PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF α-AMYLASE FROM SOME

FRUITS

MR.PORNCHAI LUANGBORISUT MRS. PATCHAREE SITTIKITYOTIN

THE RESEARCH WAS FINANCIALLY SUPPORTED BY THE UNIVERSITY OF THE THAI CHAMBER OF COMMERCE

2012

การท าใหบรสทธและลกษณะเฉพาะของเอนไซมแอลฟาอะไมเลส จากผลไมบางชนด

Purification and characterization of α-amylase from some fruits

โดย พรชย เหลองบรสทธ ภชร สทธกจโยธน

รายงานการวจยนไดรบทนสงเสรมงานวจยมหาวทยาลยหอการคาไทย พ.ศ. 2555

ชอเรอง : การท าใหบรสทธและลกษณะเฉพาะของเอนไซมแอลฟาอะไมเลสจากผลไม

บางชนด ชอผ วจย : พรชย เหลองบรสทธ สาขาวชาวทยาศาสตรพนฐาน

คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยหอการคาไทย

ผ วจยรวม : ภชร สทธกจโยธน ปทแลวเสรจ : 2556 จ านวน 59 หนา ค าส าคญ : แอลฟา อะไมเลส, มะมวง, เบตา ไซโคลเดกซตรน,

บทคดยอ* งานวจยครงนมวตถประสงคเพอการศกษาแหลงของเอนไซมแอลฟา อะไมเลสในผลไมบางชนด ท าการศกษาผลไมจ านวน 89 ตวอยาง พบวาผลไมใหผลบวก จ านวน 45 ตวอยางโดยใหผลเปนบวก +, ++, +++และ++++ จ านวน 2,19, 17และ 7 ตวอยางตามล าดบ จากนนไดท าการคดเลอกผลไมตวอยางมะมวงน าดอกไม (Namdogmai mango, Mangifera indica L.) และมะมวงอกรอง (Ok-rong Mango ; Mangifera indica L.)โดยพจารณาจากเสนผาศนยกลางของ blue zone ใน agar plate diffusion เอนไซมสกดอยางหยาบถกแยกออกโดยวธท าใหตกตะกอนกบสารละลายเอทานอล 95 เปอรเซนต น าเอนไซมสวนทไดจากการตกตะกอนนผานคอลมน β -cyclodextrin Sepharose 6B โดยใชสารละลาย KCl-HCl บฟเฟอรความเขมขน 0.1โมลาร ความเปนกรด-เบส เทากบ 2.0 เปนตวชะเอนไซมแอลฟา อะไมเลส ปรบสารละลายเอนไซมแอลฟา อะไมเลส ใหมความเขมขนขนโดยการกรองผานอลตราเมมเบรนทมการคดกรองน าหนกโมเลกล 3 กโลดาลตน เอนไซมทไดมความบรสทธ 6.89 , 9.25 เทาคดเปนรอยละ10 , 4 คาแอกตวตเฉพาะของเอนไซมเทากบ 125 , 33.33 ยนตตอมลลกรม พบในมะมวงน าดอกไมและมะมวงอกรองตามล าดบ จากผลการทดลอง SDS-PAGE แถบโปรตนบนเจลมน าหนกโมเลกลอยในชวงระหวาง 42-51 กโลดาลตน เอนไซมแอลฟา อะไมเลสท างานไดดทความเปนกรด-เบส 5 อณหภมเหมาะสมอยในชวง 45-65 องศาเซลเซยส * ผลงานวจยนไดรบทนสงเสรมการวจย ส าหรบพนกงานประจ ามหาวทยาลยหอการคาไทย

ก

Title : Purification and characterization of α-amylase from some fruits Researcher : Pornchai Luangborisut Department of Basic science

School of Science and Technology The University of the Thai Chamber

of Commerce Co-researcher : Patcharee Sittikityotin Year of Accomplishment : 2013 No. of Page : 59

Key word : alpha amylase, Mango, β -cyclodextrin

Abstract* The aim of this study is to screen source of α-amylase from some fruits. The selected samples were 89 fruit samples. The study found that 45 fruit samples were positive result in scale +, ++, +++, and ++++ with total fruit types number of 2,19,17 and 7, respectively. The fruit sample Namdogmai mango (Mangifera indica L.) and Ok-rong Mango (Mangifera indica L.) were selected based on diameter of the blue zone in agar plate diffusion. Crude enzyme was isolated by 95% ethanol precipitation. The enzyme fraction was loaded onto a β - cyclodextrin Sepharose 6B affinity column. α- Amylase was eluted by 0.1 M KCl-HCl buffer pH 2.0. α- Amylase solution was concentrated by Ultramembrane filtration molecular weight cut off 3 kDa. The enzyme were purified 6.89, 9.25 fold to homogeneity with an overall recovery of 10, 4 % and specific activity of 125, 33.33 U/mg found that in Namdogmai mango and Ok-rong Mango, respectively. The protein bands showed a molecular weight in the range of 42-51 kDa by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The purified α- amylase enzyme had a maximum activity at pH 5 and temperature in the range of 45-65 degrees celsius. *The research was Financially Supported by the University of the Thai Chamber of Commerce

ข

กตตกรรมประกาศ

คณะผ วจยขอขอบคณ มหาวทยาลยหอการคาไทย ทใหทนอดหนนและสนบสนนการท าวจยในครงน ขอขอบคณคณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย ทใหการสงเสรมในการท าวจยโดยใหความสะดวกในการใชอาคารสถานท วสดอปกรณและเครองมอตางๆ และขอขอบคณทปรกษาโครงการวจย ผศ. ดร. สรพงษ พนจกลาง ผศ. รชน ไสยประจง ทใหค าปรกษาและแนะน าในการท าวจยในครงนส าเรจลลวงไปดวยด

ค

สารบญ

หนา

บทคดยอภาษาไทย ก บทคดยอภาษาองกฤษ ข กตตกรรมประกาศ สารบญ

ค ง

สารบญตาราง ( จ สารบญภาพ/สารบญรป ( ฉ-ช บทท

1. บทน า… 1 2. เอกสารและงานวจยทเกยวของ 3 3. ระเบยบวธวจย 9 4. ผลการวเคราะหขอมล 19 5. สรปการวจย และขอเสนอแนะ 31

บรรณานกรม 33 ภาคผนวก 39 ประวตผท าวจย 59

ง

สารบญตาราง

ตารางท หนา 3.1 ตวอยางผลไมชนดตางๆและสวนทใชในการทดลอง 10 4.1 ผลการคดเลอกแหลงของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส จากตวอยางผลไม 89

ตวอยาง 20

4.3.1 แสดงล าดบการคดแยกใหบรสทธของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส จากมะมวงน าดอกไม (Namdogmai Mango ; Mangifera indica L.) โดยวธแอฟฟนต โครมาโตกราฟฟ

24

4.3.2 แสดงล าดบการคดแยกใหบรสทธของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส จากมะมวงอกรอง(Ok-rong Mango ; Mangifera indica L.) โดยวธแอฟฟนต โครมาโตกราฟฟ

25

จ

สารบญรป

รปท หนา 3.1 การหยดสารสกดเอนไซมจากตวอยางชนดตางๆบน AZCL-amylose plate 14 4.1 AZCL-amylose agar plate : A คอ AZCL-amylose plate กอนท าการ

ทดสอบความสามารถในการยอยคารโบไฮเดรต, B คอ AZCL-amylose plate หลงท าการทดสอบ จะเกด blue zone ขนรอบๆหลม มะมวงอกรอง(Ok-rong Mango ; Mangifera indica L.)

19

4.2 blue zone ทเกดจากการยอยคารโบไฮเดรทบน AZCL-amylose plate A; บมทงไว: 5 ชวโมง 35 องศาเซลเซยส B; บมทงไว: 24 ชวโมง 35 องศาเซลเซยส ของมะมวงอกรอง (Ok-rong Mango ; Mangifera indica L.)

20

4.3.1 การแยกใหบรสทธของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส โดยการน าเอาเอนไซมสกดอยางหยาบทไดจากมะมวงน าดอกไมมาแยกในคอลมนทม β-cyclodextrin Sepharose 6B โดยใชสารละลาย KCl-HCl บฟเฟอรความเขมขน 0.1 โมลาร ความเปนกรด-เบส เทากบ 2.0 เปนตวชะเอนไซมแอลฟา อะไมเลส

24

4.3.2 การแยกใหบรสทธของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส โดยการน าเอาเอนไซมสกดอยางหยาบทไดจากมะมวงอกรองมาแยกในคอลมนทม β-cyclodextrin Sepharose 6B โดยใชสารละลาย KCl-HCl บฟเฟอรความเขมขน 0.1 โมลาร ความเปนกรด-เบส เทากบ 2.0 เปนตวชะเอนไซมแอลฟา อะไมเลส

25

4.4.1 ผลทดลองการท า SDS-PAGE จากมะมวงน าดอกไม (Namdogmai Mango ; Mangifera indica L.) A Lane (A) แสดง Molecular weight standard protein (B-E) แสดงโปรตนจาก crude enzyme B Lane (A) Molecular weight standard protein, Lane (B) α-amylase purified by affinity chromatography

26

4.4.2 ผลทดลองการท า SDS-PAGE จากมะมวงอกรอง (Ok-rong Mango ; Mangifera indica L.) Lane (A) แสดง Molecular weight standard protein Lane (B-D)โปรตนทความเขมขนตางๆ(crude : B 4x, C 2x, D 1x)น าหนกโมเลกลของโปรตนอยในชวงระหวาง 10.5-14, 27-39, 42-51 กโล-

27

ฉ

ดาลตน เมอเปรยบเทยบกบแถบมาตรฐาน(A) 4.4.3 ผลทดลองการท า SDS-PAGE Lane (A) แสดง Molecular weight

standard protein Lane(B) แสดง โปรตนจาก crude enzyme Lane (C,D) α-amylase purified by affinity chromatography จากมะมวงน าดอกไม (Namdogmai Mango ; Mangifera indica L.) Lane(E) แสดง โปรตนจาก crude enzyme Lane (F,G) α-amylase purified by affinity chromatography จากมะมวงอกรอง (Ok-rong Mango ; Mangifera indica L.)

28

4.6.1 แสดงผลการการตรวจสอบแอกตวตของเอนไซมแอลฟา อะไมเลสของมะมวงน าดอกไมทมคาความเปนกรดเบส เปน 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, และ12

29

4.6.2 แสดงผลการการตรวจสอบแอกตวตของเอนไซมแอลฟา อะไมเลสของมะมวงอกรองทมคาความเปนกรดเบส เปน 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11และ12

4.6.3 แสดงผลการการตรวจสอบแอกตวตของเอนไซมแอลฟา อะไมเลสของมะมวงน าดอกไมทมคาอณหภม เปน 25, 35, 45, 65 และ 85 องศาเซลเซยส

29

30

4.6.4 แสดงผลการการตรวจสอบแอกตวตของเอนไซมแอลฟา อะไมเลสของมะมวงอกรองทมคาอณหภม เปน 25, 35, 65, 75 และ 85 องศาเซลเซยส

30

ช

1

บทท 1

บทน า ความเปนมาและความส าคญของปญหา

มการพบเอนไซมอะไมเลสในหลายแหลงดวยกน เชนในสตวพบทน าลาย และล าไส ในสงมชวตขนาดเลก (microoganism) พบในพวก เหด ราและบคเตร (Burhan และคณะ 2003; Carlsen และ Neilsen 2001; Takeuchi และคณะ 1978). โดยทวไปเอนไซมอะไมเลสจะแบงออกเปน 3 กลมยอยคอ alpha amylase (α-amylase) beta amylase (β-amylase) และ glucoamylase (หรอ – amylase มปรมาณนอย) (Horvathova และคณะ 2001) เอนไซม แอลฟา อะไมเลสจากพวกสงมชวตขนาดเลก (microorganism) เชน เหด ราและบคเตรมกน ามาใชในดานอตสาหกรรมการผลตยาและอตสาหกรรมเคม (Augustin และคณะ 1981; Pandeyและคณะ 2000) อตสาหกรรมอาหาร อตสาหกรรมสงทอ อตสาหกรรมกระดาษ สารท าความสะอาด การผลตแอลกอฮอล (Pandeyและคณะ 1999; Pandeyและคณะ 2000; Gupta และคณะ 2003; Souza, P.M. และ Oliveira M,P. 2010) พช ผก ผลไม นยมสกดมาเปนเอนไซมเสรมสขภาพชวยยอยอาหารและรกษาโรคตางๆ (Howell,1994) แตการศกษาเอนไซม แอลฟา อะไมเลส จากพวกพช เชนผลไมตางๆยงมการศกษาอยจ านวนนอย Pesis และคณะ (1978) ท าการหาแอกตวตของอะไมเลสในผลอะโวกาโด (Avocado fruit pulp) Pech และLatchke 1972 ท าการหาแอกตวตของอะไมเลสในผล Passe-crassane pears Davies และ Cocking 1967 ท าการหาแอกตวตของอะไมเลสในผลมะเขอเทศ Al-Helal 1988 ท าการหาแอกตวตของอะไมเลสในผลปาลม (Date palm: Phoenix dactyllifera L.) Srinivasa Rao และคณะ 2005 ท าการหาแอกตวต ของแอลฟา อะไมเลสในผล Borassus indica(pericarp) Kanwal และคณะ 2004 ท าการหาแอกตวตของแอลฟา อะไมเลสในผลแอบเปล (Malus pumila) Laloknam และคณะ 2009 ท าการศกษาหาแอกตวตของเอนไซมอะไมเลสในผกและผลไม 10 ชนด Bassinello และคณะ 2002 ท าการศกษาเอนไซมแอลฟา อะไมเลสจากผลกลวย (Musa paradisiaca) Nerkar และคณะ 2011 ท าการศกษาโดยการสกดและตรวจสอบดคณสมบตแอลฟา อะไมเลสของถว (Mat

