
Como proteína fue descrita por primera vez en 1987 por Schmid y Weissman, quienes
no llegaron a aclarar su función biológica. La identificación de la actividad biológica
tiene su origen en estudios con la IL-1, a la que se le atribuyeron efectos activadores
para los neutrófilos tanto in vitro (Luger y col., 1983) como in vivo (Dinarello., 1984).
Los efectos funcionales in vitro no se podían reproducir con IL-1 pura, lo que
implicaría la existencia de un factor contaminante responsable del efecto
quimiotáctico. Como consecuencia de ello, se aisló una nueva citoquina que se
designó primeramente como factor quimiotáctico de los neutrófilos derivado de los
monocitos (MDNCF) (Yoshimura y col., 1987), factor activador de los neutrófilos
INTRODUCCIÓN
55
(NFA) (Walz y col., 1987) o proteína quimiotáctica de los granulocitos (GCP) (Van
Damme y col., 1988). Su secuencia no se parecía estructuralmente a la de la IL-1,
pero sí presentaba identidad con la secuencia proteica derivada del ADNc descrito por
Schmid y Weissman. Debido a esta homología la nueva citoquina denominada
MDNCF/NFA/GCP comenzó a llamarse IL-8.
Actualmente la IL-8 se incluye dentro de la familia C-X-C de las quimioquinas y
recibe el nombre sistemático de CXCL-8 (Zlotnik y col., 2000).
V.3. La interleuquina-8: del gen a la proteína.
El gen de la IL-8 está localizado en el cromosoma 4 (q12-q21) (Modi y col., 1990), en
un locus que contiene los genes de otras proteínas inflamatorias relacionadas.
Presenta un tamaño de 3.13 Kb y contiene 4 exones y 3 intrones. En la zona
comprendida entre -1 y -133, situada “aguas arriba” de la región 5’ codificante, se
sitúa el promotor, que presenta una caja TATA característica y zonas de unión para
factores de transcripción tales como NF-κB, AP-1 y C-EBP (Mukaida y col., 1989).
El gen se transcribe hasta un ARNm de 1.6 Kb, con la característica de que contiene
sitios de inestabilidad AAUU en el extremo 3’, los cuales están asociados con los
procesos de inestabilidad del mensajero, eficiencia traduccional y rápido recambio.
(Tebo y col., 2003).
El ARNm se traduce primeramente hasta una proteína de 99 aminoácidos (10 KDa),
que por procesamiento del extremo N-terminal da lugar al menos a 4 variantes de
77, 72, 70 y 69 aminoácidos respectivamente. En este extremo N-terminal se localiza
la secuencia llamada ELR (Glu-Leu-Arg), que es esencial para su actividad (Clark-
Lewis y col., 1991).
Estructuralmente se presenta en forma de homodímeros, con 2 subunidades idénticas
(figura 13). Cada subunidad monomérica contiene 4 cadenas-β antiparalelas y una
α-hélice próxima al extremo C-terminal y se une a la otra por medio de 6 puentes de
hidrógeno que se establecen entre las cadenas-β (Baldwin y col. 1991). Tiene la
característica de que es estable al calor y resistente a los extremos de pH (Peveri y
col., 1988).
INTRODUCCIÓN
56
En la mayoría de los tejidos sanos, la proteína se produce en cantidades casi
indetectables. Sin embargo tras estimulación con un gran número de estímulos como
por ejemplo las citoquinas inflamatorias IL-1 y TNF-α (Matsushima y col., 1988),
bacterias, como Helicobacter pylori o Pseudomonas aeruginosa (Nozawa, 2002;
DiMango, 1995), productos bacterianos como el LPS (Oppenheim y col., 1991),
virus, como el citomegalovirus, rhinovirus o adenovirus (Johnston y col., 1997;
Murayama y col., 1997; Alcorn y col., 2001) y productos virales, como la proteína X
del virus de la hepatitis B (Mahe y col., 1991). En cuanto a tipos celulares, ésta puede
ser producida por leucocitos (monocitos, neutrófilos, linfocitos) y por células no
inmunes como células endoteliales, células epiteliales, fibroblastos, hepatocitos y
células sinoviales (Baggiloni y col., 1994; Oppenheim, 1991; Mukaida, 2000).
V.4. Regulación de la expresión de IL-8.
La expresión y producción de IL-8 está regulada a varios niveles de regulación por
intermediarios de señalización, sistemas de señalización dependientes de proteínas
quinasas y por elementos reguladores a nivel transcripcional y post-transcripcional.
a) Regulación por intermediarios de señalización.
Los niveles de calcio están implicados en la inducción de la IL-8 en monocitos y
neutrófilos activados con ionóforos de calcio o thapsigargina (Wilson y col., 1998;
Kuhns y col., 1998), linfocitos T activados a través del CD28 (Wechsler y col., 1994),
células de adenocarcinoma de colon estimuladas con ésteres de forbol o forskolina
(Yu y col., 2001), o en células epiteliales gástricas infectadas con Helicobacter pylori
(Nozawa y col., 2002). El enzima calmodulina (CaM) está implicado en las señales
Figura.13. Estructura de la IL-8 en solución.
INTRODUCCIÓN
57
dependientes de calcio y bajo el control del calcio se encuentra la fosfatasa
calcineurina (CaN) (Crivici y col., 1995). De esta forma, se ha descrito que la ruta
CaM-CaN regula la inducción de la IL-8 en neutrófilos humanos o células Jurkat
activados por agentes que elevan el calcio intracelular (Kuhns y col., 1998; Wechsler
y col., 1994).
Por otra parte, las especies reactivas de oxígeno regulan la inducción de la IL-8 en
monocitos humanos estimulados con homocisteína (Zeng y col., 2003), células
epiteliales estimuladas con TNF-α (Lakshminarayanan y col., 1998), células de
adenocarcinoma de colon tratadas con IL-1β (Hwang y col., 2004) o monocitos
humanos tratados con LPS (Ryan y col., 2004).
b) Regulación por sistemas de señalización dependientes de
proteínas quinasas.
Entre las proteínas quinasas que regulan la expresión de la IL-8 destacan las
proteínas de la familia MAPK. La p38 MAPK se ha relacionado con la expresión de IL-8
en una amplia variedad de células y estímulos como neutrófilos tratados con
estreptococo (Albanyan y col., 2000), células endoteliales vasculares tratadas con
TNF-α (Hashimoto y col., 2001) o células de carcinoma gástrico cultivadas con IL-1β
(Hwang y col., 2004).
La JNK también se ha implicado por ejemplo, en la inducción de la IL-8 en células
HeLa estimuladas con IL-1β (Nourbakhsh y col., 2001) o células endoteliales tratadas
con TNF-α (Natarajan y col., 2001). La ERK MAPK regula la expresión de IL-8 por
células epiteliales pulmonares activadas con adenovirus (Alcorn y col., 2001) o
monocitos tratados con LPS (Scherle y col., 1998).
c) Regulación a nivel transcripcional.
Como se comentó anteriormente, el promotor de la IL-8 contiene sitios para factores
de transcripción como NF-κB, AP-1 y C/EBP. Igualmente, se demostró por análisis de
mutaciones y deleciones, que NF-κB resulta ser un elemento imprescindible para la
regulación transcripcional de este gen en todos los tipos celulares estudiados
INTRODUCCIÓN
58
(Mukaida y col., 1994; Hoffmann y col., 2002). A diferencia del sitio NF-κB, los sitios
AP-1 y C/EBP no son esenciales para la inducción, pero sí se requieren para la
máxima expresión génica (Mukaida y col., 1994; Hoffmann y col., 2002). En general
la señales de calcio y ROS convergen en la activación de la IL-8 por NF-κB, mientras
que las señales a través de las MAPKs (principalmente JNK y ERK) activan la
inducción del gen de la IL-8 por AP-1 (Hwang y col., 2004).
Además de estar regulado positivamente por estos elementos activadores
característicos, el promotor de la IL-8 se encuentra bajo el control de elementos
represores. Así por ejemplo se ha descrito un mecanismo por el que el gen de la IL-8
está reprimido por Oct-1, que compite con NF-κB y C/EBP (Wu y col., 1997). Además
en el promotor, existe un elemento regulador negativo (NRE), que solapa con el sitio
de unión para NF-κB y al que se une la proteína NRF (factor represor de NF-κB). A
diferencia de Oct-1, NRF impide la transcripción por un mecanismo no competitivo. No
compite con NF-κB, sino que altera la función de éste. Tras estimulación, es requerido
para la máxima actividad del promotor (Nourbakhsh y col., 2001). Otros autores
también apuntan a una implicación de la acetilación de histonas en los fenómenos de
represión (Ashburner y col., 2001).
Un modelo general de regulación del promotor de la IL-8 es reflejado en la figura 14
(Hoffmann y col, 2002). Asimismo, en células no estimuladas, el promotor de las IL-8
es reprimido por 3 mecanismos: por unión de NRF al elemento NRE, que solapa con el
sitio NF-κB; segundo, por unión del octámero-1 (Oct-1) al sitio de unión localizado en
la hebra complementaria y la dirección opuesta del sitio de unión de C/EBP: y tercero,
por desacetilación de las histonas por la histona desacetilasa 1 (HDAC-1). Después de
la inducción por IL-1 o TNF-α por ejemplo, la subunidad p65 de NF-κB se transloca al
núcleo y se une a su sitio próximo a NRF. Oct-1 es reemplazado por C/EBP, mientras
que NRF cambia su función y actúa como un coactivador. El reclutamiento de la
proteína de unión a CREB (CBP/p300) resulta en una hiperacetilación de las histonas
y remodelaje de la cromatina. Como resultado la represión finaliza, los factores de
INTRODUCCIÓN
59
transcripción se fosforilan por medio de intermediarios/rutas intracelulares (JNK y
ERK para AP-1 y Ca2+/ROS para NF-κB por ejemplo), y se inicia de esta forma la
transcripción.
d) Regulación a nivel post-transcripcional.
Opera a través de los elementos ARE situados en la zona 3’ UTR del ARNm de la IL-8.
El transcrito contiene un dominio constituido por 4 copias de elementos AUUUA, que
es esencial para la estabilización por la ruta p38 MAPK (Winzen y col., 2004).
Los AREs también regulan la estabilidad del ARNm interaccionando con proteínas de
unión al ARN que regulan positiva o negativamente los procesos de deadenilación y
degradación 3’Õ5’ (Guhaniyogi y col., 2001). Hasta la fecha se ha demostrado que
proteínas de unión a ARN son capaces de interaccionar con la zona 3’ UTR del ARNm
de la IL-8. Entre éstas se encuentran HuR, que es un factor estabilizante del ARNm,
el represor transcripcional TIAR o la proteína KSRP, que podría estimular la
desestabilización por reclutamiento del exosoma, que degrada el ARN (Suswam y col.,
2005).
V.5. Funciones biológicas de la IL-8.
Una vez sintetizada, la IL-8 realiza sus funciones biológicas a través de su unión a
receptores específicos, que como todos los receptores de quimioquinas están
NRFAP-1
OCT-1
NRFAP-1p50 p65
PP PC/EBP
HDAC1
Deacetilación Histona H3
Acetilación Histona H3
CBP/p300
DEREPRESIÓNREPRESIÓN
NRFAP-1
OCT-1
NRFAP-1p50 p65p50 p65
PPPP PPC/EBP
HDAC1
Deacetilación Histona H3
Acetilación Histona H3
CBP/p300
DEREPRESIÓNREPRESIÓN
Figura.14. Modelo general de regulación del promotor de la IL-8.
INTRODUCCIÓN
60
acoplados a proteínas G. Se han identificado 2 receptores de alta afinidad para la IL-
8: un receptor denominado CXCR-1, que también reconoce a la quimioquina CXC
proteína-2 quimiotáctica para granulocitos (GCP-2), y el receptor CXCR-2, que
también puede unir otras quimioquinas como el péptido activador de neutrófilos 2
(NAP-2), la quimioquina relacionada con el crecimiento de oncogenes (GRO α-γ) y la
proteína activadora de neutrófilos derivada de células epiteliales 78 (ENA-78). Ambos
receptores se expresan en una amplia variedad de células que incluyen neutrófilos,
linfocitos T, células epiteliales y células endoteliales, siendo los neutrófilos los que
presentan mayor número (Holmes y col., 1991; Murphy y col., 1994). La IL-8 regula
en sentido descendente rápidamente la expresión de su propio receptor, proceso que
se asocia con la internalización del complejo ligando-receptor. Los receptores
reaparecen rápidamente en la superficie celular probablemente a través de un
reciclaje (Samanta y col., 1990).
Numerosos datos indican que la IL-8 está implicada en los procesos de transmigración
de los leucocitos hacia los tejidos. Así, la citoquina puede ser internalizada por las
células epiteliales y ser presentada a los neutrófilos (Middleton y col., 1997). En estos
leucocitos, la IL-8 regula la expresión de las moléculas de adhesión (L-selectina, β-2
integrinas, CR1/CD35) permitiendo su adhesión a las proteínas de la matriz
extracelular (Carveth y col., 1989). Además es capaz de estimular la migración
neutrofílica a través del endotelio, epitelio pulmonar y fibroblastos (Huber y col.,
1991; Mul y col., 2000; Burns y col., 1996).
La IL-8 puede también activar respuestas funcionales en los neutrófilos como un
incremento del calcio y fosfolípidos citoplasmáticos (Zeilhofer y col., 2000), un débil
estallido respiratorio (Kownatzki y col., 1990), liberación del contenido de gránulos
como β-glucoronidasa, elastasa, mieloperoxidasa, gelatinasa-B y lactoferrina (Gessler
y col., 2004), producción de leucotrieno B4 (LTB4) (Schröeder y col., 1989) y
producción de PAF (Bussolino y col., 1992).
Junto a los neutrófilos, la IL-8 es también quimiotáctica para otras células, como los
linfocitos T (Larsen y col., 1989), eosinófilos (Shute, 1994), basófilos activados
INTRODUCCIÓN
61
(Dahhinden y col., 1989) y células NK activadas con IL-2 (Sebok y col., 1993).
V.6. IL-8 en la alergia y otras patologías.
La propiedad de la IL-8 para estimular, in vitro, el movimiento de los neutrófilos a
través de las capas de endotelio, apoya la idea de que esta molécula juega un papel
fundamental en la acumulación de estas células en las lesiones inflamatorias in vivo.
a) IL-8 en la alergia.
En la alergia, por ejemplo, un primer estudio encontró un aumento de expresión de
IL-8 junto con GM-CSF en células epiteliales bronquiales de pacientes asmáticos
(Marini y col., 1992). Análisis inmunocitoquímicos detectaron posteriormente una
mayor expresión de IL-8 en monocitos y macrófagos de sujetos asmáticos,
comparados con una población sana de referencia (Hallsworth y col., 1994).
Un aumento de IL-8 se observó en el suero de sujetos con asma (Shute y col., 1997),
en tejidos bronquiales de estos pacientes, tras estimulación endobronquial con
alergeno, o en secreciones nasales de niños con asma inducida por virus (Teran y
col., 1996; Park y col., 1999; Teran y col., 1997).
También en esputos inducidos y lavado broncoalveolar de pacientes con asma hay un
incremento en los niveles de IL-8 en relación a una población control (Chanez, 1996;
Norzila y col., 2000; Nocker y col., 1996). También se ha descrito que la IL-8 juega
un importante papel en el asma ocupacional (Lummus y col., 1998; Park y col.,
1998).
b) IL-8 en otras patologías.
Además de en la alergia, hay datos que indican que la IL-8 participa en la patogénesis
de otras enfermedades inflamatorias como la artritis reumatoide, (Seitz y col., 1991)
o la psoriasis (Sticherling y col., 1991). También hay constancia de la implicación de
la quimioquina en un amplio rango de patologías clínicas que afectan al pulmón como
el síndrome de distrés respiratorio del adulto, la fibrosis pulmonar idiopática, la
sarcoidosis o la fibrosis quística (Mukaida y col., 2003).
INTRODUCCIÓN
62
La inducción de IL-8 también se observa en otras patologías como el shock séptico, la
pancreatitis aguda, la enfermedad de Crohn’s, la colitis ulcerosa, peritonitis, gota,
vasculitis, meningitis, lupus, hepatitis, uveitis y aparición del sarcoma de Kaposi en la
enfermedad del SIDA, entre otras (Scapini, 2000; Bautista, 2002; Van der Kuyl.,
2004; Harada y col., 1994).
En la biología del cáncer también se ha encontrado una participación activa de la IL-8.
Así se ha encontrado expresión de IL-8 en cánceres de próstata, pulmón, estómago,
colon, páncreas y mama, carcinomas renales, melanomas, mesoteliomas, adenomas
pituitarios, tumores cerebrales y de tiroides, leucemia de células B linfocítica crónica y
leucemia mielogénica (Xie, 2001).
A pesar de todo lo anterior, la IL-8 puede ejercer efectos beneficiosos en otras
patologías, por ejemplo en el tratamiento de pacientes que sufren síndromes
mielodisplásicos (Reitamo y col., 1993).
OBJETIVOS
OBJETIVOS
65
En una visión global, nuestros objetivos se dirigen a estudiar el efecto de alergenos
específicos sobre la expresión de la COX-2 y de la IL-8 en células inmunes que
participan en los procesos alérgicos, tales como los linfocitos y los neutrófilos.
Los objetivos específicos de la presente Tesis Doctoral son los siguientes:
1º. Estudiar la expresión de la COX-2 en linfocitos de pacientes alérgicos,
utilizando como estímulo alergenos específicos.
De una manera más concreta, este objetivo se puede subdividir en los siguientes
puntos: (a) analizar si el efecto está mediado por la IgE y qué receptor/es están
implicados. (b) Estudiar la participación de rutas de transmisión de señales, tales
como las MAPKs, PKC, PKA, PI-3K, calcineurina, NF-AT, NF-κB, y cuya participación se
ha demostrado en la regulación de la expresión de la COX-2. (c) Analizar la potencial
modulación de la expresión de la COX-2 por medicamentos empleados en la práctica
médica.
2º. Analizar la expresión y liberación de la IL-8 en neutrófilos de pacientes
alérgicos utilizando como estímulo alergenos específicos.
Más específicamente, este objetivo se puede subdividir en los siguientes apartados:
(a) determinar si el efecto está mediado por la IgE y qué receptor o receptores están
implicados. (b) Estudiar el efecto de los ROS tanto en la liberación de la proteína
como en los niveles del ARNm. (c) Analizar la implicación de otros elementos de
señalización, tales como el calcio y la actividad calcineurina.
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOs
69
I. MATERIALES Y REACTIVOS.
La relación de los productos utilizados en la realización de esta tesis doctoral y las
empresas que los suministraron es dada a continuación:
BIAL-ARISTEGUI (Bilbao, España): La batería de alergenos, disponibles
comercialmente como extractos antigénicos (usados en los test in vivo y en los
experimentos) y el corticoide budesonida.
BECTON-DICKINSON (BD) Vacutainer (Plymouth, Reino Unido): Los tubos
siliconizados SSTII y con heparina LH, para la obtención de suero y sangre
respectivamente.
IZASA (Barcelona, España): El equipo HYTEC 288, los kits para la IgE específica e
IgG específica, los anticuerpos anti-CD14, anti-CD3 y anti CD3-PE, anti-CD20 y
anti-CD20-PE, anti CD56 y anti-CD56-PE, anti-CD9, los controles isotípicos IgG1-
PE e IgG1-FITC, los anticuerpos GAM-esferas y GAM-FITC, el anticuerpo anti-
CD23, los kits para la determinación de la IL-8 y el TNF-α , el kit para extracción
de ARN total “RNA isolation kit RNeasy” y el kit para la PCR a tiempo real
“QuantiTect SYBR Green PCR”.
BIO-WHITTAKER (Verviers, Bélgica): El Ficoll-hypaque, el tampón PBS, el medio
de cultivo RPMI 1640, el suero fetal bovino, la L-glutamina, la
penicilina/estreptomicina y la anfotericina.
BIO-RAD (Ritchmond, USA): Las membranas de polivinilideno (PVDF), los
marcadores de peso molecular y los equipos de electroforesis.
CAYMAN CHEMYCAL (Ann Arbor, USA): Los anticuerpos anti-COX-2 humano y
anti-COX-2 humano-FITC y el kit para la determinación de los niveles de PGD2.
SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY (Santa Cruz, USA): Los anticuerpos anti-COX-1
humano (sc-7950), anti-total ERK 1/2 humano (sc-93), anti-fosfo JNK 1/2
humano (Thr183/Tyr185) (sc-6254), anti-total JNK 1/2 humano (sc-7345), anti-Iκ-B
humano (sc-371), anti p65 humano (sc-109) y anti p50 humano (sc-114).
NEW-ENGLAND BIOLABS (Beverly, USA): Los anticuerpos anti-fosfo p38 humano
(Thr180/Tyr 182) y anti-total p38.
MATERIALES Y MÉTODOS
70
PROMEGA (Madison, USA): El anticuerpo anti-fosfo ERK 1/2 humano (Thr
183/Tyr185), los anticuerpos secundarios anti-ratón y anti-conejo unidos a
peroxidasa (HRP), la retrotranscriptasa M-MLV, la RNAasa Sin, los nucleótidos
trifosfato (DNTPs) y la T4 polinucleótido quinasa.
ABCAM (Cambridge, Reino Unido): El anticuerpo anti-FcεRI (cadena α).
eBIOSCIENCE (San Diego, California, USA): El anticuerpo anti-galectina 3.
KODAK-X-OMAT (Rochester, USA): las películas fotográficas y las soluciones de
revelado.
ROCHE (Barcelona, España): Los cebadores aleatorios (“random primers”), la Taq
polimerasa, los cebadores para PCR y los oligos para los retardos en gel.
AMERSHAM-PHARMACIA BIOTECH (Barcelona, España): El dextrano T500, el γ-
32P-ATP, el Sephadex G-50 y el kit para la determinación de PGE2.
CALTAG LABORATORIES (Burlingame, USA): Los anticuerpos anti-IgE humana y
los reactivos de fijación y permeabilización (FIX & PERM).
DAKO (Copenhague, Dinamarca): El anticuerpo anti-IgE humana-conjugado a
peroxidasa (HRP).
CALBIOCHEM-NOVABIOCHEM (San Diego, USA): N-(2-ciclohexiloxi-4-nitrofenil)
metanosulfonamida (NS-398) y el N-[2-((p-Bromocinamil)amino)etil]-5-
isoquinolinesulfonamida (H89)
BIOMOL (Plymouth Meeting, USA): La wortmanina, el calphostin C, la
staurosporina y los péptidos SN50 (AAVALLPAVLLALLAPVQRKRQKLMP) y SN50M
(AAVALLPAVLLALLAPVQRNGQKLMP).
SIGMA-ALDRICH (Madrid, España): El forbol-miristato-acetato (PMA), los
anticuerpos IgG de cabra y de ratón, el anticuerpo anti-β actina humana, el 2-(2-
amino-3 metoxifenil)4H-1-4-benzopirano (PD098059), el 4-(4-fluofenil)-2-(4-
metilsulfinilfenil)-5-4-(piridil)-1-H-imidazol (SB203580), el N-CBZ-leu-leu-leu-al
(MG-132), el peptido RII (DLDVPIPGRFDRRVSVAAE), el ácido okadaico, la
proteína quinasa A (PKA), la resina Dowex, la dexamethasona, los inhibidores de
MATERIALES Y MÉTODOs
71
proteasas, el N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP), el lipopolisacárido (LPS),
el difenileniodonio (DPI), el pirrilodín ditiocarbamato (PDTC), el 2,2,6,6-
tetrametilpiperidina-1-oxyl (TEMPO), el 4-hidroxi-3-metoxiacetofenona (HMAP), el
EGTA, la trifluoperazina (TFP) y el azul tripán.
LESVI (Barcelona, España): El antihistamínico loratadina.
MENARINI (Barcelona, España): El antihistamínico ceterizina.
El anticuerpo “anti-all NFAT” fue cedido por el Dr. Juan Miguel Redondo (CBM, Madrid,
España), la ciclosporina A (CsA) por el Dr. Jean F. Borel (Sandoz, Basel, Suiza) y el
FK506 por FUJISAWA GMBH (Müchem, Alemania).
El resto de reactivos, ya fuesen de grado “biología molecular” o no, se obtuvieron
indistintamente de SIGMA, MERK (Barcelona, España) o SERVA (Barcelona, España).
MATERIALES Y MÉTODOS
72
II. MÉTODOS.
II.1. PACIENTES Y CONTROLES.
El grupo experimental para nuestro trabajo está formado por individuos alérgicos
diagnosticados por facultativos del Servicio Regional de Inmunología y Alergia del
Hospital Universitario Virgen Macarena de Sevilla, y por voluntarios sanos no
alérgicos.
En consulta médica, a cada uno de los enfermos alérgicos se les realizó una
exhaustiva historia clínica, consistente en:
Filiación (nombre, edad, sexo).
Anamnesis detallada (cuadro clínico, años de evolución del proceso).
Exploración física.
Además se les realizaron tests in vivo (tests-cutáneos) y tests in vitro (determinación
de los niveles séricos de IgE específica). Después de todo lo anterior, un paciente se
consideró como alérgico o atópico si tenía historia clínica compatible, tests in vivo y
test in vitro positivos. Por el contrario, se consideró no atópico si no padecía patología
asociada y los tests in vivo e IgE específicas eran negativos.
a) Test in vivo (Test-cutáneo).
Para su realización se sigue la técnica de tests-cutáneos (“skin-prick”) (Pepys, 1975),
utilizada habitualmente para el diagnóstico etiológico de los procesos alérgicos.
Al comenzar con los tests in vivo, los pacientes no deben de estar recibiendo ningún
tipo de tratamiento con antihistamínicos.
Procedimiento:
Antes de realizar las pruebas cutáneas, se desinfecta la piel de la cara ventral de los
antebrazos con alcohol etílico y se marcan, a distancia de 3 cm, tantos puntos como
extractos alergénicos a testar, más otros dos adicionales que se usan como control
positivo (histamina) y negativo (cloruro sódico 0.9%). Al lado de cada marca se
deposita una gota del extracto correspondiente y se practica una punción a través de
cada gota con lancetas, guardando una inclinación de 90º. Transcurrido un período de
MATERIALES Y MÉTODOs
73
15 min, se seca la superficie de los antebrazos con celulosa absorbente y se leen los
resultados (pápulas formadas) tomando como referencia los controles positivos y
negativos. Se considera resultado positivo aquella pápula cuyo diámetro sea superior
o igual al de la histamina (normalmente mayor o igual a 3 mm), siempre que el
control positivo muestre una reactividad adecuada. El grado de positividad se
expresa, como se indica en la tabla III, por el método escandinavo (Aas y col.,
1974).
La batería habitual de extractos alergénicos usados se compone, en nuestro caso de:
Ácaros: Dermatophagoides pteronyssinus (D1), Dermatophagoides farinae (D2).
Hongos: Alternaria alternata (M6), Cladosporium herbarum (M2).
Epitelios: Epitelio de gato (E1), epitelio de perro (E2).
Gramíneas: Cynodon dactylon (G2), Dactylis glomerata (G3), Lolium perenne (G5),
Phragmites communis (G7), Secale cereale (G12).
Malezas: Artemisia vulgaris (W6), Plantago lanceolata (W9), Chenopodium album
(W10), Parietaria judaica (W21).
Pólenes: Olea europeae (T9), Platanus acerifolia (T11), Cupressus sempervirens
(T23).
Grado de positividad
Porcentaje del área del habón producido por la histamina
- Mismo tamaño que control negativo
+ 25
++ 50
+++ 100
++++ 200
Tabla III. Clasificación del grado de positividad a un alergeno según el método
escandinavo.
MATERIALES Y MÉTODOS
74
b) Test in vitro: determinación de los niveles séricos de IgE
específica.
Para realizar la determinación de la IgE específica se utiliza el sistema automatizado
enzima-inmunoensayo (EIA) HYTEC 288 (HYCOR), que cuantifica en fase sólida la IgE
presente en el suero humano.
El fundamento de esta técnica (figura 15) se basa en la presencia de un extracto
alergénico unido a una fase sólida (o disco) que actúa como captador de las
moléculas de IgE presentes en las muestras séricas, fijándolas a dicha fase. Después
de un proceso de lavado, para eliminar los restos de muestra, el sistema añade un
anticuerpo anti-IgE conjugado con fosfatasa alcalina. Tras un nuevo lavado, la
solución sustrato PNPP (que contiene para-nitrofenil-fosfato) es añadida e incubada.
La reacción se detiene por adicción de solución Stop (NaOH 1N) y el color amarillento
que se desarrolla es medido por espectrofotometría. La concentración de IgE
específica, que es proporcional a la intensidad de color, viene dada por extrapolación
a partir de una curva estándar.
Procedimiento:
Las muestras se obtienen de los pacientes por venipuntura al vacío usando un tubo
con gel siliconizado SSTII. Se deja que la sangre coagule a temperatura ambiente
(durante aproximadamente 20-30 min), hasta que el coágulo empiece a retraerse, y a
Figura. 15. Determinación de la IgE específica por el método EIA-HYTEC 288.
sustrato conjugado
Adición
disco
IgE séric a
Lavado Adición
Lavado
alergeno
Adición
Lavado
e
Interpretación
automatizada:
Hjhjhj
hjhjhj
hjhjhj
hjhjh,
MATERIALES Y MÉTODOs
75
continuación se centrifuga a 1,620 x g, durante 20 min a 4ºC. El suero se recupera
con pipeta y se almacena a 4ºC.
