redes extracelulares de dna de cÉlulas...
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KEILA ABREU DA SILVEIRA
REDES EXTRACELULARES DE DNA DE CÉLULAS GRANULOCÍTICAS NO
ESCARRO DE CRIANÇAS COM ASMA
Dissertação apresentada como requisito para obtenção do grau de Mestre pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina/ Pediatria da Escola de Medicina da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul.
Orientador: Prof. Dr. Paulo M. C. Pitrez
Porto Alegre
2017
FICHA CATALOGRÁFICA
KEILA ABREU DA SILVEIRA
REDES EXTRACELULARES DE DNA DE CÉLULAS GRANULOCÍTICAS NO
ESCARRO DE CRIANÇAS COM ASMA
Dissertação apresentada como requisito para obtenção do grau de Mestre pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina/ Pediatria da Escola de Medicina da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul.
Aprovada em: ____de__________________de________.
BANCA EXAMINADORA:
______________________________________________
Profa. Dra. Florencia Barbe-Tuana
______________________________________________
Profa. Dra. Ana Paula Duarte de Souza
______________________________________________
Prof. Dr. Jose Eduardo Vargas Muñoz
Porto Alegre
2017
Dedicatória
Dedico esta conquista a minha família, em especial
aos meus pais, Jucemar e Zulmi
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por me guiar ao longo dessa trajetória.
À minha família, especialmente a minha mãe e o meu pai, que sempre me
incentivaram a estudar, me apoiaram nos momentos difíceis e me deram muito
amor. Obrigada pelo exemplo de caráter e perseverança. Aos meus irmãos pelo
carinho. Amo muito vocês!
Ao meu namorado Rodrigo, que sempre foi meu parceiro e companheiro de
todas as horas, muito obrigada por tudo! Amo-te!
Ao meu orientador Paulo Pitrez, pela oportunidade e confiança que em mim
depositou.
A Aline Andrea da Cunha pelo apoio, atenção, ensinamentos, orientação e
disponibilidade. Considero-te um exemplo de pesquisadora.
Ao João Heinzmann-Filho pela disponibilidade, atenção, ensinamentos e
competência. Admiro-te muito João!
Agradeço aos colegas de laboratório pelo carinho e auxílio, Géssica
Antunes, Rodrigo Godinho, Nailê Nuñez, Carolina Luft, Tássia Thaís e Cristian
Roncada, em especial a querida Josiane Silveira que me ajudou em alguns
experimentos.
Agradeço as meninas do laboratório 21, Giovana dos Santos e Laís Bridi por
todo carinho.
A minha colega e amiga Vanessa Fey, que viveu comigo cada momento
desta conquista.
A todas as minhas amigas em especial a Camila Wilhelm, Natália Poletti e
Luiza Argiles por estarem ao meu lado nessa conquista, pelo carinho, apoio, risadas
e pelas palavras de incentivo. Amo vocês!
À secretaria do Instituto de Pesquisas Biomédicas e do Programa de Pós-
Graduação em Pediatria/ Saúde da Criança, Elisangela Mello e Carla Rothmann,
respectivamente.
Agradeço também à PUCRS e a CNPq pela bolsa de estudos recebida.
“Ser feliz é reconhecer que vale a pena viver
apesar de todos os desafios, incompreensões e períodos de
crise.
Ser feliz é deixar de ser vítima dos problemas e
se tornar um autor da própria história.
É atravessar desertos fora de si, mas ser capaz de
encontrar
Um oásis no recôndito da sua alma.
É agradecer a Deus a cada manhã pelo milagre da vida.
Ser feliz é não ter medo dos próprios sentimentos.
É saber falar de si mesmo.
É ter coragem para ouvir um 'não'.
É ter segurança para receber uma crítica, mesmo que
injusta.
Pedras no caminho?
Guardo todas... um dia vou construir um castelo!”
(Fernando Pessoa)
RESUMO
Base teórica: a asma é uma doença heterogênea, caracterizada pela inflamação
crônica das vias aéreas inferiores. O processo inflamatório está associado à hiper-
responsividade brônquica, tendo como consequência, episódios recorrentes de
sibilância, tosse, dispneia e opressão torácica. A doença atinge em torno de 300
milhões de pessoas no mundo, sendo considerada uma doença com elevada
prevalência, principalmente na população infantil. A inflamação crônica presente nas
vias aéreas de indivíduos com asma é complexa e envolve um conjunto de células
provenientes do sistema imunológico, incluindo linfócitos T, granulócitos, células
epiteliais, entre outras. Os granulócitos são considerados células fundamentais para
sustentar a inflamação. Os neutrófilos e os eosinófilos apresentam características e
funções diferentes para a resposta imune na asma. Ambos liberam uma variedade
de mediadores que contribuem para inflamação crônica e alterações na estrutura
das vias aéreas, com estímulos externos. Neste contexto, foi demonstrado que os
neutrófilos e eosinófilos, após ativação, são capazes de liberar “armadilhas” de DNA
extracelular com proteínas específicas, que combatem agentes patogênicos
extracelularmente. Por outro lado, é possível que essas “armadilhas” de DNA
contribuam para a imunopatologia em doenças inflamatórias crônicas, como na
asma. Portanto, recentemente, foi identificado que neutrófilos e eosinófilos geram
redes extracelulares de DNA nas vias aéreas de asmáticos adultos.