2

beans: Phaseolus aconitifolius ) ชฎาวฒ และคณะ 2552 ท าการศกษาหาแอกตวตของเอนไซมอะไมเลสจากผลขนน (Jackfruit) การศก ษาผลไมในประเทศไทยทมรสหวานหลายชนดอาจมผลมาจากหลายสาเหต เชน สภาพแวดลอม ภมอากาศ แรธาตตางในดน น า ชนดของสายพนธ ปรมาณการสะสมแปง และประสทธภาพการท างานของเอนไซมอะไมเลส ในการวจยครงนมวตถประสงคในการหาองคความรใหมของเอนไซมแอลฟา อะไมเลสจากผลไมไทยบางชนดและการศกษาคณสมบตลกษณะ เฉพาะทางชวเคมตอไป วตถประสงคของโครงการวจย 1) เพอคดเลอกแหลงของเอนไซมแอลฟา อะไมเลสในผลไม 2) เพอท าการแยกเอนไซมแอลฟา อะไมเลสใหบรสทธโดยวธแอฟฟนต โครมาโตกราฟฟ 3) เพอศกษาองคความรใหมในคณสมบตของเอนไซมแอลฟา อะไมเลสทคดเลอกไดจาก

ผลไม 2 ชนด ขอบเขตของการวจย ในการวจยครงนจะท าการคดเลอกแหลงของเอนไซมแอลฟา อะไมเลสในผลไม 89 ชนด โดยน าเนอผลไมแตละชนดไปบดใหละเอยดดวยเครองปน กรองเอาสวนน าไปปนเหวยง หลงจากนนน าสารละลายทไดไปทดสอบการยอยแปงบน AZCL-Amylose plate เพอคดเลอกแหลงของเอนไซมแอลฟา อะไมเลสในผลไมเพยง 2 ชนดทมประสทธภาพสงทสด ตอจากนนท าการวดปรมาณโปรตนดวยวธมาตรฐาน (Lowry, 1951) ท าการแยกบรสทธโดยใชเทคนคทางแอฟฟนต โครมาโตกราฟและท าอเลกโทรโฟรซส (SDS-PAGE) เพอตรวจสอบสมบตลกษณะเฉพาะของ เอนไซม โดยการท าปฏกรยาของเอนไซมกบซบสเตรตสงเคราะหและศกษาผลของอณหภม กรด-เบส ทมตอแอคตวตของเอนไซม ประโยชนทคาดวาจะไดรบ 1) ท าใหพบแหลงของเอนไซมแอลฟา อะไมเลสจากผลไมทมประสทธภาพสง 2) สามารถแยกเอนไซมแอลฟา อะไมเลสใหบรสทธโดยวธแอฟฟนต โครมาโตกราฟ 3) ท าใหทราบสมบตทางเคมและกายภาพของเอนไซมแอลฟา อะไมเลสทพบจากผลไมท

เปนองคความรใหม

3

บทท 2 เอกสารและงานวจยทเกยวของ

ชนดและสมบตของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส เอนไซมอะไมเลส (amylase or amylolytic enzyme) ถกคนพบและแยกไดเปนผลส าเรจครงแรกจากขาวบาเลยทก าลงงอก โดยนกเคมชาวฝรงเศสชอ Anselme Payen และ Jean-Francois Persoz ในป ค.ศ.1833 เอนไซมอะไมเลสประกอบดวยเอนไซมกลมยอย 3 กลมไดแก แอลฟา อะไมเลส (α – amylase) เบตา อะไมเลส (β – amylase)และแกมมา อะไมเลส ( – amylase) ซงหมายถงกลมของเอนไซมทท าหนาทยอยแปง (carbohydrates) โดยเอนไซมอะไมเลสจะยอยแปงทมโมเลกลใหญ เชน polysaccharide; starch และ glycogen ใหมาเปนแปงทมโมเลกลเลกลง (oligosaccharide ,disaccharide or monosaccharide) อนไดแกน าตาลมอลโตไตรโอส (moltotriose) มอลโตส (maltose) ซโครส (sucrose) เดกซตรน (dextrin) กลโคส(glucose) ฟรคโตส (fructose) มการคนพบเอนไซมอะไมเลสในหลายแหลงดวยกนทงในพช สตวพวก prokaryote และ eukaryote เชน ในสตวพบทน าลายและล าไส ในสงมชวตจลนทรย(microorganism) พบในพวก เหด รา และบคเตร (Burhan และคณะ 2003 ; Carlsen และ Neilsen 2001 ; Takeuchi และคณะ 1978) ขณะเดยวกนไดมการประยกตใชเอนไซมอะไมเลสในอตสาหกรรมตางๆดวยกนเชนอตสาหกรรมอาหาร สารท าความสะอาด การผลตยาและดานการแพทย (Burhan และคณะ 2003 ; Shaw และคณะ 1999 ; FAO. 2001; Carlsen และ Neilsen, 2001) งานวจยทเกยวของ Fan 1975 ท าบรสทธเอนไซม แอลฟา อะไมเลสโดยใชหวมนฝรง (potato) หนก 500 กรมบดใหละเอยดในสารละลายอะซเตตบฟเฟอร (0.05 M, pH 5, 0.01M Calcium acetate, Sodium sulfite 0.5 g) 100 มลลลตร เปนเวลา 30 วนาท แลวน าไปกรองดวย Buchner funnel จะไดสารผสมประมาณ 400 มลลลตร หลงจากนนน าไปปนแยกดวยแรงเหวยงทความเรว 17,300

4

รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท แยกตะกอนออก น าสารละลายสวนใสมาวดปรมาตร ตอจากนนน าสารละลายมาตกตะกอนดวยไกลโคเจน (Layter และ Schramm 1962) โดยน าสารละลายทได 100 มลลลตร ผสมกบฟอสเฟต บฟเฟอร (0.2 M, pH 8.0) 5มลลลตร ใสลงใน flask ขนาด 250 มลลลตร วางแชใน ice bath เตมอก 6 มลลลตรของ 2 % สารละลาย ไกลโคเจนลงใน flask เขยาชาๆใหเขากนแลวน าไปปนแยกดวยแรงเหวยงทความเรว 2,500 รอบตอนาท ทอณภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท น าตะกอนทไดไปละลายในสารละลายอะซเตต บฟเฟอร (0.05 M, pH 5.5) จ านวน 5 มลลลตร ในการตกตะกอนกบไกลโคเจนน ท าซ ากนเชนเดม 4 ครง จะเกบเอนไซมทได ประมาณ 20 มลลลตร (จากการน าตะกอนมาละลายทงหมด)หลงจากนนน าเอนไซมมาผานคอลมน ขนาด 2 x 34 เซนตเมตร sephadex G -75 ตามดวยการท า อเลกโทรโฟรซส ผลการวเคราะหไดน าหนกโมเลกลขนาด 46,000 อณหภมทเหมาะสมตอกจกรรม อยท 42 องศาเซลเซยส กรด- เบส ทเหมาะสม 5.5- 6.0 จลนศาสตรของเอนไซมการเขาท าปฏกรยากบซบสเตรตมคา Km เทากบ 5.2 x 10-3 กรมตอมลลลตร Warner และคณะ 1991 ท าบรสทธเอนไซม แอลฟา อะไมเลส จากเอนโดสเปอรมของเมลดขาวโพดทก าลงงอกโดยน าเอา crude extract ของเอนโดสเปอรมทสกดเตรยมไวมาตกตะกอนโปรตนดวยอะซโตน แลวน ามาผานคอลมน cycloheptaamylose – sepharose 6 B ท า anion exchange chromatography (affinity – bound enzymes), hydroxylapatite chromatography (affinity – unbound enzymes) และ chromatofocusing วเคราะหโปรตน ตรวจสอบคณสมบตของเอนไซม พบวาเอนไซมมขนาดโมเลกล 42,000 มคาแอกตวตทเหมาะสมของเอนไซมเทากบ 345 ยนตตอมลลกรม ปรมาณโปรตน เทากบ 530 ไมโครกรม โดยมอณหภมเหมาะสมอยท 25 องศาเซลเซยส กรด-เบส อยท 4 – 5 Sang – Kyou Leeและคณะ 1994 ท าบรสทธเอนไซม แอลฟา อะไมเลสจากจลนทรย (Escherichia coli) โดยน าจลนทรยทเพาะเลยงไวมาผสมกบสารละลาย 50 mM tris- malate – NaOH,pH 7.0 แลวใชคลนความถสง (sonicated) กระแทกไปทเซลลจลนทรย เปนเวลา 10 นาท หลงจากนนน าไปปนแยกดวยแรงเหวยงทความเรว 14,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ตอจากนนน าไปตกตะกอนโปรตนดวยเกลอแอมโมเนยม ซลเฟตโดยใหมความอมตวอยทรอยละ 40 – 80 และท าไดอะไลสดวยสารละลายบฟเฟอร (Tris – acetate,pH 7.5) ตอจากนนน าไปผานคอลมน ( starch iodine column) และท าอเลกโทรโฟรซส (SDS gel electrophoresis) พบวามขนาดโมเลกลอยท 29,000 – 97,000 ความสามารถของเอนไซมทเขา

5

ท าปฏกรยากบซบสเตรต(starch)เทากบ 5,696 ยนตตอกรม ท อณหภม 4 องศาเซลเซยส คาแอกตวตเฉพาะของเอนไซมเทากบ 8.6 ยนตตอมลลกรมของโปรตน Shaw และคณะ 1995 ท าบรสทธเอนไซม แอลฟา อะไมเลสจาก แบคเตร(Thermus sp.) ทเพาะเลยงไวหลงจากนนน าสารละลายทได (crude extract) มาตกตะกอนดวยเกลอแอมโมเนยม ซลเฟต ทมความอมตว รอยละ 50- 80 ตอจากนนน าไปผานคอลมนโดยการท า FPLC – Hydrophobic interaction chromatography และตามดวยการท า Corn starch affinity adsorption แลวท าอเลกโทรโฟรซส (SDS – PAGE) อกครงไดน าหนกโมเลกลขนาด 59,000 มคาแอกตวตเฉพาะของเอนไซมเทากบ 367 ยนตตอมลลกรม อณหภมทเหมาะสมตอกจกรรมของเอนไซมอยท 70 องศาเซลเซยส โดยมคากรด-เบส pH 5.5 – 6.5 Witt และ Sauter 1996 ท าบรสทธเอนไซม แอลฟา อะไมเลสโดยใชหวมนฝรง(Solanum tuberrosum L.)หนก 400 กรม บดใหละเอยด (ใชเครองมอ ultra – turrax homogenizer ความเรวสงสด)ในสารละลายบฟเฟอร ( 50 mM HEPES/KOH, pH 8.0,5 mM MgCl2, 10 mM 2-mercaptoethanol,0.2mM Na-EDTA, 0.05%(w/v)defatted BSA) 800 มลลลตรเปนเวลา 30 วนาท แลวน าสารละลายไปกรองดวย miracloth หลงจากนนน าไปปนแยกดวยแรงเหวยงทความเรว 16,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาทตอจากนนท าการแยกตามขนตอนโดยท าแอฟฟนต โครมาโตรกราฟ ผานคอลมนแบบ starch granule column (Q – Sepharose chromatography) ขนาด 1.6 x15 เซนตเมตร และท าเจล ฟลเตชน ตอจากนนท าการคดแยกเอนไซมและตรวจสอบคณสมบตเฉพาะตอซบสเตรต ท า HPLC และอเลกโทรโฟรซส ( SDS – PAGE) ไดน าหนกโมเลกลขนาด 44,000 มคาแอกตวตเฉพาะของเอนไซม แอลฟา อะไมเลส เทากบ 824 ไมโครโมลตอนาทตอมลลกรม โดยมคากรด -เบส ทเหมาะสมอยท 7.2 และ8.0 Kanwal และคณะ 2004 ท าบรสทธเอนไซม แอลฟา อะไมเลสจากผลแอปเปล(Malus pumila) และศกษาคณสมบตดคาแอกตวตตางๆของเอนไซม โดยน าเอาเนอผลแอปเปลมา 100 กรม บดใหละเอยดกบสารละลายฟอสเฟต บฟเฟอร (0.1M , pH7) ปรมาณ 400 มลลลตร เปนเวลา 10 นาท หลงจากนนน าไปปนแยกดวยแรงเหวยงทความเรว 10,000 รอบตอนาท ท อณภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท แยกตะกอนออก น าสารละลายสวนใสมาวดปรมาตร ตอจากนนน ามาตกตะกอนโปรตนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟต ทมความเขมขนรอยละ 40 ของความอมตว แลวน าไปปนแยกดวยแรงเหวยงทความเรว 10,000 รอบตอนาท ทอณภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท ตอจากนนน าสารละลายทไดมาเตมเกลอแอมโมเนยมซลเฟตอกครง