Cuando se van a utilizar, los sueros se atemperan a temperatura ambiente durante
30 min. Tras la preparación de los reactivos necesarios (estándares, solución de
lavado, solución STOP, solución sustrato) como indica el fabricante, las muestras se
colocan en la gradilla del sistema HYTEC 288 y son analizadas automáticamente.
El sistema expresa los resultados en categorías, como sigue:
Negativo < 0.35 UI/ml
Clase I 0.35-0.70 UI/ml
Clase II 0.70-3.50 UI/ml
Clase III 3.50-17.50 UI/ml
Clase IV 17.50-50 UI/ml
Clase V 50-100 UI/ml
Clase VI > 100 UI/ml
c) Características de los sujetos en estudio.
Las muestras que componen nuestro estudio pertenecen a una población que engloba
individuos que siguen una distribución por edades comprendida entre los 18-60 años
y con un ratio por sexos (hombre/mujer) de aproximadamente 1.
Los pacientes alérgicos sufren asma bronquial, que fue diagnosticada por facultativos
según los criterios de la sociedad torácica americana (American Thoracic Society,
1962). Además, presentan las siguientes características: están altamente
sensibilizados a un/os determinado/s alergeno/s (presentan test cutáneos de ++++ y
clase superior a 4 de IgE específica en el suero), y se encuentran fuera de la época
estacional que desencadena el cuadro clínico (para eliminar activación celular basal
inespecífica). Ninguno es fumador, recibe tratamiento de hiposensibilización
(inmunoterapia), tiene tratamiento con medicamento (antihistamínicos, corticoides o
β2-agonistas), o ha experimentado episodios de asma durante los tres meses previos
1 UI/ml = 2.44 ng/ml
MATERIALES Y MÉTODOS
76
a la extracción de sangre. Asimismo ninguno ha manifestado infecciones del tracto
respiratorio cuatro semanas antes a la extracción.
Los pacientes sanos no atópicos no presentan sensibilización a los alergenos testados
y no están recibiendo ningún tipo de tratamiento.
II.2. OBTENCIÓN DE CÉLULAS A PARTIR DE SANGRE PERIFÉRICA.
Para obtener el material biológico de estudio (células) es necesaria la extracción de
sangre de los sujetos en estudio, lo cual fue aprobado por el comité ético del Hospital
Virgen Macarena de Sevilla. Además, antes de la misma, cada sujeto dio su
consentimiento informado.
a) Obtención de células mononucleares (linfocitos y
monocitos).
Para la separación de células mononucleares seguimos el método de Böyum (Böyum,
1986).
Procedimiento:
Se diluyen 30 ml de sangre de los sujetos en estudio, obtenida por venipuntura al
vacío en tubos heparinizados HD, con 30 ml de tampón PBS (dilución 1:1). La sangre
diluida se distribuye, con pipeta “pasteur”, en tubos de fondo cónico sobre una
solución de Ficoll-Hypaque a una proporción 1:2 (3 ml de ficoll y 6 ml de sangre). La
dilución debe añadirse cuidadosamente para evitar que no se mezcle con el Ficoll-
Hypaque. Las muestras se centrifugan a 1,258 x g, durante 20 min, a 4ºC,
obteniéndose las fracciones que se muestran en la figura 16. El anillo formado en la
interfase del gradiente, que contiene las células mononucleares (linfocitos y
monocitos) se recoge con pipeta “pasteur” y se coloca en tubos limpios.
Seguidamente se añade PBS hasta completar un volumen de 10 ml y se centrifugan a
400 x g, a 4ºC, durante 10 min. Al precipitado resultante se le da un choque
hipoosmótico para lisar los glóbulos rojos contaminantes, con el siguiente
procedimiento: se resuspende en 5 ml de agua destilada y desionizada (H2Odd)
durante 15-20 sg y, a continuación, se añaden 5 ml de NaCl al 1.8%. De esta forma
MATERIALES Y MÉTODOs
77
Células mononucleares
(linfocitos y monocitos)
glóbulos rojos
Ficoll
Sangre diluida
centrifugación
suero
se restaura la isoosmolaridad (0.9%). Se vuelve a centrifugar a 400 x g, a 4ºC,
durante 10 min. Después el precipitado se lava dos veces por resuspensión en 10 ml
de tampón PBS y centrifugación a 400 x g durante 10 min, a 4ºC. Las células
mononucleares ya obtenidas se resuspenden en medio de cultivo.
b) Purificación de linfocitos (eliminación de monocitos
residuales).
Procedimiento:
Las células mononucleares anteriormente obtenidas se resuspenden en medio de
cultivo y se incuban a 37ºC durante 1 h en placas de cultivo de plástico (placas de
Petri). Seguidamente, se aspira el medio de cultivo con los linfocitos, que se
mantienen en suspensión a diferencia de los monocitos que se adhieren al fondo de la
placa. Las suspensiones celulares así obtenidas se centrifugan a 400 x g, durante 10
min a 4ºC. Para conseguir una mejor purificación, los precipitados obtenidos se
resuspenden en 1 ml de medio de cultivo y se cultivan en presencia de 4 μg/ml de
anticuerpos IgG de ratón dirigidos contra el CD14 humano (marcador de monocitos)
durante 30 min a 4ºC. Posteriormente las células se lavan con 1 ml de tampón PBS y
centrifugación a 400 x g durante 10 min a 4ºC. El precipitado se resuspende en 1 ml
Figura 16. Primera centrifugación en la separación de células mononuclares
MATERIALES Y MÉTODOS
78
de tampón PBS y se incuba durante 30 min, a 4ºC, con 100 μl de anticuerpos IgG de
cabra (GAM) acoplados a esferas magnéticas dirigidos contra IgG de ratón, que están
a una concentración de 1 mg/ml y diluidos 1:20 en tampón PBS con 0.2% de BSA.
Tras un nuevo lavado con PBS, las células se resuspenden en 1 ml de medio de
cultivo, en un tubo cónico, y se colocan durante 30 min en una gradilla con un imán
acoplado. El imán fija a la pared del tubo las IgG acopladas a esferas magnéticas que
a su vez están unidas a las moléculas CD14 de los monocitos. Recogiendo con
cuidado la solución en suspensión obtendremos linfocitos altamente purificados.
c) Obtención de subpoblaciones linfocitarias T, B y NK.
En ciertos experimentos se utilizaron células T, B y NK altamente purificadas.
Procedimiento:
Para obtener cada una de las subpoblaciones linfocitarias se procede a una segunda
separación celular magnética.
Para obtener células T, tras la eliminación de los monocitos, los linfocitos se incuban
con una mezcla de anticuerpos contra el CD20 humano (marcador de linfocitos B) y
contra el CD56 humano (marcador de linfocitos NK), a 4 μg/ml cada uno. En el caso
de los B, los linfocitos se incuban con una mezcla de anticuerpos contra el CD3
humano (marcador de los linfocitos T) y contra el CD56 humano (marcador de
linfocitos NK), a 4 μg/ml cada uno. Por último, para purificar células NK, los linfocitos
se incuban con una mezcla de anticuerpos contra el CD3 humano y contra el CD20
humano, a 4 μg/ml cada uno. A continuación, en todos los casos, se procede de igual
forma que para la eliminación de los monocitos: después de la incubación durante 30
min a 4ºC, las células se lavan con PBS, se incuban con anti-IgG acoplados a esferas
magnéticas, se vuelven a lavar con PBS y se pasan por la gradilla con imán.
d) Obtención de células granulocíticas.
Para la separación de los granulocitos seguimos el método de Böyum (Böyum, 1986).
MATERIALES Y MÉTODOs
79
Procedimiento:
30 ml de sangre de los sujetos en estudio, obtenida por venipuntura al vacío en tubos
heparinizados HD son mezclados, durante 2 min aproximadamente, con una solución
de dextrano T500 al 10% en PBS, de forma que éste quede a una concentración final
de 0.7% (ej. a ∼10 ml de sangre se le añaden 700 μl de dextrano al 10%).
Posteriormente se deja sedimentar durante 45-60 min a temperatura ambiente.
Pasado este tiempo, se extrae la suspensión de color anaranjado formada en la fase
superior y se vierte con pipeta “Pasteur” en tubos que contienen una solución de
Ficoll-Hypaque, a una proporción de 1:2 de Ficoll: sangre. La suspensión debe
añadirse cuidadosamente para evitar que no se mezcle con el Ficoll-Hypaque.
Entonces, las muestras se centrifugan a 1,200 x g durante 20 min a 4ºC,
obteniéndose las fracciones mostradas en la figura 17.
La interfase de células mononucleares se recoge con pipeta “pasteur” y se desecha. El
suero y el ficoll se retiran. Al precipitado, que contiene la fracción de granulocitos y
eritrocitos, se le da un choque hiposmótico para lisar los glóbulos rojos contaminantes
(ver aislamiento de células monucleares) y el resultado se centrifuga a 400 x g
durante 5 min a 4ºC. El precipitado se somete a dos procesos de lavados por
resuspensión en 10 ml de PBS y centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4ºC.
Células mononucleares
(linfocitos y monocitos)
granulocitos con contaminación variable de glóbulos rojos
Ficoll
Suspensión
anaranjada
centrifugación
suero
Figura 17. Primera centrifugación en la separación de células granulocíticas.
MATERIALES Y MÉTODOS
80
Finalmente, el precipitado conseguido, que contiene los granulocitos, se resuspende
en medio de cultivo.
e) Purificación de neutrófilos (eliminación de eosinófilos
residuales).
Aunque por el método anteriormente descrito en II.2,d) se obtienen
mayoritariamente células polimorfonucleares (neutrófilos), aparece también una
contaminación residual de otras células granulocíticas, como son los eosinófilos.
Para obtener una población de neutrófilos purificados se usa el sistema de separación
celular magnética.
Procedimiento:
Las granulocitos resuspendidos en medio de cultivo se incuban con 4 μg/ml de
anticuerpos IgG de ratón dirigidos contra el CD9 humano (marcador de eosinófilos),
durante 30 min, a 4ºC. Con posterioridad las células se lavan con PBS, se incuban con
anti-IgG acoplados a esferas magnéticas, se vuelven a lavar con PBS y se pasan por
la gradilla con imán.
II.3. CUANTIFICACIÓN DEL NÚMERO DE CÉLULAS Y DETERMINACIÓN
DE LA VIABILIDAD CELULAR.
La viabilidad de las células obtenidas se determina mediante el test de exclusión con
azul tripán. El azul tripán es un colorante que penetra en células con pérdida de la
integridad de su membrana, apareciendo éstas teñidas de azul al microscopio.
(Hathway y col., 1964).
Procedimiento:
La solución de azul tripán se prepara al 0.4% en NaCl al 0.9%.
Para el contaje celular, se toma una alícuota de la suspensión celular, y se diluye 1:10
en tampón PBS. Después en un tubo “eppedorf” se mezclan 80 μl de PBS, 10 μl de
solución de azul tripán y 10 μl de la dilución de células, y se incuba durante 1 min. A
continuación se toman 10 μl de esta mezcla y se depositan sobre una cámara de
MATERIALES Y MÉTODOs
81
Neubauer 0.00025mm2 (Superior, Alemania). En el microscopio óptico a 40 aumentos
se cuentan las células localizadas en las zonas de 4x4 cuadrículas. Para calcular el
número de células y el porcentaje de viabilidad celular se aplican las siguientes
fórmulas:
nº células/ml = media de células contadas x 104 x dilución (10 en nuestro caso).
% viabilidad = (células no teñidas/células totales) x 100.
En todos los experimentos de la presente tesis la viabilidad celular fue del 95-98%.
II.4. CULTIVO CELULAR.
Procedimiento:
Las células obtenidas (linfocitos y neutrófilos) se cultivan en medio RPMI completo
(RPMI suplementado con 10% (v/v) de suero fetal inactivado, 2 mM de L-glutamina,
100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina y 250 ng/ml de anfotericina B)
Se mantienen a una temperatura de 37ºC y en una atmósfera del 5% de CO2 y 95%
de O2.
II.5. OBTENCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS.
a) Obtención de proteínas para el análisis de las
ciclooxigenasas.
Procedimiento:
Las células (5 x 106 / 1ml) se recogen y centrifugan a 400 x g durante 5 min a 4°C.
Los precipitados se lavan dos veces por resuspensión en 1 ml de PBS frío y
centrifugación a 400 x g durante 5 min, a 4°C. Seguidamente, los precipitados
celulares obtenidos se resuspenden en 50 μl de solución de lisis (50 mM Tris-HCl pH
8, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.1% SDS, 10 μg/ml aprotinina, 10
μg/ml leupeptina, 10 μg/ml inhibitor tripsina, 10 μg/ml N-tosyl-L-fenilalanil-clorometil
cetona (TPCK), 10 μg/ml captopril, 1 mM fenil metilsulfonil fluoruro (PMSF), 1 mM
benzamidina, y 10 mM iodoacetamida) y se mantienen en hielo durante 10 min,
agitando en el vórtex cada cierto tiempo. Después, las muestras se sonican en hielo
MATERIALES Y MÉTODOS
82
a 12 microns durante 2 sg. Las suspensiones resultantes se centrifugan a 12,000 x g
durante 5 min, a 4°C. Los sobrenadantes obtenidos, que corresponden a las
proteínas celulares totales, se dividen en dos fracciones: una alícuota se utiliza para
determinar la concentración de proteínas, y el resto se congela a -80ºC.
b) Obtención de proteínas para el análisis de las MAPKs.
Procedimiento:
Las células (5 x 106 / 1ml) se recogen y centrifugan a 400 x g durante 5 min a 4° C.
Los precipitados se lavan dos veces por resuspensión en 1 ml de PBS frío y
centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4° C. Seguidamente, los precipitados
celulares obtenidos se resuspenden en 50 μl de solución de lisis (20 mM Tris–HCl pH
7.4, 2 mM EDTA, 50 mM β -mercaptoetanol, 25 mM NaF, 1% Nonidet-P40, 1% Triton
X-100, 10 μg/ml aprotinina, 10 μg/ml leupeptina, 10 μg/ml inhibitor tripsina, 10
μg/ml N-tosyl-L-fenilalanil-clorometil cetona (TPCK), 10 μg/ml captopril, 1 mM fenil
metilsulfonil fluoruro (PMSF), 1 mM benzamidina, y 10 mM iodoacetamida, 2 mM de
diisopropil fluorofosfato, 2 mM de ortovanadato sódico y 100 μM de óxido de
fenilarsina (PAO)) y se mantienen en hielo durante 30 min, agitando cada cierto
tiempo. Después, las muestras se sonican en hielo a 12 microns durante 2 sg. Las
suspensiones resultantes se centrifugan a 12,000 x g durante 5 min, a 4° C. Los
sobrenadantes obtenidos, que corresponden a las proteínas celulares totales, se
dividen en dos fracciones: una alícuota se utiliza para determinar la concentración de
proteínas, y el resto se congela a -80ºC.
c) Cuantificación de proteínas.
Se basa en el método diseñado por Bradford (Bradford, 1976), fundamentado en el
desplazamiento de la longitud de onda máxima de absorción que sufre el azul de
Coomasie G-250 de 465 a 595 nm cuando se une a proteínas. La realización de la
determinación calorimétrica necesariamente debe referirse a una recta de calibrado
obtenida a partir de unas concentraciones conocidas de proteínas. El contenido
proteico del extracto se calcula por interpolación en dicha recta.
MATERIALES Y MÉTODOs
83
Procedimiento:
El único reactivo que se emplea para esa técnica es el reactivo de Bradford (10 mg de
azul de Coomasie brillante G-250 disuelto en 5 ml de etanol al 95%, 10 ml de ácido
ortofosfórico al 85% y H2Odd hasta completar un volumen de 100 ml).
El calibrado se realiza a partir de una disolución de albúmina de suero bovino (BSA)
de 0.1 μg/ml, mediante el siguiente protocolo. En pocillos rotulados como B, 1, 2, 3,
4, y 5, de una microplaca de 96 pocillos, se añaden por duplicado las cantidades
indicadas a continuación:
B 1 2 3 4 5
BSA (0.1 μg/ml) - 5 μl 10 μl 15 μl 20 μl 25 μl
R. Bradford 200 μl 195 μl 190 μl 185 μl 180 μl 175 μl
H2O dd 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl
[prot] μg/250 μl 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Se agita suavemente y se espera 5-10 min el desarrollo del color. Se mide la
absorbancia a 595 nm frente al blanco y se representa gráficamente la absorbancia
(media de los duplicados) a 595 nm frente a la concentración final de proteína. Se
determina la ecuación de la recta obtenida y se calcula la pendiente “a” de la misma.
Para determinar el contenido proteico del extracto celular, se toman 2 μl del mismo y
se diluyen en un tubo “eppendorf” hasta 20 μl con H2Odd (dilución 1:10). En esta
dilución se determina el contenido de proteínas, como sigue; en pocillos de una
microplaca de 96 pocillos se añade (por duplicado) 198 μl de reactivo de Bradford, 50
μl de H2Odd y 2 μl de extracto celular diluido. Se agita suavemente y se espera el
desarrollo del color durante 5-10 min. Se mide la absorbancia a 595 nm. Se
interpolan los datos obtenidos en la recta de calibrado, obteniéndose los resultados a
partir de la siguiente fórmula:
“a” recta pendienteblanco aabsorbanci - diluida muestra aabsorbanci 595595 ΧΧ
MATERIALES Y MÉTODOS
84
Por último sólo, falta multiplicar los resultados por el factor de dilución del extracto
(10 en nuestro caso) y dividirlo entre el número de μl añadidos en el pocillo (2 en
nuestro caso). De esta forma obtenemos la concentración de proteínas expresada en
μg/μl.
II.6. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR WESTERN-TRANSFERENCIA.
a) Preparación de muestras.
Procedimiento:
Las proteínas (50-80 μg) se mezclan con tampón de carga Laemmli reductor de la
siguiente forma: al volumen de la muestra se le añade 1/3 de ese volumen de
tampón de carga Laemmli 4X (250 mM Tris-HCl pH 6.8, 40% glicerol, 8% SDS,
0.004% azul de bromofenol y 20% de 2-β-mercaptoetanol). Después, las muestras
se hierven a 95° C durante 4 min y se centrifugan a 12,000 x g durante 5 min a 4°
C, para precipitar los restos celulares no disueltos (ADN, membranas...).
b) Electroforesis en geles de poliacrilamida con
dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE).
Procedimiento:
El sistema empleado es una electroforesis discontinua, que utiliza dos tipos de geles:
un gel concentrador (de poros grandes) en la zona superior, y un gel separador (de
poros pequeños) en la zona inferior.
La concentración de acrilamida del gel separador depende del peso molecular de la
proteína a analizar: gel separador al 7.5% (2.5 ml de acrilamida: bis-acrilamida
(29.2:0.8), 4.4 ml de H20dd, 2.5 ml de Tris-HCl 1.5 M pH 8.8, 100 μl de SDS al
10%, 50 μl de persulfato amónico al 10%, 5 μl de TEMED) se usa en los
experimentos de expresión de las proteínas COX-1 y COX-2; gel separador al 10%
(3.3 ml de acrilamida: bis-acrilamida (29.2:0.8), 3.5 ml de H20dd, 2.5 ml de Tris-
HCl 1.5 M pH 8.8, 100 μl de SDS al 10%, 50 μl de persulfato amónico al 10%, 5 μl de
TEMED), en los experimentos sobre fosforilación de MAPKs y degradación de I-κB.
La concentración de acrilamida del gel concentrador es siempre del 4% (430 μl de
acrilamida: bis-acrilamida (29.2:0.8), 1.88 ml de H20dd, 830 μl de Tris-HCl 0.5 M pH
6.8, 33 μl de SDS al 10%, 16 μl de persulfato amónico al 10%, 3.3 μl de TEMED).
MATERIALES Y MÉTODOs
85
Una vez preparados, los geles se sumergen en una cubeta llena de tampón de
electroforesis (25mM Tris base, 192 mM Glicina, 0,1% SDS, pH 8.3). Después, las
muestras se depositan en cada uno de los pocillos del gel concentrador, cargando
siempre la misma cantidad de proteínas (50-80 μg). También en uno de los pocillos
se carga un marcador de peso molecular. Seguidamente, los geles se someten una
corriente eléctrica con voltaje constante de 150 voltios durante aproximadamente 1
h. La electroforesis se detiene cuando el frente de desplazamiento se sitúa
aproximadamente a 5 mm del límite inferior del gel.
c) Transferencia de proteínas a membranas de fluoruro de
polivinilideno (PVDF).
Procedimiento:
Las transferencias se realizaban por el método semi-seco usando el sistema Trans-
blot SD (Bio-Rad, Ritchmond, USA). En primer lugar, las membranas de PVDF se
activan por incubación en metanol absoluto durante 30 sg. Después, las membranas
junto con los otros elementos necesarios para la transferencia (gel de electroforesis y
papeles de filtro) se equilibran en tampón de transferencia (25mM Tris base, 192 mM
Glicina, 20% metanol) durante 5-10 min. Siguiendo las instrucciones del fabricante,
los distintos elementos se ensamblan en el cassette de tranferencia, evitando la
formación de burbujas de aire, y se transfieren por aplicación de una corriente
eléctrica con voltaje constante de 15 voltios, durante 45 min. Una vez completada y
siguiendo el protocolo de detección rápida de proteínas (Mansfield, 1995), las
membranas se lavan dos veces en H20dd durante 5 min, para eliminar el exceso de
sales. A continuación se sumergen en metanol absoluto durante 30 sg y se secan a
temperatura ambiente durante 1-2 h o bien a 37°C durante 30 min.
d) Incubación de las membranas con anticuerpos.
Procedimiento:
Las membranas se incuban con los correspondientes anticuerpos primarios (ver
dilución y tiempo en tabla siguiente), diluidos en tampón PBS suplementado con
0.02% de Tween-20 y 1% de albúmina humana. Tras la incubación, se lavan 3 veces
MATERIALES Y MÉTODOS
86
durante 15 min con tampón PBS y se incuban 30-45 min con los correspondientes
anticuerpos secundarios unidos a peroxidasa (HRP) (anti-ratón o anti-conejo),
diluidos 1:10.000 en tampón PBS suplementados con 0.5% de caseína. Tras ello, de
nuevo se vuelven a lavar con tampón PBS (3 veces durante 15 min).
Anticuerpo Origen Dilución Tiempo incubación
anti-COX-2 ratón 1:2000 2 h, Ta ambiente.
anti-COX-1 conejo 1:750 “Overnight”, 4ºC
anti-fosfo ERK 1/2 conejo 1:1000 “Overnight”, 4ºC
anti-total ERK 1/2 conejo 1:3000 2 h, Ta ambiente.
anti-fosfo p38 conejo 1:2000 2 h, Ta ambiente.
anti–total p38 conejo 1:2000 2 h, Ta ambiente.
anti-fosfo JNK 1/2 ratón 1:2000 2 h, Ta ambiente.
anti-total JNK 1/2 ratón 1:2000 2 h, Ta ambiente.
anti-IκB conejo 1:4000 2 h, Ta ambiente.
anti-β actina ratón 1:3000 2h, Tª ambiente.
e) Detección de bandas específicas por quimioluminiscencia.
Esta técnica es equivalente a la usada en el Kit ECL de Amersham-Pharmacia, y está
basada en la emisión de quimioluminiscencia a partir de luminol en presencia de H2O2
y de 4-iodofenol (4-IP) como amplificador de la luz emitida (Hodgson y col., 1989).
Procedimiento:
Después de los lavados con PBS, la membrana se incuba durante 1-2 min con 10 ml
de solución de quimioluminiscencia * (10 mM Tris-HCl pH 8.3, 2.25 mM luminol, 0.45
mM 4-IP y H2O2 al 0.015%) a temperatura ambiente. A continuación, se escurre el
exceso de la solución y se coloca en un cassette entre un papel de filtro y un
plástico. Sobre ella se expone una película fotográfica y después de 1-10 min se
revela por incubación en solución de revelado, ácido acético al 1%, H20dd y solución
MATERIALES Y MÉTODOs
87
fijadora, consecutivamente.
* Para preparar la solución de quimioluminiscencia: pesar 1 mg de 4-IP y disolverlo en 5 ml de
10 mM de Tris-HCl pH 8.3 (es preciso su disolución completa, por ello agitar de 15 a 30 min).
Disolver 4 mg de luminol en 20-25 μl de NaOH 1N y completar hasta 5 ml con 10 mM de Tris-
HCl pH 8.3.
f) Limpieza de una membrana de anticuerpos (“stripping”).
En algunos experimentos una misma membrana se utiliza simultáneamente para
detectar dos proteínas distintas o una misma proteína en dos formas distintas (por
ejemplo, I-κB y β-actina o fosfo-p38 y total p38). En este caso, cuando los
anticuerpos primarios que reconocen sus proteínas dianas tienen en común la misma
fuente, es decir, los dos proceden de ratón o de conejo, es necesario que entre la
incubación con los anticuerpos se realice esta técnica.
Procedimiento:
Las membranas se lavan tres veces en PBS durante 10 min. Después se incuban a
37° C durante 30-45 min en tampón de limpieza (“stripping”) (62.5 mM Tris-HCl, pH
6.8; 2 mM EDTA; 100 mM 2-β-mercaptoetanol). Tras este periodo, las membranas se
vuelven a lavar en PBS, se incuban en metanol absoluto durante 30 sg, y se secan a
temperatura ambiente durante 1-2 h o a 37°C durante 30 min. A continuación, las
membranas se incuban con los anticuerpos apropiados y se realiza el ensayo de
quimioluminiscencia para detectar las bandas específicas (ver apartados anteriores).
II.7. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR INMUNOCITOQUÍMICA.
Procedimiento:
Los linfocitos (2 x 106 células/ml) se recogen por centrifugación a 400 x g durante 5
min, a 4ºC. Los precipitados se lavan dos veces por resuspensión en 1 ml de PBS frío
y centrifugación 400 x g durante 5 min, a 4ºC. Seguidamente, los precipitados se
resuspenden en 300 μl de PBS y se extienden sobre cubres cubiertos de poli-L-lisina.
Los cubres se incuban en la estufa de cultivo, a 37ºC, durante 15 min y luego se
lavan con PBS. Tras el lavado, se fijan con paraformaldehído al 2% (en PBS) por 10
MATERIALES Y MÉTODOS
88
min y luego se vuelven a lavar con tampón PBS. A continuación, se bloquean y
permeabilizan, durante 15 min, a temperatura ambiente, con PBS conteniendo 1%
BSA y 0.1% Tritón X-100, tras lo cual se vuelven a lavar con PBS. Tras ello, se
incuban con el anticuerpo primario (en nuestro caso, IgG de ratón-anti COX-2
humana a dilución 1:100 en tampón PBS) durante 1 h a temperatura ambiente y
luego se lavan nuevamente, por dos veces, con PBS. A continuación, se marcan con
anticuerpo secundario (IgG de cabra-anti IgG de ratón unido a isotiocianato de
fluoresceína (FITC) a dilución 1:100 en PBS) durante 30 min, a temperatura
ambiente, y se vuelven a lavar (2 veces) con PBS. Finalmente, se montan sobre
portas, usando como medio de montaje glicerol al 90% (en PBS) y se visualizan en un
microscopio de fluorescencia NIKON-EFD-3 (NIKON-IZASA, Barcelona, España).
II.8. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR CITOMETRÍA DE FLUJO.
La técnica de citometría de flujo se utiliza, en nuestro caso, para el tipaje de las
subpoblaciones de linfocitos (T, B o NK) que expresan, tras estimulación, la COX-2. El
protocolo evalúa primero los antígenos de superficie de cada subpoblación (CD3,
CD20 y CD56) y a después analiza, tras permeabilización celular, la expresión
intracelular del enzima COX-2.
Procedimiento:
Los linfocitos (2 x 106 células/ml) se recogen por centrifugación a 400 x g durante 5
min a 4ºC. Los precipitados se lavan dos veces por resuspensión en 1 ml de PBS frío
y centrifugación 400 x g durante 5 min a 4ºC. Posteriormente los precipitados se
resuspenden en 50 μl de PBS y se marcan, durante 15 min, a temperatura ambiente y
en oscuridad, con 20 μl de anticuerpo anti-antígeno de superficie (anti-CD3PE, anti-
CD20PE, anti-CD56PE) ó 20 μl de control isotípico IgG1-PE, según el caso. A
continuación se fijan con 100 μl de reactivo de fijación (FIX & PERM A), durante otros
15 min, en las mismas condiciones, tras lo cual se lavan en 1 ml de PBS frío y
centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4ºC. El precipitado celular se resuspende en
100 μl de reactivo de permeabilización (FIX & PERM B) y se marca con 10 μl (1 μg) de
MATERIALES Y MÉTODOs
89
anti-COX-2 FITC ó 20 μl de control isotípico IgG1-FITC, según el caso, durante 15
min, a 4ºC y en oscuridad. Pasado el tiempo, las células se vuelven a lavar con 1 ml
de PBS frío y centrifugación 400 x g durante 5 min a 4ºC. Por último, el precipitado se
resuspende en 500 μl del mismo tampón (PBS) y se analiza por en un citómetro de
flujo EPICS-ELITE (Beckman-Coulter-IZASA, Barcelona, España).
II.9. DISOCIACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS UNIDAS A SUPERFICIE
CELULAR Y DETERMINACIÓN DE IgE e IgG ESPECÍFICA “CELULAR”.
Para disociar las inmunoglobulinas de la superficie celular se usa el protocolo descrito
por (Ishizaka y col., 1974).
Procedimiento:
Las células (108 /ml) se resuspenden en 1 ml de tampón acetato (50 mM acetato
sódico pH 4, 85 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.03% BSA) y se incuban a 4ºC durante 3 min.
