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Técnicas de Caracterización y
purificación
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carga
hid
rofo
bic
idad
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Propiedades de las proteínas utilizadas
para caracterizar y purificar
Carga
Tamaño
Forma
Actividad biologica
Hidrofobicidad
PM
Estabilidad relativa
Solubilidad
Punto isoelectrico
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Salting-in / Salting-out / PH /Precipitación con (NH4)2SO
4
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Fraccionamiento por campo eléctrico
(electroforesis)
Movilidad electroforética = Velocidad relativa a la
fuerza del campo electrico
f = coeficiente de friccion
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Electroforesis en papel
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“Proteinograma”
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A PH = 8 - 9
Electroforesis en gel de poliacrilamida
(PAGE)
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Tipos de Electroforesis
• PAGE Nativa
• PAGE Desnaturalizante (SDS , SDS+ condiciones reductoras, urea)
• Isoelectroenfoque
• Bidimensional
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Electroforesis nativa
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1 2 3 4
q/m = q/m = q/m = q/m
Efecto “colador”
Kr
Kr
PM nativo
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t = tiempo de
incubación a
75C
t
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SDS
PAGE SDS
La mayoría de las proteínas incorporan el SDS con una relación constante de
masa, de ahí que las moléculas en SDS tengan la misma densidad de carga,
por lo tanto :
Movilidad = 1/PM
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Determinación de PM
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Isoelectroenfoque
Resolución:
diferencia proteínas
que difieren en 0.02
unidades de pH en
sus pI
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Bidimensional
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Fraccionamiento basado en el coeficiente de
reparto
El coeficiente de reparto caracteriza la distribución de una sustancia
entre dos fases: la fase móvil y la fase estacionaria
K = Cs/Cm
Fases: liquido-liquido, liquido-solido
Fase estacionaria:
• Partículas de sólidos
• Partículas de sólidos con líquido
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Contínua
Batch
Gradiente
Elución
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Fases sólidas y estacionarias
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Tipos de cromatografías
Intercambio iónico
•Técnica independiente de la forma, tamaño y PM
•Soportes: Celulosa, agarosa, vinilbenceno
•Antes hacer un desalado (diálisis, filtración en gel)
•En general elución por gradiente (de PH o con agentes caotrópicos)
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Gradiente de pH
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Gradiente de fuerza ionica
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Filtración molecular o Exclusión
molecular
• Separa por distinto tamaño molecular (cutoff o limite de exclusion)
• Se puede usar para desalado
• Se puede usar para estimar PM
• Para purificación se usa generalmente hacia el final
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Vt=v0+vi+vg
Vg=volumen ocupado por la matriz solida de gel
V0=volumen libre en el exterior de las partículas del gel(volumen de exclusion)
Vi=volumen del solvente retenido en los poros (volumen de inclusion)
ve
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Cromatografía de fase reversa
•Se basa en “interacciones hidrofóbicas”
•La fase estacionaria son generalmente compuestos alifáticos de
distinta longitud de cadena (C4, C8, C16 etc)
•Elución por gradiente (usando mezclas de agua y solventes
orgánicos)
•Muy alta capacidad resolutiva (mezclando distintas propiedades
fisicoquimicas)
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Cromatografía de Afinidad
•Reconocimiento de ligandos
•Alta resolución y especificidad ( disminuye mucho el numero de pasos
en la purificación)
•Alto tiempo de preparación
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Fraccionamiento basado en propiedades
dinámicas
Fuerza centrifuga masa efectiva factor de flotacion
velocidad de desplazamiento Coeficiente de friccion
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Sedimentación
La unidad Svedverg se refiere a 1 10-13 segundos
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Tipos de protocolos en sedimentación
1. Centrifugación en un gradiente de densidad
Centrifugation zonal: se forma un gradiente de densidades
sirve para separa moléculas por tamaño y/o conformación: glicerol,
sacarosa. Proteínas, macromoléculas
Equilibrio de sedimentacion: velocidad lenta – la sedimentacion se
equilibra con la difusion
Sirve para separar moléculas que difieran en su densidad
(isopycnic centrifugation) Cl2Cs.