6

ใหไดความเขมขน รอยละ 60 ของความอมตว แลวน าไปปนแยกดวยแรงเหวยงตอเชนเดมทความเรว 10,000 รอบตอนาท ทอณภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท ตอจากนน ละลายตะกอนทไดดวย บฟเฟอร แลวท าไดอะไลสตอทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เ ปนเวลา 5 ชว โมง แยกเอาตะกอนทงไป น าสารละลายสวนใส (ประมาณ 2 มลลลตร) มาผานคอลมน sephadex G – 150 แลวชะดวยฟอสเฟตบฟเฟอร ( pH 7) ใหไดประ มาณ 24 หลอดๆละ 2 มลลลตร จากนนน าไปวเคราะหหาน าหนกโมเลกล โดยวธอเลกโทรโฟรซส (SDS – PAGE) ตรวจสอบดคณสมบตเอนไซม ดคาแอกตวตทเหมาะสมตางๆ พบวาคาแอกตวตเฉพาะของเอนไซม แอลฟา อะไมเลสเทากบ 38.95 ยนตตอมลลลตร มขนาดโมเลกล 51,180 (Yasin และ Chaudhary 1981 ท าการทดลองการท าบรสทธเอนไซม แอลฟา อะไมเลสกบผลมะมวงไดขนาดโมเลกล 53,000 Anis, 1982 ท าการทดลองการท าบรสทธเอนไซม แอลฟา อะไมเลสกบผลมะละกอ (Carica papaya)ไดขนาดโมเลกล 52,000 ผลของอณหภมทเหมาะสมตอแอกตวต อยท 37 องศาเซลเซยส กรด-เบส ทเหมาะสม 6.8 จลนศาสตรของเอนไซมการเขาท าปฏกรยากบซบสเตรตมคา Km เทากบ 2.0 x 10-3 กรมตอมลลลตร El – Safey และAmmar 2004 ท าบรสทธเอนไซม แอลฟา อะไมเลสจากรา(Aspergillus flavus var. columinaris) โดยน าเอนไซมทไดจากการเพาะเลยงรา ตามวธของ El – Safey และ Ammar 2002 มาตกตะกอนโปรตนกอนโดยใชเกลอแอมโมเนยมซลเฟตทมความอมตวรอยละ 20, 40, 60 ,80 แลวจงท าไดอะไลสในสารละลายบฟเฟอร จากนนน าไปผานคอลมน sephadex G –200 ผลการวจยไดคาแอกตวตทเหมาะสมของเอนไซมเทากบ 6471.6 ยนตตอมลลลตรตอมลลกรมของโปรตน โดยมอณหภมเหมาะสมอยท 35 องศาเซลเซยส คา กรด-ดาง ทเหมาะสมเทากบ 6.2 Rao และคณะ 2005 ท าบรสทธเอนไซม แอลฟา อะไมเลส จากบคเตร (Bacillus licheniformis strain MTCC1483) โดยน าบคเตรทเพาะเลยงในอาหาร มาตกตะกอนโปรตนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟต โดยใหมความอมตวอยทรอยละ 20 – 80 แลวท าไดอะไลสตอจากนนน าไปผานคอลมน (starch column ขนาด 1.5 x 10 เซนตเมตร) แลวน าไปวเคราะหหาน าหนกโมเลกลโดยวธอเลกโทรโฟรซส (SDS – PAGE) พบวาคาแอกตวตเฉพาะของเอนไซมเทากบ 507 ไมโครโมลตอมลลกรม สามารถท าบรสทธได 230 เทา มขนาดโมเลกลเทากบ 58,000 ผลของ อณภมทเหมาะสมอยท 5 องศาเซลเซยส กรด-เบสเทากบ 6.8 Xiao และคณะ 2006 ไดท าการตรวจวดคา แอกตวตของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส จากเชอรา (Aspergillus oryzae) โดยวธของ Fuwa 1954 (microplate – based starch iodine

7

assay) เปรยบเทยบกบ Nelson – Somogyi method (DNS;dinitrosalicylic acid) เพอการประยกตใชในโรงงานอตสาหกรรม พบมคาแอกตวตโดยเฉลยอยท 4.92 ±0.07 ยนตตอมลลลตร และ 1.04 ±0.02 ยนตตอมลลลตร ตามล าดบ Mohamed และคณะ 2009 ท าบรสทธเอนไซม แอลฟา อะไมเลส จากขาวสาลทก าลงงอก (Triticum aestivum) โดยน ามาเพาะไวทอณหภม 25 องศาเซลเซยส ในทมดประมาณ 16 วนกอนน ามาทดสอบโดยการบดใหละเอยด (homoginization) แลวน าไปปนเหวยง ท 10,000 รอบตอนาท จะไดสวนของสารละลายทเปน crude extract หลงจากนนน าไปวเคราะหหาปรมาณโปรตนโดยวธของBradford (1976) การหาปรมาณความเขมขนของน าตาลรดวซโดยวธ DNS การท าบรสทธเอนไซม โดยน าผานคลอลมน DEAE – Sepharose Column ขนาด 4 x 1.6 เซนตเมตร พบวามปรมาณเอนไซมแอลฟา อะไมเลส 6,900 ยนต (ปรมาณของเอนไซมทยอยสลายแปงแลวไดน าตาลรดวส 1 ไมโครโมลตอชวโมง) คาแอกตวตเฉพาะของเอนไซม เทากบ 2,300 ยนตตอมลลกรมโปรตนจาก crude extract ทงหมด คาแอกตวตเฉพาะของเอนไซมจากการท า DEAE มคาเทากบ 3,260 – 6,183 ยนตตอมลลกรมโปรตน จนศาสตรของเอนไซมการเขาท าปฏกรยากบซบ -สเตรต มคา Km เทากบ 1.1 – 2 มลลกรมตอ 0.5 มลลลตรของแปง (starch) อณภมทเหมาะสมตอแอกตวตอยท 40 – 50 องศาเซลเซยส กรด-เบส ทเหมาะสมคอ 5.5 เมอตรวจสอบ โดยวธ DNS จากการยอยแปง (starch) พบปรมาณน าตาลรดวสม คาเทากบ 0.3 – 0.83 ไมโครโมล Al-Bar 2009 ท าบรสทธเอนไซมแอลฟา อะไมเลส จากขาวบารเลย (Barley Hordium vulgare) ทก าลงงอก (เรมเพาะจากเมลดจนถง 16 วนแรก) โดยในชวงของเวลาดงกลาวน ามาสกดดวยสารละลายบฟเฟอร (Tris – HCl buffer,pH7) บดใหละเอยด แลวน าไปปนแยกดวยแรงเหวยงท ความเรว 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท น าเอาสารละลายสวนใสมาเปน crude extract ตอจากนนน ามาผานคอลมน DEAE – Sepharose column ขนาด 1.6 x 10 เซนตเมตร ท าการวเคราะหโปรตนโดยวธของ Bradford 1976 ตรวจสอบคณสมบตเฉพาะของเอนไซม หาคาแอกตวตทเหมาะสมของเอนไซมโดยทดสอบกบ starch,glycogen,dextranc และ dextrose การวจยพบวามปรมาณโปรตนเทากบ 0.1 – 1.68 มลลกรมตอ 3 กรมของ grains คาแอกตวตเฉพาะของเอนไซมเทากบ 2,678 – 19,650 ยนตตอมลลกรมของโปรตน โดยมอณภมทเหมาะสมอยท 45 องศาเซลเซยส กรด-เบส เทากบ 5 ชฏาวฒและคณะ 2552 ท าบรสทธเอนไซม อะไมเลสจากผลขนนไทย (Artocarpus heterophyllus) โดยน าขนนทก าลงเรมสก ผาเอาเฉพาะสวนเนอน าไปบดละเอยดดวยเครองปน

8

แลวใชผาขาวบาง 2 ชน กรองเอาสวนน า น าไปปนแยกดวยแรงเหวยงทความเรว 10,000 รอบ/นาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท น าตะกอนทงไปน าสารละลายทไดไปเจอจาง 50 และ100 เทา หาความเขมขนของน าตาลรดวซโดยวธ DNS (Dinitrosalicylic acid) ท าการวเคราะหโปรตนโดยวธ อเลกโทรโฟรซส (sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis : SDS – PAGE) ท าการแยกบรสทธโปรตนโดยวธ Two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D – PAGE) ผลการวจยโปรตนสวนใหญ มน าหนกโมเลกลอยท 40,000 – 60,000 ความเขมขนของน าตาลรดวซเฉลยประมาณ 105 มลลโมล Nouadri และคณะ 2010 ท าบรสทธเอนไซมแอลฟาอะไมเลสจากรา (Penicillium camemberti:PL21) โดยน าเอนไซมทไดจากการเพาะเลยงรา ในอาหารเลยงเชอประมาณ 72 ชวโมงทอณหภม 30 องศาเซลเซยส กรด-เบส 6.0 และใชเกลอแอมโมเนยมซลเฟต ทมความอมตวรอยละ 30 - 50 ในการตกตะกอนโปรตนกอน แลวจงท าไดอะไลสในสารละลายฟอสเฟตบฟเฟอร จากนนน าไปผานคอลมน sephadex G –100และท า DEAE – Sepharose CL – 6B ผลการวจยไดคาแอกตวตทเหมาะสมของเอนไซมเทากบ 154.2 ยนตตอมลลลตรตอมลลกรมของโปรตน โดยมอณหภมเหมาะสมอยท 30 องศาเซลเซยส คากรด-เบส ทเหมาะสมเทากบ 6 จากการท าอเลกโทรโฟรซส (sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis : SDS – PAGE) ไดน าหนกโมเลกลเทากบ 60,500 จลนศาสตรของเอนไซมการเขาท าปฏกรยากบซบสเตรตมคา Km เทากบ 0.92 มลลกรมตอมลลลตร Valaparla 2010 ท าบรสทธเอนไซมแอลฟา อะไมเลสจากรา (Acremonium sporosulcatum) โดยน า crude extract ทไดจากการเพาะเลยงมาตกตะกอนโปรตนดวยเกลอแอมโมเนยม ซลเฟตทมความอมตวรอยละ 30 – 70 และน าไปปนแยกดวยแรงเหวยงทความเรว 10,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท แลวจงท าไดอะไลสในสารละลายฟอสเฟต บฟเฟอร (0.1 M ,pH 6.9) เปนเวลา 1 คน ตอจากนนน าไปผานคอลมน ( DEAE cellulose column) ขนาด 5 x 20 เซนตเมตร ดวยอตราเรว 20 มลลลตร/1ชวโมง น าสารละลายทไดมาท าไดอะไลสอกครงแลวจงน าไปผานคอลมน sephadex G –100 ขนาด 2.5 x 10 เซนตเมตร ดวยอตราเรว 5 มลลลตร/1ชวโมง ตอจากนนน าสารละลายทไดท าอเลกโทรโฟรซส (sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis : SDS – PAGE) หาน าหนกโมเลกล จากการแยกบรสทธโดยวธนพบวาสารมขนาดโมเลกลเทากบ 58,000 มคาแอกตวตทเหมาะสมของเอนไซม เทากบ 36.53 ยนตตอมลลกรม โดยมอณหภมเหมาะสมอยท 50 องศาเซลเซยส คา กรด-ดาง ทเหมาะสมเทากบ 6.8 และ 8.4