Tras ello se les añade 1 ml de tampón veronal-gelatina (1.8 mM barbital sódico, 3.1
mM ácido barbitúrico, 0.1% gelatina, 0.05 mM MgCl2, 141 mM NaCl, 0.15 mM CaCl2,
pH 7.4) y se centrifugan a 400 x g durante 5 min a 4ºC. El sobrenadante se recoge y
se neutraliza con 15-16 μl de NaOH 1N. A continuación se usa como fuente para
determinar la IgE o IgG específica “celular”.
La determinación de la IgE específica celular se lleva a cabo por dos métodos: por
enzima-inmunoensayo o por western-transferencia. Para el primero, se usa el sistema
automatizado HYTEC 288 (HYCOR) (ver apartado II.1 b)). Para el análisis por
western-transferencia se lleva a cabo el protocolo antes descrito: los extractos de
cada uno de los alergenos (80 μg/pocillo) se separan mediante electroforesis en geles
de poliacrilamida, bajo condiciones reductoras y se transfieren a membranas de
PVDF. Tras bloqueo por secado, las membranas se incuban durante 12 h, a
temperatura ambiente y agitación constante, con los sobrenandantes antes
obtenidos, diluidos 1:7 en tampón veronal-gelatina. Después de un ciclo de lavado,
los filtros se incuban durante 1 h con anticuerpos anti-IgE humana unidos a
peroxidasa (HRP), diluidos 1:750 en tampón veronal-gelatina. A continuación se
MATERIALES Y MÉTODOS
90
procede con otro ciclo de lavado y las bandas inmunorreactivas se visualizan por
quimioluminiscencia por el método del luminol y iodofenol.
La determinación de la IgG específica “celular” se realiza por el método de enzima-
inmunoensayo, mediante el sistema automatizado HYTEC 288 (HYCOR). En este caso,
el fundamento para la medición de la IgG es el mismo que para la IgE, con la
salvedad que el anticuerpo conjugado que se usa es una anti-IgG.
II.10. ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE ARN MENSAJEROS (ARNm) POR
RT-PCR.
a) Obtención del ARN celular total.
La extracción del ARN debe hacerse en las máximas condiciones de esterilidad y
condiciones libres de ARNasas. El H2Odd utilizada en todo el proceso de ARN debe ser
tratada con dietilpirocarbonato (DEPC). El DEPC es utilizado como potente inhibidor
de ARNasas. Se prepara diluyéndolo al 0.1% en H2Odd durante 12 h y en agitación,
para permitir una incorporación completa del producto; a continuación se autoclava la
solución con el fin de destruir el DEPC, que a la temperatura y presión del autoclave
se degrada a dióxido de carbono y etanol, ambos productos muy volátiles. Todas las
soluciones que estén en contacto con el ARN se preparan en H2Odd-DEPC. También
todo el material que se utilice será exclusivo para el aislamiento del ARN y lavado con
H2Odd-DEPC y los reactivos deberán se grado “biología molecular” y estar libre de
ARNasas.
Procedimiento:
En el caso de los linfocitos, el ARN total se aísla siguiendo el método de Chomczynsky
y Sacchi (Chomczynsky y col., 1987).
Las células se recogen y centrifugan a 400 x g durante 5 min a 4ºC. Los precipitados
se lavan dos veces por resuspensión en 1 ml de PBS frío y centrifugación 400 x g
durante 5 min a 4ºC. Seguidamente los precipitados se homogenizan en frío, con
pipeta, en 500 μl de solución desnaturalizante (isotiocianato de guanidinio 4M, citrato
sódico 25mM pH 7, sarcosil 0.5%, 0.1M 2-β-mercaptoetanol). Se añaden 50 μl de
MATERIALES Y MÉTODOs
91
acetato sódico 2M pH 4, 500 μl de fenol saturado en agua pH 4 y 100 μl de
cloroformo: isoamilalcohol (24:1). La mezcla se agita durante 1 min y se deja en
hielo 20 min; a continuación se centrifuga a 13,000 x g durante 20 min a 4ºC. La
fase acuosa superior se transfiere a un nuevo tubo “eppendorf” al que se añade 1
volumen de isopropanol y se deja precipitar el ARN durante 2 h a –20ºC. El ARN se
recupera centrifugando a 13,000 x g durante 20 min a 4ºC. El precipitado se lava por
dos veces con 500 μl de etanol frío al 75%, y centrifugación a 13,000 x g durante 5
min a 4° C.
Posteriormente, y tras descartar los sobrenadantes, las muestras se secan en un
liofilizador durante 5-10 min a 37°C, y después se disuelven en 60 μl de H20dd-DEPC
autoclavada por calentamiento a 68°C durante 5 min. Las muestras obtenidas, que
corresponden a ARN celular total, se dividen en dos fracciones: una alícuota se utiliza
para determinar la concentración de ARN, y el resto se almacena a –80ºC.
En el caso de los neutrófilos, debido a su escasa cantidad de ARN, se usa el kit
comercial “RNA isolation kit RNeasy”, siguiendo las instrucciones en él detalladas.
b) Cuantificación de la concentración de ARN.
Procedimiento:
La concentración de ARN de las muestras se determina midiendo en un
espectrofotómetro la absorbancia (A) a una longitud de onda de 260 nm y, después,
empleando la siguiente fórmula:
[ARN](μg/ml) = A260.x 44.19 x dilución
La pureza de las muestras se estima utilizando la relación A260/A280, siendo correcto
un valor entre 1.7 y 1.9.
c) Transcripción inversa del ARNm a ADN complementario
(ADNc).
La síntesis de ADN complementario (ADNc) a partir de ARN se hace mediante la
enzima transcriptasa inversa.
MATERIALES Y MÉTODOS
92
Procedimiento:
En un tubo “eppendorf” se pipetea 1 μg de ARN que se desnaturaliza calentándolo
durante 5 min a 65ºC. A lo anterior se añaden 8 μl de tampón (5x) del enzima
transcriptasa inversa, 4 μl de una mezcla de nucleótidos (dNTPs) 10 mM, 4 μl de DTT
10 mM, 20 unidades de inhibidor de ARNasa (RNAsaSin), 0.3 μM de cebadores
aleatorios (“random primers”) y 200 unidades de transcriptasa inversa (M-MLV), en
un volumen de 40 μl. La reacción se incuba a 37ºC durante 1 h. Transcurrido este
tiempo se para la reacción calentando a 95ºC durante 5 min. En todo el proceso se
usan tubos blanco de reacción en los que el volumen equivalente de ARN se sustituye
por H2Odd-DEPC.
d) Amplificación del ADNc por la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) convencional.
Procedimiento:
En tubos de PCR silicolizados de 0.2 ml, en un volumen final de 10 μl, se mezclan 2
μl de ADNc (cuya concentración debe ser de aproximadamente 25 ng/μl), 1 μl de
tampón de la Taq polimerasa (10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5mM MgCl2), 200
μM dNTPs, 5 pmoles de cada cebador, 5% DMSO y 1 unidad de Taq polimerasa. A
continuación se introducen en un termociclador Eppendorf Mastercycler personal
(Eppendorf Ibérica, Madrid, España).
Los cebadores utilizados para amplificar los genes que se indican fueron los
siguientes:
gen de la COX-2 humana (Nº Acceso Genebank: M90100)
sentido: 5’-TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA ATT GCT-3’
antisentido: 5’-AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT-3’
gen de la IL-8 humana (Nº acceso Genebank: NM_000584)
sentido:5’-CTT GGC AGC CTT CCT GAT TT-3’
antisentido: 5’-CTC AGC CCT CTT CAA AAA CT-3’
MATERIALES Y MÉTODOs
93
gen del TNF-α humano (Nº acceso Genebank: BC028148)
sentido: 5’-AAG CCT GTA GCC CAT GTT GT-3’
antisentido: 5’-CCA CCC ATG GCA AAT TCC ATG GCA-3’
gen de la GAPDH humana (Nº acceso Genebank: J04038)
sentido: 5’-CCA CCC ATG GCA AAT TCC ATG GCA-3’
antisentido: 5’-TCT AGA CGG CAG GTC AGG TCC ACC-3’
gen de la β-actina humana (Nº acceso Genebank:NG_003162)
sentido: 5´-ATG TTT GAG ACC TTC AAC AC-3’
antisentido: 5’- CAC GTC ACA CTT CAT GAT G-3’
Las condiciones de amplificación usadas en el termociclador fueron:
e) Separación de los productos obtenidos por PCR
convencional mediante electroforesis en geles de agarosa.
Los fragmentos de ADNc amplificados por PCR, se visualizaron en geles de agarosa
con bromuro de etidio.
Procedimiento:
Los productos de PCR se mezclan con 2 μl de tampón de carga (10 mM Tris-HCl pH
7.5, 50 mM EDTA, Ficoll-400 al 15%, azul de bromofenol al 0.03%, Xylen cianol al
0.03% y Orange G al 0.4%) y se depositan en los pocillos de geles de agarosa
preparados al 1% (p/v) en tampón TBE 1X (89mM Tris, 89 mM Borato, 2 mM EDTA) y
COX-2/ GAPDH
5 min/ 95ºC
1 min/ 94ºC
1 min/ 60ºC
1 min/ 72ºC
5 min/ 72ºC
30-35 ciclos
IL-8/ TNF-α/β-actina
5 min/ 95ºC
1 min/ 94ºC
1 min/ 58ºC
1 min/ 72ºC
5 min/ 72ºC
30-35 ciclos
MATERIALES Y MÉTODOS
94
con 0.5 μg/ml de bromuro de etidio. Las muestras, junto al marcador de peso
molecular, se separan en tampón TBE con una corriente de 90 voltios, durante 1 h. La
electroforesis se detiene cuando el frente de desplazamiento se sitúa
aproximadamente a 5 mm del límite del gel. Finalmente las bandas (COX-2: 300 pb;
IL-8: 265 pb; TNF-α: 330 pb; GAPDH: 600 pb; β-actina: 489 pb) se visualizan en un
transiluminador BioDoc-It TM (UVP, Upland, California, USA).
f) Amplificación del ADNc por la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) a tiempo real.
La reacción de amplificación se realiza en un termociclador ABI Prism 7000 (Applied-
Biosystems, California, USA).
Procedimiento:
Se lleva a cabo por triplicado en placas de 96 pocillos, en un volumen final de 25 μl
para cada réplica, usando el kit comercial “QuantiTect SYBR Green PCR”. Para ello, en
cada pocillo se mezclan 2 μl de ADNc (cuya concentración debe ser de 2.5 ng/ml) con
5 pmoles de cada cebador, 12.5 μl de SYBR Green máster-mix comercial (contiene la
Taq polimerasa, el tampón de reacción, los DNTPs y el SYBR Green) y el resto de
H20dd libre de RNAasas.
Los cebadores utilizados para amplificar los genes que se indican y los tamaños de
banda obtenidos tras la amplificación fueron los siguientes:
gen de la IL-8 humana (Nº acceso Genebank: NM_000584) (tamaño: 50pb)
sentido: 5’-TTAGTGACGCGCATGAATGG-3’
antisentido: 5’-TGTGGTTTCGCTGGATAGTAGGT-3’
gen del ARNr 28S humano (Nº acceso Genebank: M11167) (tamaño: 67 pb)
sentido: 5’-GTGACGCGCATGAATGGA-3’
antisentido: 5’- CCCTTGGCTGTGGTTTCG-3’
Las condiciones de amplificación usadas en el termociclador fueron:
MATERIALES Y MÉTODOs
95
g) Cuantificación de la expresión génica a partir de la PCR a
tiempo real.
Para la cuantificación relativa de la expresión génica se usa el valor CT (que
representa el primer ciclo de PCR en el que se detecta una fluorescencia cuyo valor es
10 veces superior a la desviación estándar del ruido de fondo basal).
Procedimiento:
A la media de los valores CT de cada condición experimental de nuestro gen problema
(en nuestro caso el de la IL-8) se le sustrae la media de los valores CT de cada
condición experimental de nuestro gen interno (en nuestro caso el del ARNr28S),
obteniéndose unos valores que se denominan ΔCT. A continuación se calculan los
valores ΔΔCT, que se obtienen al restar a un calibrador (que en nuestro caso
consideramos el valor ΔCT de las células sin estimular) cada uno de los valores ΔCT
obtenidos anteriormente. Por último basta con sólo emplear la fórmula 2-∆∆CT y
representar los valores obtenidos
Ejemplo:
Gen problema Control interno
Células sin estimular: CTX = 25.27 CTX = 15.52
Células con 6 h. de tratamiento: CTX = 23.70 CTX = 15.65
Se calculan primero los valores ΔCT:
Células sin estimular: ΔCT= 25.27-15.52 = 9.74
Células con 6 h. de tratamiento: ΔCT= 23.70-15.65= 8.05
Luego se calculan los valores ΔΔCT:
10 min/ 95º C
15 sg / 95º C
1 min/ 60º C
20 min/ 60 95º C (disociación)
40 cicl.
MATERIALES Y MÉTODOS
96
Células sin estimular: ΔΔCT= 9.74 - 9.74 = 0
Células con 6 h. de tratamiento: ΔΔCT= 9.74 - 8.05 = 1.69
Por último se aplica la fórmula 2-∆∆CT:
Células sin estimular: 2-∆∆CT= 2 0 =1
Células con 6 h. de tratamiento: 2-∆∆CT = 2 1.69 = 3.2
Con los resultados de este ejemplo podríamos decir que nuestro tratamiento induce
nuestro gen problema 2 veces, con respecto a la cantidad observada en las células sin
estimular.
II.11. MÉTODO DE ANÁLISIS DE ACTIVIDAD CALCINEURINA.
La actividad de la fosfatasa IIB o calcineurina se ensaya usando como sustrato un
péptido sintético (DLDVPIPGRFDRRVSVAAE) correspondiente al sitio de fosforilación
de la subunidad RII de la proteína quinasa A. El péptido se fosforila in vitro, con γ-32P-
ATP, en presencia de la PKA (la subunidad catalítica).
El péptido RII fosforilado se incuba con el extracto celular. Si en el extracto la
calcineurina está activa, desfosforila al péptido, liberándose fósforo radiactivo, que se
detecta en contador–beta (Hubbard y col., 1991).
a) Marcaje del péptido.
R-II + ATP-γ-32 R-II- P-γ-32 + ADP
Procedimiento:
El marcaje se realiza mezclando en un tubo “eppendorf” 23 nmoles de péptido RII con
100 μCi de γ-32P-ATP, 60 nmoles de ATP frío y 10 μg de PKA, completando hasta un
volumen final de 200 μl con tampón de incubación (40 mM HEPES pH 6.5, 0.4 mM
EGTA, 0.8 mM EDTA, 4 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.1 mg/ml BSA). La mezcla de
reacción se incuba 2 h a 30ºC y a continuación se para la reacción a 4ºC. El contenido
del “eppendorf” se carga en una columna cromatográfica de tipo C18 (Sep-Pak). El
ATP radioactivo que no ha reaccionado se precipita con ácido trifluoroacético (TFA) al
0.1% (en agua). El péptido marcado (R-II-P32) se eluye de la columna mediante
adiciones sucesivas de 500 μl de acetonitrilo al 30% en 0.1% TFA. El péptido eluido
PKA
MATERIALES Y MÉTODOs
97
se seca y se diluye en 3 ml de tampón de resuspensión (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1
mM NaCl, 6 mM MgCl2, 0.6 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.1 mg/ml BSA). Se hacen
alícuotas, que se guardan a – 80ºC.
b) Preparación de los extractos celulares.
Procedimiento:
Tras los correspondientes tratamientos, los linfocitos (5 x 106 células /1 ml) se
recogen y se centrifugan a 400 x g durante 5 min, a 4ºC. Los precipitados se lavan
dos veces por resuspensión en 1 ml de PBS frío y centrifugación 400 x g durante 5
min, a 4ºC. El precipitado se lisa en 50 μl de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 7.5,
0.1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 0.2% Triton X-100, 10 μg/ml aprotinina, 10
μg/ml leupeptina, 10 μg/ml inhibitor tripsina, 10 μg/ml N-tosyl-L-fenilalanil-clorometil
cetona (TPCK), 10 μg/ml captopril, 1 mM fenil metilsulfonil fluoruro (PMSF), 1 mM
benzamidina, y 10 mM iodoacetamida) y se mantienen en hielo durante 30 min,
agitando cada cierto tiempo. Después, las muestras se sonican en hielo a 12 microns
durante 2 sg. Las suspensiones resultantes se centrifugan a 12,000 x g durante 5
min a 4° C. Los sobrenadantes obtenidos se dividen en dos fracciones: una alícuota
se utiliza para determinar la concentración de proteínas, y el resto se congela a
-80ºC.
c) Incubación del extracto celular con el péptido marcado.
R-II-P-γ-32 R-II + Pi-γ-32
Procedimiento:
80μg de proteínas se incuban con 20 μl de fosfopéptido, en presencia de 500 nM de
ácido okadaico (que inhibe las fosfatasa IA y IIA) y el volumen se lleva hasta 60μl con
tampón de ensayo (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 0.5 mM DTT,
0.1 mM CaCl2, 0.1 mg/ml BSA). La mezcla se incuba durante 15 min a 30ºC y la
reacción se para con 500 μl de tricloroacético al 5% (en tampón fosfato 100 mM, pH
7) frío. La mezcla anterior se pasa por columnas cromatográficas de resina positiva
Dowex-activada. Las columnas se lavan con 500 μl de H2Odd. El volumen eluido (que
CaN
MATERIALES Y MÉTODOS
98
contiene el fósforo liberado) se recoge en viales de centelleo. Las cuentas por minuto
(c.p.m.) de la radioactividad se cuantifican en un contador microbeta-Wallac (Perkin-
Elmer Hispania, Barcelona, España).
d) Cálculo de los resultados.
Procedimiento:
Los resultados se expresan de la siguiente fórmula:
c.p.m obtenidas en cada muestra/actividad específica/n.º min/ mg proteínas
La actividad específica se calcula así:
Partimos de 23 nmoles de R-II, y suponemos que recuperamos 20 nmoles de RII-
P-γ-32= 20000 pmoles.
[RII- Pi-γ-32] =20000 pmoles/ (volumen de resuspensión del péptido) (en nuestro
caso, 3 ml ó 3000μl)= 6.66pmoles /μl. Como en cada muestra usamos 20 μl de
péptido, entonces, 153.2 pmoles/muestra.
Medimos las cuentas que hay en 1 μl de péptido marcado. Suponemos que
obtenemos 2991 c.p.m. Entonces la actividad total sería, 2991 cpm/μl x 20 μl
muestra = 59620 c.p.m./muestra.
Actividad específica = 59620 / 153.2 = 390 c.p.m./ p moles de Pi32 liberado o RII
transformado.
II.12.ANÁLISIS DEL CAMBIO EN LA MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA
(EMSA: ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAY).
a) Preparación de extractos nucleares.
Procedimiento:
Después del tratamiento, los linfocitos (10 x 106 células /1ml) se recogen y se
centrifugan a 400 x g durante 5 min, a 4ºC. Los precipitados se lavan dos veces por
resuspensión en 1 ml de PBS frío y centrifugación a 400 x g durante 5 min, a 4ºC. El
precipitado se lisa en 100 μl de tampón de lisis hipotónico (20 mM HEPES pH 7.9, 10
MATERIALES Y MÉTODOs
99
mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT, 20 mM NaF, 10% glicerol, 10 μg/ml aprotinina, 10
μg/ml leupeptina, 10 μg/ml inhibitor tripsina, 10 μg/ml N-tosyl-L-fenilalanil-clorometil
cetona (TPCK), 10 μg/ml captopril, 1 mM fenil metilsulfonil fluoruro (PMSF), 1 mM
benzamidina, y 10 mM iodoacetamida, 2 mM de diisopropil fluorofosfato, 2 mM de
ortovanadato sódico y 100 μM de óxido de fenilarsina (PAO)), y se mantienen en
hielo durante 30 min, agitando cada cierto tiempo. En los últimos 5 min se añaden 2
μl de Nonidet P-40 al 10% ([ ] final de 0,2%), y a continuación se centrifuga a
12,000 x g durante 10 min, a 4° C. Los sobrenadantes obtenidos, que corresponden
a las proteínas citoplásmicas, se dividen en dos fracciones: una alícuota se utiliza
para determinar la concentración de proteínas, y el resto, donde se analizará por
western-transferencia la degradación de I-κB y la β-actina, se congela a -80ºC.
El precipitado (células no rotas y núcleos intactos) se lava 2 veces con tampón
hipotónico, para eliminar todo el resto de células no rotas. Tras el lavado, el
precipitado se lisa con tampón hipertónico (tampón hipotónico suplementado con
10% glicerol y 420 mM NaCl y 0.2% de Nonidet P-40). Cuando se añade el tampón
las células se resuspenden en él por sonicación suave (12 microns durante 2 sg.) A
continuación se mantienen en hielo durante 30 min, agitando cada cierto tiempo y al
final se vuelven a sonicar en hielo a 12 microns durante 2 sg. Las suspensiones
resultantes se centrifugan a 12,000 x g durante 10 min, a 4°C. Los sobrenadantes
obtenidos, que corresponden a las proteínas nucleares, se dividen en dos fracciones:
una alícuota se utiliza para determinar la concentración de proteínas, y el resto se
congela a -80ºC.
b) Marcaje de los oligonucleótidos con γ 32P-ATP.
Las secuencias de los oligonucleótidos usadas fueron las siguientes:
5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’
3’-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5’
Sitio de unión
consenso
NF-κB
MATERIALES Y MÉTODOS
100
5’-GGA GGA AAA ACT GTT TCA TAC AGA AGG CGT-3’
3’-CCT CCT TTT TGA CAA AGT ATG TCT TCC GCA-5’
Procedimiento:
Cada una de las cadenas simples de los oligos se resuspenden a una concentración de
100 ng/μl en tampón TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) y se calientan a 95ºC
durante 5 min. Volúmenes iguales de cada una de las cadenas del oligo se mezclan,
obteniéndose de esta forma el oligo de doble cadena, que se guarda a -80ºC.
Para el marcaje, a 50-100 ng de oligo (de doble cadena) se le añaden 0.5 μl de
tampón de desnaturalización (200 mM Tris, pH 9.5; 10 mM espermidina; 1 mM EDTA)
y la mezcla se completa con H2O dd, hasta un volumen final de 5 μl. La mezcla se
desnaturaliza a 70ºC durante 5 min y a continuación se deja enfriar en hielo, para
evitar que se forme de nuevo la doble cadena de ADN. El ADN desnaturalizado se
centrifuga con un pulso a 12,000 x g a 4ºC y seguidamente se incuba con 5 μl
tampón de marcaje 10X (700 mM Tris-HCl, pH 7.6; 100 mM MgCl2; 150 mM DTT; 10
mM espermidina), 1μl BSA (2mg/ml), 30 unidades de T4 polinucleótido quinasa y 20-
30 μCi de γ-32P-ATP. La mezcla se completa hasta un volumen final de 50 μl y se
marca durante 1 h a 37ºC. Transcurrido el tiempo, se para la reacción en hielo. El
oligo marcado se purifica a través de una columna de Sephadex G-50, para eliminar
el γ-32P-ATP no incorporado. La sonda de ADN marcada se recupera en un tubo
“eppendorf”. 1 μl de sonda marcada se diluye en 1 ml de líquido de centelleo y se usa
para medir la eficiencia de marcaje en contador-beta. El resto se guarda a -80ºC
hasta su uso.
c) Reacción de unión oligo-extracto nuclear, electroforesis y
revelado.
Procedimiento:
En un tubo “eppendorf” se mezclan 8-10 μg de proteínas nucleares con 10 μl de
NF-AT
MATERIALES Y MÉTODOs
101
tampón de incubación (20mM HEPES pH 7.8, 6% glicerol, 1 mM EDTA, 50 mM KCl,
1mM DTT, 01% Nonidet-P40), 1 μl de poli d-IC (1 μg/μl), 1 μl poli-L-lisina (0.1 μg/μl),
sonda radiactiva (100.000 c.p.m) y se completa hasta un volumen final de 20 μl. La
mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 45 min. Pasado este tiempo, se
añaden 5 μl de tampón de carga (60% TBE 0.25X, 40% glicerol). Las muestras se
cargan en geles nativos de poliacrilamida al 5% (940 μl de acrilamida: bis-acrilamida
(39:1), 5.9 ml de H20dd, 600 μl de TBE 5X, 50 μl de persulfato amónico al 10%, 5.5
μl de TEMED). En un pocillo adicional del gel se cargan 5μl de tampón de carga con
colorante (60% TBE 0.25X, 40% glicerol, 0.2% azul de bromofenol). La electroforesis
se lleva a cabo en tampón TBE 0.5X, a 100 voltios durante aproximadamente 1 h,
hasta que el colorante llegue hasta el final. El gel se seca por vacío durante 20-30
min a 80ºC. Las bandas correspondientes al factor de transcripción unido al DNA se
revelan por autorradiografía, mediante quimioluminiscencia por el método del luminol
y iodofenol.
Cuando se realizan ensayos de superretraso (“supershift”), antes de la reacción de
unión oligo-proteínas nucleares, los extractos nucleares se preincuban durante 15
min, a 4ºC, con 1 μg de anticuerpo específico para cada factor de transcripción (o
para cada subunidad del mismo).
En estos casos, las muestras se separan en geles nativos de poliacrilamida al
4% (750 μl de acrilamida: bis-acrilamida (39:1), 6.1 ml de H20dd, 600 μl de
TBE 5X, 50 μl de persulfato amónico al 10%, 5.5 μl de TEMED).
Cuando se hacen ensayos de especificidad, la reacción de unión oligo-extracto
nuclear se hace en presencia de oligo sin marcar (100.000 veces más que oligo
marcado).
II.13. CUANTIFICACIÓN DE PROSTAGLANDINAS.
Procedimiento:
Las células (linfocitos totales, 107 células/1.5 ml), (T, B y NK, 106/300μl) se cultivan
por duplicado en placas de 24 pocillos, en presencia o ausencia de los estímulos, a las
MATERIALES Y MÉTODOS
102
dosis y tiempo indicados en cada caso. Las células se recogen y se centrifugan a 400
x g durante 5 min a 4ºC. Los sobrenadantes obtenidos se almacenan a -80ºC hasta
su uso. La determinación de los niveles de PGE2 y PGD2 se realiza por ELISA, con kits
comerciales, siguiendo las instrucciones en ellos detalladas. En el caso de la PGD2,
según indica el fabricante, antes de guardar la muestra a -80ºC, es necesario seguir
un proceso de derivatización hacia un compuesto metoxilado, debido a su alta
inestabilidad.
II.14. CUANTIFICACIÓN DE CITOQUINAS.
Procedimiento:
Las células (linfocitos totales, 107 células/1.5 ml), (T, B y NK, 106 células/300μl),
(neutrófilos, 2 x 106 células/1 ml) se cultivan por duplicado en placas de 24 pocillos,
en presencia o ausencia de los estímulos, a las dosis y tiempo indicados en cada caso.
Las células se recogen y se centrifugan a 400 x g durante 5 min a 4ºC. Los
sobrenadantes obtenidos se almacenan a -80ºC hasta su uso. La determinación de los
niveles de IL-8 y TNF-α se realiza por ELISA, con kits comerciales, siguiendo las
instrucciones en ellos detalladas.
II.15. ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
Procedimiento:
El análisis estadístico de los datos se realiza con el programa informático SIGMA-
STAT. El test de Student o el ANOVA “one-way” son los que se usan para hacer las
comparaciones entre grupos. Los valores se expresan como media ± error estándar
(E.S) o como la media ± error estándar de la media (E.S.M).
RESULTADOS Y DISCUSIONES
RESULTADOS Y DISCUSIONES
105
INDUCCIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LA CICLOOXIGENASA-2
POR ALERGENOS EN LINFOCITOS DE PACIENTES ALÉRGICOS
TRABAJO Nº. 1 [Eur. J. Immunol. 2005,aceptado para publicación]
RESUMEN: La ciclooxigenasa (COX) es un enzima clave en la síntesis de
prostaglandinas. La expresión de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) se cree responsable de
la sobreproducción de prostaglandinas en los procesos que, como las patologías
alérgicas, cursan con inflamación. En este estudio demostramos que linfocitos (T, B y
natural killer) de sujetos alérgicos expresan la COX-2 cuando se cultivan con
alergenos específicos a los que están sensibilizados, estando el proceso mediado por
la IgE y ocurriendo a través del receptor CD23. La inducción de la COX-2 se manifestó
a nivel de ARNm, proteína y actividad enzimática. De forma paralela a la inducción de
la ciclooxigenasa, nuestro trabajo describe que el tratamiento de los linfocitos con los
alergenos permite una activación de las proteínas ERK 1/2 y p38 de la familia de las
MAPKs, un incremento en la actividad de la fosfatasa calcineurina y una potenciación
de la capacidad de unión al ADN de los factores de transcripción NF-AT y NF-κB.
Nuestros resultados muestran además que inhibidores farmacológicos de las MAPKs y
NF-κB cancelan la expresión IgE-dependiente de la COX-2, sugiriendo una
dependencia directa de estas vías de transducción de señales en el proceso. Por
último, en otros apartados de este trabajo se analizan el efecto de la inhibición
enzimática de la COX-2 sobre la producción de citoquinas por linfocitos humanos, así
como, la modulación de la inducción de la COX-2 por fármacos empleados en el
tratamiento de la enfermedad alérgica.
Nuestros datos abren nuevas perspectivas para conocer el papel funcional de los
linfocitos en las enfermedades asociadas a la IgE.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
106
I. Inducción de la COX-2 por alergenos específicos en linfocitos
humanos.
