PRÁCTICA DE MICROBIOLOGIA Nro. 10

TEMA: VRDL (Venereal Disease Research Laboratory)

OBJETIVOS:

Conocer el fundamento de la prueba VDRL: pruebas treponèmicas y no treponèmicas.

Realizar en forma demostrativa tanto la técnica cualitativa como semicualitativa.

Interpretar los resultados: reactivos, no reactivos, falsos positivos, falsos negativos y la evolución de los títulos de anticuerpos pos- tratamiento.

FUNDAMENTO TEÓRICO DE LA PRÁCTICA A EJECUTAR:

La Sífilis es una enfermedad infecciosa cuyo agente causal es el Treponema Pallidum, perteneciente, junto con otros treponemas a la familia Treponemataceae. El mecanismo de transmisión es por contacto directo por las lesiones, por paso a través de la placenta o por transfusiones de sangre contaminada. Tras un periodo de incubación de 12 a 90 días, aparece en el lugar de la inoculación una lesión primaria, rica en treponemas, que desaparece en algunas semanas durante esta etapa, llamada sífilis primaria, el T. Pallidum se multiplica en los ganglios y se distribuye por la sangre a todos los órganos del individuo. En el 2º estadio, la manifestación más frecuente es el exantema, que puede afectar a cualquier superficie del cuerpo acompañado de síntomas generales; lesiones abiertas son muy contagiosas: tras la primera desaparición espontánea de la misma y durante el 1º y el 2º año, puede aparecer brotes similares cada ves de menor intensidad hasta que desaparecen todos los síntomas y signos. En la evolución de los casos no tratados, se pueden presentar un período terciario con posibilidad de alteraciones mucocutàneas y del sistema óseo, cardiovascular y nervioso.

La identificación del T. Pallidum mediante el examen directo del exudado de la lesión es una prueba definitiva para asegurar el diagnóstico, aunque un resultado negativo del mismo no descarta la posibilidad de la enfermedad, ya que la presencia de treponemas puede ser escasa dependiendo de los días de evolución y de tratamientos previos.

Actualmente existen diferentes técnicas para el diagnóstico serológico de sífilis: las no treponèmicas no determinan anticuerpos específicos frente a Treponema Pallidum y se basan en anticuerpos compuestos de soluciones alcohólicas con cantidades determinadas de Cardiolipina, colesterol y lecitina. Miden anticuerpos frente a estas sustancias que son producidas por los tejidos dañados por el T. Pallidum. Estas pruebas son: VDRL, RPR, TRUST y ELISA.

Son de bajo costo, fáciles de efectuar, se utilizan como pruebas de inicio en la detección de sífilis y para evaluar la inespecifidad, pueden arrojar falsos resultados positivos.

Las pruebas treponèmicas, en cambio, detectan específicamente los anticuerpos de Treponema Pallidum y su utilidad en el Laboratorio está orientada a confirmar los resultados arrojados por las pruebas no treponèmicas. Las pruebas treponèmicas más conocidas son: FTA- 200DS, TPH, Captia syphilis M, ELISA IgG y WESTERN BLOT, las cuales tienes muy bajo índice de falsos resultados, tanto positivos como negativos. Deben realizarse con una absorción previa del suero para eliminar la reacción cruzada con otras treponemas. Sin embargo, carecen de utilidad para monitorear los tratamientos, ya que suelen permanecer positivas en el 85/90% de los pacientes tratados y curados.

Las pruebas serológicas, en general, se vuelven reactivas pasadas 3 a 4 semanas desde el inicio de las lesiones y la sensibilidad y especificad de las mismas varía segúndiferentes estadios de evolución de la enfermedad.