9

บทท 3 เครองมอทใชในการวจยและวธการทดลอง

3.1 อปกรณ เครองมอ และสารเคมทใช 3.1.1 อปกรณและเครองมอหลกทใชในงานวจย 3.1.1.1 คอลมน β - Cyclodextrin sepharose 6B 3.1.1.2 ชดทดสอบ โปรตน

3.1.1.3 ชดเครองมอ Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electropharesis (SDS-PAGE Mighty Small II SE 250/SE 260,Hofer Scientific Instruments Ltd.,USA)และเครอง power supply ส าหรบใหกระแสไฟฟา(Bucher Instrument)

3.1.1.4 เครองวดการดดกลนคลนแสง (UV-visible spectrophotometer, Shimadzu Model UV-160A, Japan)

3.1.1.5 เครองปนแยกดวยแรงเหวยงสงทควบคมอณหภมได(superspeed refrigerated centrifuge)

3.1.1.6 Micropipette 3.1.1.7 เครองตรวจวดคา pH ของสารละลาย(pH meter, Hanna instruments,

Singapore) 3.1.1.8 เครองผสมสารละลาย(Vortex mixer ;Vortex-genie 2, Scientific

Industries Inc., USA) 3.1.1.9 เครองกวนสารละลาย(Stirrer ;Stuart Scientific) 3.1.1.10 เครองชงอเลกทรอนกส (2 และ 4 ต าแหนง, Sartorius, Germany) 3.1.1.11 อางน ารอนพรอมเครองควบคมอณหภม (Water bath) 3.1.1.12 อปกรณและเครองมอพนฐานทใชในหองปฏบตการ(ภาคผนวก ก) 3.1.2 สารเคมทจ าเปนในการทดลอง

3.1.2.1 AZCL-Amylose, RED -STARCH (Magazyme,Ireland)

10

3.1.2.2 Crude alpha-amylase 3.1.2.3 Agar (Difco Laboratories) 3.1.2.4 Bovine serum albumin (Sigma Chemical Co.,) 3.1.2.5 Bromphenol Blue(Sigma Chemical Co.,) 3.1.2.6 β - Cyclodextrin sepharose 6B 3.1.2.7 Folin-Ciocalteu’s reagent (Sigma Chemical Co.,) 3.1.2.8 Sodium dodecyl sulfate (Sigma Chemical Co.,) 3.1.2.9 N,N,N',N'-tetramethyethylenediamine (TEMED)(Phamacia

Biotechnology) 3.1.2.10 สารละลายโปรตนมาตรฐาน ( Standard Protein ส าหรบ SDS-PAGE) 3.1.2.11 สารเคมพนฐานทใชในหองปฏบตการ (ภาคผนวก ก) 3.2 การคดเลอกแหลงของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส 3.2.1 วตถดบทใชในการทดลอง แหลงของวตถดบทน ามาใชในการคดเลอกเอนไซม ตวอยางจ าพวกผลไม จ านวน 89 ตวอยาง ดงแสดงในตารางท 3.1 โดยสวนทน ามาใชในการทดสอบจะใชสวนเนอทกนได ตวอยางทใชในการทดลองจะซอจากตลาดสด หรอ ซปเปอรมาเกต และแหลงอนๆ ตารางท 3.1 ตวอยางผลไมชนดตางๆและสวนทใชในการทดลอง

ล าดบท ตวอยาง สวนทใช

1. มะมวงโชคอนนต เนอ 2. มะมวงแกวลมรง เนอ 3. มะมวงน าดอกไม เนอ 4. มะมวงอกรอง เนอ 5. มะละกอ(ฮอลแลนด) เนอ 6. สบปะรด เนอ

11

ตารางท 3.1(ตอ) 7. ละมด เนอ 8. องนแดง เนอ 9. แอปเปลแดง เนอ 10. แอปเปลเขยว เนอ 11. แกวมงกรแดง เนอ 12. สาล เนอ 13. ลกไหน เนอ 14. ล าใย เนอ 15. ชมภแดง เนอ 16. ลองกอง เนอ 17. สมสายน าผง เนอ 18. แอปเปลฟจ เนอ 19. มะไฟ เนอ 20. องนเขยว เนอ 21. องนเขยวไรเมลด เนอ 22. องนด าไรเมลด เนอ 23. สมโอขาวน าผง เนอ 24. เงาะ เนอ 25. มงคด เนอ 26. สมเขยวหวาน เนอ 27. ลกเกดด า(สกแหง) เนอ 28. ลกเกดเขยว(สกแหง) เนอ 29. อนทผลม(สกแหง) เนอ 30. เมลอน เนอ 31. แตงโมกนร(แดง) เนอ 32. แตงโมเหลอง เนอ 33. กลวยน าวา เนอ 34. กลวยไข เนอ

12

ตารางท 3.1(ตอ) 35. กลวยหอม เนอ 36. ทเรยนหมอนทอง เนอ 37. ขนน เนอ 38. แตงโมตอปโด เนอ 39. มะมวงมหาชนก เนอ 40. ทวายเดอนเกา เนอ 41. ทเรยนชะนไข เนอ 42. ทบทมสยาม เนอ 43. สาลหอม เนอ 44. สมซนคส เนอ 45. มะมวงอารทอท เนอ 46. แอปเปลฟจ เนอ 47. แคนตาลปสทอง เนอ 48. แตงไทย เนอ 49. มะเฟองหวาน เนอ 50. แตงเมลอน (พอทออเรน) เนอ 51. ลกพลบ เนอ 52. สมเชง เนอ 53. แอปเปลทอง เนอ 54. ลกไหนแดง เนอ 55. สละเนนวงศ เนอ 56. นอยหนาเพช (ปากชอง) เนอ 57. กวเขยว เนอ 58. กวทอง เนอ 59. มะขามหวาน เนอ 60. สตรอเบอร เนอ 61. ทเรยนกานยาว เนอ 62. ขนนชมพ เนอ

13

ตารางท 3.1(ตอ) 63. มะยงชด เนอ 64. เชอร เนอ 65. กะทอน เนอ 66. สบปะรดภแล เนอ 67. มะขามเทศ เนอ 68. ขาวโพดหวาน เนอ 69. ขาวโพดขาวเหนยว เนอ 70. เงาะนาสาร เนอ 71. น ามะพราว น า 72. เนอมะพราว เนอ 73. ออย น า 74. เนอลกตาล เนอ 75. ลนจ เนอ 76. สาเก เนอ 77. เมดบว เนอ 78. พชเออลแกรนด เนอ 79. พลม-กฟรบ เนอ 80. มะละกอแขกด า เนอ 81. กลวยเลบมอนาง เนอ 82. มะมวงสามฤด เนอ 83. สบปะรด(ศรราชา) เนอ 84. สบปะรด(ภเกต) เนอ 85. แกวมงกร(สขาว) เนอ 86. เสาวรส เนอ 87. พทรา เนอ 88. ตะลงปง เนอ 89. มะยม เนอ

14

3.2.2 การคดเลอกแหลงของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส ท าการคดเลอกแหลงของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส จากผลไมโดยน าตวอยางผลไมชนดตางๆ มาสกดเอนไซมดวย sodium acetate buffer กรด-เบส 5.5 ในอตราสวน 1:1 น าตวอยางบดใหละเอยดดวยเครองปนน าผลไม กรองเอากากทง จะไดสวนใส หรอ crude enzyme จากนนน า crude enzyme ทไดมาทดสอบประสทธภาพการยอยคารโบไฮเดรต บน AZCL-amylose plate ดวยเทคนค agar plate diffusion สงเกต blue zone ทเกดขน

3.2.2.1 การทดสอบแอกตวตบน AZCL-amylose plate เตรยมสารละลายวนใหมความเขมขนรอยละ 1.5 (w/v) ใน sodium acetate buffer กรด-เบส 5.5 จากนนน าไปตมเดอดน ามาเตมซบสเตรต AZCL – amylose ความเขมขนรอยละ 0.1 คนให AZCL – amylose กระจายทวสารละลาย เทใสจานเลยงเชอปรมาตร 25 มลลลตร เพอใหมความหนาของวนเทากนทกจานทงใหวนแขงตวจากนนเจาะวนใหเปนหลม เสนผาศนย กลาง 6 มลลเมตร น า Crude enzyme ทสกดไดมาหยดในหลมๆ ละ 70 ไมโครลตร (รปท 3.1) น าไปบมทอณหภม 35 องศาเซลเซยส ตรวจผลการทดลองโดยดการเกด blue zone ทก 30 นาท (รชน และคณะ, 2552) ในการทดลองจะใช crude α-amylase ทไดจากเชอรา ( Aspergillus oryzae) เปน positive control และใชสารละลาย sodium acetate buffer กรด-เบส 5.5 เปน negative control

รปท 3.1 การหยดสารสกดเอนไซมจากตวอยางชนดตางๆบน AZCL-amylose plate

15

3.3 การตรวจสอบชนดของเอนไซมแอลฟา อะไมเลสและการเตรยมเอนไซมสกดอยาง หยาบ

จากผลการคดเลอกแหลงของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส พบวามตวอยางทนาสนใจทจะน ามาศกษาตอหลายตวอยางคอ สมเขยวหวาน มะมวงอารทอท ขาวโพดขาวเหนยว มะมวงมหาชนก เชอร มะมวงอกรอง มะมวงแกวลมรงและมะมวงน าดอกไม มะมวงเปนผลไมทคนรจกและเปนทนยมบรโภคอยไมนอย และพอทจะหามาท าการทดลองไดอยางตอเนองตามฤดกาลทมอกทงอยในกลมผลไมทมแอคตวตสง โดยดจากเสนผาศนยกลางของ blue zone ใน agar plate diffusion ดงนน มะมวงอกรอง (Ok-rong Mango ; Mangifera indica L.) และมะมวงน าดอกไม (Namdogmai Mango ; Mangifera indica L.) ผ วจยจะน าไปคดเลอกเปนแหลงเอนไซมเพอท าการศกษาตอในการแยกเอนไซมใหบรสทธโดยวธแอฟฟนตโครมาโตกราฟ และศกษาลกษณะ เฉพาะของเอนไซมแอลฟา อะไมเลสตอไป เหตผลทผ วจยไดเลอกมะมวงน าดอกไมเนองจากมะมวงน าดอกไมเปนผลไมเศรษฐกจทส าคญและมปรมาณมาก มวตถดบใชตลอดปและเปนการสรางมลคาเพมและองคความรใหกบผลไมชนดน และไดเลอกมะมวงอกรองเพราะวาเปนผลไมทใหผลบวก(++++)เพอเปนการเปรยบเทยบกน จะเหนไดวามผลไมหลายชนดทใหผลบวก (++++)แตเลอกมาสองชนดกอน หลงจากนนจงจะท าการคดหาผลไมชนดทเหลออกตอไป การเตรยมเอนไซมสกดอยางหยาบ ท าการคดแยกเอนไซมแอลฟา อะมยเลสจากผลไมโดยน าตวอยางมะมวงน าดอกไมสกบดใหละเอยดดวยเครองปนน าผลไมกรองเอากากทงดวยผาขาวบางจะไดสวนทเปนเอนไซมสกดอยางหยาบ หรอ crude enzyme จากนนน า crude enzyme มาสกดดวยสารละลายเอทานอล 95 % ในอตราสวน 1:3 โดยกวนใหเขากนเปนเวลา 2 ชวโมง ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส หลงจากนนน าไปปนเหวยงความเรว 6,000 รอบตอนาทเปนเวลา 30 นาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส หลงจากนนน าตะกอนทไดไปอบใหแหงทอณหภม 35 องศาเซลเซยส 3.4 การแยกเอนไซมแอลฟา อะไมเลสโดยวธ affinity chromatography การเตรยม Epoxy activated sepharose 6B น าสาร Epoxy activated sepharose 6B จ านวน 15 กรม มาท าใหอมตวโดยแชในน ากลนและลางหลายๆครงประมาณ 1 ชวโมง จากนนเตรยม Coupling ลแกนด โดยใชสาร β - cyclodextrin จ านวน 25 กรม ความเขมขน 200 ไมโครโมล มาผสมกบน ากลน โดยปรบความเปนกรด-เบส ใหอยในชวง 9-13 น าลแกนดกบมเดยมผสมเขาดวยกนใน stoppered vessel เขยา