En los experimentos iniciales se analizó si los alergenos afectaban de alguna forma a
la expresión de las ciclooxigenasas-1 y -2 (COX-1 y COX-2) en linfocitos humanos.
Con este objetivo, se obtuvieron células de pacientes alérgicos sensibilizados
específicamente al ácaro Dermatophagoides pteronyssinuss (D1) y se cultivaron en
presencia de este alergeno, estudiándose la expresión de estas proteínas mediante
western-transferencia. La figura 18 muestra que, mientras la COX-2 es
esencialmente indetectable en células no tratadas, ésta llega a ser inducida, tras
estimulación con el alergeno, de manera dependiente de dosis (figura 18A) y de
tiempo (figura 18B). La expresión de la COX-2 se comenzó a observar a partir de 1-
2.5 μg/ml de alergeno, obteniéndose el máximo a partir de una concentración de 10
μg/ml. A esta última concentración, la proteína empezó a detectarse a partir de las 6
horas y alcanzó su pico de expresión a las 12 horas, decayendo después de 24 horas
hasta niveles indetectables a las 48 horas.
La respuesta encontrada frente a D1, fue también observada frente a otros alergenos.
La figura 18C es un ejemplo de que otras fuentes alergénicas como el polen de Olea
europaea (T9), el polen de la gramínea Dactylis glomerata (G3) o el epitelio de perro
(E2), inducen la COX-2 en linfocitos de un paciente específicamente sensibilizado a
ellos. Además, como se observa, la inducción muestra una cierta correlación con el
grado de sensibilización; la mayor expresión se observa con los alergenos T9 y G3
(frente a los que el paciente muestra clase 5 de IgE específica en el suero). En
cambio, un efecto menor tuvo E2, alergeno para la que el paciente tiene clase 2 de
IgE específica en el suero. En esta misma figura se analiza la especificidad de la
respuesta. De esta forma, cuando los linfocitos anteriores se cultivan en presencia de
los alergenos del hongo Alternaria alternata (M6) o del ácaro D1, frente a los que el
paciente no está sensibilizado, no ocurre la inducción de la COX-2.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
107
La especificidad también se estudia en linfocitos de donantes sanos no alérgicos. La
figura 18D es un ejemplo de ello. Como se muestra, no se observa respuesta frente
a los alergenos estudiados (E2, T9, G3, M6 y D1). Sin embargo, la expresión de la COX-
2 se detecta tras el tratamiento con ésteres de forbol (PMA), un potente inductor de
la expresión de la proteína en estas células (Íñiguez y col., 2000; Íñiguez y col,
1999), lo que descarta cualquier falta de funcionalidad celular.
En todos los casos, la expresión de la COX-1 no se vio afectada por ninguno de los
tratamientos (figura 18, A, B, C y D).
Figura 18. Alergenos específicos inducen la expresión de la COX-2 en linfocitos de sujetos
alérgicos.
(A) Linfocitos (5 x 106 células/1ml) obtenidos de un paciente específicamente sensibilizado al alergeno D1
fueron incubados en presencia o ausencia de éste, durante 18 horas, a las concentraciones indicadas. (B)
Linfocitos (5 x 106 células/1ml) obtenidos de un paciente específicamente sensibilizado al alergeno D1
fueron incubados en presencia o ausencia de éste, a una concentración de 10 μg/ml, durante el tiempo
indicado. (C) Linfocitos (5 x 106 células/1ml) obtenidos de un paciente específicamente sensibilizado a los
alergenos E2, G3 y T9 e insensible a M6 y D1, fueron incubados o no, durante 18 horas, con los alergenos
indicados (a 10 μg/ml). (D) Linfocitos (5 x 106 células/1ml) obtenidos de un sujeto sano no alérgico fueron
mantenidos en reposo o incubados con PMA (100nM) o con los alergenos indicados (a 10 μg/ml) durante
18 horas. Las proteínas obtenidas tras la lisis celular se separaron por electroforesis en geles de
poliacrilamida, seguida de inmunodetección usando anticuerpos anti-COX-2 y anti-COX-1.
(A) D1 (μg/ml)
Tiempo (h)
D1 (10 μg/ml)
–alergenos (10 μg/ml)(C) alergenos (10 μg/ml)(D)
0 0.5 1 2.5 5 10 20 40 0 6 12 24 48
E 2 T 9 G 3 M 6 D 1
E 2 T 9 G 3 M 6 D 1PMA–
COX-2
COX-1
COX-2
COX-1
COX-2
COX-1
(B)
COX-2
COX-1
(A) D1 (μg/ml)
Tiempo (h)
D1 (10 μg/ml)
–alergenos (10 μg/ml)(C) alergenos (10 μg/ml)(D)
0 0.5 1 2.5 5 10 20 40 0 6 12 24 48
E 2 T 9 G 3 M 6 D 1
E 2 T 9 G 3 M 6 D 1PMA–
COX-2
COX-1
COX-2
COX-1
COX-2
COX-1
COX-2
COX-1
COX-2
COX-1
COX-2
COX-1
(B)
COX-2
COX-1
COX-2
COX-1
RESULTADOS Y DISCUSIONES
108
II. Papel de la IgE en la inducción, mediada por alergenos, de la COX-
2 por los linfocitos humanos.
Con los datos de la alta especificidad en la respuesta anteriormente observados
(figura 18) se podría hipotetizar que el mecanismo por el que los alergenos llevan a
cabo su efecto está mediado por moléculas de tipo IgE.
Para desarrollar esta idea, primero examinamos si los linfocitos son capaces de unir
IgE específica en su superficie celular. Con este fin obtenemos células de pacientes
alérgicos (monosensibilizados o polisensibilizados) y células de sujetos sanos y las
sometemos a un tratamiento ácido como se indica en la sección de Materiales y
Métodos (apartado II.9), para eluir las inmunoglobulinas unidas a la superficie celular.
Los sobrenadantes resultantes de la elución se usan para cuantificar, por enzima-
inmunoensayo, la IgE específica. La tabla IV muestra una comparación entre los
valores de IgE específica obtenidos en la superficie celular y los obtenidos en el suero
de los mismos donantes. Como se observa, sólo en los sujetos alérgicos (muestras nº
5-10) se detectaron moléculas de IgE en el sobrenadante y en el suero. Las
concentraciones observadas en la superficie celular nunca superaron la clase 2 (0.70-
3.50 UI/ml), mientras que en algunos sueros se detectó hasta clase 6 (niveles
superiores a 100 UI/ml). En el caso de los sujetos sanos (muestras nº 1-4), nunca se
obtuvieron valores positivos de IgE específica, tanto si la muestra analizada era suero
o sobrenadante eluido. Paralelamente al análisis de la IgE específica, en las muestras
anteriores (nº. 1-10) cuantificamos la IgG específica. Los resultados se muestran en
la tabla V. En este caso, en ninguno de los sobrenadantes eluidos (ni de pacientes
alérgicos, ni de sujetos sanos) se detectó la presencia de IgG para ninguno de los
alergenos en estudio. En el caso de los sueros, sólo se detectó IgG en 2 sujetos
alérgicos y en uno sano.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
109
Nº.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
IgE específica en el sueroD1 E2 G3 T9 M6
– – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –
+ (4) + (3) + (5) + (5) –
+ (3) – + (4) + (3) + (3)
+ (5) – – + (1) + (2)
– – + (3) + (4) –
– – + (6) – –
10 + (6) – – – –
IgE específica en la superficie celularD1 E2 G3 T9 M6
– – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –
+ (2) + (1) + (2) + (2) –
+ (1) – + (2) + (1) + (1)
+ (2) – – – + (1)
– – + (2) + (2) –
– – + (2) – –
+ (2) – – – –
Nº.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
IgE específica en el sueroD1 E2 G3 T9 M6
– – – – –– – – – –
– – – – –– – – – –
– – – – –– – – – –
– – – – –– – – – –
+ (4) + (3) + (5) + (5) –+ (4) + (3) + (5) + (5) –
+ (3) – + (4) + (3) + (3)+ (3) – + (4) + (3) + (3)
+ (5) – – + (1) + (2)+ (5) – – + (1) + (2)
– – + (3) + (4) –– – + (3) + (4) –
– – + (6) – –– – + (6) – –
10 + (6) – – – –+ (6) – – – –
IgE específica en la superficie celularD1 E2 G3 T9 M6
– – – – –– – – – –
– – – – –– – – – –
– – – – –– – – – –
– – – – –– – – – –
+ (2) + (1) + (2) + (2) –+ (2) + (1) + (2) + (2) –
+ (1) – + (2) + (1) + (1)+ (1) – + (2) + (1) + (1)
+ (2) – – – + (1)+ (2) – – – + (1)
– – + (2) + (2) –– – + (2) + (2) –
– – + (2) – –– – + (2) – –
+ (2) – – – –+ (2) – – – –
Tabla IV. Presencia de IgE específica en la superficie de linfocitos de pacientes alérgicos.
Linfocitos obtenidos de sujetos sanos (nº 1-4) o de pacientes alérgicos (nº. 5-10) se trataron como se
indica en la sección de Materiales y Métodos para obtener los sobrenadantes. Éstos, junto a los
correspondientes sueros de cada uno de los donantes fueron analizados para determinar la presencia
de IgE específica para cada uno de los alergenos señalados, (+:positivo; -: negativo). En los casos
donde la IgE específica fue positiva, la clase correspondiente es indicada entre paréntesis.
Nº.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
IgG específica en el sueroD1 E2 G3 T9 M6
– + (1) – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –
10
IgG específica en la superficie celularD1 E2 G3 T9 M6
– – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –
– + (2) – – –
+ (1) – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –
Nº.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
IgG específica en el sueroD1 E2 G3 T9 M6
– + (1) – – –– + (1) – – –
– – – – –– – – – –
– – – – –– – – – –
– – – – –– – – – –
10
IgG específica en la superficie celularD1 E2 G3 T9 M6
– – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –– – – – –
– – – – –– – – – –
– – – – –– – – – –
– – – – –– – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –– – – – –
– – – – –– – – – –
– – – – –– – – – –
– – – – –– – – – –
– – – – –– – – – –
– – – – –– – – – –
– + (2) – – –
+ (1) – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –
– – – – –
– + (2) – – –– + (2) – – –
+ (1) – – – –+ (1) – – – –
– – – – –– – – – –
– – – – –– – – – –
– – – – –– – – – –
– – – – –– – – – –
Tabla V. Ausencia de IgG específica en la superficie de linfocitos de pacientes alérgicos.
Linfocitos obtenidos de sujetos sanos (nº 1-4) o de pacientes alérgicos (nº. 5-10) se trataron como se
indica en la sección de Materiales y Métodos para obtener los sobrenadantes. Éstos, junto a los
correspondientes sueros de cada uno de los donantes fueron analizados para determinar la presencia
de IgG específica para cada uno de los alergenos señalados, (+: positivo; -: negativo). En los casos
donde la IgG específica fue positiva, la clase correspondiente es indicada entre paréntesis.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
110
A continuación realizamos experimentos para analizar si anticuerpos anti-IgE podían
mimetizar el efecto inductor de los alergenos sobre la expresión de la COX-2.
Resultados similares a los obtenidos con los alergenos se alcanzaron cuando linfocitos
de sujetos alérgicos se incubaron con anticuerpos anti-IgE. Como se muestra en la
figura 19A, para un período de incubación de 18 horas, la aparición de la proteína se
empezó a observar con una concentración de 0.5 μg/ ml de anti-IgE y alcanzó el
máximo a 2.5-5 μg/ml. Igual que anteriormente, la expresión de la COX-1 no varió
con el tratamiento. La especificidad del anticuerpo se ensayó con 10 μg/ml de IgG de
cabra (figura 19A, último carril), que no afectó a ninguna de las dos proteínas (COX-
1 y COX-2). Además, el efecto estimulador de la anti-IgE sobre los linfocitos no se
detectó si, previo al tratamiento con ella, las moléculas de IgE eran eluidas de la
superficie celular (figura 19B, tercer carril).
Figura 19. Inducción de la COX-2 en linfocitos humanos por anticuerpos anti-IgE.
(A) Linfocitos (5 x 106 células/1ml) obtenidos de un paciente alérgico fueron incubados en presencia o
ausencia de anti-IgE (α-IgE) a las concentraciones indicadas o IgG de cabra (10 μg/ml) durante 18
horas. (B) Linfocitos (5 x 106 células/1ml) obtenidos de un paciente alérgico se mantuvieron en reposo
(carriles primero y segundo) o se trataron (carriles tercero y cuarto) como se indica en la sección de
Materiales y Métodos para eluir la IgE de superficie. A continuación las células se trataron con anti-IgE
(α-IgE, 10 μg/ml) (carriles segundo y tercero) durante 18 horas. En todos los casos, las proteínas
obtenidas tras la lisis celular se separaron por electroforesis en geles de poliacrilamida, seguida de
inmunodetección usando anticuerpos anti-COX-2 y anti-COX-1.
(A)
0 0.5 1 2.5 5 10 20 40
α-IgE (μg/ml)
COX-2
COX-1
IgG –– α-IgE
α-IgE
(B) con elución
COX-2
COX-1
(A)
0 0.5 1 2.5 5 10 20 40
α-IgE (μg/ml)
COX-2
COX-1
COX-2
COX-1
IgG –– α-IgE
α-IgE
(B) con elución
COX-2
COX-1
–– α-IgE
α-IgE
(B) con elución
COX-2
COX-1
COX-2
COX-1
RESULTADOS Y DISCUSIONES
111
III. La COX-2 inducida por un mecanismo IgE-dependiente se localiza
en la zona citosólica perinuclear.
Posteriormente, la inducción de la COX-2, promovida por alergeno o anti-IgE, se
ensayó mediante marcaje por inmunofluorescencia, para estudiar la localización
celular. La figura 20 es un ejemplo de la inducción de la COX-2, analizada por
microscopía de fluorescencia, en linfocitos de un paciente altamente sensibilizado al
alergeno D1.
Como se observa, las células en estado basal o de reposo (sin ninguna estimulación),
no muestran fluorescencia alguna (figura 20B). Sin embargo, cuando éstas se
cultivan en presencia de 10 μg/ ml de alergeno (figura 20D) ó 10 μg/ml de
anticuerpos anti-IgE (figura 20F), la señal fluorescente correspondiente a la proteína
aparece en la zona citosólica próxima al núcleo. Como en el caso de las células en
reposo, ninguna fluorescencia se observó en células tratadas con el control de
anticuerpo IgG (figura 20H). En todos los casos, la morfología celular se analizó por
microscopía de campo claro (contraste de fase) (figura 20, A, C, E, G).
IV. La inducción IgE-dependiente de la COX-2 tienen lugar
principalmente a través del receptor CD23 de los linfocitos humanos.
Desde hace años se conoce que los linfocitos pueden expresar receptores de IgE
(Spiegelberg H.L., 1987; Gagro, 1994; Novak y col., 2001; Joo y col., 2001). Con
esta base, se realizaron experimentos adicionales a los anteriores con el fin de
identificar qué receptor o receptores de IgE estaban implicados en la expresión IgE-
dependiente de COX-2. Para ello, se estudió el efecto del entrecruzamiento de éstos
con anticuerpos monoclonales. Se analizaron tres tipos de anticuerpos: el anticuerpo
CRA1 (anti-cadena α del receptor de alta afinidad, FcεRI), el anticuerpo 9P.25 (anti-
FcεRII o CD23) y el anticuerpo A3A12 (anti-galectina-3/mac-2/εbp). La figura 21
ilustra que la aparición de la inducción de la ciclooxigenasa se detecta principalmente
con el anticuerpo 9P.25 (carril cuarto). Por el contrario, no se observó ninguna
RESULTADOS Y DISCUSIONES
112
respuesta con el CRA1 (carril tercero), y el efecto del A3A12 (carril quinto) apenas fue
notable. Como control de los anticuerpos se usó IgG1 de ratón.
Figura 20. Localización por microscopía de fluorescencia de la COX-2 en los linfocitos tras
estimulación con alergeno o anti-IgE. Linfocitos (2 x 106 células/1ml) de un paciente sensibilizado al
alergeno D1 fueron fijados y procesados para microscopía de campo claro (contraste de fase) (A, C, E,
G) o microscopía de fluorescencia (B, D, F, H) como se indicó en la sección de Materiales y Métodos.
Las células sin tratar (A, B) o después de tratar durante 18 horas con 10 μg/ml de anti-IgE (C, D), 10
μg/ml de alergeno D1 ó 10 μg/ml de control de anticuerpo IgG (G, H) son mostradas. Dos experimentos
adicionales, con muestras de otros donantes, se llevaron a cabo, con resultados similares. Las imágenes
mostradas se visualizaron a 100 aumentos.
(A) (B)
(C)
(E)
(G)
(D)
(F)
(H)
(A) (B)
(C)
(E)
(G)
(D)
(F)
(H)
RESULTADOS Y DISCUSIONES
113
V. Las subpoblaciones linfocitarias T, B y NK expresan la COX-2 tras
estimulación dependiente de IgE.
A continuación nos propusimos determinar qué subpoblación o subpoblaciones
linfocitarias eran las responsables de la expresión de la COX-2, tras estimulación con
alergenos o anticuerpos anti-IgE. Para abordar este objetivo llevamos a cabo análisis
de citometría de flujo de doble marcaje, con anticuerpos específicos contra
marcadores de membrana para cada tipo celular (anti-CD3 para los linfocitos T, anti-
CD20 para los linfocitos B, y anti-CD56 para las NK) y anticuerpos contra la COX-2
intracelular. La figura 22A muestra que el tratamiento de linfocitos de sujetos
alérgicos altamente sensibilizados al alergeno D1, con este alergeno o con anticuerpos
anti-IgE, resulta en un aumento en la expresión intracelular de la COX-2, si se
compara con las células sin tratar; este aumento ocurre en los tres tipos de
subpoblaciones analizadas. Como se observa, la mayor respuesta a la estimulación se
detecta en los linfocitos B (que aumentan unas 8 veces) y las células NK (que
aumentan unas 6 veces), siendo menor en los linfocitos T (que sólo aumentan unas 4
veces). Ni el control de anticuerpo IgG, ni otros alergenos a los que los pacientes no
están sensibilizados, como G3, fueron capaces de inducir la expresión del enzima.
Hasta la fecha, la presencia de la proteína COX-2 no ha sido detectada en linfocitos B
y células NK. Para verificar los resultados obtenidos por citometría de flujo, se
realizaron experimentos adicionales por western-transferencia en células T, B y NK
altamente purificadas con esferas magnéticas. La figura 22B ilustra la respuesta de
A3A1
2
IgG1
CRA1
9P.2
5
–
COX-2
COX-1
A3A1
2
IgG1
CRA1
9P.2
5
–
COX-2
COX-1
Figura 21. Expresión de la COX-2 en linfocitos
humanos incubados con anticuerpos anti-CD23.
Linfocitos (5 x 106 células/1ml) obtenidos de un
paciente alérgico fueron incubados en presencia o
ausencia de IgG1 de ratón (5 μg/ml), 5 μg/ml de
anticuerpo CRA1, 5 μg/ml de anticuerpo 9P.25 ó 5
μg/ml de anticuerpo A3A12 durante 18 horas. Tras
este tiempo las células se recogieron y los niveles de
las proteínas COX-2 y COX-1 fueron analizados por
western-transferencia.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
114
las tres subpoblaciones a los anticuerpos anti-CD23 (9P.25) o anti-galectina-3
(A3A12). De forma similar a los alergenos o a los anticuerpos anti-IgE, la mayor
inducción de la COX-2 se detectó en las células B y NK tras el tratamiento con el
anticuerpo 9P.25. De nuevo, el tratamiento con anti-galectina-3 apenas tuvo efecto.
Figura 22. Expresión IgE-dependiente de la proteína COX-2 en linfocitos T, B y NK.
(A) Linfocitos (2 x 106 células/1ml) de pacientes atópicos sensibilizados al alergeno D1, fueron
mantenidos en reposo o cultivados en presencia de 10 μg/ ml de alergenos D1 ó G3, 10 μg/ml de anti-IgE
(α-IgE) ó 10 μg/ml de control de anticuerpo IgG, durante 18 horas. Análisis de inmunofluorescencia de
doble color para CD3/CD20/CD56 y COX-2 se llevó a cabo por citometría de flujo. Los resultados son
expresados como la media de la intensidad de fluorescencia (MIF) de las células marcadas doble
positivas. Los valores mostrados son la media ± E.S. de tres experimentos independientes, en los que
cada medida se llevó a cabo por duplicado. (B) Análisis por western-transferencia de la COX-2 y COX-1
en linfocitos T, B y NK incubados durante 18 horas en presencia o ausencia de 5 μg/ml de los anticuerpos
9P.25 ó A3A12.
100
MIF
de c
élul
as d
oble
men
te p
ositi
vas
0
20
40
60
80
Nada
α-IgE (10 μg/ml)
D1 (10 μg/ml)
COX-2/CD3 COX-2/CD20 COX-2/CD56
G3 (10 μg/ml)
IgG (10 μg/ml)
(A)
A3A1
2
9P.2
5
–A3A1
2
9P.2
5
–A3A1
2
9P.2
5
–
Células T Células B Células NK
COX-2
COX-1
(B)
100
MIF
de c
élul
as d
oble
men
te p
ositi
vas
0
20
40
60
80
Nada
α-IgE (10 μg/ml)
D1 (10 μg/ml)
COX-2/CD3 COX-2/CD20 COX-2/CD56
G3 (10 μg/ml)
IgG (10 μg/ml)
(A)
A3A1
2
9P.2
5
–A3A1
2
9P.2
5
–A3A1
2
9P.2
5
–
Células T Células B Células NK
COX-2
COX-1
(B)
RESULTADOS Y DISCUSIONES
115
VI. Análisis de la actividad enzimática de la COX-2 tras estimulación
IgE-dependiente.
Ya que la activación enzimática de las ciclooxigenasas conlleva la producción de
prostaglandinas (Smith y col., 2000; Vane y col., 1998), en los siguientes
experimentos se analizó si la inducción de la COX-2 por un mecanismo IgE-
dependiente va acompañada de un aumento en la producción de prostaglandinas.
Para ello, se obtuvieron linfocitos de pacientes alérgicos, se estimularon y tras un
período de incubación, se procedió a recoger el sobrenadante celular, donde se
cuantificaron los niveles de prostaglandinas.
Las figuras 23A y 23B son ejemplo de los resultados obtenidos cuando células de
sujetos sensibilizados a T9 se incubaron en presencia de este alergeno. Como se
observa, cuando los linfocitos son tratados, se produce un aumento, que es
dependiente de dosis (figura 23A) y de tiempo (figura 23B) en la liberación de
PGD2 de 4-5 órdenes de magnitud de los valores obtenidos en células en reposo o sin
tratar. El pico máximo de PGD2 se obtiene con una concentración de alergeno de 20-
40 μg/ml y un tiempo de 12-24 horas. Tras las 24 horas de incubación, se observa
una caída en la producción de PGD2, que se corresponde con la ausencia de proteína a
este tiempo (figura 18B). La contribución de cada una de las subpoblaciones
linfocitarias a la producción de PGD2 es ilustrada en la figura 23C. Los niveles
detectados para cada población fueron de aproximadamente de 2.5, 3.5 y 3 órdenes
de magnitud de los valores obtenidos en células en reposo o sin tratar para las células
T, B y NK respectivamente, estimuladas con el anticuerpo anti-CD23. La adicción de
anti-galectina-3 al medio de cultivo apenas fue detectable.
A diferencia de lo observado con la PGD2, los alergenos o anticuerpos anti-IgE fueron
incapaces de inducir la liberación de PGE2 al sobrenadante, que sólo fue detectada
cuando las células fueron tratadas con PMA (figura 23D).
RESULTADOS Y DISCUSIONES
116
0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
Tiempo (h)
[PG
D2]
(ng/
ml)
(A)
0 6 12 24 48 0 5 10 20 400
4
8
12
16
alergeno T9 (μg/ml)
(B)
[PG
D2]
(ng/
ml)
(C)
0
1
2
4
5
3
Nada
9P.25
A3A12
células T células B células NK
[PG
D2]
(ng/
ml)
0
1
2
3
4
5
6
7Nada
PMA 100 nM
α-IgE (10 μg/ml)
T9 (10 μg/ml)
[PG
E 2](
ng/m
l)
(D)
0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
Tiempo (h)
[PG
D2]
(ng/
ml)
(A)
0 6 12 24 48 0 5 10 20 400
4
8
12
16
alergeno T9 (μg/ml)
(B)
[PG
D2]
(ng/
ml)
(C)
0
1
2
4
5
3
Nada
9P.25
A3A12
células T células B células NK
[PG
D2]
(ng/
ml)
0
1
2
3
4
5
6
7Nada
PMA 100 nM
α-IgE (10 μg/ml)
T9 (10 μg/ml)
[PG
E 2](
ng/m
l)
(D)
Figura 23. Análisis de la producción IgE-dependiente de prostaglandinas por linfocitos
humanos.
Linfocitos (107 células/1.5 ml) de sujetos alérgicos sensibilizados al alergeno T9 fueron cultivados en
presencia o ausencia de 10 μg/ml de este alergeno los tiempos indicados (A), o durante 12 horas a las
concentraciones indicadas (B). (C) Células T, B y NK altamente purificadas (106/300 μl) obtenidas de
sujetos alérgicos fueron cultivadas en presencia o ausencia de 5 μg/ml de anticuerpos 9P.25 ó A3A12
durante 12 horas. (D) Linfocitos (107 células/1.5 ml) de sujetos alérgicos a T9 fueron cultivados en
presencia o ausencia de 100 nM de PMA, 10 μg/ml de anti-IgE (α-IgE) ó 10 μg/ml de alergeno T9. Los
niveles de PGD2 (A, B y C) o PGE2 (D) en el sobrenadante se determinaron usando un enzima
inmunoensayo. Los valores mostrados son la media ± E.S. de tres ensayos independientes en los que
cada medida fue llevada a cabo por triplicado.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
117
VII. Inducción del ARNm de la COX-2 por activación IgE-mediada.
Para determinar si la expresión del gen de la COX-2 fue paralela a la inducción de la
proteína y actividad enzimática, se analizó el ARNm de la COX-2 mediante RT-PCR. La
figura 24A muestra los resultados de la incubación de linfocitos de un sujeto alérgico
sensibilizado a D1 cultivados, a distintos tiempos (desde 1 a 48 horas), en presencia
de 10 μg/ml de dicho alergeno. Como se muestra, la cinética de inducción del ARNm
comenzó a detectarse muy tempranamente (a la hora), obteniéndose los niveles
máximos de transcrito a las 12 horas y comenzando a decaer a partir de entonces.
Un ejemplo de la especificidad de la inducción es ilustrado en la figura 24B. En este
caso se analizó la respuesta a los alergenos G3, D1 y T9, en linfocitos de un paciente
altamente sensibilizado a G3 y D1 e insensible a T9. Como se muestra, al igual que
ocurría con la proteína (figura 18C), el patrón de expresión fue paralelo a la
sensibilización previa del sujeto.
De la misma forma que los alergenos, los anticuerpos anti-IgE o anticuerpos anti-
CD23 fueron capaces de inducir el ARNm de la COX-2. La figura 24C ilustra estos
resultados junto con los obtenidos para el PMA, este último usado como control
positivo. En todos los casos (figura 24, A, B y C), se muestra el ARNm del gen de la
gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), como control de carga de PCR.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
118
VIII. Implicación de las proteínas quinasas activadas por mitógenos
(MAPKs) en la inducción de la COX-2 por un mecanismo dependiente
de IgE.
Recientemente, las proteínas de la familia MAPKs (ERK1/2, p38 y JNK) se han
implicado en la regulación de la expresión de la COX-2 en un amplio espectro de
células estimuladas con diferentes citoquinas o moléculas de señalización (Dean y
col., 1999; bChen y col., 2001; Fiebich y col., 2000; Subbaramaiah y col., 1998).
Para estudiar la potencial implicación de estas rutas de transmisión de señales en la
inducción IgE-dependiente de la COX-2, analizamos en primer lugar si estas proteínas
se activan en respuesta a los alergenos. La figura 25 muestra el grado de activación
Figura 24. Inducción IgE-dependiente del ARNm de la COX-2 por linfocitos humanos.
(A) Linfocitos (5 x 106 células/1ml) de un paciente altamente sensibilizado al alergeno D1 se trataron o no
con este alergeno (a 10 μg/ ml) durante los tiempos indicados. (B) Linfocitos (5 x 106 células/1ml) de un
paciente sensibilizado a los alergenos G3 y D1 e insensible a T9 se mantuvieron en reposo o se trataron con
los alergenos G3, D1 o T9 (a 10 μg/ ml) durante 8 horas. (C) Células (5 x 106 células/1ml) de un sujeto
atópico se mantuvieron en reposo o se trataron con PMA (100nM), anti-IgE (a 10 μg/ml) o control de
anticuerpo IgG (a 10 μg/ml). En todos los casos, se extrajo el ARN total, se sometió a RT-PCR y los
productos se separaron en geles de agarosa. La PCR se llevó a cabo para los genes de la COX-2 o la
GAPDH, este último usado para asegurar que la cantidad de ARN ensayada en cada caso es la misma.
Resultados similares a éstos se obtuvieron en otros dos experimentos adicionales para cada caso.