SEGUIMIENTO SEROLÓGICO:

Las pruebas no treponémicas (USR, VDRL o RPR) son las únicas reacciones útiles en el seguimiento serológico del paciente, mostrando la caída gradual del título en la curación (disminución del título > 4 veces, ej: 1:32 a 1:8); o un incremento frente a un tratamiento inadecuado; o una reinfección. La MHA-TP o TP-PA y la FTA-abs permanecen reactivas por muchos años, por ello no son adecuadas para el seguimiento serológico. Es importante que el control se realice en el mismo laboratorio, con la misma prueba no treponémica y, de ser posible, con la misma marca de reactivo a fin de obtener resultados comparables.

PRUEBA DIRECTA DE ANTICUERPOS FLUORESCENTES PARA T. pallidum

Es una reacción de fluorescencia directa que se aplica sobre la exudación del chancro.

Se utiliza una inmunoglobulina anti-Treponema marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) que ha sido absorbida con Treponema phagedensis, treponema Reiter, o un anticuerpo monoclonal anti-T. pallidum marcado con FITC. La inmunoglobulina marcada reacciona con el antígeno T. pallidum, subespecie pallidum en el material de la prueba.

Es obviamente más costosa que el CO y requiere un microscopio de fluorescencia, así como experiencia en la observación. El material es fijado con acetona antes de la fluorescentes pero no la típica movilidad; presenta la ventaja de permitir el envío a distancia del portaobjeto fijado.

Técnica 1. Desparramar en un portaobjeto formando un círculo de 1 cm de ancho,

aproximadamente 10 μl del material y secar al aire. Si es posible preparar 4 portaobjetos de cada espécimen.

2. Fijar los extendidos en acetona por 10 min. o con metanol 100 % por 10 seg. o con calor suave.

3. Cubrir cada extendido con conjugado diluido (aprox. 30 μl), y colocar en cámara húmeda a 35-37 ºC por 30 min. Nota: con el anticuerpo monoclonal, adicionar azul de Evans que puede prepararse como una solución al 0,05 % en PBS.

4. Lavar los extendidos con PBS, y cubrir con PBS por 10 min. Hacer un lavado final con agua destilada.

5. Secar con papel de filtro, colocar una gota de líquido de montaje y colocar un cubreobjetos. Colocar los portaobjetos en una cámara oscura y leer entre las 4 horas.

6. Examinar en microscopio de fluorescencia con objetivo de 40X y con un objetivo de inmersión de 100X para confirmación.

Criterio de informe: Se observaron por inmunofluorescencia directa, treponemas inmunológicamente específicos para T. pallidum.

REACCION EN SUERO NO CALENTADO. USR (UNHEATED SERUM REAGIN)

La USR es una prueba microscópica, no-treponémica y de floculación en placa. El antígeno de USR detectara anticuerpos (reaginas) antilipoidales en muestras de suero de personas con otras condiciones agudas y crónicas.

La prueba de microfloculación USR usa una suspensión de antígeno de VDRL modificado que contiene cloruro de colina, la cual incrementa la reactividad del anticuerpo en suero no calentado. Semejante a la VDRL, la prueba se lee microscópicamente y es rápido y fácil de hacer. Sin embargo, a diferencia de la VDRL, la suspensión antigénica de la USR no debe ser preparada o descartada diariamente.

1. La prueba de USR es una gran ayuda en el diagnóstico de sífilis. Para arribar al diagnóstico definitivo de sífilis, el profesional combina los resultados de la USR con otras pruebas serológicas, exámenes de campo oscuro, signos y síntomas clínicos y factores de riesgo. Sin alguna otro soporte para el diagnóstico de sífilis, un resultado de USR reactivo, puede deberse a causas que no correspondan con una infección por treponema patógeno. El valor predictivo de una USR en el diagnóstico de sífilis se incrementa cuando se combina con una prueba treponémica reactiva.

2. La prueba reactiva puede sugerir infección pasada o presente con Treponema patógeno aunque también podría ser una reacción falso positiva.