16

เบาๆในอางน าประมาณ 16 ชวโมงทอณหภม 20-40 องศาเซลเซยส ลางลแกนดสวนเกนออกโดยใชสารละลาย coupling บฟเฟอร ปรมาตร 400 มลลลตร แลวท าการ Blocking โดยน ามารวมกบสารละลาย ethanolamine ความเขมขน 1 โมลาร ความเปนกรด-เบส 8.0 อยางนอย 4 ชวโมง หรอขามคนทอณหภม 40-50 องศาเซลเซยส ตอจากนท าการลางอยางนอย 3 ครง ดวยการลางสลบคากรด-เบส กอนน าไปเทลงในคอลมนขนาด 30 x 2.5 เซนตเมตร และ equilibrated ดวยสารละลาย sodium acetate บฟเฟอร ความเขมขน 0.1 โมลาร ความเปนกรด-เบส 5.5 เตรยมพรอมใชงาน น าเอนไซมสกดอยางหยาบ (crude enzyme) ความเขมขน 10-3 กรมตอมลลลตร จ านวน 30 มลลลตร ใสลงในคอลมนทงไวประมาณ 30 นาท แลวชะคอลมนดวยสารละลาย sodium acetate บฟเฟอร ความเขมขน 0.1 โมลาร ความเปนกรด-เบส เทากบ 5.5 จนกระทงไมมโปรตนถกชะออกมา จากนนชะคอลมนดวยสารละลาย KCl-HCl บฟเฟอรความเขมขน 0.1 โมลาร ความเปนกรด-เบส เทากบ 2.0 เกบสารทถกชะออกมาในหลอดๆละ 10 มลลลตร วดคาการดดกลนแสงท 280 นาโนเมตร น ามาเขยนกราฟระหวางจ านวนหลอดทดลอง 3.5 การทดสอบความบรสทธดวย Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel

electrophoresis (SDS-PAGE) Laemmli (1970) ประกอบชดเจลอเลกโตรโฟรซส เปดกระแสไฟฟาท 160 โวลต น าตวอยางโปรตนทตองการทดสอบความบรสทธและหาน าหนกโมเลกลมาตมในอางน าเดอด ทอณหภม 100 องศาเซลเซยส นาน 3 นาท ทงใหเยนลงแลวแบงมา 28 ไมโครลตรผสมกบสยอม bromophenol blue ปรมาณ 7 ไมโครลตร เตมลงในชองวางส าหรบใสตวอยางโปรตนบรเวณสวนบนของ stacking gel โดยท าพรอมกบโปรตนมาตรฐานททราบน าหนกโมเลกล ปลอยใหตวอยางโปรตนเคลอนทไปภายในเจล จนเหนสของ bromophenol blue เคลอนทลงไปจนสดขอบลางของเจล น าเจลและแมพมพออกจากชดทดสอบ น าเจลทไดไป Fix ดวย fixing solution ประมาณ 30 นาท แลวยอมดวยสยอม Coomassie Billiant Blue R-250 จะตดสน าเงน หรอยอมดวย silver stain จะตดสน าตาลเขม นานประมาณ 10 นาท ลางสสวนเกนออกดวยน าแลวแชเจลตอใน Destaining solution ท า 2-3 ครงๆละประมาณ 10 นาท จนกระทงสวนทเปน background ใส (ภาคผนวก ข) 3.6 การตรวจสอบปรมาณโปรตนโดยวธ Lowry (1951) น าสารตวอยางปรมาตร 1.0 มลลลตร เตมสารละลายผสมระหวางโซเดยมคารบอ เนต ในสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด ความเขมขน 0.1 นอรมอล และคอปเปอรซลเฟต 0.5 กรม

17

ในสารละลายโพแทสเซยม โซเดยมตราเตรท รอยละ 1 ในอตราสวน 50:1 ปรมาตร 5.0 มลลลตร ผสมใหเขากนตงทงไว 10 นาท เตม Folin-ciocalteu reagent ปรมาตร 0.5 มลลลตร ผสมใหเขากนตงทงไว 30 นาท น าไปวดคาการดดกลนคลนแสงทความยาวคลน 660 นาโนเมตร โดยใช bovine serum albumin (BSA) เปนโปรตนมาตรฐาน (ภาคผนวก ข) 3.7 การตรวจสอบแอกตวตของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส Megazyme (2006) 3.7.1 การตรวจสอบแอกตวตของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส Megazyme (2006)ทมคาความเปนกรด-เบส 2-12 เตรยมสารละลายบฟเฟอรความเปนกรด-เบส 5.4 โดยน า Malic acid จ านวน 134.1 กรม และ Sodium hydroxide จ านวน 70 กรม ผสมใหเขากนโดยใชน ากลนเปนตวท าละลายใหไดปรมาตร 800 มลลลตร รอใหอณหภมของสารละลายลดลงทอณหภมหองกอนน า Calcium chloride.2H2O จ านวน 5.9 กรม ผสมลงไปและปรบคาความเปนกรด-เบส ใหไดคา 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11และ12 ตอจากนนผสม Sodium azide เขมขน 0.1% แลวปรบใหสารละลายมปรมาตรทงหมดเปน 1 ลตร เกบไวทอณภมหอง

เตรยมสารละลาย RED-STARCH โดยน า Red-Starch จ านวน 1 กรม และ Potassium chloride ความเขมขน 0.5 โมลาร จ านวน 50 มลลลตร ผสมใหเขากนในบกเกอร ทอณหภม 60 องศาเซลเซยส ประมาณ 10 นาท จากนนเกบสารไวทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เรมท าการตรวจสอบโดยน าสารละลาย Red-Starch ใสลงในหลอดทดลอง 0.5 มลลลตร ปรบใหไดอณหภมเปน 40 องศาเซลเซยส ประมาณ 5 นาทกอน และสารละลายบฟเฟอรทใชกปรบอณหภมเปน 40 องศาเซลเซยส ประมาณ 5 นาทเชนเดยวกน น าเอนไซมแอลฟา อะไมเลส จากการสกดแบบหยาบและสารตวอยางจากการท าโครมาโตรกราฟ จ านวน 1 มลลลตร เตมลงในหลอดทดลองทมสารละลาย Red-Starchอย ผสมใหเขากน บมไวทอณหภมเปน 40 องศาเซลเซยส ประมาณ 10 นาท หลงจากนนหลงจากนนเตมสารละลายเอทานอลลงไปอก 2.5 มลลลตร ผสมใหเขากนดวย vortex เปนเวลา 10 วนาท ทงไวทอณหภมหองประมาณ 10 นาท แลวน าไปปนแยกดวยเครองเซนตรฟวสทมความเรว 1000 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท จากนนน าสารละลายสวนบนไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 510 นาโนเมตร ดวยเครองสเปคโตรโฟโตมเตอร จากนนน าคาทไดมาค านวณคากจกรรมของเอนไซม (ภาคผนวก ข) 3.7.2 การตรวจสอบแอกตวตของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส Megazyme (2006)ทมคาอณหภม 25 - 85 องศาเซลเซยส

18

เตรยมสารละลายบฟเฟอรความเปนกรด-เบส 5.4 โดยน า Malic acid จ านวน 134.1 กรม และ Sodium hydroxide จ านวน 70 กรมผสมใหเขากนโดยใชน ากลนเปนตวท าละลายใหไดปรมาตร 800 มลลลตร รอใหอณหภมของสารละลายลดลงทอณหภมหองกอนน า Calcium chloride.2H2O จ านวน 5.9 กรม ผสมลงไปและปรบคาความเปนกรด-เบส ใหไดคา 5.4 ตอจากนนผสม Sodium azideเขมขน 0.1% แลวปรบใหสารละลายมปรมาตรทงหมดเปน 1 ลตร เกบไวทอณภมหอง เตรยมสารละลาย Red-Starch โดยน า Red-Starch จ านวน 1 กรม และ Potassium chloride ความเขมขน 0.5 โมลาร จ านวน 50 มลลลตร ผสมใหเขากนในบกเกอร ทอณหภม 60 องศาเซลเซยส ประมาณ 10 นาท จากนนเกบสารไวทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เรมท าการตรวจสอบโดยน าสารละลาย Red-Starch ใสลงในหลอดทดลอง 0.5 มลลลตร ปรบใหไดอณหภมเปน 40 องศาเซลเซยส ประมาณ 5 นาทกอน และสารละลายบฟเฟอรทใชกปรบอณหภมเปน 40 องศาเซลเซยส ประมาณ 5 นาทเชนเดยวกน น าเอนไซมแอลฟา อะไมเลส จากการสกดแบบหยาบและสารตวอยางจากการท าโครมาโตร กราฟ จ านวน 1 มลลลตร เตมลงในหลอดทดลองทมสารละลาย Red-Starch อย ผสมใหเขากน บมไวทอณหภม 25, 35, 45, 55, 65, 75และ85 องศาเซลเซยส ประมาณ 10 นาท หลงจากนนหลงจากนนเตมสารละลายเอทานอลลงไปอก 2.5 มลลลตร ผสมใหเขากนดวย vortex เปนเวลา 10 วนาท ทงไวทอณหภมหองประมาณ 10 นาท แลวน าไปปนแยกดวยเครองเซนตรฟวสทมความเรว 1000 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท จากนนน าสารละลายสวนบนไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 510 นาโนเมตร ดวยเครองสเปคโตรโฟโตมเตอร จากนนน าคาทไดมาค านวณคากจกรรมของเอนไซม

19

บทท 4 ผลการทดลอง

4.1 ผลการคดเลอกแหลงของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส จากการน าตวอยางผลไมจ านวน 89 ตวอยางมาตรวจสอบประสทธภาพการยอยคารโบไฮเดรต บน AZCL-amylose พบวาตวอยางจากผลไมสก ทใหผลบวก เกด blue zone ขนบรเวณรอบๆหลมทหยดตวอยาง(รปท 4.1B) จ านวน 45 ตวอยาง(ตารางท 4.1) การเกด blue zone สามารถสงเกตไดอยางชดเจนเนองจากใชซบสเตรตจ าเพาะคอ AZCL-amylose(Azurine-Crosslinked-amylose), (Megazyme, Ireland) โดยเตรยมจากส Azurine จบกบ amylose หรอ polysaccharide ชนดอนๆ ซงจะเปน insoluble substrate และเปนซบสเตรตทมความจ าเพาะตอเอนไซมแอลฟา อะไมเลส เมอท าการทดสอบความสามารถในการไฮโดรไลซคารโบไฮเดรต พบวาถาในตวอยางทน ามาศกษามเอนไซมแอลฟา อะไมเลส จะไฮโดรไลซคารโบฮยเดรตท าใหปลดปลอยสน าเงนออกมา เปน blue zone ดงแสดงใน (รปท 4.1 A,B 4.2 A,B) ซงมความกวาง ความเรวในการเกดปฏกรยาตางกนแปรตามปรมาณของเอนไซมทมอยในผลไม

A B รปท 4.1 AZCL-amylose agar plate : A คอ AZCL-amylose plate กอนท าการทดสอบความสามารถในการยอยคารโบไฮเดรต, B คอ AZCL-amylose plate หลงท าการทดสอบ จะเกด blue zone ขนรอบๆหลม มะมวงอกรอง(Ok-rong Mango ; Mangifera indica L.)