Objetivo: verificar se existe formação de redes extracelulares de DNA com a
presença de células inflamatórias em amostra de escarro de crianças e
adolescentes com asma.
Métodos: nosso estudo transversal selecionou crianças e adolescentes com asma,
entre 6 e 18 anos de idade, em acompanhamento regular em um centro de
referência do sul do Brasil. Foram coletados dados relativos a função pulmonar
(espirometria), teste cutâneo para alérgenos, e escarro induzido para identificação
do perfil de células inflamatórias, formação das redes extracelulares de DNA, e
quantificação do DNA extracelular. Para a visualização das redes extracelulares de
DNA, as células foram coradas com Hoechst 33342. As imagens foram capturadas
em microscópio confocal de fluorescência.
Resultados: foram incluídos 18 crianças e adolescentes, sendo 13 com asma grave
e 5 não grave. Destes, 17 (94,4%) obtiveram o teste cutâneo positivo para algum
tipo de alérgenos e todos apresentaram função pulmonar dentro dos limites da
normalidade. Os pacientes com perfil de células inflamatórias (7,12 [4,41-45,23])
obtiveram um aumento significativo (p=0,01) nas concentrações extracelulares de
DNA quando comparados com pacientes com perfil pauci-granulocítico (2,31[1,47-
3,56]). Os níveis de DNA extracelular correlacionaram-se positivamente (r=0,73; p=0,
0004) com as células granulocíticas totais no escarro destes pacientes. Do mesmo
modo, houve uma correlação positiva entre o DNA extracelular com a contagem
absoluta de neutrófilos (r=0,71; p=0,008) e contagem absoluta de eosinófilos (r=0,69;
p=0,0013) nas amostras de escarro.
Conclusão: nossos resultados mostram a presença de redes extracelulares de DNA
no escarro com padrão inflamatório em crianças e adolescentes com asma
sugerindo que estas redes são liberadas por células granulocíticas, especificamente
neutrófilos e eosinófilos.
Palavras-chave: asma; rede extracelular de DNA; inflamação; escarro; NETs; EETs.
ABSTRACT
Background: asthma is a heterogeneous disease characterized by chronic
inflammation of the lower airways. The inflammatory process is associated with
bronchial hyperresponsiveness, resulting in recurrent episodes of wheezing,
coughing, dyspnea and chest tightness. Asthma affects around 300 million people
worldwide, with high prevalence, mainly in children. Chronic inflammation in the
airways of patients with asthma is complex and involves a range of cells from the
immune system, including T lymphocytes, granulocytes, epithelial cells, among
others. Granulocytes are considered key cells to maintain inflammation. Neutrophils
and eosinophils have different characteristics and functions for the immune response
in asthma. Both type of cells release a variety of mediators that contribute to chronic
inflammation and changes in the structure of the airways, secondary to external
agents. In this context, it was demonstrated that after activation neutrophils and
eosinophils are able to release extracellular DNA "traps" with specific proteins that kill
extracellular pathogens. On the other hand, it is possible that these DNA "traps"
contribute to immunopathology in chronic inflammatory diseases, such as asthma.
Therefore, it has recently been shown that neutrophils and eosinophils generate
extracellular DNA traps in the airways of asthmatics, possibly contributing to tissue
damage.
Objective: to verify whether there is extracellular DNA traps and the presence of
inflammatory cells in sputum samples of children and adolescents with asthma.
Methods: this cross-sectional study selected children and adolescents with asthma,
between 6 and 18 years of age, in a regular follow-up at a reference center from
southern Brazil. We have performed lung function (spirometry), allergen skin test,
and induced sputum to identify the inflammatory cells profile, formation of
extracellular DNA traps, and quantification of extracellular DNA. To visualize the
extracellular DNA traps, the cells were stained with Hoechst 33342. The images were
captured on a fluorescence confocal microscope.
Results: 18 children and adolescents were included, 13 with severe asthma and 5
with non-severe asthma. Of these, 17 (94.4%) had a positive skin test for some type
of allergens and all patients presented pulmonary function within the limits of
normality. Patients with inflammatory cell profiles in sputum (7,12 [4,41,45,23])
showed a significant increase (p = 0.01) in extracellular DNA concentrations
compared to patients with pauci-granulocytic profile (2.31 [1.47-3.56]). The
extracellular DNA levels correlated positively (r = 0.73, p = 0.004) with the total
granulocytic cells in the sputum of these patients. Likewise, there was a significant
positive correlation between extracellular DNA and absolute sputum neutrophil
counts (r = 0.71, p = 0.008) and absolute sputum eosinophils counts (r = 0.69; p =
0.0013) in the sputum samples.