3. Las reacciones falso positivas pueden deberse a un error de laboratorio como así también a anticuerpos séricos que no están relacionados con Treponemas patógenos. Los errores técnicos son detectados por la prueba USR no reactiva sobre una segunda muestra sérica. Un resultado reactivo de USR debido a infección no relacionada u otros factores, es identificada por los resultados de una prueba treponémica no reactiva simultánea. 4. La prueba USR no reactiva sin evidencia clínica de sífilis, puede sugerir una infección sifilítica pasada, infección con tratamiento efectivo u ocasionalmente, una infección de larga evolución. Una prueba no reactiva USR con evidencia clínica de sífilis puede deberse a sífilis primaria temprana; sífilis secundaria, como resultado de una reacción de prozona; y a algunos casos de sífilis tardía. Si se sospecha reacción de prozona, debería repetirse la prueba con diluciones del suero del paciente 1:16 antes de determinar que la muestra de suero es no reactiva. Una prueba USR no reactiva no excluye una sífilis en período de incubación. 5. Cuando se realiza la prueba USR cuantitativa en pacientes con sífilis, una subida de cuatro veces el título (1:4 a 1:16) en una muestra seriada puede sugerir una infección, una reinfección un fallo de tratamiento; una disminución de 4 veces el título (1:64 a 1:16) después del tratamiento para sífilis temprana (estadio primario o secundario), usualmente sugiere que la terapia fue adecuada. 6. Todos los resultados de USR cualitativa reactivos, deberían ser cuantificados hasta un punto final y su título informado. De forma infrecuente, se pueden observar títulos altos de USR en pacientes con coinfección por HIV-1 y altos títulos falsos positivos en pacientes con linfomas.

VENEREAL DISEASE RESEARCH LABORATORY (VDRL)

Es una reacción de floculación, donde el antígeno utilizado está compuesto por colesterol, lecitina y cardiolipina.

Esta prueba no treponémica mide anticuerpos antilipídicos; IgG e IgM, los cuales son formados por el huésped en respuesta al material lipídico liberado de las células huésped dañadas en la infección por TP y material lipídico de la superficie celular treponémica.

A causa del antígeno utilizado, esta prueba reacciona frente a otras patologías: colagenopatías, parasitosis, drogadicción o en determinadas condiciones fisiológicas como embarazo, vejez, etc. Tiene gran sensibilidad y baja especificidad.

Reactivos:

Antígeno de VDRL: Es una solución alcohólica de 0,03% de cardiolipina, 0,9% de colesterol y 0,21% 0,01% de lecitina.

Buffer salino VDRL, pH 6,0 Puede ser comprado o preparado en el laboratorio (ver tabla siguiente)

Sueros controles: Control reactivo (R), débil reactivo (D) y no reactivo (N). Para la realización de las pruebas cuantitativas el suero control debe tener un título de al menos 4 dils.

Solución Salina 0,9%: Agregar a cada 100ml de agua destilada 0,9 gr de NaCl. Solución Salina 10,0%: Agregar a cada 100ml de agua destilada 10 gr de NaCl.

A. REACCION DE VDRL CUALITATIVA, EN SUERO

Preparación de la Suspensión del Antígeno VDRL:

1) Al momento de preparar la suspensión todos los reactivos deben estar entre 23° y 29°C.

2) Pipetear 0,4ml de Buffer salino VDRL y agregarlo al fondo del frasco de 30 ml o del Erlenmeyer de 25ml.

3) Agregar 0,5 ml de suspensión de antígeno (de la mitad inferior de una pipeta 1 ml graduada hasta la punta) directamente sobre la solución salina mientras se hace girar el frasco suave pero continuamente sobre una superficie plana.

NOTA: El antígeno se añade gota a gota, de modo que se permita unos seis segundos para los 0,5ml de antígeno. La punta de la pipeta debe quedar en el tercio superior del frasco y la rotación no debe ser tan vigorosa que salpique la pipeta con la solución salina. Se obtendrá la velocidad de rotación adecuada cuando el centro del frasco describa un círculo de 5 cm de diámetro, unas tres veces por segundo.

4) Expeler la última gota de antígeno de la pipeta sin que esta toque la solución salina.

