Reacţii citochimice

Citochimia se bazează pe studiul microscopic al componenţilor chimici celulari: nucleoproteine, proteine, hidraţi de carbon, lipide şi enzime.Coloraţiile citochimice oferă informaţii în legătură cu linia celulară şi diferenţierea celulelor hematopoietice şi joacă un rol important în evaluarea anomaliilor hematologice, în special în diagnosticul diferenţial şi clasificarea bolilor maligne ale sângelui.Un principiu de care trebuie tinut seama este faptul că, o reacţie pozitivă este întotdeauna valoroasă, în timp ce reacţia negativă este neconcludentă. Pentru certitudine, în majoritate cazurilor reacţiile citochimice se practică cu un martor pozitiv al reacţiei1;2.

Reacţii citochimice

LAM – M1,M2 LAM – M3 LAM – M4 LAM –

M5 LAM –M6 LAM – M7 LAL

MPO + ++ + - , +/- - - -

PAS - , +/- - , + - , +/- - , + + + - , + , ++

ANAE - - , + + ++ + + - , +/-

- negativ ; +/- slab pozitiv ; + pozitiv ;+ + intens pozitiv.Un diagnostic corect de laborator al LAM, cu subtipurile FAB şi LAL necesită coroborarea datelor de microscopie optică - morfologie şi coloraţii citochimice - cu imunofenotiparea, eventual datele de microscopie electronică.

I. Mieloperoxidaza

Informaţii generaleReacţia MPO este coloraţia citochimică de elecţie pentru recunoaşterea celulelor granulocitare, prezenţa sa reprezentând singurul marker fără echivoc al diferenţierii mieloide. Mieloperoxidaza este o enzimă localizată în granulaţiile azurofile ale celulelor seriilor granulocitare şi monocitare şi în granulaţiile specifice ale eozinofilelor4.Principiul reacţiei Peroxidazele celulare descompun apa oxigenată şi eliberează oxigenul, care oxidează benzidina şi generează un compus brun-auriu insolubil şi stabil, localizat în citoplasma celulelor peroxidazo-pozitive1;3.Recomandări pentru determinarea activităţii peroxidazei- diferenţierea leucemiei acute mieloblastice (LAM) de cea limfoblastică (LAL);- demonstrarea corpilor Auer; - detectarea scăderii activităţii, la subiecţii cu deficit de MPO congenitală sau dobândită (în mielodisplazii)1.Pregătire pacient - à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)3.Specimen recoltata) sânge capilar şi/sau aspirat medular - frotiurib) se recomandă recoltarea simultană de sânge venos pentru hemogramă3.Cauze de respingerea probei- frotiuri nefixate în maxim 8 ore de la recoltare;

- frotiuri executate din sânge recoltat pe EDTA3.Recipient de recoltarea) se execută frotiuri de sânge capilar direct pe lame de microscopie;b) vacutainer cu EDTA K3 (capac mov), pentru hemogramă3.Cantitate recoltată a) 3-5 frotiuri;b) 2 mL3.Prelucrare necesară după recoltare Este preferabil ca fixarea frotiurilor să se facă în primele 30 minute de la recoltare. Eventual, se poate face în primele 8 ore. Amestec fixator: alcool etilic 9 părţi + formol 40% 1 parte. Fixarea se cronometrează 30 secunde, după care frotiurile se spală cu jet de apă de robinet. Frotiurile fixate se pot colora imediat sau se pot păstra câteva zile la temperatura camerei, până la colorare3.Stabilitate probă- frotiurile nefixate sunt stabile maxim 8 ore la 18-30ºC;- frotiurile fixate sunt stabile 5 zile la temperatura camerei3.Metodă - examinare microscopică 3 .Interpretarea rezultatelorGranulele de culoare galben-brună indică prezenţa activităţii peroxidazelor celulare.Reacţia este intensă în celulele seriei granulocitare. Martorul pozitiv al reacţiei este reprezentat de granulocitul matur - granule mari în citoplasmă şi peste nucleu. Este discutabil dacă mieloblastul normal este peroxidazo-pozitiv în microscopia optică. Reacţia este pozitivă începând de la stadiul de promielocit; sunt prezente o multitudine de granule galben-brune în citoplasmă, care uneori maschează alte caracteristici citoplasmatice.Pentru stabilirea diagnosticului de leucemie acută mieloblastică (LAM) cel puţin 3% din blaşti trebuie să fie peroxidazo-pozitivi. Mieloblaştii prezintă de obicei granulele mari, localizate şi mai reduse numeric decât promielocitele normale. Corpii Auer, rezultaţi din coalescenţa anormală a granulaţiilor azurofile, sunt intens peroxidazo-pozitivi.Monocitele dau o reacţie negativă sau slab pozitivă. Monoblaştii din leucemia acută monocitară (LAM-M5) sunt de obicei negativi, în timp ce monoblaştii din leucemia acută mielomonocitară (LAM-M4) pot fi slab pozitivi. Limfocitele şi eritrocitele nu au activitate MPO în nici un stadiu de maturare.În concluzie, reactia pozitivă în blaşti indică leucemie mieloblastică sau mielomonocitară1;4;5.Limite şi interferenţeObţinerea unei reacţii pozitive în blaşti are valoare diagnostică pentru leucemia acută mieloblastică, în timp ce reacţia negativă este neconcludentă. Rezultatul trebuie coroborat cu alte teste citochimice1.