Conclusion: Our results show the presence of extracellular DNA traps in sputum
with inflammatory pattern of children and adolescents with asthma suggesting that
these traps are released by granulocytic cells, specifically neutrophils and
eosinophils.
Key words: asthma; DNA extracellular trap; inflammation; sputum; NETs; EETs.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Formação de redes extracelulares de DNA de neutrófilos.. ....................... 21
Figura 2. Representação esquemática da formação de redes extracelulares de DNA
de eosinófilos (EETs) em tecidos infiltrados por eosinófilos.. .................................... 24
LISTA DE FIGURAS DO ARTIGO
Figura 1. Pacientes com asma mostram aumento nas concentrações de DNA
extracelular em escarro. ............................................................................................ 52
Figura 2. Correlação entre níveis de DNA extracelular e células totais granulocíticas..
.................................................................................................................................. 53
LISTA DE TABELAS DO ARTIGO
Tabela 1: Características das crianças e adolescentes com asma.....................51
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ATS Americam Thoracic Society
BET Bashophils Extracellular Trap (Redes extracelulares de basófilos)
CVF Capacidade Vital Forçada
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
DTT Ditiotreitol
DPOC Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica
EET Eosinophil Extracellular Trap (Redes extracelulares de eosinófilos)
ECP Eosinophil Cationic Protein (Proteína catiônica eosinofílica)
EPO Eosinophil Peroxidase (Peroxidase eosinofílica)
ERO Espécies Reativas de Oxigênio
ERS European Respiratory Society
FEF 25-75 Fluxo expiratório forçado em 25 e 75% da CVF
GINA Global Initiative for Asthma
ISAAC International Study of Asthma and Allergies in Childhood
IFNγ Interferon gama
IgE Imunoglobulina E
IL Interleucina
IPB Instituto de Pesquisas Biomédicas
LBA Lavado Broncoalveolar
MBP Major basic protein (proteína básica principal)
MCET Mast cell extracellular trap (Redes extracelulares de mastócitos)
MET Macrophage Extracellular Trap (Redes extracelulares de macrófagos)
MPO Myeloperoxidase
NET Neutrophil extracellular trap (Redes extracelulares de neutrófilos)
OMS Organização Mundial de Saúde
OVA Ovalbumina
PBS Phosphate Buffered Saline
PFA Paraformaldeído
PUCRS Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
RS Rio Grande do Sul
SUS Sistema Único de Saúde
SPSS Statistical Product and Service Solutions
TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido
Th1 Células T helper do tipo 1
Th2 Células T helper do tipo 2
Th17 Células T helper do tipo 17
Treg Células T regulatórias
USA United States of American (Estados Unidos da América)
VEF1 Volume expiratório forçado no primeiro segundo
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 16
2. REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................ 18
2.1. EPIDEMIOLOGIA ........................................................................................... 18
2.2. INFLAMAÇÃO E MEDIADORES ENVOLVIDOS NA ASMA ......................... 18
2.3. REDES EXTRACELULARES DE DNA .......................................................... 20
2.4. REDES EXTRACELULARES DE DNA E ASMA ........................................... 22
3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 25
3.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 25
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................... 25
4. HIPÓTESES .......................................................................................................... 26
5. MATERIAIS E METÓDOS .................................................................................... 27
5.1. DELINEAMENTO DE PESQUISA .................................................................. 27
5.2. PARTICIPANTES DO ESTUDO ..................................................................... 27
5.3. critérios de inclusão e exclusão dos participantes ................................... 27
5.3.1 Critérios de inclusão: ....................................................................... 27
5.3.2 Critérios de exclusão: ...................................................................... 27
5.4. AVALIAÇÃO DO CONTROLE DA DOENÇA ................................................. 27
5.5. TESTE CUTÂNEO .......................................................................................... 28
5.6. ESPIROMETRIA ............................................................................................. 28
5.7. TECNICAS DE ESCARRO INDUZIDO ........................................................... 29
5.8. PROCESSAMENTO E ANALISE DO ESCARRO INDUZIDO........................ 29
5.9. QUANTIFICAÇÃO DO DNA EXTRACELULAR E FORMAÇÃO DE REDES
EXTRACELULARES DE DNA NO ESCARRO ..................................................... 30
5.10. ASPECTOS ETICOS .................................................................................... 30
5.11. TESTES ESTATÍSTICOS ............................................................................ 31
6. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 32
7. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 33
ANEXO ..................................................................................................................... 39
ANEXO - APROVAÇÃO CEP ............................................................................... 39
APÊNDICE ................................................................................................................ 43
APÊNDICE - ARTIGO ORIGINAL ......................................................................... 43
16
1. INTRODUÇÃO
A asma é uma doença respiratória obstrutiva crônica, com elevada
prevalência na população infantil, sendo considerada uma das doenças de maior
causa de hospitalizações no mundo. Segundo dados da Organização Mundial da
Saúde (OMS), cerca de 300 milhões de pessoas no mundo são acometidas pela
doença, com importante comprometimento da qualidade de vida, e elevada
mortalidade (250 mil pessoas/ano no mundo) (1, 2).