5) Proseguir con la rotación del frasco durante 10 segundos. 6) Con una pipeta de 5ml añadir 4,1ml de buffer. 7) Tapar el frasco y agitar de abajo hacia arriba y viceversa unas 30 veces en 10

segundos. 8) La suspensión de antígeno está lista y puede ser utilizada durante un día

(8Hs).

Formaldehído neutro 0,5mlNa2HPO4 anhidro 0,037gKH2PO4 0,170 gNaCl 10.00 gAgua destilada 1000 ml

9) Cada vez que se utilice la suspensión agitarla suavemente. No debe mezclarse haciéndola pasar a la fuerza de un lado a otro de la jeringa y la aguja, puesto que podría ocasionar la ruptura de partículas y la pérdida de reactividad.

B. REACCION DE VDRL CUANTITATIVA, EN SUERO

Todos los sueros que produzcan resultado reactivo, débil reactivo o no reactivo ligeramente rugoso en la reacción de VDRL en placa, deben analizarse de nuevo cuantitativamente hasta un título en dilución final.

Las diluciones de suero que deben analizarse son: sin diluir (1:1), 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16. En casos especiales continuar hasta 1:256.

a. Para cada muestra a ser testada, colocar 50 µl de NaCl al 0,9 % en los círculos 2 a 5.

b. Colocar 50 µl del suero a testar en los círculos 1 y 2. c. Mezclar la solución salina y el suero en el círculo 2 utilizando la pipeta

automática, por aspiración y eliminación, 8 veces. Evitar la formación de burbujas.

d. Transferir 50 µl del círculo 2 (1:2) al círculo 3 (1:4), mezclar como en el paso 3. a. Transferir 50 µl del círculo 3 (1:4) al círculo 4 (1:8), mezclar como en el

paso 3. b. Transferir 50 µl del círculo 4 (1:8) al círculo 5 (1:16), mezclar como en el

paso 3 y descartar 50 µl. e. Resuspender suavemente la suspensión antigénica. Sosteniendo el frasco del

antígeno en posición vertical, dispensar 1 o 2 gotas a fin de liberar el pico vertedor de aire, y luego colocar exactamente una gota (1/60 ml) de la suspensión antigénica dentro de cada círculo de prueba con una aguja no descartable sin bisel de calibre 18.

f. Rotar 4 minutos a 180 ± 2 rpm y leer los resultados al microscopio con ocular y objetivo de 10X.

g. Anotar los resultados en términos de la mayor dilución de suero que produzca un resultado reactivo.

h. Si la más alta dilución probada (1:16) es reactiva, proceder como sigue: A.- Preparar una dilución 1:16 de la muestra por adición de 100 µl del

suero a 1,5 ml de NaCl al 0,9 %. Mezclar. B.- Colocar 50 µl de la solución de NaCl 0,9 % en los círculos 2, 3, 4 y 5

de la placa. C.- Colocar 50 µl de la dilución 1:16 en los círculos 1 y 2. D.- Con la misma pipeta, realizar diluciones seriadas dobles a partir del

círculo 2 y completar la prueba como se describió antes en los pasos 3 a 6.

E.- Leer los resultados como se describió previamente.

OTRAS PRUEBAS NO TREPONÉMICAS

Con la excepción del antígeno de VDRL, los antígenos de las pruebas no treponémicas están estabilizados por el agregado de sal disódica de EDTA, además de cloruro de colina para eliminar la necesidad de inactivar el suero por calentamiento.

Las pruebas no treponémicas se dividen en procedimientos microscópicos y macroscópicos.

Microscópicos

VDRL (venereal disease research laboratory)

USR (unheated serum reagin)

Macroscópicos

RPR (rapid plasma reagin)

En esta prueba, se le agregan partículas de carbón al antígeno para facilitar la visualización de la floculación.

TRUST (toluidine red unheated serum test)

Esta prueba difiere de la anterior en que se agregan partículas de pintura pigmentada al antígeno.

En ambas pruebas, las partículas quedan atrapadas en el complejo antígeno-anticuerpo formado con el suero.

TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS PARA EJECUTAR LA PRÁCTICA:

Se realizará exposición introductoria por parte del docente.

La práctica se desarrollará en base de la obtención previa de una muestra de suero humano de pacientes con VDRL reactivo.

El VDRL es una técnica de floculación que utiliza el antígeno de cardiolipina para detectar anticuerpos antitreponèmicos inespecíficos producidos por el individuo ante una infección sifilítica.

Se práctica normalmente en lámina de cristal, en la que se mezcla el suero del paciente, con una suspensión fresca del antígeno de cardiolipina; esta mezcla se agita de forma rotatoria y al cabo de pocos minutos puede observarse la floculación utilizando un microscopio de bajo aumento; sus resultados pueden expresarse tanto cualitativa como cuantitativamente.

La técnica de VDRL cualitativa, consiste en mezclar una alícuota de suero humano de suspensión de antígeno de cardiolipina.

La técnica Semicuantitativa, consiste en hacer diluciones del suero humano de la siguiente manera: ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128……………… 1/n.

Y se mezcla como en la forma cualitativa con un alícuota de suspensión de antígeno de cardiolipina y se interpreta los resultados luego de 4 minutos, mediante observación al microscopio.

Se considera reactivo cuando el título de la dilución mínimo es reactivo en 1/16, por debajo de está dilución la reactividad de la prueba de VDRL puede presentarse en enfermedades causadas por agentes más abajo señalados.

EL MÉDICO DEBE INDICAR EL VDRL EN LOS SIGUIENTES CASOS: 1. Pacientes que presentan lesiones cutáneas en áreas genitales, rasch

cutáneo generalizado y/o erupciones en palmas y plantas de los pies, en los que incluirá a la o las parejas sexuales de los pacientes.

2. Pacientes con otras enfermedades de transmisión sexual incluyendo también a su o sus parejas sexuales.

3. Contactos sospechosos y asociados se casos de sífilis recién diagnosticados.

4. Seguimiento serológicos a pacientes sifilíticos ya tratados.

5. Consulta preconcepcional y planificación familiar.6. Mujeres embarazadas en el primero y tercer

trimestre de la gestación.7. Donantes de sangre.8. Chequeos pre- empleo y previos al ingreso en el

servicio militar general.

MANEJO DE LOS RESULTADOS DEL VDRL:

El diagnóstico positivo de la sífilis se basa en 3 pilares: 1) los elementos clínicos, 2) las investigaciones de laboratorio y 3) Los antecedentes epidemiológicos.

Es necesario tener presente que el VDRL reactivo debe ser utilizado como parámetro altamente sugestivo de sífilis, pero nunca como sinónimo de ésta.

¿CUÁLES AFECCIONES PUEDEN PROVOCAR REACTIVIDAD DEL VDRL?

1. En primer lugar se deben considerar las treponematosis: sífilis, frambesia, pinta, bejel, fiebre recurrente, leptospirosis, enfermedad de Lyme y otras beriliosis. Estas afecciones provocan una reacción serológica reactiva verdadera.

2. Enfermedades por micobacterias: tuberculosis y lepra.3. Enfermedades producidas por bacterias: neumonías neumocóccicas,

endocarditis infecciosa, chancero blando y escarlatina.4. enfermedades virales: mononucleosis infecciosa, neumonías virales,

sarampión, varicela, hepatitis infecciosa, vaccina.5. enfermedades por clamidias: linfogranuloma venéreo.6. enfermedades parasitarias: paludismo y tripanosomiasis.7. enfermedades por alteración del sistema inmune: anemias hemolíticas

autoinmunes, enfermedades del colágeno, síndrome antifísfolipidico primario.

8. situaciones especiales: inmunizaciones y embarazo.

¿EXISTEN OTRAS POSIBILIDADES DE REACTIVIDAD DEL VDRL?

1. falso reactor biológico: individuo sano, con un nivel de anticuerpos contra la cardiolipina capaz de alterar el examen de VDRL.