DNA, lipoproteinas. También Ficoll, Percoll para células
2. Centrifugación por velocidad:
Particularmente sensible a cambios de masa y de conformación molecular.
Se puede determinar S y el PM
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Determinación de S
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Técnicas de desalado
•Ultracentrifugación
•Diálisis
•Columnas de desalado
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La purificación se realiza en una serie de
pasos usando distintas tecnicas a cada paso
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Condiciones generales a evaluar
• Calidad (% de pureza del producto de acuerdo a mis
objetivos)
secuenciación, cristalización
ensayo de actividad, productos alimenticios médicos
nativa?
• Cantidad técnicas de alta capacidad y de baja capacidad
preparativas
analíticas
• Costos
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Pasos a seguir en una purificación
1. Definir un ensayo específico que identifique a la proteína (actividad
biológica) (específico, sensible, rápido y barato)
2. Elegir la fuente (matriz biológica)
3. Extraer la proteína de la fuente (proteínas intraceluares o
extracelulares)
4. Estabilización de la molécula
5. Aislamiento y concentración (fraccionamiento)
6. Determinar la pureza y calidad del producto final
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1 Actividad Biológica
Cantidad de proteína que produce, por su acción biológica, un determinado cambio.
Este cambio puede ser:
• Un efecto biológico (Muerte celular, hemólisis, protección inmunológica)
• Variación en la cantidad de una sustancia química (producto de una reacción)
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De esta forma podemos definir a la unidad de actividad biológica como :
Una unidad de Actividad Biológica es la cantidad de proteína que produce una
determinada cantidad de “efecto”
1. Toxina
Una unidad de AB para una toxina es la cantidad de proteína que produce la
muerte del 23% de los ratones de tal especie (siguen especificaciones…)
2. Enzima
Una unidad de AB para una enzima es la cantidad de proteína que produce 5.98
moles de producto en 1 minuto en condiciones …(siguen especificaciones…)
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2 Elección de la Fuente
Matriz donde se encuentra la proteína de interés
• Concentración
• Accesibilidad
• Costo
• Facilidad de la extracción
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3 Extracción de la proteína de la fuente
Lisis osmótica: técnica muy suave. Uso de sn hipotónicas + fuerzas
mecánicas. Para bacterias y células vegetales: lisozimas u otras enzimas
Molienda: a. Morteros b. Batidoras. Uso de sustancias abrasivas
Ultrasonido: sonicador. Eleva mucho la temperatura de la muestra
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4 Estabilización
Factores a tener en cuenta en cada etapa del fraccionamiento
1 PH
2 Grado de oxidación (-SH)
3 Presencia de Metales pesados. Sustancias Contaminantes
4 Polaridad y fuerza iónica de la solución
5 Presencia de proteasas
6 Temperatura
5 Actividad de la molécula
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Monitoreo del proceso de fraccionado
• Actividad Específica AE = Unidades totales en la fracción i
Total de proteínas en la fracción i
• Rendimiento R = Unidades totales en la fracción i
Unidades totales en la fracción original
• Porcentaje de purificación P = AE en la fracción i
AE en la fracción original
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Actividad vs Actividad específica
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5 Aislamiento y concentración
Fraccionamiento del extracto crudo
• Implica una serie de pasos en los cuales se aprovechan
propiedades fisicoquímicas o biológicas de la proteína de interés
para separarla del resto de las moléculas
• Cada paso debe ser monitoreado adecuadamente para evaluar el
rendimiento en la purificación, pureza y actividad específica de cada
fracción obtenida.
• Si bien no hay una sola secuencia de técnicas a seguir, en general
se recomienda empezar por técnicas de alta capacidad y seguir con
las de baja capacidad.
• En general se desea obtener una gran pureza (según los
objetivos) acompañada de un gran rendimiento.
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Solubilidad diferencial
Cromatografía de intercambio iónico
Cromatografía de absorción
Cromatografía de exclusión molecular
Cromatografía de afinidad
Electroforesis
Isoelectroenfoque
Resolución Capacidad
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La purificación se realiza en una serie de
pasos usando distintas tecnicas a cada paso
Rendimiento = actividad (i)/actividad(1) x 100
purificacion = act. sp (i)/act. Sp.(1) =2300 veces