A inflamação crônica presente em indivíduos asmáticos é complexa e resulta
de interações entre múltiplas células inflamatórias, citocinas e mediadores celulares.
Entre as várias células que contribuem para o processo inflamatório na asma, os
eosinófilos, os macrófagos, os neutrófilos e os linfócitos exercem um papel central
na fisiopatogenia da doença (3, 4).
Sabe-se que os linfócitos participam da resposta imune adaptativa da asma,
através das células T. Essas células apresentam um papel essencial na iniciação e
regulação da resposta inflamatória, ativando outras células mediante a secreção de
citocinas. Diante disso, a asma pode apresentar resposta imune mediada por
linfócitos do tipo Th1, Th2, Th17 e Treg, que atuam de forma diferente no
desenvolvimento da doença (5, 6).
A atuação dos eosinófilos nas vias aéreas de pacientes asmáticos tem um
papel importante, uma vez que estas células são estimuladas e recrutadas para o
tecido pulmonar, liberando proteínas citotóxicas que geram danos ao tecido epitelial
do pulmão (7-9). Enquanto isso, a atuação dos neutrófilos também tem sido relatada
como papel importante na asma, secretando mediadores pró-inflamatórios (10, 11).
Nesse contexto, tem sido descrito um novo mecanismo eficiente na defesa do
hospedeiro utilizado por células inflamatórias, principalmente por neutrófilos e
eosinófilos, no combate a infecções (12-14). Durante o processo inflamatório, os
granulócitos liberam redes extracelulares de DNA, particularmente associado a
apoptose celular. A formação das redes extracelulares de DNA participa do combate
a infecções bacterianas e outros patógenos (15). Apesar das propriedades
vantajosas dessas redes de DNA, sua produção excessiva tem sido demonstrada
17
em várias condições inflamatórias, desencadeando inflamação e dano ao tecido
(16). Além disso, as redes extracelulares de DNA foram identificadas em algumas
doenças pulmonares, mais recentemente em pacientes adultos com asma (14).
Contudo, seu papel na patogênese da asma ainda não é claro (17).
Desta forma, a presente dissertação é composta de uma fundamentação
teórica sobre o tema e também por um artigo original. O artigo tem como objetivo
avaliar se crianças e adolescentes com asma produzem redes extracelulares de
DNA, e se existe alguma correlação com células granulocíticas presentes no escarro
desses pacientes.
18
2. REVISÃO DA LITERATURA
A asma é uma doença complexa, com muitos fenótipos clínicos, tanto em
adultos, como em crianças. Suas principais características incluem a limitação
variável do fluxo aéreo expiratório, hiper-responsividade brônquica e inflamação das
vias aéreas. Clinicamente, apresentam episódios recorrentes de sibilância, tosse,
dispneia e opressão torácica. Para muitos pacientes, a doença tem sua origem na
infância, com fatores genéticos, predominantemente atópico, e aspectos ambientais
contribuindo para seu desenvolvimento (8).
2.1. EPIDEMIOLOGIA
Segundo estimativas da Organização Mundial da Saúde (OMS), a
prevalência da asma está aumentando na maioria dos países, cerca de 300 milhões
de pessoas, de todas as idades, são portadoras da doença no mundo. Este aumento
ocorre especialmente entre as crianças com uma taxa aproximada de 60%, sendo
esta a doença crônica mais comum na infância (1, 18). A falta de controle da doença
e a dificuldade de acesso ao tratamento em alguns países são importantes fatores
que corroboram para os índices de morbimortalidade (19, 20).
Estima-se que a asma resulte em mais de 250 mil óbitos por ano no mundo, e
que até 2025 tenhamos aproximadamente 100 milhões de pessoas com asma (21).
No Brasil, a asma é um grave problema de saúde pública, ocupando a oitava
posição mundial em prevalência de asma. Estima-se que o Brasil tenha ao redor de
15 milhões de asmáticos (10-15% da faixa etária pediátrica) (22), com cerca de 6
óbitos por dia pela doença, e aproximadamente 350 mil hospitalizações por ano,
gerando altos custos para o Sistema Único de Saúde (SUS) (23).
2.2. INFLAMAÇÃO E MEDIADORES ENVOLVIDOS NA ASMA
19
A inflamação é um aspecto característico de muitas doenças crônicas
pulmonares, incluindo a asma. O processo inflamatório na asma é complexo, com
diferentes tipos celulares e mediadores inflamatórios envolvidos, interagindo com
diferentes fatores ambientais desencadeantes (4). Os linfócitos, macrófagos e
granulócitos são células centrais na fisiopatogenia da doença (24, 25).