2. Errores de laboratorio: cambio de muestra, cristalería sucia, poco adiestramiento del personal, etc.

¿EN QUE CASOS UN PACIENTE CON SÍFILIS PUEDE TENER UNA PRUEBA SEROLÓGICA NO REACTIVA?

1. durante el periodo de incubación de la enfermedad y hasta 15 días después de la aparición del chancro sifilítico, pues no se han producido aún anticuerpos por el paciente.

2. En pacientes con títulos muy altos de anticuerpos anticardiolipina (1 o 2% de los pacientes con sífilis) se observa una reacción protónica o fenómeno turbí-dico. en estos casos no se produce floculación, a menos que se diluya el suero el paciente.

¿QUÉ CONDUCTA DEBE SEGUIR EL MEDICO CUANDO LE LLEGA UN PACIENTE CON VDRL REACTIVO?

1. Ante todo caso de VDRL reactivo durante la gestación debe instaurarse tratamiento especifico e inmediato contra sífilis a la gestante y a su pareja, después de esto realizara la interconsulta con el dermatólogo.

2. En los otros casos indicara VDRL a la o las parejas sexuales del paciente y se interconsultará el paciente con el dermatólogo que atiende el área de salud.

¿DEBE EL VDRL VOLVER A LA NORMALIDAD DESPUES DEL TRATAMIENTO ESPECIFICO DE LA ENFERMEDAD?

El VDRL no se negativiza inmediatamente después del tratamiento, si la terapéutica se realiza en los estadios precoces de la sífilis (durante los primeros 2 años) los títulos del VDRL deben descender paulatinamente y hacerse no reactivos en un período no mayor de 18 meses; por regla general regresan en 3 meses si se trata cuando esta el chancro, y 6 meses si se trata cuando l caso esta en período secundario.

Si el tratamiento se realiza en los estudios tardíos de la afección (después de los 2 años), los títulos deben descender también, aunque no necesariamente tienen que hacerse no reactivos; esto no constituye un signo de alarma.

Mientras los títulos se mantengan iguales o menores al titulo pretratamiento se considera al paciente curado. Estos fenómenos (caso tratados correctamente y que mantiene VDRL reactivo postratamiento) se denominan seropersistencia.

MATERIALES Y REACTIVOS.

Tubo con la muestra de suero reactivo al VDRL.

Reactivo de suspensión de antígenos de cardiolipina.

Lamina de cristal con pocillos

Pipetas automáticas de 20ul y 50ul.

Tubos de ensayo

Mandil

Microscopio Guantes Mascarilla

RECURSOS DIDACTICOS: Se realizara una exposición central por parte del docente e inmediatamente se ira explicando a cada grupo de estudiantes lo que se observa al finalizar el tiempo de incubación.

RESULTADOS DE APRENDIZAJE:

Los estudiantes:

Conocen el fundamento de la prueba VDRL: pruebas trepanémicas y no

treponémicas

Realizan en forma demostrativa tanto la técnica cualitativa como

semicuantitativa.

Interpretan los resultados: reactivos, no reactivos, falsos positivos, falsos

negativos y la evolución de los títulos de anticuerpos pos-tratamiento.

OBSERVACION DE LA PRUEBA REALIZADA EN EL LABORATORIO.

BIBLIOGRAFIA:

NO REACTIVA

Visto al microcopio podemos observar las células individualmente sin formación de grumos o agrupadas por sectores.

REACTIVA

En este caso observamos que las células se encuentran agrupadas, de tal manera que visto al microscopio las observamos como grandes colonias

Arenas R. Atlas de dermatología, diagnostico y tratamiento. 2 ed Interamericana, 1996:287-94.

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ANEXOS

PREPARACION DEL SUERO HUMANO Y EL SUERO FISIOLOGICO EN LOS TUBOS DE ENSAYO. 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32…

PREPARACION DEL SUERO EN LOS POSILLOS PARA SER OBSERVADOS EN EL MICROSCOPIO.