Tiempo (h)
D1 (10 μg/ml)(A)
0 1 6 12 24 48
COX-2
GAPDH
Tiempo (h)
D1 (10 μg/ml)(A)
0 1 6 12 24 48
COX-2
GAPDH
COX-2
GAPDH
G 3 T 9 α-Ig
E
9P.2
5
–– D 1 PMA
COX-2
GAPDH
(B) (C)
COX-2
GAPDH
G 3 T 9 α-Ig
E
9P.2
5
–– D 1 PMA
COX-2
GAPDH
(B) (C)
COX-2
GAPDH
α-Ig
E
9P.2
5
–– D 1 PMA
COX-2
GAPDH
(B) (C)
COX-2
GAPDH
–– D 1 PMA
COX-2
GAPDH
COX-2
GAPDH
(B) (C)
COX-2
GAPDH
COX-2
GAPDH
RESULTADOS Y DISCUSIONES
119
(medido por el estado de fosforilación) de las distintas subfamilias de MAPK, en
linfocitos de sujetos alérgicos sensibles al alergeno D1. Como se observa, la
incubación de las células con dicho alergeno induce una rápida activación (detectable
en el primer minuto de tratamiento) de las proteínas ERK 1/2 MAPK (p42/p44), que
se mantiene durante 30 min, decayendo hasta niveles basales a partir de 1 hora
(figura 25A). De las dos proteínas ERK analizadas, la ERK1 (p42) es la que
básicamente es sensible al tratamiento, ya que la ERK2 (p44) apenas sufre cambios.
Comparada con la ERK1/2, el tratamiento con el alergeno D1 induce una activación
más tardía de la p38 MAPK; la fosforilación fue detectable después de 15 min de
tratamiento y persistió durante al menos 1 hora (figura 25B).
La tercera subfamilia de MAPK, las JNK, fue también analizada. Como se muestra en
la figura 25C el tratamiento con los alergenos fue incapaz de modular la actividad de
estas MAPKs. En cambio una potente fosforilación, tanto de JNK1 (p46) como de JNK2
(p54), fue observada en respuesta a PMA (figura 25C, último carril), un conocido
estimulador de esta vía de transducción de señales en linfocitos (Chen y col., 1998).
De igual forma, se observa que en la mayoría de nuestras preparaciones siempre
observamos una aparente activación inespecífica basal de la JNK2 (p54), que persistió
a lo largo de los períodos de incubación.
En todos los casos (figura 25, A, B y C) se analizaron sistemáticamente los niveles
totales (sin fosforilar) de las MAPK (ERK, p38 y JNK), para verificar, en cada
momento, la igualdad en la cantidad de proteína.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
120
En el contexto de las MAPKs, estudiamos a continuación el efecto de dos compuestos
farmacológicos, tales como el PD098059 (que inhibe específicamente a MEK1, el
enzima que fosforila “aguas arriba” (upstream) a la ERK 1/2 (Alessi y col., 1995)), y
Figura 25. Los alergenos promueven la activación de la ERK y p38 MAPK, pero no de la JNK
MAPK, en linfocitos de sujetos alérgicos.
(A-C). Linfocitos (5 x 106 células/1ml) de sujetos alérgicos sensibilizados al alergeno D1 fueron
incubados en ausencia o presencia de este alergeno (a 10 μg/ml) durante los tiempos indicados. (C)
Adicionalmente las células se incubaron con PMA (100 nM) durante 15 minutos. Las células se lisaron y
las proteínas se separaron en geles de poliacrilamida, se transfirieron a membranas de PVDF y se
sometieron a inmunodetección con anticuerpos anti-fosfo ERK 1/2 MAPK (A), anti-fosfo p38 MAPK (B)
o anti-fosfo JNK MAPK (C). Para verificar que la cantidad de proteínas es la misma en todos los pocillos,
los filtros se trataron con tampón de limpieza (stripping) y se incubaron con anticuerpos contra la ERK
1/2 (A), p38 (B) y JNK (c) no fosforiladas. Otros dos experimentos independientes para cada caso
dieron un resultado similar.
Tiempo (min)
(A)
0 1 5 15 30 60
p-ERK 1/2
ERK 1/2
D1 (10 μg/ml)
p-p38
p38
Tiempo (min)
(B)
0 1 5 15 30 60
D1 (10 μg/ml)
Tiempo (min)
(C)
0 1 5 15 30 60
D1 (10 μg/ml)
p42p44
p42p44
JNK 1/2 p46p54
p-JNK 1/2 p46p54
PMA
Tiempo (min)
(A)
0 1 5 15 30 60
p-ERK 1/2
ERK 1/2
D1 (10 μg/ml)
p-p38
p38
Tiempo (min)
(B)
0 1 5 15 30 60
D1 (10 μg/ml)
Tiempo (min)
(C)
0 1 5 15 30 60
D1 (10 μg/ml)
p42p44
p42p44
JNK 1/2 p46p54
JNK 1/2 p46p54
p-JNK 1/2 p46p54
PMA
RESULTADOS Y DISCUSIONES
121
el SB203580 (que inhibe específicamente la actividad quinasa de la p38 MAPK
(Cuenda y col., 1995)) sobre la inducción, promovida por los alergenos de la proteína
COX-2 (figura 26). Como se observa, nosotros encontramos que tanto el PD098059
(figura 26A) como el SB203580 (figura 26B) cancelan, de una manera dosis
dependiente, la inducción de la proteína por los alergenos T9 y G3, en linfocitos de
sujetos alérgicos sensibilizados al primero o segundo alergenos, respectivamente.
Según se muestra, la expresión de la COX-2 es más sensible al SB203580 que al
PD098059; tan sólo es necesaria una concentración de 0,1 μM del primer inhibidor
para cancelar la expresión de la proteína, mientras que del segundo inhibidor se
necesita al menos una concentración 250 veces superior (25 μM) para observar el
mismo efecto. Igual que con los alergenos, el PD098059 y el SB203580, suprimen el
efecto positivo de la anti-IgE (figura 26C) o de los anticuerpos anti-CD23 (figura
26D) sobre la COX-2. En todos los casos ninguno de los tratamientos afectó a la
expresión de la COX-1 (figura 26, A, B, C y D).
Seguidamente analizamos si los resultados obtenidos a nivel de proteína con los
inhibidores de las MAPKs tienen su equivalente a nivel de ARNm. Como se observa el
PD098059 a 25 μM no fue capaz de cancelar totalmente el ARNm de la COX-2(figura
26E), mientras que a la misma dosis inhibió por completo la acumulación de la
proteína (figura 26A). En contraste, el SB203580, a 0.1 μM, suprimió totalmente los
niveles de ARN (figura 26F), de igual forma que lo hizo a nivel de proteína (figura
26C).
RESULTADOS Y DISCUSIONES
122
PD (μM)
T9 (10 μg/ml)
COX-2
COX-1
SB (μM)
G3 (10 μg/ml)(A)
0 0 0.1 0.5 1 25 0 0 0.1 0.5 1 10
COX-2
COX-1
SBPD– –9P.25
COX-2
COX-1
SBPD– –α-IgE
COX-2
COX-1
T9 (10 μg/ml)
SB (μM) – – 0.1 10– – 1 25PD (μM)
G3 (10 μg/ml)
COX-2
GAPDH
COX-2
GAPDH
(B)
(C) (D)
(E) (F)
PD (μM)
T9 (10 μg/ml)
COX-2
COX-1
COX-2
COX-1
SB (μM)
G3 (10 μg/ml)(A)
0 0 0.1 0.5 1 25 0 0 0.1 0.5 1 10
COX-2
COX-1
SBPD– –9P.25
COX-2
COX-1
SBPD– –9P.25
COX-2
COX-1
SBPD– –α-IgE
COX-2
COX-1
T9 (10 μg/ml)
SB (μM) – – 0.1 10SB (μM) – – 0.1 10– – 1 25PD (μM) 1 25PD (μM)
G3 (10 μg/ml)
COX-2
GAPDH
COX-2
GAPDH
(B)
(C) (D)
(E) (F)
Figura 26. La ERK MAPK y la p38 MAPK regulan la inducción IgE-dependiente de la COX-2 en
linfocitos humanos.
(A) Linfocitos (5 x 106 células /1ml) de un sujeto alérgico sensibilizado al alergeno T9 fueron mantenidos en
reposo o preincubados durante 45 minutos con PD098059 (PD) a las dosis indicadas, y luego se incubaron,
donde se indica, durante 18 horas, con dicho alergeno (a 10 μg/ml). (B) Linfocitos (5 x 106 células /1ml) de
un paciente alérgico sensibilizado al alergeno G3 fueron mantenidos en reposo o preincubados durante 45
minutos con SB203580 (SB) a las dosis indicadas, y luego se incubaron, donde se indica, durante 18 horas
con dicho alergeno (a 10 μg/ml). (C-D) Linfocitos (5 x 106 células /1ml) de sujetos alérgicos se
mantuvieron en reposo o se preincubaron con 25 μM de PD098059 ó 10 μM de SB203580 durante 45
minutos y luego se trataron, donde se indica, durante 18 horas, con los anticuerpos anti-IgE (α-IgE, 10
μg/ml) (C) o anti-CD23 (9P.25, 5 μg/ml) (D). En todos los casos (A-D) los niveles de expresión de las
proteínas COX-2 y COX-1 son mostrados. (E) Linfocitos (5 x 106 células /1ml) de un paciente alérgico
sensibilizado al alergeno T9 fueron mantenidos en reposo o preincubados durante 45 minutos con PD098059
(PD) a las dosis indicadas, y luego, donde se indica, se incubaron durante 8 horas con dicho alergeno (a 10
μg/ml). (F) Linfocitos de un sujeto alérgico sensibilizado al alergeno G3 fueron mantenidos en reposo o
preincubados durante 45 minutos con SB203580 (SB) a las dosis indicadas, y luego se incubaron, donde se
indica, durante 8 horas con dicho alergeno (a 10 μg/ml). En todos los casos (E-F) el ARN total fue extraído
y analizado por RT-PCR para los genes COX-2 ó GAPDH. Dos experimentos adicionales, en cada uno de los
casos, dieron el mismo resultado.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
123
IX. Papel de otras proteínas quinasas en la inducción IgE-dependiente
de la COX-2 en linfocitos humanos.
Varios autores han descrito que la expresión génica de la COX-2 está regulada,
además de por las MAPKs, por vías de señalización que dependen de otras proteínas
quinasas. En este sentido se han implicado la proteína quinasa C (Misra y col, 2001;
Wu y col, 2002), la proteína quinasa A (Wadhwa y col., 2002; Wu y col., 2002) y la
fosfatidilinositol 3-quinasa (PI-3K) (Weaver y col., 2001; Misra y col., 2001). Para
determinar si alguna de estas vías de señalización estaba implicada en el efecto
mediado por la IgE sobre la expresión de la COX-2, se utilizaron inhibidores
farmacológicos específicos: la staurosporina y el calphostin C, inhibidores de la PKC
(Watson y col., 1988; Bruns y col., 1991) el H89, inhibidor de la PKA (Wieprecht y
col., 1994); y la wortmanina, inhibidor de la PI-3K (Powis y col., 1994).
La figura 27 muestra los resultados obtenidos tras la preincubación con estos
compuestos, previo al tratamiento con anticuerpos anti-IgE. Como se observa, ni los
inhibidores de la PKC (figura 27A), ni el de la PKA (figura 27B) afectaron a la
inducción de la COX-2. Por el contrario, sólo cuando se usó el inhibidor de la PI-3K
(figura 27C) se obtuvo una reducción, aunque muy débil, en el nivel de expresión de
la COX-2.
Figura 27. Implicación de la PKC,
PKA y PI-3K en la expresión IgE-
mediada de la COX-2 en linfocitos
humanos.
Linfocitos (5 x 106 células /1ml) de
sujetos alérgicos se mantuvieron en
reposo o se pretrataron con 100 nM de
calphostin c (Calp. C) ó 100 nM de
estaurosporina (staur.) (A), 5 μM de
H89 (B) ó 100 nM de wortmanina
(wort.) (C) durante 45 minutos y luego
se incubaron en presencia o ausencia de
anti-IgE (α-IgE, 10 μg/ml) durante 18
horas. La expresión de COX-2 y COX-1
se analizó por western-transferencia.
(A)α-IgE (10 μg/ml)
– Calp.
COX-2
COX-1
Staur.
– – – H 89
α-IgE (10 μg/ml)
– –
α-IgE (10 μg/ml)
wort.
COX-2
COX-1
COX-2
COX-1
(B)
(C)
(A)α-IgE (10 μg/ml)
– Calp.
COX-2
COX-1
Staur.
– – – H 89
α-IgE (10 μg/ml)
– –
α-IgE (10 μg/ml)
wort.
COX-2
COX-1
COX-2
COX-1
(B)
(C)
RESULTADOS Y DISCUSIONES
124
X. Estudio de la participación de la vía de señalización
calcineurina/factor de transcripción NF-AT en la inducción IgE-
dependiente de la COX-2 en linfocitos humanos.
Análisis de secuencia de la región 5’ del gen de la COX-2 han revelado la existencia
de sitios de unión para varios factores de transcripción, entre los que se incluyen una
caja TATA, un motivo C/EBP, dos sitios AP-2, tres sitios SP1, dos sitios NF-κB, dos
sitios NF-AT, un motivo CRE y un sitio Ets-1 (Appleby y col., 1994; Iñiguez y col.,
2000).
Por otro lado, NF-AT ha sido descrito como uno de los factores de transcripción más
implicados en los desórdenes atópicos (Kraft y col., 2001; Schroeder y col., 2002;
Viola y col., 1997). Además, estudios recientes han identificado a la CaN y a NF-AT,
como los principales integrantes de la vía de transmisión de señales necesarias para
la inducción de la COX-2 a través de la molécula CD3 (Íñiguez y col., 2000).
Teniendo en cuenta lo anterior, analizamos la potencial implicación de la ruta CaN/NF-
AT en la inducción IgE-dependiente de la COX-2. Para ello, estudiamos primeramente
la actividad fosfatasa del enzima CaN. La figura 28A muestra que la incubación de
linfocitos de sujetos alérgicos con 10 μg/ml de anti-IgE induce un incremento,
dependiente del tiempo, de la actividad CaN, que aumenta linealmente hasta las dos
horas, disminuyendo hasta niveles basales al cabo de 8 horas. A las dos horas de
tratamiento, la estimulación máxima de la actividad CaN fue de 12 veces de órdenes
de magnitud, respecto a los valores de las células sin estimular.
Ya que la activación de la CaN permite la desfosforilación y subsiguiente translocación
al núcleo de NF-AT (Clipstone y col., 1992), a continuación analizamos si los
alergenos modifican la capacidad de unión al ADN de NF-AT. Los resultados de EMSA
de la figura 28B ilustran que el alergeno G3 (a una concentración de 10 μg/ml)
aumenta, de manera dependiente del tiempo, la formación de complejos NF-AT/ADN
en linfocitos de un sujeto alérgico altamente sensibilizado a dicho alergeno.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
125
Figura 28. Los alergenos y la anti-IgE incrementan la actividad calcineurina y promueven la
activación de NF-AT en linfocitos humanos.
(A) Linfocitos (5 x 106 células/1ml) de un sujeto alérgico fueron cultivados en presencia o ausencia
de 10 μg/ml de anti-IgE durante los tiempos indicados. Las células se lisaron y la actividad
calcineurina fue ensayada. La figura muestra los valores obtenidos ± E.S. de tres experimentos
independientes en los que cada medida se tomó por duplicado. (B-C) Linfocitos (107 células/1ml) de
un sujeto alérgico sensibilizado al alergeno G3 fueron cultivados en presencia o ausencia de éste (a 10
μg/ ml) los tiempos indicados (B) o durante 180 minutos (C). La actividad de unión de NF-AT al ADN
fue ensayada por EMSA y la banda de retraso obtenida es indicada (llave). El asterisco (B)
representa que la reacción de unión se llevó a cabo, durante 180 minutos, en presencia de un exceso
de 100 veces de sonda no marcada. (C) Se muestra el superrretraso obtenido por la adicción de 1 μl
de anticuerpo anti-NF-AT (α-NFAT). En otros dos experimentos independientes se obtuvieron
resultados similares.
NF-AT
30 60 *
G3 (10 μg/ml)
Tiempo (min) 0 180 α-NFAT
G3 (10 μg/ml)
– – +
NF-AT
sonda libresonda libre
Act
ivid
ad c
alci
neur
ina
(pm
olP
i/min
)
16
0
4
8
12
0 2 4 6 8
Tiempo (h)
(A)
(B) (C)
NF-AT
30 60 *
G3 (10 μg/ml)
Tiempo (min) 0 180 α-NFAT
G3 (10 μg/ml)
– – +
NF-AT
sonda libresonda libre
Act
ivid
ad c
alci
neur
ina
(pm
olP
i/min
)
16
0
4
8
12
0 2 4 6 8
Tiempo (h)
(A)
Act
ivid
ad c
alci
neur
ina
(pm
olP
i/min
)
16
0
4
8
12
0 2 4 6 8
Tiempo (h)
(A)
(B) (C)
RESULTADOS Y DISCUSIONES
126
Como se observa, la actividad de unión al ADN de este factor de transcripción
comienza a detectarse ligeramente a los 30 min, alcanzando su máximo a la hora y
persistiendo durante al menos 3 horas.
La especificidad de nuestros resultados queda demostrada por la competición con un
exceso de 100 veces de sonda no marcada (figura 11B, *) y se confirma por el uso de
un anticuerpo que reconoce todas las isoformas de NF-AT, que origina un sustancial
superretraso (“supershift”) del complejo (figura 28C).
En este contexto, analizamos el efecto de drogas inmunosupresoras, como la
ciclosporina (CsA) o el tacrolimo (FK506), que inhiben la actividad fosfatasa CaN (Liu
y col., 1991; Ho y col., 1996; Ruhlmann y col., 1997), sobre la inducción IgE-
dependiente de la COX-2. Los datos mostrados en la figura 29 indican que ni la
preincubación con CsA (figuras 29A y 29B), ni con FK506 (figura 29C), son
capaces de cancelar el efecto de los anticuerpos anti-IgE (figura 29A) o anti-CD23
(figura 29B) así como, de los alergenos (figura 29C) sobre la inducción de la COX-2
en linfocitos humanos. Por el contrario, de acuerdo con estudios previos (Íñiguez y
col., 1999; Iñiguez y col., 2000;), la CsA sí fue capaz de suprimir el efecto
estimulador del PMA (figura 29D). Ninguno de estos tratamientos, alteró la
expresión de la COX-1 (figura 29, A, B, C y D).
RESULTADOS Y DISCUSIONES
127
XI. Implicación del factor de transcripción NF-κB en la inducción IgE-
dependiente de la COX-2 por linfocitos humanos.
Ya que, continuamente, NF-κB se ha venido relacionando con los desórdenes atópicos
(Mitsuta y col., 2004; Barnes y col., 1997; Hart y col., 1998), en nuestro estudio
analizamos la posible implicación de este factor de transcripción en la inducción
mediada por IgE de la COX-2 en linfocitos humanos.
Figura 29. Los inhibidores de la actividad CaN no tienen efecto alguno sobre la inducción IgE-
dependiente de la COX-2 en linfocitos humanos.
(A-B) Linfocitos (5 x 106 células/1ml) de un sujeto atópico fueron preincubados o no durante 2 h con CsA
(a las dosis indicadas) y luego se cultivaron en presencia o ausencia de anti-IgE (α-IgE, 10 μg/ml) (A) o
anti-CD23 (B) (9p.25, 5 μg/ml) durante 18 horas. (C) Células (5 x 106 /1ml) de un sujeto alérgico
altamente sensibilizado al alergeno D1 fueron preincubados o no durante 2 h con FK506 (a las dosis
indicadas) y luego se cultivaron en presencia o ausencia de este alergeno (a 10 μg/ml) durante 18 horas.
(D) Linfocitos de un sujeto alérgico fueron preincubados o no durante 2 h con CsA (a 100 ng/ml) y luego se
cultivaron en presencia de PMA (100 nM) durante 18 horas. La expresión de la COX-2 y de la COX-1 fue
analizada por western-transferencia. Dos experimentos adicionales dieron un resultado similar.
(A)
– – CsA
9P.25
CsA (μg/ml)
α-IgE (10 μg/ml)
– – 0.01 0.1 1
COX-2
COX-1
COX-2
COX-1
(B)
D1 (10μg/ml) PMA
– – CsA
COX-2
COX-1
FK506 (ng/ml) – – 1 10 100
(D)
COX-2
COX-1
(C)
(A)
– – CsA
9P.25
CsA (μg/ml)
α-IgE (10 μg/ml)
– – 0.01 0.1 1
COX-2
COX-1
COX-2
COX-1
(B)
D1 (10μg/ml) PMA
– – CsA
COX-2
COX-1
FK506 (ng/ml) – – 1 10 100
(D)
COX-2
COX-1
(C)
RESULTADOS Y DISCUSIONES
128
En este sentido en primer lugar investigamos si los alergenos eran capaces de
modificar de alguna forma la capacidad de unión al ADN del factor de transcripción
NF-κB. Los resultados de la figura 30A ilustran que el alergeno D1 (a una
concentración de 10 μg/ml) aumenta, de manera dependiente del tiempo, la
formación de complejos NF-κB/ADN en linfocitos de un sujeto alérgico sensibilizado a
dicho alergeno. Como se observa, NF-κB fue detectado como una única banda en
análisis por EMSA, que comienza a detectarse a la hora y persiste durante al menos 3
horas. La especificidad de nuestros resultados queda demostrada por la competición
con un exceso de 100 veces de sonda no marcada (figura 30A,*). En experimentos
de retraso (“supershift”) con anticuerpos anti-p50 y anti-p65 (figura 30B), se
demuestra que estos péptidos participan en la formación del complejo activo de NF-
κB (el tetrámero p50/p65).
El análisis de la participación de NF-κB también se amplió estudiando la degradación
de la proteína I-κB en el citosol. Como se ilustra en la figura 30C, el alergeno D1
provocó una desaparición, dependiente del tiempo, de I-κB en linfocitos de un sujeto
altamente sensibilizado a dicho alergeno. La degradación proteica se relacionó
estrechamente con la cinética de activación de la capacidad de unión al ADN de NF-
κB, comenzando a detectarse a la hora y alcanzado el máximo a las 3 horas.
A continuación ensayamos el efecto de dos inhibidores de NF-κB sobre la expresión de
la COX-2: el MG-132, un fármaco que inhibe la actividad proteolítica del proteasoma e
impide la degradación de Iκ-B (Palombella y col., 1994), y el SN-50, un péptido que
impide la translocación al núcleo de NF-κB (Lin y col., 1995). La figura 31 ilustra el
efecto de estos compuestos sobre la expresión de la COX-2. Como se observa el MG-
132 reduce, prácticamente al completo, la expresión de la proteína inducida por
alergenos (figura 31A) o anticuerpos anti-CD23 (figura 31B). Por otro lado, el SN50
cancela el efecto positivo de los anticuerpos anti-IgE, mientras que el SN50M (un
péptido análogo a SN-50 pero con una mutación que impide que se una a p50) no
RESULTADOS Y DISCUSIONES
129
tiene efecto (figura 31C). En ambos casos, la expresión de la COX-1 no se ve
modificada por ningún tratamiento.
Figura 30. Los alergenos promueven la activación de NF-κB y la subsiguiente degradación de
Iκ-B en linfocitos humanos.
(A) Linfocitos (107 células/1ml) de un sujeto alérgico sensibilizado al alergeno D1 fueron cultivados en
presencia o ausencia de éste (a 10 μg/ ml) los tiempos indicados. La actividad de unión de NF-κB al
ADN fue ensayada por EMSA y la banda de retraso obtenida es indicada (llave). El asterisco representa
que la reacción de unión se llevó a cabo, durante 180 minutos, en presencia de un exceso de 100 veces
de sonda no marcada. (B) Como en A, pero donde se indica las células fueron preincubadas con 1 μl de
anticuerpo anti-p65 ó anti-p50 antes de desarrollar la reacción de unión. (C) Los niveles de I-κB se
analizaron por western-transferencia en los extractos citosólicos de linfocitos del mismo donante que en
A. Para verificar la igualdad en la cantidad de proteínas de cada pocillo la membrana se lavó con
tampón de stripping y se incubó con anticuerpos anti-β-actina. Para cada caso, otros dos experimentos
adicionales dieron el mismo resultado.
Tiempo (min)
D1 (10 μg/ml)(A)
0 30 60 180
NF-κB
*
sonda libre
Tiempo (min)
D1 (10 μg/ml)
0 30 60 180
I-κB
β-actina
(C)α-p
65α-p
50
(B)D1 (10 μg/ml)
–
NF-κB
sonda libre
Tiempo (min)
D1 (10 μg/ml)(A)
0 30 60 180
NF-κB
*
sonda libre
Tiempo (min)
D1 (10 μg/ml)
0 30 60 180
I-κB
β-actina
(C)α-p
65α-p
50
(B)D1 (10 μg/ml)
–
NF-κB
sonda libre
RESULTADOS Y DISCUSIONES
130
Ya que, como se apuntó anteriormente, la inducción IgE-dependiente del ARNm de la
COX-2 está regulada por miembros de la familia MAPK, nos propusimos determinar si
la activación de las proteínas ERK1/2 MAPK y p38 MAPK está de alguna forma
relacionada con el incremento de actividad de unión de NF-κB al ADN observado tras
estimulación con alergenos. La figura 32 ilustra los resultados obtenidos cuando
linfocitos de un sujeto alérgico sensibilizado al alergeno T9 son incubados con dicho
alergeno (a 10 μg/ml) después de un pretratamiento con los inhibidores PD098059 y
SB203580. Como indica la figura, sólo el inhibidor de la actividad p38 MAPK
(SB203580) es capaz de cancelar la actividad de unión al ADN de NF-κB, mientras
que el inhibidor de la MEK (PD098059) apenas tiene efecto.
––MG 132 (μM) 0.05 0.1 0.5 1 5
D1 (10 μg/ml)(A)
MG
9P.25 α-IgE (10 μg/ml)
COX-2
COX-1
––COX-2
COX-1
–– SN50
SN50M
COX-2
COX-1
(B) (C)
––MG 132 (μM) 0.05 0.1 0.5 1 5
D1 (10 μg/ml)(A)
MG
9P.25 α-IgE (10 μg/ml)
COX-2
COX-1
COX-2
COX-1
––COX-2
COX-1
COX-2
COX-1
–– SN50
SN50M
COX-2
COX-1
–– SN50
SN50M
COX-2
COX-1
COX-2
COX-1
(B) (C)
Figura 31. Los inhibidores de NF-κB cancelan la inducción de la COX-2 promovida por
alergenos, anticuerpos anti-CD23 ó anti-IgE en linfocitos humanos.
(A-B) Linfocitos (5 x 106 células/1ml) de un sujeto alérgico sensibilizado al alergeno D1 fueron
preincubados o no durante 2h con MG-132 a las dosis indicadas (A) o a 5 μM (B) y luego cultivados en
presencia o ausencia de dicho alergeno (a 10 μg/ml) (A) o anti-CD23 (9P.25, 5 μg/ml) (B) durante 18
horas. (C) Linfocitos (5 x 106 células/1ml) de un sujeto alérgico fueron preincubados o no, durante 1h,
con SN50 ó SN50M (a 13.5 μM) y luego cultivados en presencia de anticuerpos anti-IgE (α-IgE) (a 10
μg/ml) durante 18 horas. La expresión de la COX-2 y de la COX-1 fue analizada por western-blotting.
Resultados similares a los mostrados, se obtuvieron en otros dos experimentos adicionales.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
131
XII. Efecto de la inhibición de la COX-2 sobre la producción de las
citoquinas IL-8 y TNF-α por los linfocitos humanos.
El siguiente objetivo de nuestro trabajo fue estudiar si la inhibición enzimática de la
inducción IgE-dependiente de la COX-2 afectaba de alguna forma a las actividades
funcionales de los linfocitos. Trabajos previos, no publicados, de nuestro laboratorio
han determinado que entre los distintos efectos promovidos por un mecanismo
dependiente de la IgE en linfocitos de sujetos atópicos se encuentran la producción de
las citoquinas inflamatorias IL-8 y TNF-α. La figura 33 ilustra estos resultados. Como
se muestra, cuando las células de sujetos altamente sensibilizados al alergeno G3 se
cultivan en presencia de dicho alergeno o anticuerpos anti-IgE (todos a una
concentración de 10 μg/ml), se produce una liberación, dependiente de tiempo, de
estas proteínas al medio de cultivo. La producción de las citoquinas se comienza a
detectar a partir de las 6 horas, alcanzando el máximo después de 18 horas de cultivo
(figuras 33A y 33B). Tanto en un caso como en el otro, los niveles obtenidos con la
anti-IgE fueron siempre superiores a los que se detectaron con los alergenos.
Figura 32. La actividad p38MAPK regula la
activación de NF-κB inducida por
alergenos en linfocitos humanos. (A)
Linfocitos (107 células/1ml) de un sujeto
alérgico altamente sensibilizado al alergeno T9
fueron pretratados o no durante 45 minutos
con 10 μM de SB203580 (SB) ó 25 μM de
PD098059 (PD) y luego incubados en
presencia o ausencia de dicho alergeno (a 10
μg/ml) durante 1 hora. La actividad de unión
de NF-κB fue ensayada por EMSA. Dos
experimentos adicionales a éste dieron el
mismo resultado.
T9 (10 μg/ml)
– – PD SB
NF-κB
sonda libre
T9 (10 μg/ml)
– – PD SB
NF-κB
sonda libre
RESULTADOS Y DISCUSIONES
132
Figura 33. Producción IgE-dependiente de IL-8 y TNF-α en linfocitos humanos.