II. Reacţia acid periodic Schiff (PAS)

Informaţii generaleÎn celulele sangvine reacţia pozitivă este datorată în primul rând prezenţei de glicogen citoplasmatic. Acumularea de glicogen se consideră a fi un indicator al dereglării metabolismului acestuia.Multe din celulele sangvine prezintă o reacţie PAS pozitivă în citoplasmă. Intensitatea acestei reacţii şi tipul de colorare variază cu tipul celular1.Principiul reacţiei

Reactivul Schiff este o soluţie incoloră obţinută prin reducerea fucsinei bazice. Acidul periodic oxidează grupul glicol sau derivaţii săi. Rezultatul este producerea de aldehide care reacţionează cu reactivul Schiff pentru a produce o culoare purpurie1;3.Recomandări pentru determinarea PAS- diagnosticul leucemiei acute limfoblastice (LAL) subtipurile L1 şi L2;- diagnosticul de sindrom mielodisplazic ori LAM-M6 prin evidenţierea eritroblaştilor PAS-pozitivi;- diferenţierea celulelor Gaucher şi a histiocitelor cu granule „albastre ca marea” de alte tipuri de macrofage1.Pregătire pacient - à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)3.Specimen recoltata) sânge capilar şi/sau aspirat medular - frotiurib) se recomandă recoltarea simultană de sânge venos pentru hemogramă3.Cauze de respingerea probei- frotiuri nefixate în maxim 8 ore de la recoltare;- frotiuri executate din sânge recoltat pe EDTA3.Recipient de recoltarea) se execută frotiuri de sânge capilar direct pe lame de microscopie;b) vacutainer cu EDTA K3 (capac mov), pentru hemogramă3.Cantitate recoltată a) 3-5 frotiuri;b) 2 mL3.Prelucrare necesară după recoltare Este preferabil ca fixarea frotiurilor să se facă în primele 30 minute de la recoltare. Eventual, se poate face în primele 8 ore. Amestec fixator: alcool etilic 9 părţi + formol 40% 1 parte. Fixarea se cronometrează 30 secunde, după care frotiurile se spală cu jet de apă de robinet. Frotiurile fixate se pot colora imediat sau se pot păstra câteva zile la temperatura camerei, până la colorare3.Stabilitate probă- frotiurile nefixate sunt stabile maxim 8 ore la 18-30ºC;- frotiurile fixate sunt stabile 5 zile la temperatura camerei3.Metodă - examinare microscopică 3 .Interpretarea rezultatelorGlicogenul apare colorat în roşu purpuriu, sub formă de granule sau difuz.Martorul pozitiv al reacţiei este reprezentat de granulocitul matur.Granulocitele conţin glicogen sub formă difuză începând cu stadiul de promielocit unde apare roz şi creşte pe măsura maturaţiei. Bazofilele sunt moderat-intens PAS pozitive, frecvent prezentând grămezi amorfe în jurul nucleului. În leucemia acută mieloblastică (LAM) pot exista mieloblaşti care prezintă granule roşii, mici sau medii. În faza blastică a leucemiei granulocitare cronice (LGC) blaştii sunt frecvent PAS pozitivi, similar limfoblaştilor din leucemia acută limfoblastică. Promielocitele din leucemia acută promielocitară (LAM-M3), în special forma hipergranulară, sunt de obicei PAS pozitive.În mod normal, un număr mic (mai puţin de 15%) de limfocite mature pot fi PAS pozitive cu următoarele aspecte : 1+ rare granule roşii, mici sau medii; 2+ numar moderat granule roşii, mici sau medii; 3+ inele de granule roşii, grosolane sau grămezi de material amorf de culoare roşie în citoplasmă sau acoperind nucleul.În leucemia limfatică cronică (LLC) netratată şi faza leucemică a limfoamelor, numărul de celule limfoide pozitive este de obicei crescut în mod semnificativ, dar acest rezultat nu este concludent.În leucemia acută limfoblastică (LAL) un număr variabil de limfoblaşti pot fi PAS pozitivi 1+,2+,3+. Aspectul PAS pozitiv 3+ prezintă specificitate înaltă pentru limfoblaştii leucemici. Limfoblaştii sunt