20

A B รปท 4.2 blue zone ทเกดจากการยอยคารโบไฮเดรทบน AZCL-amylose plate A; บมทงไว: 5 ชวโมง 35 องศาเซลเซยส B; บมทงไว: 24 ชวโมง 35 องศาเซลเซยส ของมะมวงอกรอง (Ok-rong Mango ; Mangifera indica L.) ตารางท 4.1 ผลการคดเลอกแหลงของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส จากตวอยางผลไม 89 ตวอยาง

ล าดบท ตวอยาง ผลการทดสอบ

1 Sodium acetate buffer pH 5.5 - 2 ล าไย + 3 ชมพแดง + 4 สบปะรด ++ 5 องนแดง ++ 6 สมสายน าผง ++ 7 องนเขยว(ไรเมลด) ++ 8 สมโอขาวน าผง ++ 9 อนทผลม(สกแหง) ++ 10 ขนน ++ 11 มะมวงน าดอกไม ++ 12 สาลหอม ++ 13 ลกพลบ ++ 14 มะยงชด ++

21

ตารางท 4.1 (ตอ) 15 มะขามเทศ ++ 16 เงาะนาสาร ++ 17 ออย ++ 18 เนอลกตาล ++ 19 สาเก ++ 20 พชเออลแกรนด ++ 21 สบปะรด(ศรราชา) ++ 22 สบปะรด(ภเกต) ++ 23 มะมวงโชคอนนต ++ 24 ทเรยนชะนไข +++ 25 มะละกอฮอลแลนด +++ 26 ละมด +++ 27 แกวมงกร(เนอแดง) +++ 28 กลวยน าวา +++ 29 ทเรยนหมอนทอง +++ 30 มะมวงทวายเดอนเกา +++ 31 สมซนคส +++ 32 สมเชง +++ 33 แอปเปลทอง +++ 34 ทเรยนกานยาว +++ 35 ขาวโพดหวาน +++ 36 มะละกอแขกด า +++ 37 กลวยเลบมอนาง +++ 38 มะมวงสามฤด +++ 39 แกวมงกร(เนอขาว) +++ 40 มะมวงแกวลมรง ++++ 41 มะมวงอกรอง ++++ 42 สมเขยวหวาน ++++

22

ตารางท 4.1 (ตอ) 43 มะมวงมหาชนก ++++ 44 มะมวงอารทอท ++++ 45 เชอร ++++ 46 ขาวโพดขาวเหนยว ++++ 47 crude alpha amylase ++++ หมายเหต + หมายถงผลบวกบน AZCL-amylose plate เกด blue zone - หมายถงผลลบบน AZCL-amylose plate ไมเกด blue zone + หมายถง blue zone ทมความกวางนอยกวา 10 มลลเมตร ++ หมายถง blue zone ทมความกวางเทากบ 10-15 มลลเมตร +++ หมายถง blue zone ทมความกวางเทากบ 15-20 มลลเมตร ++++ หมายถง blue zone ทมความกวางมากกวา 20 มลลเมตร Sodium acetate buffer pH 5.5 negative control Crude α- amylase positive control จากการน าตวอยางผลไม 89 ตวอยางมาคดเลอกแหลงของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส พบวาตวอยางจากผลไมใหผลบวก จ านวน 45 ตวอยาง โดยแบงออกเปน 4 กลม กลมท 1(+)ม 2 ตวอยาง ไดแก ล าไย และชมพแดง กลมท 2(++)ม 19 ตวอยาง ตวอยางทให blue zone คอนขางกวางไดแก สมสายน าผง องนเขยวไรเมลด อนทผลม ออย สาเก ขนน มะมวงน าดอกไม กลมท 3(+++)ม 17 ตวอยาง ตวอยางทให blue zone คอนขางกวางไดแก ละมด สมซนคส สมเชง มะมวงสามฤด มะมวงทวายเดอนเกา มะมวงโชคอนนต แกวมงกร(ขาว แดง) ขาวโพดหวาน ทเรยนชะนไข ทเรยนกานยาว แอบเปลสทอง และกลมท 4(++++)ม 7 ตวอยางไดแก สมเขยวหวาน มะมวงอทอารท ขาวโพดขาวเหนยว มะมวงมหาชนก เชอร มะมวงอกรอง และมะมวงแกวลมรง ในกลมท4 นพบวามแอคตวตของ crude enzyme อยสงทสด สงเกตจาก blue zone ทกวาง

23

4.3 ผลการแยกเอนไซมแอลฟา อะไมเลสโดยวธ affinity chromatography การท าใหบรสทธบางสวนของเอนไซมแอลฟา อะมยเลส จากมะมวงน าดอกไม(Namdogmai mango, Mangifera indica L.)และมะมวงอกรอง(Ok-rong Mango ; Mangifera indica L.) โดยการสกดอยางหยาบถกแยกออกโดยวธท าใหตกตะกอนกบสารละลายเอทานอล 95 เปอรเซนต น าเอนไซมสวนทไดจากการตกตะกอนนผานคอลมน β-cyclodextrin Sepharose 6B โดยใชสารละลาย KCl-HCl บฟเฟอรความเขมขน 0.1 โมลาร ความเปนกรด-เบส เทากบ 2.0 เปนตวชะเอนไซมแอลฟา อะไมเลส (รปท 4.3.1 , 4.3.2) ปรบสารละลายเอนไซมแอลฟา อะไมเลส ใหมความเขมขนขนโดยการใชอลตราเมมเบรนฟลเตรชนทมการคดกรองน าหนกโมเลกล 3 กโลดาลตน พบวามะมวงน าดอกไมแอกตวตเฉพาะของเอนไซมมคาเทากบ 125 ยนตตอมลลกรม และมความบรสทธอยท 6.89 เทา ดงแสดงใน (ตารางท 4.3.1) มะมวงอกรองแอกตวตเฉพาะของเอนไซมมคาเทากบ 33.33 ยนตตอมลลกรม และมความบรสทธอยท 9.25 เทา ดงแสดงใน (ตารางท 4.3.2)

24

ตารางท 4.3.1 แสดงล าดบการคดแยกใหบรสทธของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส จากมะมวงน าดอกไม (Namdogmai Mango ; Mangifera indica L.) โดยวธแอฟฟนต โครมาโตกราฟฟ

Purification Steps

Volume Total activity Total protein Specific activity Yield Purification (ml) (Units/ml) (mg) (U/mg) % fold

Crude extract Affinity chromatography

400 37.5 2.068 18.13 100 1 4 3.75 0.03 125 10 6.89

รปท 4.3.1 การแยกใหบรสทธของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส โดยการน าเอาเอนไซมสกดอยางหยาบทไดจากมะมวงน าดอกไมมาแยกในคอลมนทม β-cyclodextrin Sepharose 6B โดยใชสารละลาย KCl-HCl บฟเฟอรความเขมขน 0.1 โมลาร ความเปนกรด-เบส เทากบ 2.0 เปนตวชะเอนไซมแอลฟา อะไมเลส

Fraction number

0 5 10 15 20 25

Ab

sorb

an

ce a

t

28

0n

m

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

pH 2

Absorbance at 280 nm

Fraction number

Abso

rban

ce a

t 280

nm

25

ตารางท 4.3.2 แสดงล าดบการคดแยกใหบรสทธของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส จากมะมวงอกรอง(Ok-rong Mango ; Mangifera indica L.)โดยวธแอฟฟนต โครมาโตกราฟฟ

Purification Steps

Volume Total activity Total protein Specific activity Yield Purification (ml) (Units/ml) (mg) (U/mg) % fold

Crude extract Affinity chromatography

500 40 11.1 3.60 100 1 20 5 0.15 33.33 4 9.25

Fraction number รปท 4.3.2 การแยกใหบรสทธของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส โดยการน าเอาเอนไซมสกดอยางหยาบทไดจากมะมวงอกรองมาแยกในคอลมนทม β-cyclodextrin Sepharose 6B โดยใชสารละลาย KCl-HCl บฟเฟอรความเขมขน 0.1 โมลาร ความเปนกรด-เบส เทากบ 2.0 เปนตวชะเอนไซมแอลฟา อะไมเลส

pH 2

Abso

rban

ce a

t 280

nm

26

4.4 ผลการตรวจสอบความบรสทธของเอนไซมแอลฟา อะไมเลสโดยวธ SDS-PAGE จากผลทดลองโดยการท า SDS-PAGE จากมะมวงน าดอกไม พบแถบโปรตนเอนไซมอะไมเลสบนเจล มน าหนกโมเลกลของโปรตนอยในชวงระหวาง 10.5-14, 22-29, 30-35 กโลดาลตน ดงแสดงใน (รป 4.4.1 A และ รป 4.4.1 B) และจากมะมวงอกรอง พบแถบโปรตนเอนไซมอะไมเลสบนเจล มน าหนกโมเลกลของโปรตนอยในชวงระหวาง 10.5-14, 22-29, 30-35 กโลดาลตน ดงแสดงใน รป 4.4.2 kDa A B C D E kDa A B

A B รปท 4.4.1 ผลทดลองการท า SDS-PAGE จากมะมวงน าดอกไม (Namdogmai Mango ; Mangifera indica L.) A Lane (A) แสดง Molecular weight standard protein (B-E) แสดงโปรตนจาก crude enzyme B Lane (A) Molecular weight standard protein, Lane (B) α-amylase purified by affinity chromatography

14 10.5

29

22

51

175

130

62

70

95

29

42

14

10.5

175

130

95

70

62

51

22

42

27

kDa A B C D

รปท 4.4.2 ผลทดลองการท า SDS-PAGE จากมะมวงอกรอง (Ok-rong Mango ; Mangifera indica L.) Lane (A) แสดง Molecular weight standard protein Lane (B-D) โปรตนทความเขมขนตางๆ (crude : B 4x, C 2x, D 1x) น าหนกโมเลกลของโปรตนอยในชวงระหวาง 10.5-14, 27-39, 42-51 กโลดาลตน เมอเปรยบเทยบกบแถบมาตรฐาน(A) จากผลทดลองโดยการท า SDS-PAGE จากมะมวงน าดอกไมและมะมวงอกรองเปรยบเทยบกน พบแถบโปรตนเอนไซมอะไมเลสบนเจล มน าหนกโมเลกลของโปรตนอยในชวงระหวาง 42-51 กโลดาลตน ดงแสดงใน (รป 4.4.3)

14 10.5

42

29

51

175

130

62

70

95

22

28

kDa A B C D E F G

รปท 4.4.3 ผลทดลองการท า SDS-PAGE Lane (A) แสดง Molecular weight standard protein Lane (B) แสดง โปรตนจาก crude enzyme Lane (C,D) α-amylase purified by affinity chromatography จากมะมวงน าดอกไม (Namdogmai Mango ; Mangifera indica L.) Lane (E) แสดง โปรตนจาก crude enzyme Lane (F,G) α-amylase purified by affinity chromatography จากมะมวงอกรอง (Ok-rong Mango ; Mangifera indica L.) 4.5 การตรวจสอบปรมาณโปรตนโดยวธ Lowry (1951) ผลการทดลองพบโปรตนทไดจากเอนไซมสกดอยางหยาบของมะมวงน าดอกไมและมะมวงอกรองทงหมดมคา 2.068 และ 1.11 มลลกรม ดตารางท 4.3.1 และ 4.3.2 ตามล าดบ(ภาคผนวก ข) 4.6 การตรวจสอบแอกตวตของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส Megazyme (2006) การตรวจสอบแอกตวตของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส ของมะมวงน าดอกไมและมะมวงอกรอง ทมคาความเปนกรดเบส เปน 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11และ12 อณหภม เปน 25, 35, 45, 55 65, 75 และ85 องศาเซลเซยส เมอวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 510 นาโนเมตรไดผลทดลองเปนดงน รปท 4.6.1, 4.6.2, 4.6.3 และ 4.6.4

51 42

130

175

95

70

62

14 10.5

29 22

29

pH

รปท 4.6.1 แสดงผลการการตรวจสอบแอกตวตของเอนไซมแอลฟา อะไมเลสของมะมวงน าดอกไมทมคาความเปนกรดเบส เปน 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, และ12

pH รปท 4.6.2 แสดงผลการการตรวจสอบแอกตวตของเอนไซมแอลฟา อะไมเลสของมะมวงอกรองทมคาความเปนกรดเบส เปน 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11และ12

Activ

ity (U

/ml)

Activ

ity (U

/ml)

30

Temperature ( º c ) รปท 4.6.3 แสดงผลการการตรวจสอบแอกตวตของเอนไซมแอลฟา อะไมเลสของมะมวงน าดอกไมทมคาอณหภม เปน 25, 35, 45, 65 และ 85 องศาเซลเซยส

Temperature ( º c ) รปท 4.6.4 แสดงผลการการตรวจสอบแอกตวตของเอนไซมแอลฟา อะไมเลสของมะมวงอกรองทมคาอณหภม เปน 25, 35, 65, 75 และ 85 องศาเซลเซยส

Activ

ity( U

/ml)

Activ

ity (

U/ml

)