(A-B) Linfocitos (5 x 106 células/1ml) de sujetos alérgicos sensibilizados al alergeno G3 fueron incubados
en presencia o ausencia de éste o de anticuerpos anti-IgE o control de anticuerpo IgG (todos a 10 μg/ml)
los tiempos indicados. (C-D) Células T, B y NK (106 células/300μl) de sujetos alérgicos se trataron o no
con 5 μg/ml de anticuerpos anti-CD23 (9.P25) o anti-galectina-3 (A3A12) durante 18 horas. Los niveles
de IL-8 (A y C) y TNF-α (B y D) se cuantificaron en el sobrenadante celular por ELISA. Los valores
expresados son la media ± E.S. de tres ensayos independientes en los que cada medida se tomó por
triplicado. (E) linfocitos (5 x 106 células/1ml) de un sujeto alérgico a T9 fueron incubadas en presencia o
ausencia de dicho alergeno, de anticuerpos anti-IgE o control de anticuerpo IgG (todos a 10 μg/ml)
durante 8 horas. El ARN total fue extraído y se llevó a cabo la PCR para los genes IL-8, TNF-α o GADPH.
La figura es representativa de otros dos experimentos independientes.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400 Nadaα-IgE (10 µg/ml)G3 (10 µg/ml)
[ IL-
8 ] (
pg/m
l)
Tiempo (horas)3 6 18
(A)IgG (10 µg/ml)
Tiempo (horas)
0
100
200
300
400
500
600Nadaα-IgE (10 µg/ml)G3 (10 µg/ml)
[ TN
F-α
] (pg
/ml)
3 6 18
(B)IgG (10 µg/ml)
40
80
120
160
200
0
Nada
9P.25
A3A12
200
400
600
800
0células T células B células NK
[ IL-
8 ] (
pg/m
l)
Nada
9P.25
A3A12
células T células B células NK
[ TN
F-α
] (pg
/ml)
(C) (D)T 9Ig
G
α-Ig
E
–IL-8
GAPDH
TNF-α
(E)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400 Nadaα-IgE (10 µg/ml)G3 (10 µg/ml)
[ IL-
8 ] (
pg/m
l)
Tiempo (horas)3 6 18
(A)IgG (10 µg/ml)
Tiempo (horas)
0
100
200
300
400
500
600Nadaα-IgE (10 µg/ml)G3 (10 µg/ml)
[ TN
F-α
] (pg
/ml)
3 6 18
(B)IgG (10 µg/ml)
40
80
120
160
200
0
Nada
9P.25
A3A12
200
400
600
800
0células T células B células NK
[ IL-
8 ] (
pg/m
l)
Nada
9P.25
A3A12
células T células B células NK
[ TN
F-α
] (pg
/ml)
(C) (D)T 9Ig
G
α-Ig
E
–IL-8
GAPDH
TNF-α
(E)
RESULTADOS Y DISCUSIONES
133
También en ambos casos el control de anticuerpo IgG no tuvo efecto.
El fenómeno inductor de los alergenos y la anti-IgE también se observó cuando
subpoblaciones de linfocitos T, B y NK purificadas, se cultivaron en presencia del
anticuerpo anti-CD23. En estos casos, la máxima producción de IL-8 se detectó en las
células B (aproximadamente 4 veces más que los niveles producidos por las células
sin estimular) (figura 33C), mientras que la máxima producción de TNF-α se
cuantificó en las células NK (aproximadamente 4.5 veces más que los niveles
producidos por las células sin estimular) (figura 33D). Como ocurría en otras
ocasiones, la adicción de anticuerpos anti-galectina-3 al medio de cultivo apenas fue
notable en la producción de estas citoquinas.
La inducción IgE-dependiente de ambas citoquinas observada a nivel de proteína
también se repitió a nivel de ARNm, como indica la figura 33E.
Teniendo en cuenta los resultados anteriores, a continuación analizamos si el
pretratamiento de los linfocitos con el inhibidor selectivo de la COX-2, NS-398 (Futaki
y col., 1994), tiene alguna incidencia sobre la síntesis IgE-dependiente de ambas
citoquinas. La figuras 34A y 34B muestran que la inhibición de la actividad COX-2
reduce, de manera estadísticamente significativa (p<0.001), la liberación al medio de
cultivo de IL-8 y TNF-α, inducidas tanto por alergenos como por anticuerpos anti-IgE
en linfocitos de sujetos alérgicos sensibles al alergeno T9. Como se ilustra, esta
reducción fue tanto mayor cuanto mayor era la dosis de NS-398 usada.
Para estudiar si la reducción del aumento de la citoquina fue paralela a la reducción
de expresión de los genes, ensayamos el efecto del NS-398 sobre el ARNm de la IL-8
y el TNF-α. Las figuras 34C y 34D ilustran que este compuesto, de forma similar a
la producción de proteína, inhibió la expresión inducida por anticuerpos anti-IgE de
ambas citoquinas a nivel de ARNm.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
134
XIII. Modulación de la expresión IgE-dependiente de la COX-2 por
fármacos usados en el tratamiento de los procesos alérgicos.
En el último apartado de este trabajo nos preguntamos si los medicamentos usados
en el tratamiento de las enfermedades alérgicas podían modular de alguna forma la
expresión IgE-dependiente del enzima COX-2 en linfocitos humanos.
Figura 34. El inhibidor de la actividad COX-2, NS-398, reduce la síntesis de IL-8 y TNF-α
inducidas por alergenos o anticuerpos anti-IgE en linfocitos humanos.
(A-B) Linfocitos (5 x 106 células/1ml) de sujetos alérgicos altamente sensibilizados al alergeno T9 fueron
pretratados o no durante 45 min con NS-398 (a 1 ó 50 μM) y luego incubados en presencia o ausencia
de 10 μg/ml de dicho alergeno o de anticuerpos anti-IgE (α-IgE) durante 18 horas. Los niveles de IL-8
(A) y TNF-α (B) se cuantifican por ELISA. Los valores expresados son la media ± E.S de tres ensayos
independientes en los que cada medida se toma por triplicado. (* p< 0.001 comparado con las células
tratadas con anti-IgE; ** p< 0.001 comparado con las células tratadas con alergeno). (C-D) Células
(5x106 células/1ml) de un sujeto alérgico fueron preincubadas en presencia o ausencia de NS-398 (NS)
y luego tratadas o no con anticuerpos anti- IgE (α-IgE) (a 10 μg/ml) durante 8 horas. Se realizó la RT-
PCR para los genes IL-8, TNF-α o GADPH. La figura es representativa de otros dos experimentos
realizados.
0
100
200
300
400
500
***
**
T9
NS-398 (μM) – – 501 – 501
(A)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
***
*
α-IgE[ I
L-8
] (pg
/ml) *
α-IgE
**
T9
[ TN
F-α
] (pg
/ml)
NS-398 (μM) 501 501– – –
(B)
α-IgE
– NS –IL-8
GAPDH
(C)
GAPDH
α-IgE
TNF-α– NS –
(D)
0
100
200
300
400
500
***
**
T9
NS-398 (μM) – – 501 – 501
(A)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
***
*
α-IgE[ I
L-8
] (pg
/ml) *
α-IgE
**
T9
[ TN
F-α
] (pg
/ml)
NS-398 (μM) 501 501– – –
(B)
α-IgE
– NS –IL-8
GAPDH
(C) α-IgE
– NS –IL-8
GAPDH
(C)– NS –
IL-8
GAPDH
(C)
GAPDH
α-IgE
TNF-α– NS –
(D)
RESULTADOS Y DISCUSIONES
135
Para ello estudiamos el efecto de tres grupos de fármacos. Los antagonistas de los
receptores de histamina o antihistamínicos (Jáuregui, 1999), los glucocorticoides
(Boushey ,1998) y las cromonas (Konig, 2000). Los resultados del efecto de estos
compuestos se muestran en la figura 35.
Figura 35. Efecto de los glucocorticoides, antihistamínicos y cromonas sobre la expresión IgE-
dependiente de la COX-2 en linfocitos humanos.
Linfocitos (5 x 106 células/1ml) de sujetos alérgicos fueron pretratados o no durante 45 min con loratadina
(Lor), ceterizina (Cet), dexamethasona (Dex), budesonida (Bud) o nedocromil sódico (Ned) a las dosis
indicadas y luego incubados en presencia o ausencia de 10 μg/ml de anticuerpos anti-IgE (α-IgE) durante 18
horas. La expresión de la COX-2 y de la COX-1 fue analizada por western-transferencia. Dos experimentos
adicionales dieron un resultado similar.
Lor (nM)
(A)
0 0 10 100
COX-2
1
α-IgE (10 μg/ml)
Lor (nM)
(A)
0 0 10 100
COX-2
1
α-IgE (10 μg/ml)
Cet (nM)
(B)
0 0 10 1001
α-IgE (10 μg/ml)
COX-2
COX-1COX-1
Dex (nM)
(C)
0 0 10 100
COX-2
1
α-IgE (10 μg/ml)
Bud (nM)
(D)
0 0 10 100
COX-2
1
α-IgE (10 μg/ml)
Ned (nM)
(E)
0 0 10 1001
α-IgE (10 μg/ml)
COX-2
COX-1 COX-1
COX-1
Dex (nM)
(C)
0 0 10 100
COX-2
1
α-IgE (10 μg/ml)
Bud (nM)
(D)
0 0 10 100
COX-2
1
α-IgE (10 μg/ml)
Ned (nM)
(E)
0 0 10 1001
α-IgE (10 μg/ml)
COX-2
COX-1 COX-1
COX-1
RESULTADOS Y DISCUSIONES
136
Dentro del grupo de los antihistamínicos analizamos dos compuestos representativos,
como son la loratadina y la ceterizina. Como se observa (figuras 35A y 35B)
ninguno de ellos afectó a la inducción de la COX-2 promovida por anticuerpos anti-
IgE. Estos datos contrastan con los obtenidos para los glucocorticoides (figuras 35C
y 35D). En este caso las dos drogas testadas (esto es, dexamethasona y
budesonida), cancelaron la expresión de la COX-2 en un rango de concentraciones del
orden de nM. De igual forma que con los antihistamínicos, la preincubación de los
linfocitos con el nedocromil sódico (del grupo de las cromonas) tampoco tuvo efecto
sobre el efecto inductor de los anticuerpos anti-IgE (figura 35E).
RESULTADOS Y DISCUSIONES
137
DISCUSIÓN
La participación de la expresión de la ciclooxigenasa-2 en la patogénesis de los
procesos alérgicos está fuera de toda duda y muchos autores han investigado la
relación COX-2/alergia en diferentes tipos celulares.
Algunos estudios han encontrado un aumento de expresión de la COX-2 en el epitelio
de las vías aéreas, esputos inducidos o infiltrado inflamatorio submucoso de pacientes
asmáticos comparado con sujetos sanos (Pang y col., 1998; Taha y col., 2000.,
Profita y col., 2003). En estos casos, los análisis inmunocitoquímicos señalan a los
macrófagos (Taha y col., 2000) y a los eosinófilos (Profita y col., 2003) como las
principales células que expresan la COX-2. En células de músculo liso se observa una
inducción de la COX-2 tras incubación con citoquinas proinflamatorias cuyos niveles
están incrementados en sujetos asmáticos (Belvisi y col., 1997). Sin embargo la
expresión de la COX-2 por linfocitos de sujetos alérgicos todavía no se ha analizado.
Este estudio muestra por primera vez que la activación in vitro de los linfocitos de
sujetos alérgicos con alergenos es un estímulo efectivo para inducir la expresión de la
COX-2, pero no de la COX-1, en estas células. El efecto de los alergenos se manifiesta
tanto a nivel de proteína como de ARNm. En el caso de la proteína, ésta aparece ya a
las 6 horas de tratamiento y se expresa mayoritariamente en la zona citosólica
próxima al núcleo, de acuerdo con estudios previos en células endoteliales humanas
que localizan a esta proteína en el retículo endoplásmico (Morita y col., 1995). Por
otro lado, el ARNm se detecta muy pronto (a la hora), como es característico en
genes de inducción muy temprana, dentro de los cuales se encuentra el gen de la
COX-2 (Maier y col., 1990).
Presumiblemente el mecanismo por el que operan los alergenos es dependiente de
inmunoglobulinas de tipo E, como queda apoyado por los siguientes hechos:
Los linfocitos de los sujetos alérgicos de nuestro estudio presentan IgE específica
para los alergenos, pero no IgG específica, en la superficie celular.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
138
Los anticuerpos anti-IgE mimetizan los resultados obtenidos con los alergenos en
sujetos alérgicos y este efecto sólo se observa cuando las moléculas de IgE se
mantienen en la superficie celular. En cambio, si estas moléculas son eluidas de la
misma, la estimulación promovida por los anticuerpos anti-IgE no se manifiesta.
El cultivo de los linfocitos con anticuerpos monoclonales dirigidos contra el
receptor de IgE CD23 conduce a una expresión de la COX-2, comparable a la
observada con los alergenos.
Con estos datos podemos sugerir que los alergenos activan la expresión de COX-2 en
los linfocitos a través del ligamiento de moléculas de IgE, que a su vez están unidas a
los receptores CD23. Este mecanismo puede explicar la alta especificidad observada
para los alergenos por la cual éstos sólo son efectivos en los sujetos que presentan
sensibilización a los mismos y son inefectivos en sujetos sanos o pacientes
sensibilizados a otros alergenos. En estos últimos casos, al no existir sensibilización
previa, los alergenos no se podrían unir a los complejos IgE específica/receptor, y por
tanto, la inducción no ocurriría. Ya que hasta la fecha sólo se ha descrito inducción de
la COX-2 a través del receptor de alta afinidad de IgE (FcεRI) en mastocitos de ratón
(Murakami y col., 1995; Reddy y col., 2000), nuestros resultados constituyen la
primera evidencia de una inducción de la COX-2 a través del receptor CD23. La falta
de respuesta observada en nuestro modelo a partir del FcεRI se puede entender si se
considera que los linfocitos carecen de la expresión de este tipo de receptor y que
sólo se ha encontrado expresión del mismo en linfocitos T de ratón tras estimulación
con IL-9 (Louahed y col., 1995). Por otra parte, la débil estimulación detectada a
través de la galectina-3 puede atribuirse a los posibles linfocitos T activados presentes
en las preparaciones, que son los únicos linfocitos donde se ha detectado expresión
de este receptor (Joo y col., 2001).
Aunque se ha descrito la capacidad de los linfocitos T para expresar la COX-2 (Íñiguez
y col., 1999; Iñiguez y col., 2000; De Gregorio y col., 2001), hasta la fecha todavía
ningún estudio ha analizado esta proteína en los linfocitos B y NK. Por esta razón,
RESULTADOS Y DISCUSIONES
139
nuestros resultados describen, por primera vez, que la COX-2 puede ser inducida en
estas subpoblaciones linfocitarias tras activación por alergenos-vía CD23.
Puesto que el fenómeno de la expresión de la COX-2 se manifiesta a nivel enzimático
con la producción de prostaglandinas (Vane y col., 1998; Smith y col., 2000), nuestro
trabajo muestra que la estimulación IgE dependiente de los linfocitos de sujetos
alérgicos permite la formación de PGD2. En este contexto, un aumento en los niveles
séricos de PGD2, un potente broncoconstrictor y vasodilatador (Hardy y col., 1984),
ha sido observado en las enfermedades alérgicas (Matsuoka y col., 2000). Por otra
parte, ratones deficientes en receptores para la PGD2 tienen una reducida
acumulación de linfocitos y eosinófilos tras estimulación con alergeno (Matsuoka y
col., 2000), debido probablemente a que esta prostaglandina induce la quimiotaxis de
células inmunes como los linfocitos T, los eosinófilos o los basófilos (Hirai y col.,
2001). Aunque los mastocitos son conocidos como los máximos productores de PGD2
(Holgate y col., 1984), recientes estudios han demostrado que los linfocitos T pueden
producir, tras estimulación a través del TCR, niveles comparables de la misma
(Tanaka y col., 2000). En línea con esto, nuestros datos demuestran que esta
subpoblación de linfocitos también produce PGD2 tras estimulación a través del
receptor CD23. En nuestro caso, extendemos, por primera vez, la producción de esta
prostaglandina a las subpoblaciones de células B y NK.
A diferencia de la PGD2, nosotros no encontramos liberación de PGE2 tras estimulación
IgE-dependiente, en contraste con los resultados obtenidos previamente por otros
autores, que encuentran producción de PGE2 después de la estimulación de los
linfocitos con ésteres de forbol (Iñiguez y col., 1999). Una explicación a estos
hallazgos puede encontrarse en las características propias de la PGE2: previene la
broncoconstricción inducida por alergeno, atenúa las respuestas alérgicas temprana y
tardía, inhibe la síntesis de IgE (Gauvreau y col, 1999) y reduce la respuesta celular
de los mastocitos, eosinófilos, macrófagos y linfocitos T (Pavord y col, 1995).
RESULTADOS Y DISCUSIONES
140
En otro aparatado de este trabajo estudiamos las potenciales rutas de transmisión de
señales implicadas en la activación IgE-mediada de los linfocitos humanos.
Numerosos estudios han relacionado a las proteínas de la familia de las MAPKs, esto
es ERK 1/2, p38 y JNK, en la regulación de la expresión de la COX-2 en monocitos
(Dean y col., 1999), células de nueroblastoma (Fiebich y col., 2000), células
epiteliales alveolares (bChen y col., 2001) o células epiteliales mamarias
(Subbaramaiah y col., 1998) estimuladas con LPS, IL-1β, TNF-α o ceramida
respectivamente. Por otra parte, se ha encontrado una asociación entre la inflamación
alérgica y la actividad MAPK en los pulmones de ratones asmáticos (Duan y col.,
2004) y en el lavado broncoalveolar de pacientes asmáticos (Naureckas y col., 1999).
En relación con estos datos, nuestro trabajo demuestra que el cultivo de los linfocitos
de sujetos alérgicos con los alergenos promueve la activación de las MAPKs de las
familias ERK1/2 y p38. Curiosamente, en nuestro modelo no observamos modificación
en el grado de fosforilación/activación de la otra familia de MAPKs, las quinasas
activadas por estrés o JNK, en contraste con lo observado en mastocitos humanos,
donde las tres familias son activadas tras ligación del receptor FcεRI (kimata y col.,
2000). Además, nuestros resultados indican que el inhibidor de la actividad p38
MAPK, el SB203580, reduce eficazmente la expresión de la COX-2 a nivel de ARNm y
proteína. En cambio, el inhibidor de la MEK, la quinasa “aguas arriba” de la ERK
MAPK, sólo cancela la expresión de la proteína sin apenas afectar al ARNm. Este
hecho sugiere que la ruta p38 MAPK, posiblemente, module la transcripción y/o
estabilización del ARN m de la COX-2, como previamente se ha descrito (Dean y col.,
1999).
Adicionalmente a las MAPKs, nosotros exploramos la participación de otras proteínas
quinasas como la PKC, PKA o la PI-3-K, alguna de las cuales han sido implicadas en la
regulación de la COX-2 en células de la granulosa (Wu y col., 2002), osteoblastos
(Wadhwa y col., 2002), macrófagos (Misra y col., 2001) y células epiteliales de colon
(Weaver y col., 2001) tras la luteinización, carga mecánica, ligación a través de la α-
RESULTADOS Y DISCUSIONES
141
2-macroglobulina o estimulación con TNF-α, respectivamente. Nuestros datos indican
que al menos la PKA y la PKC no median en la inducción IgE-dependiente de la COX-
2, ya que sus inhibidores no ejercen ningún efecto. Por el contrario, la PI-3K parece
controlar sólo débilmente la expresión de la proteína, como se deriva del uso del
inhibidor wortmanina.
La importancia de los sitios de unión para el factor de transcripción NF-κB en el
promotor de la COX-2 está muy bien definida en macrófagos (D’Aquisto y col., 1997),
células de neuroblastoma (Fiebich y col., 2000), células endoteliales vasculares
(Schedtje y col., 1997) o células epiteliales pulmonares (Chen y col., 2000),
estimulados con LPS, IL-1β, hipoxia y TNF-α, respectivamente.
Muchos estudios muestran una activación directa de NF-κB en los procesos alérgicos
(Barnes y col., 1997). Así, se ha descrito un aumento de la actividad NF-κB en
macrófagos de esputo inducido, células del epitelio bronquial y células mononucleares
de pacientes asmáticos (Hart y col., 1998; Mitsuta y col., 2004). En este contexto, el
presente trabajo demuestra una participación directa de NF-κB en la inducción
dependiente de IgE de la COX-2 en linfocitos humanos. Por ensayos de retardo en gel
detectamos, tras estimulación con los alergenos, una potente actividad de unión al
ADN de este factor de transcripción (constituido aparentemente por la forma activa
p65/p50), que se asocia con la degradación citoplásmica de I-κB. Nuestro estudio
también muestra que el pretratamiento con MG-132, el inhibidor específico del
complejo del proteasoma 26S, (que a su vez impide la degradación de I-κB) o con el
péptido SN50 reducen muy sensiblemente los niveles de expresión de la COX-2 en
respuesta a los alergenos, anticuerpos anti-IgE o anticuerpos anti-CD23.
En relación con NF-κB, se ha mostrado que las proteínas ERK1/2 y p38 MAPKs median
en el proceso de activación de NF-κB a través de la fosforilación de IKK, la quinasa
que permite la fosforilación de I-κB y su consiguiente degradación (bChen y col.,
2001). En nuestro modelo, sólo la p38 MAPK parece ser absolutamente necesaria
RESULTADOS Y DISCUSIONES
142
para la activación de NF-κB, ya que el inhibidor PD098059 no cancela el papel
estimulador de los alergenos.
Se ha descrito una estrecha relación entre el factor de transcripción NF-AT y la
expresión de la COX-2 en linfocitos T (Iñiguez y col., 2000; de Gregorio y col., 2001)
o células vasculares de músculo liso (Robida y col., 2000). En estas células, el
inhibidor de la fosfatasa calcineurina, ciclosporina A, de manera potente suprime la
inducción de la COX-2 dependiente de NF-AT causada por agentes tales como el UTP
o la angiotensina II, por el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) o por
la estimulación con PMA/ionomicina.
Por otra parte, está establecido que el factor de transcripción sensible a ciclosporina,
NF-AT, juega un importante papel en la respuesta alérgica (Schroeder y col., 2002;
Viola y col., 1997). En contra de estas observaciones, nuestros datos revelan que
aunque un tratamiento IgE dependiente incrementa la actividad de la calcineurina y la
actividad de unión al ADN de NF-AT, ni la CsA ni el FK506 fueron capaces de inhibir la
inducción de la COX-2 inducida por alergenos/anti-IgE/anti-CD23. A pesar de esto,
una posible participación de NF-AT en el proceso no puede descartarse
completamente. En este sentido, se ha descrito que la expresión de la COX-2 inducida
en linfocitos a través de la cot quinasa/tpl-2 es dependiente de NF-AT y sin embargo,
no es cancelada por CsA (De Gregorio y col., 2001). En este caso, los autores
sugieren que la capacidad de unión del factor de transcripción al ADN es regulada
“aguas abajo” de la activación de la calcineurina o por medio de una ruta paralela a la
misma. En nuestro modelo un mecanismo similar podría operar en la activación de
NF-AT.
Junto a la expresión de la COX-2, en este trabajo nosotros también mostramos por
primera vez un mecanismo de inducción, dependiente de IgE, de producción de las
citoquinas inflamatorias TNF-α e IL-8. Esta producción se manifiesta a nivel de
proteína y de ARNm, ocurre en las tres subpoblaciones linfocitarias (B, T y NK) y
tiene lugar mayoritariamente por ligación a través de los receptores CD23. Estos
RESULTADOS Y DISCUSIONES
143
resultados están en la línea de resultados previos que revelan una producción,
promovida por los alergenos, de TNF-α (Mitsuta y col.,2003), e IL-8 (Monteseirín y
col., 2004) en células mononucleares y neutrófilos de pacientes asmáticos,
respectivamente. Se han publicado estudios que revelan la participación de estas
citoquinas en los procesos alérgicos. Por un lado, niveles elevados de TNF-α e IL-8 se
han encontrado en el lavado broncoalveolar y en las vías aéreas de sujetos asmáticos
(Broide y col., 1992; Hosselet y col., 1994; Norzila y col., 2000; Nocker y col., 1996).
Por el otro, se conoce que ambas interleuquinas son potentes moléculas
quimioatrayentes hacia los lugares de inflamación. Así la IL-8 induce la quimiotaxis de
la mayoría de los leucocitos, como neutrófilos (Baggiolini y col., 1989; Baggiolini y
col., 1992), linfocitos (Larsen y col., 1989), o eosinófilos (Schweizer y col. 1994,
Shute, 1994). El TNF-α incrementa el influjo celular induciendo la expresión de
moléculas de adhesión en los leucocitos inflamatorios, lo que posibilita que éstos
aumenten su adherencia a superficies como las vías aéreas (Thornhill y col., 1991).
En el contexto de la IL-8 y el TNF-α, nuestros datos revelan que la inhibición
enzimática de la COX-2 con el antiinflamatorio no esteroideo, NS-398, previene la
producción IgE- mediada de estas citoquinas. Estos resultados están en línea con
previos estudios que revelan que este inhibidor, a las mismas dosis usadas por
nosotros, son capaces de reducir la producción de TNF-α (Iñiguez y col., 1999) y de
IL-8 (Kimura y col., 2003) en linfocitos y neutrófilos estimulados con ésteres de forbol
y zymosan opsonizado, respectivamente.
Los medicamentos del grupo de los antihistamínicos, glucocorticoides y cromonas
constituyen los principales agentes terapéuticos usados en el tratamiento de las
enfermedades alérgicas (British Thoracic Society, 1993; Jáuregui, 1999; Boushey,
1998; Konig, 2000). En este sentido, en el presente trabajo analizamos también la
posible modulación de la expresión IgE-dependiente de la COX-2 por los mismos. Los
datos presentados aquí establecen que los glucocorticoides, en nuestro caso la
dexamethasona y budesonida, son capaces de cancelar la inducción del enzima. Estos
RESULTADOS Y DISCUSIONES
144
datos coinciden con estudios previos que señalan que la dexametasona (Newton y
col., 1998; Lukiw y col., 1998; Ristimaki y col., 1996) o la budesonida (Lukiw y col.,
1998) reducen la expresión del gen de la COX-2 en células endoteliales pulmonares y
keratinocitos tratados con IL-1β, a las dosis usadas por nosotros. En estos casos los
autores señalan que las drogas actúan reduciendo la estabilidad del ARNm e
impidiendo la transcripción por inhibición de NF-κB. En nuestro modelo, algo similar
podría ocurrir.
En cuanto a los antihistamínicos y al nedocromil sódico, ningún estudio ha analizado
el efecto de los mismos sobre la expresión de la COX-2. Sí hay estudios que analizan
la incidencia de estas drogas sobre la producción de PGD2. Se ha descrito por
ejemplo, que la loratadina reduce la liberación, inducida por alergenos o a través del
FcεRI, de PGD2 en basófilos humanos y mastocitos procedentes de la piel y del tejido
pulmonar de sujetos asmáticos (Genovese y col., 1997). Sin embargo, las
concentraciones usadas en dicho estudio son mucho más altas que las que nosotros
ensayamos, del orden de 3 mM. También se ha señalado un efecto inhibidor para la
ceterizina en la producción de PGD2 por mastocitos humanos procedentes de tejido
pulmonar y de colon (Fabre y col., 1995). En este caso la droga, sólo actúa a
concentraciones del orden de 10 mM y sólo en células procedentes de pulmón. En lo
que respecta al nedocromil sódico, se ha publicado que no afecta a la liberación de
PGD2 (Maxwell y col., 1993).
En su conjunto, los resultados de esta investigación hacen que podamos tener una
visión más amplia de la contribución de los linfocitos a los procesos inflamatorios
alérgicos, donde se sabe que juegan un papel muy importante a través de la
producción de citoquinas o anticuerpos IgE (Romagnini y col., 2000; Del Prete y col.,
1993; Yanagihara, 1998). De esta forma, no es desafortunado afirmar que los
linfocitos, tras la expresión y activación de la COX-2, constituyen una fuente adicional
de generación de eicosanoides en las reacciones alérgicas
RESULTADOS Y DISCUSIONES
145
Por otra parte, este estudio permite conocer una nueva ruta molecular de activación
de las células linfoides por los alergenos a través del CD23.
Nuestros resultados pueden dar, además, una explicación a hechos experimentales
tales como que los inhibidores de las MAPKs (Duan y col., 2004), inhibidores del
proteasoma (Elliott y col., 1999) o inhibidores de la COX-2 (Niki y col., 1997) reducen
la inflamación alérgica en modelos experimentales de asma.
Por último, los datos aquí recogidos pueden ayudarnos a entender los mecanismos de
actuación de los medicamentos empleados en el tratamiento de la enfermedad
alérgica.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
147
LOS NEUTRÓFILOS HUMANOS PRODUCEN IL-8 POR
ACTIVACIÓN IgE MEDIADA
TRABAJO Nº. 2 [J. Leukoc. Biol. 2004. 76: 692-700]
RESUMEN: Se ha demostrado que los neutrófilos son responsables de la producción
de grandes cantidades de la quimioquina IL-8, que está asociada con la inflamación.
Para definir algunos de los mecanismos implicados en esta producción, en este
trabajo, analizamos la respuesta de neutrófilos humanos procedentes de pacientes
alérgicos ante la incubación con alergenos específicos o anticuerpos anti-IgE. Como
ilustran nuestros resultados, los neutrófilos responden a estos estímulos con una
producción de IL-8, dependiente de dosis y de tiempo. La liberación al medio de
cultivo de IL-8 fue paralela a la expresión de su ARNm, ocurriendo después de 3 h. y
manteniéndose hasta las 18h. Compuestos como la trifluoperazina, el EGTA,
inhibidores de la NADPH-oxidasa y “limpiadores” de especies reactivas de oxígeno,
inhibieron la producción de IL-8, indicando que el proceso presenta una dependencia
crítica del calcio y el estrés oxidativo. Además, en este estudio mostramos que la
ciclosporina A, una droga inmunosupresora que inhibe la actividad de la fosfatasa
calcineurina, inhibe la liberación y la expresión de ARNm de la IL-8.
