rappel détermination des conditions (amorces, t°c d ... · amorce sens amorce anti-sens sonde...
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TD2: PCR
• Rappel • Détermination des conditions (amorces, t°C d’hybridation)• RT-PCR• PCR et séquençage• PCR quantitative
Module 9: B. BrunelSeptembre 2007
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Le principe de la PCR (rappel)
= amplification génique« clonage in vitro » 100 pb-3 kb max 5 kb(standard), long PCR kits ---> 35 Kb
Kary Mullis, prix nobel 1993
outil incontournable
avantages: simple, rapide, très sensible, peu de matériel, peu de purification
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Programmation d’un thermocycleur pour PCR:
4
32
1
1. Dénaturation 2. hybridation 3. polymérisation95°C des amorces 72°C
Thyb?
4. nombre de cycles: 20-40
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Elaboration des amorces
Détermination de la taille optimale desamorces
Exercice n°7» A noter: longueur des amorces pour une
amplification spécifique
Choix des séquences des amorcesExercice n°8a
» Savoir déterminer les amorces sens et antisens
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Détermination de la T° d’hybridation
Exercices n°8bTm: t° où 50% de l’ADN est double brinFormule empirique Tm = 4(G+C) + 2(A+T)Température d’hybridation:
= min (Tm1, Tm2) - 4°CTm diminue de 1 à 1,5°C par % de différence
si une base diffère: 1/20 ---> 5%
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Mésappariement possible, mais pas n’importe où (5’ = 3’)
Vitesse d’élongation: env. 1,5-4 Kb/min--->1 Kb/min
Eviter bases complémentaires entre amorces et à l’intérieur de l’amorce (struct secondaire)
Eviter séquences répétées
T° de fusion proche entre amorces
% GC de 40-60
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Transcriptase inverse
Amplifier l’ARN: la RT-PCR
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PCR et séquençage:
une amorcematrice
+ dNTP
1. Dénaturation 95-96°C2. Hybridation 50-55°C3. Polymérisation 60-70°C
n= 25 cycles
---> amplification linéaire
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• structure of a dNTP (déoxynucléotide)
• structure of a ddNTP (didéoxynucléotide)
O
BASE (A, T, G, C)
HO
OPOPOP C
O O O
O- O- O-
O-
OH
O O O
O
BASE (A, T, G, C)
OPOPOP C
O- O- O-
O-
OH
5 ’
3 ’
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C A G T
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(Polyacrylamide)
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Quantifier l’ADN: la PCR quantitative
96 Replicates
-1.00E-01
4.00E-01
9.00E-01
1.40E+001 6
11 16 21 26 31 36
Cycle Number
Analyse temps réel
Analyse point Final
Detection de fluorescence au cours d’une PCR
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Ex: la chimie Taqman
5’3’
5’5’3’
5’
Amorce sens
Amorce anti-sens
Sonde TaqMan®
R Qp
FRET
Quenching
QuencherReporter
1ère étape: Hybridation de la sonde• Une sonde 20-40NT•Amplifier un petit fragment 75-80NT, pas de chevauchement
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2. Polymérisation
3. Clivage de la sonde(activité nucléase) etémission de fluorescence (500 nm)
4. Fin de polymérisation
PCR en temps réel: émission de fluorescence proportionnelle à la quantité d’ADN amplifié
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Système de détection
Intégré dans un seul instrument
Détection en temps réel des produits de PCR
Detection de lafluorescence
PCRde L'échantillon
Preparation Analyse spécifique à l'application
ABI Prism 7700
500 nmBloc PCR
Signal analysépar ordinateur
Fibres optiques
multiplexeur
caméra
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Plusieurs types de fluorophores possibles
Q
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Profil d’amplification de la PCRq
Ct: cycle au cours duquel démarre la phaseexponentielle de la PCR:
-2.00E-02
0.00E+00
2.00E-02
4.00E-02
6.00E-02
8.00E-02
1.00E-01
20 22 24 26 28 30
96 replicats
CYCLE SEUIL(Ct)
Seuil de Détection(Threshold)
Nombre de cycles
Phase exponentielle
Intensité de fluorescence
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Ct est proportionnel au nombre de cibles à amplifierCt est reproductible d’une amplification à l’autre
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Equation de l’amplification de la PCR
Xn = Xo x (1 + Ex)n
Xn = nombre de cibles au cycle nXo = nombre initial de molécules ciblesEx = efficacité de la PCRn = nombre de cycles de PCR
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Détermination d’une courbe standardCt = a x log (Qté ADN cible) + b
Ex = [10 1/a - 1] x 100
Pente efficacité de la PCR (p=3,32 -> E=100%)
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Application: dosage de transgènes• Préparation de 2 gammes étalon
– détermination de la qté d’ADN total– détermination de la qté d’ADN transgénique
Exercice n°33
quantité ADN total (ng) 200 100 50 25 5 2,5quantité ADN transgénique (ng) 4 2 1 0,5 0,1 0,05
Amplification d’une séquence du transgèneCt Ct
Amplification d’un gène de référence
Ct = a x log (Qté ADN total) + b
Ct = a’ x log (Qté ADN transgénique) + b’
log (Qté ADN transgénique (ng))log (Qté ADN total (ng))
% d’OGM contenu dans l’échantillon = Qté d’ADN transgénique/Qté totale d’ADN x 100
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Exercice 33