pruebas serologicas inmunologicas
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1Pruebas diagnsticas basadas en la respuesta inmunitaria
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2 El diagnstico clnico no suele ser definitivo.
Las lesiones histolgicas pueden ser indicativas pero pocas veces
son patognomnicas
A veces, el diagnstico microbiolgico es lento, complicado o
imposible
Por qu utilizamos el diagnstico inmunolgico?
Principales motivos de utilizacin del diagnstico inmunolgico
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3Inte
nsid
ad d
e la
res
pues
ta
Tiempo
Respuesta primaria
Respuesta secundaria
Periodo de induccin(0-14 das)
IgM>>IgG
IgG>>IgM
Esquema de la respuesta inmune primaria y secundaria
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4Seroconversin: Aumento del ttulo de anticuerpos x4 o paso de negativo a positivo
Ttulo: Mxima dilucin a la cual un suero contina siendo positivo en una prueba serolgica determinada
Inte
nsid
ad d
e la
res
pues
ta
Tiempo
Seroconversin
Conceptos de ttulo de anticuerpos y seroconversin
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5 Las IgM normalmente reflejan una infeccin reciente
El aumento del ttulo de anticuerpos indica una infeccin
reciente
A veces, simplemente con determinar un ttulo elevado
podemos suponer que se ha producido una infeccin reciente
Los ttulos de IgG por s solos suelen indicar uan infeccin
pasada
Conceptos bsicos
Conceptos bsicos de interpretacin de resultados
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61. Pruebas basadas en la deteccin de anticuerpos
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7Pruebas de aglutinacin
Se utilizan con antgenos particulados tales como una suspensin bacteriana.Detectan preferentemente IgM
+
Rosa de Bengala (brucelosis)
Este tipo de pruebas suele ser extremadamente sensible pero, al mismo tiempo suele padecer de falta de especificidad por el hecho de ser mayoritariamente IgMs lo que se detecta
Pruebas de aglutinacin: Se basan en la unin de antgenos particulados a los anticuerpos, preferentemente de clase IgM. Suele tratarse de pruebas muysensibles pero con poca especificidad. Ejemplos de este tipo de pruebas es la aglutinacin con rosa de Bengala empleada en el diagnstico de la brucelosis.
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8Pruebas de precipitacin
Se utilizan con antgenos solubles a los que se permite difundir en una matriz semislida
Lnea de precipitacin
Se trata de pruebas relativamente sensibles y especficas pero con un elevadocomponente subjetivo y muy engorrosas
Inmunodifusin en gel de agar
Pruebas de precipitacin: En este caso se utilizacin antgenos solubles que se difunden frente a los anticuerpos. La unin antgeno-anticuerpo precipita de forma visible y permite establecer la presencia de anticuerpos especficos. Un ejemplo clsico de este tipo de pruebas es la inmunodifusin en gel de agarutilizada histricamente en el diagnstico de la leucosis bovina.
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9Fijacin del complemento
positivo negativo
La fijacin del complemento se basa en la capacidad del complemento paraunirse a los complejos antgeno-anticuerpo. La prueba incluye la adicin de eritrocitos sensibilizados con una hemolisina. Si el suero posee anticuerpos especficos, se fija el complemento y no puede unirse a la hemolisina para lisar los eritrocitos. Se trata de una prueba muy especfica.
+ CC
C
C
CC
C
Suero Antgeno
positivo
negativo
CC
C
C
C
C
C
positivo
negativo
Fijacin del complemento: Como hemos visto en captulos anteriores, el complemento posee la capacidad de unirse a los complejos antgeno anticuerpo(fijacin). Esta capacidad es aprovechada en la prueba de fijacin del complemento. Metodolgicamente, la prueba se desarrolla en dos fases, una primera que es una reaccin antgeno anticuerpo en un medio lquido y una segunda consistente en la adicin de complemento, una hemolisina dependientede complemento y eritrocitos. Si se ha producido reaccin antgeno-anticuerpo, es decir, si el suero analizado contena anticuerpos frente al antgeno, el complemento queda fijado y no puede activar la hemlisis de los glbulos rojos. Un ejemplo clsico de utilizacin de esta prueba es la perineumona bovina o la pleuroneumona porcina.