Esta es la primera evidencia de la implicación de los ROS y de la ruta
calcio/calcineurina en la producción dependiente de IgE de IL-8. Estos datos abren
nuevas perspectivas para conocer el papel funcional de los neutrófilos en las
enfermedades asociadas a la IgE.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
148
I. Inducción de la producción de IL-8 por alergenos específicos en
neutrófilos humanos.
Puesto que se ha venido manifestando que los neutrófilos son células que juegan un
importante papel en el desarrollo y mantenimiento de los procesos alérgicos (Lee y
col., 1982; Nagy y col., 1982; Boulet y col., 1993; Montefort, 1994), y que la IL-8 es
la principal citoquina sintetizada por ellos (Altstaedt y col., 1996), en el presente
estudio nos propusimos evaluar si la incubación de neutrófilos humanos con alergenos
específicos regula la producción de IL-8. Con este propósito, se obtuvieron células de
pacientes alérgicos sensibilizados a la gramínea Dactylis glomerata (G3) y se
cultivaron en presencia de este alergeno, analizando los niveles de IL-8 en el
sobrenadante celular. Como muestra la figura 36 los alergenos produjeron un
aumento en la producción de IL-8 de manera dependiente de dosis (figura 36A) y de
tiempo (figura 36B). El efecto se comenzó a detectar a partir de 5 μg/ml de
alergeno, obteniéndose el máximo (de aproximadamente 5.5 veces el valor basal) a
una concentración de 50 μg/ml. A esta última concentración, la citoquina se comenzó
a detectar a partir de las 6 horas, alcanzando su pico de producción a las 18 horas. La
especificidad de la respuesta a los alergenos es también mostrada en la figura 1 (A y
B). Como se observa, cuando las células se incubaron en presencia del alergeno
Dermatophagoides pteronyssinuss (D1), al que los pacientes no fueron sensibles, no
se detectó liberación de IL-8. Tampoco se observó producción de esta interleuquina
cuando neutrófilos de sujetos sanos se cultivaron en presencia de los alergenos, pero
sin embargo sí respondieron al estimulador fMLP (figura 36C).
II. Papel de la IgE en la producción de IL-8 por los neutrófilos
humanos.
Desde hace años se conoce que los leucocitos polimorfonucleares pueden expresar los
tres tipos de receptores de IgE conocidos, esto es, FcεRI (Scholl y col., 1993; Soussi-
Gounni y col., 1998), FcεRII/CD23 (Yamaoka y col., 1996; Vella y col., 1999; Sugita y
col., 1993) y mac-2/galectina-3/εbp (Truong y col., 1993; Yamaoka y col., 1995;
RESULTADOS Y DISCUSIONES
149
Truong y col., 1994). Con esta premisa y con los datos de la especificidad en la
respuesta anteriormente observada (figura 36), estudiamos la potencial implicación
de la IgE en el efecto observado con los alergenos sobre la producción de IL-8.
Figura 36. Inducción de la producción de IL-8 por alergenos específicos en neutrófilos
humanos. Especificidad de la respuesta.
(A-B). Neutrófilos (106 células/0.5 ml) obtenidos de pacientes sensibilizados a G3 se incubaron en
presencia o ausencia de G3 ó D1 (al que no estaban sensibilizados) a las dosis (A) y tiempos (B) indicados.
(C) Células de sujetos sanos se incubaron en presencia o ausencia de fMLP o los alergenos G3 ó D1 durante
18h. El contenido de IL-8 en el sobrenadante celular se determinó por ELISA. Los valores mostrados son la
media ± E.S.M de 4 ensayos independientes en los que cada medida se tomó por duplicado.
[ alergeno ] (µg/ml)0 20 40 60 80 100
[ IL-
8 ] (
pg/m
l)
0
200
400
600
800
1000
1200G3
D1
(A)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400 NadaG3 (50 µg/ml)D1 (50 µg/ml)
[ IL-
8 ] (
pg/m
l)
Tiempo (horas)
3 6 18
(B)
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100Nada
G3 (50 µg/ml)D1 (50 µg/ml)
fMLP (100 nM)(C)
[ IL-
8 ] (
pg/m
l)
[ alergeno ] (µg/ml)0 20 40 60 80 100
[ IL-
8 ] (
pg/m
l)
0
200
400
600
800
1000
1200G3
D1
(A)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400 NadaG3 (50 µg/ml)D1 (50 µg/ml)
[ IL-
8 ] (
pg/m
l)
Tiempo (horas)
3 6 18
(B)
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100Nada
G3 (50 µg/ml)D1 (50 µg/ml)
fMLP (100 nM)(C)
[ IL-
8 ] (
pg/m
l)
RESULTADOS Y DISCUSIONES
150
Para ello, primero examinamos si los neutrófilos de sujetos alérgicos son capaces de
unir IgE específica en su superficie celular. Con este fin obtenemos células de sujetos
monosensibilizados al polen de Olea europaea (T9) y las sometemos a un tratamiento
ácido como se indica en la sección de Materiales y Métodos (apartado II.9), para eluir
las inmunoglobulinas unidas a superficie celular. Los sobrenadantes eluidos se usan
para analizar, por western-tranferencia, la reactividad frente a distintos extractos
alergénicos separados mediante electroforesis en geles de poliacrilamida. La figura
37 es un ejemplo de los resultados obtenidos. Como se observa, sólo encontramos
bandas inmunoreactivas en el caso en el que los sobrenadantes de células tratadas
son incubados con el extracto de T9 (carril 1). Por el contrario, no se observa señal si
los sobrenadantes de células tratadas se incuban con extractos de D1 (frente al que
los pacientes no están sensibilizados, carril 3), o cuando los sobrenadantes que se
incubaron con extractos de T9 procedían de células que no sufrieron tratamiento
alguno (carril 2). Ya que en el método usamos como secundario un anticuerpo anti-
IgE que no tiene reactividad cruzada con el resto de las inmunoglobulinas, podemos
deducir que el reconocimento de las bandas proteicas está mediado por moléculas de
tipo IgE. En el caso presentado en esta figura, se obtuvieron 2 bandas mayores de
aproximadamente 36 y 40 KDa y otras tres menores con un peso molecular
comprendido entre 49 y 60 KDa. La diversidad del tamaño de bandas podría
representar diferentes componentes alergénicos del extracto de T9, con capacidad
para ser reconocidos por moléculas de IgE específica que se encuentren a su vez
ligadas a la superficie celular. De acuerdo con nuestros resultados, para este polen se
han descrito al menos 20 bandas proteicas con actividad alergénica (Liccardi y col.,
1996; Rodríguez y col., 2001).
A continuación, realizamos experimentos para analizar si anticuerpos anti-IgE podían
mimetizar el efecto inductor de los alergenos sobre la producción de IL-8.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
151
A tal efecto se obtuvieron neutrófilos de sujetos alérgicos y se incubaron en presencia
de anti-IgE, recogiéndose los sobrenadantes después del tratamiento y analizándose
en ellos la IL-8 liberada.
Como se muestra en la figura 38A, los niveles de IL-8 aumentaron
significativamente y de forma lineal a dosis de anti-IgE comprendidas entre 5 y 15
μg/ml y a partir de entonces (20-25 μg/ml) la curva de producción se vuelve
asintótica.
La cinética de producción de IL-8 por anti-IgE, comparada con la de otros
estimuladores clásicos como el fMLP o el LPS, es mostrada en la figura 38B. Como se
observa, para la anti-IgE (a 15 μg/ml) o el fMLP, la acumulación de la citoquina fue ya
significativamente detectable después de tres horas de tratamiento, aumentando a
las 6 horas y alcanzando el máximo a las 18 horas. En cambio, para el LPS, el
aumento de IL-8 sólo se empezó a observar a las 6 horas, alcanzándose también el
máximo a las 18 horas. A este tiempo (18 horas) la máxima respuesta se obtuvo con
21
29
36
49
81
112
P.M.1 2 3
21
29
36
49
81
112
P.M.1 2 3Figura 37. Reactividad de la IgE específica
(eluida de la superficie celular) frente a los
extractos alergénicos.
Extractos de alergenos específicos se separaron por
electroforesis y se transfirieron a membranas de
PVDF. Luego las membranas se incubaron con
distintos sobrenadantes;
Carril 1: extracto de T9 incubado con sobrenadante
de neutrófilos de un paciente sensible a T9 después
del tratamiento ácido.
Carril 2: extracto de T9 incubado con sobrenadante
de neutrófilos de un paciente sensible a T9 sin
ningún tratamiento.
Carril 3: extracto de D1 incubado con sobrenadante de neutrófilos de un paciente sensible a T9 después
del tratamiento ácido. Tras de un proceso de lavado, las membranas fueron incubadas con un anticuerpo
anti-IgE-HRP y reveladas por quimioluminisciencia. Los pesos moleculares (P.M.) son mostrados.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
152
el LPS (p‹0.001, con respecto a la anti-IgE o fMLP) y los valores alcanzados con el
tratamiento con la anti-IgE fueron mayores que con el fMLP (p=0.002).
Si se comparan las curvas de cinéticas y dosis-respuesta de la producción de IL-8 de
los neutrófilos tratados con alergenos y anti-IgE (figuras 36A y 36B con figura 38A
y 38B), resulta evidente que la anti-IgE es un estímulo mucho más potente que los
alergenos. Esto se puede explicar considerando que la anti-IgE puede interaccionar
con todas las moléculas de IgE existentes en la superficie celular, mientras que los
alergenos sólo pueden interaccionar con las moléculas de IgE alergeno-específicas.
Por este motivo, de ahora en adelante usaremos mayoritariamente la anti-IgE como
estímulo.
Por otra parte, la especificidad del anticuerpo se ensaya con 10 μg/ml de IgG de cabra
(figura 38A), que no afecta a la producción de la citoquina. Además, el efecto
estimulador de la anti-IgE sobre los neutrófilos no se detecta si, previo al tratamiento
con ella, las moléculas de IgE son eluidas de la superficie celular (figura 38C).
Experimentos adicionales a los anteriores se realizaron para identificar qué receptor o
receptores de IgE están implicados en la producción IgE-dependiente de IL-8. Para
ello, se analizó el efecto del entrecruzamiento de los receptores con anticuerpos
monoclonales dirigidos contra estas estructuras. Se usaron tres tipos de anticuerpos:
el anticuerpo CRA1 (anti-cadena α del FcεRI), el anticuerpo 9P.25 (anti-CD23) y el
anticuerpo A3A12 (anti-galectina 3). La figura 39 ilustra que la liberación de la
citoquina ocurre principalmente cuando los anticuerpos CRA.1 y A3A12 son usados,
siendo las cantidades obtenidas para el primero mayores que para el segundo. Como
control de anticuerpo se usó IgG1 de ratón, sin ningún tipo de efecto.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
153
[ α-IgE ] o [ IgG ] (µg/ml)
0 5 10 15 20 25
[ IL-
8 ] (
pg/m
l)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000(A)IgG
α-IgE
Tiempo (horas)
3 6 18[ I
L-8
] (pg
/ml)
0
750
1500
2250
3000
10000Nadaα-IgE (15 µg/ml)fMLP (100 nM)LPS (0.5 µg/ml)
*
*
*
**
********
(B)
[IL-8
] (p
g/m
l)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500Nadaα-IgE
Elución + α-IgE
(C)
[ α-IgE ] o [ IgG ] (µg/ml)
0 5 10 15 20 25
[ IL-
8 ] (
pg/m
l)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000(A)IgG
α-IgE
Tiempo (horas)
3 6 18[ I
L-8
] (pg
/ml)
0
750
1500
2250
3000
10000Nadaα-IgE (15 µg/ml)fMLP (100 nM)LPS (0.5 µg/ml)
*
*
*
**
********
(B)
[IL-8
] (p
g/m
l)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500Nadaα-IgE
Elución + α-IgE
(C)
[IL-8
] (p
g/m
l)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500Nadaα-IgE
Elución + α-IgE
(C)
Figura 38. Inducción de la producción de IL-8 por anticuerpos anti-IgE en neutrófilos
humanos.
(A). Neutrófilos (106 células/0.5 ml) obtenidos de pacientes alérgicos se incubaron en presencia o
ausencia de anti-IgE (α-IgE) o IgG a las dosis indicadas durante 18 horas. (B) Neutrófilos (106
células/0.5 ml) obtenidos de pacientes alérgicos se incubaron en presencia o ausencia de 15 μg/ml de
anti-IgE (α-IgE), 100 nM de fMLP ó 0,5 μg/ml de LPS los tiempos indicados. (C) Células de sujetos
alérgicos (106/0.5 ml) se trataron o no con un medio ácido para eluir la IgE de superfice y luego fueron
incubadas en presencia o ausencia de 15 μg/ml de anti-IgE durante 18 horas. El contenido de IL-8 en el
sobrenadante celular se determinó por ELISA. Los valores mostrados son la media ± E.S.M de 3 ensayos
independientes en los que cada medida se tomó por duplicado.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
154
III. Inducción de la expresión del ARNm de la IL-8 por estimulación
IgE-dependiente.
Para determinar si la expresión del gen de la IL-8 fue paralela a la liberación de la
citoquina, se analizó el ARNm de la IL-8 mediante RT-PCR. Con este objetivo,
neutrófilos de sujetos alérgicos se incubaron en presencia de anti-IgE (a 15 μg/ml),
durante diferentes tiempos (3,6 y 18 horas). A continuación se extrajo el ARN total y
se estudió el ARNm de la IL-8. Análisis de PCR convencional (figura 40A) muestran
que la inducción fue ya aparente a las tres primeras horas de tratamiento y se
mantuvo durante 18 horas. Como control interno se usó el gen de la β-actina. Una
pequeña cantidad de ARN se observó en las células sin estimular, de acuerdo con
estudios previos (Cassatella y col., 1992), que describen una transcripción moderada
del ARNm de la IL-8 inducida en neutrófilos humanos después de 6 horas de
incubación.
La cantidad ARNm de IL-8 para cada uno de estos tiempos se analizó por PCR a
tiempo real. Como se ilustra en la figura 40B, el tratamiento de las células durante 3
horas con anti-IgE, indujo una acumulación del ARNm de la IL-8 de aproximadamente
1.5 veces la cantidad observada en las células sin estimular. El máximo, de
aproximadamente 5 veces la cantidad observada en las células sin estimular, se
obtuvo a partir de las 18 horas.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
[IL-8
] (p
g/m
l)
Nadaα-IgE
anti-galectina-3
T9
anti-FcεRIanti-CD23
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
[IL-8
] (p
g/m
l)
Nadaα-IgE
anti-galectina-3
T9
anti-FcεRIanti-CD23
Figura 39. Inducción de la producción de IL-8 a
través del FcεRI y galectina-3 en neutrófilos
humanos. Neutrófilos (106 células/0.5 ml) obtenidos de
pacientes sensibles a T9 se incubaron en presencia o
ausencia de 15 μg/ml de anti-IgE (α-IgE), 50 μg/ml de T9
ó 5 μg/ml de anti-FcεRI, anti-CD23 ó anti-galectina-3
durante 18 horas. El contenido de IL-8 en el
sobrenadante celular se determinó por ELISA. Los valores
mostrados son la media ± E.S.M de 3 ensayos
independientes en los que cada medida se tomó por
duplicado.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
155
IV. La producción IgE-dependiente de la IL-8 es dependiente de rutas
activadas por calcio y por especies reactivas de oxígeno.
Una vez conocido todo lo anterior, diseñamos nuevos experimentos con la finalidad de
conocer las rutas intracelulares que controlan la producción IgE-dependiente de IL-8
por los neutrófilos humanos.
En este contexto, se ha publicado que la expresión de la IL-8 está bajo el control del
calcio (Kuhns y col., 1995; Kuhns y col., 1998; Yu y col., 2001; Nozawa y col., 2002)
y la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) (Zeng y col., 2003;
Lakshminarayanan y col., 1998; Hwang y col., 2004). Adicionalmente, en estudios
previos a éste, nuestro grupo ha demostrado que la activación con alergenos
específicos o anticuerpos anti-IgE de neutrófilos de sujetos alérgicos induce en éstos
respuestas funcionales que incluyen un influjo en los niveles de calcio (Monteseirín y
col., 1996) y una sobreproducción de especies reactivas de oxígeno (Monteseirín y
col., 1996; Monteseirín y col., 2002).
Figura 40. Expresión del ARNm de la IL-8 en neutrófilos humanos de sujetos alérgicos
estimulados con anti-IgE.
Neutrófilos (5 x 106 células/1 ml) se incubaron en presencia o ausencia de anti-IgE (α-IgE, 15 μg/ml)
durante los tiempos indicados. Se aisló el ARN total y se sometió a RT-PCR. El cDNA resultante se
amplificó por PCR convencional (A) o por PCR a tiempo real (B). En la PCR convencional se usó la β-
actina como control de carga. Para la PCR a tiempo real se muestran las veces de cambio ± E.S.M.
Tiempo (h) 0 3 6 1 8
IL-8
β-actina
α-IgE
Uni
dade
s ar
bitr
aria
s
0
1
2
3
4
5
0 3 6 18
Tiempo (h)
(A) (B)Nadaα-IgE
Tiempo (h) 0 3 6 1 8
IL-8
β-actina
α-IgE
Uni
dade
s ar
bitr
aria
s
0
1
2
3
4
5
0 3 6 18
Tiempo (h)
(A) (B)Nadaα-IgE
RESULTADOS Y DISCUSIONES
156
Con todo ello, analizamos la potencial implicación de estos mediadores en la
producción de IL-8 por células estimuladas con anti-IgE.
Para estudiar la implicación del calcio, llevamos a cabo el siguiente abordaje
experimental: analizamos el efecto, que sobre la producción de IL-8 mediada por
anticuerpos anti-IgE, tenían dos compuestos, el EGTA y la trifluoperazina. El primero
es un quelante del calcio extracelular (Bers, 1982) y el segundo es un inhibidor
específico de la actividad dependiente de calcio del enzima calmodulina (Bar-Sagi y
col., 1983). Los resultados son mostrados en la tabla VI.
Como se observa, el pretratamiento con EGTA, a la dosis usada de 2.5 mM, inhibió
por completo la liberación de la citoquina. De forma parecida, la trifluoperazina
también redujo la generación de IL-8. En este caso se observó un efecto dependiente
de dosis.
El efecto del pretratamiento con EGTA sobre el ARNm de la IL-8 es mostrado en la
figura 41. En este caso, en contraste con lo observado a nivel de proteína, la
IL-8 (ng/ml)
Adiciones
Nada α-IgE (15 μg/ml) α-IgE (15 μg/ml) + TFP (1 μM) α-IgE (15 μg/ml) + TFP (10 μM) α-IgE (15 μg/ml) + EGTA (2.5 mM)
0.233.95 2.48 0.63 0.07
0.05 0.54 0.10a
0.10b
0.01b
±± ± ± ±
TABLA VI. Ca 2+-dependencia de la liberación de IL-8 por neutrófilos humanos estimulados
con anti-IgE.
Neutrófilos humanos (106 células/0.5 ml) de pacientes alérgicos se preincubaron, donde se indica, con
EGTA o triluoperazina (TFP), durante 1 hora a 37º C. A continuación las células se lavaron y se
incubaron, a 37º C, donde se indica, con anti-IgE. La liberación de IL-8 se analizó por ELISA en el
sobrenadante, tras la eliminación de las células por centrifugación. Los valores expresados son la media
± E.S.M. de tres experimentos independientes, en los que cada medida se llevó a cabo por triplicado. a p
<0.05 respecto a las células incubadas con anti-IgE. b p <0.001 respecto a las células incubadas con
anti-IgE.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
157
eliminación de los niveles extracelulares de calcio, sólo propició una reducción parcial
en la expresión del ARNm de la citoquina.
Para estudiar la participación de las especies reactivas de oxígeno analizamos el
efecto, que sobre la producción de IL-8, tenían varios inhibidores farmacológicos y
compuestos “limpiadores” de radicales libres.
Los dos inhibidores usados fueron: el 4-hidroxi-3-metoxiacetofenona (HMAP) y el
difenileniodonio (DPI). Ambos compuestos inhiben, de forma diferente, la actividad de
la NADPH oxidasa, el principal sistema enzimático generador de radicales O2- en
neutrófilos. El HMAP compite con el sustrato del enzima, el NADH, por la unión al sitio
activo (Satriano y col., 1994). El DPI, en cambio, bloquea la unión del enzima con su
cofactor, el FAD (Cross y col., 1990).
Los “limpiadores” de radicales libres que ensayamos fueron: el pirrilodín
ditiocarbamato (PDTC), un compuesto que elimina el efecto oxidativo de los radicales
libres (Shi y col., 2000) y el 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil (TEMPO), un agente
que bloquea el efecto oxidativo producido por radicales libres de oxígeno, como el OH-
(Voest y col., 1993).
Los resultados obtenidos quedan recogidos en la figura 42. Como se observa, todos
los compuestos usados son capaces de reducir significativamente la liberación,
inducida por anticuerpos anti-IgE, de IL-8 al medio de cultivo (figura 42A). De la
β-actina
IL-8
α-IgE
EGTA--
β-actina
IL-8
α-IgE
EGTA--
Figura 41. Efecto del EGTA sobre la expresión, inducida
por anti-IgE, del ARNm de la IL-8 por neutrófilos
humanos.
Neutrófilos (5 x 106 células/1ml) procedentes de sujetos
alérgicos se incubaron en presencia o ausencia de 2.5 mM de
EGTA durante 1 hora. A continuación las células se lavaron y
se trataron con anti-IgE (α-IgE, 15 μg/ml) por tres horas. El
ARN total se extrajo, se retrotranscribió hasta ADNc y se
amplificó por PCR convencional. Los ARNm de la IL-8 y la β-
actina son mostrados. El experimento es representativo de
otros tres con resultado similar.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
158
misma forma, este fenómeno se vio acompañado por la cancelación drástica de la
expresión del ARNm de la citoquina (figura 42B).
V. Implicación de la calcineurina en la producción IgE-dependiente de
IL-8 por los neutrófilos humanos.
Una de las dianas de la movilización del calcio y del estado redox intracelular es la
fosfatasa 2B o calcineurina (Crabtree, 2001; El Bekay y col., 2003). Ya que nuestro
grupo demostró por primera vez la presencia de este enzima y su actividad en
neutrófilos humanos (Carballo y col., 1999), los siguientes experimentos se enfocaron
al análisis de la participación de la misma en la producción IgE-dependiente de IL-8.
Con esa base estudiamos, en nuestro modelo experimental, el comportamiento de la
Figura 42. Dependencia de las especies reactivas de oxígeno de la producción de IL-8 por
neutrófilos humanos estimulados con anti-IgE.
Neutrófilos humanos (A: 106 células/0.5 ml; B: 5 x 106 células/ 1 ml) de pacientes alérgicos se
preincubaron, donde se indica, con DPI (10 μM), TEMPO (100 μM) o HMAP (500 μM) durante 30 minutos, o
con PDTC (100 μM) durante 1 hora. A continuación, se trataron, donde se indica, con anti-IgE (15 μg/ml)
durante 20 horas (A), o durante 3 horas (B). La liberación de IL-8 al sobrenadante celular (A) se analizó
por ELISA. El ARNm de la IL-8 (B) se ensayó por PCR convencional. (A) Los valores mostrados son la
media ± E.S.M. de tres experimentos independientes, en los que cada medida se llevó a cabo por
duplicado. (B) El experimento es representativo de otros tres.
[IL-8
] (p
g/m
l)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Nadaα-IgEα-IgE + DPIα-IgE +PDTC
α-IgE + HMAP
α-IgE + TEMPO
(A)
β-actina
IL-8
DPIPDTC
TEMPO
HMAP
α-IgE
(B)
--
[IL-8
] (p
g/m
l)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Nadaα-IgEα-IgE + DPIα-IgE +PDTC
α-IgE + HMAP
α-IgE + TEMPO
(A)
β-actina
IL-8
DPIPDTC
TEMPO
HMAP
α-IgE
(B)
--
RESULTADOS Y DISCUSIONES
159
ciclosporina A (CsA), un agente inmunosupresor que inhibe la actividad fosfatasa de
la calcineurina (Liu y col., 1991; Ho y col., 1996; Ruhlmann y col., 1997). Los
resultados presentados en la figura 43A indican que la CsA interfirió, de manera
dependiente de dosis, en la inducción de la IL-8 por neutrófilos estimulados con
anticuerpos anti-IgE. El efecto inhibitorio fue también observado, en un rango similar,
en neutrófilos de sujetos alérgicos sensibilizados a la gramínea Dactylis glomerata
(G3) cultivados en presencia de dicho alergeno. En cambio, el efecto de la droga fue
menos notable cuando los neutrófilos se trataron con LPS (figura 43B).
α-IgE LPS G3
[ IL-
8 ] (
pg/m
l)
0
1500
3000
8000
10000estímuloCsA (1 µg/ml)
(B)
log [ CsA ] (µg/ml)-4 -3 -2 -1 0 1
[ IL-
8 ] (
pg/m
l)
0
750
1500
2250
3000
3750
4500
- ∞
(A)
CsA (μg/ml)
β-actina
IL-8
α-IgE
0 0 0.05 0.1 1
(C)
α-IgE LPS G3
[ IL-
8 ] (
pg/m
l)
0
1500
3000
8000
10000estímuloCsA (1 µg/ml)
(B)
log [ CsA ] (µg/ml)-4 -3 -2 -1 0 1
[ IL-
8 ] (
pg/m
l)
0
750
1500
2250
3000
3750
4500
- ∞
(A)
CsA (μg/ml)
β-actina
IL-8
α-IgE
0 0 0.05 0.1 1
(C)
Figura 43. La ciclosporina A suprime la producción IgE-dependiente de IL-8 por los neutrófilos
humanos.
(A-B) Neutrófilos humanos (106 células/0.5 ml) de pacientes alérgicos a G3 se preincubaron durante 30
minutos con las dosis indicadas (A) o con 1 μg/ml (B) de CsA. A continuación se trataron con 15 μg/ml de
anti-IgE (A y B), 0.5 μg/ml de LPS (B) ó 50 μg/ml de G3 (B) durante 18 horas. La liberación de IL-8 al
sobrenadante celular se analizó por ELISA. Los valores mostrados son la media ± E.S.M. de tres
experimentos independientes, en los que cada medida se llevó a cabo por duplicado. (C) Neutrófilos
humanos (5 x 106 células/1 ml) de pacientes alérgicos se preincubaron o no durante 30 minutos con CsA (a
las dosis indicadas) y luego se incubaron en presencia o ausencia de 15 μg/ml de anti-IgE. El ARNm de la IL-8
se ensayó por PCR convencional. El experimento es representativo de otros dos.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
160
Para examinar la posibilidad de que la disminución en la liberación al medio de cultivo
de IL-8 se debiese a una inhibición de la expresión de su ARNm, se obtuvieron
neutrófilos de sujetos alérgicos y se incubaron con concentraciones crecientes de CsA,
30 min antes de la adicción de anti-IgE. La figura 43C ilustra que el inmunosupresor
es también capaz de bloquear, de manera dosis dependiente, la expresión del ARNm
de la citoquina.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
161
DISCUSIÓN
Los resultados descritos en este trabajo demuestran por primera vez que la activación
in vitro de los neutrófilos de sujetos alérgicos con alergenos es un estímulo efectivo
para inducir la producción de IL-8 en estas células. Nuestros resultados indican que el
proceso es muy específico, ya que sólo los alergenos que producen los síntomas
clínicos en los pacientes son los que permiten la producción de la citoquina. En
cambio, otros alergenos a los que los pacientes no son sensibles, no tienen efecto.
Además, los alergenos son inefectivos en los neutrófilos de sujetos alérgicos.
Presumiblemente el mecanismo por el que operan los alergenos es dependiente de
inmunoglobulinas de tipo E. Esto queda apoyado por varios hechos:
Los neutrófilos de los sujetos alérgicos de nuestro estudio presentan IgE específica
para los alergenos en la superficie celular.
Los anticuerpos anti-IgE mimetizan los resultados obtenidos con los alergenos en
sujetos alérgicos y este efecto sólo se observa cuando las moléculas de IgE se
mantienen en la superficie celular. En cambio, si estas moléculas son eluidas de la
misma, la estimulación promovida por los anticuerpos anti-IgE no se observa.
El cultivo de neutrófilos humanos con anticuerpos monoclonales dirigidos contra
los receptores de IgE, FcεRI y galectina-3, provoca una elevada producción de IL-
8.
En este contexto, cabe señalar una diferencia principal encontrada entre los alergenos
y los anticuerpos anti-IgE: los niveles detectados en el sobrenadante celular para las
células estimuladas con anti-IgE fueron siempre muy superiores a los encontrados
con los alergenos. Esto puede entenderse si se considera que mientras que los
anticuerpos anti-IgE estimulan todas las moléculas de IgE existentes en las células,
los alergenos sólo son capaces de estimular las moléculas de IgE específica para ese
alergeno.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
162
Por otra parte, nuestros resultados son los primeros que describen una producción de
IL-8 en neutrófilos humanos a través estructuras que unen IgE, tales como el FcεRI o
la galectina-2/mac-2/εbp. De acuerdo con estos resultados, otros autores han descrito
una producción de ión superóxido en neutrófilos humanos mediada por la galectina-3
(Truong y col., 1993; Yamaoka y col., 1995). El hecho de que no observemos síntesis
de la citoquina a través del otro receptor, el FcεRII o CD23, puede ser debido a que
éste se exprese en muy baja cantidad en neutrófilos de sujetos alérgicos, pues hasta
ahora sólo se ha observado en neutrófilos de sujetos con artritis reumatoide (Vella y
col., 1999), en neutrófilos de sujetos con gingivitis (Sugita y col., 1993) o en
neutrófilos estimulados con GM-CSF (Yamaoka y col., 1996).