Os linfócitos exercem um papel importante na resposta imune adaptativa da
asma (26, 27). Sabe-se que os linfócitos são classificados por moléculas de
superfície, e no caso das células T, são subdivididos funcionalmente pelo padrão de
citocinas que produzem (28). Apesar de a asma ser frequentemente considerada
uma doença imunologicamente mediada por linfócitos do tipo Th2, outros subtipos
de linfócitos T estão envolvidos na resposta imune, tais como os linfócitos Th1, Th17
e Treg (5, 29, 30). Assim, as células Th1 conduzem a imunidade celular, produzindo
citocinas pró-inflamatórias como IL-2 e INF-gama, que são fundamentais para o
mecanismo de defesa do organismo (31). Por outro lado, as células Th-2 produzem
citocinas específicas da resposta inflamatória alérgica, como IL-4, IL-5 e IL-13, que
estimulam a inflamação eosinofílica, além de ativar os linfócitos B, que são
responsáveis pela produção de IgE (32, 33). Alguns estudos têm observado o papel
importante das células Th-17 na inflamação das vias aéreas na asma, sendo
consideradas células que expressam IL-17, IL-22 e promovem inflamação
neutrofílica nas vias aéreas (30, 34). Por outro lado, as células T-reg apresentam
funções essencias no controle da resposte imune (35).
Os macrófagos são considerados vigilantes imunológicos por sua distribuição
em diferentes tecidos do organismo (36). Seu papel é essencial na modulação de
respostas inflamatórias agudas e crônicas, mas embora possam proliferar dentro do
pulmão, seu número não é adequado para combater a infecção (37, 38). Ainda
assim, os macrófagos são a principal fonte de citocinas, quimiocinas e outros
mediadores inflamatórios que suprimem ou propagam a inflamação (39, 40). Aliás,
essas citocinas e quimiocinas liberadas pelos macrófagos alveolares têm efeito
imediato na via área e no tecido pulmonar, promovendo o acúmulo de neutrófilos,
eosinófilos e outras células diretamente implicadas na fisiopatogenia da asma (4).
Os neutrófilos compreendem em torno de 60% de todos os leucócitos
encontrados na circulação sanguínea (41). Além disso, são os granulócitos mais
20
abundantes na via aérea, tanto em indivíduos saudáveis, como em pacientes com
asma (42). Durante a inflamação pulmonar, os neutrófilos são as primeiras células
do sistema imunológico a serem recrutadas para o local da lesão (43). As células
migram da corrente sanguínea para os tecidos, onde liberam citocinas, enzimas,
radicais livres e outros fatores inflamatórios que podem afetar a estrutura e a função
das vias aéreas(44, 45).
Os eosinófilos estão primariamente envolvidos no combate a infecções
parasitárias e nas doenças alérgicas, tais como a asma (46). São células
granulocíticas menos comuns, mas características da resposta alérgica nas vias
aéreas. No entanto, estão presentes em quantidades variáveis na via aérea de
pacientes com asma, e praticamente ausentes em indivíduos normais (47). Os
eosinófilos têm um papel efetor. Uma vez ativados pela IL-5, migram para o tecido
inflamado, degranulam, liberando proteínas citotóxicas importantes no mecanismo
efetor, resultando na broncoconstrição e produção de muco, mas que, se não
reguladas podem também induzir dano tecidual (9, 48).
Em resumo, os sintomas resultantes da inflamação brônquica na asma são
efeito de um complexo ambiente de desencadeantes ambientais e participação de
de linfócitos T, eosinófilos, neutrófilos, macrófagos e citocinas, que tem sido alvo de
pesquisas para novas terapias.
2.3. REDES EXTRACELULARES DE DNA
As redes extracelulares de DNA tem sido mencionadas, ultimamente, como
um novo mecanismo celular eficiente na defesa do hospedeiro contra infecções.
Estas redes são geradas por diferentes células que representam um papel
fundamental na resposta imune (12). Pimeiramente descritas em neutrófilos, as
redes extracelulares de neutrófilos (NETs) são compostas, pricipalmente, por fibras
de cromatina descondensada, revestidas com histonas e enzimas granulares de
neutrófilos, tais como mieloperoxidase (MPO), elastase neutrofílica, catepsina G, e
lactoferrina. Logo, estas estruturas são liberadas em resposta a agentes infecciosos
21
e mediadores inflamatórios, levando à captura e morte de numerosos
microrganismos patogênicos (15, 49, 50).
A figura 1 mostra um esquema da formação das NETs. Apesar da formação
das redes extracelulares servir como uma armadilha para bactérias e outros
patógenos, sua produção excessiva pode levar ao dano de diversos tecidos.
Figura 1. Formação de redes extracelulares de DNA de neutrófilos. As NETs são formadas de
nucleossomos (complexo de DNA e histonas) revestidos com componentes granulares, incluindo elastase de neutrófilos, mieloperoxidase (MPO), e catepsina G. As NETs ligam e matam micróbios. Fonte: adaptado de Miyata and Fan (2012) (51).