caracterizaţi printr-o mare variabilitate a activităţii glicogenice: sunt PAS pozitivi doar în ~ 50% din cazurile de LAL-L1 şi L2, în timp ce în LAL-L3 sunt constant negativi.Creşterea glicogenului în limfocitele patologice nu este specifică leucemiei, ci se datorează creşterii activităţii metabolice care are loc în cursul oricărui tip de proliferare limfoidă 1.Monocitele sunt negative sau slab pozitive(1+). Precursorii monocitelor în leucemia acută monocitară (LAM-M5) sunt frecvent pozitivi şi pot prezenta granule mari sau grămezi amorfe, similar limfoblaştilor leucemici, dar de obicei limitate la citoplasmă. În leucemia acută mielomonocitară (LAM-M4) blaştii, când sunt PAS pozitivi, prezintă un aspect fin granular.Precursorii eritroizi normali sunt PAS negativi. Proeritroblaştii şi eritroblaştii bazofili din eritroleucemie (LAM-M6) pot prezenta un aspect granular, cu granule grosolane dispuse în jurul nucleului. Un aspect difuz PAS pozitiv, poate fi prezent în eritroblaştii maturi din LAM-M6 şi sindromul mielodisplazic (SMD).Megacarioblaştii, megacariocitele şi plachetele sunt PAS pozitive. Megacarioblaştii din LAM-M7 prezintă un aspect difuz sau cu granule dispuse periferic1;4;5.Limite şi interferenţeReacţia PAS are valoare mică în diferenţierea LAL de alte tipuri de LA cu diagnostic dificil şi incert, datorită heterogenităţii limfoblaştilor1.

III. Esteraze nespecifice

Informaţii generaleEsterazele sunt enzime care hidrolizează esteri alfatici şi aromatici şi sunt utile pentru a distinge celulele seriei granulocitare de celulele seriei monocitare.Naphthol AS-D cloracetat esteraza este prezentă în celulele liniei granulocitare şi se găseşte în cantitate mică sau este absentă în monocite şi precursorii monocitelor.Esteraza nespecifică este, aşa cum îi arată şi numele, o enzimă ubiquitară prezentă în mai multe tipuri de celule, printre care: monocite,celule T şi megacariocite. Poate utiliza ca substraturi: alfa-naftil acetat, alfa-naftil butirat, naftol AS- D acetat4.Principiul metodeiNe vom referi la reacţia alfa-naftil acetat esterază (ANAE): alfa-naftil acetatul este hidrolizat de esteraze în alfa-naftol, care în prezenţa unei sări de diazoniu formează un compus de culoare roşu-brun, insolubil în apă1;3.Recomandări pentru determinarea esterazelor nespecifice- diagnosticul LA monocitare tipurile M4 şi M51.Pregătire pacient - à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)3.Specimen recoltata) sânge capilar şi/sau aspirat medular - frotiurib) se recomandă recoltarea simultană de sânge venos pentru hemogramă3.Cauze de respingerea probei- frotiuri nefixate în maxim 8 ore de la recoltare;- frotiuri executate din sânge recoltat pe EDTA3.Recipient de recoltarea) se execută frotiuri de sânge capilar direct pe lame de microscopie;b) vacutainer cu EDTA K3 (capac mov), pentru hemogramă3.Cantitate recoltată a) 3-5 frotiuri;b) 2 mL3.Prelucrare necesară după recoltare