31

บทท 5

สรปผลการวจย อภปราย และขอเสนอแนะ สรปผลการวจย จากการทดลองสามารถสรปผลการทดลองไดดงน 1. จากการน าตวอยางผลไม 89 ตวอยาง มาคดเลอกแหลงของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส พบวาตวอยางจากผลไมใหผลบวก จ านวน 45 ตวอยาง โดยแบงออกเปน 4 กลม และกลมท 4(++++)ม 7 ตวอยางไดแก สมเขยวหวาน มะมวงอทอารท ขาวโพดขาวเหนยว มะมวงมหาชนก เชอร มะมวงอกรอง และมะมวงแกวลมรง ในกลมท4 พบวามแอกตวตของ crude enzyme อยสงทสด สงเกตจาก blue zone ทกวาง 2. ท าการศกษาแยกเอนไซมแอลฟา อะไมเลส จากมะมวงน าดอกไม โดยวธ แอฟฟนต โครมาโตกราฟฟ พบวาใหปรมาณเอนไซมแอลฟา อะไมเลส มความบรสทธ 6.98 เทา คดเปนรอยละ 10 คาแอกตวตเฉพาะของเอนไซมเทากบ 125 ยนตตอมลลกรม จากมะมวงอกรองมความบรสทธ 9.25 เทา คดเปนรอยละ 4 คาแอกตวตเฉพาะของเอนไซมเทากบ 33.33 ยนตตอมลลกรม ถาวเคราะหด % yield คอนขางนอย ทเปนดงน เนองจาก การท าแอฟฟนตโครมาโตกราฟฟ ligand (β-cyclodextrin Sepharose 6B) ทใชมโครงสรางเปนวงแหวนปดของน าตาลกลโคส อาจท าให binding ของเอนไซมจบไดไมหมด สงผลให % yield ต า แตมขอดคอสามารถแยกเอนไซมแอลฟา อะไมเลสและเบตา อะไมเลส ออกจากกนไดเลยในขนตอนของการแยก เมอน ามาตรวจสอบดน าหนกโมเลกล อยระหวาง 42-51 กโลดาลตน โดยการตรวจวเคราะหจากคา Rf ของโปรตนมาตรฐาน พบวาอยท 49.32 กโลดาลตน ซงไดมผท าการศกษาไว (Yasin และ Chaudhary 1981) ท าการทดลองการท าบรสทธเอนไซม แอลฟา อะไมเลสกบผลมะมวงไดน าหนกโมเลกล 53 กโลดาลตน

32

3. เมอวเคระหดแอกตวตของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส ของมะมวงอกรองและมะมวงน าดอกไมพบวามะมวงน าดอกไม ใหคาแอกตวตเฉพาะของเอนไซมทสงกวา ประมาณ 4เทา 4. การตรวจสอบแอกตวตของเอนไซมแอลฟา อะไมเลส ของมะมวงน าดอกไมและมะมวงอกรอง พบวาเอนไซมของมะมวงทงสองท างานไดดทความเปนกรด-เบส 5 อณหภมเหมาะสมอยในชวง 45-65 องศาเซลเซยส ซงมผ วจยรายงานไว (Mohamed และคณะ 2009, Shaw และคณะ 1995) 5. เอนไซมแอลฟา อะไมเลส ของมะมวงน าดอกไมและมะมวงอกรอง สามารถยอยซบสเตรตสงเคราะห คอ Red Starch ไดด เนองจากวธการทดสอบแอกตวตโดยใช Red Starch เปน substrate จะสะดวกในการตรวจสอบซ าเปน continuous assay แตถาใชวธอนในการวเคราะห มหลายวธแตตองท าปฏกรยากบไอโอดน เชน การใชแปงขาวโพด แปงมนส าปะหลงวธเหลานจะตองท าปฏกรยาหลายขนตอนในการตรวจสอบแอกตวต แตอยางไรกตามในการทดลองตอไป กจะมการเปรยบเทยบชนดของ substrate ในการวดแอกตวต จากการตรวจสอบแอกตวต แสดงวาการแยกเอนไซมแอลฟา อะไมเลส ใหบรสทธโดยวธท าแอฟฟนตโครมาโตกราฟฟสามารถแยกและตรวจสอบเอนไซมไดโดยการท า SDS-PAGE และตรวจสอบแอกตวตตามล าดบขนตอน 6. องคความรใหมของการวจยทไดจากผลการทดลองนสามารถน าไปประยกต ใชในการคดเลอกและสกดแยกใหบรสทธของเอนไซมในผลไมชนดอนๆ ดงตวอยางผลไมทนาใหความสนใจน ามาศกษาตอ เชน มะมวงมหาชนก เชอร มะมวงแกวลมรง หรอผลไมชนดอนทใหความสนใจสวนการประยกตใชเอนไซมแอลฟา อะไมเลส ในอตสาหกรรมนนจะใชจากเชอ จลนทรยจะคมคากวา แตอยางไรกตาม การศกษาเอนไซมแอลฟา อะไมเลส จากผลไม กจะเปนองคความรของเอนไซมจากผลไมซงจะมประโยชนตอไปในอนาคต

33

บรรณานกรม

34

บรรณานกรม Al-Bar, O. A. M. 2009. Screening of α-amylase in the barley hordium vulgare during

germination: Characterization of an α-amylase. Journal of Applied Sciences

Research 5,(11): 2546-2552. Al-Helal, A.A. 1988. Amylase isoenzymes and protein of date palm(Phoenix dactylifera

L.) Botanical Bulletin Academia Sinica 29: 239-244. Annis, 1982. Purification and characterization of α-amylase extracted from Carica

papaya. Pakistan J. Agricultural Research 12: 34–5. Augustin, J., J. Zemek, O. Fassatiova and L. Kuniak. 1981. Production of α-amylase by

microscopic fungi. Folia Microbiology 26: 142–6. Bassinello, P.Z., Cordenunsi,B. R. and Lajolo,F. M. 2002. Amylolytic activity in fruits:

comparison of different substrates and methods using banana as model. J. Agriculture Food Chemistry 50: 5781–6.

Bernfeld, P. 1955. Methods in enzymology 1: 149-158. Bradford, M. 1976. "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding" Analytical

Biochemistry 72,(2): 48-254. Burhan, A., Nisa, U., Gohan C., Ashabil, A., and Osmair, G. 2003. Enzymatic properties

of a novel thermostable thermophilc alkaline and chelator resistant amylase from and alkaphilic bacillus sp. Isolate ANT-6 Process Biochemistry 38: 1397-1403.

Carlsen, M. and Neilsen, J. 2001. Influence of carbon source on α-amylase production by Aspergillus oryzae. Applied microbiology and biotechnology 57,(3): 346 – 349.

35

Davies, J. B. and Cocking, E. C. 1967. Protein synthesis in tomato fruit locule tissue ; The sites of synthesis and the pathway of carbon into protein. Planta 76: 285-303.

El-Safey E. M. and Ammar M. S., 2002. α-amylase production using nile hyacinth under solid-state fermentation (SSF) conditions. Int. Conf. for Develop. and the Envroment In the Arab world march 26-28, 2002, pp. 101-113, Assuit

University Center for Environmental studies, Assiut, Egypt. El-Safey E. M., and Ammar M. S. 2004. Purification and characterization of α-amylase

isolated from Aspergillus falvus var. columnaris. Assuit University Bulletin

Environment Researches. 7,(1): 93-100. Fan May LAY. 1975. Purification and properties of potato alpha amylase. Taiwania 20,(1)

: 71-76. FAO. 2001. Review: Enzyme applications for agro-processing in development countries.

An inventory of current and potential application[On-line]. Available:http://www.FAO. Org,ag/ags/ags.

Fuwa, H. 1954. A new method for microdetermination of amylase activity by the use of amylose as the substrate. Journal of Biochemistry (Tokyo) 41: 583-603.

Gupta, R., Gigras, P., Mohapatra, H., Goswami, VK., Chauhan, B. 2003. Microbial α-amylase : a biotechnological perspective . Process Biochemistry 38: 1599-1616.

Howell, Dr. Edward. 1994. Food Enzyme for Health & Longevity.; Lotus Press: Twin Lakes, Wl.

Horvathova, V., Janecek, S. and Sturdik, E. 2001. Amylolytic enzymes: Molecular aspects of their properties. General Physiology Biophysic 20: 7-32.

Kanwal, B., Zia, M. A., Yasin, M., Rahman, K., and Sheikh, M. A. 2004. Purification and characterization of α-amylase from apple(Malus pumila). International

Journal of Agriculture and Biology 6,(2): 233-236.

36

Laloknam, S., Sirisopana, S., Attaphinyo, P., Poohuarai, S., and Phornphisuttimas, S. 2009. Study of detection of activity from vegetables and fruits. Asian Journal

of Food and Agro-Industry 2,(03): 402-411. Layter, A. and Schramm M. 1962. The glycogen-amylase complex as a means of

obtaining highly purified alpha-amylase. Biochemistry Biophysics. Acta 65:200.

Lowry OH., Rosebrough NJ., Farr A., Land Randall RJ. 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biology Chemistry 193: 265-275.

Megazyme, 2006, Assay of Alpha-amylase Using Red-Starch. Megazyme International

Ireland, Bray Business Park, Bray,Co. Wicklow, Ireland. Mohamed S. A., Abdulrahman, L., Malki-Al., Kumosani, T. A. 2009. Partial purification

and characterization of five α-Amylase from a wheat local variety(Balady) during germination. Australian Journal of basic and Applied sciences 3,(3): 1740-1748.

Nerkar,G.S.,Chaudhari,Y.A. and Khutle, N.M. 2011. Extraction and characterization of α-amylase from Phaseolus aconitifolius . Current Pharma Research 1,(2):115-122.

Nouadri T., Meraihi, Z., Shahrazed D-D., and Leila, B. 2010. Purification and characterization of the α –amylase isolated from Penicillium carmemberti PL21. African Journal of Biochemistry Research 4,(6): 155-162.

Pandey, A., Selvakumar P., Soccol, C. R., Nigam, P. 1999. Solid stated fermentation for the production of industrial enzyme . Current Science 77: 149-162.

Pandey, A., Nigam, P., Soccol, C. R., Soccol,V. T., Singh, D. and Mohan, R. 2000. Advances in microbial amylases. Biotechnology Applied Biochemistry 31:135-152.

Pesis, E., Fuchs, Y. and Zauberman, G. 1978. Starch content and amylase activity in Avocado fruit pulp. Journal America Society Horticultural Science 103(5): 673-676.

37

Pech, J. C. and Latchke, A. 1972. Activities of enzymes involved in sugar metabolism in Passes-Crassane pears during cold storage . Journal of the Science of

Food and Agriculture 23:1499-1502. Rao M. D., Ratnam, B. V., Ramesh, V., and Ayyanna, C. 2005. Rapid method for the

affinity purification of thermostable α-amylase from Bacillus licheniformis. World Journal of Microbiology & Biotechnology 21: 371-375.

Rao Srinivasa, M., Reddy, N.S., Rao Venkateswara, G. and Rao Sambasiva K.R.S. Studies on the extraction and characterization of thermostable α-amylase from pericarp of Borassus indica. African Journal of Biotechnology 4(3):289-291

Sang Kyou Lee., Se Yeon Park., and Chul-Hak Yang. 1994. An Improved method for the purification of α-amylase by affinity chromatography. Korean Biochemistry

Journal 27,(6): 576-578. Shaw J-F., Lin, F-P., Chen, S-C., and Chen, H-C. 1995. Purification and properties of an

extracellular α-amylase from Thermus sp. Botanical Bulletin Academia

Sinica 36: 195-200. Shaw, J. F., Lans, F. P., Chen, S. C., Chen, H. C. 1999. Purification and properties of an

extracellular alpha amylase from Thermos sp. Botanical Bulletin Academia

Sinica 36: 195-299. Souza, P.M., Oliveira M,P. 2010. Aplication of microbial α-amylase in industry . Brazilian

Journal of Microbiology 41: 850-861. Takeuchi, T., Kozu, T., Watanabe, S., Morita, M., Shiratori , K., and Shibata, I. 1978.

Substrate specificity for pancreatic amylase. Journal of Gastroenterology 15,(3): 395 – 400.

Valaparla V. K. 2010. Purification and properties of a thermostable α-amylase by Acremonium sporosulcatum. International Journal of Biotechnology and

Chemistry 6,(1): 25-34.

38

Waner D. A., Grove M. J., and Knutson C. A. 1991. Isolation and characterization of α-amylase from endosperm of germinating maize. Cereal Chemistry 68: 383-390.

Witt Wolfgang and Sauter Jorg J. 1996. Purification and properties of a starch granule-degrading α-amylase from Potato tubers. Journal of Experimental Botany 47,(304): 1789-1795.

Worthington V. 2011. Amylase,Alpha Assay [On-line]. Available: http://www.worthington-biochem.com/AA/assay.html

Xiao Z., Storms R., and Tsang A. 2006. A Quantitative starch-iodine method for alpha amylase and glucoamylase activities. Analytical Biochemistry 351,(1): 146-8.