A formação de redes extracelulares de DNA não parece ser um mecanismo
exclusivo dos neutrófilos. Recentemente, alguns estudos vêm documentando a
formação de estruturas similares às NETs, em macrófagos (METs), mastócitos
(MCETs), basófilos (BETs) e eosinófilos (EETs) (48, 52-54). Assim, um estudo
publicado por Aliuk e colaboradores (2012) mostrou que as redes extracelulares de
DNA geradas por macrófagos foram capazes de reter e matar uma variedade de
bactérias (55). Os mastócitos são também descritos por exercer atividade
antimicrobiana extracelular através da formação de “armadilhas” de DNA (56). Os
22
basófilos são também capazes de gerar redes extracelulares de DNA, sob condições
inflamatórias. As BETs contêm DNA mitocondrial, mas não nuclear, e proteínas de
grânulos especificamente expressas pelos basófilos. Por fim, dados mais recentes
relatam um mecanismo de proteção extracelular por eosinófilos para matar agentes
infecciosos, de forma rápida e eficiente (52). As redes extracelulares de DNA
produzidas por eosinófilos são compostas por uma malha de fibras de DNA e
proteínas de grânulos de eosinófilos, tais como a proteína básica principal (MBP) e a
proteína catiônica eosinofílica (ECP) (48). Essas proteínas são responsáveis por boa
parte das funções citotóxicas exercidas pelos eosinófilos, podendo ser protetoras
helmintos e ao mesmo tempo nocivas, uma vez expostas no meio extracelular,
causando lesões teciduais devido ao efeito citotóxico nas células do próprio
organismo (57).
O DNA expelido pelos eosinófilos, curiosamente, é de origem mitocondrial,
parecendo não estar associado com a morte celular (58). Um evento chave na
sinalização intracelular para a formação das EETs parece ser a ativação de uma
enzima chamada NADPH oxidase. Essa enzima está ligada a membrana de
eosinófilos e de várias outras células (48, 59). Portanto, uma vez que ocorra a
inibição desta enzima por algum efeito farmacológico ou genético, pode resultar na
diminuição de precursores e mediadores inflamatórios, entre eles as espécies
reativas de oxigênio (EROs), que inibem completamente a capacidade dos
eosinófilos em liberar EETs (48). Além disso, estudos sugerem que a atividade
fagocítica dos eosinófilos é em grande parte limitada, quando comparada com outras
células fagocíticas, sugerindo que sua atividade bactericida possa ocorrer
extracelularmente, provavelmente através da liberação de EETs (60).
2.4. REDES EXTRACELULARES DE DNA E ASMA
Como descrito acima, a formação de redes extracelulares de DNA apresenta
um importante papel na resposta imune inata, agindo na defesa contra infecções, e
tem sido reportada em várias doenças pulmonares, incluindo a asma (14). Nos
últimos anos, tem sido comprovado que as células granulares, tais como neutrófilos
23
e eosinófilos, geram armadilhas extracelulares bactericidas, com conteúdo de DNA e
proteínas de grânulos (12, 15, 48).
A asma foi classicamente descrita como uma doença eosinofílica, entretanto,
nos últimos anos, foi demonstrado que os neutrófilos também exercem um papel
importante na inflamação das vias aéreas da doença (61). O papel principal das
redes extracelulares de DNA é evitar a propagação microbiana e matar agentes
patogênicos (15). Assim, tem sido descrito que os neutrófilos são recrutados para os
pulmões de asmáticos liberando redes extracelulares compostas por proteínas
derivadas do citoplasma celular e por DNA (14). Além disso, foi detectado um
aumento de NETs e componentes nas vias aéreas de pacientes com asma,
sugerindo um envolvimento das NETs na patogênese da asma (62).
Apesar das propriedades vantajosas das NETs, sua produção excessiva já foi
demonstrada em várias condições inflamatórias, desencadeando inflamação e dano
ao tecido (16). O papel patogênico das NETs foi descrito por várias doenças
inflamatórias e autoimunes (63). Nesse sentido, um estudo recentemente realizado
por Pham e colaboradores (2016), observou a produção de redes extracelulares de
DNA a partir de neutrófilos de sangue periférico de pacientes com asma grave,
indicando que as NETs estejam envolvidas na preservação da inflamação (17).
Dworski e colaboradores (2011) também relataram que além dos neutrófilos, os
eosinófilos infiltrados nas vias aéreas de asmáticos liberam redes extracelulares de
DNA (14). Adicionalmente, um estudo mais recente do nosso grupo de pesquisa
mostrou no lavado broncoalveolar (LBA) de camundongos asmáticos a presença de
EETs, sem nenhum sinal de apoptose ou necrose, sugerindo que a liberação seja
um processo ativo celular (64).
Yousefi e colaboradores (2012) mostram de forma ilustrativa na Figura 2 que
os eosinófilos podem ser ativados diretamente por bactérias invasoras e/ou citocinas
geradas por células epiteliais ou por células T, produzindo as EETs. As EETs são
capazes de ligar e matar bactérias, mas também ocorrem em doenças não
infecciosas, como nas alergias. No entanto, nem todos os eosinófilos que infiltram o
tecido necessariamente participam na formação de EETs (58).