Este preferabil ca fixarea frotiurilor să se facă în primele 30 minute de la recoltare. Eventual, se poate face în primele 8 ore. Amestec fixator: alcool etilic 9 părţi + formol 40% 1 parte. Fixarea se cronometrează 30 secunde, după care frotiurile se spală cu jet de apă de robinet. Frotiurile fixate se pot colora imediat sau se pot păstra câteva zile la temperatura camerei, până la colorare3.Stabilitate probă- frotiurile nefixate sunt stabile maxim 8 ore la 18-30ºC;- frotiurile fixate sunt stabile 5 zile la temperatura camerei3.Metodă - examinare microscopică 3 .Interpretarea rezultatelorÎn monocite, activitatea enzimatică a ANAE se evidenţiază prin apariţia unui compus roşu-brun, cu aspect difuz, moderat sau intens colorat (tip M –monocitar). În celulele T (inclusiv limfoblaştii T) şi megacarioblaşti, aspectul este mai mult focal, în regiunea Golgi sau paranuclear. Aspectul colorării este util, într-o anumită măsură, în diferenţierea tipurilor de celule. Etapa de inhibare cu NaF a fost adăugată pentru a face esteraza nespecifică „mai specifică”. Activitatea enzimei în celulele liniei monocitare este inhibată de NaF, în timp ce în restul celulelor activitatea persistă.Alfa-naftil acetat esteraza este obişnuit negativă în celulele de serie granulocitară. Celulele blastice din LAM-M0, M1 şi M2 sunt de obicei negative. În LAM–M3 esteraza nespecifică este pozitivă în 20-30% din cazuri, fiind mai slabă ca intensitate decât în monocite; reacţia este sensibilă la inhibare cu NaF în aproximativ 1/3-1/2 din cazurile pozitive.Celulele blastice monocitare din LAM-M4 au activitate ANAE intens pozitivă, difuză (tip M) în proporţie de peste 20%, iar în cele din LAM-M5 în proporţie de peste 80%, sensibilă la NaF.Megacarioblaştii leucemici din LAM-M7 au pozitivitate focală distinctă parţial inhibată de NaF. Eritroblaştii din LAM-M6 au de obicei activitate ANAE pozitivă, neinhibată de NaF.Celulele blastice din LAL sunt negative; foarte rar pot apărea celule ANAE slab pozitive cu aspect granular, cu sensibilitate variabilă la NaF1;4.

IV. Fosfataza alcalină leucocitară (indice FAL)

Informaţii generale şi recomandăriActivitatea fosfatazei alcaline este prezentă în citoplasma neutrofilelor, osteoblastelor, celulelor endoteliului vascular şi unor limfocite.Determinarea activităţii (indicelui) fosfatazei alcaline leucocitare este utilizată in :- diferenţierea leucemiei granulocitare cronice de alte boli mieloproliferative (în particular metaplazie mieloidă cu mielofibroză şi policitemia vera) şi de reactiile leucemoide (infecţii, neoplazii);- diferentierea poliglobuliilor secundare de policitemia vera;- parametru de prognostic în LGC, ce reflectă diferitele faze de activitate ale bolii;- diferenţierea formelor stabile, benigne de hairy cell leukemia (HCL) cu FAL normal, de formele active de boală, cu neutropenie severă şi FAL mult crescut1;3;6.Principiul reacţieiFosfataza alcalină leucocitară catalizează reacţia de hidroliză a esterilor fosfaţi în mediu alcalin.1-naftolul rezultat din 1-naftil-fosfat se cuplează cu o sare de diazoniu, formând precipitate brune, în funcţie de localizarea şi activitatea fosfatazei alcaline în celule. Intensitatea şi frecvenţa granulelor se evaluează prin examen microscopic1,3.Pregătire pacient - à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)3.Specimen recoltata) sânge capilar şi/sau aspirat medular - frotiurib) se recomandă recoltarea simultană de sânge venos pentru hemogramă3.