En nuestro trabajo describimos, además, que la producción de la citoquina en
neutrófilos estimulados con anticuerpos anti-IgE a partir de las 6 horas fue mayor que
la obtenida con el estimulador clásico fMLP. Aunque el cultivo de neutrófilos humanos
en presencia de IL-8 induce sólo un “modesto” aumento en la producción de IL-8
(Dunican y col., 2000), es posible que el efecto de los anticuerpos anti-IgE sea
potenciado por la propia IL-8 liberada tras activación IgE-dependiente,
estableciéndose así un mecanismo autocrino que puede regular la producción de la
citoquina.
Análisis de PCR a tiempo real revelan que los niveles de ARNm de la IL-8 tras el
tratamiento con anticuerpos anti-IgE son detectables a partir de las 3 horas y
alcanzan el máximo a las 18 horas. De acuerdo con nuestros datos se ha descrito, en
neutrófilos, una inducción del ARNm de la IL-8 tras 3 horas de tratamiento con
proteína granular mayor básica eosinofílica (MBP) purificada (Page y col., 1999). Por
el contrario, también se ha descrito en las mismas células una rápida inducción (a los
5 min) del ARNm de esta citoquina por agentes tales como la thapsigargina (un
inhibidor de la bomba de Ca2+ microsomal) (Kuhns y col., 1995). Ya que el ARNm de
la IL-8 contiene elementos ricos en adenosina-uridina (elementos AAUUUA), que
están asociados con la inestabilidad del mensajero, eficiencia traduccional y rápido
RESULTADOS Y DISCUSIONES
163
recambio (“turnover”) (Tebo y col., 2003), es posible que el aumento observado en la
cantidad del ARNm de la citoquina tras estimulación IgE-dependiente se deba a un
proceso que ocurre a nivel de transcripción y/o estabilización.
Previamente, algunos estudios han demostrado que aunque los neutrófilos humanos
obtenidos de sangre periférica producen de por sí cantidades mínimas de IL-8, éstos
son capaces de alcanzar, tras estimulación con ionóforos de calcio, los niveles
encontrados in vivo en neutrófilos exudados de sitios inflamados (Kuhns y col., 1995).
Recientemente, otros datos apuntan hacia una dependencia del calcio en la inducción
de la IL-8 en células de adenocarcinoma de colon estimuladas con ésteres de forbol o
forskolina (Yu y col., 2001), o células epiteliales gástricas infectadas con Helicobacter
pylori (Nozawa y col., 2002). Estos datos sugieren que la elevación del calcio
intracelular puede ser una importante señal fisiológica que regula la producción de la
citoquina. Por otro lado, nuestro grupo ha publicado que cuando los neutrófilos de
sujetos alérgicos son incubados en presencia de alergenos o anticuerpos anti-IgE, se
produce un aumento en los niveles de calcio citoplásmicos (Monteseirín y col. 1996).
En este ámbito, nuestros resultados obtenidos con el quelante de calcio, EGTA,
indican que el influjo del calcio es necesario para la síntesis y la secrección, IgE-
dependiente, de la IL-8. Estos datos son consistentes con los obtenidos previamente
para neutrófilos humamos tratados con thapsigargina (Kuhns y col. 1998).
Junto con el EGTA, nosotros observamos un efecto inhibidor de la trifluoperazina
(TFP), un agente bloqueante de la actividad enzimática dependiente de calcio de la
calmodulina. Estos datos están en concordancia con los obtenidos en células
epiteliales, donde se observa una reducción en la producción de IL-8 por otros
inhibidores de la calmodulina como el W7 y el calmidazolium (Nozawa y col., 2002).
La calmodulina es un enzima que está implicado en muchas rutas de señalización,
activando la función de varias quinasas (las calmodulinas-quinasas I y II, la quinasa
de la cadena ligera de miosina), fosfatasas (calcineurina), canales iónicos (bomba de
RESULTADOS Y DISCUSIONES
164
Ca2+ de la membrana plasmática) y otros enzimas citosólicos, tales como la
fosfodiesterasa, la adenilato ciclasa y la óxido nítrico sintetasa (Crivici y col., 1995).
Es por ello por lo que no es sorprendente que los inhibidores de la calmodulina
controlen los procesos de activación celular. Así, se ha descrito que inhibidores de la
calmodulina reducen varias de las funciones de los neutrófilos, entre las que se
encuentran, el “estallido respiratorio”, la expresión de los receptores del complemento
C3b (CR1) y C3bi (CR3), la liberación del contenido de los gránulos secundarios, la
migración celular y la movilidad celular (Alobaidi y col., 1981; Berger y col., 1985).
En otro apartado de este trabajo intentamos estudiar el potencial papel de las
especies reactivas de oxígeno (ROS) en la producción IgE-dependiente de IL-8 por los
neutrófilos humanos. Nuestro grupo ha demostrado que la estimulación con
anticuerpos anti-IgE o con alergenos induce el “estallido respiratorio” en neutrófilos
de sujetos alérgicos (Monteseirín y col., 1996; Monteseirín y col., 2002). Además,
varios autores han indicado la participación de radicales oxidantes en la expresión del
gen de la IL-8 en diferentes tipos celulares, como por ejemplo en monocitos humanos
estimulados con homocisteína (Zeng y col., 2003), en células epiteliales de cordón
umbilical tratadas con H2O2 y TNF-α (Lakshminarayanan y col., 1998) o en células de
adenocarcinoma de colon tratadas con IL-1β (Hwang y col., 2004). De acuerdo con
todo lo anterior, nuestros resultados indican que los efectos de los anticuerpos anti-
IgE están mediados por especies reactivas de oxígeno producidas a través de la
NADPH oxidasa, como demuestra el uso de los inhibidores DPI, HMAP, PDTC y TEMPO,
que redujeron la síntesis y secrección de la citoquina.
Previamente, nosotros describimos la presencia de la fosfatasa calcineurina en el
lisado de neutrófilos humanos y como la actividad de la misma es dependiente del
calcio y del estado redox celular (Carballo y col., 1999; El Bekay y col., 2003).
Por esta razón, en el presente estudio exploramos también la implicación de esta
proteína intracelular en la producción dependiende de IgE de IL-8 por los neutrófilos
de sujetos alérgicos. Nosotros presentamos datos de que la droga que interfiere en
RESULTADOS Y DISCUSIONES
165
activación de la calcineurina, CsA, inhibe de manera dependiente de dosis la inducción
IgE-dependiente del ARNm y de la proteína de la IL-8 en neutrófilos de sujetos
alérgicos. Estos datos coinciden con estudios previos que indican que la inducción de
la IL-8 en células Jurkat a través de la ruta coestimuladora del CD28 es sensible a
CsA (Wechsler y col., 1994), que la inducción del gen de la IL-8 en neutrófilos por
thapsigargina es inhibida por CsA (Khuns y col., 1998) o que la producción de IL-8
por ésteres de forbol en células de adenocarcinoma de colon es reducida
sensiblemente con el FK506 (Yu y col., 2001).
En su conjunto, los resultados de esta investigación hacen que podamos tener una
visión más amplia de la contribución de los neutrófilos a los procesos inflamatorios
alérgicos. De esta forma, la producción IgE-dependiente de IL-8 por los neutrófilos
puede contribuir a los procesos inflamatorios característicos del asma crónica. Así, la
IL-8 aumenta la migración celular, ya que es quimioatrayente para los neutrófilos
(Baggiolini y col., 1989; Baggiolini y col., 1992), linfocitos T (Larsen y col., 1989),
eosinófilos (Shute, 1994; Schweizer y col., 1994), basófilos primados con IL-3
(Dahhinden y col., 1989) y células NK activadas con IL-2 (Sebok y col., 1993).
Asimismo el efecto mediado por la IgE sobre la producción de IL-8 es incluso más
relevante en la fisiopatología del asma: además de promover un influjo de neutrófilos
anormalmente elevado, la IL-8 prolonga la activación neutrofílica de manera
autocrina, posibilitando la producción de mediadores, entre los que se encuentran los
radicales libres (Kownatzki y col., 1990), LTB4 (Schröder, 1989), y proteínas
granulares como la elastasa y la myeloperoxidasa (Gessler, 2004), los cuales
exacerban los cambios observados en el asma fatal, tales como la hipersecrección de
moco.
Por otro lado, nuestros resultados contribuyen a explicar la relación IL-8/asma, de
acuerdo con previos estudios que relacionan un aumento de IL-8 en esputos inducidos
y lavado broncoalveolar de pacientes con asma en relación a una población control
RESULTADOS Y DISCUSIONES
166
(Norzila y col., 2000; Nocker y col., 1996) y en pacientes asmáticos tras estimulación
con el alergeno (Park y col., 1999).
De igual forma, nuestros datos ayudan a explicar el efecto protector de la
trifluoperazina en la hiperreactividad bronquial observada en pacientes asmáticos
(Bowden y col., 1988) o el efecto beneficioso de los inmunosupresores en el asma
inducida por alergeno y en el asma severa crónica (Kahn y col., 2000; Sihra y col.,
1997; Alexander y col., 1992).
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
169
Los resultados de estos trabajos permiten alcanzar las siguientes conclusiones:
Con relación al objetivo nº 1:
1) El cultivo in vitro de linfocitos de pacientes alérgicos, con el alergeno responsable
del cuadro clínico, provoca la inducción de la COX-2, pero no de la COX-1. Esta
inducción es específica, ya que no se produce cuando los linfocitos se cultivan con
un alergeno al que el paciente no es sensible, o si las células proceden de sujetos
sanos. También hemos observado que las tres subpoblaciones linfocitarias
(linfocitos T, B y NK) contribuyen a la expresión de la COX-2.
2) La inducción se manifiesta a nivel del ARNm y de la proteína. Esta última presenta
actividad enzimática, que se traduce en la liberación de PGD2 al medio de cultivo.
3) A nivel de la membrana, describimos que el efecto de los alergenos está mediado
por moléculas de tipo IgE, ya que la eliminación de la IgE de la superficie celular
conlleva la supresión de la inducción de la COX-2. Además, mostramos que el
proceso ocurre mayoritariamente a través del receptor FcεRII/CD23.
4) La señalización intracelular de la inducción de la COX-2 dependiente de IgE,
implica la activación directa de vías de señalización dependientes de ERK y p38
MAPKs. La PI-3K sólo participa parcialmente en esta inducción, mientras que otras
proteínas quinasas, como la PKC o la PKA, no intervienen en ella. A nivel nuclear,
la expresión de la COX-2 es dependiente de la activación del factor de
transcripción NF-κB y parece ser independiente de la ruta calcineurina/NF-AT.
5) La inhibición de la actividad COX-2 en linfocitos con NS-398, un inhibidor selectivo
no esteroideo, produce una disminución de la liberación de las citoquinas IL-8 y
TNF-α, cuando las células se estimulan por un mecanismo dependiente de IgE.
También describimos que los glucocorticoides, pero no los antihistamínicos ni las
cromonas, inhiben la expresión mediada por IgE de la COX-2 en linfocitos
humanos.
CONCLUSIONES
170
Con relación al objetivo nº 2:
1) El cultivo in vitro de neutrófilos de pacientes alérgicos, con el alergeno
responsable del cuadro clínico, conduce a la producción de IL-8. Esta
producción es específica ya que no se produce cuando los neutrófilos se
cultivan con un alergeno al que el paciente no es sensible o si empleamos
células de sujetos sanos. La producción se manifiesta a nivel de ARNm y de
proteína, que se libera al medio de cultivo.
2) La eliminación de la IgE de la superficie celular conlleva la supresión de la
producción de IL-8. Este hecho sugiere que el efecto está mediado por
moléculas de tipo IgE y ocurre mayoritariamente a través del receptor FcεRI,
aunque también a través de la galectina-3/Mac-2/εbp.
3) Tanto la liberación de la IL-8 como la expresión de su ARNm, dependientes de
IgE, se realizan a través de mecanismos que incluyen el calcio extracelular y
las especies reactivas de oxígeno, ya que quelantes del calcio (EGTA) o
moléculas que reducen los niveles de los ROS cancelan los efectos descritos.
4) La presencia de trifluoperazina, un inhibidor de la actividad calmodulina, y de
la ciclosporina A, un inhibidor de la actividad calcineurina, cancela la expresión
y producción de IL-8 por los neutrófilos, lo que sugiere la participación de la
vía de señalización calmodulina/calcineurina.
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ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
211
AA Ácido araquidónico
ADNc ADN complementario
BCR Receptor de la célula B
BSA Albúmina sérica bovina
Bud Budesonida
Calp Calphostin C
CaM Calmodulina
CaN Calcineurina
Cet Ceterizina
COX Ciclooxigenasa
CsA Ciclosporina A
Dex Dexamethasona
DNTP Dinucleótido trifosfato
DPI Difenileniodonio
DTT Ditiotreitol
EDTA Etilendiamina ácido tetraacético
EGTA Etilen-bis-(oxietilennitrilo)-ácido tetraacético
ERK Proteína quinasa activada por señales extracelulares
FITC Isotiocianato de fluoresceína
fMLP N-formil-Metionil-leucil-fenilalanina
GAM Goat-anti mouse
GAPDH Gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa
H2O2 Peróxido de hidrógeno
H2Odd Agua destilada y desionizada
H89 N-[2-((p-Bromocinamil) amino)etil]-5-isoquinolinesulfonamida
HMAP 4-hidroxi-3-metoxiacetofenona
Ig Inmunoglobulina
IL Interleuquina
JNK Quinasa terminal NH2-c-Jun
Lor Loratadina
LPS Lipopolisacárido
MAPK Proteína quinasa activada por mitógenos
MG-132 N-CBZ-leucina-leucina-leucina-alanina
MHC complejo mayor de histocompatibilidad
Min Minuto
MPO Mieloperoxidasa
Ned Nedocromil
NF-AT Factor nuclear de activación de células T
ABREVIATURAS
212
NF-κB Factor nuclear-κB
NK Natural killer
NS-398 N-(2-ciclohexiloxi-4-nitrofenil) metanosulfonamida
PBS Tampón fosfato salino
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PD098059 2-(2-amino-3 metoxifenil)4H-1-4-benzopirano
PDTC Pirrilodín ditiocarbamato
PE Ficoeritrina
PG Prostaglandina
PI-3K Fosfatidil inositol-3- quinasa
PKA Proteína quinasa A
PKC Proteína quinasa C
PMA Forbol miristato acetato
PMSF Fenil metilsulfonil fluoruro
PVDF Fluoruro de polivinilideno
ROS Especies Reactivas de oxígeno
SB203580 4-(4-fluofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-5-4-(piridil)-1-H-imidazol
Staur Estaurosporina
Tª Temperatura
TBE Tampón Tris-Borato
TCR Receptor célula T
TEMED N,N,N’,N’ tetrametiletilendiamina
TEMPO 2, 2, 6, 6-tetrametilpiperidina-1-oxyl
TFP Trifluoperazina
TNF-α Factor de necrosis tumoral-α
TPCK N-tosyl-L-fenilalanil-clorometil cetona
Wort wortmanina
α-IgE anti-IgE
CURRÍCULUM VITAE
I. Datos personales.
Nombre y Aprellidos: Pedro José Chacón Fernández
D.N.I: 09.203.208 - B
Fecha y lugar de nacimiento: 17/01/1976. Sevilla.
Domicilio: c/ Alberto Durero 1. Escalera 3- 2.º A. 41018. Sevilla.
Estado civil: Soltero.
Teléfonos: 954 531 931/ 699 460 835
E-mail: [email protected]
II. Formación Académica.
• Titulación superior: Licenciatura en Biología.
Centro: Facultad de Biología. Universidad de Sevilla.
Fecha: 1994-1999.
• Estudios de Doctorado en Biología Molecular y Celular (periodo docente e investigador).
Centro: Vicerrectorado de Enseñanzas propias y Tercer Ciclo. Universidad de Sevilla.
Fecha: 2000-2001.
• Diploma de estudios avanzados (D.E.A) y suficiencia investigadora.
Centro: Vicerrectorado de Enseñanzas propias y Tercer Ciclo. Universidad de Sevilla.
Fecha: 2002.
III. Actividades de carácter científico profesional
• Personal Investigador
Centro: Dpto. de Medicina. Facultad de Medicina. Universidad de Sevilla.
Fecha: 04/2003 al 05/2004.
• Becario predoctoral
Centros: Dpto. de Bioquímica Médica y Biología Molecular & Servicio de Inmunología y Alergia. Dpto. de Medicina. Facultad de Medicina. Universidad de Sevilla.
Fecha: 1999-2005.
• Colaborador honorario
Centro: Dpto. de Bioquímica Médica y Biología Molecular. Facultad de Medicina. Universidad de Sevilla.
Fecha: 2000-2004.
• OTROS: Socio Adherido de la Sociedad Española de Bioquímica Médica y Biología Molecular (SEBBM).
IV. Publicaciones científicas
Revistas
• “Induction of cyclooxygenase-2 expression by allergens in lymphocytes from allergic patients”.
Chacón, P., Vega, A., Monteseirín J., El Bekay, R., Alba G.,Pérez-Formoso, J.L., Martínez, A., Asturias, J.A., Pérez-Cano, R., Conde J.
Eur. J. Immunol. Mayo 2005. Aceptado para publicación.
• “L Selectin expression on neutrophils from allergic patients”.
Monteserín, J., Chacón P., Vega, A., Sánchez-Monteseirín, H., Pérez-Formoso, J.L., Asturias, J.A., Martínez, A., Guardia, P., Pérez-cano, R., Conde J.
Clin. Exp. Allergy. Mayo 2005. Aceptado para publicación.
• “Myeloperoxidase release after allergen-specific conjunctival challenge”.
Monteseirín J., Fernández-Pineda, I., Chacón P., Vega A., Bonilla I., Camacho M.J., Fernández-Delgado L., Conde J., Sobrino F.
J. Asthma. 2004; 6: 639-643.
• “Stimulators of AMP-activated protein kinase inhibit the respiratory burst in human neutrophils”.
Alba G., El Bekay R., Álvarez-Maqueda M., Chacón P., Vega A., Monteseirín J., Santa María C., Pintado E., Bedoya F.J., Sobrino F.
FEBBS lett. 2004; 573: 219-225.
• “Human neutrophils synthesize IL-8 in an IgE-mediated activation”.
Monteseirín J., Chacón P., Vega A., El Bekay R., Álvarez M., Alba G., Conde M., Jiménez J., Asturias J.A., Martínez A., Conde J., Pintado E., Bedoya F.J., Sobrino F.
J Leukoc Biol. 2004; 76: 692-700.
• “A new role for monoamine oxidases in the modulation of macrophage-inducible nitric oxide synthase gene expression”.
Vega A., Chacón P., Monteseirín J.,El Bekay R., Álvarez M., Alba G., Martín-Nieto J., Bedoya F.J., Pintado E., Sobrino F.
J.Leukoc Biol. 2004; 75: 1093-1101.
• “15-Deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2 induces heme-oxygenase-1 gene expression in a reactive oxygen species-dependent manner in human lymphocytes”.
Álvarez-Maqueda M., El Bekay R., Monteseirín J., Alba G., Chacón P., Vega A., Martín-Nieto J., Bedoya F.J., Pintado E., Sobrino F.
J. Biol. Chem. 2004; 279: 21929-21937.
• “¿Es el neutrófilo una célula reguladora del eosinófilo en los procesos mediados por IgE?”.
Monteseirín J., Chacón P., Vega A., Camacho M.J., Bonilla I., Guardia P., Sobrino F., Conde J. Allergol Immunol Clin, 2004; 19: 7-12.
• “Homocysteine enhances superoxide anion release and NADPH oxidase assambly by human neutrophils. Effects on MAPK activation and neutrophil migration”.
Álvarez-Maqueda M., El Bekay R., Monteseirín J., Alba G., Chacón P., Vega A., Santa María C., Tejedo J.R., Martín-Nieto J., Bedoya F.J., Pintado E., Sobrino F.
Atherosclerosis, 2004; 172: 220-238.
• “Specific allergens enhance elastase release in stimulated neutrophils from allergic patients”.
Monteseirín J., Bonilla I., Camacho M.J., Chacón P., Vega A., Chaparro A., Conde J., Sobrino F.
Int. Arch. Allergy, 2003; 131: 174 -181.
• “Allergen-dependent CD14 modulation and apoptosis in monocytes from allergic patients”.
Monteseirín J., Bonilla I., Chacón P., Vega A., Camacho M.J., Guardia P., Conde J., Sobrino F.
Allergy, 2003; 58: 1027-1032.
• “Oxidative stress is a critical mediator of the angiotensin II signal in human neutrophils: involvement of mitogen-activated protein kinase, calcineurin, and the transcription factor NF-κB”.
El Bekay R., Álvarez M., Monteseirín J., Alba G., Chacón P., Vega A., Martín-Nieto J., Jiménez J., Pintado E., Bedoya F.J., Sobrino F.
Blood, 2003; 102: 662-671.
• “Allergen-induced release of lactoferrin by neutrophils from asthmatic patients”.
Monteseirín, J., Fernández-Delgado, L., Chacón P., Vega, A., Pérez-Formoso, J.L., Martínez, A., Asturias J.A., Pérez-Cano, R., Conde, J.
Enviado a Am. J. Crit. Care. Med. 2005.
• “Synthesis and release of eosinophil cationic protein from human neutrophils”.
Monteseirín J., Vega, A., Chacón P., Camacho M.J., Bonilla I., Conde J., Sobrino F.
En preparación, 2005.
• “Angiotensin II promotes Rac-2 activation in human neutrophils. Crosstalk with MAP kinase pathways, calcium signalling and calcineurin.
El Bekay, R., Alba, G., Chacón, P., Vega, A., Monteseirín J., Pintado, E., Bedoya, F., and Sobrino, F.
En preparación, 2005.
• “The inhibitory effect of angiotensin II-on HO-1 expression is mediated by the reduction of iNOS transcription by neutrophils”.
Alba, G., El Bekay R., Álvarez-Maqueda M., Chacón P., Vega A., Ramos E., Jiménez J., Bedoya, F.J., Pintado, E., Sobrino F.
En prepración.2005
Libros
• “Test de Inmunología y Alergia”. Volumen V.
Francisco Javier Monteseirín Mateo, Pedro Chacón Fernández, José Conde Hernández, Francisco Sobrino Beneyto.
Fundación Alergol. (Dep. Leg. SE-4116-02 (V)). Sevilla, 2002.
• “Test de Inmunología y Alergia”. Volumen VI.
Francisco Javier Monteseirín Mateo, Pedro Chacón Fernández, José Conde Hernández, Francisco Sobrino Beneyto.
Fundación Alergol. (Dep. Leg. SE-4116-02 (VI)). Sevilla, 2002.
V. Participación en proyectos y grupos de Investigación
• “Inflamación y estrés oxidativo: activación de factores de transcripción de linfocitos y macrófagos”.
Entidad financiadora: Ministerio de ciencia y Tecnología (SAF2000-0117).
Investigador responsable: Francisco Sobrino Beneyto.
• “Análisis de las funciones de los neutrófilos en la respuesta alérgica”.
Entidad financiadora: Consejería de Salud. Junta de Andalucía.
Investigador responsable: Francisco J. Monteseirín Mateo.
• “Inmunología de la respuesta alérgica”.
Entidad financiadora: Plan Andaluz de Investigación (Grupos PAI/ CTS511). Junta de Andalucía.
Investigador responsable: Francisco J. Monteseirín Mateo.
VI. Contribuciones a Congresos
• “Los neutrófilos humanos producen IL-8 por activación IgE-mediada”.
Pedro Chacón, Antonio Vega, Javier Monteseirn, Moisés Álvarez, Gonzalo Alba, Juan Jiménez, José Conde, Elizabeth Pintado, Francisco J. Bedoya, Francisco Sobrino.
Tipo de presentación: Comunicación oral.
Congreso: II Jornadas de Investigación área hospitalaria Virgen Macarena.
Lugar: Sevilla, España.
Fecha: 2004.
• “Inducción IgE-dependiente de la síntesis y actividad de la Cyclooxygenasa-2 en linfocitos humanos”.
P. Chacón, A. Vega, J. Monteseirín, R. El Bekay, M.J. Camacho, I. Bonilla, M. Álvarez, G. Alba, J. Conde, F. Sobrino.
Tipo de presentación: Comunicación oral.
Congreso: XXVII Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular.
Lugar: Lleida, España.
Fecha: 2004
• “La 15-deoxy-delta (12,14)-prostaglandina J2 induce la expresión genética de la Hemo-oxigensa-1 por un mecanismo que depende de intermediarios reactivos de oxígeno en linfocitos humanos”.
M. Álvarez-Maqueda, R. el Bekay, G. Alba, J. Monteseirín, P. Chacón, A. Vega, J. Martín-Nieto, F.J. Bedoya, E. pintado, F. Sobrino.
Tipo de presentación: póster
Congreso: XXVII Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular.
Lugar: Lleida, España.
Fecha: 2004
• “La activación de la 5’-AMP quinasa inhibe la producción de ROS en neutrófilos”.
G.Alba Jiménez, R. El Bekay, M. Álvarez-Maqueda, P. Chacón, A. Vega, D. Mena, J. Monteseirín, C. Santa María, R. Bartrons, E. Pintado, F.J. Bedoya, F. Sobrino.
Tipo de presentación: póster.
Congreso: XXVII Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular.
Lugar: Lleida, España.
Fecha: 2004
• “Alergia alimentaria a proteínas de sangre y huevo de pollo”.
Valverde L., Guardia P., Chacón P., Vega A., Cabanillas M., Crespo P., Orovitg A., Gómez L., Maraví A., Duque J.M., Conde J.
Tipo de presentación: póster.
Congreso: Symposium Internacional de aerobiología y polinosis.
Lugar: Zaragoza, España.
Fecha: 2003.
• “Sensitization to different kinds of live fish bait”.
J.L. Pérez-Formoso, Y. Puente Crespo, A. Maraví-San Martín, J.C. Daza-Muñoz, A. Vega-Rioja, P. Chacón-Fernández, B. Bartolomé-Zabala, F.J. Monteseirín-Mateo, J. Conde-Hernández.
Tipo de presentación: póster.
Congreso: XXII congreso de la Academia Europea de Alergología e Inmunología Clínica.
Lugar: París, Francia.
Fecha: 2003.
• “Structural changes in Egraulis encrasicholus proteins modified by vinegar”.
A. Maraví-San Martín, J.L. Pérez-Formoso, P. Chacón-Fernández, A. Vega-Rioja, Y. Puente Crespo, F.J. Monteseirín-Mateo, J. Conde-Hernández
Tipo de presentación: póster.
Congreso: XXII congreso de la Academia Europea de Alergología e Inmunología Clínica
Lugar: París, Francia.
Fecha: 2003
• “Cytosolic calcium levels in neutrophils from asthmatic patients”
J. Monteseirín, M.J. Camacho, I. Bonilla, A. Vega, J. Delgado, P. Chacón, J. Conde, F. Sobrino.
Tipo de presentación: póster
Congreso: XX congreso de la Academia Europea de Alergología e Inmunología Clínica.
Lugar: Berlín, Alemania.
Fecha: 2001.
• “Respiratory burst in neutrophils from asthmatic patients”.
J. Monteseirín, M.J. Camacho, I. Bonilla, P. Chacón, P. Guardia, A. Vega, J. Conde, F. Sobrino.
Tipo de presentación: póster.
Congreso: XX congreso de la Academia Europea de Alergología e Inmunología Clínica.
Lugar: Berlín, Alemania.
Fecha: 2001.
• “Myeloperoxidase release after allergen-specific conjunctival challenge”.
J. Monteseirín, I. Fernández-Pineda, I. Bonilla, M.J. Camacho, A. Vega, P. Chacón, C. Sánchez-Hernández, M. Hernández, J. Conde.
Tipo de presentación: póster.
Congreso: XX congreso de la Academia Europea de Alergología e Inmunología Clínica
Lugar: Berlín, Alemania.
Fecha: 2001.
• “IgE-dependent CD14 modulation and apoptosis in monocytes from allergic patients”.
J. Monteseirín, I. Bonilla, P. Chacón, M.J. Camacho, A. Vega, J. Conde, F. Sobrino.
Tipo de presentación: póster.
Congreso: XX congreso de la Academia Europea de Alergología e Inmunología Clínica.
Lugar: Berlín, Alemania.
Fecha: 2001.
• “Honeymoon rhinitis in patients with allergic rhinoconjunctivitis”.
J. Monteseirín, M.J. Camacho, I. Bonilla, C. Sánchez-Hernández, M. Hernández, A. De la Calle, A. Vega, P. Chacón, J. Conde.
Tipo de presentación: póster.
Congreso: XX congreso de la Academia Europea de Alergología e Inmunología Clínica
Lugar: Berlín, Alemania.
Fecha: 2001.
• “Efecto potenciador del butirato de sodio en la inducción fotoquímica de roturas de doble cadena al ADN”.
T. Ortiz, P. Chacón, R. Pleite, R. Toro, J. Piñero.
Tipo de presentación: póster.
Congreso: II congreso de la Sociedad Española de Genética.
Lugar: La Coruña. España.
Fecha: 1999.