Yasin, M. Salim and Chaudhary A. H. 1981. Characterization of amylase from mango. Pakistan J. Agricultural Research. 2: 20–3.

ชฎาวฒ เนองนนท, วฒชย จนมลตร, สมปอง ธรรมศรรกษ, และ ศกดา ดาดวง. 2552. การศกษาเอนไซมอะไมเลสในขนนไทย.ภาควชาชวเคมคณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน. 5 หนา.

รชน ไสยประจง, สรพงษ พนจกลาง, กนก รตนะกนกชย. 2552. รายงานการวจยเรองการท าใหบรสทธและลกษณะจ าเพาะของเอนไซมซสเตอน โปรตเนส จากผกและผลไม. 62 หนา

39

ภาคผนวก

40

ภาคผนวก ก 1. สารเคมทจ าเปนในการทดลอง

1. AZCL-Amylose(starch) และ Alpha amylase 2. Acrylamide(Phamacia Biotechnology) 3. Agar (Difco Laboratories) 4. Ammonium sulfate (Carlo Erba) 5. Bovine serum albumin (Sigma Chemical Co.,) 6. Bromphenol Blue(Sigma Chemical Co.,) 7. β -mercaptoethanol 8. Crude alpha-amylase 9. Copper sulphate 10. Coomassie Brilliant Blue G 250 11. β - Cyclodextrin sepharose 6B 12. Dialysis bag (Spectrum Laboratories) 10,000 cut of M.W. 13. Ethylenediaminetetraacetic acid (Fluka Chemical) 14. Ethanolamine 15. Folin-Ciocalteu’s reagent (Sigma Chemical Co.,) 16. Glutadialdehyde 17. Glycerol 18. Glycine (Sigma Chemical Co.,) 19. Phosphate buffer 20. Potassium sodium tartrate(Carlo Erba) 21. Silver nitrate 22. Sodium acetate 23. Sodium carbonate (Merck KGaA) 24. Sodium chloride (Merck KGaA)

41

25. Sodium dodecyl sulfate (Sigma Chemical Co.,) 26. Sodium hydroxide (Carlo Erba) 27. Sodium acetate buffer 28. Sodium Potassium Tartrate Solution 29. Sodium thiosulphate 30. N,N,N',N'-tetramethyethylenediamine (TEMED)(Phamacia Biotechnology) 31. Tris (hydroxymethyl)-aminomethane (Merck KGaA) 32. สารละลายโปรตนมาตรฐาน ( Standard Protein ส าหรบ SDS-PAGE)

42

ภาคผนวก ข การเตรยมสารเคม และวธการทดสอบ 1. การวเคราะหปรมาณโปรตน ตามวธของ Lowry (1951) สารเคม 1. Reagent

Reagent A โซเดยมคารบอนเนต 10 กรมในสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด ความเขมขน 0.1นอรมอล ปรมาตร 500 มลลลตร Reagent B คอปเปอรซลเฟต 0.5 กรม ในสารละลายโพแทสเซยมโซเดยมตราเตรท (รอยละ 1) ปรมาตร 100 มลลลตร

Reagent C ผสม reagent A กบ reagent B ในอตราสวน 50:1 (เมอตองการใชภายใน 1 วน)

2. Folin-ciocalteu reagent น ามาเจอจางดวยน ากลนอตราสวน 1:1 3. bovine serum albumin (BSA) วธทดลอง 1.1 การเตรยมกราฟมาตรฐานของโปรตน เตรยมสารละลาย bovine serum albumin (BSA) ทความเขมขน 0, 50, 100, 200, 250, และ 300 ไมโครกรมตอมลลลตร บรรจในหลอดทดลองหลอดละ 1.0 มลลลตร เตมสารรเอเจนตซหลอดละ 5.0 มลลลตร ผสมใหเขากนทงไวเปนเวลา 10 นาท หลงจากนนเตมสาร โฟลนรเอเจนตลงไปหลอดละ 0.5 มลลลตร ผสมใหเขากนทงไวนาน 30 นาท จากนนน าไป วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 660 นาโนเมตร ดวยเครองสเปคโตรโฟโตมเตอร (Spectrophotometer) สรางกราฟมาตรฐานระหวางคาการดดกลนแสงกบความเขมขนของสารละ ลาย BSA ทความเขมขนตางๆ ดงกลาวขางตน

43

BSA(ไมโครกรม/มลลลตร) รปท 1 กราฟมาตรฐานของโปรตน 1.2 การวเคราะหปรมาณโปรตนของสารละลายตวอยาง

1. น าสารตวอยางปรมาตร 1.0 มลลลตรในหลอดทดลอง 2. เตม Reagent C ปรมาตร 5.0 มลลลตร ผสมใหเขากนตงทงไว 10 นาท 3. เตม Folin-ciocalteu reagent ปรมาตร 0.5 มลลลตร ผสมใหเขากนตงทงไว

30 นาท 4. น าไปวดคาการดดกลนคลนแสงทความยาวคลน 660 นาโนเมตร โดยวดเปรยบเทยบกบ blank ทใชน ากลนแทนสารตวอยาง อานคาความเขมขนของโปรตนจากกราฟมาตรฐาน

2. การเตรยมสารทใชส าหรบทดสอบดวยเทคนค electrophoresis 2.1 SDS-PAGE ชด Electrophoresis ของบรษท Hoefer scientific instruments ประเทศสหรฐอเมรกา สารเคม 1. Seperating gel (รอยละ 12) Acrylamide (รอยละ 30) 5.0 มลลลตร Tris-HCl (1.5 โมลาร pH 8.8) 3.8 มลลลตร SDS (รอยละ 10) 160.0 ไมโครลตร น ากลน 6.0 มลลลตร

คากา

รดดก

ลนแส

ง(66

0 nm

)

44

ไลอากาศ 10 นาท แอมโมเนยมเปอรซลเฟต(รอยละ30) 20.0 ไมโครลตร N,N,N’,N’ -tetramethylenediamine (TEMED) 20.0 ไมโครลตร 2. Stacking gel (รอยละ 5)

Acrylamide (รอยละ 30) 0.825 มลลลตร Tris-HCl (0.5 โมลาร pH 6.8) 0.625 มลลลตร SDS (รอยละ 10) 50.0 ไมโครลตร น ากลน 3.45 มลลลตร แอมโมเนยมเปอรซลเฟต (รอยละ 30) 10.0 ไมโครลตร TEMED 10.0 ไมโครลตร

3. Sample buffer น ากลน 3.8 มลลลตร Tris-HCl (0.5 โมลาร pH 6.8) 1.0 มลลลตร กลเซอรอล 0.8 มลลลตร SDS (รอยละ 10) 1.6 มลลลตร

-mercaptoethanol 0.4 มลลลตร Bromophenol blue 0.4 มลลลตร 4. Electrode buffer เขมขน 5 เทา Tris 45.0 กรม ไกลซน 216.0 กรม SDS 15.0 กรม น ากลน 3.0 ลตร เกบไวทอณหภม 4 องศาเซลเซยส กอนน าไปใชเจอจาง electrode buffer (5X) ปรมาตร 70 มลลลตร ดวยน ากลนใหมปรมาตรเปน 350 มลลลตร 5. ชดสยอม Silver stain kits protein (Amersham Bioscience, Sweden) ประกอบดวย - EDTA-Na2 - Glutadialdehyde 25% - Sodium carbonate

45

- Silver nitrate 2.5% - Sodium acetate - Sodium Thiosulphate 5% 6. สารละลายโปรตนมาตรฐานของบรษท Promega, USA วธทดลอง 1. ยดแมพมพทประกอบดวยแผนกระจกและแผนเซรามคกบแทนเตรยมเจลใหแนน โดยมแผนพลาสตกบางขนาดเลกสอดดานขางระหวางแผนกระจกและแผนเซรามค เพอใหเกดชองวางส าหรบเทเจล 2. ผสม seperating gel (รอยละ 12) เทลงในแมพมพ ใหมพนทสวนบนเหลออยประมาณ 1 นว ปลอยทงไวใหเจลแขงตวทอณหภมหอง 3. ผสม stacking gel (รอยละ 5) เททบลงบน seperating gel ในแมพมพจนสดขอบดานบนของกระจก สอดแผนพลาสตกบางทมลกษณะเปนซฟนลงใน stacking gel ทยงไมแขงตว เพอใหเกดชองวางส าหรบใสตวอยางโปรตนทตองการทดสอบ ปลอยทงไวใหเจลแขงตวทอณหภมหอง 4. ถอดแผนพลาสตกบางทมลกษณะเปนซฟนออกจากเจล น าเจลรวมทงแมพมพออกจากแทนยด ตดตงเขากบชดทดสอบโดยใหดานลางของเจลจมอยใน electrode buffer เตม electrode buffer ลงในชองวางระหวางเจลสองแผนจนทวมผวดานบนของเจล 5. เตมตวอยางโปรตนทตองการทดสอบความบรสทธ และหาขนาดโมเลกลทตมดวยสารละ ลาย sample buffer ทอณหภม 100 องศาเซลเซยส นาน 3 นาท ทงใหเยนแลวเตมลงในชองวางส าหรบใสตวอยางโปรตนบรเวณสวนบนของ stacking gel โดยท าพรอมกบโปรตนมาตรฐานททราบขนาดโมเลกล 6. ตอขวไฟฟาของชดทดสอบเขากบหมอแปลงไฟฟากระแสตรง ปรบใหมความตางศกย 100 โวลท และกระแสไฟประมาณ 10-15 มลลแอมแปร 7. ปลอยใหตวอยางโปรตนเคลอนทไปภายในเจล จนสของ bromophenol blue ทเตมใน sample buffer เคลอนทลงไปจนสดขอบลางของเจล 8. ปดกระแสไฟฟา น าเจลและแมพมพออกจากชดทดสอบ 9. ลอกเนอเจลออกจากแมพมพ 10. น าเจลทไดไปยอมดวยสยอม silver stain 11. ลางสสวนเกนออกโดยใช destain I นานประมาณ 1 ชวโมง

46

12. แชเจลตอใน destain II จนกระทงสวนทเปน background ใส 3. กราฟมาตรฐานโปรตนขนาดตางๆส าหรบ SDS-PAGE การตรวจสอบขนาดโมเลกลโปรตนโดยเทคนค SDS-PAGE สามารถค านวณไดจากคา Rf(relative migration distance) ซงค านวณจากการวดระยะทางจากแถบโปรตนทเคลอนทจากหลมดานบนลงสเจลดานลางตอระยะทางท marker dye เคลอนท จากนน plot graph ระหวาง Log molecular weight กบคา Rf เพอค านวณหาขนาดโมเลกลของแถบโปรตนทปรากฏขน จากความสมพนธเชงเสนตรงระหวาง log MW และ Rf จะไดสมการ y = mx + by คอ log

MW, m คอ slope ของกราฟ, x คอ Rf, b คอจดตดแกน y

Rf รปท 2 คา Rf ของโปรตนมาตรฐาน

Log

Mo

lecu

lar

Wei

ght

x 1

03

47

48

ภาคผนวก ค

งานวจยทน าเสนอผลงานวจยในการประชมวชาการและเสนอผลงานวจยพชเขตรอนและกงรอนครงท 5 ในระหวางวนท 21-22 กรกฎาคม พ.ศ. 2554 ณ มหาวทยาลยหอการคาไทย กรงเทพมหานคร และ ครงท 6 ในระหวางวนท 26-27 กรกฎาคม พ.ศ. 2555 ณ หอประชมเบญจรตน อาคารนวมนทรราชน มหาวทยาลยเทคโนโลยพระจอมเกลาพระนครเหนอ กรงเทพมหานคร

59

ประวตคณะผวจย หวหนาโครงการวจย ชอ-สกล พรชย เหลองบรสทธ ประวตการศกษา วท.ม (ชววทยาสภาวะแวดลอม) มหาวทยาลยมหดล 2539 สถานทตดตอ สาขาวชาวทยาศาสตรพนฐาน คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยหอการคาไทย โทรศพท 02-6976519 ผรวมโครงการวจย ชอ-สกล ภชร สทธกจโยธน ประวตการศกษา วท.ม (เคมชวภาพ) มหาวทยาลยศรนครนทรวโรฒ ประสานมตร 2538 สถานทตดตอ สาขาวชาวทยาศาสตรพนฐาน คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยหอการคาไทย โทรศพท 02-6976519