Cauze de respingerea probei- frotiuri nefixate în maxim 8 ore de la recoltare;- frotiuri executate din sânge recoltat pe EDTA3.Recipient de recoltarea) se execută frotiuri de sânge capilar direct pe lame de microscopie;b) vacutainer cu EDTA K3 (capac mov), pentru hemogramă3.Cantitate recoltată a) 3-5 frotiuri;b) 2 mL3.Prelucrare necesară după recoltare Este preferabil ca fixarea frotiurilor să se facă în primele 30 minute de la recoltare. Eventual, se poate face în primele 8 ore. Amestec fixator: alcool etilic 9 părţi + formol 40% 1 parte. Fixarea se cronometrează 30 secunde, după care frotiurile se spală cu jet de apă de robinet. Frotiurile fixate se pot colora imediat sau se pot păstra câteva zile la temperatura camerei, până la colorare3.Stabilitate probă- frotiurile nefixate sunt stabile maxim 8 ore la 18-30ºC;- frotiurile fixate sunt stabile 5 zile la temperatura camerei3.Metodă - examinare microscopică 3 .Determinarea citochimică a fosfatazei alcaline este bazată pe formarea unui precipitat colorat brun, a cărui intensitate este subiectiv gradată de la 0 la 5:-grad 0= fără pigment, granulaţii absente-grad 1= una-puţine granulaţii distincte-grad 2= câteva granulaţii localizate-grad 3= granulaţii difuz distribuite-grad 4= precipitate intense compacte care acoperă citoplasma celulelor, dând aspect de pigment continuu, nucleul celulelor fiind însă vizibil-grad 5= număr maxim de granulaţii, cu nucleul frecvent invizibil.Scorul fosfatazei alcaline leucocitare într-un frotiu este dat de suma scorurilor de colorare a 100 granulocite neutrofile mature1;3. Valori de referinţă3 - Scor FAL:10-100.Interpretarea rezultatelorValori scăzute:- leucemie granulocitară cronică (tipic, FAL este foarte scăzută sau absentă);- hemoglobinurie paroxistică nocturnă;- sindroame mielodisplazice6.Valori crescute- boli mieloproliferative, altele decat LGC (policitemia vera şi unele cazuri de metaplazie mieloidă cu mielofibroză);- LGC în remisiune (poate avea FAL normal sau chiar crescut);- infectii;- afectiuni inflamatorii;- leucemie cu celule păroase1,6.Limite şi interferenţe• Condiţii fiziologice de stress: sarcină, efort fizic intens (cresc indicele FAL).• Condiţii patologice: infecţiile asociate LGC pot creşte valoarea FAL.• Medicamente: terapia cu factori de creştere, contraceptive orale, preparatele cortizonice, litiu, (determină creşteri ale indicelui FAL).• Interferenţe analiticeScăderi : EDTA (activitatea enzimei scade rapid în timp)6.

Observaţie: Pentru a determina indicele FAL, trebuie să existe suficiente granulocite neutrofile mature în formula leucocitară3.

Bibliografie

1. Dan Coliţă. Tratat de Medicină Internă-Hematologie, partea a II-a (sub redacţia Radu Păun), ed 1999, 1014-1026.2. Lothar Thomas. Hematology. In Clinical Laboratory Diagnostics, ed 1998, 520.3. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2006. Ref Type: Catalog;4. Marsha C.Kinney, John N.Lukens. Classification and differentiation of the acute leukemias. In Wintrobe's Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 2211-2220.5. Shafer J, Canadian Society of Laboratory Technologist Congress, Winnipeg, Manitoba, June 16 to 20, 1996, Workshop Manual, p 167-176. 6. Sherrie L. Perkins. Cytochemical Stains. In Wintrobe's Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 26-27.