24
Figura 2. Representação esquemática da formação de redes extracelulares de
DNA de eosinófilos (EETs) em tecidos infiltrados por eosinófilos. Mitocôndrias (azul) e grânulos (vermelho) liberando DNA e proteínas catiônicas que co-localizam no espaço extracelular, formando uma estrutura em forma de rede. Fonte: Adaptado de Yousefi et al. (2012) (58).
De forma geral, as redes extracelulares de DNA podem ser geradas como
ferramentas eficientes para proteger o hospedeiro contra agentes infecciosos, que
potencialmente invadem brônquios após a lesão tecidual. Por outro lado, a formação
das redes extracelulares de DNA pode contribuir para o dano celular epitelial e
endotelial característico na asma (65). Assim, o papel das NETS e EETs na asma
ainda não é bem compreendidos.
25
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Verificar se existe presença de redes extracelulares de DNA e células
granulocíticas no escarro de crianças e adolescentes com asma.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Verificar se redes extracelulares de DNA estão mais elevadas em escarros
com células do sistema imune de crianças e adolescentes com asma.
Verificar se existe correlação entre níveis de DNA extracelular e células
granulocíticas (eosinófilos e neutrófilos) em pacientes com asma.
26
4. HIPÓTESES
Redes extracelulares de DNA são liberadas nas vias aéreas inferiores de
crianças com asma.
Concentrações de DNA extracelular estão associadas a células granulocíticas
(neutrófilos e eosinófilos) presentes no escarro de crianças e adolescentes
com asma.
27
5. MATERIAIS E METÓDOS
5.1. DELINEAMENTO DE PESQUISA
Trata-se de um estudo transversal
5.2. PARTICIPANTES DO ESTUDO
Crianças e adolescentes, com diagnóstico de asma (6 a 18 anos), de ambos
os sexos.
5.3. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO DOS PARTICIPANTES
5.3.1 Critérios de inclusão:
Crianças e adolescentes com idade entre 6 e 18 anos, de ambos os sexos,
com diagnóstico de asma, em acompanhamento ambulatorial por mais de três
meses, independente do tratamento prescrito.
5.3.2 Critérios de exclusão:
Participantes com limitações cognitivas ou com outras doenças crônicas
associadas (doenças neurológicas, anomalias cardíacas, congênitas ou
imunodeficiências).
5.4. AVALIAÇÃO DO CONTROLE DA DOENÇA
Para fins de controle da doença, as crianças e os adolescentes asmáticos
foram convidados a responder um questionário curto, padronizado e bem
estabelecido pela literatura. Foi utilizado o questionário do GINA (66), sobre o
28
controle da doença, com 5 perguntas sobre sintomas relacionado às quatro últimas
semanas antecedentes à entrevista.
5.5. TESTE CUTÂNEO
Para avaliação de sensibilização a alérgenos foi realizado um teste cutâneo
(Prick test), através de método padronizado internacionalmente reconhecido e
utilizado pelo nosso grupo de pesquisa (67). O teste foi realizado na superfície volar
medial do antebraço, onde foram aplicados os extratos de alérgenos (gota única),
utilizando-se o conta-gotas, a uma distância de aproximadamente 2 cm.
A região avaliada foi dividida em duas fileiras, sendo a primeira sequência
composta pela aplicação do soro (controle negativo), histamina (controle positivo),
mix de baratas, Dermatophagoide pteronyssinus, epitélio de cão e epitélio de gato.
Já a segunda, foi seguido do Aspergilus formigatus, mix de gramíneas, Blomia
tropicalis, fungos do ar e Dermatophagoide farinae. Foi utilizada uma pequena
lanceta (PUNTOR®, com dispositivo plástico que limita o grau de penetração na
pele) para cada alérgeno. Após 3 minutos, foi retirado o excesso de extrato com
papel toalha, evitando-se “contaminar” os testes vizinhos. A leitura foi feita entre 15 e
20 minutos após a aplicação dos alérgenos. O teste cutâneo foi considerado positivo
para qualquer alergeno na presença de pápulas com diâmetro ≥ 3 mm (67).
5.6. ESPIROMETRIA
Os procedimentos técnicos e os critérios de aceitabilidade e reprodutibilidade
para a realização do exame de função pulmonar seguiram as recomendações da
American Thoracic Society – European Respiratory Society (ATS/ERS) (66). O teste
foi realizado com equipamento Koko (Louisville, CO, EUA). Todas as medidas foram
corrigidas de acordo com a pressão barométrica local e com a temperatura do dia.
Os seguintes parâmetros foram avaliados: capacidade vital forçada (CVF),
volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF1), a relação da razão
29
VEF1/CVF e o fluxo expiratório forçado entre 25% e 75 % da capacidade vital
forçada (FEF25-75%). Os dados foram apresentados em valores absolutos (litros) e
normalizados através do escore-z por uma equação de referência internacional (68).
Desta forma, foram considerados normais os valores de VEF1, CVF e VEF1/CVF ≥-
1,645 em escore-z.