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Pruebas de hemaglutinacin e inhibicin de la hemaglutinacin
Estas pruebas se basan en la capacidad de algunos patgenos (p.ej. el virus de la influenza) para causar la aglutinacin de los eritrocitos. Pueden utilizarse para detectar el patgeno (pruebas de hemaglutinacin) o los anticuerpos dirigidos contra las hemaglutininas del microorganismo (inhibicin de la hemaglutinacin). Suelen ser pruebas especficas de serotipo o subtipo y bastante sensibles.
+
Suero
positivo
negativo Inhibicin de la hemaglutinacin
Las pruebas de hemaglutinacin se utilizan con patgenos que poseen esta capacidad, generalmente virus. El ejemplo ms clsico es el diagnstico de la influenza.
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ELISA
Placa de ELISA tapizada con el antgeno
Aadir suero
Aadir anti-inmunoglobulinaconjugada a enzima (peroxidasa)
Aadir sustratoy leer
Las pruebas inmunoenzimticas se basan en una reaccin antgeno anticuerpo que tiene lugar sobre un soporte slido (normalmente una microplaca de plstico) a la que se ha adsorbido un antgeno o un anticuerpo.
La prueba puede desarrollarse en diferentes modalidades pero en todas ellas la reaccin final se revela mediante un enzima que modifica un substrato que adquiere color. Se trata de pruebas muy sensibles y especficas
a) ELISA indirecto
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b) ELISA de competicin
Placa de ELISA tapizada con el antgeno
Aadir suero
Aadir anticuerpo frente al antgenoconjugado al enzima
Aadir sustratoy leer
Suero positivo
Suero negativo
b) ELISA de capturaAadir muestra Aadir anticuerpo deteccin
Revelar y leerPlaca de ELISA tapizada
con un anticuerpo frente al patgeno
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Pruebas de inmunofluorescencia
Las pruebas de inmunofluorescencia pueden utilzarse para detectar anticuerpos o para detectar la presencia de un patgeno. En ambos casos la reaccin finaliza mediante la adicin de un anticuerpo conjugado a una sustancia fluorescente, habitualmente fluorescena. Estas pruebas son muy sensibles pero su interpretacin tiene un alto grado de subjetividad
Inmunofluorescencia indirecta
Portaobjetos en el que se ha fijado el microorganismo
suero
1:10 1:20 1:40 1:80 1:160
Conjugadofluorescente
Las pruebas de inmunofluorescencia, en sus dos variantes, directa e indirecta, han sido muy utilizadas durante el siglo pasado aunque hoy en da han cadobastante en desuso debido al desarrollo de otros sistemas diagnsticos como el ELISA o las tcnicas de biologa molecular. La tcnica se basa en una reaccinantgeno-anticuerpo que se revela con la ayuda de un anticuerpo marcado con una sustancia fluorescente. Ejemplos de este tipo de pruebas los encontramosen el diagnstico directo de la mayora de virus del sndrome respiratorio bovino.
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Pruebas de neutralizacin
Las pruebas de neutralizacin van dirigidas a la deteccin de anticuerpos capaces de bloquear los eptopos crticos del patgeno. Normalmente suelen tener una interpretacin biolgica correlacionada con la proteccin. Sin embargo, no suelen ser tiles para diferenciar respuestas entre animales infectados y vacunados ya que la matyora de vacunas inducen anticuerpos neutralizantes
+
Suero
+Cultivo celularo inoculacin
Cultivo celular sin alteraciones
Las pruebas de neutralizacin y en particular las de neutralizacin vrica, son unode los estndares habituales para medir los niveles de inmunidad protectivafrente a un patgeno. Normalmente la prueba se realiza en dos pasos, unoprimero de incubacin del patgeno con el suero del animal a analizar y un segundo consistente en la inoculacin del patgeno en un cultivo celular o en un animal. Si el suero contena anticuerpos neutralizantes, se bloquea la capacidadinfectiva del patgeno y; por lo tanto, no produce la infeccin del animal o del cultivo. Este mismo sistema puede utilizarse con toxinas o bacterias. A pesar de su utulidad, este mtodo ha cado en desuso fuera de la investigacin debido al tiempo quew requiere y a la dificultad de trabajar con animales experimentales o cultivos celulares.