5.7. TÉCNICAS DE ESCARRO INDUZIDO
O procedimento para obtenção do escarro induzido foi realizado conforme o
método adaptado de Pizzichini e colaboradores (1998) (69), após a espirometria e o
teste de broncodilatador. As amostras foram obtidas através da inalação de solução
salina em uma concentração de 4,5%, com quatro repetições de cinco minutos,
sucessivamente, até obtenção do escarro, ou interrompido por uma queda de
VEF1≥15%, em relação ao valor basal da espirometria. Utilizou-se um nebulizador
ultrassônico de alto débito (Ultra-Neb 2000, DeVilbiss-Sunrise Medical, Somerset,
Pennsylvania, USA). Após cada período de inalação, o VEF1 foi medido para garantir
a segurança do teste. A amostra de escarro foi coletada de forma espontânea, em
um pote estéril, por meio da participação ativa dos pacientes.
5.8. PROCESSAMENTO E ANÁLISE DO ESCARRO INDUZIDO
A amostra de escarro foi processada dentro de no máximo duas horas. Os
grumos foram separados da saliva manualmente, diluídos em ditiotreitol (DTT) (1:9)
por 10 minutos, com posterior adição de DPBS, e filtrados em nylon (60 µm). A
amostra foi centrifugada. Posteriormente foi realizada a contagem celular total de
leucócitos e viabilidade celular, utilizando uma Câmara de Neubauer espelhada, e
método de exclusão pelo corante azul de trypan. Lâminas para exame citológico
diferencial foram citocentrifugadas a 500 rpm, por 5 minutos. As lâminas foram
coradas com Panótico rápido (Laborclin), e 400 células foram contadas. Os
resultados foram expressos como percentual do tipo celular. As amostras obtidas
30
foram consideradas adequadas se a contagem celular total apresentar viabilidade
celular maior que 50% e uma contaminação com células escamosas da orofaringe
inferior a 20% no exame citológico diferencial (69).
Os escarros com células epiteliais escamosas ≤20% foram classificados
como: pauci-granulocítico (<2,5% eosinófilos e <54% de neutrófilos), eosinofílicas (>
2,5% de eosinófilos e < 54% de neutrófilos), neutrofílicas (< 2,5% de eosinófilos e >
54% de neutrófilos) ou mistas (> 2,5% de eosinófilos e > 54% de neutrófilos) (70).
5.9. QUANTIFICAÇÃO DO DNA EXTRACELULAR E FORMAÇÃO DE REDES
EXTRACELULARES DE DNA NO ESCARRO
O DNA extracelular foi quantificado no sobrenadante da amostra, usando o kit
dsDNAHS (Invitrogen®, USA) e mensurados no fluorímetro Quibit 2.0 (Invitrogen®,
USA), seguindo as instruções do fabricante. Para a visualização das redes
extracelulares de DNA, o escarro foi aderido em lâmina revestida com poli-L-lisina
previamente revestida (Sigma-Aldrich®, USA), posteriormente a este período a
lâmina foi incubada com paraformaldeído (PFA) 4% por 1 hora, após este período a
lâmina foi lavada com PBS-1X por 10 minutos, em seguida as células foram
incubadas com o Hoechst 33342 (1:2000 em PBS, Molecular Probes®), para a
coloração do DNA, por 4 minutos, à temperatura ambiente. As imagens foram
capturadas em microscópio confocal de fluorescência (Zeiss LSM Exciter, USA).
5.10. ASPECTOS ÉTICOS
O projeto foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da PUCRS (CEP-
PUCRS) com aprovação consubstanciada n°. 1.309.504.
Os responsáveis pelos pacientes foram convidados a ler e assinar o termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE), o qual contemplou informações
sobre todos os procedimentos aplicados, bem como os possíveis
desconfortos, riscos e benefícios associados.
31
As crianças e adolescentes foram convidados a ler e assinar o termo de
assentimento ao estudo.
As crianças concordaram em participar do estudo.
5.11. TESTES ESTATÍSTICOS
A normalidade das variáveis contínuas foi avaliada por meio do teste de
Shapiro-Wilk. Os dados que apresentaram distribuição normal foram demonstrados
em média e desvio-padrão, enquanto os dados assimétricos, em mediana e intervalo
interquartílico. As variáveis categóricas foram expressas em frequência absoluta e
relativa. A comparação do DNA extracelular entre o grupo com perfil inflamação e
pauci-granulocítico foi realizado pelo teste U de Mann-Whitney. Já a associação do
DNA extracelular com as células granulocíticas no escarro foi realizada pelo teste de
correlação de Spearman. Todas as análises e o processamento dos dados foram
realizados com o programa SPSS versão 18,0 (SPSS Inc., EUA). Em todos os casos
as diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
32
6. CONCLUSÕES
Redes extracelulares de DNA estão presentes em escarro com padrão
inflamatório de crianças e adolescentes com asma.
As formações de redes extracelulares de DNA apresentam uma
correlação positiva com número de células granulocíticas totais, neutrófilos e
eosinófilos.
33
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ANEXO
ANEXO - APROVAÇÃO CEP
40
41
42